JP7800918B2 - 培養上清液の製造方法 - Google Patents

Description

本発明は、幹細胞の培養上清液を製造する製造方法に関する。

間葉系幹細胞を使った医療においては、幹細胞自体が治療効果をもたらすだけでなく、幹細胞が分泌するサイトカインやエクソソーム等の種々の生理活性物質が治療効果に大きく寄与していることが分かっている。間葉系幹細胞を人工的に培養すると、培養液中に細胞からこれらのサイトカイン等が放出されることから、間葉系幹細胞を除去した培養液を培養上清液として回収し有効利用することができる。

特許文献１には、透過性膜中空糸の内表面に播種した間葉系幹細胞に培養液を供給する工程と、間葉系幹細胞に培養液を接触させて間葉系幹細胞を培養する工程と、間葉系幹細胞が分泌した成分を含む培養液を回収する工程を含む培養上清液の製造方法が開示されている。特許文献１の発明は、培養上清液を簡便に作製することができる。

特許６９５８３５０号公報

しかし、特許文献１の発明は、作製される培養上清が少ないという問題がある。
そこで本発明は、間葉系幹細胞を使って、有効成分を高濃度に含む培養上清液を大量に作製する、培養上清液の製造方法を提供することを目的とする。

本実施形態は、間葉系幹細胞を培養した培養液から間葉系幹細胞を除去した培養上清液の製造方法である。その製造方法は、（ａ）担体、間葉系幹細胞、及び血清を含む培養液を培養槽に供給する工程と、（ｂ）間葉系幹細胞を担体へ接着させる工程と、（ｃ）血清を含む培養液を使って間葉系幹細胞を培養する工程と、（ｄ）フィルタ内に担体に接着した間葉系幹細胞を残し、血清を含む培養液を除去する工程と、（ｅ）培養槽、担体に接着した間葉系幹細、及びフィルタを洗浄する工程と、（ｆ）血清を含まない上清液用の培養液を培養槽に供給する工程と、（ｇ）血清を含まない上清液用の培養液を使って間葉系幹細胞を培養する工程と、（ｈ）フィルタ内に担体に接着した間葉系幹細胞を残し、血清を含まない上清液用の培養液を回収する工程と、を備える。

（ｂ）工程は、担体が血清を含む培養液中に浮遊するように血清を含む培養液を攪拌する第一期間と、攪拌を止める第二期間とを有してもよい。
また（ｃ）工程は、担体が血清を含む培養液中に浮遊するように血清を含む培養液が攪拌されてもよい。
また（ｇ）工程は、担体が血清を含まない上清液用の培養液中に浮遊するように血清を含まない上清液用の培養液が攪拌されてもよい。

フィルタのメッシュサイズが、７０メッシュから４００メッシュであることが好ましい。
（ａ）工程から（ｅ）工程後に、（ｆ）工程から（ｈ）工程が連続して繰り返されることが好ましい。
また（ｆ）工程から（ｈ）工程が２回から４回連続して繰り返されても良い。

回収した血清を含まない上清液用の培養液に、サイトカイン及びエクソソームの少なくとも一方が所定値よりも少ない場合に、前記培養槽に血清を含む培養液を供給し、（ｃ）工程、（ｄ）工程及び（ｅ）工程が一度だけ行われ、
回収した血清を含まない上清液用の培養液に、サイトカイン及びエクソソームの少なくとも一方が所定値よりも多い場合に、（ｆ）工程から（ｈ）工程が連続して繰り返されても良い。

間葉系幹細胞が不死化された幹細胞であることが好ましく、さらに不死化された幹細胞が乳歯歯髄幹細胞であることが好ましい。

本実施形態は、間葉系幹細胞を培養した培養液から間葉系幹細胞を除去した培養上清液の製造方法である。そして培養上清液の製造方法は、（ｐ）血清を含む培養液を使って担体に接着された間葉系幹細胞を培養槽内で培養し、その後培養槽内に配置されたフィルタ内に担体に接着した間葉系幹細胞を残し、血清を含む培養液を除去する工程と、（ｑ）（ｐ）工程後、培養槽、担体に接着した間葉系幹細、及びフィルタを洗浄する工程と、（ｒ）（ｑ）工程後、血清を含まない上清液用の培養液を培養槽に供給し、血清を含まない上清液用の培養液を使って間葉系幹細胞を培養した後、フィルタ内に担体に接着した間葉系幹細胞を残し、血清を含まない上清液用の培養液を回収する工程と、を備える。

