JP7801093B2

JP7801093B2 - 細胞トランスフェクション及び／又はｒＡＡＶベクター産生の改善のための増強剤

Info

Publication number: JP7801093B2
Application number: JP2019567687A
Authority: JP
Inventors: グワンチィ，; リンリュー，; ヘスサジョセアルムクヴィスト，; ジョンフレーザーライト，
Original assignee: Spark Therapeutics Inc
Current assignee: Spark Therapeutics Inc
Priority date: 2017-06-07
Filing date: 2018-06-06
Publication date: 2026-01-16
Anticipated expiration: 2038-06-06
Also published as: EP3635108A4; IL271190B1; JP2023113706A; JP2020524498A; HRP20260306T1; KR20250030036A; CL2019003561A1; AU2018281306B2; EP3635108B1; RU2019143489A; IL271190A; PE20251181A1; EP3635108A1; WO2018226887A1; MY207281A; BR112019025792A2; PE20200619A1; AU2018281306A1; CO2019014704A2; IL271190B2

Description

［関連出願情報］
[0001]本出願は、２０１７年６月７日に出願された米国仮特許出願第６２／５１６，４３２号、及び２０１７年７月１２日に出願された米国仮特許出願第６２／５３１，６２６号への優先権を主張する。前述の出願の全ての内容は、全てのテキスト、表、配列表及び図面を含め、参照により本明細書に取り込まれる。

［発明の分野］
[0002]本発明は、核酸、例えばプラスミドでの細胞形質導入（トランスフェクション）の分野に関する。より詳細には、本発明は、形質導入（トランスフェクト）細胞を産生するための組成物及び方法を提供し、前記細胞は、任意選択でアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）ベクターを産生する。

発明の詳細な説明

［序論］
[0003]本発明の属する最新技術を記載するために、本明細書全体を通していくつかの刊行物及び特許文書が引用されている。これらの引用のそれぞれは、完全に記載されているかのように参照により本明細書に組み込まれる。
［発明の概要］

[0004]本発明は、少なくとも１つの核酸配列で細胞をトランスフェクトするための組成物及び方法を提供する。一実施形態において、トランスフェクション組成物又は方法は：（ａ）細胞を、ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）を含む溶液で製剤化された少なくとも１つの核酸と接触させるステップ；（ｂ）細胞を、核酸及びポリエチレンイミン（ＰＥＩ）溶液とともにインキュベート又は培養するステップ；（ｃ）ステップ（ａ）の時点又は直後、又はステップ（ａ）から３時間以内までに増強剤を加えて混合物を産生するステップ；並びに（ｄ）ステップ（ｃ）の前記混合物をインキュベートし、それにより細胞を核酸配列でトランスフェクトするステップを含む。

[0005]本発明はまた、ｒＡＡＶベクターのような組換えウイルスベクターを産生する細胞の組成物及び細胞を作製する方法を提供する。一実施形態において、組成物又は方法は：（ａ）構成物（ｉ）、（ｉｉ）及び（ｉｉｉ）のＰＥＩ／プラスミド混合物を提供するステップであって、（ｉ）はＡＡＶパッケージングタンパク質をコードする核酸及び／又はヘルパータンパク質をコードする核酸を含む１つ又は複数のプラスミドであり；（ｉｉ）はタンパク質をコードする又は目的の転写物に転写される導入遺伝子を含むプラスミドであり；（ｉｉｉ）はポリエチレンイミン（ＰＥＩ）溶液であるステップ、（ｂ）細胞を、ステップ（ａ）のプラスミド／ＰＥＩ混合物と接触させて、プラスミド／ＰＥＩ細胞培養液を産生するステップ；（ｃ）増強剤をプラスミド／ＰＥＩ細胞培養液に加えて、第２の混合物を産生するステップ；並びに（ｄ）ステップ（ｃ）の前記第２の混合物をインキュベートし、それにより組換えｒＡＡＶベクターを産生するトランスフェクトされた細胞を作製するステップを含む。

[0006]本発明の組成物及び方法の様々なさらなる実施形態には、１つ又は複数の追加の任意選択的なステップが含まれる。

[0007]特定の態様において、さらなるステップは、（ｅ）ステップ（ｄ）で産生された前記トランスフェクトされた細胞及び／又はステップ（ｄ）で産生されたトランスフェクトされた細胞からの培養培地を収穫して、細胞及び／又は培養培地収穫物を産生することを含む。

[0008]特定の態様において、さらなる任意選択的なステップは、（ｅ）核酸又はプラスミドでトランスフェクトされた細胞の培養、拡張、単離又は選択を含む。

[0009]特定の態様において、さらなる任意選択的なステップは、（ｅ）ステップ（ｄ）で産生されたトランスフェクトされた細胞及び／若しくは培養培地から、並びに／又はステップ（ｄ）で産生されたトランスフェクトされた細胞から、組換えＡＡＶベクターを単離及び／又は精製することを含む。

[0010]特定の態様において、さらなる任意選択的なステップは、（ｆ）ステップ（ｅ）で産生されたトランスフェクトされた細胞及び／又は培養培地収穫物から組換えＡＡＶベクターを単離及び／又は精製することを含む。

[0011]さらなる実施形態において、核酸配列（複数可）はベクター及び／又はプラスミドを含む。

[0012]さらなる実施形態において、核酸配列（複数可）はウイルスベクター及び／又はウイルスプラスミドを含む。特定の態様において、ウイルスベクター又はウイルスプラスミドは、レンチウイルスベクター若しくはプラスミド、又はアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクター若しくはプラスミドを含む。

[0013]さらなる実施形態において、ベクターは、タンパク質をコードするか、又は目的の転写物に転写される導入遺伝子を含む。特定の態様において、導入遺伝子は、野生型又は機能的変異体の血液凝固因子、ａｐｏＥ２、ＴＰＰ１、アルギニノコハク酸合成酵素、銅輸送ＡＴＰａｓｅ２、酸性α－グルコシダーゼ、β－グルコセレブロシダーゼ、α－ガラクトシダーゼ又はＣ１阻害セリンプロテアーゼ阻害剤をコードする。特定の態様において、野生型又は機能的変異体の血液凝固因子は、因子ＶＩＩ、因子ＶＩＩＩ、又は因子ＩＸである。

[0014]さらなる実施形態において、増強剤は、ステップ（ａ）の前、ステップ（ａ）の時点、又はステップ（ａ）の直後に添加される。

[0015]さらなる実施形態において、増強剤は、ステップ（ａ）の前、ステップ（ａ）の時点、又はステップ（ａ）の１６時間後までに添加される。

[0016]さらなる実施形態において、増強剤は、ステップ（ａ）の前、ステップ（ａ）の時点、又はステップ（ａ）の後３時間未満までに添加される。

[0017]さらなる実施形態において、増強剤は、ステップ（ａ）の前に添加され、ステップ（ａ）の時点で増強剤はステップ（ａ）又は（ｂ）の前又は後に２回以上添加される。

[0018]さらなる実施形態において、増強剤は、ステップ（ａ）の時点又は直後、又はステップ（ａ）の１６時間後までに最初に加えられ、ステップ（ａ）若しくは（ｂ）の１６～７２時間後に再び加えられるか、又はステップ（ａ）若しくは（ｂ）の１６～４８時間後に再び加えられるか、又はステップ（ａ）若しくは（ｂ）の１６～２４時間後に再び加えられる。

[0019]さらなる実施形態において、増強剤は、ステップ（ａ）の時点又は直後、又はステップ（ａ）の３時間未満後までに最初に加えられ、ステップ（ａ）若しくは（ｂ）の１２～７２時間後に再び加えられるか、又はステップ（ａ）若しくは（ｂ）の１２～４８時間後に再び加えられるか、又はステップ（ａ）若しくは（ｂ）の１２～２４時間後に再び加えられる。

