JP7791310B2

JP7791310B2 - ヒトｂ型ナトリウム利尿ペプチド又はその前駆体若しくは分解物を検出するための方法、組成物、及びキット

Info

Publication number: JP7791310B2
Application number: JP2024512593A
Authority: JP
Inventors: 恭平吉崎; 康幸池永
Original assignee: Denka Co Ltd; Denki Kagaku Kogyo KK
Current assignee: Denka Co Ltd
Priority date: 2022-03-31
Filing date: 2023-03-28
Publication date: 2025-12-23
Anticipated expiration: 2043-03-28
Also published as: JPWO2023190560A1; WO2023190560A1; CN118946807A

Description

本発明は、ヒトＢ型ナトリウム利尿ペプチド又はその前駆体若しくは分解物を検出するための方法、組成物、及びキットに関する。

ヒトＢ型ナトリウム利尿ペプチド（ｈＢＮＰ、配列番号１）は心筋細胞で生合成及び分泌される循環ホルモンであり、利尿作用、血管拡張作用、交感神経抑制作用、心肥大抑制作用などの作用を有し、心筋を保護するように働く。心臓（特に心室）に負荷がかかると、まず、ｈＢＮＰの前駆体のひとつであるヒトプレプロＢ型ナトリウム利尿ペプチド（ｈｐｒｅｐｒｏＢＮＰ、配列番号２）が発現し、ヒトプロＢ型ナトリウム利尿ペプチド（ｈｐｒｏＢＮＰ、配列番号３）へと切断されて翻訳後修飾を受ける。その後、ｈｐｒｏＢＮＰの９６番目のアミノ酸（アルギニン）と９７番目のアミノ酸（セリン）との間のペプチド結合が酵素的に切断されて、９７～１２８番目のアミノ酸（３２個のアミノ酸）からなるｈＢＮＰが生成し、上述の病態生理機能の発現を果たす。したがって、ｈＢＮＰの発現量は、心臓の負荷亢進及び病勢に応じて増加し、血中濃度に反映される。このように、心不全の重症度に応じてｈＢＮＰ発現が亢進して、血中ｈＢＮＰが上昇することから、ｈＢＮＰは心不全の診断マーカーとして用いられてきた。

ｈＢＮＰは、体内での生物学的半減期が約２０分であるといわれており、血漿中及び血清中で不安定な分子であることが知られている。プロテアーゼタイプの酵素によるｈＢＮＰの分解が報告されており、例えば、非特許文献１には、Ｃ末端におけるＡｒｇ３０－Ａｒｇ３１結合、及びＮ末端部分、より具体的にはＰｒｏ２－Ｌｙｓ３結合が開裂することが記載されている。これにより生じたｈＢＮＰの分解物も上述の病態生理機能を保持していることが報告されており、心不全の病勢に対する代償応答の発現機序を踏まえると、ｈＢＮＰ分解物も含めた総ｈＢＮＰの血中濃度を評価することが、心不全の病態把握とその後の治療に資する診断指標として重要である（非特許文献２）。

ｈＢＮＰの検出には、従来、ｈＢＮＰの異なるエピトープを認識する二種以上のモノクローナル抗体又はポリクローナル抗体を用いて行うサンドイッチ免疫アッセイ法が用いられてきた。サンドイッチ免疫アッセイ法とは、一般的に、抗原の定量的及び定性的な検出に用いられる方法である。かかる方法では、抗原上の異なるエピトープに対してそれぞれのエピトープを認識する抗体を同時に結合させ、又はどちらか一方を結合させた後にもう一方の抗体を結合させ、二つの抗体によりサンドイッチされた抗原を検出する。

従来のサンドイッチ免疫アッセイ法に利用可能な抗ｈＢＮＰ抗体としては、様々なエピトープに結合する抗体が報告されてきた。例えば、特許文献１には、ｈＢＮＰのＣ末端エピトープ（Ｌｙｓ２７からＨｉｓ３２）の最後のアミノ酸であるヒスチジン（Ｈｉｓ３２）を認識するモノクローナル抗体が記載されている。ｈＢＮＰ上の他のエピトープとして、特許文献２には、Ｓｅｒ１からＣｙｓ１０、Ｖａｌ５からＡｒｇ１３、及びＭｅｔ１５からＧｌｙ２５が記載されている。