（ｐ）工程及び（ｑ）工程が一度だけ行われ、その後、（ｒ）工程が２回から４回連続して繰り返され、再び、（ｐ）工程及び（ｑ）工程が一度だけ行われ、その後、（ｒ）工程が２回から４回連続して繰り返されてもよい。

培養槽の容量が５ｌ（リットル）から２０ｌ（リットル）であり、フィルタのメッシュサイズが、７０メッシュから４００メッシュであることが好ましい。また間葉系幹細胞が不死化された幹細胞であることが好ましい。

本発明の培養上清液の製造方法によれば、有効成分を高濃度に含む培養上清液を大量に連続して提供することができる。

フィルター３０が装着されていない状態の培養容器１００の一例を示した概略断面図である。 （Ａ）はフィルター３０の斜視図であり、（Ｂ）は担体４０の斜視図である。 培養上清液の製造方法の一例を示したフローチャートである。 （Ａ）は培養容器１００に培養液が満たされている状態を示した概念図であり、（Ｂ）は培養容器１００から培養液がほとんど排出された状態を示した概念図である。

＜培養の対象となる幹細胞＞
本実施形態の幹細胞としては、特に限定されるものではないが、骨髄間葉系幹細胞、あるいは脂肪組織由来間葉系幹細胞が好適である。動物種も特に限定されず、ヒト、マウス、ラット等のいずれの動物由来のものも使用できる。また、細胞の種類も特に限定されず、例えば、線維芽細胞、内皮細胞、上皮細胞、神経細胞、幹細胞、白血球、骨細胞、筋肉細胞、脂肪細胞などであってよく、好ましくは線維芽細胞または内皮細胞であってよい。さらに好ましい幹細胞として、ヒト由来の歯髄幹細胞であり、特に乳歯歯髄幹細胞である。

＜間葉系幹細胞の不死化＞
間葉系幹細胞の不死化方法は、例えば米国特許１０４９４６０６Ｂ２に開示されている。この開示方法は、間葉系幹細胞を初期培養して得られた初代培養細胞に、ｈＴＥＲＴ、ｂｍｉ－１、Ｅ６、及びＥ７という４種類の遺伝子を導入して、間葉系幹細胞を不死化させることが可能である。
また別の間葉系幹細胞の不死化方法として、不死化幹細胞に、米国特許６１４６８８８に開示されている。この開示方法は、ＳＶ４０遺伝子をウィルスベクターにより導入して、間葉系幹細胞を不死化させることが可能である。別の間葉系幹細胞の不死化方法して、間葉系幹細胞にテロメラーゼ逆転換酵素（ＴＥＲＴ）遺伝子を導入する方法などもあり、この方法で間葉系幹細胞を不死化させることが可能である。

＜間葉系幹細胞の培養上清液＞
本明細書において、間葉系幹細胞を培養して得られ、間葉系幹細胞を除去したものを培養上清液という。なお、安全性を高めるため、培養上清液は動物血清を含まないことが好ましい。培養上清液に対して、透析や溶媒置換などを利用して動物血清を無くすこともできる。

培養上清液は、凍結または凍結乾燥されてもよいし、凍結乾燥した培養上清液を適切な溶媒に溶解されてもよい。凍結乾燥により良好な保存安定性が得られる。細胞培養上清液の凍結乾燥方法としては、タンパク質を含む液体の凍結乾燥に通常用いられている方法を適用することができる。

本実施形態の間葉系幹細胞の培養上清液は、特に乳歯歯髄幹細胞の培養上清液であることが好ましい。乳歯歯髄幹細胞は、増殖能力が高くその培養上清液にはサイトカインやエクソソーム等が多く含まれている。

＜培養液及びその調整＞
本実施形態の培養上清液の製造方法に用いる培養液は、特に限定されない。例えば、ＤＭＥＭ、αＭＥＭ、ＩＭＤＭ、ハムＦ－１２、ＲＰＭＩ－１６４０またはそれらの混合物などを基礎培養液として、ウシ胎児血清（ＦＢＳ）などの血清、またはＫＳＲ（KnockOutTM Serum Replacement）などの血清代替物、グルコース、アミノ酸、ビタミン、抗生剤などを適宜添加した培養液でよい。

本実施形態の培養液は、血清を含む培養液と、上清液回収用の血清を含まない培養液との２種類を用意することが好ましい。血清を含む培養液は、ＤＭＥＭ、５－２０％体積のＦＢＳ、及び抗生剤等が含まれることが好ましい。血清を含まない上清液用の培養液は、上清液を得るため、ＤＭＥＭ及び抗生剤等が含まれ血清がほとんど含まれない若しくはまったく含まれないものが好ましい。