[0020]さらなる実施形態において、増強剤は、ステップ（ａ）の１２～７２時間前に最初に添加され、ステップ（ａ）の時点又は直後又はステップ（ａ）の１６時間後までに再び添加される。

[0021]さらなる実施形態において、増強剤は、ステップ（ａ）の１２～７２時間前に最初に添加され、ステップ（ａ）の時点又は直後又はステップ（ａ）の３時間未満後までに再び添加される。

[0022]さらなる実施形態において、プラスミド（ｉ）及び（ｉｉ）は、約１：０．０１～約１：１００のモル比範囲にあるか、又は約１００：１～約１：０．０１のモル比範囲にあり、構成物（ｉ）、（ｉｉ）及び（ｉｉｉ）の混合物は、ステップ（ｂ）の前に約１０秒～約４時間の期間にわたって任意選択でインキュベートされる。

[0023]さらなる実施形態において、核酸又はプラスミドは、約０．１：１～約５：１の範囲のＰＥＩ：核酸若しくはＰＥＩ：プラスミド重量比、又は約５：１～約０．１：１の範囲のＰＥＩ：核酸若しくはＰＥＩ：プラスミド重量比にある。

[0024]さらなる実施形態において、核酸又はプラスミドは、約１：１～約５：１の範囲のＰＥＩ：核酸若しくはＰＥＩ：プラスミド重量比、又は約５：１～約１：１の範囲のＰＥＩ：核酸若しくはＰＥＩ：プラスミド重量比にある。

[0025]さらなる実施形態において、核酸又はプラスミドは、約１：１～約３：１の範囲のＰＥＩ：核酸又はＰＥＩ：プラスミド重量比にある。

[0026]さらなる実施形態において、核酸又はプラスミドは、約１：１、約１．５：１、約２：１、約２．５：１又は約３：１の範囲のＰＥＩ：核酸又はＰＥＩ：プラスミド重量比にある。

[0027]さらなる実施形態において、組成物又は方法は、遊離ＰＥＩを細胞に加えるステップをさらに含む。

[0028]さらなる実施形態において、遊離ＰＥＩは、ステップ（ａ）若しくは（ｂ）の前、その時点若しくはその後に、又はステップ（ｃ）の前若しくはその時点若しくはその後に、細胞に加えられる。

[0029]さらなる実施形態において、遊離ＰＥＩは、ステップ（ａ）若しくは（ｂ）の時点若しくはその後、又はステップ（ｃ）の時点若しくはその後に、細胞に加えられる。

[0030]さらなる実施形態において、遊離ＰＥＩは、ＰＥＩ：核酸又はＰＥＩ：プラスミドの重量比が約０．１：１～約５：１の範囲、又は約５：１～約０．１：１までの範囲になるように加えられる。

[0031]さらなる実施形態において、遊離ＰＥＩは、ＰＥＩ：核酸又はＰＥＩ：プラスミドの重量比が約１：１～約５：１の範囲、又は約５：１～約１：１の範囲になるように加えられる。

[0032]さらなる実施形態において、ＰＥＩ：核酸及び／又はＰＥＩ：プラスミド及び／又は遊離ＰＥＩにおけるＰＥＩは、直鎖ポリエチレンイミンを含む。

[0033]さらなる実施形態において、ＰＥＩ：核酸及び／又はＰＥＩ：プラスミド及び／又は遊離ＰＥＩにおけるＰＥＩは、加水分解された直鎖ポリエチレンイミンを含む。

[0034]さらなる実施形態において、ＰＥＩ：核酸及び／又はＰＥＩ：プラスミド及び／又は遊離ＰＥＩにおけるＰＥＩは、約４０００～約１６００００の範囲の分子量及び／又は遊離塩基形態で約２５００～約２５００００の分子量の範囲を有する加水分解された直鎖ポリエチレンイミンを含む。

[0035]さらなる実施形態において、ＰＥＩ：核酸及び／又はＰＥＩ：プラスミド及び／又は遊離ＰＥＩにおけるＰＥＩは、約４００００の分子量及び／又は遊離塩基形態で約２５０００分子量を有する加水分解された直鎖ポリエチレンイミンを含む。

[0036]さらなる実施形態において、全ＰＥＩ中の窒素（Ｎ）の核酸：ＰＥＩ及び／又はプラスミド：ＰＥＩ中のリン酸塩（Ｐ）に対するモル比は、約１：１～約５０：１（Ｎ：Ｐ）の範囲である。

[0037]さらなる実施形態において、全ＰＥＩ中の窒素（Ｎ）の核酸：ＰＥＩ及び／又はプラスミド：ＰＥＩ中のリン酸塩（Ｐ）に対するモル比は、約５：１～約１０：１である。

[0038]さらなる実施形態において、全ＰＥＩ中の窒素（Ｎ）の核酸：ＰＥＩ及び／又はプラスミド：ＰＥＩ中のリン酸塩（Ｐ）に対するモル比は、約５：１、６：１、７：１、８：１、９：１、又は１０：１（Ｎ：Ｐ）のいずれかである。

[0039]さらなる実施形態において、遊離ＰＥＩの量は、全ＰＥＩの約１０％～約９０％である。

[0040]さらなる実施形態において、遊離ＰＥＩの量は全ＰＥＩの約２５％～約７５％である。

[0041]さらなる実施形態において、遊離ＰＥＩの量は全ＰＥＩの約５０％である。

[0042]さらなる実施形態において、遊離ＰＥＩの量は約０．１μｇ／ｍＬ～約１０μｇ／ｍＬである。

[0043]さらなる実施形態において、遊離ＰＥＩの量は約１．０μｇ／ｍＬ～約５μｇ／ｍＬである。

[0044]さらなる実施形態において、ＰＥＩ溶液及び／又は遊離ＰＥＩは、約７．０～約８．０のｐＨを有する溶液を含む。

[0045]さらなる実施形態において、核酸配列及びＰＥＩは、ステップ（ａ）の前に互いに約１０秒～約４時間インキュベートされている。

[0046]さらなる実施形態において、核酸配列及びＰＥＩは、ステップ（ａ）の前に互いに約３０秒～約４時間インキュベートされている。

[0047]さらなる実施形態において、核酸配列及びＰＥＩは、ステップ（ａ）の前に互いに約１分～約３０分インキュベートされている。

[0048]さらなる実施形態において、構成物（ｉ）、（ｉｉ）及び（ｉｉｉ）の混合物は、ステップ（ｂ）の前に約１０秒～約４時間、一緒にインキュベートされる。

[0049]さらなる実施形態において、構成物（ｉ）、（ｉｉ）及び（ｉｉｉ）の混合物は、ステップ（ｂ）の前に約３０秒～約４時間、一緒にインキュベートされる。

[0050]さらなる実施形態において、構成物（ｉ）、（ｉｉ）及び（ｉｉｉ）の混合物は、ステップ（ｂ）の前に約１分～約４時間、一緒にインキュベートされる。

[0051]さらなる実施形態において、ステップ（ｄ）のインキュベーションは少なくとも約４時間である。

[0052]さらなる実施形態において、ステップ（ｄ）のインキュベーションは約４時間～約１４０時間である。

[0053]さらなる実施形態において、ステップ（ｄ）のインキュベーションは約４時間～約９６時間である。

[0054]さらなる実施形態において、細胞は哺乳動物細胞を含む。特定の態様において、細胞はヒト胎児腎臓（ＨＥＫ）又はチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞である。特定の態様において、細胞はヒト胎児腎臓（ＨＥＫ）２９３細胞を含む。特定の態様において、細胞はＨＥＫ２９３Ｅ、ＨＥＫ２９３Ｆ又はＨＥＫ２９３Ｔ細胞である。

