JP7794822B2 - 撮像システムおよび撮像範囲調整方法 - Google Patents

Description

本発明は撮像システムおよび撮像範囲調整方法に関する。

生化学や分子生物学などの領域において、多数の小さな独立した反応サイトが設けられたマイクロプレートに微量な試料を添加し、反応させて、反応による反応サイトの色の変化を画像撮影し、デジタルカウントする計測が行われている。マイクロプレートのように、プレート上に多数のマルチウェルを備えた計測デバイスの画像撮影には、プレート内のウェルサイズと光検出器であるＣＣＤまたはＣＭＯＳカメラのピクセルサイズの関係が重要となる。ウェルサイズがピクセルサイズよりも十分に大きいとき、ウェル１つあたりをカバーするピクセル（データ点数）は多くなる。その一方で、ウェルサイズが小さくなると各ウェルに対応するデータ点数が低下し、データ解析の観点において信号強度の信頼性が低下する。そのため、各ウェルのデータ点数を増やす必要がある。

特許文献１では、マルチウェルで構成された試料ホルダーは、少なくとも２００００個の独立した反応サイトを備えており、光センサは、所定のピクセル数を備え、該所定のピクセル数は、独立した反応サイト数の少なくとも２０倍であると記載されている。

特表２０１５－５１５２６７号公報

マルチウェルなどの撮像において、データ点数がウェルサイズに依存して減少し、信号強度の信頼性の低下につながることが課題である。

データ点数の減少を防ぎ信頼度の高い測定を行うために、カメラのピクセル数を増やすことによるデータ点数の増加や多数のマルチウェルを備えた計測デバイスを拡大し、複数回撮像する場合がある。しかし、これらはカメラの高コスト化と測定の長時間化を導く。

特許文献１には、信号解析時に正確な計算を行ううえで、各反応サイトにおいて大きいピクセル数を保持することが重要であることが記載されている。また、そのためにはウェル形状を円でなく六角形とすることでデータ点数を若干増やすことができる可能性があると記載されている。しかし、これは円から六角形にすることで、ウェル面積が増加し、それに伴ってデータ点数が増加することを意味している。このようなウェル形状では、例えば、円に内接した六角形のサイズのウェルを利用した場合には、ウェル面積が円と比較して小さいため、データ点数が減少してしまう可能性がある。さらに、光学系の調節によるデータ点数の増加等に関する指針や方法、効果については触れられていない。

本発明は上記事情に鑑みてなされたものであり、ピクセル数のより少ないカメラを用いて、ウェルのデータ点数をより増加させ、これによって測定精度を高める技術を提供するものである。

本発明に係る撮像システムの一例は、
平面上に配置された複数の測定対象を撮像する、撮像システムであって、
前記撮像システムは、
前記複数の測定対象に対し光を照射する光源と、
前記複数の測定対象からの光を検出する光検出器と、
１つ以上のレンズと、
前記複数の測定対象に撮像の焦点を合わせる調整機構と、
前記光検出器と前記複数の測定対象との相対位置を変更する駆動機構と、
を有し、
前記複数の測定対象は同一形状かつ同一サイズであり、
前記複数の測定対象は前記平面上に縦方向および横方向に等ピッチで並び、
前記複数の測定対象のピッチに撮像倍率を乗じた値が、前記光検出器の画素ピッチの２倍以上の整数倍であり、
前記駆動機構による前記相対位置の変更において、撮像範囲の調整単位が前記画素ピッチ以下であることを特徴とする。

本発明に係る撮像範囲調整方法の一例は、
平面上に配置された複数の測定対象を撮像するための撮像範囲調整方法であって、
前記撮像範囲調整方法は、撮像システムによって実行され、
前記撮像システムは、
前記複数の測定対象に対し光を照射する光源と、
前記複数の測定対象からの光を検出する光検出器と、
１つ以上のレンズと、
前記複数の測定対象に撮像の焦点を合わせる調整機構と、
前記光検出器と前記複数の測定対象との相対位置を変更する駆動機構と、
を有し、
前記複数の測定対象は同一形状かつ同一サイズであり、
前記複数の測定対象は前記平面上に縦方向および横方向に等ピッチで並び、
前記撮像範囲調整方法は、
前記駆動機構が、前記複数の測定対象について焦点合わせを行うことと、
前記光検出器によって前記複数の測定対象を撮像して画像を取得することと、
前記画像内で前記複数の測定対象が水平軸方向または垂直軸方向に配列するように、前記駆動機構が前記複数の測定対象および前記光検出器の少なくとも一方を回転させることと、
前記画像におけるピクセル強度のヒストグラムにおけるピークのうち、強度が最大であるピークおよび強度が最小であるピークの少なくとも一方のピーク形状に基づき、前記駆動機構が、前記光検出器と前記複数の測定対象との相対位置を第１軸方向に変更することと、
前記画像におけるピクセル強度のヒストグラムにおけるピークのうち、強度が最大であるピークおよび強度が最小であるピークの少なくとも一方のピーク形状に基づき、前記駆動機構が前記相対位置を前記第１軸方向と直交する第２軸方向に変更することと、
を備える。