＜培養槽及び培養装置＞
図１は、本実施形態で用いられる培養容器１００の一例を示した概略断面図である。図１は、後述するフィルター３０を装着する前の状態を示した図である。

培養容器１００は、５ｌ（リットル）から２０ｌ（リットル）の容量の培養槽１０を有する。培養槽１０は、内部に培養液を保持する部材で、その形状や容量、材質は、培養の目的に合わせて適宜選択される。本実施形態では、培養槽１０は、円形の底面と円筒形の側面とを有する。培養槽１０の構成材料は特に限定されるものではないが、本実施形態では、培養槽１０は、ガラス、ポリカーボネート材、ステンレス等で構成されていることが好ましく、特に培養状況もしくは攪拌状況を目視で確認できるように、透明材料で構成されることが好ましい。培養槽１０の下方には、培養槽１０内の温度を調整するヒータ２５が巻き付けられている。

培養容器１００は、天板２２を有する。天板２２は、培養槽１０の上部開口を覆う部材であり、気密性を高めるように天板２２と培養槽１０との間に複数のＯリングＯＲが配置されている。天板２２は、例えばポリカーボネート材もしくはステンレス材によって構成することができる。天板２２には複数の開口孔が形成されていて、種々の部品の取り付けが可能になっている。本実施形態では、天板２２には、攪拌シャフト１３、各種センサ１８、ガス供給チューブ１９、培養液排出ノズル２４、培養液供給ノズル（不図示）、ガス排出チューブ（不図示）などが取り付けられている。

ステンレス材の攪拌シャフト１３の先端にはステンレス材の攪拌パドル１２が取り付けられ、攪拌シャフト１３の後端には回転モータ１６が取り付けられている。また攪拌シャフト１３はベアリング１５で回転可能に保持されている。例えば攪拌シャフト１３は、回転モータ１６によって５－１００ｒｐｍで回転し、培養液を攪拌することができる。培養容器１００に、攪拌パドル１２、回転モータ１６及び攪拌シャフト１３を設ける代わりに、テフロン（登録商標）で被覆した攪拌子（磁石の棒）を培養槽１０内に入れて、マグネットスターラー（撹拌機）で攪拌子を回転させて、培養液が攪拌されてもよい。

各種センサ１８は、天板２２の開口孔に取り付けられており、培養液中の酸素濃度、二酸化炭素濃度、ｐＨ、温度等を測定する。ガス供給チューブ１９は、天板２２の開口孔に取り付けられ、酸素などのガスを培養液中に供給する。ガス供給チューブ１９は、例えば、耐化学薬品性のフッ素樹脂等の材料で構成され多孔質の貫通穴からガスを供給する。ガス排出チューブ（不図示）も天板２２の開口孔に取り付けられ、二酸化炭素等の不要なガスを排出する。培養液供給ノズル（不図示）は、天板２２の開口孔に取り付けられ、培養液を培養槽１０に供給する。培養液排出ノズル２４は、天板２２の開口孔に取り付けられ、ステンレス等で構成され、培養液もしくは上清液を培養槽１０から排出する。なお、天板２２の開口孔の代わりに、培養槽１０に開口孔を設けて、各種センサ１８又は培養液排出ノズル２４等が取り付けられても良い。

また、天板２２もしくは培養槽１０に、フィルタ保持枠２８が取り付けられている。フィルタ保持枠２８は、後述するフィルタ３０を例えば円筒形状の所定形状に保持するために設けられている。フィルタ保持枠２８は、例えばステンレス等の針金を円筒形状になるように縦横に組み合わせて製作されている。

不図示の制御部は、制御プログラムによって、培養液供給ノズル（不図示）で培養液を培養槽１０に供給し、攪拌パドル１２で培養液を攪拌する。またガス供給チューブ１９は、各種センサ１８からの測定結果に基づいて、ガス供給チューブ１９から酸素を供給したり、ガス排出チューブ（不図示）で二酸化炭素等を排出したり、ヒータ２５で培養液の温度を上げたりする。また制御プログラムは、予定時間になると、培養液排出ノズル２４で培養液を培養槽１０の外に排出する。本実施形態の制御プログラムは、培養液の供給、培養液の温度・ｐＨ・酸素濃度等の管理、培養液の回収、培養槽内の洗浄を自動化することができる。