特許第２６６５８５０号特開２００７－１６９２９３号公報

Ｓｈｉｍｉｚｕ，ｅｔａｌ．（２００２）ＣｌｉｎｉｃａＣｈｉｍｉｃａＡｃｔａ３１６：１２９－１３５ＴｏｍｏｋｏＩｃｈｉｋｉ，ｅｔａｌ．ＡｄｖＣｌｉｎＣｈｅｍ．２０１３；６１：１－３１

ｈＢＮＰの検出には高感度が要求されるため、サンドイッチ免疫アッセイ法のなかでも、化学発光法を利用した方法（化学発光酵素免疫測定法）が用いられてきた。化学発光試薬は高価であるため、より安価なラテックス凝集法を利用することができれば好ましい。しかしながら、ラテックス凝集法では二種類の抗体をそれぞれラテックス粒子に固定化させる必要があり、また、ｈＢＮＰは３２個のアミノ酸からなる小さなペプチドであるため、従来の抗ｈＢＮＰ抗体を用いた場合は、抗体固定化ラテックス粒子間の立体障害により抗体が抗原に結合できない場合がある。抗体固定化ラテックス粒子間の立体障害を避けるために、二種類の抗体のうちの片方としてｈＢＮＰのＣ末端を認識する抗体を用いることも考えられるが、この場合は、血清又は血漿中で末端が分解されたｈＢＮＰを検出できない。

本発明は上記課題に鑑みてなされたものであり、抗体固定化ラテックス粒子間の立体障害及びｈＢＮＰの末端の分解による影響を抑えつつ、ラテックス凝集法によりｈＢＮＰを検出することを目的とする。

本発明者らは鋭意検討の結果、プロテアーゼによる分解を受けやすいｈＢＮＰのＮ末端及びＣ末端領域以外の領域における新規エピトープｈＢＮＰ１７－２４（ｈＢＮＰの１７～２４番目のアミノ酸領域：配列番号４）を発見し、かかるエピトープを認識する新規な抗体を作製した。驚くべきことに、ｈＢＮＰ１７－２４は、公知のエピトープｈＢＮＰ５－１３（ｈＢＮＰの５～１３番目のアミノ酸領域：配列番号５）の近傍に位置するにもかかわらず、ｈＢＮＰ１７－２４を認識する抗体とｈＢＮＰ５－１３を認識する抗体の組合せを用いることで、立体障害の影響をほとんど受けずに、ラテックス凝集法により効率良くｈＢＮＰを検出可能であった。上記抗体の組合せであれば、ｈＢＮＰのＮ末端及びＣ末端の分解の影響もほとんど受けることがない。本発明者らは以上の知見に基づき、本発明を完成させるに至った。

本発明の一側面に係る試料中のヒトＢ型ナトリウム利尿ペプチド又はその前駆体若しくは分解物を検出する方法は、配列番号１で示されるアミノ酸配列における１７～２４番目のアミノ酸領域を認識するモノクローナル抗体又はその抗原結合性断片と、配列番号１で示されるアミノ酸配列における５～１３番目のアミノ酸領域を認識するモノクローナル抗体又はその抗原結合性断片と、を用いて、試料中のヒトＢ型ナトリウム利尿ペプチド又はその前駆体若しくは分解物をラテックス凝集法により検出する工程を含み、ヒトＢ型ナトリウム利尿ペプチドの前駆体はヒトプロＢ型ナトリウム利尿ペプチドであり、ヒトＢ型ナトリウム利尿ペプチドの分解物は配列番号１で示されるアミノ酸配列における５～２４番目のアミノ酸領域を含む分解物である。