本発明に係る撮像範囲調整方法の一例は、
平面上に配置された複数の測定対象を撮像するための撮像範囲調整方法であって、
前記撮像範囲調整方法は、撮像システムによって実行され、
前記撮像システムは、
前記複数の測定対象に対し光を照射する光源と、
前記複数の測定対象からの光を検出する光検出器と、
１つ以上のレンズと、
前記複数の測定対象に撮像の焦点を合わせる調整機構と、
前記光検出器と前記複数の測定対象との相対位置を変更する駆動機構と、
を有し、
前記複数の測定対象は同一形状かつ同一サイズであり、
前記複数の測定対象は前記平面上に縦方向および横方向に等ピッチで並び、
前記撮像範囲調整方法は、
前記駆動機構が、前記複数の測定対象について焦点合わせを行うことと、
前記光検出器によって前記複数の測定対象を撮像して画像を取得することと、
前記画像内で前記複数の測定対象が水平軸方向または垂直軸方向に配列するように、前記駆動機構が前記複数の測定対象および前記光検出器の少なくとも一方を回転させることと、
前記画像におけるピクセル強度の標準偏差に基づき、前記駆動機構が前記相対位置を第１軸方向に変更することと、
前記画像におけるピクセル強度の標準偏差に基づき、前記駆動機構が前記相対位置を前記第１軸方向と直交する第２軸方向に変更することと、
を備える。

本発明によれば、ピクセル数のより少ないカメラを用いて、ウェルのデータ点数をより増加させ、これによって測定精度を高めることができる。

さらに、光検出器の有効ピクセル数を最大限に活用することができるため、１回の測定当たりの測定可能ウェル数を増やすことができる。

本発明に関連する更なる特徴は、本明細書の記述、添付図面から明らかになるものである。また、上記した以外の、課題、構成及び効果は、以下の実施例の説明により明らかにされる。

本発明の実施例１に係る、撮像範囲を調整するための撮像システム構成図。 撮像範囲を調整する代表的なフローチャート。 マルチウェルを利用したΘ軸調整方法を説明する図。 基準マーカを利用したΘ軸調整方法を説明する図。 Ｘ軸とＹ軸調整による信号強度とピクセル数の分布を例示する図。 図５における分布におけるピーク解析法を例示する図。 面積に基づいて撮像範囲を調整する変形例のフローチャート。 Ｘ軸とＹ軸調整する際に標準偏差による調整方法を説明する図。 図８の方法を利用した際のフローチャート。 マルチウェルと光検出器の各ピッチの関係性を説明する図。 円形ウェルに撮像範囲調整方法の適用を例示する図。 四角形ウェルに撮像範囲調整方法の適用で得られる効果を説明する図。 様々な測定条件に対するウェルとピクセルの関係を例示する図。 ウェル内のピクセル強度の信号解析方法を説明する図。

以下、図面を用いて本発明の実施例について説明する。

［実施例１］
以下、図１から図７を用いて、実施例１について説明する。実施例１では、複数の測定対象を撮像する撮像システムによる撮像範囲の調整方法を示す。実施例１において、撮像システムの調整機構はＸＹＺ軸とΘ軸の計４軸において撮像範囲を調整可能である。本実施例の撮像システムを用いることで、ウェルのデータ点数を増加することが可能になる。

図１は、実施例１に係る撮像システムの全体構成図である。撮像システムは顕微鏡を備え、平面上に配置された複数の測定対象４を撮像することができる。顕微鏡は、測定対象４に対し光を照射する光源１と、１つ以上のレンズ２と、ハーフミラー３と、ＸＹＺ軸ステージ５と、Θ軸ステージ６と、カメラレンズ７と、カメラ８と、撮像部回路９と、制御回路１０と、コンピュータ１３とを備える。

本実施例に係る撮像システムは測定対象４を含まないが、測定対象４を含む撮像システムを構成することも可能である。

撮像システムは、本実施例に従って、複数の測定対象４を撮像するための撮像範囲調整方法を実行することができる。

コンピュータ１３は公知のコンピュータとしてのハードウェア構成を有し、たとえば演算手段および記憶手段を備える。演算手段はたとえばプロセッサを含み、記憶手段はたとえば半導体メモリ装置および磁気ディスク装置等の記憶媒体を含む。記憶媒体の一部または全部が、過渡的でない(non-transitory)記憶媒体であってもよい。

また、コンピュータは入出力手段を備えてもよい。入出力手段は、たとえばキーボードおよびマウス等の入力装置と、ディスプレイおよびプリンタ等の出力装置と、ネットワークインタフェース等の通信装置とを含む。

記憶手段はプログラムを記憶してもよい。プロセッサがこのプログラムを実行することにより、コンピュータは本実施形態において説明される機能を実行してもよい。

本実施例では、記憶手段はたとえばメモリ１１であり、演算手段は解析部１２として機能し、入力装置はたとえば情報を入力するための操作部１４であり、出力装置はたとえば撮像システムに係る情報（カメラ８によって撮像された画像を含む）を表示する表示部１５である。

カメラ８として、たとえばセンサシフト方式のＣＣＤまたはＣＭＯＳカメラを用いることにより、解像度および精度の高い画像を取得することができる。カメラ８の撮像素子数が１００００００個以上であるものを用いることにより、解像度がより高い画像を取得することができる。撮像倍率は任意に設計可能であるが、０．４倍以上かつ２．５倍以下とすると既存の撮像システムによく適合する。

光源１からの光は、１つ以上のレンズ２（本実施例では２枚）によってビームスポット径が調整され、ハーフミラー３を透過後、複数の測定対象４に照射される。ある実施形態ではレンズ２の位置にライトガイドのような均一照射ユニットを導入し、均一照射光を提供することにより、光学性能を改善するように使用され得る。複数の測定対象４から放出される光はハーフミラー３により反射され、カメラレンズ７により集光および結像され、カメラ８により検出される。

複数の測定対象４は、ＸＹＺ軸ステージ５に対して移動可能に固定される。ＸＹＺ軸ステージ５は、カメラ８に対してＺ軸方向に測定対象４を移動させる。たとえば、ＸＹＺ軸ステージ５は、測定対象４に撮像の焦点を合わせる調整機構として機能する。