＜フィルタ＞
図２（Ａ）は、本実施形態で用いられるフィルタ３０の一例を示した斜視図である。フィルタ３０は、全体的に円筒形状で、円筒部３２と円筒部３２の下部に形成された底部３３とを有しており、底部３３は円形のボウル形状である。円筒部３２の上部には開口部３１が形成されている。またフィルタ保持枠２８もしくは天板２２にフィルタ３０を取り付けるための取り付け紐３５が開口部３１の周辺に設けられている。フィルタ３０の大きさは、培養槽１０の大きさに依存するが、例えば長さＬＬが１５０ｍｍから５００ｍｍであり、直径ΦＤＭがΦ１００ｍｍから３００ｍｍである。フィルタ３０は、軽量性、耐薬品性および熱接着性に優れている点から、ポリプロピレン、ポリエステル、又はポリプロピレンとポリエチレンの組み合わせのフィルタが好ましい。

後述するように、間葉系幹細胞は担体４０に接着されて浮遊する。このため、フィルタ３０は、担体４０が貫通せず、接着しなかった間葉系幹細胞が貫通するようなメッシュサイズが好ましい。生きている間葉系幹細胞は担体４０に接着したままであるが、死んでしまった幹細胞は担体４０から剥がれ、もしくは担体４０から剥がれた間葉系幹細胞は死んでしまう。担体４０は一般に２００μｍ以上の大きさであり、死んだ間葉系幹細胞の大きさは２０μｍ前後であるため、例えば、フィルタ３０のメッシュサイズは、７０メッシュ（網目の大きさ約１８５μｍ）から４００メッシュ（網目の大きさ約３５μｍ）が好ましい。

＜担体（キャリア）＞
図２（Ｂ）は、本実施形態で用いられる担体４０の一例を示した斜視図である。本実施形態は、担体に接着した幹細胞を培養液に浮遊させた状態で増殖させる培養方法を採用する。大きな培養面積と培養容量とを確保し大量培養を行うため、浮遊培養に担体を用いることが好ましい。担体は多孔質の球形状・多角形状であったり円盤状であったりしてもよい。一般に多孔質の球形状等の担体の大きさは１４０μｍから２８０μｍである。本実施形態では、大量培養のため、厚さＬＴが２００μｍから５００μｍで直径ΦＤＵがΦ３ｍｍから９ｍｍの大きさの円盤状の不織布の担体４０が採用されている。不織布は多孔質性を有するものであることが好ましい。不織布を構成する繊維は、繊維径の小さい繊維であることが望ましく、平均繊維径は好ましくは１０～１００μｍ、特に好ましくは１５～５０μｍである。

担体の材料は、有機物、無機物、又はこれらの複合材料であってよい。有機物として、例えば、ポリスチレン、ポリエステル、ポリウレタン、ポリエチレン、ポリプロピレン、アクリル系ポリマ、アクリルアミド系ポリマ、ポリビニルアルコール、シリコーン系ポリマ、エポキシ樹脂等の合成高分子；コラーゲン、ゼラチン等の天然高分子；ペクチン、ペクチン酸塩等のポリガラクツロン酸；アルギン酸塩、セルロース、架橋アガロース、デキストラン、キトサン等の多糖類などが挙げられる。無機物として、例えば、ガラス、セラミック等が挙げられる。

培養槽１０に入れられる担体の量は、培養液１０００ｍｌに対して、５ｇから４０ｇ（乾燥状態）が好ましい。担体が５ｇより少ないと、培養される間葉系幹細胞が少なくなり回収される上清液のカイトサイン等の量が少なくなる。一方、担体が４０ｇより多いと、培養条件の管理が難しくなり、間葉系幹細胞が死にやすくなる。

＜培養方法＞
図３は、上清液を製造する製造方法を示したフローチャートである。図１で示された培養容器１００の培養槽１０内に、フィルタ３０が取り付け紐３５を使って取り付けられる。図４（Ａ）及び（Ｂ）は、フィルタ３０がフィルタ保持枠２８に取り付けられた概念図である。フィルタ３０の外側に培養液排出ノズル２４が配置されるようになっている。なお、担体３０を見やすくするため、図１に示された各種センサ１８、ガス供給チューブ１９等は描かれていない。

