JP7799621B2 - 糸状菌細胞におけるタンパク質産生の増強のための組成物及び方法 - Google Patents

Description

本開示は一般に、分子生物学、生化学、工業発酵、タンパク質の産生、糸状菌などの分野に関する。したがって、本開示の特定の実施形態は、目的タンパク質の産生に使用するための、変異型及び／又は遺伝子改変された糸状菌細胞、並びにその方法に関する。

関連出願の相互参照
本出願は、２０２０年４月２２日に出願された米国仮特許出願第６３／０１３，７４１号の利益を主張するものであり、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。

配列表
本明細書に添付して提出した配列表テキストファイルには、２０２１年３月２２日に作成した、サイズが１３６キロバイトのファイル「ＮＢ４１７５４ＷＯＰＣＴ＿ＳｅｑｕｅｎｃｅＬｉｓｔｉｎｇ．ｔｘｔ」が含まれている。この配列表は、３７Ｃ．Ｆ．Ｒ．§１．５２（ｅ）に適合しており、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。

リグノセルロース植物物質の成分であるセルロースは、自然界に見られる最も豊富な多糖類である。同様に、糸状菌が植物バイオマスの効率的な分解菌であることが当該技術分野で知られており、実際、工業に関連したリグノセルロース分解酵素（以下、集合的に「セルラーゼ」酵素と呼ぶ）の主要な供給源である。例えば、糸状菌は、セルロースのβ－（１，４）結合グリコシド結合を加水分解してグルコースを生成する細胞外セルラーゼ酵素（例えば、セロビオヒドロラーゼ、エンドグルカナーゼ、β－グルコシダーゼ）を産生する（すなわち、それにより、これらの糸状菌に増殖のためにセルロースを利用する能力を付与する）ことが知られている。特に、糸状菌トリコデルマ・リーゼイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉ）（Ｔ．リーゼイ（Ｔ．ｒｅｅｓｅｉ）；菌類ヒポクレア・ジェコリナ（Ｈｙｐｏｃｒｅａ ｊｅｃｏｒｉｎａ）のアナモルフ）は、セルラーゼ酵素の効率的な産生菌であることが知られており（例えば、国際公開第１９９８／１５６１９号パンフレット、国際公開第２００５／０２８６３６号パンフレット、国際公開第２００６／０７４００５号パンフレット、国際公開第１９９２／０６２２１号パンフレット、国際公開第１９９２／０６２０９号パンフレット、国際公開第１９９２／０６１８３号パンフレット、国際公開第２００２／１２４６５号パンフレットなどを参照）、このため、糸状菌は、セルロース由来のエタノール、織物及び衣類、洗剤、繊維、食品及び飼料添加物、並びに他の工業用途などの商品の生産に有用な酵素を生産する能力のために利用されている。

これらの工業関連酵素のトリコデルマ属（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）の真菌細胞における発現／産生は、増殖に利用できる炭素源に依存することが知られている。糸状菌によるセルラーゼ酵素の発現／産生は、エネルギー消費プロセスであり、したがって、これらの酵素の効率的な産生を確実にするために、誘導及び抑制の両機構が発達してきた。例えば、植物細胞壁物質の分解に必要な酵素（すなわち、リグノセルロース分解酵素、例えば、セルラーゼ／ヘミセルラーゼ）をコードする種々の遺伝子は、「誘導」基質の存在下で「活性化」され、植物バイオマスよりも好ましい、容易に代謝される炭素源（例えば、Ｄ－グルコース）の存在下では「炭素カタボライト抑制」（「ＣＣＲ」）として知られる機構により「抑制」される。このように、セルラーゼ遺伝子はグルコースによって強く抑制され、セルロース及び特定の二糖類（例えば、ソホロース、ラクトース、ゲンチビオース）によって数千倍誘導される。例えば、主要なセロビオヒドロラーゼ１（ｃｂｈ１）の発現レベルは、グルコース含有培地と比較して、セルロース又はソホロースなどの誘導炭素源を含有する培地で数千倍「アップレギュレート」される（Ｉｌｍｅｎ ｅｔ ａｌ．，１９９７）。

一般に、トリコデルマ属（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）などの糸状菌による酵素／ポリペプチドの商業規模生産は、一般に、バッチ法、流加法、及び連続フロープロセスなどの、固体培養又は浸漬培養による。例えば、トリコデルマ属（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）における工業的セルラーゼ生産で最も問題であり、且つ高価な態様の１つは、トリコデルマ属（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）宿主細胞に適切なインデューサー（すなわち、誘導基質）を提供することにある。例えば、研究室規模実験の場合と同様、商業規模のセルラーゼ（酵素）の生産は、固体セルロース（すなわち、誘導基質）上で真菌細胞を増殖させることによって、又は「ラクトース」などの二糖インデューサー（すなわち、誘導基質）の存在下で細胞を培養することによって「誘導」される。

残念ながら、工業的規模では、「誘導」の両方法はセルラーゼ生産に関連する高いコストをもたらす欠点を有し、したがって、そのような生産のために高価な誘導基質（例えば、ソホロース、ラクトースなど）を提供する必要又は要求なしに、糸状菌による酵素／ポリペプチドの費用効率のよい商業規模の生産のための継続的且つ満たされていないニーズが当該技術分野において未だ残っている。本明細書中に記載され、且つ例示されているように、本開示の変異型及び／又は改変真菌細胞（株）は、誘導基質の存在下又は非存在下での目的タンパク質の発現／産生の増強のための工業規模の発酵プロセスにおける使用によく適している。

本開示の特定の実施形態は、ポリペプチドの商業規模での生産に使用するための、変異型及び遺伝子改変されたトリコデルマ属（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）の真菌細胞に関する。より詳細には、本開示の特定の実施形態は、１種又は複数のリグノセルロース分解酵素をコードする１つ又は複数の遺伝子の発現をアップレギュレートすることができる新規バリアントＡｃｅ３転写因子（ＴＦ）タンパク質に関する。したがって、特定の他の実施形態は、本明細書に開示されるそのような新規（すなわち、バリアント）Ａｃｅ３転写因子（ＴＦ）タンパク質をコードするポリヌクレオチド（核酸配列）に関する。特定の他の実施形態は、本明細書に開示されるバリアントＡｃｅ３転写因子（ＴＦ）タンパク質を含み、且つ発現するトリコデルマ属（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）菌細胞（株）を構築し、改変し、試験し、スクリーニングし、単離するなどのための組成物及び方法に関する。

したがって、本開示の特定の実施形態は、バリアントＡｃｅ３ＴＦタンパク質をコードする単離されたポリヌクレオチドであって、バリアントＡｃｅ３ＴＦは、配列番号２のアミノ酸位置１～６７２に対して少なくとも９０％の配列同一性を含み、且つ配列番号２の６７３～６８９位から選択される１つ又は複数のＣ末端アミノ酸残基の遺伝子改変を含むポリヌクレオチドを対象としている。関連する実施形態では、ポリヌクレオチドは、配列番号２９に対して少なくとも９０％の配列同一性を含む機能的Ｎ末端亜鉛二核クラスター（Ｚｎ_２Ｃｙｓ_６）ＤＮＡ結合ドメインを含むバリアントＡｃｅ３ＴＦをコードする。他の実施形態では、配列番号２のアミノ酸位置６７３～６８９から選択される１つ又は複数のＣ末端アミノ酸残基の遺伝子改変は、アミノ酸欠失、アミノ酸挿入、アミノ酸置換、又はこれらの組み合わせを含む。

ポリヌクレオチドの特定の他の実施形態では、１つ又は複数のＣ末端アミノ酸残基の遺伝子改変は、少なくとも配列番号２の最後の７個のＣ末端アミノ酸位置６８３～６８９の欠失、少なくとも配列番号２の最後の８個のＣ末端アミノ酸位置６８２～６８９の欠失、少なくとも配列番号２の最後の９個のＣ末端アミノ酸位置６８１～６８９の欠失、少なくとも配列番号２の最後の１０個のＣ末端アミノ酸位置６８０～６８９の欠失、少なくとも配列番号２の最後の１１個のＣ末端アミノ酸位置６７９～６８９の欠失、少なくとも配列番号２の最後の１２個のＣ末端アミノ酸位置６７８～６８９の欠失、少なくとも配列番号２の最後の１３個のＣ末端アミノ酸位置６７７～６８９の欠失、少なくとも配列番号２の最後の１４個のＣ末端アミノ酸位置６７６～６８９の欠失、少なくとも配列番号２の最後の１５個のＣ末端アミノ酸位置６７５～６８９の欠失、少なくとも配列番号２の最後の１６個のＣ末端アミノ酸位置６７４～６８９の欠失、又は少なくとも配列番号２の最後の１７個のＣ末端アミノ酸位置６７３～６８９の欠失を含む。

特定の実施形態では、本開示の単離されたポリヌクレオチドは、配列番号９～配列番号１８のいずれか１つから選択されるアミノ酸配列に対して少なくとも９０％の配列同一性を含むバリアントＡｃｅ３ ＴＦをコードする。

本開示の特定の他の実施形態は、バリアントＡｃｅ３転写因子（ＴＦ）タンパク質をコードする変異ａｃｅ３遺伝子を含む単離されたトリコデルマ属（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）菌変異細胞であって、バリアントＡｃｅ３ＴＦタンパク質は、配列番号２のアミノ酸位置１～６７２に対して少なくとも９０％の配列同一性を含み、且つ、配列番号２の６７３～６８９位から選択される１つ又は複数の変異したＣ末端アミノ酸残基を含むトリコデルマ属（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）菌変異細胞に関する。特定の実施形態では、変異細胞がリグノセルロース分解酵素の産生に好適な条件下で発酵される場合、変異細胞のバリアントＡｃｅ３ ＴＦタンパク質は、誘導基質の非存在下でリグノセルロース分解酵素をコードする遺伝子の発現をアップレギュレートする。

本開示の特定の他の実施形態は、配列番号２に対して少なくとも９０％の配列同一性を含むＡｃｅ３転写因子（ＴＦ）タンパク質をコードするａｃｅ３遺伝子を含む親トリコデルマ属（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）菌細胞に由来する遺伝子改変トリコデルマ属（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）真菌細胞に関し、この遺伝子改変細胞は、配列番号２のアミノ酸位置１～６７２に対して少なくとも９０％の配列同一性を含むバリアントＡｃｅ３ ＴＦタンパク質をコードし、且つ、配列番号２の６７３～６８９位から選択される１つ又は複数のＣ末端アミノ酸残基の遺伝子改変を含む改変ａｃｅ３遺伝子を含む。

本開示の特定の他の実施形態は、配列番号４に対して少なくとも９０％の配列同一性を含むバリアントＡｃｅ３転写因子（ＴＦ）タンパク質をコードする変異ａｃｅ３遺伝子を含む親トリコデルマ属（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）菌細胞に由来する遺伝子改変トリコデルマ属（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）真菌細胞であって、配列番号４のＮ末端は、配列番号２９に記載のインタクトな亜鉛二核（Ｚｎ_２Ｃｙｓ_６）ＤＮＡ結合を含まず、遺伝子改変細胞は、配列番号２の１～６７２位に対して少なくとも９０％の配列同一性を含むバリアントＡｃｅ３ ＴＦタンパク質をコードする改変ａｃｅ３遺伝子を含み、配列番号２のＮ末端は、配列番号２９に記載のインタクトな亜鉛二核（Ｚｎ_２Ｃｙｓ_６）ＤＮＡ結合を含み、且つ配列番号２の６７３～６８９位から選択される１つ又は複数のＣ末端アミノ酸残基の遺伝子改変を含む遺伝子改変トリコデルマ属（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）真菌細胞に関する。

特定の他の実施形態では、本開示は、誘導基質の非存在下でリグノセルロース分解酵素をコードする遺伝子の発現を誘導するバリアントＡｃｅ３ ＴＦタンパク質をスクリーニングする方法に関する。他の実施形態では、本開示は、誘導基質の非存在下でレポータータンパク質をコードする遺伝子の発現を誘導するバリアントＡｃｅ３ ＴＦタンパク質をスクリーニングする方法を提供する。他の実施形態では、本開示は、誘導基質の非存在下で、トリコデルマ属（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）真菌細胞においてリグノセルロース分解酵素を産生させるための方法を対象とする。特定の他の実施形態では、本開示は、誘導基質の非存在下で、トリコデルマ属（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）菌細胞において目的タンパク質（ＰＯＩ）を産生させるための方法に関する。

図１は、Ａｃｅ３－Ｓタンパク質（配列番号４）、Ａｃｅ３－Ｌタンパク質（配列番号６）及びＡｃｅ３－ＬＣタンパク質（配列番号２）のアミノ酸配列アライメントを示す。図１Ａに示すように、亜鉛二核クラスター（Ｚｎ_２Ｃｙｓ_６）ＤＮＡ結合ドメインの６つのＮ末端システインアミノ酸は、灰色の陰影付きシステイン（Ｃ）で示されている。図１Ａに示すように、Ａｃｅ３－Ｓタンパク質（配列番号４）は、トランケートされたＮ末端を含み、亜鉛（Ｚｎ_２Ｃｙｓ_６）ＤＮＡ結合ドメインの６つのシステイン残基のうちの２つが、Ａｃｅ３－Ｌタンパク質及びＡｃｅ３－ＬＣタンパク質のＮ末端に対して欠損（欠失）している。同様に、図１Ｂに示すように、Ａｃｅ３－Ｌタンパク質のＣ末端は、Ａｃｅ３－Ｓタンパク質及びＡｃｅ３－ＬＣタンパク質に対してトランケートされており、Ａｃｅ３－Ｓタンパク質及びＡｃｅ３－ＬＣタンパク質は、アスパラギン酸（Ｄ）で終わるＡｃｅ３－Ｌタンパク質のトランケートされたＣ末端に対して、グリシン（Ｇ）で終わる野生型Ｃ末端を含む。

図２は、６８９個のアミノ酸残基、及び６８９位のグリシン（Ｇ）で終わる野生型Ｃ末端を含むＡｃｅ３－ＬＣタンパク質のアミノ酸配列を示す（図２Ａ、配列番号２）。さらに、図２は、増分Ｃ末端トランケーションを含む１６の異なるＡｃｅ３タンパク質のアミノ酸配列（すなわち、野生型Ａｃｅ３－ＬＣタンパク質のＣ末端に対して；配列番号２）を示す。図２に示すように、Ａｃｅ３ Ｃ－ｔｅｒｍ－５タンパク質（図２Ａ；配列番号７）は、６８４個のアミノ酸残基、及び６８４位のセリン（Ｓ）で終わるＣ末端での５個のアミノ酸トランケーション（ＷＴ Ａｃｅ３ Ｃ末端に対して；配列番号２）を含み、Ａｃｅ３ Ｃ－ｔｅｒｍ－６タンパク質（図２Ａ；配列番号８）は、６８３個のアミノ酸残基、及び６８３位のトレオニン（Ｔ）で終わるＣ末端での６個のアミノ酸トランケーション（ＷＴ Ａｃｅ３ Ｃ末端に対して；配列番号２）を含み、Ａｃｅ３ Ｃ－ｔｅｒｍ－７タンパク質（図２Ｂ；配列番号９）は、６８２位のアスパラギン（Ｎ）で終わるＣ末端での７個のアミノ酸トランケーション（ＷＴ Ａｃｅ３ Ｃ末端に対して；配列番号２）を有する６８２個のアミノ酸残基を含み、Ａｃｅ３ Ｃ－ｔｅｒｍ－８タンパク質（図２Ｂ；配列番号１０）は、６８１位のアルギニン（Ｒ）で終わるＣ末端での８個のアミノ酸トランケーション（ＷＴ Ａｃｅ３ Ｃ末端に対して；配列番号２）を有する６８１個のアミノ酸残基を含み、Ａｃｅ３ Ｃ－ｔｅｒｍ－９タンパク質（図２Ｂ；配列番号１１）は、６８０位のロイシン（Ｌ）で終わるＣ末端での９個のアミノ酸トランケーション（ＷＴ Ａｃｅ３ Ｃ末端に対して；配列番号２）を有する６８０個のアミノ酸残基を含み、Ａｃｅ３ Ｃ－ｔｅｒｍ－１０タンパク質（図２Ｃ；配列番号１２）は、６７９位のグルタミン（Ｑ）で終わるＣ末端での１０個のアミノ酸トランケーション（ＷＴ Ａｃｅ３ Ｃ末端に対して；配列番号２）を有する６７９個のアミノ酸残基を含み、Ａｃｅ３ Ｃ－ｔｅｒｍ－１２タンパク質（図２Ｃ；配列番号１３）は、６７７位のセリン（Ｓ）で終わるＣ末端での１２個のアミノ酸トランケーション（ＷＴ Ａｃｅ３ Ｃ末端に対して；配列番号２）を有する６７７個のアミノ酸残基を含み、Ａｃｅ３ Ｃ－ｔｅｒｍ－１３タンパク質（図２Ｃ；配列番号１４）は、６７６位のアラニン（Ａ）で終わるＣ末端での１３個のアミノ酸トランケーション（ＷＴ Ａｃｅ３ Ｃ末端に対して；配列番号２）を有する６７６個のアミノ酸残基を含み、Ａｃｅ３ Ｃ－ｔｅｒｍ－１４タンパク質（図２Ｄ；配列番号１５）は、６７５位のリシン（Ｋ）で終わるＣ末端での１４個のアミノ酸トランケーション（ＷＴ Ａｃｅ３ Ｃ末端に対して；配列番号２）を有する６７５個のアミノ酸残基を含み、Ａｃｅ３ Ｃ－ｔｅｒｍ－１５タンパク質（図２Ｄ；配列番号１６）は、６７４位のセリン（Ｓ）で終わるＣ末端での１５個のアミノ酸トランケーション（ＷＴ Ａｃｅ３ Ｃ末端に対して；配列番号２）を有する６７４個のアミノ酸残基を含み、Ａｃｅ３ Ｃ－ｔｅｒｍ－１６タンパク質（図２Ｄ；配列番号１７）は、６７３位のアスパラギン酸（Ｄ）で終わるＣ末端での１６個のアミノ酸トランケーション（ＷＴ Ａｃｅ３ Ｃ末端に対して；配列番号２）を有する６７３個のアミノ酸残基を含み、Ａｃｅ３ Ｃ－ｔｅｒｍ－１７タンパク質（図２Ｅ；配列番号１８）は、６７２位のロイシン（Ｌ）で終わるＣ末端での１７個のアミノ酸トランケーション（ＷＴ Ａｃｅ３ Ｃ末端に対して；配列番号２）を有する６７２個のアミノ酸残基を含み、Ａｃｅ３ Ｃ－ｔｅｒｍ－１８タンパク質（図２Ｅ；配列番号１９）は、６７１位のアルギニン（Ｒ）で終わるＣ末端での１８個のアミノ酸トランケーション（ＷＴ Ａｃｅ３ Ｃ末端に対して；配列番号２）を有する６７１個のアミノ酸残基を含み、Ａｃｅ３ Ｃ－ｔｅｒｍ－１９タンパク質（図２Ｅ；配列番号２０）は、６７０位のトレオニン（Ｔ）で終わるＣ末端での１９個のアミノ酸トランケーション（ＷＴ Ａｃｅ３ Ｃ末端に対して；配列番号２）を有する６７０個のアミノ酸残基を含み、Ａｃｅ３ Ｃ－ｔｅｒｍ－２０タンパク質（図２Ｆ；配列番号２１）は、６６９位のロイシン（Ｌ）で終わるＣ末端での２０個のアミノ酸トランケーション（ＷＴ Ａｃｅ３ Ｃ末端に対して；配列番号２）を有する６６９個のアミノ酸残基を含み、Ａｃｅ３ Ｃ－ｔｅｒｍ－２５タンパク質（図２Ｆ；配列番号２２）は、６６４位のバリン（Ｖ）で終わるＣ末端での２５個のアミノ酸トランケーション（ＷＴ Ａｃｅ３ Ｃ末端に対して；配列番号２）を有する６６４個のアミノ酸残基を含む。

図３は、Ａｃｅ３亜鉛二核クラスター（Ｚｎ_２Ｃｙｓ_６）ＤＮＡ結合ドメインのアミノ酸配列（配列番号：２９）を示し、これは６個のシステイン（Ｃ）残基（太字で下線を付したＣ残基で示される）を含み、ＤＮＡ結合ドメインはＡｃｅ３－ＬＣタンパク質（配列番号２）及びＡｃｅ３－Ｌ（配列番号６）タンパク質のアミノ酸位置７３～１０９内に位置する。

図４は、アミノ酸位置６８９のグリシン（Ｇ）で終わる、Ａｃｅ３－ＬＣタンパク質（配列番号２）の野生型Ｃ末端を示す。図４に示すように、太字テキストで示されたＣ末端アミノ酸には負の数字が割り当てられ、最もＣ末端のアミノ酸位置（すなわち、グリシン（Ｇ）；６８９位）には負の１（－１）が割り当てられ、６８５位のトレオニン（Ｔ）には負の５（－５）が割り当てられ、６８０位のロイシン（Ｌ）には負の１０（－１０）が割り当てられる、などである。本明細書の実施例及び詳細な説明に一般的に記載されるように、図４に示された、太字のＣ末端アミノ酸及び灰色の陰影（すなわち、－７（Ｔ）スレオニン～－１７（Ｄ）アスパラギン酸）を有するＡｃｅ３タンパク質のＣ末端アミノ酸領域は、遺伝子改変（例えば、トランケーション、内部欠失、挿入、置換、及びこれらの組み合わせ）に特に好適な領域である。

図５は、野生型Ｃ末端（すなわち、アミノ酸位置６４１～６８９；配列番号２）を有するＡｃｅ３－ＬＣと、Ａｃｅ３－ＬＣ Ｃ－ｔｅｒｍ－７タンパク質のＣ末端（アミノ酸位置６４１～６８２；配列番号：９）及びＡｃｅ３－ＬＣ Ｃ－ｔｅｒｍ－１７タンパク質のＣ末端（アミノ酸位置６４１～６７２；配列番号１８）のアライメントを示す。図５に示すように、Ａｃｅ３タンパク質の太字で下線を引いたＣ末端アミノ酸残基（ＤＳＫＡＳＤＱＬＲＮ）は、遺伝子改変（例えば、トランケーション、内部欠失、挿入、置換、及びこれらの組み合わせ）に特に好適な領域である。

図６は、グリシンで終わる野生型（すなわち、完全長）Ｃ末端を含むＡｃｅ３タンパク質（例えば、Ａｃｅ３－ＬＣタンパク質；配列番号２）をコードするポリヌクレオチド配列を含むプラスミドｐＹＬ７２の概略マップである。

図７は、誘導（ラクトース；Ｌａｃ）及び非誘導（グルコース；Ｇｌｕ）条件下で発酵させたＴ．リーゼイ（Ｔ．ｒｅｅｓｅｉ）株の平均総分泌タンパク質力価を示す。図７に示すように、スクリーニングしたＴ．リーゼイ（Ｔ．ｒｅｅｓｅｉ）株には、対照株（ＲＬ－Ｐ３７）、野生型Ｃ末端を含むＡｃｅ３－ＬＣタンパク質（配列番号２）を発現する「Ｃ－ｔｅｒｍ－ＷＴ」株、５個のアミノ酸のＣ末端トランケーションを含むバリアントＡｃｅ３－ＬＣタンパク質（配列番号７）を発現する「Ｃ－ｔｅｒｍ－５」株、１０個のアミノ酸のＣ末端トランケーションを含むバリアントＡｃｅ３－ＬＣタンパク質（配列番号１２）を発現する「Ｃ－ｔｅｒｍ－１０」株、１１個のアミノ酸のＣ末端トランケーションを含むバリアントＡｃｅ３－ＬＣタンパク質（配列番号６）を発現する「Ｃ－ｔｅｒｍ－１１」株、１５個のアミノ酸のＣ末端トランケーションを含むバリアントＡｃｅ３－ＬＣタンパク質（配列番号１６）を発現する「Ｃ－ｔｅｒｍ－１５」株、２０個のアミノ酸のＣ末端トランケーションを含むバリアントＡｃｅ３－ＬＣタンパク質（配列番号２１）を発現する「Ｃ－ｔｅｒｍ－２０」株、２５個のアミノ酸のＣ末端トランケーションを含むバリアントＡｃｅ３－ＬＣタンパク質（配列番号２２）を発現する「Ｃ－ｔｅｒｍ－２５」株が含まれた。図７に示すように、親対照株ＲＬ－Ｐ３７はラクトース上で（すなわち、誘導条件下で）のみ多量のタンパク質を産生することができ、グルコース上で（すなわち、非誘導条件下で）は、最小の基礎レベルのタンパク質を産生した。対照的に、Ｃ末端に１０個、１１個又は１５個のアミノ酸のトランケーションを含むＡｃｅ３－ＬＣバリアントを発現する娘株（細胞）（すなわち、それぞれ配列番号：１２、配列番号６及び配列番号１６）は、ラクトース（誘導）及びグルコース（非誘導）の両条件下で、タンパク質産生の増加を示した。

図８は、誘導（ラクトース；Ｌａｃ）及び非誘導（グルコース；Ｇｌｕ）条件下で発酵された２～４の生物学的複製物からの平均総分泌タンパク質力価及び標準偏差を示す。図８に示すように、スクリーニングしたＴ．リーゼイ（Ｔ．ｒｅｅｓｅｉ）株には、対照株（ＲＬ－Ｐ３７）、野生型Ｃ末端を含むＡｃｅ３－ＬＣタンパク質（配列番号２）を発現する「Ｃ－ｔｅｒｍ－ＷＴ」株、５個のアミノ酸のＣ末端トランケーションを含むバリアントＡｃｅ３－ＬＣタンパク質（配列番号７）を発現する「Ｃ－ｔｅｒｍ－５」株、６個のアミノ酸のＣ末端トランケーションを含むバリアントＡｃｅ３－ＬＣタンパク質（配列番号８）を発現する「Ｃ－ｔｅｒｍ－６」株、７個のアミノ酸のＣ末端トランケーションを含むバリアントＡｃｅ３－ＬＣタンパク質（配列番号９）を発現する「Ｃ－ｔｅｒｍ－７」株、８個のアミノ酸のＣ末端トランケーションを含むバリアントＡｃｅ３－ＬＣタンパク質（配列番号１０）を発現する「Ｃ－ｔｅｒｍ－８」株、９個のアミノ酸のＣ末端トランケーションを含むバリアントＡｃｅ３－ＬＣタンパク質（配列番号１１）を発現する「Ｃ－ｔｅｒｍ－９」株、１０個のアミノ酸のＣ末端トランケーションを含むバリアントＡｃｅ３－ＬＣタンパク質（配列番号１２）を発現する「Ｃ－ｔｅｒｍ－１０」株、１１個のアミノ酸のＣ末端トランケーションを含むバリアントＡｃｅ３－ＬＣタンパク質（配列番号６）を発現する「Ｃ－ｔｅｒｍ－１１」株、１２個のアミノ酸のＣ末端トランケーションを含むバリアントＡｃｅ３－ＬＣタンパク質（配列番号１３）を発現する「Ｃ－ｔｅｒｍ－１２」株、１３個のアミノ酸のＣ末端トランケーションを含むバリアントＡｃｅ３－ＬＣタンパク質（配列番号１４）を発現する「Ｃ－ｔｅｒｍ－１３」株、１４個のアミノ酸のＣ末端トランケーションを含むバリアントＡｃｅ３－ＬＣタンパク質（配列番号１５）を発現する「Ｃ－ｔｅｒｍ－１４」株、１５個のアミノ酸のＣ末端トランケーションを含むバリアントＡｃｅ３－ＬＣタンパク質（配列番号１６）を発現する「Ｃ－ｔｅｒｍ－１５」株、１６個のアミノ酸のＣ末端トランケーションを含むバリアントＡｃｅ３－ＬＣタンパク質（配列番号１７）を発現する「Ｃ－ｔｅｒｍ－１６」株、１７個のアミノ酸のＣ末端トランケーションを含むバリアントＡｃｅ３－ＬＣタンパク質（配列番号１８）を発現する「Ｃ－ｔｅｒｍ－１７」株、１８個のアミノ酸のＣ末端トランケーションを含むバリアントＡｃｅ３－ＬＣタンパク質（配列番号１９）を発現する「Ｃ－ｔｅｒｍ－１８」株、１９個のアミノ酸のＣ末端トランケーションを含むバリアントＡｃｅ３－ＬＣタンパク質（配列番号２０）を発現する「Ｃ－ｔｅｒｍ－１９」株、２０個のアミノ酸のＣ末端トランケーションを含むバリアントＡｃｅ３－ＬＣタンパク質（配列番号２１）を発現する「Ｃ－ｔｅｒｍ－２０」株、２５個のアミノ酸のＣ末端トランケーションを含むバリアントＡｃｅ３－ＬＣタンパク質（配列番号２２）を発現する「Ｃ－ｔｅｒｍ－２５」株が含まれた。

図９は、Ｔ４ａｂｃ株（配列番号６のＡｃｅ３タンパク質をコードするａｃｅ３トランケーション対立遺伝子を含む）、Ｔ４ａｂｃ Ａｃｅ３＿ｒｅｖ株（野生型を有するａｃｅ３タンパク質（完全長Ｃ末端；配列番号２）をコードする復帰Ａｃｅ３対立遺伝子を含む）、及びＴ４ａｂｃ ｄｅｌ－ｃｂｈ１株（ｃｂｈ１（セロビオヒドロラーゼ）遺伝子の欠失を含む）の全分泌タンパク質力価を示す。ここで、各株は２つの独立した振盪フラスコ（例えば、フラスコＡ及びフラスコＢ）において評価した。図９に示すように、完全長のＡｃｅ３をコードするように、ａｃｅ３変異がＴ４ａｂｃバックグラウンドにおいて元に戻された場合に、総分泌タンパク質力価は、Ａｃｅ３のトランケート型をコードするＴ４ａｂｃ親株と比較して、７３％減少した。

図１０は、ｐＲＡＴＴ３４６と命名されたａｃｅ３復帰カセットプラスミドの概略マップである。

図１１は、アミノ酸位置６７３に変異を有するバリアントＡｃｅ３－ＬＣタンパク質をコードするポリヌクレオチド配列（配列番号：３２）を含むプラスミドｐＡ３Ｌ０２の概略マップである。

図１２は、Ａｃｅ３－ＬのＣ末端（図１２；Ａｃｅ３－Ｌ ６４１位～６７８位；配列番号６）、Ａｃｅ３－ＬＣ－Ｖ５（図１２；Ａｃｅ３－ＬＣ－Ｖ５ ６４１位～６９２位；配列番号６７）、及びＡｃｅ３－ＬＣ－Ｖ５（６×Ｈｉｓ）（図１２；Ａｃｅ３－ＬＣ－Ｖ５（６ｘＨｉｓ）６４２位～７０１位；配列番号：６９）とアラインさせた、天然Ａｃｅ３－ＬＣ Ｃ末端（図１２；Ａｃｅ３－ＬＣアミノ酸残基位置６４１～６８９；配列番号２）のアミノ酸配列アライメントを示す。図１２に示すように、Ｖ５タグは太字のアミノ酸残基で示され、６つのヒスチジン（Ｈｉｓ）タグは下線を引いたＨアミノ酸残基で示され、これは３つのアミノ酸「ＲＴＧ」のリンカー配列によって分離されている。

図１３は、Ｖ５エピトープタグ（配列番号６７）によるＣ末端アミノ酸置換を有するバリアントＡｃｅ３－ＬＣタンパク質をコードするポリヌクレオチド配列を含むプラスミドｐＹＬ１８の概略マップである。

図１４は、誘導（Ｇｌｕ／Ｓｏｐ）条件及び非誘導（Ｇｌｕ）条件下で発酵させたＴ．リーゼイ（Ｔ．ｒｅｅｓｅｉ）株の総分泌タンパク質力価を示す。

図１５は、配列番号３０の完全長（野生型）Ａｃｅ３－ＬＣ Ｃ末端アミノ酸位置６４１～６８９を含む野生型Ａｃｅ３－ＬＣタンパク質（配列番号：２）の部分配列を示す。図１５（配列番号３０）に示すように、アミノ酸位置はＳ_６４１～Ｇ_６８９として示され、大文字はアミノ酸残基を示し、続く下付きの数字はその位置を示す。

生物学的配列の説明
配列番号１は、「Ａｃｅ３－ＬＣ」と命名したＡｃｅ３タンパク質（配列番号２）をコードする遺伝子を含む野生型トリコデルマ・リーゼイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉ）ポリヌクレオチド配列である。