[0055]さらなる実施形態において、細胞は安定的に又は一時的にトランスフェクトされる。

[0056]さらなる実施形態において、細胞は懸濁培養液中にある。

[0057]さらなる実施形態において、細胞は接着性である。

[0058]さらなる実施形態において、細胞は、無血清培養培地で増殖又は維持される。

[0059]さらなる実施形態において、細胞は、前記核酸配列若しくは前記プラスミド／ＰＥＩ混合物と接触したとき、及び／又は前記遊離ＰＥＩと接触したとき、約１×１０^５細胞／ｍＬ～」約１×１０^８細胞／ｍＬの範囲の密度である。

[0060]さらなる実施形態において、細胞は、前記核酸配列若しくは前記プラスミド／ＰＥＩ混合物と接触したとき、及び／又は前記遊離ＰＥＩと接触したとき、約５×１０^５細胞／ｍＬ～約１×１０^７細胞／ｍＬの範囲の密度である。

[0061]さらなる実施形態において、細胞は、前記核酸配列若しくは前記プラスミド／ＰＥＩ混合物と接触したとき、及び／又は前記遊離ＰＥＩと接触したとき、約１×１０^６細胞／ｍＬ～約５×１０^６細胞／ｍＬの範囲の密度である。

[0062]さらなる実施形態において、前記核酸配列若しくはプラスミド／ＰＥＩ混合物又は前記遊離ＰＥＩと接触したときの細胞の生存率は、約６０％若しくは６０％よりも大きいか、又は前記核酸配列若しくはプラスミド／ＰＥＩ混合物と接触させたときに前記細胞は対数増殖期にある。

[0063]さらなる実施形態において、前記核酸配列若しくはプラスミド／ＰＥＩ混合物又は前記遊離ＰＥＩと接触したときの細胞の生存率は、約９０％若しくは９０％よりも大きいか、又は前記核酸配列若しくはプラスミド／ＰＥＩ混合物又は前記遊離ＰＥＩと接触させたときに前記細胞は対数増殖期にある。

[0064]さらなる実施形態において、核酸配列又はプラスミドの総量は、細胞１ｍＬあたり約０．１μｇ～約１５μｇの範囲にある。

[0065]さらなる実施形態において、導入遺伝子を含むプラスミドの、ＡＡＶパッケージングタンパク質をコードする核酸及び／又はヘルパータンパク質をコードする核酸を含む１つ又は複数のプラスミドに対するモル比は、約１：５～約１：１、又は約１：１～約５：１である。

[0066]さらなる実施形態において、１つ又は複数のプラスミドは、ＡＡＶパッケージングタンパク質をコードする核酸を含む第１のプラスミド及びヘルパータンパク質をコードする核酸を含む第２のプラスミドとを含む。

[0067]さらなる実施形態において、導入遺伝子を含むプラスミドと、ＡＡＶパッケージングタンパク質をコードする核酸を含む第１のプラスミドと、ヘルパータンパク質をコードする核酸を含む第２のプラスミドとのモル比は、約１～５：１：１、又は１：１～５：１、又は１：１：１～５の範囲にある。

[0068]さらなる実施形態において、コードされたＡＡＶパッケージングタンパク質は、ＡＡＶｒｅｐ及び／又はＡＡＶｃａｐを含む。

[0069]さらなる実施形態において、コードされたＡＡＶパッケージングタンパク質は、ＡＡＶ血清型のＡＡＶｒｅｐ及び／又はＡＡＶｃａｐタンパク質を含む。

[0070]さらなる実施形態において、コードされたヘルパータンパク質は、アデノウイルスＥ２及び／若しくはＥ４、ＶＡＲＮＡタンパク質、並びに／又は非ＡＡＶヘルパータンパク質を含む。

[0071]さらなる実施形態において、組換えＡＡＶベクターは、ＡＡＶ血清型１～１２、ＡＡＶＶＰ１、ＶＰ２及び／若しくはＶＰ３キャプシドタンパク質、又は改変若しくは変異体ＡＡＶＶＰ１、ＶＰ２及び／若しくはＶＰ３キャプシドタンパク質、又は野生型ＡＡＶＶＰ１、ＶＰ２及び／若しくはＶＰ３キャプシドタンパク質のいずれかを含む。

[0072]さらなる実施形態において、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターは、キャプシドＶＰ１、ＶＰ２及び／若しくはＶＰ３タンパク質配列、又はキャプシドタンパク質配列若しくは任意のキャプシドタンパク質配列のＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、及びＡＡＶ１０血清型から選択される逆位末端反復（ＩＴＲ）配列に対して７０％以上の配列同一性を有する逆位末端反復配列を含む。

[0073]さらなる実施形態において、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターは、配列番号１及び配列番号２から選択されるキャプシドタンパク質配列に対して７０％以上の配列同一性を有するキャプシドＶＰ１、ＶＰ２及び／又はＶＰ３タンパク質配列を含む。

[0074]さらなる実施形態において、ＡＡＶベクターは、ＡＡＶ血清型又はＡＡＶ偽型を含み、前記ＡＡＶ偽型は、ＩＴＲ血清型とは異なるＡＡＶキャプシド血清型を含む。

[0075]さらなる実施形態において、ＡＡＶベクターは、キャプシドＶＰ１、ＶＰ２及び／又はＶＰ３タンパク質、又はＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、配列番号１及び配列番号２から選択される任意の血清型の逆位末端反復を含む。

[0076]さらなる実施形態において、ＡＡＶベクターは、イントロン、発現制御要素、１つ又は複数のアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）逆位末端反復（ＩＴＲ）及び／又はフィラーポリヌクレオチド配列（ｆｉｌｌｅｒｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓｅｑｕｅｎｃｅ）をさらに含む。

[0077]さらなる実施形態において、イントロンは、タンパク質をコードするか、又は目的の転写物に転写される核酸内にあるか、又は隣接する。

[0078]さらなる実施形態において、発現制御要素は、タンパク質をコードするか、又は目的の転写物に転写される核酸に作動可能に連結されている。

[0079]さらなる実施形態において、ＡＡＶＩＴＲ（複数可）は、タンパク質をコードするか、又は目的の転写物に転写される核酸の５’又は３’末端に隣接する。

[0080]さらなる実施形態において、フィラーポリヌクレオチド配列は、タンパク質をコードするか、又は目的の転写物に転写される核酸の５’又は３’末端に隣接する。

[0081]さらなる実施形態において、発現制御要素は、構成的若しくは調節可能な制御要素、又は組織特異的発現制御要素又はプロモーターを含む。

[0082]さらなる実施形態において、発現制御要素は、肝臓で発現を付与する要素を含む。

[0083]さらなる実施形態において、ＩＴＲは、ＡＡＶ２又はＡＡＶ６血清型のいずれか、又はそれらの組み合わせの１つ又は複数のＩＴＲを含む。

[0084]さらなる実施形態において、細胞は、前記核酸配列又はプラスミド／ＰＥＩ混合物と接触する前に、細胞密度が減少するまで継代培養される。

[0085]さらなる実施形態において、細胞は、前記核酸配列又はプラスミド／ＰＥＩ混合物と接触する前に、約０．１×１０^６細胞／ｍＬ～約５．０×１０^６細胞／ｍＬの範囲の細胞密度に継代培養される。

[0086]さらなる実施形態において、細胞は、継代培養後２日～５日の期間の間、前記核酸配列又はプラスミド／ＰＥＩ混合物と接触される。

[0087]さらなる実施形態において、細胞は、継代培養後３日～４日の期間の間、前記核酸配列又はプラスミド／ＰＥＩ混合物と接触される。

[0088]さらなる実施形態において、前記トランスフェクトされた細胞に導入される核酸配列又はプラスミドの量は、遊離ＰＥＩを細胞培養液に加えるステップを用いると、遊離ＰＥＩを細胞培養液に加えない場合と比較して少なくとも５０％多い。

[0089]さらなる実施形態において、前記トランスフェクトされた細胞に導入される核酸配列又はプラスミドの量は、増強剤を添加するステップを用いると、増強剤を添加しない場合と比較して少なくとも５０％多い。