ＸＹＺ軸ステージ５は、Θ軸ステージ６に対して回転可能に固定される。ＸＹＺ軸ステージ５およびΘ軸ステージ６は、カメラ８と測定対象４との相対位置を変更する駆動機構として機能する。たとえば、ＸＹＺ軸ステージ５がＸＹ平面内で測定対象４を平行移動させ、Θ軸ステージ６がＸＹ平面内で測定対象４を回転させる。

ＸＹＺ軸ステージ５は、各軸の動作機構を１つないし複数所持していてもよい。たとえば、Ｘ軸の動作機構を２種類保持し、それらには手動ステージと自動ステージ（ステッピングモーターやピエゾ素子）を含む。また、カメラ８は、光検出素子がＸ軸および／またはＹ軸に沿って移動してもよく、Θ軸の周りに回転してもよい（その場合にはカメラ８も駆動機構として機能する）。

撮像部回路９はカメラ８に撮像条件の信号を送信し、カメラ８からのデータを受信する。撮像部回路９で受信したデータはコンピュータ１３内のメモリ１１に送信され記録される。データはメモリ１１と解析部１２（解析機構）において送受信される。解析部１２はデータを解析し、解析結果に応じて（たとえば解析結果が所定の条件を満たしていない場合に）、撮像部回路９には撮像条件の信号を、制御回路１０には各軸における制御条件の信号を、それぞれ送信する。

制御回路１０は、解析部１２から受信した信号をもとに、ＸＹＺ軸ステージ５およびΘ軸ステージ６を制御する。表示部１５は、撮像部回路９、制御回路１０、メモリ１１、解析部１２の一連の処理に関する情報を表示する。一連の処理に用いる制御値等は操作部１４を用いて入力することができる。

図２は図１に示した撮像システムにより撮像範囲を調整するフローチャートを示した図である。図１に示した光学部品を参照しながら調整方法を説明する。複数の測定対象４をＸＹＺ軸ステージ５上に設置する（Ｓ１）。

カメラ８によって複数の測定対象４を撮像し、画像を取得しながら、取得された画像に基づいてＸＹＺ軸ステージ５をＺ軸方向に移動させ（たとえば上下に移動させ）、最適なピント位置に合わせる（Ｓ２）。このようにして、ＸＹＺ軸ステージ５が、複数の測定対象４について焦点合わせを行う。なお、画像に基づいて焦点合わせを行うための具体的な方法は、当業者が公知技術等に基づいて適宜設計可能である。

Θ軸調整では、Θ軸ステージ６により複数の測定対象４を回転させて（Ｓ３）、マルチウェルの方向を所定の方向に一致させる（Ｓ４）。すなわち、画像内で複数の測定対象４が水平軸方向または垂直軸方向に配列するように、Θ軸ステージ６が複数の測定対象を回転させる。詳細は図３および図４に関連して後述する。

Θ軸調整後、カメラ８により、複数の測定対象４を撮像して画像を取得する。すなわち、カメラ８の全ピクセルについて強度を測定する（Ｓ５）。その後、画像におけるピクセル強度のヒストグラムにおけるピークのうち強度が最大であるピークの形状に基づき、ＸＹＺ軸ステージ５が、カメラ８と複数の測定対象４との相対位置を、Ｘ軸（第１軸）方向に変更する（Ｓ６）。

詳細は図５に関連して後述するが、本実施例では、Ｓ６の処理はピークの高さに基づいて実行され、画像におけるピクセル強度のヒストグラムにおけるピークのうち強度が最大であるピークの高さが最大となるように実行される（Ｓ７）。Ｓ６およびＳ７は、随時カメラ８による画像取得を行いながら実行される。

一例では、Ｓ６において相対位置をＸ軸方向に、たとえば位置Ｘ０から位置Ｘ１に移動させ、ピークの高さを取得する。その後Ｓ７において、位置Ｘ１において取得したピークの高さＨ１を、位置Ｘ０において取得したピークの高さＨ０と比較する。Ｈ１≧Ｈ０であれば、ピークの高さはまだ最大に達していないと判断してＳ６に戻る。一方、Ｈ１＜Ｈ０であれば、ピークの高さが最大に達したと判断してＳ８に進む。この場合には、ピークの最大の高さはＨ０となる。

別の一例では、所定のＸ方向範囲について相対位置を掃引し、ピークの高さが最大となる位置を決定してもよい。

その後、同様にして、Ｙ軸方向の調整が行われる。すなわち、画像におけるピクセル強度のヒストグラムにおけるピークのうち強度が最大であるピークの形状に基づき、ＸＹＺ軸ステージ５が、カメラ８と複数の測定対象４との相対位置を、Ｙ軸（第１軸と直交する第２軸）方向に変更する（Ｓ８）。本実施例では、Ｓ８の処理は、画像におけるピクセル強度のヒストグラムにおけるピークのうち強度が最大であるピークの高さが最大となるように実行される（Ｓ９）。Ｓ８およびＳ９は、随時カメラ８による画像取得を行いながら実行される。

このフローチャートの操作を実行することで、解析に利用可能なウェル内のデータ点数が増加する。ある変形例では、ＸＹＺ軸ステージ５およびΘ軸ステージ６に代えて、またはこれらに加えて、カメラ８に備えられているＸ軸、Ｙ軸、Θ軸の調整機構を利用し、カメラ８と複数の測定対象４との相対位置を変更してもよい。