配列番号２は、配列番号１によりコードされるＡｃｅ３－ＬＣタンパク質のアミノ酸配列である。

配列番号３は、「Ａｃｅ３－Ｓ」と命名したＡｃｅ３タンパク質（配列番号４）をコードする遺伝子を含むＴ．リーゼイ（Ｔ．ｒｅｅｓｅｉ）ポリヌクレオチド配列である。

配列番号４は、配列番号３によりコードされるＡｃｅ３－Ｓタンパク質のアミノ酸配列である。

配列番号５は、「Ａｃｅ３－Ｌ」と命名したＡｃｅ３タンパク質（配列番号６）をコードする遺伝子を含むＴ．リーゼイ（Ｔ．ｒｅｅｓｅｉ）ポリヌクレオチド配列である。

配列番号６は、配列番号５によりコードされるＡｃｅ３－Ｌタンパク質のアミノ酸配列である。５の範囲であり得る。

配列番号７は、「Ｃ－ｔｅｒｍ－５」と命名したバリアントＡｃｅ３タンパク質のアミノ酸配列である。

配列番号８は、「Ｃ－ｔｅｒｍ－６」と命名したバリアントＡｃｅ３タンパク質のアミノ酸配列である。

配列番号９は、「Ｃ－ｔｅｒｍ－７」と命名したバリアントＡｃｅ３タンパク質のアミノ酸配列である。

配列番号１０は、「Ｃ－ｔｅｒｍ－８」と命名したバリアントＡｃｅ３タンパク質のアミノ酸配列である。

配列番号１１は、「Ｃ－ｔｅｒｍ－９」と命名したバリアントＡｃｅ３タンパク質のアミノ酸配列である。

配列番号１２は、「Ｃ－ｔｅｒｍ－１０」と命名したバリアントＡｃｅ３タンパク質のアミノ酸配列である。

配列番号１３は、「Ｃ－ｔｅｒｍ－１２」と命名したバリアントＡｃｅ３タンパク質のアミノ酸配列である。

配列番号１４は、「Ｃ－ｔｅｒｍ－１３」と命名したバリアントＡｃｅ３タンパク質のアミノ酸配列である。

配列番号１５は、「Ｃ－ｔｅｒｍ－１４」と命名したバリアントＡｃｅ３タンパク質のアミノ酸配列である。

配列番号１６は、「Ｃ－ｔｅｒｍ－１５」と命名したバリアントＡｃｅ３タンパク質のアミノ酸配列である。

配列番号１７は、「Ｃ－ｔｅｒｍ－１６」と命名したバリアントＡｃｅ３タンパク質のアミノ酸配列である。

配列番号１８は、「Ｃ－ｔｅｒｍ－１７」と命名したバリアントＡｃｅ３タンパク質のアミノ酸配列である。

配列番号１９は、「Ｃ－ｔｅｒｍ－１８」と命名したバリアントＡｃｅ３タンパク質のアミノ酸配列である。

配列番号２０は、「Ｃ－ｔｅｒｍ－１９」と命名したバリアントＡｃｅ３タンパク質のアミノ酸配列である。

配列番号２１は、「Ｃ－ｔｅｒｍ－２０」と命名したバリアントＡｃｅ３タンパク質のアミノ酸配列である。

配列番号２２は、「Ｃ－ｔｅｒｍ－２５」と命名したバリアントＡｃｅ３タンパク質のアミノ酸配列である。

配列番号２３は、核酸プライマー配列（ＴＰ２１８）である。

配列番号２４は、核酸プライマー配列（ＴＰ２２０）である。

配列番号２５は、核酸プライマー配列（ＴＰ１２５）である。

配列番号２６は、核酸プライマー配列（ＴＰ１２３）である。

配列番号２７は、核酸プライマー配列（ＴＰ２２１）である。

配列番号２８は、核酸プライマー配列（ＴＰ２２２）である。

配列番号２９は、Ａｃｅ３二核（Ｚｎ_２Ｃｙｓ_６）亜鉛ＤＮＡ結合ドメインのアミノ酸配列である。

配列番号３０は、「Ａｃｅ３－ＬＣ Ｃ末端」を定義するアミノ酸残基位置６４１～６８９を含む。

配列番号３１は、配列番号３０のＡｃｅ３－ＬＣ Ｃ末端をコードするポリヌクレオチド配列である。

配列番号３２は、「Ａｃｅ３－ＬＣ Ｃ末端ｍｕｔ＿６７３」と命名したＡｃｅ３－ＬＣ Ｃ末端バリアントをコードするポリヌクレオチド配列である。

配列番号３３は、「Ａｃｅ３－ＬＣ Ｃ末端ｍｕｔ＿６７４」と命名したＡｃｅ３－ＬＣ Ｃ末端バリアントをコードするポリヌクレオチド配列である。

配列番号３４は、「Ａｃｅ３－ＬＣ Ｃ末端ｍｕｔ＿６７５」と命名したＡｃｅ３－ＬＣ Ｃ末端バリアントをコードするポリヌクレオチド配列である。

配列番号３５は、「Ａｃｅ３－ＬＣ Ｃ末端ｍｕｔ＿６７６」と命名したＡｃｅ３－ＬＣ Ｃ末端バリアントをコードするポリヌクレオチド配列である。

配列番号３６は、「Ａｃｅ３－ＬＣ Ｃ末端ｍｕｔ＿６７７」と命名したＡｃｅ３－ＬＣ Ｃ末端バリアントをコードするポリヌクレオチド配列である。

配列番号３７は、「Ａｃｅ３－ＬＣ Ｃ末端ｍｕｔ＿６７８」と命名したＡｃｅ３－ＬＣ Ｃ末端バリアントをコードするポリヌクレオチド配列である。

配列番号３８は、「Ａｃｅ３－ＬＣ Ｃ末端ｍｕｔ＿６７９」と命名したＡｃｅ３－ＬＣ Ｃ末端バリアントをコードするポリヌクレオチド配列である。

配列番号３９は、「Ａｃｅ３－ＬＣ Ｃ末端ｍｕｔ＿６８０」と命名したＡｃｅ３－ＬＣ Ｃ末端バリアントをコードするポリヌクレオチド配列である。

配列番号４０は、「Ａｃｅ３－ＬＣ Ｃ末端ｍｕｔ＿６８１」と命名したＡｃｅ３－ＬＣ Ｃ末端バリアントをコードするポリヌクレオチド配列である。

配列番号４１は、「Ａｃｅ３－ＬＣ Ｃ末端ｍｕｔ＿６８２」と命名したＡｃｅ３－ＬＣ Ｃ末端バリアントをコードするポリヌクレオチド配列である。

配列番号４２は、「Ａｃｅ３－ＬＣ Ｃ末端ｍｕｔ＿６８３」と命名したＡｃｅ３－ＬＣ Ｃ末端バリアントをコードするポリヌクレオチド配列である。

配列番号４３は、「Ａｃｅ３－ＬＣ Ｃ末端ｉｎｓ＿６７２」と命名したＡｃｅ３－ＬＣ Ｃ末端バリアントをコードするポリヌクレオチド配列である。

配列番号４４は、「Ａｃｅ３－ＬＣ Ｃ末端ｉｎｓ＿６７３」と命名したＡｃｅ３－ＬＣ Ｃ末端バリアントをコードするポリヌクレオチド配列である。

配列番号４５は、「Ａｃｅ３－ＬＣ Ｃ末端ｉｎｓ＿６７４」と命名したＡｃｅ３－ＬＣ Ｃ末端バリアントをコードするポリヌクレオチド配列である。

配列番号４６は、「Ａｃｅ３－ＬＣ Ｃ末端ｉｎｓ＿６７５」と命名したＡｃｅ３－ＬＣ Ｃ末端バリアントをコードするポリヌクレオチド配列である。

配列番号４７は、「Ａｃｅ３－ＬＣ Ｃ末端ｉｎｓ＿６７６」と命名したＡｃｅ３－ＬＣ Ｃ末端バリアントをコードするポリヌクレオチド配列である。

配列番号４８は、「Ａｃｅ３－ＬＣ Ｃ末端ｉｎｓ＿６７７」と命名したＡｃｅ３－ＬＣ Ｃ末端バリアントをコードするポリヌクレオチド配列である。

配列番号４９は、「Ａｃｅ３－ＬＣ Ｃ末端ｉｎｓ＿６７８」と命名したＡｃｅ３－ＬＣ Ｃ末端バリアントをコードするポリヌクレオチド配列である。

配列番号５０は、「Ａｃｅ３－ＬＣ Ｃ末端ｉｎｓ＿６７９」と命名したＡｃｅ３－ＬＣ Ｃ末端バリアントをコードするポリヌクレオチド配列である。

配列番号５１は、「Ａｃｅ３－ＬＣ Ｃ末端ｉｎｓ＿６８０」と命名したＡｃｅ３－ＬＣ Ｃ末端バリアントをコードするポリヌクレオチド配列である。

配列番号５２は、「Ａｃｅ３－ＬＣ Ｃ末端ｉｎｓ＿６８１」と命名したＡｃｅ３－ＬＣ Ｃ末端バリアントをコードするポリヌクレオチド配列である。

配列番号５３は、「Ａｃｅ３－ＬＣ Ｃ末端ｉｎｓ＿６８２」と命名したＡｃｅ３－ＬＣ Ｃ末端バリアントをコードするポリヌクレオチド配列である。

配列番号５４は、「Ａｃｅ３－ＬＣ Ｃ末端ｉｎｓ＿６８３」と命名したＡｃｅ３－ＬＣ Ｃ末端バリアントをコードするポリヌクレオチド配列である。

配列番号５５は、「Ａｃｅ３－ＬＣ Ｃ末端ｄｅｌ＿６７３－６７５」と命名したＡｃｅ３－ＬＣ Ｃ末端バリアントをコードするポリヌクレオチド配列である。

配列番号５６は、「Ａｃｅ３－ＬＣ Ｃ末端ｄｅｌ＿６７４－６７６」と命名したＡｃｅ３－ＬＣ Ｃ末端バリアントをコードするポリヌクレオチド配列である。

配列番号５７は、「Ａｃｅ３－ＬＣ Ｃ末端ｄｅｌ＿６７５－６７７」と命名したＡｃｅ３－ＬＣ Ｃ末端バリアントをコードするポリヌクレオチド配列である。

配列番号５８は、「Ａｃｅ３－ＬＣ Ｃ末端ｄｅｌ＿６７６－６７８」と命名したＡｃｅ３－ＬＣ Ｃ末端バリアントをコードするポリヌクレオチド配列である。

配列番号５９は、「Ａｃｅ３－ＬＣ Ｃ末端ｄｅｌ＿６７７－６７９」と命名したＡｃｅ３－ＬＣ Ｃ末端バリアントをコードするポリヌクレオチド配列である。

配列番号６０は、「Ａｃｅ３－ＬＣ Ｃ末端ｄｅｌ＿６７８－６８０」と命名したＡｃｅ３－ＬＣ Ｃ末端バリアントをコードするポリヌクレオチド配列である。

配列番号６１は、「Ａｃｅ３－ＬＣ Ｃ末端ｄｅｌ＿６７９－６８１」と命名したＡｃｅ３－ＬＣ Ｃ末端バリアントをコードするポリヌクレオチド配列である。

配列番号６２は、「Ａｃｅ３－ＬＣ Ｃ末端ｄｅｌ＿６８０－６８２」と命名したＡｃｅ３－ＬＣ Ｃ末端バリアントをコードするポリヌクレオチド配列である。

配列番号６３は、「Ａｃｅ３－ＬＣ Ｃ末端ｄｅｌ＿６８１－６８３」と命名したＡｃｅ３－ＬＣ Ｃ末端バリアントをコードするポリヌクレオチド配列である。

配列番号６４は、「Ａｃｅ３－ＬＣ Ｃ末端ｄｅｌ＿６８２－６８４」と命名したＡｃｅ３－ＬＣ Ｃ末端バリアントをコードするポリヌクレオチド配列である。

配列番号６５は、「Ａｃｅ３－ＬＣ Ｃ末端ｄｅｌ＿６８３－６８５」と命名したＡｃｅ３－ＬＣ Ｃ末端バリアントをコードするポリヌクレオチド配列である。

配列番号６６は、配列番号６７のアミノ酸配列を含むＡｃｅ３－ＬＣ Ｃ末端Ｖ５置換をコードするポリヌクレオチド配列である。

配列番号６７は、「Ａｃｅ３－ＬＣ Ｃ末端Ｖ５置換」バリアントのアミノ酸配列である。

配列番号６８は、配列番号６９のアミノ酸配列を含むＡｃｅ３－ＬＣ Ｃ末端Ｖ５－（６×Ｈｉｓ）置換をコードするポリヌクレオチド配列である。

配列番号６９は、「Ａｃｅ３－ＬＣ Ｃ末端Ｖ５－（６×Ｈｉｓ）置換」バリアントのアミノ酸配列である。

配列番号７０は、ｇｌａ１遺伝子座を標的とするｓｇＲＮＡである。

詳細な説明
Ｉ．概説
本明細書に記載するように、本開示の特定の実施形態は、目的タンパク質の商業規模での生産に使用するための、変異型及び／又は遺伝子改変されたトリコデルマ属（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）の真菌細胞に関する。より詳細には、本開示の特定の実施形態は、リグノセルロース分解酵素をコードする１つ又は複数の遺伝子の発現をアップレギュレートすることができる新規Ａｃｅ３（バリアント）転写因子（ＴＦ）タンパク質に関する。したがって、特定の実施形態は、本明細書に開示される新規（バリアント）Ａｃｅ３ ＴＦタンパク質をコードするポリヌクレオチド（核酸配列）を対象とする。例えば、本開示の特定の実施形態は、バリアントＡｃｅ３ ＴＦタンパク質をコードする単離されたポリヌクレオチドであって、バリアントＡｃｅ３ ＴＦは、配列番号２のアミノ酸位置１～６７２に対して少なくとも９０％の配列同一性を含み、且つ、配列番号２の６７３～６８９位から選択される１つ又は複数のＣ末端アミノ酸残基の遺伝子改変を含むポリヌクレオチドを対象としている。

したがって、特定の実施形態は、本開示のバリアントＡｃｅ３ＴＦタンパク質をコードするａｃｅ３遺伝子を含む遺伝子改変トリコデルマ属（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）菌細胞に関し、改変細胞は、誘導基質の非存在下で目的タンパク質を産生することができる。特定の他の実施形態は、本開示のバリアントＡｃｅ３ＴＦタンパク質をコードするａｃｅ３遺伝子を含む遺伝子改変トリコデルマ属（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）菌細胞に関し、改変細胞は、誘導基質の存在下で産生される目的タンパク質の量を増加させることができる（すなわち、野生型Ａｃｅ３タンパク質（例えば、配列番号２）をコードする野生型ａｃｅ３遺伝子を含む対照トリコデルマ属（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）菌細胞によって産生される同じ目的タンパク質の量と比較して（改変トリコデルマ属（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）菌細胞と対照トリコデルマ属（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）菌細胞が、ＰＯＩの産生のために、誘導基質の存在下、同じ条件で培養／発酵された場合））。したがって、本開示の特定の他の実施形態は、本開示のバリアントＡｃｅ３転写因子（ＴＦ）タンパク質を含み、発現する改変トリコデルマ属（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）菌細胞（株）を構築し、改変し、試験し、スクリーニングし、単離するなどのための組成物及び方法に関する。

ＩＩ．定義
本組成物及び方法をさらに詳細に説明する前に、以下の用語及び語句を定義する。定義されない用語は、使用され、且つ当業者に知られている通常の意味と一致すべきである。

本明細書に引用されている全ての刊行物及び特許は、参照により本明細書に組み込まれる。

ある範囲の値が示されている場合、文脈上別段の明確な指示がなければ、その範囲の上限と下限の間にある下限値の単位の１０分の１までの各介在値、及びその範囲内の任意の他の記載された値又は介在値は、本組成物及び方法の範囲内に包含されると理解される。これらのより小さい範囲の上限及び下限は、独立して、より小さい範囲に含まれ、また、記載された範囲における任意の具体的に除外された限界に従うことを条件として、本発明の組成物及び方法に包含される。記載された範囲が限界の一方又は両方を含む場合、それらの含まれた限界の一方又は両方を除く範囲もまた、本発明の組成物及び方法に含まれる。

本明細書において、いくつかの範囲は、「約」という用語が先行する数値で示される。本明細書においては、「約」という用語は、これが先行する正確な数、及び、この用語が先行する数に近い数又は近似する数に対するリテラルサポートを提供するために使用される。数字が具体的に挙げられた数に近い又は近似するかを決定する際に、挙げられていない近い又は近似する数は、それが提示される文脈において、具体的に挙げられた数の実質的に等価な数を提供する数であり得る。例えば、数値に関連して「約」という用語は、その用語が文脈において特に明確に定義されていない限り、その数値の^－１０％～^＋１０％の範囲を指す。別の例では、語句「約６のｐＨ値」は、ｐＨ値が特に明確に定義されていない限り、５．４～６．６のｐＨ値を指す。

本明細書に示した見出しは、本明細書全体を参照することによって得ることができる本組成物及び方法の様々な態様又は実施形態を限定するものではない。したがって、すぐ下で定義する用語は、本明細書全体を参照することによってより完全に定義される。

この詳細な説明によると、以下の略語及び定義が適用される。文脈が明白に他のことを指示していない限り、単数形「１つの（ａ）」、「１つの（ａｎ）」及び「その（ｔｈｅ）」は、複数の対象を含むことに留意されたい。したがって、例えば、「酵素（ａｎ ｅｎｚｙｍｅ）」という言及は、複数のそのような酵素を含み、「用量（ｔｈｅ ｄｏｓａｇｅ）」という言及は、１つ又は複数の用量及び当業者には既知のその同等物を含むなどである。

特許請求の範囲が任意選択的な要素を排除するように記載され得ることにもさらに留意されたい。したがって、この記述は、請求項の構成要素の列挙に関連して「唯一の」、「ただ～のみ」、「～を除いて」、「～を含まない」などの排他的な用語の使用、又はその「否定的な」限定若しくは「条件」の使用のための先行文として機能することを意図している。

さらに、「～を含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」という用語は、本明細書で使用されるとき、「～を含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」という用語の後の成分を「含むが、それに限定されない（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ，ｂｕｔ ｎｏｔ ｌｉｍｉｔｅｄ ｔｏ）」ことを意味することに留意されたい。用語「～を含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」の後の成分は必要とされ、又は必須であるが、この成分を含む組成物は、その他の非必須又は任意選択の成分をさらに含み得る。

また、「～から構成される（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｏｆ）」という用語は、本明細書で使用されるとき、「～から構成される（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｏｆ）という用語の後の成分を「含み、且つそれに限定される（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ ａｎｄ ｌｉｍｉｔｅｄ ｔｏ）」ことを意味することにも留意されたい。したがって、用語「～から構成される（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｏｆ）」の後の成分は必要とされ、又は必須であり、且つその他の成分はその組成物中に存在しない。

本開示を読めば当業者には明らかなように、本明細書に記載及び例示する個々の実施形態のそれぞれは、本明細書に記載する本組成物及び方法の範囲又は精神から逸脱することなく、他の一部の実施形態のいずれかの特徴から容易に分離又は組み合わせることができる別個の構成要素及び特徴を有する。記載した方法はいずれも、記載した事象の順序で、又は論理的に可能な他の任意の順序で実施することができる。

本明細書で使用される場合、「子嚢菌真菌細胞」という用語は、菌界における子嚢菌門（Ａｓｃｏｍｙｃｏｔａ）の任意の生物を指す。子嚢菌真菌細胞の例としては、例えば、トリコデルマ属（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）の菌種、アスペルギルス属（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）の菌種、ミセリオフトラ属（Ｍｙｃｅｌｉｏｐｈｔｈｏｒａ）の菌種及びペニシリウム属（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ）の菌種などのチャワンタケ亜門（Ｐｅｚｉｚｏｍｙｃｏｔｉｎａ）内の糸状菌が挙げられるがそれらに限定されない。

本明細書で使用される場合、用語「糸状菌」は、真菌類（Ｅｕｍｙｃｏｔａ）亜界及び卵菌類（Ｏｏｍｙｃｏｔａ）亜界の全ての糸状菌形を指す。例えば、糸状菌としては、限定されないが、アクレモニウム属（Ａｃｒｅｍｏｎｉｕｍ）、アスペルギルス属（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）、エメリセラ属（Ｅｍｅｒｉｃｅｌｌａ）、フザリウム属（Ｆｕｓａｒｉｕｍ）、フミコーラ属（Ｈｕｍｉｃｏｌａ）、ムコール属（Ｍｕｃｏｒ）、ミセリオフトラ属（Ｍｙｃｅｌｉｏｐｈｔｈｏｒａ）、ニューロスポラ属（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ）、ペニシリウム属（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ）、スキタリジウム属（Ｓｃｙｔａｌｉｄｉｕｍ）、チエラビア属（Ｔｈｉｅｌａｖｉａ）、トリポクラジウム属（Ｔｏｌｙｐｏｃｌａｄｉｕｍ）、及びトリコデルマ属（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）の種が挙げられる。

いくつかの実施形態では、糸状菌は、トリコデルマ属（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）菌細胞（株）であり、例えば、トリコデルマ・ハルチアナム（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｈａｒｚｉａｎｕｍ）、トリコデルマ・コニンギイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｋｏｎｉｎｇｉｉ）、トリコデルマ・ロンジブラチアトウム（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｌｏｎｇｉｂｒａｃｈｉａｔｕｍ）、トリコデルマ・リーゼイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉ）又はトリコデルマ・ビリデ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｖｉｒｉｄｅ）が挙げられるがこれらに限定されない。

いくつかの実施形態では、糸状菌は、アスペルギルス・アクレアツス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ａｃｕｌｅａｔｕｓ）、アスペルギルス・アワモリ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ａｗａｍｏｒｉ）、アスペルギルス・フェチダス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｆｏｅｔｉｄｕｓ）、アスペルギルス・ジャポニクス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｊａｐｏｎｉｃｕｓ）、アスペルギルス・ニデュランス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｄｕｌａｎｓ）、アスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ）、又はアスペルギルス・オリザエ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ）などのアスペルギルス属（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）菌細胞（株）であり得る。

いくつかの実施形態では、糸状菌は、トリコデルマ・リーゼイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉ）ＡＴＣＣ寄託番号５６７６５としてＡｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎから入手可能な、Ｔ．リーゼイ（Ｔ．ｒｅｅｓｅｉ）株「Ｒｕｔ－Ｃ３０」由来のＴ．リーゼイ（Ｔ．ｒｅｅｓｅｉ）細胞である。他の実施形態では、糸状菌は、ＵＳ Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒｅ、Ｎｏｒｔｈｅｒｎ Ｒｅｇｉｏｎａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙの培養物コレクションからＮＲＲＬ番号１５７０９として入手可能な、Ｔ．リーゼイ（Ｔ．ｒｅｅｓｅｉ）株「ＲＬ－Ｐ３７」由来のＴ．リーゼイ（Ｔ．ｒｅｅｓｅｉ）細胞である。

本明細書で使用される場合、「変異トリコデルマ属（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）菌細胞」などの語句で使用される場合の「変異細胞」、用語「変異細胞」は、特に、本開示の変異Ａｃｅ３ ＴＦをコードする変異ａｃｅ３遺伝子を含む任意の天然に存在するトリコデルマ属（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）菌（変異）細胞を指す。例えば、トリコデルマ属（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）菌細胞の集団を本明細書に記載の方法に従ってスクリーニングして、誘導基質の非存在下で目的タンパク質を産生することができる天然に存在する変異トリコデルマ属（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）菌細胞を確認することができる。例えば、特定の実施形態では、上記のように確認された変異トリコデルマ属（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）菌細胞は、トリコデルマ属（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）菌細胞の集団から単離され、誘導基質の非存在下で目的タンパク質を産生するための好適な条件下で培養／発酵される。

本明細書で使用される場合、「バリアント糸状菌細胞」、「改変糸状菌細胞」、「バリアント真菌細胞」、「改変真菌細胞」などという語句は、チャワンタケ（Ｐｅｚｉｚｏｍｙｃｏｔｉｎａ）亜門に属する親糸状菌細胞に由来する（すなわち、得られる）糸状菌細胞を指す。したがって、本明細書で使用される「改変」又は「バリアント」糸状菌細胞は、「親」糸状菌細胞に由来し、「変異」細胞は、「親」細胞にはない少なくとも１つの遺伝子改変を含む。例えば、本開示の「改変細胞」と「親細胞」を比較する場合、「親」細胞は、少なくとも１つの遺伝子改変を含む「改変」細胞に対して、改変されていない「対照」細胞としての役割を果たす。

本明細書で使用される場合、用語「改変」及び「遺伝子改変」は互換的に使用され、以下を含む：（ａ）遺伝子（若しくはそのＯＲＦ）における１つ又は複数のヌクレオチドの導入、置換、若しくは除去、又は遺伝子若しくはそのＯＲＦの転写若しくは翻訳に必要な調節エレメントにおける１つ若しくは複数のヌクレオチドの導入、置換、若しくは除去、（ｂ）遺伝子破壊、（ｃ）遺伝子変換、（ｄ）遺伝子欠失、（ｅ）遺伝子のダウンレギュレーション、（ｆ）特異的変異誘発、及び／或いは（ｇ）本明細書に開示される任意の１つ若しくは複数の遺伝子のランダム変異誘発。

本明細書で使用される場合、「遺伝子の破壊」、「遺伝子破壊」、「遺伝子の不活性化」及び「遺伝子不活性化」は、互換的に使用され、宿主細胞の機能的遺伝子産物（例えば、タンパク質）の産生を実質的に妨げる任意の遺伝子改変を広く指す。例示的な遺伝子破壊方法としては、ポリペプチドをコードする配列、プロモーター、エンハンサー又はまた別の調節エレメントを含む遺伝子の任意の部分の完全若しくは部分的な消失又はその変異誘発が挙げられる（ここで、変異誘発は、標的遺伝子を破壊／不活性化し、機能的遺伝子産物（すなわち、タンパク質）の産生を実質的に減少若しくは妨げる、置換、挿入、欠失、逆位、並びにこれらの任意の組み合わせ及び変形形態を包含する）。

本明細書で使用される場合、遺伝子発現の「ダウンレギュレーション」及び遺伝子発現の「アップレグレーション」という用語には、遺伝子発現の低下（ダウンレギュレーション）又は上昇（アップレグレーション）をもたらす任意の方法が含まれる。例えば、遺伝子のダウンレギュレーションは、ＲＮＡ誘導遺伝子サイレンシング、プロモーター、リボソーム結合部位（ＲＢＳ）／シャイン・ダルガーノ配列、未翻訳領域（ＵＴＲ）、コドン変化などの制御エレメントの遺伝子改変によって達成され得る。

本明細書で使用される場合、「ターゲティングベクター」は、ターゲティングベクターが形質転換される宿主細胞の染色体内の領域に相同なポリヌクレオチド配列を含み、その領域で相同組換えを駆動できるベクターである。例えば、ターゲティングベクターは、相同組換えによって宿主細胞の染色体に変異を導入する際に使用される。いくつかの実施形態では、ターゲティングベクターは、例えば末端に付加された他の非相同配列（すなわち、スタッファー配列又はフランキング配列）を含む。末端は、例えば、ベクターへの挿入などのように、ターゲティングベクターが閉環を形成するように閉じることができる。例えば、特定の実施形態では、親トリコデルマ属（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）菌細胞は、トランケート型（非機能性）Ｎ末端亜鉛二核クラスターＤＮＡ結合ドメインを含むバリアントＡｃｅ３タンパク質（例えば、Ａｃｅ３－Ｓ；配列番号４）をコードするａｃｅ３を含む。

したがって、本明細書に記載され企図されるように、特定の実施形態では、バリアントＡｃｅ３タンパク質（例えば、Ａｃｅ３－Ｓ；配列番号：４）をコードするａｃｅ３遺伝子は、Ａｃｅ３タンパク質の天然ＤＮＡ結合ドメインを元に戻すように設計された１つ又は複数の「ターゲティングベクター」を親細胞に導入することによって、遺伝子改変（例えば、形質転換）される。例えば、天然のＡｃｅ３ ＤＮＡ結合ドメインは、配列番号２９に記載のアミノ酸配列を含む。（例えば、ａｃｅ３遺伝子内の天然Ａｃｅ３ ＤＮＡ結合を元に戻すための）適切なベクターの選択及び／又は構築は、当業者の知識の範囲内に明確に含まれる。同様に、他の実施形態では、１つ又は複数のターゲティングベクターは、本明細書に記載されるように、コードされるＡｃｅ３タンパク質が改変Ｃ末端を含むように、ａｃｅ３遺伝子に対し、１つ又は複数のヌクレオチドを欠失、導入（挿入）及び／又は置換するように設計／構築される。

本明細書で使用される場合、「フランキング配列」は、考察対象の配列の上流又は下流にある任意の配列を指す（例えば、遺伝子Ａ－Ｂ－Ｃでは、遺伝子ＢがＡ及びＣの遺伝子配列にフランキングされている）。特定の実施形態では、入来配列は、両側でホモロジーボックスにフランキングされている。別の実施形態においては、入来配列及びホモロジーボックスは、両側でスタッファー配列によってフランキングされている単位を含む。いくつかの実施形態では、フランキング配列は、一方の側（３’又は５’）にのみ存在するが、好ましい実施形態では、フランキングされている配列の両側に存在する。各相同ボックスの配列は、トリコデルマ属（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）菌の染色体の配列に相同である。これらの配列は、トリコデルマ属（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）菌の染色体のどこに新規なコンストラクトが組み込まれ、トリコデルマ属（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）菌の染色体のどの部分が入来配列により置換されるかを指示する。他の実施形態では、選択マーカーの５’側及び３’側末端は、不活化染色体セグメントの一部を含むポリヌクレオチド配列によってフランキングされている。

本明細書で使用される場合、用語「遺伝子」は、タンパク質又はＲＮＡの発現をコードし、且つ指示する核酸を指すという点で、用語「対立遺伝子」と同義である。糸状菌の栄養型は一般に一倍体であり、このため特定の表現型を付与するには、特定の遺伝子の単一コピー（すなわち、単一の対立遺伝子）で十分である。

本明細書中で使用される場合、「野生型」及び「天然」という用語は、互換的に使用され、そして天然に見出されるような遺伝子、タンパク質、真菌細胞又は菌株を指す。

本明細書で使用される場合、トリコデルマ・リーゼイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉ）「ＱＭ６ａ株」は、「Ａｃｅ３－Ｓ」と命名したＡｃｅ３タンパク質（配列番号４）をコードするＡｃｅ３遺伝子を含む。４を参照）。

本明細書で使用される場合、トリコデルマ・リーゼイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉ）「ＲＬ－Ｐ３７株」は、「Ａｃｅ３－Ｌ」と命名したＡｃｅ３タンパク質（配列番号６）をコードするＡｃｅ３遺伝子を含む。

本明細書で使用される場合、「Ａｃｅ３－ＬＣ」タンパク質は、配列番号２のアミノ酸配列を含む。図１に示すように、Ａｃｅ３－ＬＣタンパク質は、インタクトな亜鉛二核クラスター（Ｚｎ_２Ｃｙｓ_６）ＤＮＡ結合ドメイン（図１Ａ；６個の太字で且つ灰色のシステイン（Ｃ）残基によって示される）、及び６８９位のグリシン（Ｇ）残基で終わる完全長（野生型；非トランケート型）Ｃ末端（図１Ｂ）を含むＮ末端アミノ酸配列を有する６８９個のアミノ酸残基を含む。本明細書で使用される場合、天然Ａｃｅ３－ＬＣタンパク質の最後の４９のアミノ酸残基位置（配列番号：２；すなわち、残基位置６４１～６８９）を配列番号３０（例えば、図１５を参照）として記載する。したがって、特定の実施形態では、バリアントＡｃｅ３タンパク質は改変Ｃ末端を含み、この改変Ｃ末端は配列番号３０の６４１～６８９の天然Ａｃｅ３－ＬＣ Ｃ末端アミノ酸位置と比較される。

本明細書で使用される場合、「Ａｃｅ３－ＬＣ」タンパク質は、配列番号６のアミノ酸配列を含む。図１に示すように、Ａｃｅ３－Ｌタンパク質は、インタクトな亜鉛二核クラスター（Ｚｎ_２Ｃｙｓ_６）ＤＮＡ結合ドメイン（６個の太字で且つ灰色のシステイン（Ｃ）残基によって示される；図１Ａ）を含むＮ末端アミノ酸配列を含み、アスパラギン酸（Ｄ）残基で終わるトランケートされたＣ末端（図１Ｂ、例えば、Ａｃｅ３－ＬＣタンパク質Ｃ末端と比較して；配列番号２）を含む。

本明細書で使用される場合、「Ａｃｅ３－Ｓ」タンパク質は、配列番号４のアミノ酸配列を含む。図１Ａに示すように、Ａｃｅ３－Ｓタンパク質は、Ａｃｅ３－ＬＣ（図１Ａ；配列番号２）及び／又はＡｃｅ３－Ｌ（図１Ａ；配列番号６）と比較してより短い（トランケートされた）Ｎ末端アミノ酸配列を含む。したがって、図１Ａに示すように、Ａｃｅ３－Ｓタンパク質は、インタクトな亜鉛二核クラスター（Ｚｎ_２Ｃｙｓ_６）ＤＮＡ結合ドメインを含まない（すなわち、Ａｃｅ３－ＬＣ及びＡｃｅ３－ＬのＮ末端配列と比較して）。

本明細書で使用される場合、語句「Ａｃｅ３ ＤＮＡ結合ドメイン」及び「Ａｃｅ３亜鉛二核クラスター（Ｚｎ_２Ｃｙｓ_６）ＤＮＡドメイン」は、互換的に使用され得、配列番号２９のＡｃｅ３ ＤＮＡ結合ドメインとの相同性を含むアミノ酸配列を指す。例えば、配列番号２９のＡｃｅ３ ＤＮＡ結合ドメイン（図３）は、Ａｃｅ３－ＬＣ（配列番号：２）及びＡｃｅ３－Ｌ（配列番号６）タンパク質のアミノ酸位置７３～１０９に位置する。

本明細書で使用される場合、「アップレギュレートする」という用語は、「Ａｃｅ３ ＴＦタンパク質は、リグノセルロース分解酵素をコードする遺伝子の発現を「アップレギュレートする」などの語句で述べる場合、この用語は、誘導基質の非存在下で、リグノセルロース分解酵素をコードする遺伝子の発現をアップレギュレートすることができるＡｃｅ３ ＴＦタンパク質を具体的に指す。例えば、リグノセルロース分解酵素をコードする遺伝子の発現をアップレギュレートするＡｃｅ３ ＴＦタンパク質を含む本開示の改変糸状菌細胞は、誘導基質の非存在下でリグノセルロース分解酵素を産生することができる。対照的に、野生型Ａｃｅ３ ＴＦタンパク質をコードする野生型ａｃｅ３遺伝子を含む糸状菌（対照）細胞は、誘導基質の非存在下でリグノセルロース分解酵素をコードする遺伝子の発現をアップレギュレートしない。

本明細書で使用される場合、「リグノセルロース分解酵素」という用語は、セロビオヒドロラーゼ、エンドグルカナーゼ及びβ－グルコシダーゼを含むが、これらに限定されない。本明細書で使用される場合、「増加した量」という用語は、「改変細胞は誘導基質の存在下でリグノセルロース分解酵素を「増加した量」産生する」などの語句で使用される場合、産生されるリグノセルロース分解酵素の「増加した量」は、改変細胞及び親細胞が同じ誘導基質の存在下でＰＯＩの産生のための同じ条件下で培養／発酵された場合に、親細胞によって産生される同じリグノセルロース分解酵素の量と比較してである。

以下の実施例の項に記載され、且つ以下で説明されるように、本開示の特定の実施形態は、配列番号２に対して少なくとも９０％の配列同一性を含むＡｃｅ３転写因子（ＴＦ）タンパク質をコードするａｃｅ３遺伝子を含む親トリコデルマ属（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）菌細胞（株）に由来する遺伝子改変トリコデルマ属（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）真菌細胞（株）を対象とし、この遺伝子改変細胞は、配列番号２のアミノ酸位置１～６７２に対して少なくとも９０％の配列同一性を含むバリアントＡｃｅ３ ＴＦタンパク質をコードし、且つ、配列番号２の６７３～６８９位から選択される１つ又は複数のＣ末端アミノ酸残基の遺伝子改変を含む、バリアントＡｃｅ３遺伝子を含む。例えば、特定の実施形態では、本開示の改変トリコデルマ属（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）真菌細胞は、目的タンパク質（ＰＯＩ）をコードするオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）の発現を、ＯＲＦがリグノセルロース分解酵素をコードする遺伝子に由来する上流（５’）プロモーター配列に作動可能に連結されている場合、アップレギュレートすることができるバリアントＡｃｅ３ ＴＦタンパク質を含む。

したがって、本明細書で使用される場合、「アップレギュレートする」という用語は、「目的タンパク質（ＰＯＩ）をコードするＯＲＦの発現をアップレギュレートすることができるバリアントＡｃｅ３ ＴＦタンパク質（ここで、ＯＲＦがリグノセルロース分解酵素をコードする遺伝子に由来する上流（５’）プロモーター配列に作動可能に連結されている）」などの語句で述べられる場合、この用語は、誘導基質の非存在下で、ＰＯＩをコードするＯＲＦの発現をアップレギュレートすることができるＡｃｅ ３ＴＦタンパク質を具体的に指す。

本明細書で使用される場合、「リグノセルロース分解酵素をコードする遺伝子に由来する上流（５’）プロモーター配列」は、セロビオヒドロラーゼプロモーター配列、エンドグルカナーゼプロモーター配列、β－グルコシダーゼプロモーター配列、及びキシラナーゼプロモーター配列を含むが、これらに限定されない。

本明細書で使用される場合、「増加した量」という用語は、「改変細胞は誘導基質の存在下で目的タンパク質（ＰＯＩ）を「増加した量」を産生する」などの語句で使用される場合、産生されるＰＯＩの「増加した量」は、親細胞又は対照細胞によって産生される同じＰＯＩの量と比較してである。例えば、ＰＯＩをコードするＯＲＦの発現をアップレギュレートすることができるＡｃｅ３ ＴＦタンパク質を含む本開示の改変糸状菌細胞（すなわち、ＯＲＦがリグノセルロース分解酵素をコードする遺伝子に由来する５’プロモーター配列に作動可能に連結されている場合）は、同じ誘導基質の存在下で培養／発酵された場合、野生型Ａｃｅ３ ＴＦタンパク質（例えば、配列番号２）をコードする野生型ａｃｅ３遺伝子を含む対照細胞によって産生される同じＰＯＩの量と比較して、誘導基質の存在下で培養／発酵された場合、増加した量のＰＯＩを産生する。

本明細書で使用される場合、野生型Ａｃｅ３ Ｃ末端の特定のアミノ酸欠失（トランケーション）は、「Ｃ－ｔｅｒｍ」と略され、その後に数字表示が続き（例えば、「Ｃ－ｔｅｒｍ－５」～「Ｃ－ｔｅｒｍ－２０」及び「Ｃ－ｔｅｒｍ－２５」）、ここで、数字表示はＡｃｅ３ Ｃ末端から（すなわち、６８９位のグリシン（Ｇ）で終わる野生型Ａｃｅ３ Ｃ末端に対して；配列番号２）欠失したアミノ酸残基の数を表す。例えば、図４に示す野生型Ａｃｅ３ Ｃ末端（すなわち、これは６８９位のグリシン（Ｇ）で終わる）を参照することにより、「Ｃ－ｔｅｒｍ－７」タンパク質は最後の７個のＣ末端アミノ酸（すなわち、「ＴＳＴＴＶＶＧ」）の７アミノ酸欠失（トランケーション）を含み、「Ｃ－ｔｅｒｍ－１７」タンパク質は最後の１７個のＣ末端アミノ酸（すなわち、「ＤＳＫＡＳＤＱＬＲＮＴＳＴＴＶＶＧ」）の１７アミノ酸欠失（トランケーション）を含む。