間葉系幹細胞、ＥＤＴＡ溶液等で洗浄された担体４０、及び３６－３８℃に温められた血清を含む培養液が培養槽１０に投入される（ステップＳ３１）。なお間葉系幹細胞は、凍結された間葉系幹細胞をフラスコで培養し、培養槽１０に必要な量になるまで培養された幹細胞である。各種センサ１８は温度、ｐＨ、酸素濃度を適宜測定し、血清を含む培養液は、制御プログラムによって、温度調整、ｐＨ調整及び酸素濃度調整される。

次に、間葉系幹細胞が担体４０に接着させられる（ステップＳ３２）。間葉系幹細胞が担体４０に接着されるように、攪拌パドル１２が血清を含む培養液を所定の回転数で攪拌し、担体４０が血清を含む培養液中に浮遊するようにする。さらに、間葉系幹細胞が確実に担体４０に接着するように、攪拌パドル１２の回転が停止し培養槽１０内の血清を含む培養液を落ち着かせる。血清を含む培養液を攪拌する第一期間は、一時間当たり例えば１分から５９分に対して、攪拌を止める第二期間は５９分から１分である。この攪拌と攪拌の停止とを４８時間から７２時間続ける。攪拌パドル１２の回転は一定であっても良いし、可変させるようにしても良い。

次に、間葉系幹細胞が培養される（ステップＳ３３）。攪拌パドル１２が血清を含む培養液を所定の回転数で攪拌し、担体４０が血清を含む培養液中に浮遊するようにする。これにより、間葉系幹細胞が担体４０で三次元的に増殖していく。間葉系幹細胞が増殖し担体４０の重量が重くなってくると、攪拌パドル１２の回転数を上げないと、担体４０が血清を含む培養液中に浮遊しなくなる。このため、攪拌パドル１２の回転数を徐々に上げることが好ましい。間葉系幹細胞が担体４０の全ての領域を占有すると、プラトー期（静止期）に入る。このため攪拌パドル１２の回転数を一定に保ったままでも担体４０が血清を含む培養液中に浮遊している。プラトー期になったら培養完了になり、この培養時間は７２時間から９６時間である。図４（Ａ）は、担体４０が血清を含む培養液中に浮遊している状態を示した図である。

次に、培養液排出ノズル２４が血清を含む培養液を除去する（ステップＳ３４）。その際には攪拌パドル１２は停止している。培養液排出ノズル２４が血清を含む培養液を排出していくと、担体４０がフィルタ３０に引っかかる。図４（Ｂ）は、血清を含む培養液がほぼ除去され、担体４０がフィルタ３０内に引っかかっている状態を示した図である。

次に、リン酸緩衝液(phosphate-buffered saline：ＰＢＳ)が培養槽１０に供給され、攪拌パドル１２が高速で数分間から１０分程度回転する。これにより、フィルター３０、担体４０、各種センサ１８、ガス供給チューブ１９等を含む培養槽１０全体が洗浄される（ステップＳ３５）。そして、培養液排出ノズル２４がリン酸緩衝液を回収し、その回収されたリン酸緩衝液は除去される。

次に、３６－３８℃に温められた血清を含まない上清液用の培養液が培養槽１０に投入される（ステップＳ３６）。各種センサ１８は温度、ｐＨ、酸素濃度を適宜測定し、血清を含まない上清液用の培養液は、制御プログラムによって、温度調整、ｐＨ調整及び酸素濃度が調整される。

次に、間葉系幹細胞を培養する（ステップＳ３７）。攪拌パドル１２が血清を含まない上清液用の培養液を所定の回転数で攪拌し、担体４０が血清を含まない上清液用の培養液中に浮遊するようにする。これにより、間葉系幹細胞が担体４０で培養される。培養時間は４０時間から６０時間である。

次に、培養液排出ノズル２４で血清を含まない上清液用の培養液を回収する（ステップＳ３８）。その際には攪拌パドル１２は停止している。培養液排出ノズル２４が血清を含まない上清液用の培養液を回収し、これが間葉系幹細胞の培養上清液として保管される。

回収された血清を含まない上清液用の培養液（培養上清液）は、間葉系幹細胞の状態が良いか否かが判断される（ステップＳ３９）。間葉系幹細胞の状態が良いか否かは、例えば、計測されたサイトカイン及びエクソソームの少なくとも一方が所定の閾値よりも多いか否かで判断されてもよい。分泌されたサイトカイン及びエクソソームの少なくとも一方が所定値よりも多い場合には、間葉系幹細胞の状態が良いことを示している。