以上が、本実施例の撮像システムの構成とフローチャートである。以下、本システムの特徴であるΘ軸調整とＸＹ軸調整の詳細な動作の流れについて説明する。

上述のように、本実施例に係る撮像システムは、カメラ８からのデータを記録するメモリ１１と、データを解析する解析部１２とを備える。ＸＹＺ軸ステージ５およびΘ軸ステージ６は、カメラ８の検出結果に応じて、ピクセル強度をモニタしながら、カメラ８と複数の測定対象４との相対位置を変更する。このような構成により、リアルタイムでの位置調整が可能となる。

図３は、複数の測定対象４を水平に調整する方法を示した図である。この例では複数の測定対象４として複数の四角形ウェル１００を用いる。四角形ウェル１００は同一形状かつ同一サイズであり、たとえば正方形である。四角形ウェル１００は３×３で配列している。四角形ウェル１００は、平面上に縦方向および横方向に等ピッチで並ぶ。ここで「縦方向」「横方向」とは互いに直交する方向を意味するが、ＸＹＺ軸ステージ５における縦方向または横方向の絶対的な定義は任意に設計することができる。また、一度に撮像される四角形ウェル１００の数が１００００個以上であると、多数のウェルを効率的に処理することができる。

四角形ウェル１００は、マルチウェルプレートの反応ウェルまたはデジタルＰＣＲの反応ウェルであってもよい。このような構成によれば、マルチウェルまたはデジタルＰＣＲの判定に本実施例を適用することができる。

複数の測定対象４の水平度を評価するためには、サンプル上のラインプロファイルを取得する。ラインプロファイルとは、たとえばＸ軸と平行な直線上において、各位置でのピクセル強度を表すプロファイルである。１個以上のウェルが含まれるように、水平にラインプロファイルを取得する。ラインプロファイルで取得されるデータ点と強度の間には、ウェル位置のシグナルが強く観測され、ウェルが存在しない位置では背景光強度が観測される。

水平度を評価するために着目するのは、シグナルと背景光強度の変化周期である。複数の測定対象４がななめに設置されているとき、変化周期は一定とならず、ばらつきが存在する。複数の測定対象４が水平に設置されているとき、変化周期は一定となる。

図４は、複数の測定対象４を水平に調整する別の方法を示した図である。図４に示した方法では、マルチウェルではなく、測定対象上に作製する基準マーカ２００を使用する。基準マーカ２００の特定の頂点２つを通る直線を取得し、その直線が水平か否かにより評価する。水平だった場合、測定対象が水平に設置されていることを意味する。基準マーカ２００の形状は、例示した形状に限らない。

以上が、Θ軸ステージ６の動作により複数の測定対象４を水平に配置する方法である。以降、ＸＹＺ軸ステージ５によるＸ軸とＹ軸の調整を説明する。

図５は、ＸＹＺ軸ステージ５によりＸ軸方向とＹ軸方向に複数の測定対象４を調整したときのウェルとピクセルの関係を示している。図５（ａ）は、図２中のΘ軸調整後（Ｓ５）の強度測定に対応する。

撮像開始時点では、四角形ウェル１００とピクセル３００の関係はランダムである。したがって、ウェル全域をカバーしているピクセルも存在すれば、ウェルを部分的にカバーしているピクセルも存在する。

このときのピクセル強度に対するピクセル数の分布をグラフに示すと、強度０のピクセル３０１、強度２．５のピクセル３０２、強度４のピクセル３０３、強度５のピクセル３０４、強度１０のピクセル３０５が存在する。このように、ピクセル強度分布には広がりが生じる。ピクセル強度分布の広がりは、信号解析精度の減少につながるため、可能な限り分布の広がりは狭めることが望ましい。

ピクセル強度分布を狭めるために、図５（ｂ）、図５（ｃ）に示すように、ＸＹＺ軸ステージ５によるＸ軸方向とＹ軸方向の調整を行う。Ｘ軸方向とＹ軸方向に調整する順番に関しては、どちらが先であっても構わない。図５（ｂ）のように、ピクセル強度分布をモニタしながら、Ｘ軸を調整することで、ウェルをフルでカバーするピクセル（すなわち全領域がウェルに該当するピクセル）の数は増加し、その一方で、部分的にカバーしていたピクセル（すなわち一部の領域がウェルに該当し、他の領域が背景に該当するピクセル）の数は減少する。それに伴い、ピクセル強度分布の広がりは減少する。

ここで、ＸＹＺ軸ステージ５による相対位置の変更において、撮像範囲の調整単位はカメラ８の画素ピッチ以下であり、好ましくはカメラ８の画素ピッチより十分に小さい。たとえば撮像範囲の調整単位は画素ピッチの１／１０以下または１／１００以下である。

図５（ｂ）の状態から、さらにピクセル強度分布をモニタしながら、同様にＹ軸を調整することで、ウェルをフルでカバーするピクセルの数は増加し、その一方で、部分的にカバーしていたピクセルの数は減少する。その結果、最終的なピクセル分布は、強度０のピクセル３０１、強度１０のピクセル３０５に二分化される。なお、図５（ｃ）のヒストグラムには複数のピークが現れているが、強度１０におけるピークは、ピークのうち強度が最大であるピークに対応し、強度０におけるピークは、ピークのうち強度が最小であるピークに対応する。

このような一連の調整により、ウェルをフルでカバーするピクセルの数（ウェルをフルでカバーするデータ点数）を増加することが可能となる。また、ピクセル強度の値はたとえばカメラ８による実測値であり、図５の分布は一つの例である。

図６は、ピーク解析方法を例示する。ピーク解析の指標は、たとえばピーク高さまたはピーク面積である。ピーク面積は、たとえばピークの半値幅範囲を取得し、半値幅範囲内の面積を用いることができる。