特定の実施形態では、野生型（Ａｃｅ３）Ｃ末端アミノ酸残基を参照し、視覚的明瞭性のために負の数を割り当てる。例えば、図４に示すように。Ａｃｅ３－ＬＣタンパク質の最もＣ末端のアミノ酸位置（すなわち、６８９位のグリシン（Ｇ））には負の１（－１）が割り当てられ、６８５位のトレオニン（Ｔ）には負の５（－５）が割り当てられ、６８０位のロイシン（Ｌ）には負の１０（－１０）が割り当てられ、６７５位のリシン（Ｋ）には負の１５（－１５）が割り当てられるなど。

本明細書で使用される場合、Ａｃｅ３「Ｃ－ｔｅｒｍ－５」タンパク質（図２Ａ；配列番号７）は、６８４位のセリン（Ｓ）で終わる、Ｃ末端の５個のアミノ酸トランケーション（ＷＴ Ａｃｅ３ Ｃ末端に対して；配列番号２）を有する６８４個のアミノ酸残基を含む。

本明細書で使用される場合、Ａｃｅ３「Ｃ－ｔｅｒｍ－６」タンパク質（図２Ａ；配列番号８）は、６８３位のトレオニン（Ｔ）で終わる、６８３個のアミノ酸残基、及びＣ末端の６個のアミノ酸トランケーション（ＷＴ Ａｃｅ３ Ｃ末端に対して；配列番号２）を含む。

本明細書で使用される場合、Ａｃｅ３「Ｃ－ｔｅｒｍ－７」タンパク質（図２Ｂ；配列番号９）は、６８２位のアスパラギン（Ｎ）で終わる、Ｃ末端の７個のアミノ酸トランケーション（ＷＴ Ａｃｅ３ Ｃ末端に対して；配列番号２）を有する６８２個のアミノ酸残基を含む。

本明細書で使用される場合、Ａｃｅ３「Ｃ－ｔｅｒｍ－８」タンパク質（図２Ｂ；配列番号１０）は、６８１位のアルギニン（Ｒ）で終わる、Ｃ末端の８個のアミノ酸トランケーション（ＷＴ Ａｃｅ３ Ｃ末端に対して；配列番号２）を有する６８１個のアミノ酸残基を含む。

本明細書で使用される場合、Ａｃｅ３「Ｃ－ｔｅｒｍ－９」タンパク質（図２Ｂ；配列番号１１）は、６８０位のロイシン（Ｌ）で終わる、Ｃ末端の９個のアミノ酸トランケーション（ＷＴ Ａｃｅ３ Ｃ末端に対して；配列番号２）を有する６８０個のアミノ酸残基を含む。

本明細書で使用される場合、Ａｃｅ３「Ｃ－ｔｅｒｍ－１０」タンパク質（図２Ｃ；配列番号１２）は、６７９位のグルタミン（Ｑ）で終わる、Ｃ末端の１０個のアミノ酸トランケーション（ＷＴ Ａｃｅ３ Ｃ末端に対して；配列番号２）を有する６７９個のアミノ酸残基を含む。

本明細書で使用される場合、Ａｃｅ３「Ｃ－ｔｅｒｍ－１２」タンパク質（図２Ｃ；配列番号１３）は、６７７位のセリン（Ｓ）で終わる、Ｃ末端の１２個のアミノ酸トランケーション（ＷＴ Ａｃｅ３ Ｃ末端に対して；配列番号２）を有する６７７個のアミノ酸残基を含む。

本明細書で使用される場合、Ａｃｅ３「Ｃ－ｔｅｒｍ－１３」タンパク質（図２Ｃ；配列番号１４）は、６７６位のアラニン（Ａ）で終わる、Ｃ末端の１３個のアミノ酸トランケーション（ＷＴ Ａｃｅ３ Ｃ末端に対して；配列番号２）を有する６７６個のアミノ酸残基を含む。

本明細書で使用される場合、Ａｃｅ３「Ｃ－ｔｅｒｍ－１４」タンパク質（図２Ｄ；配列番号１５）は、６７５位のリシン（Ｋ）で終わる、Ｃ末端の１４個のアミノ酸トランケーション（ＷＴ Ａｃｅ３ Ｃ末端に対して；配列番号２）を有する６７５個のアミノ酸残基を含む。

本明細書で使用される場合、Ａｃｅ３「Ｃ－ｔｅｒｍ－１５」タンパク質（図２Ｄ；配列番号１６）は、６７４位のセリン（Ｓ）で終わる、Ｃ末端の１５個のアミノ酸トランケーション（ＷＴ Ａｃｅ３ Ｃ末端に対して；配列番号２）を有する６７４個のアミノ酸残基を含む。

本明細書で使用される場合、Ａｃｅ３「Ｃ－ｔｅｒｍ－６」タンパク質（図２Ｄ；配列番号１７）は、６７３位のアスパラギン酸（Ｄ）で終わる、Ｃ末端の１６個のアミノ酸トランケーション（ＷＴ Ａｃｅ３ Ｃ末端に対して；配列番号２）を有する６７３個のアミノ酸残基を含む。

本明細書で使用される場合、Ａｃｅ３「Ｃ－ｔｅｒｍ－１７」タンパク質（図２Ｅ；配列番号１８）は、６７２位のロイシン（Ｌ）で終わる、Ｃ末端での１７個のアミノ酸トランケーション（ＷＴ Ａｃｅ３ Ｃ末端に対して；配列番号２）を有する６７２個のアミノ酸残基を含む。

本明細書で使用される場合、Ａｃｅ３「Ｃ－ｔｅｒｍ－１８」タンパク質（図２Ｅ；配列番号１９）は、６７１位のアルギニン（Ｒ）で終わる、Ｃ末端での１８個のアミノ酸トランケーション（ＷＴ Ａｃｅ３ Ｃ末端に対して；配列番号２）を有する６７１個のアミノ酸残基を含む。

本明細書で使用される場合、Ａｃｅ３「Ｃ－ｔｅｒｍ－１９」タンパク質（図２Ｅ；配列番号２０）は、６７０位のトレオニン（Ｔ）で終わるＣ末端での１９個のアミノ酸トランケーション（ＷＴ Ａｃｅ３ Ｃ末端に対して；配列番号２）を有する６７０個のアミノ酸残基を含む。

本明細書で使用される場合、Ａｃｅ３「Ｃ－ｔｅｒｍ－２０」タンパク質（図２Ｆ；配列番号２１）は、６６９位のロイシン（Ｌ）で終わるＣ末端の２０個のアミノ酸トランケーション（ＷＴ Ａｃｅ３ Ｃ末端に対して；配列番号２）を有する６６９個のアミノ酸残基を含む。

本明細書で使用される場合、Ａｃｅ３「Ｃ－ｔｅｒｍ－２５」タンパク質（図２Ｆ；配列番号２２）は、６６４位のバリン（Ｖ）で終わるＣ末端での２５個のアミノ酸トランケーション（ＷＴ Ａｃｅ３ Ｃ末端に対して；配列番号２）を有する６６４個のアミノ酸残基を含む。

本明細書で使用される場合、「Ａｃｅ３「Ｃ－ｔｅｒｍ」タンパク質をコードする遺伝子を発現する遺伝子改変を含む」改変又はバリアント細胞という語句は、本開示のＡｃｅ３「Ｃ－ｔｅｒｍ」タンパク質（例えば、Ｃ－ｔｅｒｍ－７；配列番号９～Ｃ－ｔｅｒｍ－１７；配列番号１８）をコードする遺伝子（又はＯＲＦ）の少なくとも１つのコピーの導入を含むがこれらに限定されない。特定の実施形態では、Ａｃｅ３ Ｃ－ｔｅｒｍタンパク質をコードする遺伝子（又はＯＲＦ）は、上流（５’）異種プロモーター配列に作動可能に連結され（すなわち、ａｃｅ３遺伝子はその天然ａｃｅ３プロモーター配列に連結されない）、且つ／又はＡｃｅ３ Ｃ－ｔｅｒｍタンパク質をコードする遺伝子（又はＯＲＦ）は、下流（３’）異種ターミネーター配列に作動可能に連結される。

特定の実施形態では、本開示のＡｃｅ３「Ｃ－ｔｅｒｍ」タンパク質をコードする遺伝子を発現する遺伝子改変を含む改変細胞（例えば、Ｃ－ｔｅｒｍ－７；配列番号９～Ｃ－ｔｅｒｍ－１７；配列番号１８）をコードする遺伝子を発現する遺伝子改変を含む改変細胞は、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９編集により内因性ａｃｅ３遺伝子の改変を含み、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９改変ａｃｅ３遺伝子は、本開示のＡｃｅ３「Ｃ－ｔｅｒｍ」タンパク質をコードする。

特定の実施形態では、本開示の真菌細胞は、トランケートされたＮ末端亜鉛二核クラスターＤＮＡ結合ドメインをコードする内因性ａｃｅ３遺伝子の存在についてスクリーニングされ得る。例えば、図３（配列番号２９）は、Ａｃｅ３－Ｌ（配列番号：６）及びＡｃｅ３－ＬＣ（配列番号２）タンパク質に見られるようなインタクトなＤＮＡ結合ドメインを示す。したがって、特定の実施形態では、（内因性の）トランケートされたＮ末端を含むものとしてスクリーニングされ確認された親真菌細胞は、完全長（野生型）Ｎ末端（配列番号２９）を復帰するように、本明細書において遺伝子改変される。

同様に、本開示の真菌細胞は、完全長（野生型）Ａｃｅ３ Ｃ末端（例えば、Ａｃｅ３－ＬＣ；配列番号：２）をコードする内因性ａｃｅ３遺伝子の存在をスクリーニングされ得る。例えば、図４は、Ａｃｅ３－ＬＣタンパク質の完全長（野生型）Ｃ末端を示す（配列番号：２）。したがって、特定の実施形態では、完全長（野生型）Ｃ末端をコードする内因性ａｃｅ３遺伝子を含むものとしてスクリーニングされ確認された親真菌細胞は、完全長（野生型）Ｃ末端の少なくとも７個、１７個以下のアミノ酸を欠失（トランケート）するように、本明細書において遺伝子改変される。したがって、図４に示すように、灰色の陰影（すなわち、－７位（Ｔ）～－１７位（Ｄ））で示されるＡｃｅ３ Ｃ末端アミノ酸残基位置は、以下にさらに記載されるように、Ａｃｅ３ Ｃ末端で許容されるアミノ酸の欠失（トランケーション）の最小（少なくとも７）及び最大数（１７以下）を示す。

他の実施形態では、本開示の改変糸状菌細胞は、さらなる遺伝子改変を含むであろう。例えば、特定の実施形態では、このようなバリアント糸状菌細胞は、炭素カタボライト抑制タンパク質「Ｃｒｅ１」又は「Ａｃｅ１」抑制タンパク質をコードする遺伝子の発現及び／又は活性を低下させる遺伝子改変をさらに含み得る。他の実施形態では、このような改変糸状菌細胞は、キシラナーゼ調節因子１（Ｘｙｒ１）の少なくとも１つのコピーを導入する遺伝子改変をさらに含む。

本明細書で使用される場合、「宿主細胞」という用語は、本明細書に記載されているように、入来配列（すなわち、細胞に導入されるポリヌクレオチド配列）のための、宿主及び発現ビヒクルとして作用する能力を有する糸状菌細胞を指す。

「異種」核酸コンストラクト又は配列は、それが発現される細胞に対して天然でないか、又は天然の形態で存在しない配列の一部を有する。制御配列に関して、異種とは、現在発現を調節している同じ遺伝子に対して天然においては調節作用をしない制御配列（例えば、プロモーター、エンハンサー）を指す。一般に、異種核酸配列は、それらが存在する細胞又はゲノムの一部に対して内因性ではなく、感染、トランスフェクション、形質転換、マイクロインジェクション、エレクトロポレーションなどによって細胞に加えられたものである。「異種」核酸コンストラクトは、天然細胞に見出される制御配列／ＤＮＡコード配列の組み合わせと同一であるか、又は異なる制御配列／ＤＮＡコード配列の組み合わせを含み得る。同様に、異種タンパク質は、天然において互いに同じ関係で見出されない２つ以上のサブ配列（例えば、融合タンパク質）を指すことが多い。

本明細書で使用される場合、「プロモーター」という用語は、下流の遺伝子又はそのオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）の転写を指示するように機能する核酸配列を指す。プロモーターは一般に、標的遺伝子が発現している宿主細胞に適切である。プロモーターは他の転写及び翻訳調節核酸配列（「制御配列」とも呼ばれる）と共に、所与の遺伝子を発現させるために必要である。一般に、転写及び翻訳調節配列には、プロモーター配列、リボソーム結合部位、転写開始及び転写停止配列、翻訳開始及び翻訳停止配列、並びにエンハンサー又は活性化因子の配列が含まれるが、これらに限定されない。特定の実施形態では、プロモーターは誘導性プロモーターである。他の実施形態では、プロモーターは構成的プロモーターである。

本明細書で使用される場合、「プロモーター配列」は、発現目的のために特定の糸状菌によって認識されるＤＮＡ配列である。「プロモーター」は、核酸の転写を指示する核酸制御配列のアレイと定義される。本明細書で使用される場合、プロモーターには、転写開始部位近傍の必要な核酸配列を、例えば、ポリメラーゼＩＩ型プロモーターの場合にはＴＡＴＡエレメントを、含む。「構成的」プロモーターは、殆どの環境及び発生条件下で活性なプロモーターである。「誘導性」プロモーターは、特定の環境又は発生の調節下で活性なプロモーターである。

本明細書で使用される場合、「作動可能に連結された」という用語は、核酸発現制御配列（例えば、プロモーター、又は転写因子結合部位のアレイ）と第２の核酸配列との機能的な連結を指し、発現制御配列が第２の配列に対応する核酸の転写を指示する。したがって、核酸は、それが別の核酸配列と機能的関係に配置されたとき、「作動可能に連結されて」いる。例えば、分泌リーダー（すなわち、シグナルペプチド）をコードするＤＮＡは、ポリペプチドの分泌に関与するプレタンパク質として発現する場合、ポリペプチドをコードするＤＮＡに作動可能に連結されており；プロモーター又はエンハンサーは、配列の転写に影響する場合、コード配列に作動可能に連結されており；又はリボソーム結合部位は、翻訳を促進するように配置されている場合、コード配列に作動可能に連結されている。一般に、「作動可能に連結された」は、連結されるＤＮＡ配列が隣接しており、分泌リーダーの場合には、隣接し、且つリーディング相にあることを意味する。しかしながら、エンハンサーは、隣接している必要はない。連結は、便宜的な制限部位でのライゲーションによって行われる。そのような部位が存在しない場合は、従来の手法に従って、合成オリゴヌクレオチドアダプター又はリンカーが使用される。他の実施形態では、連結は、ＤＮＡを配列に依存せず瘢痕を残さない方法で結合するシームレスクローニング法によって行われる。シームレスクローニングは、通常、Ｇｉｂｓｏｎ Ａｓｓｅｍｂｌｙ（ＮＥＢ）、ＮＥＢｕｉｌｄｅｒ ＨｉＦｉ ＤＮＡ Ａｓｓｅｍｂｌｙ（ＮＥＢ）、Ｇｏｌｄｅｎ Ｇａｔｅ Ａｓｓｅｍｂｌｙ（ＮＥＢ）、及びＧｅｎｅＡｒｔ Ｓｅａｍｌｅｓｓ ｃｌｏｎｉｎｇ ａｎｄ Ａｓｓｅｍｂｌｙ ｓｙｓｔｅｍ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）などの商業的に入手可能なシステムを用いて実行されるが、これらに限定されない。

本明細書で使用される場合、「異種「プロモーター」又は「異種プロモーター配列」は、「上流（５’）異種プロモーター配列に作動可能に連結されたａｃｅ３遺伝子（又はそのＯＲＦ）」などの語句で使用される場合、「異種プロモーター」という語句は、天然ａｃｅ３プロモーター配と区別することを意味し、ａｃｅ３遺伝子に作動可能に連結された異種プロモーター配列は、本開示の糸状菌細胞において機能する任意のプロモーター配列であり得る（すなわち、天然ａｃｅ３遺伝子プロモーターを除く）。

同様に、「異種プロモーター配列」は、「目的タンパク質（ＰＯＩ）をコードする目的の遺伝子（ＧＯＩ）が、上流（５’）異種プロモーター配列に作動可能に連結されている」などの語句で使用される場合、語句「異種プロモーター」は目的の遺伝子の天然プロモーター配列と区別することを意味し、ＰＯＩをコードするＧＯＩに作動可能に連結された異種プロモーター配列は、本開示の糸状菌細胞において機能する任意のプロモーター配列であり得る（すなわち、ＧＯＩの天然プロモーターを除く）。

本明細書で使用される場合、「ＤＮＡコンストラクト」又は「発現コンストラクト」という用語は、少なくとも２つのＤＮＡポリヌクレオチドフラグメントを含む核酸配列を指す。ＤＮＡ又は発現コンストラクトを用いて、核酸配列を真菌宿主細胞に導入することができる。このＤＮＡはインビトロで（例えば、ＰＣＲで）又は任意の他の好適な手法によって生成し得る。いくつかの好ましい実施形態では、ＤＮＡコンストラクトは目的配列（例えば、Ａｃｅ３－Ｌタンパク質をコードする）を含む。特定の実施形態では、目的ポリヌクレオチド配列は、プロモーターに作動可能に連結される。いくつかの実施形態では、ＤＮＡコンストラクトは少なくとも１つの選択マーカーをさらに含む。さらなる実施形態では、ＤＮＡコンストラクトは、宿主細胞染色体に相同な配列を含む。他の実施形態では、ＤＮＡコンストラクトは、宿主細胞染色体とは非相同な配列を含む。

本明細書で使用される場合、「リグノセルロース分解」酵素という語句には、セロビオヒドロラーゼ、エンドグルカナーゼ及びβ－グルコシダーゼが含まれる。

本明細書で使用される場合、「セルラーゼ」、「セルロース分解酵素」又は「セルラーゼ酵素」という用語は、エキソグルカナーゼ、エキソセロビオヒドロラーゼ、エンドグルカナーゼ及び／又はβ－グルコシダーゼなどの細菌酵素又は真菌酵素を意味する。これらの異なるタイプのセルラーゼ酵素は、セルロース及びその誘導体をグルコースに変換するのに相乗的に働く。例えば、多くの微生物、例えば、木材腐朽菌のトリコデルマ属（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）、堆肥化細菌のテルモモノスポラ属（Ｔｈｅｒｍｏｍｏｎｏｓｐｏｒａ）（現在は、テルモビフィダ属（Ｔｈｅｒｍｏｂｉｆｉｄａ））、バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）、及びセルロモナス属（Ｃｅｌｌｕｌｏｍｏｎａｓ）；ストレプトミケス属（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）；並びに真菌フミコーラ属（Ｈｕｍｉｃｏｌａ）、アスペルギルス属（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）、及びフザリウム属（Ｆｕｓａｒｉｕｍ）は、セルロースを加水分解する酵素を産生する。これらの微生物が産生する酵素は、セルロースのグルコースへの変換に有用な３種類の作用を有するタンパク質の混合物、すなわちエンドグルカナーゼ（ＥＧ）、セロビオヒドロラーゼ（ＣＢＨ）、及びβ－グルコシダーゼ（ＢＧ）の混合物である。本明細書の定義では、「エンドグルカナーゼ」（ＥＧ）、「セロビオヒドロラーゼ」（ＣＢＨ）及び「β－グルコシダーゼ」（ＢＧ）という用語は、それぞれ、それらの略語「ＥＧ」、「ＣＢＨ」及び「ＢＧ」と互換的に使用される。

本明細書で使用される場合、用語「コード配列」は、その（コードされた）タンパク質産物のアミノ酸配列を直接的に指定するヌクレオチド配列を指す。コード配列の境界は、一般に、通常ＡＴＧ開始コドンで始まるオープンリーディングフレームによって決まる。コード配列には、通常、ＤＮＡ、ｃＤＮＡ、及び組換えヌクレオチド配列が含まれる。

本明細書の定義では、「オープンリーディングフレーム」（以下「ＯＲＦ」）は、（ｉ）開始コドン、（ｉｉ）アミノ酸を示す一連のコドン、及び（ｉｉｉ）終止コドンからなる連続するリーディングフレームを含む核酸又は核酸配列（天然に存在するか、天然に存在しないか、又は合成であるかにかかわらず）を意味し、ＯＲＦは、５’から３’の方向に読み取られる（又は翻訳される）。

本明細書で使用される場合、「遺伝子」という用語は、ポリペプチド鎖の生成に関与するＤＮＡのセグメントを意味し、これは、コード領域の前後の領域（例えば、５’非翻訳（５’ＵＴＲ）配列又は「リーダー」配列、及び３’ＵＴＲ配列又は「トレーラー」配列、並びに個々のコードセグメント（エクソン）間の介在配列（イントロン）を含んでいても含んでいなくてもよい。遺伝子は、酵素（例えば、プロテアーゼ、マンナナーゼ、キシラナーゼ、アミラーゼ、グルコアミラーゼ、セルラーゼ、オキシダーゼ、リパーゼなど）などの商業的に重要な工業用タンパク質又はペプチドをコードし得る。目的遺伝子は、天然に存在する遺伝子、変異遺伝子又は合成遺伝子であり得る。

細胞、核酸、タンパク質、又はベクターに関して使用する場合の「組換え」という用語は、本明細書で使用される場合、細胞、核酸、タンパク質、又はベクターが、異種核酸又は異種タンパク質の導入によって、又は天然の核酸又はタンパク質の改変によって改変されていること、又は細胞がそのように改変された細胞に由来することを示す。したがって、例えば、組換え細胞は、細胞の天然（非組換え）形態内には見出されない遺伝子を発現するか、又はさもなければ異常に発現する、過少発現する、若しくは全く発現しない天然遺伝子を発現する。

「ベクター」という用語は、本明細書では、１つ以上の細胞型に導入する核酸配列を保有するように設計されたポリヌクレオチドと定義される。ベクターには、クローニングベクター、発現ベクター、シャトルベクター、プラスミド、ファージ又はウイルス粒子、ＤＮＡコンストラクト、カセットなどが含まれる。発現ベクターには、プロモーター、シグナル配列、コード配列及び転写ターミネーターなどの調節配列が含まれ得る。

本明細書で使用される「発現ベクター」は、好適な宿主中でタンパク質を発現させることができる好適な制御配列に、作動可能に連結されたコード配列を含むＤＮＡコンストラクトを意味する。そのような制御配列には、転写を生じさせるプロモーター、転写を制御する任意選択的なオペレーター配列、ｍＲＮＡ上の好適なリボソーム結合部位をコードする配列、エンハンサー、並びに転写及び翻訳の終了を制御する配列が含まれ得る。

本明細書で使用される場合、「分泌シグナル配列」という用語は、より大きなポリペプチドの成分として、そのより大きなポリペプチドに、それが合成された細胞の分泌経路を通過させるポリペプチド（すなわち、「分泌ペプチド」）をコードするＤＮＡ配列を意味する。より大きなポリペプチドは、通常、分泌経路を通る過程で切断され、分泌ペプチドが除去される。

本明細書で使用される場合、「誘導」という用語は、「インデューサー」（すなわち、誘導基質）の存在に応じて、極めて大きい速度で糸状菌細胞中での目的タンパク質（ＰＯＩ）の合成をもたらす遺伝子の転写の増加を指す。ＰＯＩをコードする「目的遺伝子」（ＧＯＩ）又は「目的ＯＲＦ」の「誘導」を測定するために、バリアント糸状菌（宿主）細胞を候補誘導基質（インデューサー）で処理し、誘導基質（インデューサー）で処理していない親糸状菌（対照、非改変）細胞と比較する。したがって、（未処理の）親（対照）細胞に１００％の相対タンパク質活性値を割り当てると、バリアント（改変）宿主細胞においてＰＯＩをコードするＧＯＩの誘導は、活性値（すなわち、対照細胞に対して）が１００％より大きい、１０５％より大きい、１１０％より大きい、１５０％より大きい、２００～５００％より大きい（すなわち、対照に対して）、又はそれより高い場合に達成される。

本明細書で使用される場合、「インデューサー（ｉｎｄｕｃｅｒ）」、「インデューサー（ｉｎｄｕｃｅｒｓ）」、「誘導基質（ｉｎｄｕｃｉｎｇ ｓｕｂｓｔｒａｔｅ）」又は「誘導基質（ｉｎｄｕｃｉｎｇ ｓｕｂｓｔｒａｔｅｓ）」は互換的に使用され、糸状菌細胞に「増加した量」のポリペプチド（例えば、酵素、レセプター、抗体など）を産生させる、又は誘導基質が存在しない場合に産生するもの以外の化合物／物質を産生させる任意の化合物を指す。誘導基質の例には、ソホロース、ラクトース、ゲンチビオース及びセルロースが含まれるが、これらに限定されない。

本明細書で使用される場合、用語「誘導供給材料」は、少なくとも糸状菌細胞に供給される「誘導基質」（ソホロース、ラクトース、ゲンチビオース、セルロース）を含む組成物を指す。

本明細書で使用される場合、「単離（された）」又は「精製（された）」という用語は、それが天然に結合している少なくとも１つの成分から取り出された糸状菌細胞、核酸又はポリペプチドを指す。

本明細書の定義では、「目的タンパク質」又は「ＰＯＩ」という用語は、糸状菌細胞において発現することが所望されるポリペプチドを指す。そのようなタンパク質は、酵素、基質結合タンパク質、表面活性タンパク質、構造タンパク質などであり得、高レベルで発現させることができ、商業化を目的とすることができる。目的タンパク質は、内因性遺伝子又は異種遺伝子によってコードされ得る。目的タンパク質は、細胞内で、又は分泌（細胞外）タンパク質として発現させることができる。

特定の実施形態では、本開示の糸状菌細胞において発現／産生させるＰＯＩをコードする遺伝子（又はＯＲＦ）は、ＰＯＩをコードする遺伝子又はＯＲＦに作動可能に連結された上流（５’）セルラーゼ遺伝子プロモーター（例えば、ｃｂｈ１）を含む。したがって、セルラーゼプロモーター（例えば、ｃｂｈ１）の制御下でのＰＯＩをコードする遺伝子又はＯＲＦの発現は、本明細書に記載の改変Ａｃｅ３ ＴＦタンパク質の１つ又は複数の存在下でアップレギュレートされる。

本明細書で使用される場合、用語「ポリペプチド」及び「タンパク質」（並びに／又はそれらのそれぞれの複数形）は、互換的に使用され、ペプチド結合によって連結されたアミノ酸残基を含む任意の長さのポリマーを指す。本明細書では、アミノ酸残基に対する従来の１文字コード又は３文字コードを使用する。ポリマーは直鎖状であっても分枝状であってもよく、改変アミノ酸を含むことができ、非アミノ酸によって中断されていてもよい。これらの用語はまた、天然に又は介入によって修飾（例えば、ジスルフィド結合形成、グリコシル化、脂質化、アセチル化、リン酸化、又は標識成分との結合などの他の任意の操作若しくは修飾）されているアミノ酸ポリマーを包含する。また、例えば、アミノ酸の１つ又は複数のアナログ（例えば、非天然アミノ酸などを含む）、及び当該技術分野で知られている他の修飾を含むポリペプチドも、この定義内に含まれる。

本明細書で使用される場合、機能的及び／又は構造的に類似するタンパク質は、「関連タンパク質」であると見なされる。そのようなタンパク質は、属及び／若しくは種が異なる生物、又は分類の異なる生物（例えば、細菌及び真菌）に由来し得る。関連タンパク質はまた、一次配列分析によって決定されるか、二次若しくは三次構造分析によって決定されるか、又は免疫学的交差反応性によって決定される相同体を包含する。

本明細書で使用される場合、「実質的に活性を有しない」という語句、又は類似の語句は、特定の活性が混合物中で検出できないか、又は混合物の意図する目的を妨害しない量で存在することを意味する。

本明細書で使用される場合、用語「誘導ポリペプチド」は、Ｎ末端及びＣ末端の一方又は両方への１つ又は複数のアミノ酸の付加、アミノ酸配列中の１つ又は複数の異なる部位での１つ又は複数のアミノ酸の置換、タンパク質の一方若しくは両方の末端での、又はアミノ酸配列中の１つ若しくは複数の部位での１つ若しくは複数のアミノ酸の欠失、及び／或いはアミノ酸配列中の１つ又は複数の部位での１つ又は複数のアミノ酸の挿入によって、タンパク質から得られるか、又は得ることができるタンパク質を指す。タンパク質誘導体の調製は、天然のタンパク質をコードするＤＮＡ配列を改変し、そのＤＮＡ配列を好適な宿主に形質転換し、その改変ＤＮＡ配列を発現させて誘導タンパク質を形成することによって達成することができる。

関連（及び誘導）タンパク質には、「バリアントタンパク質」が含まれる。バリアントタンパク質は、少数のアミノ酸残基における置換、欠失及び／又は挿入によって、参照／親タンパク質（例えば、野生型タンパク質）とは異なる。バリアントタンパク質と親タンパク質との間の異なるアミノ酸残基の数は、１個以上、例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、３０、４０、５０個又はそれ以上のアミノ酸残基であり得る。バリアントタンパク質は、参照タンパク質と少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、若しくは少なくとも約９９％、又はそれ以上のアミノ酸配列同一性を共有し得る。バリアントタンパク質はまた、選択されたモチーフ、ドメイン、エピトープ、保存領域などにおいて、参照タンパク質と異なっていてもよい。

本明細書で使用される場合、用語「相同タンパク質」は、参照タンパク質と類似した活性及び／又は構造を有するタンパク質を指す。相同体が必ずしも進化的に関連しているということではない。したがって、この用語は異なる生物から得られる、同一の、類似の、又は対応するタンパク質（すなわち、構造及び機能に関して）を包含することが意図されている。いくつかの実施形態では、参照タンパク質に類似の四次、三次及び／又は一次構造を有する相同体を特定することが望ましい。いくつかの実施形態では、相同タンパク質は、参照タンパク質と類似の免疫応答を誘導する。いくつかの実施形態では、相同タンパク質は、所望の活性を有する酵素を産生するように遺伝子操作される。

配列間の相同性の程度は、当該技術分野で周知の任意の好適な方法を使用して決定し得る（例えば、Ｓｍｉｔｈ ａｎｄ Ｗａｔｅｒｍａｎ，１９８１；Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ ａｎｄ Ｗｕｎｓｃｈ，１９７０；Ｐｅａｒｓｏｎ ａｎｄ Ｌｉｐｍａｎ，１９８８；Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｐａｃｋａｇｅ（Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）のＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＦＡＳＴＡ及びＴＦＡＳＴＡなどのプログラム；並びにＤｅｖｅｒｅｕｘ ｅｔ ａｌ．，１９８４を参照されたい）。

本明細書で使用される場合、「実質的に類似」及び「実質的に同一」という語句は、少なくとも２つの核酸又はポリペプチドとの関連では、通常、ポリヌクレオチド又はポリペプチドが参照（すなわち、野生型）配列と比較して少なくとも約７０％の同一性、少なくとも約７５％の同一性、少なくとも約８０％の同一性、少なくとも約８５％の同一性、少なくとも約９０％の同一性、少なくとも約９１％の同一性、少なくとも約９２％の同一性、少なくとも約９３％の同一性、少なくとも約９４％の同一性、少なくとも約９５％の同一性、少なくとも約９６％の同一性、少なくとも約９７％の同一性、少なくとも約９８％の同一性、又は少なくとも約９９％若しくはそれ以上の同一性を有する配列を含むことを意味する。配列同一性は、標準的なパラメーターを用いて、ＢＬＡＳＴ、ＡＬＩＧＮ及びＣＬＵＳＴＡＬ等の公知のプログラムを使用して決定することができる

本明細書で使用される場合、「遺伝子の欠失」は、宿主細胞のゲノムからの遺伝子の除去を指す。遺伝子が遺伝子のコード配列に直接隣接して位置していない制御エレメント（例えば、エンハンサーエレメント）を含む場合、遺伝子の欠失は、コード配列の欠失を指し、また任意選択的に、例えば、プロモーター配列及び／又はターミネーター配列を含むがこれらに限定されない隣接エンハンサーエレメントの欠失を指す。

本明細書で使用される場合、「遺伝子の破壊」は、広くは、細胞が宿主細胞内で機能的遺伝子産物、例えば、タンパク質を産生するのを実質的に妨げる任意の遺伝子操作又は化学的操作、すなわち、変異を指す。例示的な破壊方法としては、ポリペプチドコード配列、プロモーター、エンハンサー、若しくは別の調節エレメントを含む、遺伝子の任意の部分の完全若しくは部分的な欠失、又はその変異誘発が挙げられ、変異誘発は、置換、挿入、欠失、逆位、並びにそれらの組み合わせ及び変形形態を包含し、その変異はいずれも機能的遺伝子産物の産生を実質的に妨げる。遺伝子の発現はまた、ＲＮＡｉ、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９、又は遺伝子発現を消失、減少又は低減する任意の他の方法を使用して破壊することができる。

本明細書で使用される場合、「好気性発酵」は、酸素の存在下における増殖を指す。

本明細書で使用される場合、「細胞ブロス」という用語は、液体培養／浸漬培養における培地及び細胞を集合的に指す。

本明細書で使用される場合、「細胞集団」という用語は、液体培養／浸漬培養中に存在する細胞成分（インタクト細胞及び溶解細胞を含む）を指す。細胞集団は、乾燥重量又は湿潤重量で表すことができる。

本明細書で使用される場合、「機能性タンパク質」は、酵素活性、結合活性、表面活性特性などの活性を有し、且つ、その活性を消失又は減少させるために、変異誘発されたり、トランケートされたり、又はその他の改変がなされていないタンパク質である。

本明細書で使用される場合、「機能性遺伝子」は、活性な遺伝子産物、一般的にはタンパク質を産生するために、細胞成分が使用し得る遺伝子である。機能性遺伝子は、細胞成分が活性遺伝子産物を産生するために使用することができないか、又は細胞成分が活性遺伝子産物を産生するために使用する能力が低下するように改変された破壊された遺伝子とは正反対のものである。

本明細書で使用される場合、「目的タンパク質」は、糸状菌細胞の浸漬培養において産生が所望されるタンパク質である。一般に、目的タンパク質は、工業、医薬、動物の健康、並びに食品及び飲料の用途において商業的に重要なものであり、大量に生産することが望ましい。目的タンパク質は、糸状菌細胞によって発現される、数え切れないほどの他のタンパク質（これらは一般に産物として関心がもたれるものではなく、主にバックグラウンドのタンパク質混入物と考えられる）と区別されるべきものである。

ＩＩＩ．セルラーゼ発現の活性化因子３（Ａｃｅ３）
Ｈａｋｋｉｎｅｎ ｅｔ ａｌ．（２０１４）の概説されているように、「セルラーゼ発現の活性化因子３」（ａｃｅ３）と命名されたＴ．リーゼイ（Ｔ．ｒｅｅｓｅｉ）遺伝子は、「Ａｃｅ３」と命名された転写因子（ＴＦ）タンパク質をコードし、Ａｃｅ３ ＴＦはセルラーゼ及びヘミセルラーゼの遺伝子発現を調節する。さらに、出願人の国際公開第２０１８／０６７５９９号パンフレットでは、誘導基質（例えば、ラクトース、ソホロープス）の非存在下でのＴ．リーゼイ（Ｔ．ｒｅｅｓｅｉ）株におけるセルラーゼ／ヘミセルラーゼの発現／産生をアップレギュレートすることができるＡｃｅ３ ＴＦタンパク質の特定のバリアント形態が特定されている。例えば、国際公開第２０１８／０６７５９９号パンフレットは、Ｈａｋｋｉｎｅｎ ｅｔ ａｌ．（２０１４）に記載のクローン化されたａｃｅ３ ＯＲＦ（すなわち、ａｃｅ３のＴ．リーゼイ（Ｔ．ｒｅｅｓｅｉ）「ＱＭ６ａ株」（注釈）に基づく）を、Ｔｒｅｅｓｅｉ「ＲＵＴ－Ｃ３０株」（注釈）に基づくａｃｅ３ ＯＲＦと比較して評価した際の驚くべき且つ予期しなかった結果を記載している。