[0090]さらなる実施形態において、産生された組換えＡＡＶベクターの量は、遊離ＰＥＩをプラスミド／ＰＥＩ細胞培養液に加えるステップを用いると、遊離ＰＥＩをプラスミド／ＰＥＩ細胞培養液に加えない場合と比較して少なくとも５０％以上である。

[0091]さらなる実施形態において、産生された組換えＡＡＶベクターの量は、プラスミド／ＰＥＩ細胞培養液に遊離ＰＥＩを加えるステップを用いると、遊離ＰＥＩをプラスミド／ＰＥＩ細胞培養液に加えない場合と比較して１～５、５～８、８～１０又は１０～２０倍多い。

[0092]さらなる実施形態において、産生された組換えＡＡＶベクターの量は、増強剤を添加するステップを用いると、プラスミド／ＰＥＩ細胞培養液に増強剤を加えない場合と比較して１～５、５～８、８～１０又は１０～１５倍多い。

[0093]さらなる実施形態において、細胞は、約１０～５００ｍＬ、５００ｍＬ～２リットル、２～２０リットル、２０～５０リットル、５０～１００リットル、１００～５００リットル、５００～１０００リットル、又は１０００～２０００リットルの培養容量である。

[0094]さらなる実施形態において、導入遺伝子は約４．０Ｋｂ～約６．０Ｋｂのサイズを有する。

[0095]さらなる実施形態において、導入遺伝子は約４．５Ｋｂ～約６．０Ｋｂのサイズを有する。

[0096]さらなる実施形態において、導入遺伝子は約４．５Ｋｂ～約５．５Ｋｂのサイズを有する。

[0097]さらなる実施形態において、導入遺伝子は約４．５Ｋｂ～約５．０Ｋｂのサイズを有する。

[0098]さらなる実施形態において、増強剤は、バルプロ酸、その塩又は誘導体を含む。特定の態様において、バルプロ酸塩はナトリウム又はカリウム塩を含む。特定の態様において、バルプロ酸誘導体は、それに結合又はコンジュゲートしたアミノ酸を含む。

[0099]さらなる実施形態において、増強剤は、イソ酪酸、その塩又は誘導体を含む。特定の態様において、イソ酪酸塩はナトリウム又はカリウム塩を含む。特定の態様において、イソ酪酸誘導体は、それに結合又はコンジュゲートしたアミノ酸を含む。

[0100]さらなる実施形態において、増強剤は、イソ吉草酸、その塩又は誘導体を含む。特定の態様において、イソ吉草酸塩はナトリウム又はカリウム塩を含む。特定の態様において、イソ吉草酸誘導体は、それに結合又はコンジュゲートしたアミノ酸を含む。

[0101]さらなる実施形態において、添加後、増強剤（複数可）は約０．１ｍＭ～約２５ｍＭの濃度である。

[0102]さらなる実施形態において、添加後、増強剤（複数可）は約０．５ｍＭ～約１０ｍＭの濃度である。

[0103]さらなる実施形態において、添加後、増強剤（複数可）は約０．５ｍＭ～約５ｍＭの濃度である。

[0104]さらなる実施形態において、添加後、増強剤（複数可）は、約１ｍＭ～約１０ｍＭ、約１ｍＭ～約９ｍＭ、約１ｍＭ～約８ｍＭ、約１ｍＭ～約７ｍＭ、約１ｍＭ～約６ｍＭ、約１ｍＭ～約５ｍＭ、約１ｍＭ～約４ｍＭ、約１ｍＭ～約３ｍＭ、又は約１ｍＭ～約２ｍＭの濃度である。

[0105]さらなる実施形態において、ステップ（ａ）～（ｆ）のいずれか、又は請求項１～９４のいずれかに記載される条件は、実施例１～３のいずれかに記載されるように行われる。