または、ピーク面積として、たとえばピークの半値幅範囲を取得し、半値幅範囲内に含まれる全ピクセルについて強度の平均値および標準偏差を算出し、平均値±標準偏差の範囲内の面積を用いてもよい。上述のように、ピークのうち強度が最大であるピークが解析の対象となる。すなわち、この場合には、当該ピーク（より厳密には、当該ピークの半値幅範囲内）におけるピクセル強度の平均値±標準偏差の範囲内の面積が用いられる。このようなピーク解析方法によれば、ピーク高さのみならず、ピーク内の分布を考慮したより適切な解析が可能となる。

図７は、面積に基づくピーク解析法で撮像範囲を調整する変形例のフローチャートを示す。図２のＳ７に代えてＳ７ａが実行され、図２のＳ９に代えてＳ９ａが実行される。

本変形例では、Ｓ６の処理はピークの面積に基づいて実行され、画像におけるピクセル強度のヒストグラムにおけるピークのうち強度が最大であるピークについて、その面積が最大となるように実行される（Ｓ７ａ）。同様に、Ｓ８の処理もピークの面積に基づいて実行され、画像におけるピクセル強度のヒストグラムにおけるピークのうち強度が最大であるピークについて、その面積が最大となるように実行される（Ｓ９ａ）。

このように、ピークの高さ（図２）または面積（図７）に基づいてカメラ８と測定対象４との相対位置を変更することにより、ピクセルと測定対象との関係を最適化することができる。たとえば、ウェル内のデータ点数を増加させることができ、より信号強度の信頼性を高めることが可能となる。

上述の実施例１およびその変形例では、ヒストグラムにおけるピークのうち強度が最大であるピーク（すなわち図５（ｃ）における強度１０のピーク）のピーク形状に基づいてカメラ８と複数の測定対象４との相対位置が変更されるが、変形例として、ヒストグラムにおけるピークのうち強度が最小であるピーク（すなわち図５（ｃ）における強度０のピーク）のピーク形状に基づいてカメラ８と複数の測定対象４との相対位置を変更してもよい。

あるいは、ヒストグラムにおけるピークのうち、強度が最大であるピークおよび強度が最小であるピークの双方の形状に基づいて（たとえば、これら２つのピークの高さの和に基づいて）カメラ８と複数の測定対象４との相対位置を変更してもよい。このようにすると、広い強度範囲を考慮して相対位置を最適化することができる。

［実施例２］
以下、図８と図９を用いて、実施例２について説明する。実施例１と共通する部分については、説明を省略する場合がある。

実施例２は、ＸＹＺ軸ステージ５によりＸ軸方向とＹ軸方向に複数の測定対象４を調整したときのウェルとピクセルの関係を標準偏差により決定づけるものである。この決定方法は実施例１（図５）とは異なり、ピクセル強度分布のヒストグラムをモニタする必要はない。

図８（ａ）は、図２中のΘ軸調整後の相対位置に対応する。このとき、測定に利用した全ピクセル強度の標準偏差を算出する。実施例１（図５）と同様に、ウェルをフルでカバーしているピクセルをピクセル強度１０とし、ウェルをまったくカバーしていないピクセルをピクセル強度０とし、部分的にウェルをカバーしているピクセルはそれらの間のピクセル強度を保持する。

図８（ａ）では、全ピクセル強度の標準偏差が３．８である。図８（ｂ）はＸ軸方向調整後の相対位置であり、図８（ｃ）はＹ軸方向調整後の相対位置である。これらの調整では、標準偏差が最大となるようにする。この一連の調整により、データ点数を増加させることが可能となる。また、ピクセル強度の値はカメラ８の実測値であり、図８は一つの例である。

図９は図８の操作のフローチャートを示す。フローチャートは、Ｓ７ｂおよびＳ９ｂを除き実施例１（図２）と同一である。Ｓ７ｂおよびＳ９ｂでは、標準偏差の値に基づいて分岐判断を行う。

すなわち、ＸＹＺ軸ステージ５は、画像におけるピクセル強度の標準偏差に基づき、カメラ８と測定対象４とのをＸ軸方向に変更し、その後、同様に画像におけるピクセル強度の標準偏差に基づき、相対位置をＹ軸方向に変更する。

以上、実施例２においても、同様にウェル内のデータ点数を増加させることができ、より信号強度の信頼性を高めることが可能となる。

［実施例３］
以下、図１０を用いて、実施例３について説明する。実施例１または２と共通する部分については、説明を省略する場合がある。

実施例３は、ウェルのデータ点数を増加させるためのマルチウェルの構成を決定づけるものである。実施例３において、ウェル形状は四角形とする。測定系の撮像倍率や光検出器のピクセルピッチなどを踏まえて、マルチウェルのウェルピッチを決める。本実施例が開示するマルチウェルの構成を用いることで、ウェルをカバーするデータ点数を増加させることが可能になる。

マルチウェルの構成は下記の数式１から数式８で定まり、ピクセルピッチ、はみ出し割合、正の整数で説明される。はみ出し割合(ｍ_ｘ、ｍ_ｙ)と正の整数（a、b、c、d）は数式７と数式８の条件を満たす。