より詳細には、国際公開第２０１８／０６７５９９号パンフレットでは、誘導基質の非存在下でのＴ．リーゼイ（Ｔ．ｒｅｅｓｅｉ）株におけるセルラーゼ／ヘミセルラーゼ遺伝子発現をアップレギュレートすることができるバリアントＡｃｅ３ ＴＦをコードする変異ａｃｅ３遺伝子が特定された。国際公開第２０１８／０６７５９９号パンフレットに記載されているように、ＲＬ－Ｐ３７及びＲＵＴ－Ｃ３０などのＴ．リーゼイ（Ｔ．ｒｅｅｓｅｉ）株における変異ａｃｅ３遺伝子は、バリアントＡｃｅ３ ＴＦのＣ末端に（すなわち、コードされた野生型Ａｃｅ３ ＴＦタンパク質のＣ末端と比較して）、１１個のアミノ酸のトランケーションをもたらす早期終止コドンを含んでいた。例えば、本開示の図１Ａに示すように。「Ａｃｅ３－Ｓ」（配列番号４）と命名したバリアントＡｃｅ３タンパク質は、亜鉛二核クラスター（Ｚｎ_２Ｃｙｓ_６）ＤＮＡ結合ドメイン（すなわち、野生型Ａｃｅ３ ＴＦ亜鉛二核クラスター（Ｚｎ_２Ｃｙｓ_６）ＤＮＡ結合ドメイン；配列番号２９に見られるような）の６つのシステイン残基のうちの２つが欠失している、より短い（トランケートされた）Ｎ末端配列を有し、且つ図１Ｂに示すように、バリアントＡｃｅ３－Ｓ ＴＦタンパク質（配列番号４）は、グリシン（Ｇ）で終わる完全長（野生型）Ｃ末端を含む。さらに、国際公開第２０１８／０６７５９９号パンフレットに記載され、本開示の図１Ａに示すように、「Ａｃｅ３－ＬＣ」と命名した野生型Ａｃｅ３タンパク質（配列番号２）は、インタクトな亜鉛二核クラスター（Ｚｎ_２Ｃｙｓ_６）ＤＮＡ結合ドメイン（配列番号２９）を含む完全長Ｎ末端を含み、且つ図１Ｂに示すように、野生型Ａｃｅ３－ＬＣタンパク質（配列番号２）は、グリシン（Ｇ）で終わる完全長（野生型）Ｃ末端を含む。対照的に、本開示の図１Ａに示すように「Ａｃｅ３－Ｌ」（配列番号６）と命名したバリアントＡｃｅ３タンパク質は、は、インタクトな亜鉛二核クラスター（Ｚｎ_２Ｃｙｓ_６）ＤＮＡ結合ドメイン（配列番号２９）を含む完全長（野生型）Ｎ末端を含み、且つ図１Ｂに示すように、Ａｃｅ３－Ｌタンパク質（配列番号６）は、アスパラギン酸（Ｄ）で終わる１１個のアミノ酸がトランケートされたＣ末端を含む。Ｚｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．（２０１９）による最近の刊行物は、完全長亜鉛クラスター（Ｚｎ_２Ｃｙｓ_６）ＤＮＡ結合ドメインを有するＡｃｅ３バリアントがＤＮＡに結合することができるという本出願人の実験的観察をさらに実証した。

したがって、国際公開第２０１８／０６７５９９号パンフレットに概説されているように、バリアントＡｃｅ３－Ｌタンパク質（すなわち、Ｃ末端に１１個のアミノ酸のトランケーションを含む；配列番号６）をコードするａｃｅ３遺伝子（又はそのオープンリーディングフレーム）を含むトリコデルマ属（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）菌細胞は、バリアントＡｃｅ３－Ｓタンパク質（配列番号４）又は野生型Ａｃｅ３－ＬＣタンパク質（配列番号２）をコードするａｃｅ３遺伝子（又はそのオープンリーディングフレーム）を含むトリコデルマ属（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）菌細胞と比較して、誘導基質の非存在下でリグノセルロース分解酵素を産生することができた（すなわち、同一条件下で発酵／培養した場合）。より最近では、Ｃｈｅｎ ｅｔ ａｌ．（２０２０）による刊行物は、天然のａｃｅ３遺伝子座における最後の１１個のＣ末端アミノ酸残基のトランケーション（欠失）（すなわち、完全長（野生型）Ａｃｅ３ Ｃ末端と比較して）を有するバリアントＡｃｅ３ ＴＦタンパク質をコードする変異ａｃｅ３遺伝子を含むトリコデルマ属（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）菌細胞が、誘導条件下で野生型Ａｃｅ３タンパク質をコードする野生型ａｃｅ３遺伝子を含むトリコデルマ属（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）菌細胞と比較して、そのようなトリコデルマ属（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）菌細胞が増加した量のリグノセルロース分解酵素（例えば、セルラーゼ／ヘミセルラーゼ）を産生することを可能にするという本出願人の実験的観察をさらに実証した。

したがって、本開示の結果を他の著者の刊行物（例えば、Ｚｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．２０１９；Ｃｈｅｎ ｅｔ ａｌ．２０２０）の結果／観察と比較した場合、本出願人はこれらの観察の間に以下の差異があることを強調し注記する。例えば、本明細書に一般的に記載し、以下の実施例の項に示すように、本出願人は、（非改変）親株として天然の遺伝子座にトランケート型Ａｃｅ３ ＴＦタンパク質をコードするａｃｅ３遺伝子を有する株を使用し、（改変）娘株の異所性遺伝子座のバリアントＡｃｅ３ ＴＦタンパク質をコードするバリアントａｃｅ３遺伝子を過剰発現させる。したがって、本開示の（改変）娘細胞は、トランケートされたＣ末端を有する天然Ａｃｅ３ ＴＦタンパク質に加えて、過剰発現したバリアントＡｃｅ３ ＴＦタンパク質の混合物を産生する。対照的に、Ｃｈｅｎ ｅｔ ａｌ．（２０２０）の刊行物は、その天然遺伝子座にａｃｅ３のトランケーションのみを導入している。同様に、Ｚｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．（２０１９）の刊行物は、Ｔ．リーゼイ（Ｔ．ｒｅｅｓｅｉ）株ＱＭ６ａのａｃｅ３遺伝子座において、２つのバリアントＡｃｅ３ ＴＦタンパク質（ここで、第１のバリアントＡｃｅ３ ＴＦは、Ｎ末端に不完全な亜鉛クラスター（Ｚｎ_２Ｃｙｓ_６）ＤＮＡ結合ドメインを含み、且つ野生型Ｃ末端を含み、第２のバリアントＡｃｅ３ ＴＦは、Ｎ末端に完全な／インタクトな亜鉛クラスター（Ｚｎ_２Ｃｙｓ_６）ＤＮＡを含み、野生型Ｃ末端を含む、野生型Ａｃｅ３ ＴＦと類似しているが同一ではない）をその天然Ａｃｅ３ ＴＦの非存在下で過剰発現させるプロモータースワップ戦略を記載している。したがって、上記のＺａｎｇ ｅｔ ａｌ．（２０１９）及びＣｈｅｎ ｅｔ ａｌ．（２０２０）らによる２つの研究は、概して、誘導条件下（すなわち、誘導基質の存在下で培養／発酵された場合）でのタンパク質産生の特定の改善を実証するが、いずれの刊行物も、非誘導条件下（すなわち、誘導基質の非存在下で培養／発酵された場合）でのタンパク質産生の改善を実証又は記載していない。

本開示において、本出願人は、Ａｃｅ３－ＬＣ ＴＦタンパク質（配列番号２；この野生型Ａｃｅ３－ＬＣタンパク質は、リグノセルロース分解酵素を発現／産生するために誘導基質を必要とする）の野生型Ｃ末端を、Ａｃｅ３－Ｌ ＴＦタンパク質（配列番号６；このＡｃｅ３－Ｌタンパク質は、リグノセルロース分解酵素を発現／産生するために誘導基質を必要としない）のトランケートされたＣ末端と比較してさらに評価し分析した。より詳細には、以下の実施例１に記載するように、本出願人は、Ｃ末端に連続したアミノ酸欠失（トランケーション）を含むバリアントＡｃｅ３タンパク質をコードする複数のａｃｅ３発現ベクターを構築した。

例えば、５アミノ酸欠失増分を用いて、０アミノ酸欠失から２５アミノ酸欠失までの範囲のＣ末端欠失を含む６つのベクターからなる第１のセットを構築した（例えば、表１；セット１を参照）。同様に、１アミノ酸欠失増分を用いて、６アミノ酸欠失から１９アミノ酸欠失までの範囲のＣ末端欠失を含む１２のベクターからなる第２のセットを構築した（表１；セット２）。したがって、実施例１で構築された１８個のＡｃｅ３ Ｃ末端バリアントタンパク質（表３に列挙）は、Ａｃｅ３－ＬＣタンパク質配列（配列番号２）に基づいており、それは６８９位のグリシン（Ｇ）で終わる完全長（野生型）Ａｃｅ３ Ｃ末端を含む。

本出願人は、続いて、構築されたＴ．リーゼイ（Ｔ．ｒｅｅｓｅｉ）株（表３）を、「非誘導」条件（グルコース）及び「誘導」条件（グルコース／ソホロース、又はラクトース）下でのタンパク質産生について試験／スクリーニングした。例えば、図７に示すように。本出願人は、（Ａｃｅ３－ＬＣ）Ｃ末端バリアントを発現する６菌株からなる第１のセットを用いて総タンパク質産生を評価した。親対照株（ＲＬ－Ｐ３７）は、単に、ラクトース上で（すなわち、「誘導」条件下で）大量のタンパク質を産生することができ、グルコース上で（すなわち、「非誘導」条件下で）は最低基礎レベルのタンパク質を産生した。同様に、図７に示すように、１０アミノ酸欠失（Ｃｔｅｒｍ－１０）、１１アミノ酸欠失（Ｃｔｅｒｍ－１１）、又は１５アミノ酸欠失（Ｃｔｅｒｍ－１５）を有する（Ａｃｅ３－ＬＣ）Ｃ末端バリアントを発現する娘細胞は、ラクトース（「誘導」条件）及びグルコース（「非誘導」条件）の両方の下でタンパク質産生の増加を示した。例えば、図７に示すように。倍率変化の増加は、ラクトース上の親株（ＲＬ－Ｐ３７）によって産生されるタンパク質レベルと比較して、グルコース上で約１．８倍、ラクトース上の親株（ＲＬ－Ｐ３７）によって産生されるタンパク質レベルと比較して、ラクトース上で約３倍である。

対照的に、図７に示すように、野生型（Ａｃｅ３－ＬＣ）Ｃ末端（すなわち、０個のアミノ酸欠失を含む；配列番号２）、及び２０個のアミノ酸欠失（配列番号２１）、又は２５個のアミノ酸欠失（配列番号２２）を含む（Ａｃｅ３－ＬＣ）Ｃ末端バリアントは、ラクトース上及びグルコース上の両方で、総タンパク質の産生が大きく減少した。これらの結果は、野生型（Ａｃｅ３－ＬＣ）Ｃ末端のトランケーションがタンパク質産生をアップレギュレートする機能に必須であり、且つＡｃｅ３ Ｃ末端で許容されるアミノ酸とトランケーションの数に上限及び下限があることを示している。

野生型（Ａｃｅ３－ＬＣ）Ｃ末端における許容されるアミノ酸欠失の上限及び下限をさらに探索するために、本出願人は、１アミノ酸欠失増分を使用して、６アミノ酸欠失から１９アミノ酸欠失までの範囲のＣ末端欠失を含むＴ．リーゼイ（Ｔ．ｒｅｅｓｅｉ）株をスクリーニングした（例えば、表１、セット２；及び表３を参照）。例えば、図８に示すように。５又は６個のＣ末端アミノ酸のトランケーションは、親株と同様の結果を示した（すなわち、グルコース上での基礎タンパク質産生、及びラクトース上でのより高い産生）。対照的に、Ｃ末端の少なくとも最後の７個のアミノ酸の欠失（トランケーション）（図５）。及び１７個まで（１７個を含む）のアミノ酸の欠失（トランケーション）（図５）。は、図８に示すように、グルコース（非誘導）条件及びラクトース（誘導）条件の両方の下で、産生の改善を示した。

例えば、（Ａｃｅ３－ＬＣ）Ｃ末端バリアントのＣ－ｔｅｒｍ－７（配列番号：９）、Ｃ－ｔｅｒｍ－８（配列番号１０）、Ｃ－ｔｅｒｍ－９（配列番号１１）、Ｃ－ｔｅｒｍ－１０（配列番号１２）、Ｃ－ｔｅｒｍ－１２（配列番号１３）、Ｃ－ｔｅｒｍ－１３（配列番号１４）、Ｃ－ｔｅｒｍ－１４（配列番号１５）、Ｃ－ｔｅｒｍ－１５（配列番号１６）、Ｃ－ｔｅｒｍ－１６（配列番号１７）及びＣ－ｔｅｒｍ－１７（配列番号１８）を発現するＴ．リーゼイ（Ｔ．ｒｅｅｓｅｉ）株は、総タンパク質産生が、ラクトース上の親株ＲＬ－Ｐ３７と比較して、グルコース（非誘導性）条件下で約２倍の増加、及びラクトース上の親株ＲＬ－Ｐ３７と比較して、ラクトース（誘導性）条件下で約３倍の増加を示した。対照的に、野生型Ａｃｅ３－ＬＣタンパク質（すなわち、野生型Ａｃｅ３ Ｃ末端を含む；配列番号２）を発現するＴ．リーゼイ（Ｔ．ｒｅｅｓｅｉ）株のラクトース上のタンパク質の産生量は、ラクトース上の親株ＲＬ－Ｐ３７よりも減少し、グルコース上の産生量は最小であった（図８）。Ｃ末端に７個未満のアミノ酸欠失を有する（Ａｃｅ３－ＬＣ）Ｃ末端バリアントを発現するＴ．リーゼイ（Ｔ．ｒｅｅｓｅｉ）株は、グルコース上及びラクトース上で、同じ条件下の親株ＲＬ－Ｐ３７と同等の量のタンパク質を産生した。Ｃ末端に１７個を超えるアミノ酸欠失を含む（Ａｃｅ３－ＬＣ）Ｃ末端バリアントを発現するＴ．リーゼイ（Ｔ．ｒｅｅｓｅｉ）株は、タンパク質の産生量がグルコース条件下又はラクトース条件下で最小であった（図８）。

以下の実施例２に記載するように、本出願人は、ａｃｅ３遺伝子座におけるＣ末端トランケーション点変異（すなわち、Ａｃｅ３－Ｌをコードする；配列番号６）を（Ｇ）グリシンで終わるＱＭ６ａ（すなわち、Ａｃｅ３－ＬＣをコードする）の野生型（Ａｃｅ３）Ｃ末端配列に分子的に復帰させた（図１Ｂ；配列番号２）。より具体的には、実施例２に記載され、図９に示すように、本出願人は、３つの株のタンパク質産生を振盪フラスコ発酵において評価した。３つの株には、「Ｔ４ａｂｃ」株（Ａｃｅ３－Ｌをコードするａｃｅ３トランケーション対立遺伝子を含む；配列番号６）、「Ｔ４ａｂｃ ａｃｅ３＿ｒｅｖ」株（Ａｃｅ３－ＬＣをコードするａｃｅ３完全長対立遺伝子を含む；配列番号：２）、及び「Ｔ４ａｂｃ ｄｅｌ－ｃｂｈ１」株（その内因性セロビオヒドロラーゼ（ｃｂｈ１）遺伝子の欠失を含む）が含まれた。図９に示すように、ａｃｅ３変異（Ａｃｅ３－Ｌ；配列番号６）を野生型（完全長）Ａｃｅ３Ｃ末端（グリシン（Ｇ）で終わるＡｃｅ３－ＬＣ；配列番号２）をコードするように、Ｔ４ａｂｃバックグラウンドで復帰させた場合、総分泌タンパク質力価は約７３％減少した。比較のために、最も顕著な分泌タンパク質（Ｃｂｈ１）をコードする遺伝子（ｃｂｈ１）の欠失は、総分泌タンパク質力価を４７％だけ減少させた。

上記の天然Ａｃｅ３ Ｃ末端トランケーション（欠失）に加えて、本出願人は、本明細書に記載の特定の他のＡｃｅ３ Ｃ末端改変を企図し、構築し、試験し、検証した。より具体的には、そのいずれかの特定の機構又は操作方法に拘束されることを望むものではないが、本出願人は、Ａｃｅ３ Ｃ末端の他の遺伝子改変（例えば、置換、挿入、内部（Ｃ末端）欠失、及びこれらの組み合わせ）が、本明細書に記載されるように、タンパク質産生の改善に等しく好適な遺伝子改変であると考える。例えば、以下の実施例３に示すように、本出願人は、Ａｃｅ３ ＴＦ Ｃ末端バリアントライブラリーを構築し、そのようなライブラリーをスクリーニングして、トリコデルマ属（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）菌細胞におけるタンパク質の生産性を改善するための組成物及び方法を記載する。Ａｃｅ３のＣ末端バリアントライブラリーは、配列番号２のアミノ酸位置６４１～６８９をコードする完全長（野生型）Ａｃｅ３－ＬＣ Ｃ末端のコード配列の改変によって生成される。例えば、図１５（配列番号３０）は、アミノ酸位置Ｓ６４１～Ｇ６８９をコードする完全長（野生型）Ａｃｅ３－ＬＣ Ｃ末端を示す。より具体的には、本出願人は、部位置換ライブラリー（ライブラリー１）、走査挿入ライブラリー（ライブラリー２）及び走査欠失ライブラリー（ライブラリー３）を含む３つの異なるＡｃｅ３ Ｃ末端ライブラリーを記載する。

本開示の実施例４は、Ａｃｅ３－ＬＣタンパク質のＣ末端の最後の１１個のアミノ酸残基の、Ｖ５エピトープタグ又はＶ５－（６×Ｈｉｓ）タンデムタグによる分子置換を記載しており、Ｃ末端Ｖ５タグ置換を有するＡｃｅ３－ＬＣタンパク質（すなわち、Ａｃｅ３－ＬＣ－Ｖ５）を発現するか、又はＣ末端Ｖ５－（６×Ｈｉｓ）タンデムタグ置換を有するＡｃｅ３－ＬＣタンパク質（すなわち、Ａｃｅ３ ＬＣ－Ｖ５－（６×Ｈｉｓ））を発現するトリコデルマ属（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）の菌株を、「非誘導」（Ｇｌｕ）及び「誘導」（Ｇｌｕ／Ｓｏｐ）の両条件下で試験した（発酵させた）。

例えば、１１アミノ酸トランケーションを含むバリアントＡｃｅ３－Ｌ ＴＦタンパク質（配列番号６）を含み、発現する改変（娘）Ｔ．リーゼイ（Ｔ．ｒｅｅｓｅｉ）細胞は、誘導（Ｇｌｕ／Ｓｏｐ）及び非誘導（Ｇｌｕ）の両条件下で、大量の分泌タンパク質を産生した。さらに、Ａｃｅ３－ＬＣ－Ｖ５（すなわち、最後の１１個のアミノ酸の１４アミノ酸置換を含む）を含み、発現する改変（娘）Ｔｒｅｅｓｅｉ細胞、及びＡｃｅ３－ＬＣ－Ｖ５－（６×Ｈｉｓ）（すなわち、最後の１１個のアミノ酸の２３アミノ酸置換を含む）を含み、発現するバリアント（娘）Ｔ．リーゼイ（Ｔ．ｒｅｅｓｅｉ）細胞もまた、誘導（Ｇｌｕ／Ｓｏｐ）及び非誘導（Ｇｌｕ）の両条件下で、Ａｃｅ３－Ｌバリアントよりも約１０％低いものの、高いタンパク質生産性を示した（図１４を参照）。したがって、これらの結果は、以下に限定されないが、置換、挿入、内部（Ｃ末端）欠失、及びこれらの組み合わせを含むＡｃｅ３ Ｃ末端の遺伝子改変が、本明細書に記載されるように、タンパク質の生産性の改善に等しく好適な遺伝子改変であることを示している。

ＩＶ．組換え核酸及び分子生物学
特定の実施形態において、本開示は、バリアントＡｃｅ３ ＴＦタンパク質をコードする単離されたポリヌクレオチド（核酸配列）を対象としている。特定の実施形態では、バリアントＡｃｅ３ ＴＦは、配列番号２のアミノ酸位置１～６７２に対して少なくとも９０％の配列同一性を含み、且つ配列番号２の６７３～６８９位から選択される１つ又は複数のＣ末端アミノ酸残基の遺伝子改変を含む。したがって、特定の他の実施形態は、本開示のバリアントＡｃｅ３ ＴＦタンパク質をコードするａｃｅ３遺伝子を含む遺伝子改変トリコデルマ属（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）菌細胞に関し、この改変細胞は、誘導基質の非存在下で目的タンパク質（ＰＯＩ）を産生することができ、且つ／又はこの改変細胞は、誘導基質の存在下で増加した量のＰＯＩを産生することができる。特定の実施形態では、「改変」又は「遺伝子改変」に以下が含まれる：（ａ）遺伝子（若しくはそのＯＲＦ）における１つ又は複数のヌクレオチドの導入、置換、若しくは除去、又は遺伝子若しくはそのＯＲＦの転写若しくは翻訳に必要な調節エレメントにおける１つ若しくは複数のヌクレオチドの導入、置換、若しくは除去、（ｂ）遺伝子破壊、（ｃ）遺伝子変換、（ｄ）遺伝子欠失、（ｅ）遺伝子のダウンレギュレーション、（ｆ）特異的変異誘発、及び／或いは（ｇ）本明細書に開示される任意の１つ若しくは複数の遺伝子のランダム変異誘発。

したがって、特定の実施形態では、本開示は、Ａｃｅ３タンパク質をコードする遺伝子又はＯＲＦ含む組換え核酸に対象とする。特定の実施形態では、組換え核酸は、糸状菌宿主細胞内でＡｃｅ３バリアントタンパク質を産生するためのポリヌクレオチド発現カセットを含む。他の実施形態では、ポリヌクレオチド発現カセットは、発現ベクター内に含まれる。特定の実施形態では、発現ベクターはプラスミドである。

他の特定の実施形態では、組換え核酸（又はそのポリヌクレオチド発現カセット若しくはその発現ベクター）は、１つ又は複数の選択マーカーをさらに含む。糸状菌に使用するための選択マーカーとしては、以下に限定されないが、ａｌｓｌ、ａｍｄＳ、ｈｙｇＲ、ｐｙｒ２、ｐｙｒ４、ｐｙｒＧ、ｓｕｃＡ、ブレオマイシン耐性マーカー、ブラストサイジン耐性マーカー、ピリチアミン耐性マーカー、クロリムロンエチル耐性マーカー、ネオマイシン耐性マーカー、アデニン経路遺伝子、トリプトファン経路遺伝子、チミジンキナーゼマーカーなどが挙げられる。特定の実施形態では、選択マーカーはｐｙｒ２であり、その成分及び使用方法は、国際公開第２０１１／１５３４４９号パンフレットに一般的に記載されている。したがって、特定の実施形態では、本開示のＡｃｅ３タンパク質をコードするポリヌクレオチドコンストラクトは、それに作動可能に連結された、選択マーカーをコードする核酸配列を含む。

別の実施形態では、組換え核酸、ポリヌクレオチドコンストラクト、ポリヌクレオチド発現カセット又はその発現ベクターは、バリアントＡｃｅ３タンパク質をコードする遺伝子（又はＯＲＦ）の発現を駆動する異種プロモーターを含む。より詳しくは、特定の実施形態では、異種プロモーターは構成的プロモーター又は誘導性プロモーターである。特定の実施形態では、異種プロモーターは、ｒｅｖ３プロモーター、ｂｘｌプロモーター、ｔｋｌ１プロモーター、ＰＩＤ１０４２９５プロモーター、ｄｌｄ１プロモーター、ｘｙｎ４プロモーター、ＰＩＤ７２５２６プロモーター、ａｘｅ１プロモーター、ｈｘｋ１プロモーター、ｄｉｃ１プロモーター、ｏｐｔプロモーター、ｇｕｔ１プロモーター及びｐｋｉ１プロモーターからなる群から選択される。したがって、特定の実施形態では、組換え核酸（又はポリヌクレオチドコンストラクト、ポリヌクレオチド発現カセット若しくはその発現ベクター）は、バリアントＡｃｅ３タンパク質をコードする核酸配列の５’に作動可能に連結したプロモーター配列を含む。

別の実施形態では、組換え核酸（又はポリヌクレオチドコンストラクト、ポリヌクレオチド発現カセット、若しくはその発現ベクター）は、天然ａｃｅ３ターミネーター配列をコードする核酸配列をさらに含む。したがって、特定の実施形態では、組換え核酸（又はポリヌクレオチドコンストラクト、ポリヌクレオチド発現カセット、若しくはその発現ベクター）は、Ａｃｅ３タンパク質をコードする核酸配列の５’に作動可能に連結した異種プロモーターを含み、またバリアントＡｃｅ３タンパク質をコードする核酸配列の３’に作動可能に連結した天然ａｃｅ３ターミネーター配列を含む（例えば、５’－Ｐｒｏ－ＯＲＦ－Ｔｅｒｍ－３’（ここで「Ｐｒｏ」は構成的プロモーターであり、「ＯＲＦ」はＡｃｅ３をコードし、「Ｔｅｒｍ」は天然ａｃｅ３ターミネーター配列である））。

調節配列又は制御配列の例は、プロモーター配列又はその機能的部分（すなわち、核酸配列の発現に十分に影響を及ぼす部分）であり得る。改変のための他の制御配列としては、リーダー配列、プロペプチド配列、シグナル配列、転写ターミネーター、転写活性化因子などが挙げられるがこれらに限定されない。

特定の他の実施形態では、目的タンパク質をコードする目的遺伝子（又はＯＲＦ）は、リグノセルロース分解酵素をコードする遺伝子に由来するプロモーター配列の制御下に置かれる。例えば、特定の実施形態では、目的タンパク質をコードする目的遺伝子（又はＯＲＦ）は、ＧＯＩの発現が本開示のバリアントＡｃｅ３ ＴＦタンパク質の存在下でアップレギュレートされるように、ｃｂｈ１プロモーターの制御下に置かれる。したがって、特定の実施形態では、リグノセルロース分解酵素をコードする遺伝子に由来するプロモーター配列は、セロビオヒドロラーゼプロモーター配列、エンドグルカナーゼプロモーター配列、β－グルコシダーゼプロモーター配列、又はキシラナーゼプロモーター配列である。

所定の実施形態では、本開示の改変トリコデルマ属（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）菌細胞は、当該技術分野においてよく知られた方法、例えば、挿入、破壊、置換又は欠失を使用して、目的遺伝子（ＧＯＩ）の発現を減少させる、又は排除することによって構築される。改変又は不活化対象の遺伝子部分は、例えば、コード領域、又はコード領域を発現させるために必要とされる調節エレメントであり得る。

特定の他の実施形態では、改変トリコデルマ属（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）菌細胞は、少なくとも１つのＧＯＩの発現を消失又は減少させる遺伝子欠失によって構築される。遺伝子欠失技術は、遺伝子の部分的又は完全な除去を可能にし、それによりそれらの発現を排除する、又は非機能的（若しくは活性が減少した）タンパク質産物を発現させる。そのような方法では、遺伝子の欠失は、遺伝子にフランキングする５’及び３’領域を隣接して含有するように構築されているプラスミドを用い、相同組換えによって遂行され得る。

他の実施形態では、本開示の改変トリコデルマ属（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）菌細胞は、それらの転写又は翻訳に必要とされる遺伝子又は調節エレメント内の１つ又は複数のヌクレオチドを導入するか、置換するか、又は除去することによって構築される。例えば、終止コドンの導入、開始コドンの除去、又はオープンリーディングフレームのフレームシフトを生じさせるように、ヌクレオチドを挿入又は除去し得る。このような改変は、当該技術分野で知られた方法に従って、部位特異的変異誘発又はＰＣＲ生成変異誘発によって達成され得る。

別の実施形態では、改変トリコデルマ属（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）菌細胞は、遺伝子変換プロセスによって構築される。例えば、遺伝子変換法では、遺伝子に対応する核酸配列をインビトロで変異させて欠陥のある核酸配列を生成し、次いで、この核酸配列を親トリコデルマ属（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）菌細胞に形質転換して欠陥のある遺伝子を生成する。相同組換えによって、欠陥のある核酸配列が内在性遺伝子に取って代わる。欠陥のある遺伝子又は遺伝子断片は又、欠陥のある遺伝子を含有する形質転換体の選択に使用され得るマーカーをコードすることが望ましい場合がある。例えば、欠陥のある遺伝子は、選択マーカーと会合している非複製プラスミド又は感温性プラスミドに導入され得る。プラスミドを組み込むための選択は、プラスミド複製を許容しない条件下でそのマーカーを選択することによって実施される。遺伝子置換をもたらす第２の組換え事象の選択は、選択マーカーの消失及び変異遺伝子の獲得についてコロニーを調査することによって実施される（Ｐｅｒｅｇｏ，１９９３）。或いは、欠陥のある核酸配列は、以下に記載するように、遺伝子の１つ又は複数のヌクレオチドの挿入、置換又は欠失を含有し得る。

他の実施形態では、改変トリコデルマ属（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）菌細胞は、遺伝子の核酸配列と相補的であるヌクレオチド配列を使用する確立されたアンチセンス技術によって構築される（Ｐａｒｉｓｈ ａｎｄ Ｓｔｏｋｅｒ，１９９７）。より具体的には、トリコデルマ属（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）菌細胞による遺伝子の発現は、この遺伝子の核酸配列に相補的なヌクレオチド配列を導入することにより低減（ダウンレギュレート）又は消失させることができ、それは細胞内で転写され得、細胞内で産生されるｍＲＮＡにハイブリダイズすることができる。したがって、相補的アンチセンスヌクレオチド配列がｍＲＮＡにハイブリダイズできる条件下では、翻訳されるタンパク質量は低減又は排除される。そのようなアンチセンス法としては、以下に限定されないが、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、アンチセンスオリゴヌクレオチドなどが挙げられ、これらの全てが当業者によく知られている。

他の実施形態では、改変トリコデルマ属（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）菌細胞は、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９編集によって作製／構築される。例えば、目的の遺伝子は、ＤＮＡ上の標的配列にエンドヌクレアーゼを動員するガイドＲＮＡ（例えば、Ｃａｓ９）及びＣｐｆ１又はガイドＤＮＡ（例えば、ＮｇＡｇｏ）に結合することによってそれらの標的ＤＮＡを見出す核酸誘導型エンドヌクレアーゼによって破壊（又は欠失又はダウンレギュレート）されてもよく、ここで、エンドヌクレアーゼは、ＤＮＡにおいて一本鎖又は二本鎖切断を生成することができる。この標的化ＤＮＡ切断は、ＤＮＡ修復のための基質となり、遺伝子を破壊又は欠失させるために提供された編集鋳型と再結合し得る。例えば、核酸誘導型エンドヌクレアーゼ（この目的のためには、Ｓ．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）由来のＣａｓ９）をコードする遺伝子、又はＣａｓ９ヌクレアーゼをコードするコドン最適化遺伝子は、トリコデルマ属（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）菌細胞内で活性なプロモーター及びトリコデルマ属（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）菌細胞内で活性なターミネーターに作動可能に連結されており、これによりトリコデルマ属（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）Ｃａｓ９発現カセットを生成する。同様に、目的遺伝子に固有の１つ又は複数の標的部位は、当業者により容易に同定される。例えば、目的の遺伝子内の標的部位に向けられたｇＲＮＡをコードするＤＮＡコンストラクトを構築するためには、可変ターゲティングドメイン（ＶＴ）は、そのヌクレオチドが、Ｓ．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）Ｃａｓ９（ＣＥＲ）に対するＣａｓ９エンドヌクレアーゼ認識ドメインをコードするＤＮＡに融合している、（ＰＡＭ）プロトスペーサー隣接モチーフ（ＴＧＧ）の５’側である標的部位のヌクレオチドを含むであろう。ＶＴドメインをコードするＤＮＡとＣＥＲドメインをコードするＤＮＡとの組み合わせは、それによりｇＲＮＡをコードするＤＮＡを生成する。したがって、ｇＲＮＡのためのトリコデルマ属（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）菌発現カセットは、トリコデルマ属（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）細胞内で活性なプロモーター及びトリコデルマ属（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）細胞内で活性なターミネーターにｇＲＮＡをコードするＤＮＡを作動可能に連結させることによって作製される。

特定の実施形態では、エンドヌクレアーゼによって誘導されたＤＮＡ切断は、入来配列を用いて修復／置換される。例えば、上述したＣａｓ９発現カセット及びｇＲＮＡ発現カセットによって生成されたＤＮＡ切断を精密に修復するためには、細胞のＤＮＡ修復機構が編集鋳型を利用できるように、ヌクレオチド編集鋳型が提供される。例えば、標的化遺伝子の約５００ｂｐの５’は、編集鋳型を生成するために標的化遺伝子の約５００ｂｐの３’に融合させることができ、その鋳型は、ＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼ（ＲＧＥＮ）によって生成されたＤＮＡ切断を修復するためにトリコデルマ属（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）宿主の機構によって使用される。

Ｃａｓ９発現カセット、ｇＲＮＡ発現カセット及び編集鋳型は、多数の様々な方法（例えば、プロトプラスト融合法、エレクトロポレーション法、天然コンピテンス又は誘導コンピテンス）を使用して糸状菌細胞に共送達することができる。形質転換細胞は、遺伝子座をフォワードプライマー及びリバースプライマーを用いて増幅させることによる、標的遺伝子座をＰＣＲ増幅させることによってスクリーニングされる。これらのプライマーは、野生型遺伝子座又はＲＧＥＮによって編集されている改変遺伝子座を増幅させることができる。

さらに他の実施形態では、改変トリコデルマ属（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）菌細胞は、化学的変異誘発及び転座を含むがそれらに限定されない当該技術分野においてよく知られる方法を使用して、ランダム変異誘発又は特異的変異誘発によって構築される。遺伝子の改変は、親細胞に変異誘発を受けさせること、及びその中で遺伝子の発現が低減又は消失されている変異細胞をスクリーニングすることによって実施され得る。変異誘発は、特異的であってもランダムであってもよいが、例えば、好適な物理的若しくは化学的変異誘発剤の使用によって、好適なオリゴヌクレオチドの使用によって、又はＤＮＡ配列をＰＣＲ生成変異誘発に供することによって実施され得る。さらに、変異誘発は、これらの変異誘発法を任意に組み合わせることにより実施され得る。本発明の目的に好適な物理的又は化学的な変異誘発剤の例としては、紫外線（ＵＶ）照射、ヒドロキシルアミン、Ｎ－メチル－Ｎ’－ニトロ－Ｎ－ニトロソグアニジン（ＭＮＮＧ）、Ｎ－メチル－Ｎ’－ニトロソグアニジン（ＮＴＧ）、Ｏ－メチルヒドロキシルアミン、亜硝酸、エチルメタンスルホネート（ＥＭＳ）、亜硫酸水素ナトリウム、蟻酸及びヌクレオチドアナログが挙げられる。このような薬剤を使用する場合、変異誘発は、一般的には、好適な条件の下、最適な変異誘発剤の存在下で変異誘発対象の親細胞をインキュベートする工程、及び遺伝子発現の減少、又は遺伝子発現を示さない変異細胞を選択する工程によって実施される。

したがって、特定の実施形態では、本開示の真菌宿主細胞を形質転換するために、糸状菌の形質転換及び真菌の培養のための標準的な手法（これは、当業者によく知られている）が使用される。したがって、真菌宿主細胞へのＤＮＡコンストラクト又はベクターの導入法には、形質転換、エレクトロポレーション、核マイクロインジェクション、形質導入、トランスフェクション（例えば、リポフェクション媒介及びＤＥＡＥ－デキストリン媒介トランスフェクション）、リン酸カルシウムＤＮＡ沈殿物とのインキュベーション、ＤＮＡ被覆微粒子を用いる高速銃、遺伝子銃又はバイオリスティック形質転換、プロトプラスト融合などの手法が含まれる。一般的な形質転換技術は当該技術分野で知られている（例えば、Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．，１９８７、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，２００１及び２０１２、並びにＣａｍｐｂｅｌｌ ｅｔ ａｌ．，１９８９を参照されたい）。トリコデルマ属（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）内での異種タンパク質の発現は、例えば、米国特許第６，０２２，７２５号明細書；同第６，２６８，３２８号明細書；Ｈａｒｋｋｉ ｅｔ ａｌ．，１９９１及びＨａｒｋｋｉ ｅｔ ａｌ．，１９８９に記載されている。アスペルギルス属（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）の株の形質転換については、Ｃａｏ ｅｔ ａｌ．（２０００）も参照されたい。