本発明の一側面に係るヒトＢ型ナトリウム利尿ペプチド又はその前駆体若しくは分解物を検出するための組成物は、配列番号１で示されるアミノ酸配列における１７～２４番目のアミノ酸領域を認識するモノクローナル抗体又はその抗原結合性断片を固定化した第一のラテックス粒子と、配列番号１で示されるアミノ酸配列における５～１３番目のアミノ酸領域を認識するモノクローナル抗体又はその抗原結合性断片を固定化した第二のラテックス粒子と、を含み、ヒトＢ型ナトリウム利尿ペプチドの前駆体はヒトプロＢ型ナトリウム利尿ペプチドであり、ヒトＢ型ナトリウム利尿ペプチドの分解物は配列番号１で示されるアミノ酸配列における５～２４番目のアミノ酸領域を含む分解物である。

本発明の一側面に係るヒトＢ型ナトリウム利尿ペプチド又はその前駆体若しくは分解物を検出するためのキットは、配列番号１で示されるアミノ酸配列における１７～２４番目のアミノ酸領域を認識するモノクローナル抗体又はその抗原結合性断片を固定化した第一のラテックス粒子と、配列番号１で示されるアミノ酸配列における５～１３番目のアミノ酸領域を認識するモノクローナル抗体又はその抗原結合性断片を固定化した第二のラテックス粒子と、を含み、ヒトＢ型ナトリウム利尿ペプチドの前駆体はヒトプロＢ型ナトリウム利尿ペプチドであり、ヒトＢ型ナトリウム利尿ペプチドの分解物は配列番号１で示されるアミノ酸配列における５～２４番目のアミノ酸領域を含む分解物である。

本発明によれば、抗体固定化ラテックス粒子間の立体障害及びｈＢＮＰの末端の分解による影響を抑えつつ、ラテックス凝集法によりｈＢＮＰを検出することができる。

ｈＢＮＰに特異的に結合した抗体のエピトープマッピングの結果を示す図である。ラテックス粒子に固定化した異なる抗体ペアの、ｈＢＮＰとの反応性を示す図である。図２の（Ａ）は、ｈＢＮＰの５～１３番目及び１７～２４番目のアミノ酸領域を認識する抗体ペアを用いた結果であり、図２の（Ｂ）は、ｈＢＮＰの５～１３番目及び１４～２０番目のアミノ酸領域を認識する抗体ペアを用いた結果である。ｈＢＮＰの血漿中での分解が、ラテックス粒子に固定化した異なる抗体ペアの、ｈＢＮＰとの反応性に及ぼす影響を示す図である。図３の（Ａ）は、ｈＢＮＰの５～１３番目及び１７～２４番目のアミノ酸領域を認識する抗体ペアを用いた結果であり、図３の（Ｂ）は、ｈＢＮＰの５～１３番目及び２７～３２番目のアミノ酸領域を認識する抗体ペアを用いた結果である。

＜検出方法＞
本発明の一側面に係る試料中のヒトＢ型ナトリウム利尿ペプチド（ｈＢＮＰ）又はその前駆体若しくは分解物を検出する方法は、配列番号１で示されるアミノ酸配列における１７～２４番目のアミノ酸領域（配列番号４）を認識するモノクローナル抗体又はその抗原結合性断片と、配列番号１で示されるアミノ酸配列における５～１３番目のアミノ酸領域（配列番号５）を認識するモノクローナル抗体又はその抗原結合性断片と、を用いて、試料中のヒトＢ型ナトリウム利尿ペプチド又はその前駆体若しくは分解物をラテックス凝集法により検出する工程を含む。

配列番号１で示されるアミノ酸配列はｈＢＮＰの全長アミノ酸配列であり、配列番号１で示されるアミノ酸配列における１７～２４番目のアミノ酸領域を認識するモノクローナル抗体及び配列番号１で示されるアミノ酸配列における５～１３番目のアミノ酸領域を認識するモノクローナル抗体は、それぞれｈＢＮＰにおけるｈＢＮＰ１７－２４エピトープ（ｈＢＮＰの１７～２４番目のアミノ酸領域：配列番号４）及びｈＢＮＰ５－１３エピトープ（ｈＢＮＰの５～１３番目のアミノ酸領域：配列番号５）に特異的に結合するモノクローナル抗体である。ここで、「特異的に」とは、ｈＢＮＰの上記エピトープを有するタンパク質と、上記エピトープを有さないその他のタンパク質成分と、上記モノクローナル抗体とが混じり合う液系において、上記モノクローナル抗体がその他のタンパク質成分と検出可能なレベルで抗原抗体反応を起こさないか、何らかの結合反応又は会合反応を起こしたとしても、上記モノクローナル抗体の、上記エピトープを有するタンパク質との抗原抗体反応よりも、明らかに弱い反応しか起こさないことを意味する。