数式１～数式３はマルチウェルのＸ軸方向への配列条件を、数式４～数式６はマルチウェルのＹ軸方向への配列条件を決定づける式である。ただし、
ｐｉｘｅｌ_ｘ：ｘ方向のピクセルピッチ
ｐｉｘｅｌ_ｙ：ｙ方向のピクセルピッチ
Ｗ_ｘ：ｘ方向のウェルサイズ×撮像倍率
Ｗ_ｙ：ｙ方向のウェルサイズ×撮像倍率
Ｓ_ｘ：ｘ方向のウェル間隔×撮像倍率
Ｓ_ｙ：ｙ方向のウェル間隔×撮像倍率
Ｐ_ｘ：ｘ方向のウェルピッチ×撮像倍率
Ｐ_ｙ：ｙ方向のウェルピッチ×撮像倍率
ｍ_ｘ１：ｘ方向のはみだし量
ｍ_ｘ２：ｘ方向のはみだし量
ｍ_ｙ１：ｙ方向のはみだし量
ｍ_ｙ２：ｙ方向のはみだし量
ｍ_ｘ：ｘ方向のはみだし割合
ｍ_ｙ：ｙ方向のはみだし割合
ａ，ｂ，ｃ，ｄ：正の整数
である。

各ウェルのピッチに撮像倍率を乗じた値（Ｗ_ｘおよびＷ_ｙ）が、カメラ８の画素ピッチ（ｐｉｘｅｌ_ｘおよびｐｉｘｅｌ_ｙ）の２倍以上の整数倍になるように、各ウェルおよび／またはカメラ８が構成される。たとえば、画像中で拡大されたウェルの一辺が、整数個の画素（ただし２個以上。図５の例では４個）に及ぶように構成される。とくに、ウェルは、ウェルのピッチに撮像倍率を乗じた値が、カメラ８の画素ピッチの５倍以上の整数倍になるように構成されていると、１つのウェルを十分な数（たとえば２５個以上）の画素でカバーすることができ好適である。

本実施例によれば、「ウェルのピッチ×撮像倍率」が「ピクセルピッチ」の２倍以上の整数倍とすることが好適である。たとえば、「ウェルのピッチ×撮像倍率」が「ピクセルピッチ」の２倍である場合、Ｘ軸方向およびＹ軸方向において、それぞれウェルに１ピクセル、ウェル隔壁に１ピクセルが割り当てられる場合がある。ウェル内のデータ点数を多くするためには、正の整数(a、c)を大きな値にすることができる。

［実施例４］
以下、図１１を用いて、実施例４について説明する。実施例１～３のいずれかと共通する部分については、説明を省略する場合がある。

実施例４は、ウェル形状が四角形でなく円形や六角形でも実施例１の撮像視野調整を行うことでウェル内のデータ点数を増加させること可能であることを示すものである。実施例４において、ウェルは円形ウェル４００とする。撮像範囲を調整せずに撮像すると、ウェル内においてフルでカバーするピクセル数はたとえば８個／ウェル程度である。一方で、撮像範囲調整を行うことで、フルでカバーするピクセル数は９個／ウェルと増やすことができる。

ある変形例では、六角形ウェルを用いてもデータ点数を増加させることが可能である。ただし、一般的にカメラ８のピクセル形状は四角形であることから、四角形ウェル１００（図５）の方が相性が良く、多くのデータ点数を稼ぐことが可能である。また、それと同様にマルチウェルは、六方最密充填（すなわち各行が半列ずつずれた構成）に配列するよりも格子状（すなわち各行の各列が直線上に配列された構成）に配列されている方が、データ点数を増やす観点において良いといえる。

ウェルの形状は、たとえば、円形であって、直径が５μｍ以上かつ１００μｍ以下であるように構成することができる。または、六角形であって、外接円の直径が５μｍ以上かつ１００μｍ以下であるように構成することができる。または、正方形であって、１辺の長さが５μｍ以上かつ１５０μｍ以下であるように構成することができる。このような構成は、既存の撮像システムとよく適合する。

［実施例５］
以下、図１２を用いて、実施例５について説明する。実施例１～４のいずれかと共通する部分については、説明を省略する場合がある。

実施例５は、四角形ウェルを用いて撮像範囲調整方法を実行することで得られる効果について示すものである。６．５×６．５μｍのピクセルサイズのカメラ８と、外接円の直径が６０μｍの六角形ウェルとを用いる。

顕微鏡の撮像倍率が１．１６倍である場合、六角形ウェルにおいてフルでカバーしているピクセル（フクピクセル）の数は平均で５７個程度である。フルピクセルカバー率をウェル面積に対するフルピクセルの総面積と定義したとき、カバー率は７６．５％となる。一方で、一辺が４４．８３μｍの正方形ウェルを用いて同一の測定系で撮像範囲調整を行う場合、正方形ウェルにおけるフルピクセル数は６４個となり、フルピクセルカバー率はほぼ１００％を実現する。

ウェルピッチとピクセルピッチを調整することで、測定における有効ピクセル数を増加させることが可能である。さらに、六角形ウェルと四角形ウェルで同一のデータ点数を取得する場合、四角形ウェルを利用することでウェル面積を縮小化することが可能である。これにより、一度に測定できるウェル数を増加させることを可能とする。例えば、図１２の条件においては、約２５％のウェル面積の縮小化が可能である。したがって、六角形ウェルで２００００個配列できるチップがある場合、四角形ウェルでは２５０００個配列することが可能となる。

［実施例６］
以下、図１３を用いて、実施例６について説明する。実施例１～５のいずれかと共通する部分については、説明を省略する場合がある。

実施例６は、図１２の条件からピクセルサイズやウェルサイズを変更しても同様の効果を取得可能であることを示すものである。カメラ８は、センサのピクセルサイズを変更可能であり、たとえば数種類のうちから選択可能である。例えば、６．５×６．５μｍのピクセルサイズから４．５×４．５μｍのピクセルサイズに変更する場合、実施例３の計算式に従い、ウェルサイズを適切に変更することで、変更前後でデータ点数を同一に維持することが可能である。