一般に、トリコデルマ属（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）菌の形質転換は、通常、１０^５～１０^７／ｍＬ、特に２×１０^６／ｍＬの密度で透過性処理を施したプロトプラスト又は細胞を使用する。適切な溶液中（例えば、１．２Ｍソルビトール及び５０ｍＭ ＣａＣｌ_２）の１００μＬの容量のこれらのプロトプラスト又は細胞を、所望のＤＮＡと混合する。一般に、高濃度のポリエチレングリコール（ＰＥＧ）が取り込み溶液に添加される。ジメチルスルホキシド、ヘパリン、スペルミジン、塩化カリウムなどの添加剤もまた、形質転換を促進するために取り込み溶液に添加し得る。同様の手順は、他の真菌宿主細胞についても利用可能である。例えば、米国特許第６，０２２，７２５号明細書及び同第６，２６８，３２８号明細書を参照されたい（これらは両者とも参照により組み込まれる）。

特定の実施形態では、本開示は、糸状菌宿主細胞に対して内因性である１種又は複数の目的タンパク質の発現及び産生を対象としている（すなわち、バリアントＡｃｅ３タンパク質を発現する遺伝子改変を含む、本開示のバリアント真菌宿主細胞によって、内因性タンパク質が産生される）。他の実施形態では、本開示は、糸状菌宿主細胞に対して異種である１つ又は複数の目的タンパク質の発現及び産生を対象としている。したがって、本開示は一般に、組換え遺伝学の分野におけるルーチンの手法に頼っている。本開示で使用する一般的な方法を開示する基本的なテキストとしては、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，（２^ｎｄＥｄｉｔｉｏｎ，１９８９）；Ｋｒｉｅｇｌｅｒ（１９９０）及びＡｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．，（１９９４）が挙げられる。

したがって、特定の実施形態では、目的タンパク質をコードする異種遺伝子又はＯＲＦが糸状菌（宿主）細胞に導入される。特定の実施形態では、異種遺伝子又はＯＲＦは、典型的には、複製及び／又は発現のために糸状菌（宿主）細胞に形質転換される前に、中間ベクターにクローニングされる。これらの中間ベクターは、例えば、プラスミド又はシャトルベクターなどの原核生物ベクターであり得る。特定の実施形態では、異種遺伝子又はＯＲＦの発現は、その天然のプロモーターの制御下にある。他の実施形態では、異種遺伝子又はＯＲＦの発現は、異種構成的プロモーター又は異種誘導性プロモーターであり得る異種プロモーターの制御下に置かれる。

当業者は、自然（天然）のプロモーターが、その機能を変化させることなく、１つ又は複数ヌクレオチドの取換え、置換、付加又は削除によって改変され得ることを知っている。本発明の実施は、プロモーターに対するそのような改変を包含するが、それらを強いるものではない。

発現ベクター／コンストラクトは、通常、異種配列の発現に必要な全ての追加のエレメントを含む転写ユニット又は発現カセットを含有する。例えば、典型的な発現カセットは、目的タンパク質をコードする異種核酸配列に作動可能に連結した５’プロモーターを含有し、転写物、リボソーム結合部位、及び翻訳終結の効率的なポリアデニル化に必要な配列シグナルをさらに含み得る。カセットの追加のエレメントには、エンハンサーと、ゲノムＤＮＡが構造遺伝子として使用される場合には、機能性スプライスドナー部位及びアクセプター部位を有するイントロンが含まれ得る。

プロモーター配列に加えて、発現カセットはまた、効率的な終結を提供するために、構造遺伝子の下流に転写終結領域を含み得る。終結領域は、プロモーター配列と同じ遺伝子から得てもよく、又は異なる遺伝子から得てもよい。本発明においては、任意の真菌ターミネーターが機能的である可能性が高いが、好ましいターミネーターには、トリコデルマ属（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）ｃｂｈＩ遺伝子由来のターミネーター、アスペルギルス・ニデュランス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｄｕｌａｎｓ）ｔｒｐＣ遺伝子由来のターミネーター（Ｙｅｌｔｏｎ ｅｔ ａｌ．，１９８４；Ｍｕｌｌａｎｅｙ ｅｔ ａｌ．，１９８５）、アスペルギルス・アワモリ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ａｗａｍｏｒｉ）若しくはアスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ）グルコアミラーゼ遺伝子（Ｎｕｎｂｅｒｇ ｅｔ ａｌ．，１９８４；Ｂｏｅｌ ｅｔ ａｌ．，１９８４）、及び／又はムコール・ミエヘイ（Ｍｕｃｏｒ ｍｉｅｈｅｉ）カルボキシルプロテアーゼ遺伝子（欧州特許第０２１５５９４号明細書）が含まれる。

遺伝子情報を細胞に輸送するために使用される特定の発現ベクターは、特に重要ではない。真核細胞又は原核細胞における発現に使用される、従来のベクターのいずれも使用し得る。標準的な細菌発現ベクターには、バクテリオファージλ及びＭ１３、並びにｐＢＲ３２２ベースのプラスミド、ｐＳＫＦ、ｐＥＴ２３Ｄなどのプラスミド、ＭＢＰ、ＧＳＴ及びＬａｃＺなどの融合発現系が含まれる。便宜的な単離方法を提供するために、組換えタンパク質にエピトープタグ、例えば、ｃ－ｍｙｃを添加することもできる。

発現ベクター中に含むことができるエレメントには、また、レプリコン、組換えプラスミドを保有する細菌の選択を可能にする抗生物質耐性をコードする遺伝子、又は異種配列の挿入を可能にするためのプラスミドの非必須領域における固有の制限部位があり得る。当該技術分野で知られている多くの耐性遺伝子のいずれもが好適であり得るため、選択された特定の抗生物質耐性遺伝子は確定的ではない。原核生物配列は、トリコデルマ・リーゼイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉ）におけるＤＮＡの複製又は組み込みを妨害しないように選択することが好ましい。

本発明の形質転換方法は、形質転換ベクターの全部又は一部の、糸状菌ゲノムへの安定な組み込みをもたらし得る。しかしながら、自己複製する染色体外形質転換ベクターの維持をもたらす形質転換も考えられる。

外来ヌクレオチド配列を宿主細胞に導入する既知の手順はいずれも使用し得る。これらには、リン酸カルシウムトランスフェクション法、ポリブレン法、プロトプラスト融合法、エレクトロポレーション法、バイオリスティックス法、リポソーム法、マイクロインジェクション法、血漿ベクター法、ウイルスベクター法、及び宿主細胞にクローン化ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、合成ＤＮＡ又は他の外来遺伝子物質を導入する方法として知られる他の任意の方法の使用が含まれる（例えば、上記のＳａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．を参照されたい）。米国特許第６，２５５，１１５号明細書に記載されているような、アグロバクテリウム属（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）媒介トランスフェクション法も有用である。使用する特定の遺伝子工学の手順が、異種遺伝子を発現し得る宿主細胞に少なくとも１つの遺伝子を首尾よく導入し得ることのみが必要である。

発現ベクターが細胞に導入された後、トランスフェクトされた細胞は、セルラーゼ遺伝子プロモーター配列の制御下で遺伝子の発現に有利な条件下で培養される。形質転換細胞の大きなバッチは、本明細書に記載のようにして培養することができる。最後に、標準的な手法を用いて培養物から生成物を回収する。

このように、本明細書における開示は、その発現が天然に存在するセルラーゼ遺伝子、融合ＤＮＡ配列、及び種々の異種コンストラクトを含む、セルラーゼ遺伝子プロモーター配列の制御下にある、所望のポリペプチドの発現及び増強された分泌を提供する。本発明はまた、このような所望産物を高レベルで発現及び分泌させる方法を提供する。

Ｖ．目的タンパク質
上記のように、本開示の特定の実施形態は、本明細書に記載のバリアントＡｃｅ３タンパク質をコードする遺伝子又はＯＲＦを発現する遺伝子改変を含む遺伝子改変糸状菌細胞に関する。より詳細には、特定の実施形態は、誘導基質の非存在下で、バリアントＡｃｅ３タンパク質をコードするそのような改変された真菌細胞において、目的タンパク質（ＰＯＩ）を発現／産生させるための組成物及び方法に関する。特定の他の実施形態は、誘導基質の存在下での、そのような改変された真菌細胞におけるＰＯＩの産生を増加させるための組成物及び方法に関する。

本明細書に記載されるように、目的タンパク質（ＰＯＩ）としては、ヘミセルラーゼ、ペルオキシダーゼ、プロテアーゼ、セルラーゼ、キシラナーゼ、リパーゼ、ホスホリパーゼ、エステラーゼ、クチナーゼ、ペクチナーゼ、ケラチナーゼ、レダクターゼ、オキシダーゼ、フェノールオキシダーゼ、リポキシゲナーゼ、リグニナーゼ、プルラナーゼ、タンナーゼ、ペントサナーゼ、マンナナーゼ、β－グルカナーゼ、ヒアルロニダーゼ、コンドロイチナーゼ、ラッカーゼ、アミラーゼ、グルコアミラーゼ、アセチルエステラーゼ、アミノペプチダーゼ、アミラーゼ類、アラビナーゼ、アラビノシダーゼ、アラビノフラノシダーゼ、カルボキシペプチダーゼ、カタラーゼ、デオキシリボヌクレアーゼ、エピメラーゼ、α－ガラクトシダーゼ、β－ガラクトシダーゼ、α－グルカナーゼ、グルカンライザーゼ、エンド－β－グルカナーゼ、グルコースオキシダーゼ、グルクロニダーゼ、インバーターゼ、イソメラーゼなどが挙げられるがこれらに限定されない。

したがって、特定の実施形態では、ＰＯＩは、ＥＣ１、ＥＣ２、ＥＣ３、ＥＣ４、ＥＣ５又はＥＣ６から成る群から選択される酵素委員会（ＥＣ）番号から選択される。

例えば、特定の実施形態では、ＰＯＩは、ＥＣ１．１０．３．２（例えば、ラッカーゼ）、ＥＣ１．１０．３．３（例えば、Ｌ－アスコルビン酸オキシダーゼ）、ＥＣ１．１．１．１（例えば、アルコール脱水素酵素）、ＥＣ１．１１．１．１０（例えば、塩化物ペルオキシダーゼ）、ＥＣ１．１１．１．１７（例えば、ペルオキシダーゼ）、ＥＣ１．１．１．２７（例えば、Ｌ－乳酸脱水素酵素）、ＥＣ１．１．１．４７（例えば、グルコース１－脱水素酵素）、ＥＣ１．１．３．Ｘ（例えば、グルコースオキシダーゼ）、ＥＣ１．１．３．１０（例えば、ピラノースオキシダーゼ）、ＥＣ１．１３．１１．Ｘ（例えば、ジオキシゲナーゼ）、ＥＣ１．１３．１１．１２（例えば、リノール酸ｌ３Ｓ－リポキシゲナーゼ）、ＥＣ１．１．３．１３（例えば、アルコールオキシダーゼ）、ＥＣ１．１４．１４．１（例えば、モノオキシゲナーゼ）、ＥＣ１．１４．１８．１（例えば、モノフェノールモノオキシゲナーゼ）、ＥＣ１．１５．１．１（例えば、スーパーオキシドジスムターゼ）、ＥＣ１．１．５．９（以前のＥＣ１．１．９９．１０、例えば、グルコース脱水素酵素）、ＥＣ１．１．９９．１８（例えば、セロビオース脱水素酵素）、ＥＣ１．１．９９．２９（例えば、ピラノース脱水素酵素）、ＥＣ１．２．１．Ｘ（例えば、脂肪酸還元酵素）、ＥＣ１．２．１．１０（例えば、アセトアルデヒド脱水素酵素）、ＥＣ１．５．３．Ｘ（例えば、フルクトシルアミン還元酵素）、ＥＣ１．８．１．Ｘ（例えば、ジスルフィド還元酵素）及びＥＣ１．８．３．２（例えば、チオールオキシダーゼ）から選択されるＥＣ１酵素（酸化還元酵素）を含むがそれらに限定されない酸化還元酵素である。

特定の実施形態では、ＰＯＩは、ＥＣ２．３．２．１３（例えば、トランスグルタミナーゼ）、ＥＣ２．４．１．Ｘ（例えば、ヘキソシルトランスフェラーゼ）、ＥＣ２．４．１．４０（例えば、アルテルナスクラーゼ）、ＥＣ２．４．１．１８（例えば、１，４α－グルカン分枝酵素）、ＥＣ２．４．１．１９（例えば、シクロマルトデキストリングルカノトランスフェラーゼ）、ＥＣ２．４．１．２（例えば、デキストリンデキストラナーゼ）、ＥＣ２．４．１．２０（例えば、セロビオースホスホリラーゼ）、ＥＣ２．４．１．２５（例えば、４－α－グルカノトランスフェラーゼ）、ＥＣ２．４．１．３３３（例えば、１，２－β－オリゴグルカンリントランスフェラーゼ）、ＥＣ２．４．１．４（例えば、アミロスクラーゼ）、ＥＣ２．４．１．５（例えば、デキストランスクラーゼ）、ＥＣ２．４．１．６９（例えば、ガラクトシド２－α－Ｌ－フコシルトランスフェラーゼ）、ＥＣ２．４．１．９（例えば、イヌロスクラーゼ）、ＥＣ２．７．１．１７（例えば、キシルロキナーゼ）、ＥＣ２．７．７．８９（以前のＥＣ３．１．４．１５、例えば、［グルタミンシンテターゼ］－アデニリル－Ｌ－チロシンホスホリラーゼ）、ＥＣ２．７．９．４（例えば、αグルカンキナーゼ）及びＥＣ２．７．９．５（例えば、ホスホグルカンキナーゼ）から選択されるＥＣ２（トランスフェラーゼ）酵素を含むがそれらに限定されないトランスフェラーゼ酵素である。

他の実施形態では、ＰＯＩは、ＥＣ３．１．Ｘ．Ｘ（例えば、エステラーゼ）、ＥＣ３．１．１．１（例えば、ペクチナーゼ）、ＥＣ３．１．１．１４（例えば、クロロフィラーゼ）、ＥＣ３．１．１．２０（例えば、タンナーゼ）、ＥＣ３．１．１．２３（例えば、グリセロール－エステルアシルヒドラーゼ）、ＥＣ３．１．１．２６（例えば、ガラクトリパーゼ）、ＥＣ３．１．１．３２（例えば、ホスホリパーゼＡ１）、ＥＣ３．１．１．４（例えば、ホスホリパーゼＡ２）、ＥＣ３．１．１．６（例えば、アセチルエステラーゼ）、ＥＣ３．１．１．７２（例えば、アセチルキシランエステラーゼ）、ＥＣ３．１．１．７３（例えば、フェルロイルエステラーゼ）、ＥＣ３．１．１．７４（例えば、クチナーゼ）、ＥＣ３．１．１．８６（例えば、ラムノガラクツロナンアセチルエステラーゼ）、ＥＣ３．１．１．８７（例えば、フモシンＢ１エステラーゼ）、ＥＣ３．１．２６．５（例えば、リボヌクレアーゼＰ）、ＥＣ３．１．３．Ｘ（例えば、リン酸物エステルヒドラーゼ）、ＥＣ３．１．３０．１（例えば、アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）ヌクレアーゼＳ１）、ＥＣ３．１．３０．２（例えば、セラチア・マルセッセンス（Ｓｅｒｒａｔｉａ ｍａｒｃｅｓｃｅｎｓ）ヌクレアーゼ）、ＥＣ３．１．３．１（例えば、アルカリホスファターゼ）、ＥＣ３．１．３．２（例えば、酸性ホスファターゼ）、ＥＣ３．１．３．８（例えば、３－フィターゼ）、ＥＣ３．１．４．１（例えば、ホスホジエステラーゼＩ）、ＥＣ３．１．４．１１（例えば、ホスホイノシチドホスホリパーゼＣ）、ＥＣ３．１．４．３（例えば、ホスホリパーゼＣ）、ＥＣ３．１．４．４（例えば、ホスホリパーゼＤ）、ＥＣ３．１．６．１（例えば、アリールスルファターゼ）、ＥＣ３．１．８．２（例えば、ジイソプロピル－フルオロホスファターゼ）、ＥＣ３．２．１．１０（例えば、オリゴ－１，６－グルコシダーゼ）、ＥＣ３．２．１．１０１（例えば、マンナンエンド－１，６－α－マンノシダーゼ）、ＥＣ３．２．１．１１（例えば、α－１，６－グルカン－６－グルカノヒドロラーゼ）、ＥＣ３．２．１．１３１（例えば、キシランα－１，２－グルクロノシダーゼ）、ＥＣ３．２．１．１３２（例えば、キトサンＮ－アセチルグルコサミノヒドロラーゼ）、ＥＣ３．２．１．１３９（例えば、α－グルクロニダーゼ）、ＥＣ３．２．１．１４（例えば、キチナーゼ）、ＥＣ３．２．１．１５１（例えば、キシログルカン－特異的エンド－β－１，４－グルカナーゼ）、ＥＣ３．２．１．１５５（例えば、キシログルカン－特異的エキソ－β－１，４－グルカナーゼ）、ＥＣ３．２．１．１６４（例えば、ガラクタンエンド－１，６－β－ガラクトシダーゼ）、ＥＣ３．２．１．１７（例えば、リゾチーム）、ＥＣ３．２．１．１７１（例えば、ラムノガラクツロナンヒドロラーゼ）、ＥＣ３．２．１．１７４（例えば、ラムノガラクツロナンラムノヒドロラーゼ）、ＥＣ３．２．１．２（例えば、β－アミラーゼ）、ＥＣ３．２．１．２０（例えば、α－グルコシダーゼ）、ＥＣ３．２．１．２２（例えば、α－ガラクトシダーゼ）、ＥＣ３．２．１．２５（例えば、β－マンノシダーゼ）、ＥＣ３．２．１．２６（例えば、β－フルクトフラノシダーゼ）、ＥＣ３．２．１．３７（例えば、キシラン１，４－β－キシロシダーゼ）、ＥＣ３．２．１．３９（例えば、グルカンエンド－１，３－β－Ｄ－グルコシダーゼ）、ＥＣ３．２．１．４０（例えば、α－Ｌ－ラムノシダーゼ）、ＥＣ３．２．１．５１（例えば、α－Ｌ－フコシダーゼ）、ＥＣ３．２．１．５２（例えば、β－Ｎ－アセチルヘキソサミニダーゼ）、ＥＣ３．２．１．５５（例えば、α－Ｎ－アラビノフラノシダーゼ）、ＥＣ３．２．１．５８（例えば、グルカン１，３－β－グルコシダーゼ）、ＥＣ３．２．１．５９（例えば、グルカンエンド－１，３－α－グルコシダーゼ）、ＥＣ３．２．１．６７（例えば、ガラクツラン１，４－α－ガラクツロニダーゼ）、ＥＣ３．２．１．６８（例えば、イソアミラーゼ）、ＥＣ３．２．１．７（例えば、１－β－Ｄ－フルクタンフルクタノヒドロラーゼ）、ＥＣ３．２．１．７４（例えば、グルカン１，４－グルコシダーゼ）、ＥＣ３．２．１．７５（例えば、グルカンエンド－１，６－β－グルコシダーゼ）、ＥＣ３．２．１．７７（例えば、マンナン１，２－（１，３）－α－マンノシダーゼ）、ＥＣ３．２．１．８０（例えば、フルクタンβ－フルクトシダーゼ）、ＥＣ３．２．１．８２（例えば、エキソ－ポリ－α－ガラクツロノシダーゼ）、ＥＣ３．２．１．８３（例えば、κ－カラギナーゼ）、ＥＣ３．２．１．８９（例えば、アラビノガラクタンエンド－１，４－β－ガラクトシダーゼ）、ＥＣ３．２．１．９１（例えば、セルロース１，４－β－セロビオシダーゼ）、ＥＣ３．２．１．９６（例えば、マンノシル－グリコプロテインエンド－β－Ｎ－アセチルグルコサミニダーゼ）、ＥＣ３．２．１．９９（例えば、アラビナンエンド－１，５－α－Ｌ－アラビナナーゼ）、ＥＣ３．４．Ｘ．Ｘ（例えば、ペプチダーゼ）、ＥＣ３．４．１１．Ｘ（例えば、アミノペプチダーゼ）、ＥＣ３．４．１１．１（例えば、ロイシルアミノペプチダーゼ）、ＥＣ３．４．１１．１８（例えば、メチオニルアミノペプチダーゼ）、ＥＣ３．４．１３．９（例えば、Ｘａａ－Ｐｒｏジペプチダーゼ）、ＥＣ３．４．１４．５（例えば、ジペプチジル－ペプチダーゼＩＶ）、ＥＣ３．４．１６．Ｘ（例えば、セリンタイプカルボキシペプチダーゼ）、ＥＣ３．４．１６．５（例えば、カルボキシペプチダーゼＣ）、ＥＣ３．４．１９．３（例えば、ピログルタミル－ペプチダーゼＩ）、ＥＣ３．４．２１．Ｘ（例えば、セリンエンドペプチダーゼ）、ＥＣ３．４．２１．１（例えば、キモトリプシン）、ＥＣ３．４．２１．１９（例えば、グルタミルエンドペプチダーゼ）、ＥＣ３．４．２１．２６（例えば、プロリルオリゴペプチダーゼ）、ＥＣ３．４．２１．４（例えば、トリプシン）、ＥＣ３．４．２１．５（例えば、トロンビン）、ＥＣ３．４．２１．６３（例えば、オリジン）、ＥＣ３．４．２１．６５（例えば、テルモミコリン）、ＥＣ３．４．２１．８０（例えば、ストレプトグリシンＡ）、ＥＣ３．４．２２．Ｘ（例えば、システインエンドペプチダーゼ）、ＥＣ３．４．２２．１４（例えば、アクチニジン）、ＥＣ３．４．２２．２（例えば、パパイン）、ＥＣ３．４．２２．３（例えば、フィカイン）、ＥＣ３．４．２２．３２（例えば、ステムブロメライン）、ＥＣ３．４．２２．３３（例えば、フルーツブロメライン）、ＥＣ３．４．２２．６（例えば、キモパパイン）、ＥＣ３．４．２３．１（例えば、ペプシンＡ）、ＥＣ３．４．２３．２（例えば、ペプシンＢ）、ＥＣ３．４．２３．２２（例えば、エンドチアペプシン）、ＥＣ３．４．２３．２３（例えば、ケカビペプシン）、ＥＣ３．４．２３．３（例えば、ガストリシン）、ＥＣ３．４．２４．Ｘ（例えば、メタロエンドペプチダーゼ）、ＥＣ３．４．２４．３９（例えば、デューテロリシン）、ＥＣ３．４．２４．４０（例えば、セラリシン）、ＥＣ３．５．１．１（例えば、アスパラギナーゼ）、ＥＣ３．５．１．１１（例えば、ペニシリンアミダーゼ）、ＥＣ３．５．１．１４（例えば、Ｎ－アシル－脂肪族－Ｌ－アミノ酸アミドヒドロラーゼ）、ＥＣ３．５．１．２（例えば、Ｌ－グルタミンアミドヒドロラーゼ）、ＥＣ３．５．１．２８（例えば、Ｎ－アセチルムラモイル－Ｌ－アラニンアミダーゼ）、ＥＣ３．５．１．４（例えば、アミダーゼ）、ＥＣ３．５．１．４４（例えば、プロテイン－Ｌ－グルタミンアミドヒドロラーゼ）、ＥＣ３．５．１．５（例えば、ウレアーゼ）、ＥＣ３．５．１．５２（例えば、ペプチド－Ｎ（４）－（Ｎ－アセチル－β－グルコサミニル）アスパラギンアミダーゼ）、ＥＣ３．５．１．８１（例えば、Ｎ－アシル－Ｄ－アミノ酸デアシラーゼ）、ＥＣ３．５．４．６（例えば、ＡＭＰデアミナーゼ）及びＥＣ３．５．５．１（例えば、ニトリラーゼ）から選択されるＥＣ３（ヒドロラーゼ）酵素を含むがそれらに限定されないヒドロラーゼ酵素である。

他の実施形態では、ＰＯＩは、ＥＣ４．１．２．１０（例えば、マンデロニトリルリアーゼ）、ＥＣ４．１．３．３（例えば、Ｎ－アセチルノイラミン酸リアーゼ）、ＥＣ４．２．１．１（例えば、炭酸脱水酵素）、ＥＣ４．２．２．－（例えば、ラムノガラクツロナンリアーゼ）、ＥＣ４．２．２．１０（例えば、ペクチンリアーゼ）、ＥＣ４．２．２．２２（例えば、ペクチン酸三糖リアーゼ）、ＥＣ４．２．２．２３（例えば、ラムノガラクツロナンエンドリアーゼ）及びＥＣ４．２．２．３（例えば、マンヌロン酸特異的アルギン酸リアーゼ）から選択されるＥＣ４（リアーゼ）酵素を含むがそれらに限定されないリアーゼ酵素である。

特定の他の実施形態では、ＰＯＩは、ＥＣ５．１．３．３（例えば、アルドース１－エピメラーゼ）、ＥＣ５．１．３．３０（例えば、Ｄ－プシコース３－エピメラーゼ）、ＥＣ５．４．９９．１１（例えば、イソマルツロースシンターゼ）及びＥＣ５．４．９９．１５（例えば、（１ ４）－α－Ｄ－グルカン１－α－Ｄ－グルコシルムターゼ）から選択されるＥＣ５（イソメラーゼ）酵素を含むがそれらに限定されないイソメラーゼ酵素である。

さらに他の実施形態では、ＰＯＩは、ＥＣ６．２．１．１２（例えば、４－クマリン酸塩：補酵素Ａリガーゼ）及びＥＣ６．３．２．２８（例えば、Ｌ－アミノ酸α－リガーゼ）から選択されるＥＣ６（リガーゼ）酵素を含むがそれらに限定されないリガーゼ酵素である。

タンパク質の産生の最適条件は、宿主細胞の選択及び発現されるタンパク質の選択によって変化する。そのような条件は、ルーチンの実験及び／又は最適化によって、当業者には容易に確かめ得る。

目的タンパク質は、発現後に精製又は単離することができる。目的タンパク質は、どのような他の成分が試料中に存在するかによって、当業者に知られた様々な方法で単離又は精製し得る。標準的な精製方法としては、電気泳動手法、分子的手法、免疫学的手法、クロマトグラフィー手法、例えば、イオン交換、疎水性、親和性、及び逆相ＨＰＬＣクロマトグラフィー、並びにクロマトフォーカシングが挙げられる。例えば、目的タンパク質は、標準的な抗目的タンパク質抗体カラムを用いて精製し得る。タンパク質濃度と関連して、限外ろ過及びダイアフィルトレーション手法もまた有用である。必要な精製の程度は、目的タンパク質の使用目的により異なる。場合によっては、タンパク質の精製は不要である。

特定の他の実施形態では、本開示の遺伝子改変真菌細胞が目的タンパク質のレベルの増加をもたらすことを確認するために、様々なスクリーニング方法を実施することができる。発現ベクターは、検出可能な標識として機能する標的タンパク質へのポリペプチド融合物をコードし得る、又は標的タンパク質自体が選択可能な若しくはスクリーニング可能なマーカーとして機能し得る。標識タンパク質は、ウェスタンブロッティング、ドットブロッティング（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓウェブサイトで入手可能な方法）、ＥＬＩＳＡ、又は標識がＧＦＰである場合、全細胞蛍光法若しくはＦＡＣＳによって検出し得る。例えば、６－ヒスチジンタグは標的タンパク質への融合体として含まれ、そしてこのタグはウェスタンブロッティングによって検出される。標的タンパク質が十分に高いレベルで発現する場合、クマシー／銀染色と組み合わされたＳＤＳ－ＰＡＧＥを、バリアント宿主細胞において親（対照）細胞を越える発現の増加を検出するために実施することができ、この場合は標識を必要としない。さらに、細胞１個あたりのタンパク質の活性又は量、培地１ミリリットルあたりのタンパク質の活性又は量の増加を検出するなどの他の方法を使用して、目的タンパク質の改善されたレベルを確認することができ、これにより、又はこれらの方法の組み合わせにより、より長時間、培養又は発酵を効率的に継続することが可能になる。

比生産性の検出は、タンパク質の産生を評価する別の方法である。比生産性（Ｑｐ）は、次式により求めることができる：
Ｑｐ＝ｇＰ／ｇＤＣＷ・ｈｒ

（式中、「ｇＰ」はタンク内で生成されたタンパク質のグラム数であり、「ｇＤＣＷ」はタンク内の乾燥細胞重量（ＤＣＷ）のグラム数であり、「ｈｒ」は、生成時間及び増殖時間を含む接種時点からの発酵時間（時間）である）。

ＶＩ．発酵
特定の実施形態では、本開示は、改変真菌細胞の発酵を含む、目的タンパク質を産生する方法（ここで、バリアント真菌細胞は、目的タンパク質を分泌する）を提供する。一般に、当該技術分野でよく知られた発酵方法が、バリアント真菌細胞を発酵させるために使用される。いくつかの実施形態では、真菌細胞は、バッチ又は連続発酵条件下で増殖させる。古典的なバッチ発酵は、クローズドシステムであり、培地の組成は発酵の開始時に設定され、発酵中に変更されない。発酵の開始時に、培地に所望の生物を接種する。この方法では、系にいかなる成分も添加することなく醗酵を行わせる。一般に、バッチ発酵は、炭素源の添加に関して「バッチ」であると見なされ、ｐＨ及び酸素濃度などの因子を制御することは頻繁に行われる。バッチ系の代謝物及びバイオマス組成物は、発酵が停止される時点まで絶えず変化する。バッチ培養内で、細胞は静的誘導期を経て高増殖対数期に進み、最終的に増殖速度が低下又は停止する静止期に進む。未処理のまま放置すると、静止期にある細胞は最終的には死滅する。一般に、対数期の細胞は、生成物の大部分の産生を担っている。

標準バッチ系に対する好適な変形形態は、「フェドバッチ発酵」系である。一般的なバッチ系のこの変形形態では、発酵の進行に伴い基質が徐々に加えられる。フェドバッチ系は、カタボライト抑制が細胞の代謝を阻害する可能性が高い場合、及び培地中の基質量が限られた量であることが望ましい場合に有用である。フェドバッチ系では、実際の基質濃度の測定は困難であり、したがって、ｐＨ、溶存酸素、及びＣＯ_２などの廃ガスの分圧などの測定可能な因子の変化に基づいて推定される。バッチ発酵及びフェドバッチ発酵は、当該技術分野において一般的であり、よく知られている。

連続発酵は、規定の発酵培地をバイオリアクターに連続的に添加し、処理のために等量の馴化培地を同時に除去するオープンシステムである。連続発酵は、一般に、培養物を一定の高密度に維持し、細胞は主として対数増殖期にある。連続発酵は、細胞の増殖及び／又は産生物の濃度に影響する１つ以上の因子の調節を可能にする。例えば、一実施形態では、炭素源又は窒素源などの制限栄養素は一定比率で維持され、他の全てのパラメーターは調節することができる。他の系では、培地の濁度によって測定される細胞濃度を一定に保ちながら、増殖に影響を及ぼす多数の因子は連続的に変化させることができる。連続系は、定常状態の増殖条件を維持しようとする。したがって、培地を取り出すことによる細胞損失は、発酵中の細胞増殖速度に対して平衡が保たれなければならない。連続発酵プロセスで栄養素及び増殖因子を調節する方法、並びに産生物形成速度を最大化するための手法は、工業微生物学の技術分野においてはよく知られている。

本開示の特定の実施形態は、真菌を培養するための発酵手順に関する。セルラーゼ酵素の産生のための発酵手順は、当該技術分野で知られている。例えば、セルラーゼ酵素は、バッチ、フェドバッチ及び連続フロープロセスなどの、固体又は浸漬培養によって産生することができる。培養は一般に、水性無機塩培地、有機増殖因子、炭素及びエネルギー源物質、分子状酸素、及び、当然に、使用される糸状菌宿主の出発接種材料を含む増殖培地中で行われる。

適切な微生物増殖を確実にし、微生物変換プロセスで細胞による炭素及びエネルギー源の吸収を最大にし、発酵培地において最大細胞密度で最大細胞収率を達成するには、炭素及びエネルギー源、酸素、吸収可能な窒素、並びに微生物接種材料に加えて、好適な量の無機栄養素を適切な割合で供給する必要がある。

水性無機培地の組成は、当該技術分野で知られているように、使用する微生物及び基質に部分的に依存して、広範囲にわたって変えることができる。無機培地には、窒素に加えて、好適な量のリン、マグネシウム、カルシウム、カリウム、硫黄、及びナトリウムが、好適な可溶性の吸収可能なイオン性の複合形態で含まれ、また、好ましくは、銅、マンガン、モリブデン、亜鉛、鉄、ホウ素、及びヨウ素などのいくつかの微量元素も、これもまた好適な可溶性の吸収可能な形態で含まれるが、これらは全て当該技術分野で知られていることである。

発酵反応は、微生物種が盛んに増殖するのを助けるのに有効な好適な酸素分圧で、発酵槽の内容物を維持するために提供される、空気、酸素富化空気、又は実質的に純粋な分子状酸素などの分子状酸素含有ガスによって必要な分子状酸素が供給される好気的プロセスである。

発酵温度はいくらか変えることができるが、トリコデルマ・リーゼイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉ）などの糸状菌の場合、温度は一般に約２０℃～４０℃の範囲内、一般に好ましくは約２５℃～３４℃の範囲内である。

微生物はまた、吸収可能な窒素源を必要とする。吸収可能な窒素源は、任意の窒素含有化合物、又は微生物による代謝利用に好適な形態で窒素を放出することができる任意の化合物であり得る。タンパク質加水分解物などの、様々な有機窒素源化合物を使用することができるが、通常、アンモニア、水酸化アンモニウム、尿素などの安価な窒素含有化合物、及びリン酸アンモニウム、硫酸アンモニウム、ピロリン酸アンモニウム、塩化アンモニウム、又は他の様々なアンモニウム化合物などの各種アンモニウム塩を利用することができる。アンモニアガス自体は、大規模な操作に便利であり、好適な量で水性発酵物（発酵培地）をバブリングして使用することができる。同時に、そのようなアンモニアは、ｐＨ制御を助けるために用いることもできる。

水性微生物発酵物（発酵混合物）のｐＨ範囲は、約２．０～８．０の例示的な範囲であるべきである。糸状菌では、ｐＨは、通常、約２．５～８．０の範囲であり、トリコデルマ・リーゼイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉ）では、ｐＨは、通常、約３．０～７．０の範囲である。微生物の好ましいｐＨ範囲は、使用する培地及び特定の微生物にある程度まで依存し、したがって、当業者ならば容易に決定できることであるが、培地の変化と共にいくらか変化する。

制限因子として炭素含有基質を制御することができるようなやり方で醗酵を行うことが好ましく、それによって炭素含有基質の細胞への良好な転換が提供され、相当量の未転換基質による細胞の汚染が回避される。後者は、水溶性基質では、微量の残存物は容易に洗い流せるので、問題にならない。しかしながら、非水溶性基質の場合には問題となる可能性があり、好適な洗浄工程などの追加の生成物処理工程が必要になる。

上記のように、このレベルに到達する時間は重要ではなく、特定の微生物及び実施する発酵プロセスによって変化し得る。しかしながら、発酵培地中の炭素源濃度の決定方法、及び所望の炭素源レベルが達成されているか否かの決定方法は、当該技術分野ではよく知られている。

発酵はバッチ又は連続操作として行うことができ、フェドバッチ操作は、制御の容易さ、均一な量の生成物の生産、及び全ての装置の最も経済的な使用という点で非常に好ましい。

必要ならば、水性無機培地を発酵槽に供給する前に、炭素及びエネルギー源物質の一部又は全部及び／又はアンモニアなどの吸収可能な窒素源の一部を水性無機培地に加えることができる。