[0106]図１は、ｒＡＡＶ－ＦＶＩＩＩベクターの生産性の比較を示す図である。スピナーフラスコ内のＨＥＫ２９３Ｆ細胞を３つのプラスミドを用いてトランスフェクトした：ｒＡＡＶ産生のためのアデノウイルス由来のヘルパー遺伝子を含むｐＡｄヘルパープラスミド；Ｒｅｐｓ及びＣａｐｓのｐＡＡＶｒｅｐ／ｃａｐ発現ＡＡＶ遺伝子；ＡＡＶＩＴＲに隣接するヒト第ＶＩＩＩ因子発現カセットを含むｐＡＡＶｈＦＶＩＩＩ。使用した総ＤＮＡ量は、モル比１：１：１で１．８６ｕｇ／ｍＬであった。１：１（重量）のＰＥＩ／ＤＮＡ比を使用して、ＰＥＩ／ＤＮＡ複合体を調製し、細胞をトランスフェクトした。追加の遊離ＰＥＩ（ＰＥＩ／ＤＮＡ複合体の調製に使用されたものと同じ量）も、トランスフェクション時に別々に細胞培養液に加えた。エクスピフェクタミン（ＥｘｐｉＦｅｃｔａｍｉｎｅ）（商標）２９３トランスフェクションキットのエンハンサー１及び２を、トランスフェクションと同時、又はトランスフェクション後１６～１８時間（製造業者の指示に従って）に細胞に加えた。エンハンサー１及び２は、それぞれ培養量の１：２００及び１：２０で使用された。トランスフェクションの７２時間後に細胞培養液を収穫し、ｒＡＡＶ－ＦＶＩＩＩベクターをＱ－ＰＣＲ分析により決定した。ｒＡＡＶ－ＦＶＩＩＩベクターの力価は、エンハンサーをトランスフェクション時に加えた場合には、エンハンサーをトランスフェクションの１６時間後に加えた場合やエンハンサーを加えない場合と比べて２～３倍高かった。 [0107]図２は、異なるＤＮＡ量及びＰＥＩ／ＤＮＡ比を使用したｒＡＡＶ－ＦＶＩＩＩベクター産生の最適化を示す図である。３つのプラスミドを使用して、スピナーフラスコ内のＨＥＫ２９３Ｆ細胞をＤＮＡの総量がそれぞれ１．２、１．８６、又は２．８μｇ／ｍＬのＤＮＡでトランスフェクトした。プラスミドＤＮＡの比率は以前に記載した通りであった。ただし、この研究で使用したＰＥＩ／ＤＮＡ比は１：１、１．５：１、２：１、２．５：１及び３：１であった。使用した遊離ＰＥＩは１．５μｇ／ｍＬであった。エクスピフェクタミン（商標）２９３トランスフェクションキットのエンハンサー１及び２を上に記載のように使用した。トランスフェクション時の細胞密度は２～３×１０^６細胞／ｍＬであった。トランスフェクション後４８時間（＃）又は７２時間（＊）にサンプルを採取し、ｒＡＡＶベクター力価をＱ－ＰＣＲアッセイで決定した。最も高いｒＡＡＶベクター収量は、１．２μｇ／ｍＬのＤＮＡ、ＰＥＩ／ＤＮＡ比が２～２．５：１、エンハンサーを用いた条件下で、観察された。 [0108]図３は、バイオリアクター中のｒＡＡＶ－ＦＶＩＩＩベクターの生産性を確認した図である。ＨＥＫ２９３Ｆ細胞をバイオリアクター中、４００ｍＬのスケールで培養し、３つのプラスミドを用いトランスフェクトした（プラスミドＤＮＡの総量は１．２又は２．８μｇ／ｍＬ）。１：１：１のプラスミドＤＮＡモル比、１．５：１、２：１、２．５：１及び３：１のＰＥＩ／ＤＮＡ（重量）比を使用した。以前に記載したように、１．５μｇ／ｍＬの遊離ＰＥＩとエンハンサー１及び２もまた使用した。トランスフェクション時の細胞密度は２～３×１０^６細胞／ｍＬであった。最も高いベクター産生（Ｑ－ＰＣＲデータ）は、２．５～３：１のＰＥＩ／ＤＮＡ比で１．２μｇ／ｍＬの総ＤＮＡの条件下で観察された。 [0109]図４は、フルスケールのＤＡＳＧＩＰバイオリアクターで、高いｒＡＡＶベクター生産性が維持されることを示す図である。最適化されたトランスフェクション条件を、フルスケールのＤＡＳＧＩＰバイオリアクターである１．２リットル（Ｌ）スケールでのｒＡＡＶ産生についてさらに評価した。ＨＥＫ２９３Ｆ細胞を、ＤＡＳＧＩＰバイオリアクターで、１３０ｒｐｍ、１５０ｒｐｍ、及び１７０ｒｐｍの攪拌速度で２つ又は３つのインペラーを備えた１．２Ｌスケールで培養した。１．２μｇ／ｍＬの全プラスミドＤＮＡの３つのプラスミドで細胞をトランスフェクトし、２．５：１のＰＥＩ／ＤＮＡ比を使用してＰＥＩ／ＤＮＡ複合体を調製した；ＤＮＡモル比と遊離ＰＥＩ及びトランスフェクションエンハンサーの量は、以前に記載したようであった。Ｑ－ＰＣＲデータは、１．２Ｌのスケールでのベクター生産性が小スケールで観察されたものと同等に維持することを示し、最適化されたトランスフェクションをスケールアップできることを示した。いかなる理論にも縛られることを望んでいないが、Ｑ－ＰＣＲデータはまた、高速の攪拌速度がベクターの生産性をさらに増強することも示唆した。 [0110]図５は、エンハンサー１のみが、エンハンサー１及び２の両方を使用した場合に産生されるものと同じレベルまでｒＡＡＶ生産性を改善したことを示す図である。ｒＡＡＶ生産方法をさらに最適化するために、いずれか１つだけのエンハンサー：トランスフェクション時にエンハンサー１又はエンハンサー２のみを使用して研究を行い、ベクターの生産性を両方のエンハンサーを使用した場合と比較した。Ｑ－ＰＣＲデータは、エンハンサー１を使用した場合のｒＡＡＶ生産性は、エンハンサー１と２の両方を使用した場合の生産性と同等であることを示した。しかしながら、エンハンサー２はｒＡＡＶの産生を低下させるだけであり、エンハンサー２がｒＡＡＶの産生にポジティブな影響を与えないことを示唆した。さらに、トランスフェクション時にエンハンサー１及び２の量を減らすと、ｒＡＡＶの力価が低下した。 [0111]図６は、トランスフェクション（ＴＦ）及びトランスフェクション後２４時間若しくは４８時間の両方でのエンハンサー１及び２の反復使用により、又はトランスフェクション及びトランスフェクション後２４時間及び４８時間の３回のエンハンサー１及び２の反復使用により、ｒＡＡＶ力価がわずかに増加することを示す図である。エンハンサー１及び２は、最初のトランスフェクション時に、それぞれ培養量の１：２００及び１：２０で使用された。追加量のエンハンサー１及び２を、トランスフェクション後２４時間、又は４８時間、又は２４時間と４８時間の両方で細胞培養液に加えた。この研究において使用したトランスフェクション条件は図５に示されている。エンハンサーの反復使用によりｒＡＡＶベクターの生産性がわずかに増加すること（１倍未満の増加）がＱ－ＰＣＲデータにより示された。 [0112]図７は、バルプロ酸がｒＡＡＶ産生を増強することを示すデータを示す図である。スピナーフラスコ内のＨＥＫ２９３Ｆ細胞を、以前に記載したＰＥＩトランスフェクション法を使用して３つのプラスミドでトランスフェクトした。この研究においては、エクスピフェクタミン（商標）２９３トランスフェクションキットのエンハンサーは使用しなかった。トランスフェクション時に異なる濃度のバルプロ酸を細胞に加えた。細胞は、１．２μｇ／ｍＬの合計３つのプラスミドＤＮＡを用いてトランスフェクトし、３つのプラスミドのＤＮＡモル比は１：１：１であり、ＰＥＩ／ＤＮＡ（重量）比は２：１であり、１．５μｇ／ｍＬの遊離ＰＥＩを使用した。０．２５ｍＭ～２ｍＭのバルプロ酸を評価した。トランスフェクション時に２ｍＭバルプロ酸を使用した場合、バルプロ酸の非存在下で産生されたベクターの量と比較して、１０倍高いｒＡＡＶベクターの産生が観察されたことが、Ｑ－ＰＣＲデータにより示された。 [0113]図８は、ｑＰＣＲにより決定された、バルプロ酸の異なる濃度でのｒＡＡＶ－ＦＶＩＩＩベクター産生を示す。２ｍＭ～８ｍＭ（２ｍＭ、３ｍＭ、４ｍＭ、５ｍＭ、６ｍＭ、７ｍＭ及び８ｍＭ）のバルプロ酸を、１Ｌバイオリアクター培養液中でのＨＥＫ２９３Ｆ細胞のトランスフェクションに使用した。バルプロ酸≧４ｍＭは、２ｍＭのバルプロ酸と比較して、１．２～１．８倍高いＡＡＶベクター産生をもたらした。この研究においては、１．２μｇ／ｍＬのＤＮＡ、１：１：１のＤＮＡモル比、２．５のＰＥＩ／ＤＮＡ重量比及び１．５μｇ／ｍＬの遊離ＰＥＩを使用した。

[0114]核酸（例えば、プラスミド）などの分子を高効率で細胞に形質導入する組成物及び方法が本明細書に開示される。このような高効率形質導入細胞は、タンパク質をコードするか又は目的の転写物に転写される配列を含む核酸（プラスミド）を形質導入すると、高効率でタンパク質及び／又は転写物を産生できる。さらに、そのような細胞は、ウイルスパッケージングタンパク質及び／又はヘルパータンパク質をコードするプラスミドや、タンパク質をコードする、又は目的の転写物に転写される導入遺伝子などの配列で形質導入されると、タンパク質をコードするか又は、目的の転写物に転写される配列を含む導入遺伝子を含む組換えベクターを産生でき、これにより組換えウイルスベクターが高収率で産生される。

[0115]本発明は、現在の「産業標準」ウイルス（例えばＡＡＶ）ベクター産生プロセスと区別される特徴が含まれた、細胞のトランスフェクション／形質導入及び／又はウイルス（例えばＡＡＶ）ベクター産生プラットフォームを提供する。本発明の組成物及び方法は、特定の条件下でＰＥＩを核酸と混合することを特徴とする。ＰＥＩを核酸と混合すると、ＰＥＩにより核酸が効率的に圧縮され、ポリプレックスと呼ばれる安定した複合体が形成される。細胞を核酸でトランスフェクトする組成物及び方法は、特定の条件下で細胞をＰＥＩと混合した核酸と接触させることを含む。

[0116]本発明の組成物及び方法は、細胞に増強剤を加えることをさらに含む。特定の実施形態において、増強剤は、細胞が核酸／ＰＥＩ混合物と接触する前に、又はほぼ同じ頃に、又は同時に加えられる。特定の実施形態において、増強剤は、細胞を核酸／ＰＥＩ混合物と接触させた後に加えられる。特定の態様において、細胞を核酸／ＰＥＩ混合物と接触させてから５～３０又は３０～６０秒後に増強剤が加えられる。特定の態様において、増強剤は、細胞を核酸／ＰＥＩ混合物と接触させてから１～２、２～５、５～１０、１０～２０、２０～３０、３０～６０分後に加えられる。特定の態様において、増強剤は、細胞を核酸／ＰＥＩ混合物と接触させてから１～２、２～４、４～６、６～１２、１２～２４、２４～３６、３６～４８又は４８～７２時間後に加えられる。