間葉系幹細胞の状態が良い場合には、ステップＳ３６－Ｓ３８が連続して繰り返される。間葉系幹細胞の状態が悪い場合には、ステップＳ４０に進み３６－３８℃に温められた血清を含む培養液が培養槽１０に投入される。そしてステップＳ３３－Ｓ３４に進る。つまり血清である栄養素が間葉系幹細胞に与えられ、間葉系幹細胞が増殖しまたは良好の状態に戻る。

ステップＳ３９において、間葉系幹細胞の状態が良いか否かがサイトカイン等が所定の閾値よりも多いか否かで判断されたが、必ずしも毎回計測する必要はない。血清を含む培養液による培養と血清を含まない上清液用の培養液による培養とを交互に繰り返せば、分泌されたサイトカイン等が所定の閾値よりも多いことが把握できているのであれば、毎回計測することなく、血清を含む培養液による培養と血清を含まない上清液用の培養液による培養とを交互に繰り返してもよい。血清を含まない上清液用の培養液による培養を４回連続し、その後血清を含む培養液による培養を１回行っても、分泌されたサイトカイン等が所定の閾値よりも多いことが把握できているのであれば、４回連続の血清を含まない上清液用の培養液による培養及び１回の血清を含む培養液による培養のサイクルであってもよい。

＜不死化されたヒト歯髄幹細胞の培養＞
ヒト歯髄幹細胞として、ヒト乳歯の歯髄組織から調製したヒト乳歯歯髄幹細胞（ＳＨＥＤ）を用いた。また、このＳＨＥＤは、ＳＶ４０遺伝子をウィルスベクターにより導入して不死化されたものである。この不死化されたＳＨＥＤ（以下、ＩＭ－ＳＨＥＤと呼ぶ。）は、－８０℃の冷凍庫内で保管しており、常温に解凍され、３７℃のＦＢＳ－ＤＭＥＭでフラスコ内で培養された。継代を繰り返し、３２枚のフラスコがフルコンフルエントになった状態で、培養槽１０に入れられた。

＜ＩＭ－ＳＨＥＤのＦＢＳ－ＤＭＥＭによる培養＞
ＩＭ－ＳＨＥＤ、６０ｇ（乾燥重量）の円盤状の不織布である担体４０、及び４０００ｍｌのＦＢＳ－ＤＭＥＭが、容量１０ｌ（リットル）の培養槽１０に投入された。フィルタ３０のメッシュサイズは、１８０メッシュ（網目の大きさ約８４μｍ）を採用した。ＦＢＳ－ＤＭＥＭは、ｐＨ７．０、溶存酸素２．０、温度３７℃で用意された。

ＩＭ－ＳＨＥＤ、不織布の担体４０、及びＦＢＳ－ＤＭＥＭが、攪拌パドル１２により攪拌された。ＩＭ－ＳＨＥＤが担体４０に接着するように、攪拌パドル１２の回転は２０－４０ｒｐｍで所定時間回転した後、回転を停止し、再び所定時間回転させるようにプログラムされている。２４時間後１０００ｍｌのＦＢＳ－ＤＭＥＭが培養槽１０に追加投入された。

ＩＭ－ＳＨＥＤが担体４０に接着する工程が、４８時間から７２時間行われた後、攪拌パドル１２が４０ｒｐｍの回転数でＦＢＳ－ＤＭＥＭを攪拌し、担体４０がＦＢＳ－ＤＭＥＭ中に浮遊するようにした。時間と共に担体４０に接着したＩＭ－ＳＨＥＤが増殖するため、担体４０がＦＢＳ－ＤＭＥＭ内で浮遊しにくくなる。このため攪拌パドル１２が４０ｒｐｍから７０ｒｐｍへと徐々に回転数を上げてＦＢＳ－ＤＭＥＭを攪拌した。

ＩＭ－ＳＨＥＤ、担体４０、及びＦＢＳ－ＤＭＥＭの投入から２１６時間後に、ＩＭ－ＳＨＥＤの培養完了となり、培養液排出ノズル２４でＦＢＳ―ＤＭＥＭが回収された。そして、５０００ｍｌのリン酸緩衝液 が培養槽１０に供給され、フィルター３０、担体４０等を含む培養槽１０全体が洗浄された。

次に、３７℃に温められた７５００ｍｌのＣＭ－ＤＭＥＭが培養槽１０に投入され、ＩＭ－ＳＨＥＤが培養された。攪拌パドル１２はＣＭ－ＤＭＥＭを５０ｒｐｍから６０ｒｐｍの回転数で攪拌し、担体４０がＣＭ－ＤＭＥＭ中に浮遊するようにした。ＩＭ－ＳＨＥＤの培養時間は４８時間とした。