反応器に導入される流れの各々は、所定の速度に制御するか、炭素及びエネルギー基質の濃度、ｐＨ、溶存酸素、発酵槽排ガス中の酸素又は二酸化炭素、乾燥細胞重量により測定可能な細胞密度、透光度などの、モニタリングによって決定可能な必要性に応じて制御することが好ましい。炭素及びエネルギー源の効率的な利用と一致して、可能な限り迅速な細胞増殖速度を得、基質の供給に対して可能な限り高い微生物細胞の収率を得るために、各種材料の供給速度は変化させることができる。

バッチ又は好ましいフェドバッチ操作においては、全ての装置、反応器、又は発酵手段、槽又は容器、配管、付随する循環又は冷却装置などは、最初に、通常、蒸気を使用して、例えば、約１２１℃で少なくとも約１５分間、滅菌する。次いで、酸素を含む必要な栄養素の全て、及び炭素含有基質を存在下で、滅菌した反応器に選択された微生物の培養物を接種する。使用する発酵槽の種類は重要ではない。

発酵ブロスからの酵素（例えば、セルラーゼ）の回収及び精製もまた、当業者に知られた手順によって行うことができる。発酵ブロスは、一般に、細胞残屑、例えば、細胞、種々の懸濁固体及び他のバイオマス混入物質、並びに所望のセルラーゼ酵素産物を含み、これらは、当該技術分野で知られた手段によって発酵ブロスから除去することが好ましい。

そのような除去に好適なプロセスとしては、無細胞ろ液を生成するための、例えば、遠心分離、ろ過、透析、精密ろ過、回転真空ろ過、又は他の知られたプロセスなどの従来の固液分離手法が挙げられる。結晶化の前に、限外ろ過、蒸発又は沈殿などの手法を使用して、発酵ブロス、又は細胞を含まないろ液をさらに濃縮することが好ましい。

上清又はろ液のタンパク質成分の沈澱が、塩、例えば硫酸アンモニウムによって行われ、続いて、各種のクロマトグラフィー法、例えば、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、又は類似の分野で認められている方法によって精製が行われ得る。

ＶＩＩ．例示的な実施形態
特定の例示的な実施形態には、以下が含まれる。

１．バリアントＡｃｅ３転写因子（ＴＦ）タンパク質をコードする単離されたポリヌクレオチドであって、バリアントＡｃｅ３ ＴＦは、配列番号２のアミノ酸位置１～６７２に対して少なくとも９０％の配列同一性を含み、且つ、配列番号２の６７３～６８９位から選択される１つ又は複数のＣ末端アミノ酸残基の遺伝子改変を含む、ポリヌクレオチド。

２．バリアントＡｃｅ３ ＴＦは、配列番号２９に対して少なくとも９５％の配列同一性を含む機能的Ｎ末端亜鉛二核クラスター（Ｚｎ_２Ｃｙｓ_６）ＤＮＡ結合ドメインを含む、実施形態１のポリヌクレオチド。

３．配列番号２の６７３～６８９の位置から選択される１つ又は複数のＣ末端アミノ酸残基の遺伝子改変は、アミノ酸欠失、アミノ酸挿入、アミノ酸置換、又はこれらの組み合わせである、実施形態１のポリヌクレオチド。

４．１つ又は複数のＣ末端アミノ酸残基の遺伝子改変は、少なくとも配列番号２の最後の７個のＣ末端アミノ酸位置６８３～６８９の欠失を含む、実施形態３のポリヌクレオチド。

５．１つ又は複数のＣ末端アミノ酸残基の遺伝子改変は、少なくとも配列番号２の最後の８個のＣ末端アミノ酸位置６８２～６８９の欠失を含む、実施形態３のポリヌクレオチド。

６．１つ又は複数のＣ末端アミノ酸残基の遺伝子改変は、少なくとも配列番号２の最後の９個のＣ末端アミノ酸位置６８１～６８９の欠失を含む、実施形態３のポリヌクレオチド。

７．１つ又は複数のＣ末端アミノ酸残基の遺伝子改変は、少なくとも配列番号２の最後の１０個のＣ末端アミノ酸位置６８０～６８９の欠失を含む、実施形態３のポリヌクレオチド。

８．１つ又は複数のＣ末端アミノ酸残基の遺伝子改変は、少なくとも配列番号２の最後の１１個のＣ末端アミノ酸位置６７９～６８９の欠失を含む、実施形態３のポリヌクレオチド。

９．１つ又は複数のＣ末端アミノ酸残基の遺伝子改変は、少なくとも配列番号２の最後の１２個のＣ末端アミノ酸位置６７８～６８９の欠失を含む、実施形態３のポリヌクレオチド。

１０．１つ又は複数のＣ末端アミノ酸残基の遺伝子改変は、少なくとも配列番号２の最後の１３個のＣ末端アミノ酸位置６７７～６８９の欠失を含む、実施形態３のポリヌクレオチド。

１１．１つ又は複数のＣ末端アミノ酸残基の遺伝子改変は、少なくとも配列番号２の最後の１４個のＣ末端アミノ酸位置６７６～６８９の欠失を含む、実施形態３のポリヌクレオチド。

１２．１つ又は複数のＣ末端アミノ酸残基の遺伝子改変は、少なくとも配列番号２の最後の１５個のＣ末端アミノ酸位置６７５～６８９の欠失を含む、実施形態３のポリヌクレオチド。

１３．１つ又は複数のＣ末端アミノ酸残基の遺伝子改変は、少なくとも配列番号２の最後の１６個のＣ末端アミノ酸位置６７４～６８９の欠失を含む、実施形態３のポリヌクレオチド。

１４．１つ又は複数のＣ末端アミノ酸残基の遺伝子改変は、少なくとも配列番号２の最後の１７個のＣ末端アミノ酸位置６７３～６８９の欠失を含む、実施形態３のポリヌクレオチド。

１５．バリアントＡｃｅ３ ＴＦは、配列番号９～配列番号１８のいずれか１つから選択されるアミノ酸配列を含む、実施形態３のポリヌクレオチド。

１６．配列番号２の６７３～６８９位から選択される１つ又は複数のＣ末端アミノ酸残基の遺伝子改変は、配列番号２の６７３～６８３位から選択される１つ又は複数のアミノ酸残基の欠失である、実施形態３のポリヌクレオチド。

１７．配列番号２の６７３～６８９位から選択される１つ又は複数のＣ末端アミノ酸残基の遺伝子改変は、配列番号２の６７３～６７４位、配列番号２の６７４～６７５位、配列番号２の６７５～６７６位、配列番号２の６７６～６７７位、配列番号２の６７７～６７８位、配列番号２の６７８～６７９位、配列番号２の６７９～６８０位、配列番号２の６８０～６８１位、配列番号２の６８１～６８２位、配列番号２の６８２～６８３位、及び配列番号２の６８３～６８４位から選択される２つの連続するアミノ酸残基の欠失である、実施形態３のポリヌクレオチド。

１８．配列番号２の６７３～６８９位から選択される１つ又は複数のＣ末端アミノ酸残基の遺伝子改変は、配列番号２の６７３～６７５位、配列番号２の６７４～６７６位、配列番号２の６７５～６７７位、配列番号２の６７６～６７８位、配列番号２の６７７～６７９位、配列番号２の６７８～６８０位、配列番号２の６７９～６８１位、配列番号２の６８０～６８２位、配列番号２の６８１～６８３位、配列番号２の６８２～６８４位、及び配列番号２の６８３～６８５位から選択される３つの連続するアミノ酸残基の欠失である、実施形態３のポリヌクレオチド。

１９．バリアントＡｃｅ３ ＴＦは、配列番号２のアミノ酸位置６７２～６８３から選択される１つ又は複数のＣ末端アミノ酸残基の置換を含む、実施形態３のポリヌクレオチド。

２０．バリアントＡｃｅ３ ＴＦは、少なくとも配列番号２の最後の７個のＣ末端アミノ酸位置６８３～６８９の欠失さらに含む、実施形態１９のポリヌクレオチド。

２１．バリアントＡｃｅ３ ＴＦは、配列番号２のアミノ酸位置６７３～６８３から選択されるＣ末端アミノ酸位置に１つ又は複数のアミノ酸残基の挿入を含む、実施形態３のポリヌクレオチド。

２２．バリアントＡｃｅ３転写因子（ＴＦ）タンパク質をコードする変異ａｃｅ３遺伝子を含む単離されたトリコデルマ属（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）菌変異細胞であって、バリアントＡｃｅ３ ＴＦタンパク質は、配列番号２のアミノ酸位置１～６７２に対して少なくとも９０％の配列同一性を含み、且つ、配列番号２の６７３～６８９位から選択される１つ又は複数の変異したＣ末端アミノ酸残基を含む変異細胞。

２３．変異細胞がリグノセルロース分解酵素の産生に好適な条件下で発酵される場合、バリアントＡｃｅ３ ＴＦタンパク質は、誘導基質の非存在下でリグノセルロース分解酵素をコードする遺伝子の発現をアップレギュレートする、実施形態２２の変異細胞。

２４．リグノセルロース分解酵素が、セロビオヒドロラーゼ、エンドグルカナーゼ及びβ－グルコシダーゼからなる群から選択される、実施形態２３の変異細胞。

２５．バリアントＡｃｅ３ ＴＦタンパク質は、配列番号２９に対して少なくとも９５％の配列同一性を含む機能的Ｎ末端亜鉛二核クラスターＤＮＡ結合ドメインを含む、実施形態２２の変異細胞。

２６．目的タンパク質（ＰＯＩ）をコードする導入された発現カセットを含み、導入されたカセットは、ＰＯＩをコードする下流（３’）オープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）配列に作動可能に連結されたリグノセルロース分解酵素をコードする遺伝子に由来する上流（５’）プロモーター配列を含む、実施形態２２の変異細胞。

２７．配列番号２の６７３～６８９位から選択される１つ又は複数の変異Ｃ末端アミノ酸残基は、アミノ酸欠失、アミノ酸挿入、アミノ酸置換、又はこれらの組み合わせを含む、実施形態２２の変異細胞。

２８．変異細胞は、ＰＯＩの産生に好適な条件下で発酵させた場合、誘導基質の非存在下でＰＯＩを産生することができる、実施形態２６に記載の変異細胞。

２９．実施形態２２～２８のいずれか一つの変異菌株によって産生される目的タンパク質（ＰＯＩ）。

３０．配列番号２に対して少なくとも９０％の配列同一性を含むＡｃｅ３転写因子（ＴＦ）タンパク質をコードするａｃｅ３遺伝子を含む、親トリコデルマ属（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）菌細胞に由来する遺伝子改変トリコデルマ属（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）真菌細胞であって、遺伝子改変細胞は、配列番号２のアミノ酸位置１～６７２に対して少なくとも９０％の配列同一性を含むバリアントＡｃｅ３ＴＦタンパク質をコードし、且つ、配列番号２の６７３～６８９位から選択される１つ又は複数のＣ末端アミノ酸残基の遺伝子改変を含む改変ａｃｅ３遺伝子を含む改変細胞。

３１．Ａｃｅ３ ＴＦタンパク質は、配列番号２９に対して少なくとも９５％の配列同一性を含む機能的Ｎ末端亜鉛二核クラスターＤＮＡ結合ドメインを含む、実施形態３０の改変細胞。

３２．リグノセルロース分解酵素の産生に好適な条件下で発酵させた場合、バリアントＡｃｅ３ ＴＦタンパク質は、誘導基質の非存在下でリグノセルロース分解酵素をコードする遺伝子の発現をアップレギュレートする、実施形態３０の改変細胞。

３３．リグノセルロース分解酵素は、セロビオヒドロラーゼ、エンドグルカナーゼ及びβ－グルコシダーゼからなる群から選択される、実施形態３２の改変細胞。

３４．目的タンパク質（ＰＯＩ）をコードする導入された発現カセットを含み、導入されたカセットは、ＰＯＩをコードする下流（３’）オープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）配列に作動可能に連結されたリグノセルロース分解酵素をコードする遺伝子に由来する上流（５’）プロモーター配列を含む、実施形態３０の改変細胞。

３５．配列番号２の６７３～６８９位から選択される１つ又は複数の変異Ｃ末端アミノ酸残基は、アミノ酸欠失、アミノ酸挿入、アミノ酸置換、又はこれらの組み合わせを含む、実施形態３０の改変細胞。

３６．改変細胞は、ＰＯＩの産生に好適な条件下で発酵させた場合、誘導基質の非存在下でＰＯＩを産生する、実施形態３４の改変細胞。

３７．改変細胞は、誘導基質の存在下、ＰＯＩを産生するための同じ条件下で発酵させた場合、親細胞によって産生される同じＰＯＩの量と比較して、誘導基質の存在下で増加した量のＰＯＩを産生する、実施形態３４の改変細胞。

３８．配列番号２の６７３～６８９位から選択される１つ又は複数の変異Ｃ末端アミノ酸残基は、少なくとも配列番号２の最後の７個のＣ末端アミノ酸位置６８３～６８９の欠失を含む、実施形態３５の改変細胞。

３９．配列番号２の６７３～６８９位から選択される１つ又は複数の変異Ｃ末端アミノ酸残基は、少なくとも配列番号２の最後の８個のＣ末端アミノ酸位置６８２～６８９の欠失を含む、実施形態３５の改変細胞。

４０．配列番号２の６７３～６８９位から選択される１つ又は複数の変異Ｃ末端アミノ酸残基は、少なくとも配列番号２の最後の９個のＣ末端アミノ酸位置６８１～６８９の欠失を含む、実施形態３５の改変細胞。

４１．配列番号２の６７３～６８９位から選択される１つ又は複数の変異Ｃ末端アミノ酸残基は、少なくとも配列番号２の最後の１０個のＣ末端アミノ酸位置６８０～６８９の欠失を含む、実施形態３５の改変細胞。

４２．配列番号２の６７３～６８９位から選択される１つ又は複数の変異Ｃ末端アミノ酸残基は、少なくとも配列番号２の最後の１１個のＣ末端アミノ酸位置６７９～６８９の欠失を含む、実施形態３５の改変細胞。

４３．配列番号２の６７３～６８９位から選択される１つ又は複数の変異Ｃ末端アミノ酸残基は、少なくとも配列番号２の最後の１２個のＣ末端アミノ酸位置６７８～６８９の欠失を含む、実施形態３５の改変細胞。

４４．配列番号２の６７３～６８９位から選択される１つ又は複数の変異Ｃ末端アミノ酸残基は、少なくとも配列番号２の最後の１３個のＣ末端アミノ酸位置６７７～６８９の欠失を含む、実施形態３５の改変細胞。

４５．配列番号２の６７３～６８９位から選択される１つ又は複数の変異Ｃ末端アミノ酸残基は、少なくとも配列番号２の最後の１４個のＣ末端アミノ酸位置６７６～６８９の欠失を含む、実施形態３５の改変細胞。

４６．配列番号２の６７３～６８９位から選択される１つ又は複数の変異Ｃ末端アミノ酸残基は、少なくとも配列番号２の最後の１５個のＣ末端アミノ酸位置６７５～６８９の欠失を含む、実施形態３５の改変細胞。

４７．配列番号２の６７３～６８９位から選択される１つ又は複数の変異Ｃ末端アミノ酸残基は、少なくとも配列番号２の最後の１６個のＣ末端アミノ酸位置６７４～６８９の欠失を含む、実施形態３５の改変細胞。

４８．配列番号２の６７３～６８９位から選択される１つ又は複数の変異Ｃ末端アミノ酸残基は、少なくとも配列番号２の最後の１７個のＣ末端アミノ酸位置６７３～６８９の欠失を含む、実施形態３５の改変細胞。

４９．バリアントＡｃｅ３ ＴＦは、配列番号９～配列番号１８のいずれか１つから選択されるアミノ酸配列を含む、実施形態３５の改変細胞。

５０．配列番号２の６７３～６８９位から選択される１つ又は複数のＣ末端アミノ酸残基の遺伝子改変は、配列番号２の６７３～６８３位から選択される１つ又は複数のアミノ酸残基の欠失である、実施形態３５の改変細胞。

５１．配列番号２の６７３～６８９位から選択される１つ又は複数のＣ末端アミノ酸残基の遺伝子改変は、配列番号２の６７３～６７４位、配列番号２の６７４～６７５位、配列番号２の６７５～６７６位、配列番号２の６７６～６７７位、配列番号２の６７７～６７８位、配列番号２の６７８～６７９位、配列番号２の６７９～６８０位、配列番号２の６８０～６８１位、配列番号２の６８１～６８２位、配列番号２の６８２～６８３位、及び配列番号２の６８３～６８４位から選択される２つの連続するアミノ酸残基の欠失である、実施形態３５の改変細胞。

５２．配列番号２の６７３～６８９位から選択される１つ又は複数のＣ末端アミノ酸残基の遺伝子改変は、配列番号２の６７３～６７５位、配列番号２の６７４～６７６位、配列番号２の６７５～６７７位、配列番号２の６７６～６７８位、配列番号２の６７７～６７９位、配列番号２の６７８～６８０位、配列番号２の６７９～６８１位、配列番号２の６８０～６８２位、配列番号２の６８１～６８３位、配列番号２の６８２～６８４位、及び配列番号２の６８３～６８５位から選択される３つの連続するアミノ酸残基の欠失である、実施形態３５の改変細胞。

５３．バリアントＡｃｅ３ ＴＦは、配列番号２のアミノ酸位置６７２～６８３から選択される１つ又は複数のＣ末端アミノ酸残基の置換を含む、実施形態３５の改変細胞。

５４．バリアントＡｃｅ３ ＴＦは、少なくとも配列番号２の最後の７個のＣ末端アミノ酸位置６８３～６８９の欠失をさらに含む、実施形態５３の改変細胞。

５５．バリアントＡｃｅ３ ＴＦは、配列番号２のアミノ酸位置６７３～６８３から選択されるＣ末端アミノ酸位置に１つ又は複数のアミノ酸残基の挿入を含む、実施形態３５の改変細胞。

５６．誘導基質は、ラクトース、ソホロース、ゲンチビオース及びセルロースから選択される、実施形態３２、３６及び３７のいずれか一つの改変細胞。

５７．実施形態３２の改変細胞によって産生されるリグノセルロース分解酵素。

５８．実施形態３４の改変細胞により産生される目的タンパク質（ＰＯＩ）。

５９．配列番号４に対して少なくとも９０％の配列同一性を含むバリアントＡｃｅ３転写因子（ＴＦ）タンパク質をコードする変異ａｃｅ３遺伝子を含む、親トリコデルマ属（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）菌細胞に由来する遺伝子改変トリコデルマ属（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）真菌細胞であって、配列番号４のＮ末端は、配列番号２９に記載のインタクトな亜鉛二核（Ｚｎ_２Ｃｙｓ_６）ＤＮＡ結合を含まず、遺伝子改変細胞は、配列番号２の１～６７２位に対して少なくとも９０％の配列同一性を含むバリアントＡｃｅ３ ＴＦタンパク質をコードする改変ａｃｅ３遺伝子を含み、配列番号２のＮ末端は、配列番号２９に記載のインタクトな亜鉛二核（Ｚｎ_２Ｃｙｓ_６）ＤＮＡ結合を含み、且つ配列番号２の６７３～６８９位から選択される１つ又は複数のＣ末端アミノ酸残基の遺伝子改変を含む改変細胞。

６０．リグノセルロース分解酵素の産生に好適な条件下で発酵させた場合、バリアントＡｃｅ３ ＴＦタンパク質は、誘導基質の非存在下でリグノセルロース分解酵素をコードする遺伝子の発現をアップレギュレートする、実施形態５９の改変細胞。

６１．バリアントＡｃｅ３ ＴＦタンパク質は、改変細胞及び親細胞がリグノセルロース分解酵素の産生のための同じ条件下で発酵される場合、改変細胞が同じ誘導基質の存在下で親細胞によって産生される同じリグノセルロース分解酵素の量と比較して増加した量のリグノセルロース分解酵素を産生するように、誘導基質の存在下でリグノセルロース分解酵素をコードする遺伝子の発現をアップレギュレートする、実施形態５９の改変細胞。

６２．目的タンパク質（ＰＯＩ）をコードする導入された発現カセットを含み、導入されたカセットは、ＰＯＩをコードする下流（３’）オープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）配列に作動可能に連結されたリグノセルロース分解酵素をコードする遺伝子に由来する上流（５’）プロモーター配列を含む、実施形態５９の改変細胞。

６３．改変細胞は、ＰＯＩの産生に好適な条件下で発酵させた場合、誘導基質の非存在下でＰＯＩを産生する、実施形態６２の改変細胞。

６４．改変細胞及び親細胞を誘導基質の存在下、ＰＯＩの産生のための同じ条件下で発酵させた場合、同じＰＯＩをコードする同じ導入された発現カセットを含む親細胞と比較して、改変細胞は、誘導基質の存在下で増加した量のＰＯＩを産生する、実施形態６２の改変細胞。

６５．配列番号２の６７３～６８９位から選択される１つ又は複数の変異Ｃ末端アミノ酸残基は、アミノ酸欠失、アミノ酸挿入、アミノ酸置換、又はこれらの組み合わせを含む、実施形態５９の改変細胞。

６６．配列番号２の６７３～６８９位から選択される１つ又は複数の変異Ｃ末端アミノ酸残基は、少なくとも配列番号２の最後の７個のＣ末端アミノ酸位置６８３～６８９の欠失を含む、実施形態５９の改変細胞。

６７．配列番号２の６７３～６８９位から選択される１つ又は複数の変異Ｃ末端アミノ酸残基は、少なくとも配列番号２の最後の８個のＣ末端アミノ酸位置６８２～６８９の欠失を含む、実施形態５９の改変細胞。

６８．配列番号２の６７３～６８９位から選択される１つ又は複数の変異Ｃ末端アミノ酸残基は、少なくとも配列番号２の最後の９個のＣ末端アミノ酸位置６８１～６８９の欠失を含む、実施形態５９の改変細胞。

６９．配列番号２の６７３～６８９位から選択される１つ又は複数の変異Ｃ末端アミノ酸残基は、少なくとも配列番号２の最後の１０個のＣ末端アミノ酸位置６８０～６８９の欠失を含む、実施形態５９の改変細胞。

７０．配列番号２の６７３～６８９位から選択される１つ又は複数の変異Ｃ末端アミノ酸残基は、少なくとも配列番号２の最後の１１個のＣ末端アミノ酸位置６７９～６８９の欠失を含む、実施形態５９の改変細胞。

７１．配列番号２の６７３～６８９位から選択される１つ又は複数の変異Ｃ末端アミノ酸残基は、少なくとも配列番号２の最後の１２個のＣ末端アミノ酸位置６７８～６８９の欠失を含む、実施形態５９の改変細胞。

７２．配列番号２の６７３～６８９位から選択される１つ又は複数の変異Ｃ末端アミノ酸残基は、少なくとも配列番号２の最後の１３個のＣ末端アミノ酸位置６７７～６８９の欠失を含む、実施形態３５の改変細胞。

７３．配列番号２の６７３～６８９位から選択される１つ又は複数の変異Ｃ末端アミノ酸残基は、少なくとも配列番号２の最後の１４個のＣ末端アミノ酸位置６７６～６８９の欠失を含む、実施形態５９の改変細胞。

７４．配列番号２の６７３～６８９位から選択される１つ又は複数の変異Ｃ末端アミノ酸残基は、少なくとも配列番号２の最後の１５個のＣ末端アミノ酸位置６７５～６８９の欠失を含む、実施形態５９の改変細胞。

７５．配列番号２の６７３～６８９位から選択される１つ又は複数の変異Ｃ末端アミノ酸残基は、少なくとも配列番号２の最後の１６個のＣ末端アミノ酸位置６７４～６８９の欠失を含む、実施形態５９の改変細胞。

７６．配列番号２の６７３～６８９位から選択される１つ又は複数の変異Ｃ末端アミノ酸残基は、少なくとも配列番号２の最後の１７個のＣ末端アミノ酸位置６７３～６８９の欠失を含む、実施形態５９の改変細胞。

７７．バリアントＡｃｅ３ ＴＦは、配列番号９～配列番号１８のいずれか１つから選択されるアミノ酸配列を含む、実施形態５９の改変細胞。

７８．配列番号２の６７３～６８９位から選択される１つ又は複数のＣ末端アミノ酸残基の遺伝子改変は、配列番号２の６７３～６８３位から選択される１つ又は複数のアミノ酸残基の欠失である、実施形態５９の改変細胞。

７９．配列番号２の６７３～６８９位から選択される１つ又は複数のＣ末端アミノ酸残基の遺伝子改変は、配列番号２の６７３～６７４位、配列番号２の６７４～６７５位、配列番号２の６７５～６７６位、配列番号２の６７６～６７７位、配列番号２の６７７～６７８位、配列番号２の６７８～６７９位、配列番号２の６７９～６８０位、配列番号２の６８０～６８１位、配列番号２の６８１～６８２位、配列番号２の６８２～６８３位、及び配列番号２の６８３～６８４位から選択される２つの連続するアミノ酸残基の欠失である、実施形態５９の改変細胞。

８０．配列番号２の６７３～６８９位から選択される１つ又は複数のＣ末端アミノ酸残基の遺伝子改変は、配列番号２の６７３～６７５位、配列番号２の６７４～６７６位、配列番号２の６７５～６７７位、配列番号２の６７６～６７８位、配列番号２の６７７～６７９位、配列番号２の６７８～６８０位、配列番号２の６７９～６８１位、配列番号２の６８０～６８２位、配列番号２の６８１～６８３位、配列番号２の６８２～６８４位、及び配列番号２の６８３～６８５位から選択される３つの連続するアミノ酸残基の欠失である、実施形態５９の改変細胞。

８１．バリアントＡｃｅ３ ＴＦは、配列番号２のアミノ酸位置６７２～６８３から選択される１つ又は複数のＣ末端アミノ酸残基の置換を含む、実施形態５９の改変細胞。

８２．バリアントＡｃｅ３ ＴＦは、少なくとも配列番号２の最後の７個のＣ末端アミノ酸位置６８３～６８９の欠失をさらに含む、実施形態８１の改変細胞。

８３．バリアントＡｃｅ３ ＴＦは、配列番号２のアミノ酸位置６７３～６８３から選択されるＣ末端アミノ酸位置に１つ又は複数のアミノ酸残基の挿入を含む、実施形態５９の改変細胞。

８４．誘導基質は、ラクトース、ソホロース、ゲンチビオース及びセルロースから選択される、請求項６１、６４又は６５のいずれか一項に記載の改変細胞。

８５．実施形態６１の改変細胞によって産生されるリグノセルロース分解酵素。

８６．実施形態６３の改変細胞により産生される目的タンパク質（ＰＯＩ）。

８７．誘導基質の非存在下でリグノセルロース分解酵素をコードする遺伝子の発現を誘導するバリアントＡｃｅ３ ＴＦタンパク質のスクリーニング方法であって、（ａ）配列番号２の６７３～６８３位から選択される１つ又は複数のＣ末端アミノ酸位置に改変アミノ酸残基を含む複数のバリアントＡｃｅ３ ＴＦタンパク質をコードするＤＮＡライブラリーを構築する工程、（ｂ）工程（ａ）のＤＮＡライブラリーからのＤＮＡ配列で複数のトリコデルマ属（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）菌細胞を形質転換する工程、並びに（ｃ）複数の形質転換されたトリコデルマ属（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）菌細胞を、誘導基質の非存在下、リグノセルロース分解酵素の産生に好適な条件下で培養及びスクリーニングする工程を含み、リグノセルロース分解酵素をコードする遺伝子を発現するスクリーニングされたトリコデルマ属（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）菌細胞は、誘導基質の非存在下でリグノセルロース分解酵素遺伝子の発現を誘導するバリアントＡｃｅ３ ＴＦタンパク質をコードするその中のＤＮＡライブラリー配列を同定する、方法。

８８．誘導基質の非存在下でリグノセルロース分解酵素の発現を誘導するバリアントＡｃｅ３ ＴＦタンパク質をコードするＤＮＡライブラリー配列を含む形質転換トリコデルマ属（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）菌細胞を単離する工程をさらに含む、実施形態８７の方法。

８９．バリアントＡｃｅ３ ＴＦタンパク質をコードするＤＮＡ配列を単離する工程をさらに含む、実施形態８８の方法。

９０．誘導基質の存在下でのリグノセルロース分解酵素をコードする遺伝子の発現を、同じ誘導基質の存在下での配列番号２の野生型Ｃ末端を有するＡｃｅ３ ＴＦタンパク質によって調節される同じリグノセルロース分解酵素をコードする同じ遺伝子の発現と比較してアップレギュレートするバリアントＡｃｅ３ ＴＦタンパク質をスクリーニングする方法であって、（ａ）配列番号２の６７３～６８３位から選択される１つ又は複数のＣ末端アミノ酸位置に改変アミノ酸残基を含む複数のバリアントＡｃｅ３ ＴＦタンパク質をコードするＤＮＡライブラリーを構築する工程、（ｂ）工程（ａ）のＤＮＡライブラリーからのＤＮＡ配列で複数のトリコデルマ属（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）菌細胞を形質転換する工程、並びに（ｃ）複数の形質転換されたトリコデルマ属（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）菌細胞を、誘導基質の存在下、リグノセルロース分解酵素の産生に好適な条件下で培養及びスクリーニングする工程を含み、配列番号２の野生型Ｃ末端を有するＡｃｅ３ ＴＦタンパク質をコードする遺伝子を含むトリコデルマ属（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）菌対照細胞によって産生される同じリグノセルロース分解酵素の量と比較して、増加した量のリグノセルロース分解酵素を産生するスクリーニングされたトリコデルマ属（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）菌細胞は、誘導基質の存在下でリグノセルロース分解酵素遺伝子の発現をアップレギュレートするバリアントＡｃｅ３ ＴＦタンパク質をコードするその中のＤＮＡライブラリー配列を同定する、方法。

９１．誘導基質の存在下でリグノセルロース分解酵素の発現をアップレギュレートするバリアントＡｃｅ３ ＴＦタンパク質をコードするＤＮＡライブラリー配列を含む形質転換トリコデルマ属（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）菌細胞を単離する工程をさらに含む、実施形態９０の方法。

９２．バリアントＡｃｅ３ ＴＦタンパク質をコードするＤＮＡ配列を単離する工程をさらに含む、実施形態９１の方法。

９３．誘導基質の非存在下でレポータータンパク質をコードする遺伝子の発現を誘導するバリアントＡｃｅ３ ＴＦタンパク質をスクリーニングする方法であって、（ａ）配列番号２の６７３～６８３位から選択される１つ又は複数のＣ末端アミノ酸位置に改変アミノ酸残基を含む複数のバリアントＡｃｅ３ ＴＦタンパク質をコードするＤＮＡライブラリーを構築する工程、（ｂ）工程（ａ）のＤＮＡライブラリーからのＤＮＡ配列で複数のトリコデルマ属（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）菌細胞を形質転換する工程であって、形質転換されたトリコデルマ属（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）菌細胞は、レポータータンパク質をコードするオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）に作動可能に連結された上流（５’）セルラーゼプロモーターを含む導入された発現カセットを含む工程、並びに（ｃ）誘導基質の非存在下でレポータータンパク質をコードするＯＲＦの発現について複数の形質転換されたトリコデルマ属（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）菌細胞を培養及びスクリーニングする工程であって、レポータータンパク質をコードするＯＲＦを発現するスクリーニングされたトリコデルマ属（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）菌細胞は、誘導基質の非存在下でレポータータンパク質をコードするＯＲＦの発現を誘導するバリアントＡｃｅ３ ＴＦタンパク質をコードするその中のＤＮＡライブラリー配列を同定する工程、を含む方法。

９４．誘導基質の非存在下でレポータータンパク質をコードするＯＲＦの発現を誘導するバリアントＡｃｅ３ ＴＦタンパク質をコードするＤＮＡライブラリー配列を含む形質転換トリコデルマ属（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）菌細胞を単離する工程をさらに含む、実施形態９３の方法。

９５．バリアントＡｃｅ３ ＴＦタンパク質をコードするＤＮＡ配列を単離する工程をさらに含む、実施形態９３の方法。

９６．誘導基質の存在下でレポータータンパク質をコードする遺伝子の発現を、同じ誘導基質の存在下での配列番号２の野生型Ｃ末端を有するＡｃｅ３ ＴＦタンパク質によって調節される同じレポータータンパク質をコードする同じ遺伝子の発現と比較してアップレギュレートするバリアントＡｃｅ３ ＴＦタンパク質をスクリーニングする方法であって、（ａ）配列番号２の６７３～６８３位から選択される１つ又は複数のＣ末端アミノ酸位置に改変アミノ酸残基を含む複数のバリアントＡｃｅ３ ＴＦタンパク質をコードするＤＮＡライブラリーを構築する工程、（ｂ）工程（ａ）のＤＮＡライブラリーからのＤＮＡ配列で複数のトリコデルマ属（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）菌細胞を形質転換する工程であって、形質転換されたトリコデルマ属（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）菌細胞は、レポータータンパク質をコードするオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）に作動可能に連結された上流（５’）セルラーゼプロモーターを含む導入された発現カセットを含み、且つ任意選択により、トリコデルマ属（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）菌において作動可能な下流（３’）ターミネーター配列を含む工程、並びに（ｃ）誘導基質の存在下でレポータータンパク質をコードするＯＲＦの発現について複数の形質転換されたトリコデルマ属（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）菌細胞を培養及びスクリーニングする工程を含み、配列番号２の野生型Ｃ末端を有するＡｃｅ３ ＴＦタンパク質をコードする遺伝子を含むトリコデルマ属（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）菌対照細胞によって産生される同じレポータータンパク質の量と比較して、増加した量のレポータータンパク質を産生し、且つ工程（ｂ）の発現カセットを含むスクリーニングされたトリコデルマ属（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）菌細胞は、誘導基質の存在下でレポータータンパク質をコードするＯＲＦの発現をアップレギュレートするバリアントＡｃｅ３ ＴＦタンパク質をコードするその中のＤＮＡライブラリー配列を同定する、方法。

９７．誘導基質の存在下でレポータータンパク質をコードするＯＲＦの発現をアップレギュレートするバリアントＡｃｅ３ ＴＦタンパク質をコードするＤＮＡライブラリー配列を含む形質転換トリコデルマ属（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）菌細胞を単離する工程をさらに含む、実施形態９６の方法。

９８．バリアントＡｃｅ３ ＴＦタンパク質をコードするＤＮＡ配列を単離する工程をさらに含む、実施形態９７の方法。

９９．リグノセルロース分解酵素は、セロビオヒドロラーゼ、エンドグルカナーゼ及びβ－グルコシダーゼからなる群から選択される、実施形態８７又は実施形態９０の方法。

１００．セルラーゼプロモーターは、セロビオヒドロラーゼプロモーター配列、エンドグルカナーゼプロモーター配列、β－グルコシダーゼプロモーター配列及びキシラナーゼプロモーター配列からなる群から選択される、実施形態９３又は実施形態９６の方法。

１０１．誘導基質は、ラクトース、ソホロース、ゲンチビオース及びセルロースから選択される、実施形態８７、９０、９３及び９６のいずれか一つの方法。

１０２．誘導基質の非存在下、トリコデルマ属（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）真菌細胞中で、リグノセルロース分解酵素を産生する方法であって、（ａ）バリアントＡｃｅ３転写因子（ＴＦ）タンパク質をコードする変異ａｃｅ３遺伝子を含むＴ．リーゼイ（Ｔ．ｒｅｅｓｅｉ）変異細胞を単離する工程であって、バリアントＡｃｅ３ ＴＦタンパク質は、配列番号２のアミノ酸位置１～６７２に対して少なくとも９０％の配列同一性を含み、且つ配列番号２の６７３～６８９位から選択される１つ又は複数の変異したＣ末端アミノ酸残基を含む工程、及び（ｂ）リグノセルロース分解酵素の産生に好適な条件下で単離された変異体細胞を発酵させる工程であって、好適な発酵条件は誘導基質を含まない工程、を含む方法。