ｈＢＮＰの１７～２４番目のアミノ酸領域を認識するモノクローナル抗体及びｈＢＮＰの５～１３番目のアミノ酸領域を認識するモノクローナル抗体は、ｈＢＮＰの前駆体又は分解物にも結合することができる。ｈＢＮＰの前駆体はヒトプロＢ型ナトリウム利尿ペプチド（ｈｐｒｏＢＮＰ）である。ｈＢＮＰの分解物は、ｈＢＮＰのアミノ酸配列における５～２４番目のアミノ酸領域を含む分解物であれば特に限定されない。ｈＢＮＰの分解物は、例えば、ｈＢＮＰから３１番目及び３２番目のアミノ酸が除去された分解物、又はｈＢＮＰから１番目及び２番目のアミノ酸が除去された分解物であってよい。

上記モノクローナル抗体のクラスは、ＩｇＧに限定されず、ＩｇＹ、ＩｇＭ、ラクダＩｇ、又はＩｇＮＡＲであってもよい。また、上記モノクローナル抗体の抗原結合性断片は、特に限定されず、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）_２、又は一本鎖抗体（ｓｃＦｖ）であってよい。

上記モノクローナル抗体は、例えば、公知の免疫学的手法を用いて、ｈＢＮＰ又は上記エピトープを含むｈＢＮＰ断片を動物に免疫し、免疫された動物の細胞を用いて作製したハイブリドーマから得ることができる。あるいは、上記モノクローナル抗体は、ファージディスプレイ法、酵母ディスプレイ法等の遺伝子組換え技術により作製することもできる。免疫に用いるｈＢＮＰ断片の長さは特に限定されないが、好ましくは１０アミノ酸以上、より好ましくは１３アミノ酸以上である。

試料は、ｈＢＮＰ又はその前駆体若しくは分解物が含まれる可能性のある試料であれば限定されず、例えば、ヒト又はヒト以外の動物から採取した生体試料であってよい。生体試料は、例えば、血液（全血）、血漿、又は血清であってよい。

ｈＢＮＰの１７～２４番目のアミノ酸領域を認識するモノクローナル抗体又はその抗原結合性断片と、ｈＢＮＰの５～１３番目のアミノ酸領域を認識するモノクローナル抗体又はその抗原結合性断片と、を用いて、試料中のヒトＢ型ナトリウム利尿ペプチド又はその前駆体若しくは分解物をラテックス凝集法により検出する工程は、公知のラテックス凝集法に従って行うことができる。すなわち、まず、ｈＢＮＰの１７～２４番目のアミノ酸領域を認識するモノクローナル抗体又はその抗原結合性断片と、ｈＢＮＰの５～１３番目のアミノ酸領域を認識するモノクローナル抗体又はその抗原結合性断片を、それぞれ第一のラテックス粒子及び第二のラテックス粒子に固定化する。次いで、必要に応じて、各抗体固定化ラテックス粒子をウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）等の公知のブロッキング剤を用いてブロッキングした後、緩衝液中で抗体固定化ラテックス粒子と試料を混合し、混合液を抗原抗体反応が起こり得る温度でインキュベートする。これにより、試料中にｈＢＮＰ又はその前駆体若しくは分解物が存在する場合は、抗原抗体反応が起こることにより抗体固定化ラテックス粒子同士が凝集するため、この凝集の有無を光照射等公知の手法により検出することにより、試料中のｈＢＮＰ又はその前駆体若しくは分解物の有無を検出することができる。