６０μｍのウェルサイズから３０μｍのウェルサイズに変更する場合、同一の測定系ではデータ点数が減少してしまう。そのような場合、撮像システムのカメラレンズ７を変更し、撮像倍率を２倍に変更する。それに伴い、データ点数を増加させることが可能である。

以上、本実施例により、本技術はカメラの変更やマルチウェルのサイズ変更があった場合においても容易に対応し、データ点数を増加させることが可能である。

［実施例７］
以下、図１４を用いて、実施例７について説明する。実施例１～６のいずれかと共通する部分については、説明を省略する場合がある。

実施例７は、撮像範囲調整後（たとえば図２の処理が完了した後）に取得するデータにおいて、信号解析方法を提供するものである。画像中の領域は、ウェルをフルでカバーしているピクセルの領域５００と、ウェルを部分的にカバーしているピクセルの領域５０１と、ウェルを全くカバーしていないピクセルの領域５０２との３つに分けられる。

信号解析には、ウェルをフルでカバーしているピクセル（ピクセルの全体が撮像対象に対応するピクセル）の領域５００と、ウェルを全くカバーしていないピクセル（ピクセルの全体が背景に対応するピクセル）の領域５０２とを利用し、ウェルを部分的にカバーしているピクセル（ピクセルの一部が撮像対象に対応し、ピクセルの他の一部が背景に対応するピクセル）の領域５０１は利用しない。

たとえば、ピクセル強度のヒストグラムに基づいて調整を行う場合、ピクセル強度のヒストグラムは、領域５００のピクセル強度と、領域５０２のピクセル強度とを含むが、領域５０１のピクセル強度を含まない。標準偏差を用いる場合にも同様にしてピクセルを限定することができる。

領域５００の強度をシグナル強度とし、領域５０２の強度をバックグラウンド強度とする。解析では、各領域内のピクセルを最小で１ピクセル、最大で全ピクセル使用することができる。信号強度をそのまま、または、信号強度からバックグラウンド強度を減算した値を使用しても良い。また、信号強度やバックグラウンド強度の各平均強度を算出して解析に使用してもよい。

このような信号解析は、たとえばデジタルＰＣＲにおけるウェルカウントに応用可能である。領域５００および領域５０２のみを使用し、領域５０１を捨てることにより、発光しているウェルと発光していないウェルとをより正確に判別することができ、ウェル数をより正確にカウントすることができる。

［その他の実施例］
なお、本発明は上記した実施例に限定されるものではなく、様々な変形例が含まれる。例えば、上記した実施例は本発明を分かりやすく説明するために詳細に説明したものであり、必ずしも説明した全ての構成を備えるものに限定されるものではない。また、ある実施例の構成の一部を他の実施例の構成に置き換えることが可能であり、また、ある実施例の構成に他の実施例の構成を加えることも可能である。また、各実施例の構成の一部について、他の構成の追加・削除・置換をすることが可能である。

１：光源
２：レンズ
３：ハーフミラー
４：複数の測定対象
５：ＸＹＺ軸ステージ
６：Θ軸ステージ
７：カメラレンズ
８：カメラ（光検出器）
９：撮像部回路
１０：制御回路
１１：メモリ
１２：解析部
１３：コンピュータ
１４：操作部
１５：表示部
１００：四角形ウェル
２００：基準マーカ
３００：ピクセル
３０１：強度０のピクセル
３０２：強度２．５のピクセル
３０３：強度４のピクセル
３０４：強度５のピクセル
３０５：強度１０のピクセル
４００：円形ウェル
５００：ウェルをフルでカバーしているピクセルの領域
５０１：ウェルを部分的にカバーしているピクセルの領域
５０２：ウェルをカバーしていないピクセルの領域

Claims (15)