１０４．リグノセルロース分解酵素は、セロビオヒドロラーゼ、エンドグルカナーゼ及びβ－グルコシダーゼからなる群から選択される、実施形態１０３の方法。

１０５．誘導基質の非存在下、遺伝子改変トリコデルマ属（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）真菌細胞中で、リグノセルロース分解酵素を産生する方法であって、（ａ）配列番号２のアミノ酸位置１～６８９に対して少なくとも９０％の配列同一性を含む野生型Ａｃｅ３転写因子（ＴＦ）タンパク質をコードするａｃｅ３遺伝子を含むトリコデルマ属（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）真菌細胞を得る工程、

（ｂ）工程（ａ）のトリコデルマ属（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）菌細胞のａｃｅ３遺伝子を遺伝子改変する工程であって、改変されたａｃｅ３遺伝子は、配列番号２のアミノ酸位置１～６７２に対して少なくとも９０％の配列同一性を含み、且つ配列番号２の６７３～６８９位から選択される１つ又は複数の変異したＣ末端アミノ酸残基を含むバリアントＡｃｅ３ ＴＦタンパク質をコードする工程、及び（ｃ）リグノセルロース分解酵素の産生に好適な条件下で工程（ｂ）の改変されたトリコデルマ属（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）菌細胞を発酵させる工程を含み、好適な発酵条件は誘導基質を含まない、方法。

１０６．野生型Ａｃｅ３ ＴＦタンパク質のＣ末端は、配列番号２のアミノ酸位置６７３～６８９に対して少なくとも９５％の配列同一性を含む、実施形態１０５の方法。

１０７．誘導基質の非存在下、遺伝子改変トリコデルマ属（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）真菌細胞中で、リグノセルロース分解酵素を産生する方法であって、（ａ）配列番号４のＡｃｅ３－Ｓ ＴＦタンパク質と少なくとも９０％の配列同一性を含むバリアントＡｃｅ３ ＴＦタンパク質をコードするａｃｅ３遺伝子を含むトリコデルマ属（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）真菌細胞を得る工程、（ｂ）工程（ａ）のトリコデルマ属（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）菌細胞のａｃｅ３遺伝子を遺伝子改変する工程であって、改変されたａｃｅ３遺伝子は、配列番号２のアミノ酸位置１～６７２に対して少なくとも９０％の配列同一性を含み、且つ配列番号２の６７３～６８９位から選択される１つ又は複数の変異したＣ末端アミノ酸残基を含むバリアントＡｃｅ３ ＴＦタンパク質をコードする工程、及び（ｃ）リグノセルロース分解酵素の産生に好適な条件下で工程（ｂ）の改変されたトリコデルマ属（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）菌細胞を発酵させる工程を含み、好適な発酵条件は誘導基質を含まない、方法。

１０８．配列番号４のＡｃｅ３－Ｓ ＴＦタンパク質に対して少なくとも９０％の配列同一性を含むバリアントＡｃｅ３ＴＦタンパク質は、配列番号２９に記載のインタクトな亜鉛二核（Ｚｎ_２Ｃｙｓ_６）ＤＮＡ結合を含まない、実施形態１０７の方法。

１０９．配列番号２のアミノ酸位置１～６７２に対して少なくとも９０％の配列同一性を含むバリアントＡｃｅ３ ＴＦタンパク質をコードする遺伝子改変ａｃｅ３遺伝子は、配列番号２９に記載のインタクトな亜鉛二核（Ｚｎ_２Ｃｙｓ_６）ＤＮＡ結合を含む、実施形態１０７の方法。

１１０．誘導基質の非存在下、改変されたトリコデルマ属（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）菌細胞中で、目的タンパク質（ＰＯＩ）を産生する方法であって、（ａ）配列番号２のアミノ酸位置１～６８９に対して少なくとも９０％の配列同一性を含む野生型Ａｃｅ３転写因子（ＴＦ）タンパク質をコードするａｃｅ３遺伝子を含むトリコデルマ属（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）真菌細胞を得る工程、（ｂ）工程（ａ）のトリコデルマ属（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）菌細胞のａｃｅ３遺伝子を遺伝子改変する工程であって、改変されたａｃｅ３遺伝子は、配列番号２のアミノ酸位置１～６７２に対して少なくとも９０％の配列同一性を含み、且つ配列番号２の６７３～６８９位から選択される１つ又は複数の変異したＣ末端アミノ酸残基を含むバリアントＡｃｅ３ ＴＦタンパク質をコードする、工程、（ｃ）ＰＯＩをコードする発現カセットを、工程（ｂ）の改変トリコデルマ属（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）菌細胞に導入する工程であって、発現カセットは、ＰＯＩをコードする下流（３’）オープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）配列に作動可能に連結されたリグノセルロース分解酵素をコードする遺伝子に由来する上流（５’）プロモーター配列を含む、工程、及び（ｄ）工程（ｃ）の改変トリコデルマ属（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）菌細胞を、ＰＯＩの産生に好適な条件下で発酵させる工程を含み、好適な発酵条件は誘導基質を含まない、方法。

１１１．工程（ｂ）及び（ｃ）は、同時に又はいずれの順序でも実施される、実施形態１１０の方法。

１１２．誘導基質の非存在下、改変されたトリコデルマ属（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）菌細胞中で、目的タンパク質（ＰＯＩ）を産生する方法であって、（ａ）配列番号４のＡｃｅ３－Ｓ ＴＦタンパク質と少なくとも９０％の配列同一性を含むバリアントＡｃｅ３ ＴＦタンパク質をコードするａｃｅ３遺伝子を含むトリコデルマ属（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）真菌細胞を得る工程、（ｂ）工程（ａ）のトリコデルマ属（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）菌細胞のａｃｅ３遺伝子を遺伝子改変する工程であって、改変されたａｃｅ３遺伝子は、配列番号２のアミノ酸位置１～６７２に対して少なくとも９０％の配列同一性を含み、且つ配列番号２の６７３～６８９位から選択される１つ又は複数の変異したＣ末端アミノ酸残基を含むバリアントＡｃｅ３ ＴＦタンパク質をコードする、工程、（ｃ）ＰＯＩをコードする発現カセットを、工程（ｂ）の改変トリコデルマ属（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）菌細胞に導入する工程であって、発現カセットは、ＰＯＩをコードする下流（３’）オープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）配列に作動可能に連結されたリグノセルロース分解酵素をコードする遺伝子に由来する上流（５’）プロモーター配列を含む、工程、及び（ｄ）工程（ｃ）の改変トリコデルマ属（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）菌細胞を、ＰＯＩの産生に好適な条件下で発酵させる工程を含み、好適な発酵条件は誘導基質を含まない、方法。

１１３．工程（ｂ）及び（ｃ）は、同時に又はいずれの順序でも実施される、実施形態１１０の方法。

以下の実施例は本開示の実施形態を示しているが、それらは例示としてのみ与えられていることを理解されたい。上記の議論及びこれらの実施例から、当業者は種々の使用及び条件に適合させるために、本開示の種々の変更及び修正を行うことができる。このような修正もまた、特許請求の範囲に記載された発明の範囲に含まれるものとする。

実施例１
Ｃ末端のトランケーションを含むＡＣＥ３－Ｌタンパク質
Ａ．概説
Ａｃｅ３は、誘導条件下（例えば、ラクトースの存在下）でセルラーゼ及びヘミセルラーゼ産生を調節するＴ．リーゼイ（Ｔ．ｒｅｅｓｅｉ）転写因子である。同様に、「Ａｃｅ３Ｌ」と名付けられたＡｃｅ３転写因子の高機能形態が同定され、国際公開第２０１８／０６７５９９号パンフレットに記載されている。例えば、国際公開第２０１８／０６７５９９号パンフレットに記載されているように、Ａｃｅ３Ｌ転写因子（例えば、配列番号６）を発現するＴ．リーゼイ（Ｔ．ｒｅｅｓｅｉ）株は、インデューサー（例えば、ラクトース、ソホロース）の存在下でタンパク質産生の増強（増加）を示しただけでなく、インデューサーの非存在下でもタンパク質産生の有意な増加を示した。

Ａｃｅ３転写因子は、そのＣ末端に２つの知られたバリアントを有する。例えば、Ｔ．リーゼイ（Ｔ．ｒｅｅｓｅｉ）株ＱＭ６ａにおけるａｃｅ３遺伝子は、ａｃｅ３遺伝子によってコードされる完全長（野生型）Ｃ末端を含むＡｃｅ３－Ｓタンパク質（図１）をコードし、一方、ＲＬ－Ｐ３７及びＲＵＴ－Ｃ３０のＴ．リーゼイ（Ｔ．ｒｅｅｓｅｉ）株における同じａｃｅ３遺伝子は、コードされるタンパク質の１１個のアミノ酸のトランケーションをもたらす早期終止コドンを含む（図１；配列番号６）。さらに、図１に示すように、Ａｃｅ３Ｌタンパク質は、Ａｃｅ３－Ｓタンパク質配列番号４）と比較して、Ｎ末端にインタクトな亜鉛二核クラスター（Ｚｎ_２Ｃｙｓ_６）ＤＮＡ結合ドメイン（図３；配列番号６）を含む。４を参照）。Ａｃｅ３－ＬＣ変異体は、早期終止コドンをグルタミンコドンに戻すことによって生成され、したがって、Ｎ末端にインタクトな亜鉛二核クラスター（Ｚｎ_２Ｃｙｓ_６）ＤＮＡ結合ドメインを含み、Ｃ末端に完全長（野生型）配列を含む。

本明細書に記載され、例示されるように、Ａｃｅ３タンパク質のトランケートされたＣ末端及びＡｃｅ３タンパク質のインタクトなＮ末端亜鉛二核クラスター（Ｚｎ_２Ｃｙｓ_６）ＤＮＡ結合ドメインはいずれも、インデューサーの非存在下及び存在下の両方でタンパク質産生を増加させる機能に必須の特徴である。本実施例においては、本出願人は、以下に記載するように、Ｃ末端アミノ酸残基を選択的にトランケートすることによって、Ａｃｅ３タンパク質のＣ末端アミノ酸領域をさらに評価した。以下の実施例に示すＴ．リーゼイ（Ｔ．ｒｅｅｓｅｉ）親細胞は、Ｓｈｅｉｒ－Ｎｅｉｓｓ ａｎｄ Ｍｏｎｔｅｎｅｃｏｕｒｔ，１９８４により一般的に記述されているように、Ｔ．リーゼイ（Ｔ．ｒｅｅｓｅｉ）ｐｙｒ４遺伝子が欠失したＴ．リーゼイ（Ｔ．ｒｅｅｓｅｉ）株ＲＬ－Ｐ３７（ＮＲＲＬ寄託番号１５７０９）に由来した。

Ｂ．発現ベクター及び菌株の構築
Ａｃｅ３ Ｃ末端トランケーションを有する２セットの発現ベクターを構築した。第１のセットの６つのベクターは、５アミノ酸増分で０アミノ酸～２５アミノ酸の範囲のＣ末端トランケーションを含む（表１；セット１を参照）。第２のセットの１２個のベクターは、１アミノ酸増分で６アミノ酸～１９アミノ酸の範囲のトランケーションを含む（表１；セット２を参照）。

これらの１８個のＡｃｅ３－ＬＣ＿Ｃ－ｔｅｒｍバリアント発現ベクターを、標準的な分子生物学的手法を用いて構築した。これらのベクターは、Ｔ．リーゼイ（Ｔ．ｒｅｅｓｅｉ）のグルコアミラーゼ（ｇｌａ１）遺伝子座にａｃｅ３発現カセットの標的組み込みを可能にするように設計された。それらは、標的組み込みに必要なＴ．リーゼイ（Ｔ．ｒｅｅｓｅｉ）ｇｌａ１遺伝子座の５’フランク及び３’フランクを有している。５’フランク配列は、ｓｃａｆｆｏｌｄ＿１：１４８９２２６－１４９０６６２に対応するＤＮＡ配列に相同な１．５Ｋｂホモロジーボックスを含む。３’フランク配列は、ｓｃａｆｆｏｌｄ＿１：１４９２８３５－１４９４３３５に対応するＤＮＡ配列に相同な１．５Ｋｂホモロジーボックスを含む。これらの配列は、ｇｌａ１遺伝子（ＪＧＩ ｐｒｏｔｅｉｎ ＩＤ Ｔｒｉｒｅ２＿１８８５）を標的化し、５’フランクと３’フランクとの間のゲノムのヌクレオチド（ｓｃａｆｆｏｌｄ＿１：１４９０６６３－１４９２８３４）を介在カセット配列で置換するように設計された。発現ベクターはまた、天然ａｃｅ３遺伝子ターミネーターを有するａｃｅ３ ＯＲＦコード配列に作動可能に連結された異種Ｔ．リーゼイ（Ｔ．ｒｅｅｓｅｉ）ｄｉｃ１プロモーター配列（ｓｃａｆｆｏｌｄ＿８：１３７６８７１－１３７８８３３、例えば、国際公開第２０１８／０６７５９９号パンフレットを参照）を含む。さらに、これらのベクターは、Ｔ．リーゼイ（Ｔ．ｒｅｅｓｅｉ）形質転換体の選択のために、ｐｙｒ４マーカーをその天然のプロモーター及びターミネーターと共に含む。ｇｌａ１遺伝子座に組み込んだ後のｐｙｒ４遺伝子の切除を可能にするために、ｐｙｒ４プロモーターのリピートが含まれた。ベクターはまた、Ｅ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）における複製及び選択のための細菌ＣｏｌＥ１ ｏｒｉ及びＡｍｐＲ遺伝子と共に、Ｓ．セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）における複製及び選択のための酵母２μ ｏｒｉ及びｕｒａ３遺伝子を含む。代表的なベクターマップを図２に示すが、それにはＡｃｅ３－ＬＣタンパク質（配列番号２；すなわち、完全長の野生型Ｃ末端を含む）をコードするＯＲＦを含むベクターｐＹＬ７２が記載されている。他のベクター（例えば、ｐＹＬ７３、ｐＹＬ７４など）は、様々なＣ末端がトランケートされたＡｃｅ３タンパク質をコードするＯＲＦ配列を含む（表１）。

表１に示した発現ベクターをＰｍｅＩで消化して、標的組み込みのために断片を放出させ、アガロースゲル電気泳動で分離した。ゲル抽出キット（Ｑｉａｇｅｎ）を用い、製造業者のプロトコルに従って、ゲルから正しい断片を単離した。ｇｌａ１遺伝子内の２３ｂｐ配列を標的とするＣａｓ９ヌクレアーゼ及び合成シングルガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）（配列番号：７０）を、国際公開第２０１６／１００５６８号パンフレットに一般的に記載されているように、製造業者（Ｓｙｎｔｈｅｇｏ）のプロトコルに従ってインビトロで構築した。約１０μｇの精製断片及び構築したＣａｓ９－ｓｇＲＮＡ複合体を使用して、Ｔ．リーゼイ（Ｔ．ｒｅｅｓｅｉ）（ＲＬ－Ｐ３７）株のｐｙｒ４^－変異体のプロトプラストを形質転換した。形質転換は、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）媒介プロトプラスト形質転換プロトコル（Ｏｕｅｄｒａｏｇｏ ｅｔ ａｌ．，２０１５；Ｐｅｎｔｔｉｌａ ｅｔ ａｌ，１９８７）を用いて行った。

形質転換体をＶｏｇｅｌ最小培地寒天プレート上で増殖させ、ｐｙｒ４マーカーによって獲得したウリジン原栄養性について選択した。増殖クローンを、表２に列挙したプライマーを用い、正確な組み込みについてＰＣＲによりスクリーニングした。予想されたシグナルを与えるクローンを単細胞クローンに精製し、表２に列挙したプライマーを用いるＰＣＲにより、正確な組み込み及びクローン純度について再スクリーニングした。ＰＣＲ産物をサンガーシーケンス法により配列決定して、指定されたａｃｅ３ Ｃ末端トランケーションバリアントの存在を確認した。精製され、配列が確認されたＡｃｅ３ Ｃ末端トランケーションバリアントを表３に列挙する。

Ｃ．種々のａｃｅ３形質転換体の培養
上記の親（ＬＴ３３８）及び形質転換された（娘）Ｔ．リーゼイ（Ｔ．ｒｅｅｓｅｉ）細胞（表３）を、「非誘導」（グルコース）及び「誘導」（グルコース／ソホロース又はラクトース）の両条件下で試験した。例えば、「非誘導」条件で、標準の２４ウェルマイクロタイタープレート（ＭＴＰ）中、２％グルコース（重量／体積）を補充した規定培地の１．２５ｍｌ液体ブロス中で細胞を増殖させた。「誘導」条件では、２４ウェルＭＴＰ中、２％ラクトース又は２％グルコース／ソホロース（重量／体積）を補充した規定培地の１．２５ｍｌ液体ブロス（ここで、ラクトース又はソホロースはセルラーゼ酵素発現の強力なインデューサーとして働く）中で細胞を増殖させた。

ＭＴＰ培養物を２８℃、２５０ｒｐｍ、８５％湿度で５日間インキュベートした。インキュベーションに続いて、全培養物から上清を回収し、製造業者のプロトコルに従って、Ｂｉｏ－Ｒａｄ試薬（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（登録商標）；カタログ番号２３２３６）及び標準として牛血清アルブミン（ＢＳＡ）の５倍希釈を使用し、５９５ｎｍでＢｒａｄｆｏｒｄ色素結合アッセイにより総分泌タンパク質を測定した。

Ｄ．１０～１５アミノ酸Ｃ末端トランケーションを有するＡｃｅ３－ＬＣバリアントは機能的である
図７に示すように、本出願人は、Ｃ末端に５、１０、１５、２０及び２５個のアミノ酸のトランケーションを有するＡｃｅ３－ＬＣバリアントを発現する第１のセットの菌株（表１；セット１及び表３）による総タンパク質産生を評価した（例えば、表１；セット１；表３及び図７を参照）。図７に示すように、親対照株ＲＬ－Ｐ３７はラクトース上で（すなわち、誘導条件下で）のみ多量のタンパク質を産生することができ、グルコース上で（すなわち、非誘導条件下で）は、最小の基礎レベルのタンパク質を産生した。１０アミノ酸トランケーション（配列番号１２）、又は１５アミノ酸トランケーション（配列番号１６）を有するＡｃｅ３－Ｌを発現する娘細胞は、ラクトース（誘導）及びグルコース（非誘導）の両条件下で、タンパク質産生の増加を示した。したがって、図７に示すように、増加の倍率変化は、ラクトースで親株（ＲＬ－Ｐ３７）によって産生されるタンパク質レベルと比較して、グルコースで約１．８倍、ラクトースで約３倍である。

例えば、総タンパク質産生におけるこの改善は、国際公開第２０１８／０６７５９９号パンフレットに記載された１１アミノ酸トランケーションを含むＡｃｅ３－Ｌタンパク質（配列番号６）で観察されたタンパク質産生の改善と類似している。５個のアミノ酸のトランケーション（配列番号：７）は、ラクトースとグルコースの両方で親株と同様のタンパク質発現レベルを示した。０個のアミノ酸のトランケーション（すなわち、Ａｃｅ３－ＬＣ；ＷＴ Ｃ末端；配列番号２）、２０個のアミノ酸のトランケーション（配列番号：２１）、又は２５個のアミノ酸のトランケーション（配列番号２２は、ラクトース上及びグルコース上の両方で、総タンパク質の産生が大きく減少した。これらの結果は、Ａｃｅ３タンパク質のＣ末端のトランケーションがタンパク質産生をアップレギュレートする機能に必須であることを示している。同様に、図７に示すように。Ａｃｅ３ Ｃ末端で許容されるアミノ酸トランケーションの数には上限及び下限がある。

Ｅ．７～１７アミノ酸Ｃ末端トランケーションを有するＡｃｅ３－ＬＣバリアントは機能的である
許容されるＡｃｅ３ Ｃ末端アミノ酸トランケーションの上限及び下限をさらに調べるために、本出願人は、５～２０個のアミノ酸のＣ末端トランケーションを有するＡｃｅ３－ＬＣを含むＴ．リーゼイ（Ｔ．ｒｅｅｓｅｉ）株を構築し、試験した（すなわち、１アミノ酸増分のトランケーションを用いる；例えば、表１、表３及び図８を参照）。例えば、５個又は６個のアミノ酸のトランケーション（図８）は、親株と同様の結果を示した（すなわち、グルコース上で基礎レベルのタンパク質産生、及びラクトース上で高レベルの産生）。対照的に、少なくとも７～１７個のアミノ酸のトランケーションは、グルコース及びラクトースの両方で改善された産生を示し、これは、Ａｃｅ３－Ｌタンパク質における１１アミノ酸トランケーションによる以前の観察と同様である（図８）。さらに、１８個以上のＣ末端アミノ酸のトランケーションは、ラクトース及びグルコースの両方で、タンパク質産生を基礎レベルまで有意に減少させた（図８）。

したがって、上記のように、（Ａｃｅ３）Ｃ末端は、インデューサーの存在下及びインデューサーの非存在下の両方において、Ａｃｅ３タンパク質の機能（すなわち、タンパク質産生の調節）に必須の役割を果たす。例えば、７～１７個のアミノ酸のトランケーションを有するＡｃｅ３－ＬＣタンパク質を発現する菌株は、ラクトース（誘導）条件下の親株ＲＬ－Ｐ３７と比較して、グルコース（非誘導）条件下の総タンパク質産生において約２倍の改善を示し、また、ラクトース（誘導）条件下の親株ＲＬ－Ｐ３７と比較して、ラクトース（誘導）条件下の総タンパク質産生において約３倍の改善を示した。対照的に、野生型Ｃ末端、又は５、６、１８若しくはそれ以上のアミノ酸のトランケーションを有するＣ末端を有するＡｃｅ３－ＬＣを発現する菌株は、グルコース（非誘導）条件下で最小量のタンパク質を産生し、また、ラクトース（誘導）条件下では、産生したタンパク質の量は、ラクトース（誘導）条件下の親株と比較して、同程度か又は減少した。したがって、本明細書で示すように、少なくとも７アミノ酸トランケーション（配列番号９）、最大で１７アミノ酸トランケーション（配列番号：１８）を有するＡｃｅ３－ＬＣタンパク質を含むＴ．リーゼイ（Ｔ．ｒｅｅｓｅｉ）株は、（試験した他の株と比較して）増強されたタンパク質産生表現型を含み、増強されたタンパク質産生表現型は、インデューサーの存在下及びインデューサーの非存在下の両方で観察された。

実施例２
ＡＣＥ３トランケーションの復帰
Ａ．概説
工業的に重要なトリコデルマ属（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）株のＲｕｔ－Ｃ３０及びＲＬ－Ｐ３７は、トリコデルマ属（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）天然単離物ＱＭ６ａの変異誘発誘導体であり（Ｌｅ Ｃｒｏｍ ｅｔ ａｌ．，２００９；Ｓｈｅｉｒ－Ｎｅｉｓｓ ａｎｄ Ｍｏｎｔｅｎｅｃｏｕｒｔ，１９８４）、ＮＧ１４株が最後の共通祖先である。ＮＧ１４とＱＭ６Ａとのゲノム比較により、原株ＱＭ６Ａ（ＰＭＩＤ：１９８０５２７２）との間で１２６個の一塩基多型（ＳＮＰ）及び２２個の挿入及び欠失（ｉｎｄｅｌ）が確認された。

これらのうち、転写因子をコードする遺伝子の点変異は、その時点で利用可能な計算的に予測される遺伝子構造に基づいて１１アミノ酸Ｃ末端トランケーションをもたらすと予測された。後に、この転写因子は、遺伝子のノックアウトの結果、誘導条件下（例えば、ラクトースの存在下；Ｈａｋｋｉｎｅｎ ｅｔ ａｌ．，２０１４）でセルラーゼ及びヘミセルラーゼ産生の有意な喪失をもたらした後、Ａｃｅ３と命名される。以前に、出願人は、１１アミノ酸トランケーションが過剰に発現されると、それは、インデューサーの存在下及び非存在下の両方でのタンパク質産生の改善におけるＡｃｅ３－Ｌ（Ａｃｅ３の特定の変異体）の機能に必須であることを示した（例えば、国際公開第２０１８／０６７５９９号パンフレットを参照されたい）。

上記の実施例１に記載されるように、本出願人は、タンパク質産生の改善に必要なＣ末端（アミノ酸）トランケーションの正確な数（すなわち、７～１７個のアミノ酸）を決定した。本実施例においては、本出願人は、ａｃｅ３遺伝子座におけるＣ末端トランケーション点変異を、野生型Ｎ末端（図１Ａ；配列番号２）及びグリシン（Ｇ）で終わる野生型Ｃ末端（図１Ｂ；配列番号２）を含む完全長Ａｃｅ３タンパク質をコードするＱＭ６ａの「野生型」（Ｃ末端）配列に分子的に戻した。以下に記載するように、完全長Ａｃｅ３転写因子（配列番号２）を発現する菌株は、蛋白質産生の減少を示した。

Ｂ．Ｔ．リーゼイ（Ｔ．ｒｅｅｓｅｉ）宿主株
本実施例に記載されるＴ．リーゼイ（Ｔ．ｒｅｅｓｅｉ）親株は、Ｓｈｅｉｒ－Ｎｅｉｓｓ ａｎｄ Ｍｏｎｔｅｎｅｃｏｕｒｔ（１９８４）によって記載されるように、Ｔ．リーゼイ（Ｔ．ｒｅｅｓｅｉ）株ＲＬ－Ｐ３７（ＮＲＲＬ寄託番号１５７０９）に由来した。本明細書で「Ｔ４ａｂｃ ｐｙｒ２」と名付けた菌株は、ＲＬ－Ｐ３７の変異誘発誘導体であり、ｐｙｒ２に菌株が成長のためにウリジンを必要とするような顕著な変異を有し、総タンパク質産生を増加させるｎｉｋ１（Ｍ７４３Ｔ）変異を有する（例えば、米国特許公開第２０１８／００３７９１９号明細書を参照）。

Ｃ．発現ベクター及び菌株の構築
当業者であれば、本明細書に開示した関連ＤＮＡ部品からこのプラスミドを容易に再作製できるように、標準の分子生物学的手順を用いて、トリコデルマ属（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）ａｃｅ３復帰カセットプラスミド、ｐＲＡＴＴ３４６を調製した。このｐＲＡＴＴ３４プラスミドは、Ｓｃａｆｆｏｌｄ ８、４２２４７５～４２４５１６（左フランク）に対応するＤＮＡ配列と相同である２．０Ｋｂのホモロジーボックスを有するＤＮＡ配列を含んだ。この左フランク内のＳｃａｆｆｏｌｄ ８、４２４１３２に対応するヌクレオチドは、ＮＧ１４及びＴ４ａｂｃを含む誘導体のゲノムにおけるようなチミン（Ｔ）とは対照的に、ＱＭ６ａのゲノムにおけるようなシトシン（Ｃ）であった。また、このプラスミド内には、Ｓｃａｆｆｏｌｄ ８、４２４５８８～４２６３８１（右フランク）に対応するＤＮＡ配列と相同な１．８Ｋｂのホモロジーボックスを有するＤＮＡ配列も含まれた。これらの配列は、ａｃｅ３遺伝子を標的とし、左フランクと右フランクとの間のゲノムの領域（Ｓｃａｆｆｏｌｄ ８、４２４５１７～４２４５８７）を介在カセット配列で置換するために設計された。

これらの介在カセット配列は、形質転換すべき菌株のゲノム内の内因性Ｔ．リーゼイ（Ｔ．ｒｅｅｓｅｉ）ｐｙｒ２との相同性を最小限に抑えることが意図されたトリコデルマ・アトロビリデ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ａｔｒｏｖｉｒｉｄｅ）由来のｐｙｒ２選択マーカーを含んだ。ｐｙｒ２選択マーカーの直ぐ上流には、その後のマーカーの消失及び形質転換体／破壊株の有用なｐｙｒ２変異誘導体の単離を促進する、このマーカーの３’末端の直接繰返し重複（リピート）があった。正確に標的化された介在カセット配列を備える形質転換体のサブセットでは、左フランクのシトシン（Ｃ）ヌクレオチドもまた変異チミン（Ｔ）ヌクレオチド（Ｓｃａｆｆｏｌｄ ８、４２４１３２）に代わってゲノム内に組み込まれるであろう。本明細書に記載したａｃｅ３復帰対立遺伝子（完全長Ａｃｅ３をコードする；配列番号２）は、Ｓｃａｆｆｏｌｄ ８、４２４１３２でのヌクレオチドの復帰及びＳｃａｆｆｏｌｄ ８、４２４５１７～４２４５８７の間での繰返し隣接ｐｙｒ２マーカーの挿入の両方を含有する。

したがって、菌株Ｔ４ａｂｃ ｐｙｒ２は、ＰＥＧ媒介性形質転換法を使用して、ｐＲＡＴＴ３４６由来のａｃｅ３復帰カセットを用いて形質転換させ、ｐｙｒ２マーカーによって獲得されたウリジン原栄養性に基づいて候補について選択するために１．２Ｍのソルビトールを含有するフォーゲル最少培地（Ｖｏｇｅｌ，１９５６）でプレーティングした。トリコデルマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）形質転換法は、当該技術分野においてよく知られており、記載されている（例えば、米国特許第５，２４６，８５３号明細書を参照されたい）。個々の形質転換体を単離し、フォーゲル最少培地に移動させて増殖させた。ＰＣＲ分析を使用し、下記のガイダンスによって当業者に知られた方法を使用して、ａｃｅ３復帰カセットがａｃｅ３遺伝子座で相同組換えによって組み込まれた形質転換体を同定した。

目的遺伝子の破壊を正確に標的化するには、組換え細胞のサブセットしか相同フランクを首尾よく利用することができないので、所望の事象を備える形質転換体を同定するためには、多数の形質転換体をスクリーニングする必要があり得る。ＰＣＲを使用すると、どの組換え細胞が所望の標的化破壊を有するかを試験することができる。ホモロジーボックス領域のそれぞれにわたって増幅するプライマーが設計されなければならないが、ここで、１つのプライマーは最も近い末端から１００ｂｐ超の選択マーカー内の１つの場所でプライミングし、他方のプライマーは、隣接ゲノム配列内のホモロジーボックス領域の末端を１００ｂｐ超える場所でプライミングする。正確な標的化破壊を含有する可能性が高い細胞は、破壊カセットの左フランクと右フランクに及ぶＰＣＲ産物を作製することに成功するであろうが、他方不成功に終わる形質転換事象は予想されるサイズの産物を生成しないであろう。この段階では、培養は形質転換細胞と未形質転換細胞の混合であるので、精製のステップが必要になる可能性がある。培養の精製は、破壊部位に渡る短いＰＣＲ産物の消失についてＰＣＲによって試験することができる。

胞子の精製後、組み込みが正確に発生したこと、及び形質転換体が同核状態であることを確認するために、さらなるＰＣＲ分析を実施した。次に、組み込み事象中に左フランク内にこの突然変異が組み込まれたかどうかを決定するために、復帰変異に及ぶａｃｅ３遺伝子の一部をＰＣＲ増幅させてシーケンシングした。ａｃｅ３復帰カセットの確証された相同組み込みを有する生成された菌株を、「Ｔ４ａｂｃ ａｃｅ３＿ｒｅｖ」と命名した。

Ｄ．ａｃｅ３復帰形質転換体の発酵
３菌株を、振盪フラスコ発酵において、それらのタンパク質産生について評価した。これには、「Ｔ４ａｂｃ」株（ａｃｅ３トランケーション対立遺伝子を含有する）、「Ｔ４ａｂｃ ａｃｅ３＿ｒｅｖ」株（ａｃｅ３完全長対立遺伝子を含有する）、及び「Ｔ４ａｂｃ ｄｅｌ－ｃｂｈ１」株（ｃｂｈ１セロビオヒドロラーゼ遺伝子の欠失を含有する）が含まれた。各菌株を２つの独立した振盪フラスコ（例えば、フラスコＡ及びフラスコＢ）で評価した。

液体規定（ＬＤ）培養培地（例えば、米国特許第８，４５５，６３１号明細書を参照）は、以下の成分を含有した。カザミノ酸、９ｇ／Ｌ；（ＮＨ_４）_２ＳＯ_４、５ｇ／Ｌ；ＭｇＳＯ_４・７Ｈ_２Ｏ、１ｇ／Ｌ；ＫＨ_２ＰＯ_４、４．５ｇ／Ｌ；ＣａＣｌ_２・２Ｈ_２Ｏ、１ｇ／Ｌ；ＰＩＰＰＳ、３３ｇ／Ｌ；４００×Ｔ．リーゼイ（Ｔ．ｒｅｅｓｅｉ）微量元素、２．５ｍＬ／Ｌ；ｐＨ、ＮａＯＨを用いて５．５に調整。滅菌後、ラクトース又はグルコース／ソホロース混合液を１．６ｗ／ｖ％の最終濃度に添加した。

種培養を創出するために、２５０ｍＬフラスコ内の５０ｍＬのＹＥＧ（５ｇ／Ｌの酵母抽出物、２２ｇ／Ｌのグルコース、Ｈ_２Ｏ）に各菌株の芽胞を個別に加えた。培養は、振盪インキュベーター内で３６～４８時間にわたって２８℃及び２００ｒｐｍで増殖させた。インキュベーション後、０．３ｍＬの種培養をバッフル付き振盪フラスコ内で５０ｍＬのＬＤ培地中に加えた。この生産培養を５日間にわたり２８℃及び１８０ｒｐｍで増殖させた。分泌されたタンパク質を、細胞をペレット化し、次に上清を収集するために、遠心分離によって収穫した。タンパク質を、当量のトリクロロ酢酸（ＴＣＡ）を用いて上清から沈降させ、その後に０．１Ｎの水酸化ナトリウム（ＮａＯＨ）中で溶解させた。次に総タンパク質を、製造業者のプロトコルに従ってＢＣＡタンパク質アッセイを用いて測定した（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｇｒａｎｄ Ｉｓｌａｎｄ、Ｎ．Ｙ．、ＵＳＡ）。ＢＣＡアッセイ数は、総タンパク質生産効率におけるいずれかの週毎の変化が及ぼす影響を最小限に抑えるために並行して実施されたＴ４ａｂｃ培養物の平均値に正規化した。

図９に示すように、ａｃｅ３変異が完全長Ａｃｅ３（例えば、配列番号２）をコードするようにＴ４ａｂｃバックグラウンドで復帰した場合、Ａｃｅ３ Ｃ末端のトランケート型（例えば、配列番号６）をコードするＴ４ａｂｃ親株と比較して、総分泌タンパク質力価は７３％減少した。これに対し、最も顕著な分泌タンパク質（Ｃｂｈ１）をコードする遺伝子の欠失は、総分泌タンパク質力価を４７％減少させただけであった。

実施例３
ＡＣＥ３ Ｃ末端アミノ酸バリアント
上記の実施例１及び２に記載したように、本出願人は、Ａｃｅ３ＬＣ Ｃ末端における規定数のアミノ酸トランケーション（例えば、７～１７）が、タンパク質の生産性を改善するために必要であることを示した。さらに、詳細な説明において簡単に上述したように、本出願人は、Ａｃｅ３ Ｃ末端の他の遺伝子改変（例えば、置換、挿入、内部（Ｃ末端）欠失、これらの組み合わせなど）が、タンパク質の生産性を改善するために等しく好適な遺伝子改変であることを企図する。

本実施例では、タンパク質の生産性を改善するために、Ａｃｅ３ Ｃ末端バリアントライブラリーを構築し、そのようなライブラリーをスクリーニングするための組成物及び方法を記載する。例えば、Ａｃｅ３についてのＣ末端バリアントライブラリーは、当業者によって、プラスミドｐＹＬ７２（図６）からの配列番号２の６４１～６８９のアミノ酸をコードするＡｃｅ３－ＬＣのコード配列を置換することにより、そして、各ライブラリーについて提供される配列識別番号（配列番号）及び配列番号３２のための例示的なプラスミドｐＡ３Ｌ０２（図１１）を参照することにより生成することができる。したがって、本出願人は、部位置換ライブラリー（ライブラリー１）、走査挿入ライブラリー（ライブラリー２）及び走査欠失ライブラリー（ライブラリー３）を含む、３つの異なるＡｃｅ３ Ｃ末端ライブラリーを構築し、スクリーニングする方法を本明細書に記載する。したがって、本明細書に記載の３つのライブラリーの例は、限定することを意図するものではなく、むしろ全体的なアプローチを例示するものであり、他のＡｃｅ３ Ｃ末端バリアントライブラリーを設計／構築し、タンパク質の生産性を改善するためにそれをスクリーニングするために、当業者によって容易に適合され得る。