[0117]増強剤は、細胞と一定の期間、接触させて維持させることができる。特定の実施形態において、増強剤は、細胞を核酸／ＰＥＩ混合物と接触させた後、５分～７２時間、細胞と接触する。特定の実施形態において、増強剤は、細胞を核酸／ＰＥＩ混合物と接触させた後、１～２、２～５、５～１０、１０～２０、２０～３０、３０～６０分、細胞と接触する。特定の態様において、増強剤は、細胞を核酸／ＰＥＩ混合物と接触させた後、１～７２時間、６～４８時間、１２～３６時間、２４～４８時間、又は３６～７２時間、細胞と接触する。特定の態様において、増強剤は、細胞を核酸／ＰＥＩ混合物と接触させた後、１～２、２～４、４～６、６～１２、１２～２４、２４～３６、３６～４８又は４８～７２時間、細胞と接触する。

[0118]特定の実施形態において、細胞を遊離ＰＥＩと接触させるか、又は本方法は、細胞をＰＥＩ／核酸混合物と接触させるステップに関して特定の順序で、細胞を遊離ＰＥＩと接触させることを含む。特定の実施形態において、細胞が核酸／ＰＥＩ混合物と接触するのとほぼ同じ頃、又は同時に、細胞を遊離ＰＥＩと接触させる。詳細な実施形態において、細胞が核酸／ＰＥＩ混合物と接触した後で、細胞を遊離ＰＥＩと接触させる。

[0119]特定の実施形態において、細胞を遊離ＰＥＩと接触させるか、又は本方法は、核酸／ＰＥＩ混合物と接触した細胞に増強剤を加えるステップに関して特定の順序で、細胞を遊離ＰＥＩと接触させることを含む。特定の実施形態において、細胞を増強剤と接触させるのとほぼ同じ頃に、又は同時に細胞を遊離ＰＥＩと接触させる。詳細な実施形態において、細胞を増強剤と接触させた後、細胞を遊離ＰＥＩと接触させる。

[0120]「核酸」及び「ポリヌクレオチド」という用語は、本明細書ではデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）及びリボ核酸（ＲＮＡ）を含む全ての形態の核酸、オリゴヌクレオチドを指すために互換的に使用される。核酸及びポリヌクレオチドには、ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ及びアンチセンスＤＮＡ、並びにスプライス又は非スプライスｍＲＮＡ、ｒＲＮＡｔＲＮＡ及び阻害性ＤＮＡ又はＲＮＡ（ＲＮＡｉ、例えば、スモール又は短ヘアピン（ｓｈ）ＲＮＡ、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、スモール又は短干渉（ｓｉ）ＲＮＡ、トランススプライシングＲＮＡ、又はアンチセンスＲＮＡ）が含まれる。核酸及びポリヌクレオチドには、天然に存在する、合成の、及び意図的に修飾又は改変された配列（例えば、変異体核酸）が含まれる。

[0121]核酸又はプラスミドはまた、タンパク質をコードする配列を指し得る。そのようなタンパク質は、野生型又は変異体、修飾又はキメラタンパク質であり得る。「変異体タンパク質」とは、その修飾タンパク質が野生型タンパク質と比較してアミノ酸変化を有するような修飾タンパク質を意味し得る。

[0122]核酸又はプラスミドによってコードされるタンパク質には、治療用タンパク質が含まれる。非限定的な例には、血液凝固因子（例えば、因子ＸＩＩＩ、因子ＩＸ、因子Ｘ、因子ＶＩＩＩ、因子ＶＩＩａ、又はプロテインＣ）、ａｐｏＥ２、ＴＰＰ１、アルギニノコハク酸合成酵素、銅輸送ＡＴＰａｓｅ２、酸性α－グルコシダーゼ、β－グルコセレブロシダーゼ、α－ガラクトシダーゼ、Ｃ１阻害セリンプロテアーゼ阻害剤、ＣＦＴＲ（嚢胞性線維症膜貫通調節タンパク質）、抗体、網膜色素上皮特異的６５ｋＤａタンパク質（ＲＰＥ６５）、エリスロポエチン、ＬＤＬ受容体、リポタンパク質リパーゼ、オルニチントランスカルバミラーゼ、β－グロビン、α－グロビン、スペクトリン、α－アンチトリプシン、アデノシンデアミナーゼ（ＡＤＡ）、金属輸送体（ＡＴＰ７Ａ又はＡＴＰ７）、スルファミダーゼ、リソソーム蓄積症に関与する酵素（ＡＲＳＡ）、ヒポキサンチングアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ、β－２５グルコセレブロシダーゼ、スフィンゴミエリナーゼ、リソソームヘキソサミニダーゼ、分岐鎖ケト酸デヒドロゲナーゼ、ホルモン、成長因子（例えば、インスリン様成長因子１及び２、血小板由来成長因子、表皮成長因子、神経成長因子、神経栄養因子－３及び－４、脳由来神経栄養因子、グリア由来成長因子、形質転換成長因子α及びβなど）、サイトカイン（例えば、α－インターフェロン、β－インターフェロン、インターフェロン－γ、インターロイキン－２、インターロイキン－４、インターロイキン１２、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子、リンホトキシンなど）、自殺遺伝子産物（例えば、単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ、シトシンデアミナーゼ、ジフテリア毒素、シトクロムＰ４５０、デオキシシチジンキナーゼ、腫瘍壊死因子など）、薬物耐性タンパク質（例えば、がん治療に使用される薬物に対する耐性を提供するもの）、腫瘍抑制タンパク質（例えば、ｐ５３、Ｒｂ、Ｗｔ－１、ＮＦ１、フォンヒッペルリンダウ（ＶＨＬ）、大腸腺腫症（ＡＰＣ））、免疫調節特性を持つペプチド、寛容原性又は免疫原性のペプチド又はタンパク質トレギトープ、又はｈＣＤＲ１、インスリン、グルコキナーゼ、グアニル酸シクラーゼ２Ｄ（ＬＣＡ－ＧＵＣＹ２Ｄ）、Ｒａｂ護衛タンパク質１（色素沈着症）、ＬＣＡ５（ＬＣＡ－レベルシリン）、オルニチンケト酸アミノトランスフェラーゼ（ジャイレート萎縮）、リチノスキシン１（Ｘ連鎖網膜分離症）、ＵＳＨ１Ｃ（アッシャー症候群１Ｃ）、Ｘ連鎖網膜色素変性症ＧＴＰａｓｅ（ＸＬＲＰ）、ＭＥＲＴＫ（ＡＲ型ＲＰ：色素性網膜炎）、ＤＦＮＢ１（コネキシン２６難聴）、ＡＣＨＭ２、３及び４（色覚異常）、ＰＫＤ－１又はＰＫＤ－２（多発性嚢胞腎）、ＴＰＰ１、ＣＬＮ２、リソソーム蓄積症の原因となる遺伝子欠損（例えば、スルファターゼ、Ｎ－アセチルグルコサミン－１－リン酸トランスフェラーゼ、カテプシンＡ、ＧＭ２－ＡＰ、ＮＰＣ１、ＶＰＣ２、スフィンゴ脂質活性化タンパク質など）、ゲノム編集用の１つ又は複数の亜鉛フィンガーヌクレアーゼ、又はゲノム編集のための修復テンプレートとして使用されるドナー配列が含まれる。

[0123]核酸又はプラスミドはまた、転写されたときに転写物を産生する配列を指し得る。そのような転写物は、阻害性ＲＮＡ（ＲＮＡｉ、例えば、スモール又は短ヘアピン（ｓｈ）ＲＮＡ、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、スモール又は短干渉（ｓｉ）ＲＮＡ、トランススプライシングＲＮＡ、又はアンチセンスＲＮＡ）などのＲＮＡであり得る。