次に、培養液排出ノズル２４でＣＭ―ＤＭＥＭを回収し、ＩＭ－ＳＨＥＤの培養上清液として冷蔵もしくは冷凍保管された。

回収された培養上清液は、表１に示されるように、ＶＥＧＦが３７１１．５ｐｇ／ｍｌ、ＨＧＦが２５６６．７ｐｇ／ｍｌ等、サイトカインが高濃度で分泌されている。例えばＶＥＧＦの閾値が３４００ｐｇ／ｍｌ、ＨＧＦの閾値が２３００ｐｇ／ｍｌ等と設定された。このため、ＦＢＳ－ＤＭＥＭが投入されることなく、ＣＭ－ＤＭＥＭが培養槽１０に投入され、連続して培養上清液を回収した。つまり、図３のステップＳ３６－Ｓ３８が連続して繰り返された。

表１において、ＩＭ―ＳＨＥＤ―ＡＵＴＯ（不死化されたヒト歯髄幹細胞の自動培養）は、本実施例のサイトカインの濃度であり、ＩＭ―ＳＨＥＤ（不死化されたヒト歯髄幹細胞）は、作業者がフラスコを使った場合の濃度であり、ＳＨＥＤ（不死化されていないヒト歯髄幹細胞）は、作業者がフラスコを使った場合の濃度である。

ＦＢＳ－ＤＭＥＭが投入されることなく、５回連続してＣＭ－ＤＭＥＭが培養槽１０に投入されると上記ＶＥＧＦの閾値を下回ることが確認できた。確実に閾値を超えるように、実施例では、ＣＭ－ＤＭＥＭが２回連続して投入され、そしてＦＢＳ－ＤＭＥＭが１回投入されるサイクルで、培養上清液を自動回収するようにした。この結果、９か月間で４０サイクル（ＣＭ－ＤＭＥＭの投入回数が８０回、ＦＢＳ－ＤＭＥＭの投入回数が４０回）繰り返されても、表１で示された高濃度のサイトカインを含む培養上清液を得ることができている。

本実施例では、高濃度のサイトカインを得られるだけでなく、大量に培養上清液を得ることができる。例えば、フラスコを使ってＩＭ―ＳＨＥＤを培養した場合、１枚のフラスコで３０ｍｌの培養上清液が得られる。２人の作業者がフラスコを使って培養できる量は、多くても約１００枚であり、１ケ月に得ることができる培養上清液は、２４ｌである。一方、本実施例では、作業者がほぼ介入することなく、自動的に１ケ月に８０ｌを得ることができた。なお、培養槽１０の容量が２０ｌであれば、１６０ｌを得ることが可能となる。

１０ … 培養槽、 １２ … 攪拌パドル、 １３ … 攪拌シャフト
１５ … ベアリング、 １６ … 回転モータ、 １８ … 各種センサ
１９ … ガス供給チューブ、２２ … 天板、 ２４ … 培養液排出ノズル
２５ … ヒータ、 ２８ … フィルタ保持枠
３０ … フィルタ、 ３１ … 開口部、 ３３ … 底部
４０ … 担体、 １００ … 培養容器

Claims (13)