ライブラリー１は部位置換ライブラリーであり、配列番号２のアミノ酸位置６７３～６８３に対応する各アミノ酸に対するコドンは、「ＮＮＫ」コドンで置換される（ｍｕｔ）（ここで、「Ｎ」は任意のヌクレオチドであり、「Ｋ」は「Ｇ」又は「Ｔ」ヌクレオチドである）。配列番号２の６４１～６８９のアミノ酸に対応する各コードされたアミノ酸位置についてのライブラリー１の縮重ＤＮＡ配列をそれぞれ配列番号３２～４２として記載し、以下の表４に示す。比較のために、配列番号３１は、配列番号２の６４１～６８９のアミノ酸（例えば、配列番号３０、配列番号２のアミノ酸位置６４１～６８９を含む）に対応する各コードされたアミノ酸位置についての天然ＤＮＡ配列に対応する。

ライブラリー２は走査挿入ライブラリーであり、３つのコドン配列「ＮＤＴ」（コドン１）－「ＮＤＴ」（コドン２）－「ＮＮＫ」（コドン３）は、配列番号２の６７２～６８３のアミノ酸に対応する（３’）各コドンの後に挿入される（ここで、「Ｎ」は任意のヌクレオチドであり、「Ｄ」は「Ａ」、「Ｇ」又は「Ｔ」ヌクレオチドであり、「Ｋ」は「Ｇ」又は「Ｔ」ヌクレオチドである）。配列番号２の６４１～６８９のアミノ酸に対応する各コードされたアミノ酸位置についてのライブラリー２の縮重ＤＮＡ配列をそれぞれ配列番号４３～５４として記載し、以下の表５に示す。
ライブラリー３は走査欠失ライブラリーであり、配列番号２のアミノ酸位置６７３～６８３に対応する各コドンは、以下のように改変される：配列番号２のアミノ酸位置６７３に対応するコドンで開始し、６７３位のコドン及び次の２つの隣接する下流（３’）コドン（すなわち、全部で９個のヌクレオチド）はＡｃｅ３コード配列から欠失している。配列番号２の６４１～６８９のアミノ酸に対応する各コードされたアミノ酸位置についてのライブラリー３のＤＮＡ配列を配列番号５５～６５として記載し、以下の表６に示す。

（例えば、ライブラリー１からの）変異アミノ酸位置を含む縮重ライブラリープラスミドクローンをプールすることによって、当業者は、必要とされるトリコデルマ・リーゼイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉ）の形質転換の数を減少させることができる。例えば、トリコデルマ・リーゼイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉ）形質転換のために、ライブラリー３全体を合理的にプールすることができる。したがって、プールは個々のプラスミドクローンの単離及び配列決定の後に、又はプラスミド抽出の前にランダムなＥ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）形質転換体をプールすることによって行うことができ、この場合、Ｅ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）形質転換体の９０％超においてｐＹＬ７２プラスミドの正しい改変に高い信頼性があり、プールについて１００個超のＥ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）形質転換体が存在する。

したがって、トリコデルマ・リーゼイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉ）細胞（例えば、ＲＬ－Ｐ３７）は上記の実施例１に記載されるように形質転換されるが、上記に記載のプールされたコンストラクトライブラリーを用いて、Ａｃｅ３バリアントをｇｌａ１遺伝子座に標的化する。各形質転換ライブラリーについて、６０個超の形質転換体を培養し、実施例１に記載のようにタンパク質産生についてアッセイする。細胞培養物は、目的の形質転換体の分子特性の解析を可能にするために保存することができる。プラスミドｐＹＬ７２（Ａｃｅ３－ＬＣ）及びｐＹＬ８８（Ａｃｅ３－ＬＣ Ｃ－ｔｅｒｍ－１１）の組み込みによる形質転換体は、陰性及び陽性対照として、１つの２４ウェルプレートあたり少なくとも３連で含まれる。例えば、ライブラリー１における「ＮＮＫ」縮重から、１／３２クローンが終止コドンを有し、それによって、実施例１に記載されるトランケート型Ａｃｅ３バリアントの１つをコードすることが予想され、これらのクローン（トランケート型Ａｃｅ３バリアント）は、内部陽性対照及び実施される方法の検証として役立つ。

同様に、Ａｃｅ３バリアントを保有するいくつかのトリコデルマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）形質転換体（例えば、ｐＹＬ８８（Ａｃｅ３－ＬＣ Ｃ－ｔｅｒｍ－１１）形質転換体など））は、インデューサーの非存在下で、ｐＹＬ７２（Ａｃｅ３－ＬＣ）形質転換体と比較して、発酵中に分泌セルラーゼ及びヘミセルラーゼをより多く産生することができる。これらの形質転換体中のｇｌａ１遺伝子座に組み込まれたＡｃｅ３バリアントの配列を決定するために、バリアントは、以下のように、当該技術分野で知られた方法によって分子的に特徴付けることができる。

ゲノムＤＮＡは個々の形質転換体から抽出され、ｇｌａ１遺伝子座におけるＡｃｅ３バリアントのＣ末端部分は、各形質転換体から個々に、配列番号２のアミノ酸位置６７０をコードするコドンの約５００ｂｐ上流（５’）にプライミングするフォワードプライマー（配列番号２３、表２）及びＡｃｅ３バリアントの終止コドンのｐｙｒ４遺伝子及び約９００ｂｐ下流（３’）で特異的にプライミングするリバースプライマー（配列番号２４、ＴＡＢＬＥ２）を用いて、ＰＣＲ増幅される。次いで、精製されたＰＣＲ産物を、さらなるネステッドプライマーを用いて、又は当業者に知られた他の配列決定法によって配列決定する。続いて、配列決定結果の分析により、インデューサーの非存在下でタンパク質産生の増強を示すＡｃｅ３バリアントを容易に決定する。

当業者に理解されるように、いくつかの偽陽性がスクリーニングにおいて得られる可能性がある。したがって、当業者は同定された特定のＡｃｅ３バリアントを含有するｐＹＬ７２の誘導体を生成し、プールについて上述したように、特定のＡｃｅ３バリアントを有するさらなる形質転換体を評価することができる。

様々なＡｃｅ３バリアントを有する形質転換体が、ｐＹＬ７２（Ａｃｅ３－ＬＣ）とｐＹＬ８８（Ａｃｅ３－ＬＣ Ｃ－ｔｅｒｍ－１１）対照形質転換体との間のインデューサー非依存性表現型中間体を示す場合（実際に可能であれば）、これらのバリアントの個々の変異を組み合わせて、上記のように同様に評価することができる。

同様に、上記のようなスクリーニングされたライブラリープールから（例えば、ライブラリー１、ライブラリー２及び／又はライブラリー３から）から同定された任意のＡｃｅ３バリアントの最適アミノ酸配列を組み合わせ、その後のラウンド焦点ライブラリースクリーニングにさらに供し、上記のように評価することができる。例えば、スクリーニングされた形質転換体のサンプルサイズに応じて、所与の位置でのいくつかのアミノ酸置換は、部位置換ライブラリー（ライブラリー１）に表されない場合がある。最も有用な位置についてのバリアントを有する個々のプラスミドクローンを単離又は生成するインセンティブが存在し得、全ての可能な置換が個々に評価され得る（例えば、ライブラリー１に最初に使用されたプールとは対照的に）。さらに、走査挿入ライブラリー（ライブラリー２）から同定された有用なＡｃｅ３バリアントについて、例えば、挿入長を６個、９個又はそれ以上のアミノ酸残基に増加させ、及び／又は挿入を２個又は１個のアミノ酸残基に挿入を減少させることによって、最も有用な位置でさらなるバリアントを試験するインセンティブがあり得る。さらに、走査欠失ライブラリー（ライブラリー３）から同定された有用なバリアントについて、例えば、実際には隣接する欠失残基の数を４個、６個、８個などのアミノ酸残基に増加させる、及び／又は欠失サイズを２個又は１個のアミノ酸残基に減少させることによって、最も有用な位置でさらなるバリアントを生成及び試験するインセンティブがあり得る。

実施例４
Ｃ末端置換を有するＡＣＥ３
Ａ．概説
本実施例では、本出願人は、Ａｃｅ３－ＬＣ（配列番号：２）Ｃ末端の最後の１１個のアミノ酸残基を、Ｖ５エピトープタグ又はＶ５－（６×Ｈｉｓ）タンデムタグで分子的に置換した（図１２）。以下に記載するように、Ｃ末端Ｖ５タグ置換を有するＡｃｅ３－ＬＣ（すなわち、Ａｃｅ３－ＬＣ－Ｖ５）、及びＣ末端Ｖ５－（６×Ｈｉｓ）タンデムタグを有するＡｃｅ３－ＬＣ（すなわち、Ａｃｅ３－ＬＣ－Ｖ５－（６×Ｈｉｓ））置換を発現するトリコデルマ属（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）株は、誘導基質の存在下及び非存在下の両方でタンパク質産生の増加を示した。

Ｂ．宿主株、発現ベクター及び株構築。
Ｔ．リーゼイ（Ｔ．ｒｅｅｓｅｉ）株Ｔ４ａｂｃ（例えば、上記実施例２に記載）を、本実施例における親株として使用した。トリコデルマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）ａｃｅ３ Ｃ末端置換カセットプラスミドｐＹＬ１８（Ａｃｅ３－ＬＣ－Ｖ５）及びｐＹＬ１９（Ａｃｅ３－ＬＣ－Ｖ５－（６×Ｈｉｓ））を、当業者が開示された関連ＤＮＡ部分からこのプラスミドを容易に再作製できるように、標準的な分子生物学的手順を用いて調製した。より詳細には、配列番号２の６４１のアミノ酸残基に対応するコドンから始まるＡｃｅ３ Ｃ末端置換バリアントのコード配列のＤＮＡ配列を、Ａｃｅ３－ＬＣ－Ｖ５に対しては配列番号６７として、Ａｃｅ３－ＬＣ－Ｖ５－（６×Ｈｉｓ）に対しては配列番号６９として記載する。

発現ベクターは、Ｅ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）の複製及び選択のための細菌ＣｏｌＥ１ ｏｒｉ及びＡｍｐＲ遺伝子、並びにサッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）の複製及び選択のための２μ ｏｒｉ及びＵＲＡ３遺伝子を有するベクター骨格を含む。さらに、Ｔ．リーゼイ（Ｔ．ｒｅｅｓｅｉ）テロメア配列（「ＴｒＴＥＬ」）、Ｔ．リーゼイ（Ｔ．ｒｅｅｓｅｉ）ｐｙｒ２選択マーカー、遺伝子ｄｉｃ１のＴ．リーゼイ（Ｔ．ｒｅｅｓｅｉ）プロモーター配列、及びその天然ターミネーター配列を有するＡｃｅ３－ＬＣバリアントが存在する。代表的なベクターマップを図１３に示すが、それには１４アミノ酸Ｖ５タグ配列で最後の１１個のアミノ酸が置換されたＡｃｅ３－ＬＣバリアントを含有するベクターｐＹＬ１８が記載されている。

この発現ベクターを、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）媒介プロトプラスト形質転換によってＴ．リーゼイ（Ｔ．ｒｅｅｓｅｉ）親宿主株（非機能性ｐｙｒ２遺伝子を含む）に挿入（形質転換）した（Ｏｕｅｄｒａｏｇｏ ｅｔ ａｌ．，２０１５；Ｐｅｎｔｔｉｌａ ｅｔ ａｌ．，１９８７）。形質転換体をフォーゲル最少培地最小培地寒天プレート上で増殖させ、ｐｙｒ２マーカーによって獲得したウリジン原栄養性について選択した。フォーゲル寒天プレート上で２回連続してトランスファーすることによって安定な形質転換体を得、続いて非選択的ＰＤＡプレート上で２回連続して増殖させ、フォーゲル寒天プレート上で１回増殖させ、その後、胞子懸濁液を平板希釈することによって単一コロニーを得た。

Ｃ．Ａｃｅ３Ｃ末端置換形質転換体の発酵
上記の実施例１に記載されるように、「非誘導」及び「誘導」の両条件で、上記の親及び形質転換した（娘）Ｔ．リーゼイ（Ｔ．ｒｅｅｓｅｉ）宿主細胞を試験した。例えば、図１４に示すように。親Ｔ．リーゼイ（Ｔ．ｒｅｅｓｅｉ）細胞は、ソホロースインデューサーの存在下でのみ、高レベルの分泌タンパク質を産生した。対照的に、Ａｃｅ３－Ｌ（すなわち、１１アミノ酸トランケーションを含む）を含み、且つ発現させる、バリアント（娘）Ｔ．リーゼイ（Ｔ．ｒｅｅｓｅｉ）細胞は、誘導（Ｇｌｕ／Ｓｏｐ）及び非誘導（Ｇｌｕ）の両条件下で大量の分泌タンパク質を産生した。さらに、Ａｃｅ３－ＬＣ－Ｖ５タグ（すなわち、最後の１１個のアミノ酸の１４アミノ酸置換を含む）を含み、発現するバリアント（娘）Ｔｒｅｅｓｅｉ細胞、及びＡｃｅ３－ＬＣ－Ｖ５－（６×Ｈｉｓ）デュアルタグ（すなわち、最後の１１個のアミノ酸の２３アミノ酸置換を含む）を含み、発現するＴ．リーゼイ（Ｔ．ｒｅｅｓｅｉ）細胞もまた、誘導（Ｇｌｕ／Ｓｏｐ）及び非誘導（Ｇｌｕ）の両条件下で、Ａｃｅ３－Ｌバリアントよりも約１０％低いものの、高いタンパク質生産性を示した（図１４）。

上記に基づき、これらの結果は、以下に限定されないが、置換、挿入、内部（Ｃ末端）欠失、及びこれらの組み合わせを含むＡｃｅ３ Ｃ末端のさらなる遺伝子改変が、誘導（Ｇｌｕ／Ｓｏｐ）基質及び非誘導（Ｇｌｕ）基質の両条件下で、トリコデルマ属（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）菌細胞におけるタンパク質生産性の改善に等しく好適な遺伝子改変であることを示している。

参考文献
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Claims (23)

1. バリアントＡｃｅ３転写因子（ＴＦ）タンパク質をコードする単離されたポリヌクレオチドであって、前記バリアントＡｃｅ３ ＴＦは、配列番号２のアミノ酸位置１～６７２に対して少なくとも９０％の配列同一性を含み、かつ配列番号２の最後の７個のＣ末端アミノ酸位置６８３～６８９の欠失、配列番号２の最後の８個のＣ末端アミノ酸位置６８２～６８９の欠失、配列番号２の最後の９個のＣ末端アミノ酸位置６８１～６８９の欠失、配列番号２の最後の１０個のＣ末端アミノ酸位置６８０～６８９の欠失、配列番号２の最後の１２個のＣ末端アミノ酸位置６７８～６８９の欠失、配列番号２の最後の１３個のＣ末端アミノ酸位置６７７～６８９の欠失、配列番号２の最後の１４個のＣ末端アミノ酸位置６７６～６８９の欠失、配列番号２の最後の１５個のＣ末端アミノ酸位置６７５～６８９の欠失、配列番号２の最後の１６個のＣ末端アミノ酸位置６７４～６８９の欠失、配列番号２の最後の１７個のＣ末端アミノ酸位置６７３～６８９の欠失、または配列番号２のＣ末端の最後の１１個のアミノ酸残基のＶ５エピトープタグあるいはＶ５－（６×Ｈｉｓ）タンデムタグによるアミノ酸置換を含み、前記バリアントＡｃｅ３転写因子（ＴＦ）タンパク質において、配列番号２に対応するアミノ酸位置６７３から前記欠失または前記置換の部位に至るまでのアミノ酸残基が存在する場合、それらは配列番号２の対応するアミノ酸残基と同一である、ポリヌクレオチド。
2. 前記バリアントＡｃｅ３ ＴＦは、配列番号９～配列番号１８のいずれか１つから選択されるアミノ酸配列を含む、請求項１に記載のポリヌクレオチド。
3. 配列番号２に対して少なくとも９０％の配列同一性を含むＡｃｅ３転写因子（ＴＦ）タンパク質をコードするａｃｅ３遺伝子を含む親トリコデルマ属（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）菌細胞に由来する遺伝子改変トリコデルマ属（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）真菌細胞であって、前記遺伝子改変細胞は、配列番号２のアミノ酸位置１～６７２に対して少なくとも９０％の配列同一性を含み、かつ配列番号２の最後の７個のＣ末端アミノ酸位置６８３～６８９の欠失、配列番号２の最後の８個のＣ末端アミノ酸位置６８２～６８９の欠失、配列番号２の最後の９個のＣ末端アミノ酸位置６８１～６８９の欠失、配列番号２の最後の１０個のＣ末端アミノ酸位置６８０～６８９の欠失、配列番号２の最後の１２個のＣ末端アミノ酸位置６７８～６８９の欠失、配列番号２の最後の１３個のＣ末端アミノ酸位置６７７～６８９の欠失、配列番号２の最後の１４個のＣ末端アミノ酸位置６７６～６８９の欠失、配列番号２の最後の１５個のＣ末端アミノ酸位置６７５～６８９の欠失、配列番号２の最後の１６個のＣ末端アミノ酸位置６７４～６８９の欠失、配列番号２の最後の１７個のＣ末端アミノ酸位置６７３～６８９の欠失、または配列番号２のＣ末端の最後の１１個のアミノ酸残基のＶ５エピトープタグあるいはＶ５－（６×Ｈｉｓ）タンデムタグによるアミノ酸置換を含み、前記バリアントＡｃｅ３転写因子（ＴＦ）タンパク質において、配列番号２に対応するアミノ酸位置６７３から前記欠失または前記置換の部位に至るまでのアミノ酸残基が存在する場合、それらは配列番号２の対応するアミノ酸残基と同一であるバリアントＡｃｅ３ ＴＦタンパク質をコードする改変ａｃｅ３遺伝子を含む改変細胞。
4. 前記Ａｃｅ３ ＴＦタンパク質は、配列番号２９に対して少なくとも９５％の配列同一性を含む機能的Ｎ末端亜鉛二核クラスターＤＮＡ結合ドメインを含む、請求項３に記載の改変細胞。
5. 前記バリアントＡｃｅ３ ＴＦタンパク質は、リグノセルロース分解酵素の産生に好適な条件下で発酵させた場合、誘導基質の非存在下でリグノセルロース分解酵素をコードする遺伝子の発現をアップレギュレートする、請求項３に記載の改変細胞。
6. 前記リグノセルロース分解酵素は、セロビオヒドロラーゼ、エンドグルカナーゼ及びβ－グルコシダーゼからなる群から選択される、請求項５に記載の改変細胞。
7. 目的タンパク質（ＰＯＩ）をコードする導入された発現カセットを含み、前記導入されたカセットは、ＰＯＩをコードする下流（３’）オープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）配列に作動可能に連結されたリグノセルロース分解酵素をコードする遺伝子に由来する上流（５’）プロモーター配列を含む、請求項３に記載の改変細胞。
8. 前記改変細胞は、前記ＰＯＩの産生に好適な条件下で発酵させた場合、誘導基質の非存在下で前記ＰＯＩを産生する、請求項７に記載の改変細胞。
9. 前記改変細胞は、誘導基質の存在下、ＰＯＩを産生するための同じ条件下で発酵させた場合、前記親細胞によって産生される同じＰＯＩの量と比較して、誘導基質の存在下で増加した量の前記ＰＯＩを産生する、請求項７に記載の改変細胞。
10. 前記バリアントＡｃｅ３ ＴＦは、配列番号９～配列番号１８のいずれか１つから選択されるアミノ酸配列を含む、請求項３に記載の改変細胞。
11. 配列番号４に対して少なくとも９０％の配列同一性を含むバリアントＡｃｅ３転写因子（ＴＦ）タンパク質をコードする変異ａｃｅ３遺伝子を含む親トリコデルマ属（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）菌細胞に由来する遺伝子改変トリコデルマ属（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）真菌細胞であって、配列番号４のＮ末端は、配列番号２９に記載のインタクトな亜鉛二核（Ｚｎ_２Ｃｙｓ_６）ＤＮＡ結合を含まず、前記遺伝子改変細胞は、配列番号２の１～６７２位に対して少なくとも９０％の配列同一性を含むバリアントＡｃｅ３ ＴＦタンパク質をコードする改変ａｃｅ３遺伝子を含み、配列番号２のＮ末端は、配列番号２９に記載のインタクトな亜鉛二核（Ｚｎ_２Ｃｙｓ_６）ＤＮＡ結合を含み、且つ配列番号２の最後の７個のＣ末端アミノ酸位置６８３～６８９の欠失、配列番号２の最後の８個のＣ末端アミノ酸位置６８２～６８９の欠失、配列番号２の最後の９個のＣ末端アミノ酸位置６８１～６８９の欠失、配列番号２の最後の１０個のＣ末端アミノ酸位置６８０～６８９の欠失、配列番号２の最後の１２個のＣ末端アミノ酸位置６７８～６８９の欠失、配列番号２の最後の１３個のＣ末端アミノ酸位置６７７～６８９の欠失、配列番号２の最後の１４個のＣ末端アミノ酸位置６７６～６８９の欠失、配列番号２の最後の１５個のＣ末端アミノ酸位置６７５～６８９の欠失、配列番号２の最後の１６個のＣ末端アミノ酸位置６７４～６８９の欠失、配列番号２の最後の１７個のＣ末端アミノ酸位置６７３～６８９の欠失、または配列番号２のＣ末端の最後の１１個のアミノ酸残基のＶ５エピトープタグあるいはＶ５－（６×Ｈｉｓ）タンデムタグによるアミノ酸置換を含み、前記バリアントＡｃｅ３転写因子（ＴＦ）タンパク質において、配列番号２に対応するアミノ酸位置６７３から前記欠失または前記置換の部位に至るまでのアミノ酸残基が存在する場合、それらは配列番号２の対応するアミノ酸残基と同一である、改変細胞。
12. 前記バリアントＡｃｅ３ ＴＦタンパク質は、リグノセルロース分解酵素の産生に好適な条件下で発酵させた場合、誘導基質の非存在下でリグノセルロース分解酵素をコードする遺伝子の発現をアップレギュレートする、請求項１１に記載の改変細胞。
13. 誘導基質の非存在下、トリコデルマ属（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）真菌細胞中で、リグノセルロース分解酵素を産生する方法であって、
    （ａ）バリアントＡｃｅ３転写因子（ＴＦ）タンパク質をコードする変異ａｃｅ３遺伝子を含むＴ．リーゼイ（Ｔ．ｒｅｅｓｅｉ）変異細胞を単離する工程であって、前記バリアントＡｃｅ３ ＴＦタンパク質は、配列番号２のアミノ酸位置１～６７２に対して少なくとも９０％の配列同一性を含み、且つ、配列番号２の最後の７個のＣ末端アミノ酸位置６８３～６８９の欠失、配列番号２の最後の８個のＣ末端アミノ酸位置６８２～６８９の欠失、配列番号２の最後の９個のＣ末端アミノ酸位置６８１～６８９の欠失、配列番号２の最後の１０個のＣ末端アミノ酸位置６８０～６８９の欠失、配列番号２の最後の１２個のＣ末端アミノ酸位置６７８～６８９の欠失、配列番号２の最後の１３個のＣ末端アミノ酸位置６７７～６８９の欠失、配列番号２の最後の１４個のＣ末端アミノ酸位置６７６～６８９の欠失、配列番号２の最後の１５個のＣ末端アミノ酸位置６７５～６８９の欠失、配列番号２の最後の１６個のＣ末端アミノ酸位置６７４～６８９の欠失、配列番号２の最後の１７個のＣ末端アミノ酸位置６７３～６８９の欠失、または配列番号２のＣ末端の最後の１１個のアミノ酸残基のＶ５エピトープタグあるいはＶ５－（６×Ｈｉｓ）タンデムタグによるアミノ酸置換を含み、前記バリアントＡｃｅ３転写因子（ＴＦ）タンパク質において、配列番号２に対応するアミノ酸位置６７３から前記欠失または前記置換の部位に至るまでのアミノ酸残基が存在する場合、それらは配列番号２の対応するアミノ酸残基と同一である、工程、及び
    （ｂ）リグノセルロース分解酵素の産生に好適な条件下で前記単離された変異体細胞を発酵させる工程であって、前記好適な発酵条件は誘導基質を含まない工程、
    を含む方法。
14. 前記リグノセルロース分解酵素は、セロビオヒドロラーゼ、エンドグルカナーゼ及びβ－グルコシダーゼからなる群から選択される、請求項１３に記載の方法。
15. 誘導基質の非存在下、遺伝子改変トリコデルマ属（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）真菌細胞中で、リグノセルロース分解酵素を産生する方法であって、
    （ａ）配列番号２のアミノ酸位置１～６８９に対して少なくとも９０％の配列同一性を含む野生型Ａｃｅ３転写因子（ＴＦ）タンパク質をコードするａｃｅ３遺伝子を含むトリコデルマ属（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）真菌細胞を得る工程、
    （ｂ）工程（ａ）の前記トリコデルマ属（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）菌細胞の前記ａｃｅ３遺伝子を遺伝子改変する工程であって、前記改変されたａｃｅ３遺伝子は、配列番号２のアミノ酸位置１～６７２に対して少なくとも９０％の配列同一性を含み、且つ配列番号２の最後の７個のＣ末端アミノ酸位置６８３～６８９の欠失、配列番号２の最後の８個のＣ末端アミノ酸位置６８２～６８９の欠失、配列番号２の最後の９個のＣ末端アミノ酸位置６８１～６８９の欠失、配列番号２の最後の１０個のＣ末端アミノ酸位置６８０～６８９の欠失、配列番号２の最後の１２個のＣ末端アミノ酸位置６７８～６８９の欠失、配列番号２の最後の１３個のＣ末端アミノ酸位置６７７～６８９の欠失、配列番号２の最後の１４個のＣ末端アミノ酸位置６７６～６８９の欠失、配列番号２の最後の１５個のＣ末端アミノ酸位置６７５～６８９の欠失、配列番号２の最後の１６個のＣ末端アミノ酸位置６７４～６８９の欠失、配列番号２の最後の１７個のＣ末端アミノ酸位置６７３～６８９の欠失、または配列番号２のＣ末端の最後の１１個のアミノ酸残基のＶ５エピトープタグあるいはＶ５－（６×Ｈｉｓ）タンデムタグによるアミノ酸置換を含むバリアントＡｃｅ３転写因子（ＴＦ）タンパク質において、配列番号２に対応するアミノ酸位置６７３から前記欠失または前記置換の部位に至るまでのアミノ酸残基が存在する場合、それらは配列番号２の対応するアミノ酸残基と同一であるバリアントＡｃｅ３ ＴＦタンパク質をコードする工程、及び
    （ｃ）リグノセルロース分解酵素の産生に好適な条件下で工程（ｂ）の前記改変されたトリコデルマ属（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）菌細胞を発酵させる工程
    を含み、
    前記好適な発酵条件は誘導基質を含まない、方法。
16. 前記野生型Ａｃｅ３ ＴＦタンパク質のＣ末端は、配列番号２のアミノ酸位置６７３～６８９に対して少なくとも９５％の配列同一性を含む、請求項１５に記載の方法。
17. 誘導基質の非存在下、遺伝子改変トリコデルマ属（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）真菌細胞中で、リグノセルロース分解酵素を産生する方法であって、
    （ａ）配列番号４のＡｃｅ３－Ｓ ＴＦタンパク質と少なくとも９０％の配列同一性を含むバリアントＡｃｅ３ ＴＦタンパク質をコードするａｃｅ３遺伝子を含むトリコデルマ属（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）真菌細胞を得る工程、
    （ｂ）工程（ａ）の前記トリコデルマ属（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）菌細胞の前記ａｃｅ３遺伝子を遺伝子改変する工程であって、前記改変されたａｃｅ３遺伝子は、配列番号２のアミノ酸位置１～６７２に対して少なくとも９０％の配列同一性を含み、且つ配列番号２の最後の７個のＣ末端アミノ酸位置６８３～６８９の欠失、配列番号２の最後の８個のＣ末端アミノ酸位置６８２～６８９の欠失、配列番号２の最後の９個のＣ末端アミノ酸位置６８１～６８９の欠失、配列番号２の最後の１０個のＣ末端アミノ酸位置６８０～６８９の欠失、配列番号２の最後の１２個のＣ末端アミノ酸位置６７８～６８９の欠失、配列番号２の最後の１３個のＣ末端アミノ酸位置６７７～６８９の欠失、配列番号２の最後の１４個のＣ末端アミノ酸位置６７６～６８９の欠失、配列番号２の最後の１５個のＣ末端アミノ酸位置６７５～６８９の欠失、配列番号２の最後の１６個のＣ末端アミノ酸位置６７４～６８９の欠失、配列番号２の最後の１７個のＣ末端アミノ酸位置６７３～６８９の欠失、または配列番号２のＣ末端の最後の１１個のアミノ酸残基のＶ５エピトープタグあるいはＶ５－（６×Ｈｉｓ）タンデムタグによるアミノ酸置換を含むバリアントＡｃｅ３転写因子（ＴＦ）タンパク質において、配列番号２に対応するアミノ酸位置６７３から前記欠失または前記置換の部位に至るまでのアミノ酸残基が存在する場合、それらは配列番号２の対応するアミノ酸残基と同一であるバリアントＡｃｅ３ ＴＦタンパク質をコードする工程、及び
    （ｃ）リグノセルロース分解酵素の産生に好適な条件下で工程（ｂ）の前記改変されたトリコデルマ属（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）菌細胞を発酵させる工程
    を含み、
    前記好適な発酵条件は誘導基質を含まない、方法。
18. 配列番号４のＡｃｅ３－Ｓ ＴＦタンパク質に対して少なくとも９０％の配列同一性を含む前記バリアントＡｃｅ３ ＴＦタンパク質は、配列番号２９に記載のインタクトな亜鉛二核（Ｚｎ_２Ｃｙｓ_６）ＤＮＡ結合を含まない、請求項１７記載の方法。
19. 配列番号２のアミノ酸位置１～６７２に対して少なくとも９０％の配列同一性を含むバリアントＡｃｅ３ ＴＦタンパク質をコードする前記遺伝子改変ａｃｅ３遺伝子は、配列番号２９に記載のインタクトな亜鉛二核（Ｚｎ_２Ｃｙｓ_６）ＤＮＡ結合を含む、請求項１７に記載の方法。
20. 誘導基質の非存在下、改変されたトリコデルマ属（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）菌細胞中で、目的タンパク質（ＰＯＩ）を産生する方法であって、
    （ａ）配列番号２のアミノ酸位置１～６８９に対して少なくとも９０％の配列同一性を含む野生型Ａｃｅ３転写因子（ＴＦ）タンパク質をコードするａｃｅ３遺伝子を含むトリコデルマ属（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）真菌細胞を得る工程、
    （ｂ）工程（ａ）の前記トリコデルマ属（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）菌細胞の前記ａｃｅ３遺伝子を遺伝子改変する工程であって、前記改変されたａｃｅ３遺伝子は、配列番号２のアミノ酸位置１～６７２に対して少なくとも９０％の配列同一性を含み、且つ配列番号２の最後の７個のＣ末端アミノ酸位置６８３～６８９の欠失、配列番号２の最後の８個のＣ末端アミノ酸位置６８２～６８９の欠失、配列番号２の最後の９個のＣ末端アミノ酸位置６８１～６８９の欠失、配列番号２の最後の１０個のＣ末端アミノ酸位置６８０～６８９の欠失、配列番号２の最後の１２個のＣ末端アミノ酸位置６７８～６８９の欠失、配列番号２の最後の１３個のＣ末端アミノ酸位置６７７～６８９の欠失、配列番号２の最後の１４個のＣ末端アミノ酸位置６７６～６８９の欠失、配列番号２の最後の１５個のＣ末端アミノ酸位置６７５～６８９の欠失、配列番号２の最後の１６個のＣ末端アミノ酸位置６７４～６８９の欠失、配列番号２の最後の１７個のＣ末端アミノ酸位置６７３～６８９の欠失、または配列番号２のＣ末端の最後の１１個のアミノ酸残基のＶ５エピトープタグあるいはＶ５－（６×Ｈｉｓ）タンデムタグによるアミノ酸置換を含むバリアントＡｃｅ３転写因子（ＴＦ）タンパク質において、配列番号２に対応するアミノ酸位置６７３から前記欠失または前記置換の部位に至るまでのアミノ酸残基が存在する場合、それらは配列番号２の対応するアミノ酸残基と同一であるバリアントＡｃｅ３ ＴＦタンパク質をコードする工程、
    （ｃ）ＰＯＩをコードする発現カセットを、工程（ｂ）の前記改変トリコデルマ属（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）菌細胞に導入する工程であって、前記発現カセットは、ＰＯＩをコードする下流（３’）オープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）配列に作動可能に連結されたリグノセルロース分解酵素をコードする遺伝子に由来する上流（５’）プロモーター配列を含む工程、及び
    （ｄ）前記ＰＯＩの産生に好適な条件下で工程（ｃ）の前記改変されたトリコデルマ属（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）菌細胞を発酵させる工程
    を含み、
    前記好適な発酵条件は誘導基質を含まない、方法。
21. 工程（ｂ）及び（ｃ）は、同時に又はいずれの順序でも実施される、請求項２０に記載の方法。
22. 誘導基質の非存在下、改変されたトリコデルマ属（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）菌細胞中で、目的タンパク質（ＰＯＩ）を産生する方法であって、
    （ａ）配列番号４のＡｃｅ３－Ｓ ＴＦタンパク質と少なくとも９０％の配列同一性を含むバリアントＡｃｅ３ ＴＦタンパク質をコードするａｃｅ３遺伝子を含むトリコデルマ属（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）真菌細胞を得る工程、
    （ｂ）工程（ａ）の前記トリコデルマ属（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）菌細胞の前記ａｃｅ３遺伝子を遺伝子改変する工程であって、前記改変されたａｃｅ３遺伝子は、配列番号２のアミノ酸位置１～６７２に対して少なくとも９０％の配列同一性を含み、且つ配列番号２の最後の７個のＣ末端アミノ酸位置６８３～６８９の欠失、配列番号２の最後の８個のＣ末端アミノ酸位置６８２～６８９の欠失、配列番号２の最後の９個のＣ末端アミノ酸位置６８１～６８９の欠失、配列番号２の最後の１０個のＣ末端アミノ酸位置６８０～６８９の欠失、配列番号２の最後の１２個のＣ末端アミノ酸位置６７８～６８９の欠失、配列番号２の最後の１３個のＣ末端アミノ酸位置６７７～６８９の欠失、配列番号２の最後の１４個のＣ末端アミノ酸位置６７６～６８９の欠失、配列番号２の最後の１５個のＣ末端アミノ酸位置６７５～６８９の欠失、配列番号２の最後の１６個のＣ末端アミノ酸位置６７４～６８９の欠失、配列番号２の最後の１７個のＣ末端アミノ酸位置６７３～６８９の欠失、または配列番号２のＣ末端の最後の１１個のアミノ酸残基のＶ５エピトープタグあるいはＶ５－（６×Ｈｉｓ）タンデムタグによるアミノ酸置換を含むバリアントＡｃｅ３転写因子（ＴＦ）タンパク質において、配列番号２に対応するアミノ酸位置６７３から前記欠失または前記置換の部位に至るまでのアミノ酸残基が存在する場合、それらは配列番号２の対応するアミノ酸残基と同一であるバリアントＡｃｅ３ ＴＦタンパク質をコードする工程、
    （ｃ）ＰＯＩをコードする発現カセットを、工程（ｂ）の前記改変トリコデルマ属（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）菌細胞に導入する工程であって、前記発現カセットは、ＰＯＩをコードする下流（３’）オープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）配列に作動可能に連結されたリグノセルロース分解酵素をコードする遺伝子に由来する上流（５’）プロモーター配列を含む工程、及び
    （ｄ）前記ＰＯＩの産生に好適な条件下で工程（ｃ）の前記改変されたトリコデルマ属（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）菌細胞を発酵させる工程
    を含み、
    前記好適な発酵条件は誘導基質を含まない、方法。
23. 工程（ｂ）及び（ｃ）は、同時に又はいずれの順序でも実施される、請求項２２記載の方法。