[0124]非限定的な例には、以下の発現を阻害する阻害性核酸が含まれる：ハンティングチン（ｈｕｎｔｉｎｇｔｉｎ；ＨＴＴ）遺伝子、歯状核赤核淡蒼球ルイ体萎縮症（ｄｅｎｔａｔｏｒｕｂｒｏｐａｌｌｉｄｏｌｕｓｙａｎａｔｒｏｐｙ）に関与する遺伝子（例えば、アトロフィン１（ａｔｒｏｐｈｉｎ１）、ＡＴＮ１）；脊髄球性筋萎縮症におけるＸ染色体上のアンドロゲン受容体、ヒトのアタキシン－１（Ａｔａｘｉｎ－１）、－２、－３、及び－７、Ｃａｖ２．１Ｐ／Ｑ電位依存性カルシウムチャネルは、（ＣＡＣＮＡ１Ａ）によってエンコードされる、ＴＡＴＡ結合タンパク質、ＡＴＸＮ８ＯＳとしても知られるアタキシン８の反対側鎖、脊髄小脳運動失調症（タイプ１、２、３、６、７、８、１２１７）におけるセリン／スレオニンタンパク質ホスファターゼ２Ａ５５ｋＤａ調節サブユニットＢベータアイソフォーム、脆弱Ｘ症候群におけるＦＭＲ１（脆弱Ｘ精神遅滞１）、脆弱Ｘ関連振戦／運動失調症候群におけるＦＭＲ１（脆弱Ｘ精神遅滞１）、脆弱ＸＥ精神遅滞におけるＦＭＲ１（脆弱Ｘ精神遅滞２）又はＡＦ４／ＦＭＲ２ファミリーメンバー２；筋強直性ジストロフィーにおけるミオトニンプロテインキナーゼ（ＭＴ－ＰＫ）；フリードライヒ失調症のフラタキシン；筋萎縮性側索硬化症におけるスーパーオキシドジスムターゼ１（ＳＯＤ１）遺伝子の変異体；パーキンソン病及び／又はアルツハイマー病の病因に関与する遺伝子；アポリポタンパク質Ｂ（ＡＰＯＢ）及びプロタンパク質転換酵素スブチリシン／ケキシン９型（ＰＣＳＫ９）、高コレステロール血症；ＨＩＶ感染症における、ＨＩＶＴａｔ、転写遺伝子のヒト免疫不全ウイルストランスアクチベーター；ＨＩＶ感染症における、ＨＩＶＴＡＲ、ＨＩＶＴＡＲ、ヒト免疫不全ウイルストランスアクチベーター応答要素遺伝子；ＨＩＶ感染におけるＣ－Ｃケモカイン受容体（ＣＣＲ５）；ＲＳＶ感染症におけるラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）ヌクレオキャプシドタンパク質、Ｃ型肝炎ウイルス感染症における肝臓特異的ｍｉｃｒｏＲＮＡ（ｍｉＲ－１２２）；ｐ５３、急性腎障害又は遅発性移植機能腎移植又は腎障害急性腎不全；進行再発又は転移性の固形悪性腫瘍におけるプロテインキナーゼＮ３（ＰＫＮ３）；ＬＭＰ２、プロテアソームサブユニットベータ型９（ＰＳＭＢ９）としても知られるＬＭＰ２、転移性黒色腫；プロテアソームサブユニットベータ型８（ＰＳＭＢ８）としても知られるＬＭＰ７、転移性黒色腫；プロテアソームサブユニットベータ型１０（ＰＳＭＢ１０）としても知られるＭＥＣＬ１、転移性黒色腫；固形腫瘍の血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）；固形腫瘍におけるキネシン紡錘体タンパク質、慢性骨髄性白血病におけるアポトーシス抑制Ｂ細胞ＣＬＬ／リンパ腫（ＢＣＬ－２）；固形腫瘍におけるリボヌクレオチド還元酵素Ｍ２（ＲＲＭ２）；固形腫瘍におけるフューリン（Ｆｕｒｉｎ）；肝腫瘍におけるポロ様キナーゼ１（ＰＬＫ１）、Ｃ型肝炎感染におけるジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ１（ＤＧＡＴ１）、家族性大腸腺腫症におけるベータカテニン；ベータ２アドレナリン受容体、緑内障；糖尿病黄斑浮腫（ＤＭＥ）又は加齢性黄斑変性症における、ＤＡＮ損傷誘導性転写物４タンパク質としても知られるＲＴＰ８０１／Ｒｅｄｄ１；加齢性黄斑変性症又は脈絡膜血管新生における血管内皮成長因子受容体Ｉ（ＶＥＧＦＲ１）、非動脈炎性虚血性視神経症におけるカスパーゼ２；先天性爪甲におけるケラチン６ＡＮ１７Ｋ変異タンパク質；インフルエンザ感染におけるインフルエンザＡウイルスのゲノム／遺伝子配列；ＳＡＲＳ感染における重症急性呼吸器症候群（ＳＡＲＳ）コロナウイルスゲノム／遺伝子配列；呼吸器合胞体ウイルス感染における呼吸器合胞体ウイルスのゲノム／遺伝子配列；エボラ感染症におけるエボラフィロウイルスゲノム／遺伝子配列；Ｂ型及びＣ型肝炎感染におけるＢ型及びＣ型肝炎ウイルスゲノム／遺伝子配列；ＨＳＶ感染における単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）ゲノム／遺伝子配列、コクサッキーウイルスＢ３感染におけるコクサッキーウイルスＢ３ゲノム／遺伝子配列；原発性ジストニアにおけるトルシンＡ（ｔｏｒｓｉｎＡ；ＴＯＲ１Ａ）、パン－クラスＩ（ｐａｎ－ｃｌａｓｓＩ）及び移植に特異的なＨＬＡ対立遺伝子のような遺伝子の病原性対立遺伝子のサイレンシング（対立遺伝子特異的サイレンシング）；常染色体優性遺伝性網膜色素変性症（ａｄＲＰ）における変異ロドプシン遺伝子（ＲＨＯ）；又は、阻害性核酸は、前述の遺伝子又は配列のいずれかの転写物に結合する。

[0125]核酸（プラスミド）は、単鎖、二重鎖、又は三重鎖、線状又は環状であり得、任意の長さであり得る。核酸（プラスミド）を議論する場合、特定のポリヌクレオチドの配列又は構造は、５’から３’方向に配列を提供する慣例に従って本明細書に記載され得る。

[0126]「プラスミド」は、典型的にはプラスミドの発現（例えば、転写、複製など）又は増殖（複製）のための追加の要素を有する核酸又はポリヌクレオチドの形態である。本明細書で使用されるプラスミドを使用して、核酸及びポリヌクレオチド配列を参照することもできる。したがって、全ての態様において、本発明の組成物及び方法は、例えば、プラスミド、核酸又はポリヌクレオチドを細胞に導入し、プラスミド、核酸又はポリヌクレオチドで細胞を形質導入（トランスフェクト）し、プラスミド、核酸又はポリヌクレオチドを有する形質導入（トランスフェクトされた）細胞を産生して、ウイルス（例えば、ＡＡＶ）ベクターを産生する細胞を産生する、ウイルス（例えば、ＡＡＶ）ベクターを産生する、ウイルス（例えば、ＡＡＶ）ベクターを有する細胞培養培地を産生することなどについて、プラスミド、核酸及びポリヌクレオチドに適用可能である。

[0127]本発明の組成物及び方法には、ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）が含まれる。ＰＥＩはカチオン性ポリマーであり、ポリプレックスと呼ばれる核酸と安定な複合体を形成することができる。いかなる理論にも拘束されることを望まないが、ポリプレックスはエンドサイトーシスを介して細胞に導入されると考えられている。