第一のラテックス粒子及び第二のラテックス粒子は、同じであっても異なっていてもよく、公知のラテックス粒子を用いることができる。第一のラテックス粒子及び第二のラテックス粒子の材料は特に限定されず、例えば、ポリスチレン、ポリアクリロニトリル、ポリメタクリロニトリル、又はポリメタクリル酸メチルであってよい。第一のラテックス粒子及び第二のラテックス粒子の平均粒径は、立体障害を低減するとともに十分な検出感度を得る観点から、例えば、０．０２～５μｍ、０．０５～１μｍ、又は０．２～０．６μｍであってよい。本明細書において、平均粒径とは、動的光散乱法によって得られた体積基準の粒径の分布曲線において、小粒径からの積算値が全体の５０％に達したときの粒径（すなわちメディアン径）を意味する。

ｈＢＮＰの１７～２４番目のアミノ酸領域を認識するモノクローナル抗体を固定化した第一のラテックス粒子と、ｈＢＮＰの５～１３番目のアミノ酸領域を認識するモノクローナル抗体を固定化した第二のラテックス粒子は、同時に試料と混合してもよいし、別々に試料と混合してもよい。これら抗体固定化ラテックス粒子を別々に試料と混合する場合、一方の抗体固定化ラテックス粒子と試料を混合して、混合液を抗原抗体反応が起こり得る温度でインキュベートした後、該混合液にもう一方の抗体固定化ラテックス粒子を混合して、抗原抗体反応が起こり得る温度で再度インキュベートすることができる。

インキュベーションの温度は、特に限定されず、例えば、２０～３７℃であってよく、特に、３７℃、２５℃、又は２０℃であってよい。

ｈＢＮＰの１７～２４番目のアミノ酸領域を認識するモノクローナル抗体と、ｈＢＮＰの５～１３番目のアミノ酸領域を認識するモノクローナル抗体とは、それぞれが認識するエピトープが近接しているにもかかわらず、それぞれが固定化されたラテックス粒子間の立体障害の影響をほとんど受けずにｈＢＮＰに結合することができる。したがって、本側面に係る方法によれば、立体障害による影響を抑えつつ、ラテックス凝集法によりｈＢＮＰ又はその前駆体若しくは分解物を検出することができる。また、ｈＢＮＰの１７～２４番目のアミノ酸領域を認識するモノクローナル抗体と、ｈＢＮＰの５～１３番目のアミノ酸領域を認識するモノクローナル抗体は、ｈＢＮＰの末端領域以外の領域を認識するため、本側面に係る方法によれば、ｈＢＮＰの末端の分解による影響も抑えつつ、ラテックス凝集法によりｈＢＮＰ又はその前駆体若しくは分解物を検出することができる。

＜検出用組成物＞
本発明の一側面に係るｈＢＮＰ又はその前駆体若しくは分解物を検出するための組成物は、本発明の上記側面に係る検出方法において用いられる、配列番号１で示されるアミノ酸配列における１７～２４番目のアミノ酸領域を認識するモノクローナル抗体又はその抗原結合性断片を固定化した第一のラテックス粒子と、配列番号１で示されるアミノ酸配列における５～１３番目のアミノ酸領域を認識するモノクローナル抗体又はその抗原結合性断片を固定化した第二のラテックス粒子と、含む。これらモノクローナル抗体並びに第一及び第二のラテックス粒子の詳細は、上述したとおりある。本側面に係る組成物は、上記抗体固定化ラテックス粒子を含む緩衝液であってよい。本側面に係る組成物を試料と混合することで、該試料中のｈＢＮＰ又はその前駆体若しくは分解物をラテックス凝集法により検出することができる。

＜検出用キット＞
上記側面に係る組成物は、配列番号１で示されるアミノ酸配列における１７～２４番目のアミノ酸領域を認識するモノクローナル抗体又はその抗原結合性断片を固定化した第一のラテックス粒子と、配列番号１で示されるアミノ酸配列における５～１３番目のアミノ酸領域を認識するモノクローナル抗体又はその抗原結合性断片を固定化した第二のラテックス粒子とを含む組成物であるが、本発明の別の一側面において、これらの抗体固定化ラテックス粒子は、別々の試薬として提供されてもよい。すなわち、本発明の別の一側面は、配列番号１で示されるアミノ酸配列における１７～２４番目のアミノ酸領域を認識するモノクローナル抗体又はその抗原結合性断片を固定化した第一のラテックス粒子と、配列番号１で示されるアミノ酸配列における５～１３番目のアミノ酸領域を認識するモノクローナル抗体又はその抗原結合性断片を固定化した第二のラテックス粒子と、含む、ｈＢＮＰ又はその前駆体若しくは分解物を検出するためのキットである。