1. 平面上に配置された複数の測定対象について、デジタルＰＣＲの反応による色の変化を撮像する、撮像システムであって、
   前記撮像システムは、
   前記複数の測定対象に対し光を照射する光源と、
   前記複数の測定対象からの光を検出して画像を取得する光検出器と、
   １つ以上のレンズと、
   前記複数の測定対象に前記光検出器の撮像の焦点を合わせる調整機構と、
   前記光検出器と前記複数の測定対象との相対位置を変更する駆動機構と、
   デジタルカウント測定を行う解析機構と、
   を有し、
   前記駆動機構は、前記画像内で前記複数の測定対象が水平軸方向または垂直軸方向に配列するように、前記複数の測定対象および前記光検出器の少なくとも一方を前記平面内で回転させること、前記光検出器と前記複数の測定対象との相対位置を第１軸方向及び／又は前記第１軸方向と直交する第２軸方向に変更することが可能な駆動機構であって、
   前記複数の測定対象は同一形状かつ同一サイズであり、
   前記複数の測定対象は前記平面上に縦方向および横方向に等ピッチで並び、
   前記複数の測定対象のピッチに撮像倍率を乗じた値が、前記光検出器の画素ピッチの２倍以上の整数倍であり、
   前記駆動機構による前記相対位置の変更において、前記駆動機構は、前記画像内で前記複数の測定対象を前記水平軸方向及び前記垂直軸方向に配列させた後、前記相対位置を前記水平軸方向及び前記垂直軸方向の少なくとも一方において調整し、このときの撮像範囲の調整単位が前記画素ピッチ以下であることを特徴とする、撮像システム。
2. 前記光検出器からのデータを記録するメモリを備え、
   前記解析機構は、前記データを解析し、
   前記駆動機構は、前記光検出器の検出結果に応じて前記相対位置を調整することを特徴とする、請求項１に記載の撮像システム。
3. 各前記測定対象は、
   円形であって、直径が５μｍ以上かつ１００μｍ以下であるか、
   六角形であって、外接円の直径が５μｍ以上かつ１００μｍ以下であるか、または、
   正方形であって、１辺の長さが５μｍ以上かつ１５０μｍ以下である、
   ことを特徴とする、請求項１に記載の撮像システム。
4. 前記複数の測定対象のピッチに撮像倍率を乗じた前記値が、前記光検出器の画素ピッチの５倍以上の整数倍であることを特徴とする、請求項１に記載の撮像システム。
5. 前記撮像倍率は、０．４倍以上かつ２．５倍以下であることを特徴とする、請求項１に記載の撮像システム。
6. 前記測定対象の数が１００００個以上であることを特徴とする、請求項１に記載の撮像システム。
7. 前記光検出器はＣＣＤまたはＣＭＯＳカメラであることを特徴とする、請求項１に記載の撮像システム。
8. 前記光検出器の撮像素子数は１００００００個以上であることを特徴とする、請求項７に記載の撮像システム。
9. 平面上に配置された複数の測定対象について、デジタルＰＣＲの反応による色の変化を撮像するための撮像範囲調整方法であって、
   前記撮像範囲調整方法は、撮像システムによって実行され、
   前記撮像システムは、
   前記複数の測定対象に対し光を照射する光源と、
   前記複数の測定対象からの光を検出する光検出器と、
   １つ以上のレンズと、
   前記複数の測定対象に前記光検出器の撮像の焦点を合わせる調整機構と、
   前記光検出器と前記複数の測定対象との相対位置を変更する駆動機構と、
   デジタルカウント測定を行う解析機構と、
   を有し、
   前記複数の測定対象は同一形状かつ同一サイズであり、
   前記複数の測定対象は前記平面上に縦方向および横方向に等ピッチで並び、
   前記撮像範囲調整方法は、
   前記駆動機構が、前記複数の測定対象について焦点合わせを行うことと、
   前記光検出器によって前記複数の測定対象を撮像して画像を取得することと、
   前記画像内で前記複数の測定対象が水平軸方向または垂直軸方向に配列するように、前記駆動機構が前記複数の測定対象および前記光検出器の少なくとも一方を前記平面内で回転させることと、
   前記画像におけるピクセル強度のヒストグラムにおけるピークのうち、強度が最大であるピークおよび強度が最小であるピークの少なくとも一方のピーク形状に基づき、前記駆動機構が、前記光検出器と前記複数の測定対象との相対位置を前記水平軸方向又は前記垂直軸方向のうちいずれか一方に変更することと、
   前記画像におけるピクセル強度のヒストグラムにおけるピークのうち、強度が最大であるピークおよび強度が最小であるピークの少なくとも一方のピーク形状に基づき、前記駆動機構が前記相対位置を前記水平軸方向又は前記垂直軸方向の他方に変更することと、
   を備える、撮像範囲調整方法。
10. 前記駆動機構は、前記ピークの面積または前記ピークの高さに基づいて前記相対位置を変更することを特徴とする、請求項９に記載の撮像範囲調整方法。
11. 前記ピークの面積は、当該ピークにおけるピクセル強度の平均値±標準偏差の範囲内の面積であることを特徴とする、請求項１０に記載の撮像範囲調整方法。
12. 前記駆動機構は、前記ヒストグラムにおけるピークのうち、強度が最大であるピークおよび強度が最小であるピークの高さの和に基づいて、前記相対位置を変更することを特徴とする、請求項９に記載の撮像範囲調整方法。
13. 前記ヒストグラムは、
    ピクセルの全体が撮像対象に対応するピクセルのピクセル強度と、
    ピクセルの全体が背景に対応するピクセルのピクセル強度と、
    を含み、
    ピクセルの一部が撮像対象に対応し、ピクセルの他の一部が背景に対応するピクセルのピクセル強度を含まない、
    請求項９に記載の撮像範囲調整方法。
14. 平面上に配置された複数の測定対象について、デジタルＰＣＲの反応による色の変化を撮像するための撮像範囲調整方法であって、
    前記撮像範囲調整方法は、撮像システムによって実行され、
    前記撮像システムは、
    前記複数の測定対象に対し光を照射する光源と、
    前記複数の測定対象からの光を検出する光検出器と、
    １つ以上のレンズと、
    前記複数の測定対象に前記光検出器の撮像の焦点を合わせる調整機構と、
    前記光検出器と前記複数の測定対象との相対位置を変更する駆動機構と、
    デジタルカウント測定を行う解析機構と、
    を有し、
    前記複数の測定対象は同一形状かつ同一サイズであり、
    前記複数の測定対象は前記平面上に縦方向および横方向に等ピッチで並び、
    前記撮像範囲調整方法は、
    前記駆動機構が、前記複数の測定対象について焦点合わせを行うことと、
    前記光検出器によって前記複数の測定対象を撮像して画像を取得することと、
    前記画像内で前記複数の測定対象が水平軸方向または垂直軸方向に配列するように、前記駆動機構が前記複数の測定対象および前記光検出器の少なくとも一方を前記平面内で回転させることと、
    前記画像におけるピクセル強度の標準偏差に基づき、前記駆動機構が前記相対位置を前記水平軸方向又は前記垂直軸方向のうちいずれか一方に変更することと、
    前記画像におけるピクセル強度の標準偏差に基づき、前記駆動機構が前記相対位置を前記水平軸方向又は前記垂直軸方向の他方に変更することと、
    を備える、撮像範囲調整方法。
15. 前記駆動機構は、ウェル位置のピクセル強度と背景光強度の周期が一定となるように水平方向の調整を行うことを特徴とする、請求項１に記載の撮像システム。