1. 不死化された間葉系幹細胞を培養した培養液から前記間葉系幹細胞を除去した培養上清液の製造方法であって、
   （ａ） 担体、前記間葉系幹細胞、及び血清を含む培養液を培養槽に供給する工程と、
   （ｂ） 前記（ａ）工程後、前記間葉系幹細胞を前記担体へ接着させる工程と、
   （ｃ） 前記血清を含む培養液を攪拌して前記間葉系幹細胞を培養する工程と、
   （ｄ） フィルタ内に前記担体に接着した前記間葉系幹細胞を残し、前記血清を含む培養液を前記培養槽から除去する工程と、
   （ｅ） 前記（ｄ）工程後、前記培養槽、前記担体に接着した前記間葉系幹細胞、及び前記フィルタを洗浄する工程と、
   （ｆ） 前記（ｅ）工程後、血清を含まない上清液用の培養液を前記培養槽に供給する工程と、
   （ｇ） 前記血清を含まない上清液用の培養液を攪拌して前記間葉系幹細胞を培養する工程と、
   （ｈ） 前記フィルタ内に前記担体に接着した前記間葉系幹細胞を残し、前記血清を含まない上清液用の培養液を回収する工程と、
   を備え、
   前記（ａ）工程から前記（ｅ）工程後に、前記（ｆ）工程、前記（ｇ）工程及び前記（ｈ）工程が連続して繰り返される、培養上清液の製造方法。
2. 前記（ｆ）工程、前記（ｇ）工程及び前記（ｈ）工程が２回から４回連続して繰り返される、請求項１に記載の培養上清液の製造方法。
3. 前記（ｂ）工程は、前記担体が前記血清を含む培養液中に浮遊するように前記血清を含む培養液が攪拌される第一期間と、攪拌を止める第二期間とを有し、
   前記（ｃ）工程は、前記担体が前記血清を含む培養液中に浮遊するように前記血清を含む培養液が攪拌され、
   前記（ｇ）工程は、前記担体が前記血清を含まない上清液用の培養液中に浮遊するように、前記血清を含まない上清液用の培養液が攪拌される、請求項１に記載の培養上清液の製造方法。
4. 前記担体が繊維から構成される不織布からなり、その不織布の繊維の平均繊維径が１０－１００μｍである請求項１に記載の培養上清液の製造方法。
5. 前記不織布からなる担体は、Φ３ｍｍ－Φ９ｍｍの円盤状である、請求項４に記載の培養上清液の製造方法。
6. 前記不織布からなる担体は、前記血清を含む培養液又は前記血清を含まない上清液用の培養液１０００ｍｌ当たり５ｇ－４０ｇ供給される、請求項４に記載の培養上清液の製造方法。
7. 前記フィルタのメッシュサイズが、７０メッシュから４００メッシュである、請求項１から請求項６のいずれか一項に記載の培養上清液の製造方法。
8. 回収した前記血清を含まない上清液用の培養液に、サイトカイン及びエクソソームの少なくとも一方が所定値よりも少ない場合に、前記培養槽に血清を含む培養液を供給し、前記（ｃ）工程、前記（ｄ）工程及び前記（ｅ）工程が一度だけ行われ、 回収した前記血清を含まない上清液用の培養液に、サイトカイン及びエクソソームの少なくとも一方が所定値よりも多い場合に、前記（ｆ）工程、前記（ｇ）工程及び前記（ｈ）工程が連続して繰り返される、請求項１から請求項６のいずれか一項に記載の培養上清液の製造方法。
9. 不死化された前記幹細胞が乳歯歯髄幹細胞である、請求項１に記載の培養上清液の製造方法。
10. 不死化された間葉系幹細胞を培養した培養液から前記間葉系幹細胞を除去した培養上清液の製造方法であって、
    （ｐ） 血清を含む培養液を攪拌して、担体に接着された前記間葉系幹細胞を培養槽内で培養し、その後前記培養槽内に配置されたフィルタ内に前記担体に接着した前記間葉系幹細胞を残し、前記培養槽から前記血清を含む培養液を除去する工程と、
    （ｑ） 前記（ｐ）工程後、前記培養槽、前記担体に接着した前記間葉系幹細胞、及び前記フィルタを洗浄する工程と、
    （ｒ） 前記（ｑ）工程後、血清を含まない上清液用の培養液を前記培養槽に供給し、前記血清を含まない上清液用の培養液を攪拌して前記間葉系幹細胞を培養した後、前記フィルタ内に前記担体に接着した前記間葉系幹細胞を残し、前記血清を含まない上清液用の培養液を回収する工程と、
    を備え、
    前記（ｐ）工程から前記（ｑ）工程後に、前記（ｒ）工程が連続して繰り返される、培養上清液の製造方法。
11. 前記（ｐ）工程及び前記（ｑ）工程が一度だけ行われ、その後、前記（ｒ）工程が２回から４回連続して繰り返され、再び、前記（ｐ）工程及び前記（ｑ）工程が一度だけ行われ、その後、前記（ｒ）工程が２回から４回連続して繰り返される、請求項１０に記載の培養上清液の製造方法。
12. 前記培養槽の容量が５ｌ（リットル）から２０ｌ（リットル）であり、前記フィルタのメッシュサイズが、７０メッシュから４００メッシュである、請求項１０又は請求項１１に記載の培養上清液の製造方法。
13. 前記担体は、繊維から構成される不織布からなり、その不織布の繊維の平均繊維径が１０―１００μｍであり、
    前記不織布からなる担体は、前記血清を含む培養液又は前記血清を含まない上清液用の培養液１０００ｍｌ当たり５ｇ－４０ｇ供給される、請求項１０又は請求項１１に記載の培養上清液の製造方法。