キットは、緩衝液等、ラテックス凝集法おいて用いられる公知の試薬、材料、器具等をさらに含むことができる。

＜試験例１＞新規抗体のエピトープマッピング
マウス及びウサギの免疫化
表１に示すペプチド１～１９を合成し、各ペプチドに対して、免疫原性を高めるために、種々の官能基を用いてチログロブリン、ＫＬＨ（キーホールリンペットヘモシニアン）、ＯＶＡ（オボアルブミン）、ＢＳＡなどの担体タンパク質に結合させた。担体タンパク質を結合させたペプチド毎にマウス及びウサギを準備し、７～１４日の間隔で２ヶ月にわたり、免疫した。アジュバントとして、ｓｉｇｍａａｄｊｕｖａｎｔｓｙｓｔｅｍ（登録商標）（メルク社製）を使用した。免疫期間中に経時採血を行い、抗体価をＥＬＩＳＡ（酵素結合免疫吸着検査）法で測定した。抗体価の高い個体を選別し、脾臓を摘出した。

抗体取得
摘出した脾臓からＴＲＩｚｏｌ（登録商標）ＰｌｕｓＲＮＡＰｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎＫｉｔ（サーモフィッシャーサイエンティフィック社製）を用いてＲＮＡを抽出し、ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ（登録商標）ＩＩＩＲｅｖｅｒｓｅＴｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ（サーモフィッシャーサイエンティフィック社製）を用いた逆転写反応によりｃＤＮＡを得た。得られたｃＤＮＡを、抗体遺伝子特異的なプライマーを用いてＰＣＲ反応により増幅し、増副産物をベクターに挿入して抗体遺伝子ライブラリを得た。該ライブラリ及びｈＢＮＰ固定化ビーズを用いて、ファージディスプレイ法により４ラウンドのパニングを実施し、ＥＬＩＳＡ法によりｈＢＮＰに特異的に結合する抗体を確認した。ｈＢＮＰに特異的に結合する種々の抗体の配列をそれぞれ細胞発現用ベクターに挿入してＣＨＯ（チャイニーズハムスター卵巣）細胞にて発現させた後、ＰｒｏｔｅｉｎＡ（ＧＥ）カラムを用いて精製し、１８種の全長抗体を得たのち、すべてについてエピトープの同定を行った。なお、得られた１８種の抗体のほとんどが、ペプチド１９で免疫した個体由来であった。

エピトープの同定
取得した抗体のエピトープを以下のように確認した。まず、ビオチン化したペプチド１～１８を合成し（ＪＰＴＰｅｐｔｉｄｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社に委託）、互いに区別可能なビーズ（ルミネックス社製のＬｕｍＡｖｉｄｉｎ（登録商標）Ｍｉｃｒｏｓｐｈｅｒｅｓ）に固定化した。各ペプチド固定化ビーズを５００個ずつポリプロピレン製マイクロプレートの各ウェルに加え、一つのウェルに対して一種類の抗体を終濃度で１μｇ／ｍＬ加えた。マイクロプレートを３７℃で１時間インキュベートした後、磁気スタンドを用いて上清を除去し、マイクロプレートを洗浄した。検出用の抗体として、Ｒ－フィコエリスリン標識したヤギ抗マウスＩｇＧ又はヤギ抗ウサギＩｇＧを加え、３７℃で１時間インキュベートした。磁気スタンドを用いて上清を除去し、マイクロプレートを洗浄した後、Ｂｉｏ－Ｐｌｅｘを用いてＲ－フィコエリスリンの蛍光を測定した。ペプチド１９で免疫したマウス由来の抗体のうちの一つのエピトープマッピングの結果を図１に示す。

ｈＢＮＰの１７番目及び２４番目のアミノ酸を含むペプチド（ペプチド１０～１７）に対しては、これらのアミノ酸を含まないペプチドと比べて格段に多くの抗体が結合していた。この結果から、この抗体が、ｈＢＮＰの１７～２４番目のアミノ酸領域を特異的に認識することが示唆された。

＜試験例２＞立体障害の影響の評価
各種抗ｈＢＮＰ抗体溶液をそれぞれポリスチレンビーズ（平均粒径：０．３μｍ）と混合し、４℃で一晩反応させて、抗体固定化ビーズを得た。抗体としては、ｈＢＮＰの５～１３番目のアミノ酸領域を認識する抗体、ｈＢＮＰの１７～２４番目のアミノ酸領域を認識する抗体、及びｈＢＮＰの１４～２０番目のアミノ酸領域を認識する抗体を用いた。各抗体固定化ビーズにさらにＢＳＡを加えてブロッキングを行った後、ｈＢＮＰの５～１３番目のアミノ酸領域を認識する抗体を固定化したビーズと、ｈＢＮＰの１７～２４番目又は１４～２０番目のアミノ酸領域を認識する抗体を固定化したビーズとを緩衝液に懸濁した。ＰＢＳで１０ｎｇ／ｍＬに希釈した合成ｈＢＮＰ（Ｐｒｏｓｐｅｃ社製）を希釈用緩衝液に加えて３７℃で５分間静置した後、抗体固定化ビーズ懸濁液と混合して３７℃で５分間反応させ、ラテックス凝集反応を６３５ｎｍの光を照射することにより検出した。結果を図２に示す。

図２の（Ａ）は、ｈＢＮＰの５～１３番目及び１７～２４番目のアミノ酸領域を認識する抗体ペアを用いた結果であり、図２の（Ｂ）は、ｈＢＮＰの５～１３番目及び１４～２０番目のアミノ酸領域を認識する抗体ペアを用いた結果である。５～１３番目及び１７～２４番目のアミノ酸領域を認識する抗体ペアを用いた場合は、時間経過とともに６３５ｎｍの光の散乱強度が増していったのに対し、５～１３番目及び１４～２０番目のアミノ酸領域を認識する抗体ペアを用いた場合は、散乱強度が僅かしか上昇しなかった。この結果は、５～１３番目及び１７～２４番目のアミノ酸領域を認識する抗体ペアを用いた場合には、抗体固定化ラテックス粒子間で立体障害が生じず、ラテックス反応が進行したのに対し、５～１３番目及び１４～２０番目のアミノ酸領域を認識する抗体ペアを用いた場合は、立体障害によりラテックス凝集反応が阻害されたことを示す。なお、１４～２０番目のアミノ酸領域を認識する抗体及び１７～２４番目のアミノ酸領域を認識する抗体のｈＢＮＰに対する親和性はそれぞれ２．４×１０^－１０Ｍ及び２．４１×１０^－１０ＭであることをＢｉａｃｏｒｅ（登録商標）８Ｋ（Ｃｙｔｉｖａ社製）により確認しており、凝集性の違いが親和性の差によるものではないと考えられる。

＜試験例３＞ｈＢＮＰの分解の影響の評価
各種抗ｈＢＮＰ抗体溶液をそれぞれポリスチレンビーズ（平均粒径：０．３μｍ）と混合し、４℃で一晩反応させて、抗体固定化ビーズを得た。抗体としては、ｈＢＮＰの５～１３番目のアミノ酸領域を認識する抗体、ｈＢＮＰの１７～２４番目のアミノ酸領域を認識する抗体、及びｈＢＮＰの２７～３２番目のアミノ酸領域を認識する抗体を用いた。各抗体固定化ビーズにさらにＢＳＡを加えてブロッキングを行った後、ｈＢＮＰの５～１３番目のアミノ酸領域を認識する抗体を固定化したビーズと、ｈＢＮＰの１７～２４番目又は２７～３２番目のアミノ酸領域を認識する抗体を固定化したビーズとを緩衝液に懸濁した。ｈＢＮＰ除去血漿（ｈｙｔｅｓｔ社製）で希釈した合成ｈＢＮＰ（Ｐｒｏｓｐｅｃ社製）を希釈用緩衝液に加えて３７℃で５分間反応させた後、抗体固定化ビーズ懸濁液と混合して３７℃で５分間反応させ、ラテックス凝集反応を７３０ｎｍの光を照射することにより検出した（１日目）。さらに、１日目にｈＢＮＰ除去血漿（ｈｙｔｅｓｔ社製）で希釈した合成ｈＢＮＰを４℃で一晩静置し、この合成ｈＢＮＰを希釈用緩衝液に加えて、上述のとおりラテックス凝集反応を行った（２日目）。結果を図３に示す。

図３中、散乱強度は、反応開始後０分での散乱強度と反応開始後５分での散乱強度の差で示す。図３の（Ａ）は、ｈＢＮＰの５～１３番目及び１７～２４番目のアミノ酸領域を認識する抗体ペアを用いた結果であり、図３の（Ｂ）は、ｈＢＮＰの５～１３番目及び２７～３２番目のアミノ酸領域を認識する抗体ペアを用いた結果である。５～１３番目及び１７～２４番目のアミノ酸領域を認識する抗体ペアを用いた場合は、１日目も２日目もラテックス凝集反応が生じたのに対し、５～１３番目及び２７～３２番目のアミノ酸領域を認識する抗体ペアを用いた場合は１日目のみラテックス凝集反応が生じ、２日目はラテックス凝集反応が生じなかった。この結果は、一晩血漿中で保存したｈＢＮＰはその末端が分解されており、５～１３番目及び１７～２４番目のアミノ酸領域を認識する抗体ペアによれば、末端が分解されたｈＢＮＰを検出できるのに対し、５～１３番目及び２７～３２番目のアミノ酸領域を認識する抗体ペアでは、末端が分解されたｈＢＮＰを検出できないことを示す。

Claims

試料中のヒトＢ型ナトリウム利尿ペプチド又はその前駆体若しくは分解物を検出する方法であって、
配列番号１で示されるアミノ酸配列における１７～２４番目のアミノ酸領域を認識するモノクローナル抗体又はその抗原結合性断片と、
配列番号１で示されるアミノ酸配列における５～１３番目のアミノ酸領域を認識するモノクローナル抗体又はその抗原結合性断片と、
を用いて、試料中のヒトＢ型ナトリウム利尿ペプチド又はその前駆体若しくは分解物をラテックス凝集法により検出する工程を含み、
ヒトＢ型ナトリウム利尿ペプチドの前駆体はヒトプロＢ型ナトリウム利尿ペプチドであり、ヒトＢ型ナトリウム利尿ペプチドの分解物は配列番号１で示されるアミノ酸配列における５～２４番目のアミノ酸領域を含む分解物である、方法。
ヒトＢ型ナトリウム利尿ペプチド又はその前駆体若しくは分解物を検出するための組成物であって、
配列番号１で示されるアミノ酸配列における１７～２４番目のアミノ酸領域を認識するモノクローナル抗体又はその抗原結合性断片を固定化した第一のラテックス粒子と、
配列番号１で示されるアミノ酸配列における５～１３番目のアミノ酸領域を認識するモノクローナル抗体又はその抗原結合性断片を固定化した第二のラテックス粒子と、を含み、
ヒトＢ型ナトリウム利尿ペプチドの前駆体はヒトプロＢ型ナトリウム利尿ペプチドであり、ヒトＢ型ナトリウム利尿ペプチドの分解物は配列番号１で示されるアミノ酸配列における５～２４番目のアミノ酸領域を含む分解物である、組成物。
ヒトＢ型ナトリウム利尿ペプチド又はその前駆体若しくは分解物を検出するためのキットであって、
配列番号１で示されるアミノ酸配列における１７～２４番目のアミノ酸領域を認識するモノクローナル抗体又はその抗原結合性断片を固定化した第一のラテックス粒子と、
配列番号１で示されるアミノ酸配列における５～１３番目のアミノ酸領域を認識するモノクローナル抗体又はその抗原結合性断片を固定化した第二のラテックス粒子と、を含み、
ヒトＢ型ナトリウム利尿ペプチドの前駆体はヒトプロＢ型ナトリウム利尿ペプチドであり、ヒトＢ型ナトリウム利尿ペプチドの分解物は配列番号１で示されるアミノ酸配列における５～２４番目のアミノ酸領域を含む分解物である、キット。