[0128]ＰＥＩは、直鎖ＰＥＩ又は分岐鎖ＰＥＩであり得る。ＰＥＩは、塩の形態又は遊離塩基であり得る。詳細な実施形態において、ＰＥＩは、任意選択で加水分解された直鎖ＰＥＩなどの直鎖ＰＥＩである。加水分解されたＰＥＩは、完全に又は部分的に加水分解されてもよい。加水分解直鎖ＰＥＩは、非加水分解直鎖ＰＥＩと比較して、より多くの割合の遊離（プロトン化可能な）窒素を有し、典型的には非加水分解直鎖ＰＥＩと比較して少なくとも１～５％より多くの遊離（プロトン化可能な）窒素を有し、より典型的には非加水分解直鎖ＰＥＩと比較して５～１０％より多くの遊離（プロトン化可能な）窒素を有し、最も典型的には非加水分解直鎖ＰＥＩと比較して１０～１５％より多くの遊離（プロトン化可能な）窒素を有する。

[0129]詳細な実施形態において、ＰＥＩは、約４０００～約１６００００の範囲の分子量及び／又は遊離塩基形態で約２５００～約２５００００の範囲の分子量を有し得る。さらに詳細な実施形態において、ＰＥＩは、約４００００の分子量及び／又は遊離塩基形態で約２５０００の分子量を有し得る。詳細には、約４００００及び／又は遊離塩基形態で約２５０００の分子量を有する直鎖ＰＥＩ。さらに、化学修飾された直鎖ＰＥＩ又は分岐鎖ＰＥＩもまた使用できる。ＰＥＩは市販されている（例えば、Ｐｏｌｙｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｉｎｃ．、ウォリントン、ペンシルバニア州、米国）。

[0130]本発明の組成物及び方法において、プラスミドのような核酸をＰＥＩと混合して、ＰＥＩ混合物又は溶液を形成する。そのような混合物又は溶液は、「プラスミド／ＰＥＩ混合物」又は「核酸／ＰＥＩ混合物」と呼ばれ得る。したがって、「プラスミド／ＰＥＩ混合物」及び「核酸／ＰＥＩ混合物」という用語は、ＰＥＩが核酸／プラスミドと混合されたものを意味する。したがって、本明細書に記載のＰＥＩは、形質導入／トランスフェクションのために、細胞の接触の前又は実質的に同時に、核酸（プラスミド）と混合されてもよい。

[0131]本明細書で使用される場合、「遊離ＰＥＩ」という用語は、実質的に又は完全に核酸（プラスミド）を含まないＰＥＩを意味する。したがって、本明細書に記載されるＰＥＩは、遊離ＰＥＩの形態でもあり得る。したがって、「プラスミド／ＰＥＩ混合物」又は「核酸／ＰＥＩ混合物」は、遊離ＰＥＩとは異なる。遊離ＰＥＩが実質的に遊離している場合、存在する核酸（プラスミド）配列の量は、分子量又は質量によって決定された約５％以下になる。もちろん、量は５％未満、例えば約４．５％以下、約４％以下、約３．５％以下、約３％以下、約２．５％以下、約２％以下、約１．５％以下、約１％以下、又は約０．５％以下であってもよい。

[0132]本明細書で使用される場合、「全ＰＥＩ」という用語は、ＰＥＩ／プラスミド混合物中に存在するＰＥＩと遊離ＰＥＩの合計を意味する。したがって、全ＰＥＩには、プラスミドと混合されるＰＥＩと、プラスミドのような核酸配列を実質的又は完全に含まないＰＥＩとが含まれる。

[0133]ＰＥＩの量、比率、組成、溶液、溶媒及び緩衝液、ｐＨ、塩、並びに細胞接触及びインキュベーションのタイミング及び持続時間の開示は、以下のいずれか１つ、いずれか２つ、又は３つの全てに適用される：１）プラスミド／ＰＥＩ混合物又は核酸／ＰＥＩ混合物中のＰＥＩ；２）遊離ＰＥＩとしてのＰＥＩ（すなわち、プラスミドのような核酸又はポリヌクレオチド配列を実質的又は完全に含まないＰＥＩ；及び３）全ＰＥＩ（プラスミド／ＰＥＩ混合物又は核酸／ＰＥＩ混合物中のＰＥＩ＋遊離ＰＥＩ）。

[0134]詳細な実施形態において、ＰＥＩは、水溶液（例えば、水）などの溶液である。追加の詳細な実施形態において、ＰＥＩは酸性化又は中和ＰＥＩである。「酸性化ＰＥＩ」という用語は、酸性溶媒にＰＥＩを溶解することにより調製されるＰＥＩ溶液を意味する。酸性化ＰＥＩ溶液の酸性度は、典型的には約０～約３．０のｐＨ、より典型的には約０．５～約２．０のｐＨである。「中和ＰＥＩ」という用語は、ＰＥＩを中性溶媒又は緩衝液に溶解することにより調製されるＰＥＩ溶液を意味する。中和ＰＥＩ溶液は、約６．０～約８．０の範囲のｐＨ、典型的には約６．５～約７．５の範囲のｐＨ、より典型的には約６．８～約７．２の範囲のｐＨ、最も典型的には約７．０～約７．２の範囲、例えば約７．１のｐＨを有し得る。

[0135]ＰＥＩのトランスフェクション活性を破壊することなく、ＰＥＩ溶液のｐＨを前述の範囲内に確立又は維持するために、任意の溶媒又は緩衝液を使用することができる。酸性溶媒の例には、塩酸（ＨＣｌ）などの鉱酸、及びグリシン塩酸溶液などの酸性範囲のｐＨを持つ有機酸が含まれる。中性溶媒／緩衝液の非限定的な例には、トリス（トリズマ塩基）及びＨＥＰＥＳが含まれる。緩衝液は、約１ｍＭ～約１００ｍＭ、より典型的には約２ｍＭ～約５０ｍＭ、最も典型的には約５ｍＭ～約２０ｍＭの範囲であり得る。

[0136]ＰＥＩ溶液は、任意選択で塩を含むことができる。塩の非限定的な例には、ナトリウム（Ｎａ）、カリウム（Ｋ）及びマグネシウム（Ｍｇ）塩が含まれる。特定の態様において、ＰＥＩ溶液の塩濃度は、約５０ｍＭ～約５００ｍＭ、より典型的には約１００ｍＭ～約２５０ｍＭ、最も典型的には約１２５ｍＭ～約１７５ｍＭの範囲である。

[0137]核酸（プラスミド）及びＰＥＩの混合は、溶液中で核酸（プラスミド）及びＰＥＩを混合することにより行われる。混合は、ＰＥＩベースの細胞形質導入と互換性のある任意の溶液で起き得る。非限定的な例は、本明細書に記載されている通りである。混合後、核酸（プラスミド）／ＰＥＩ混合物を、約１分～約８時間；約１０秒～約４時間；約１分～約６０分；約１分～約３０分；約１０分～約４５分；約１０分～約３０分；及び／又は約２０分～約３０分間の間インキュベートすることができる。典型的には、時間には約１分、約５分、約１０分、約１５分、約２０分、及び約３０分が含まれる。

[0138]ＰＥＩ及び核酸（プラスミド）は、限定されない比率で混合される。典型的な比率には、プラスミド／ＰＥＩ混合物を産生するための、約１：０．０１～約１：１００のモル（又は重量）比率範囲、又は約１００：１～約１：０．０１のモル（又は重量）比率範囲のプラスミドの混合物が含まれる。より典型的なモル（又は重量）比には、プラスミド／ＰＥＩ混合物を産生するための、約１：１～約１：５のモル（又は重量）比範囲、又は約１：２～約１：４のモル（又は重量）比範囲のプラスミドの混合物が含まれる。さらなる実施形態において、ＰＥＩ：プラスミド重量比は、約０．１：１～約５：１の範囲、又は約５：１～約０．１：１の範囲である。さらなる実施形態において、遊離ＰＥＩ／プラスミド／ＰＥＩ細胞培養液は、約０．１：１～約５：１の範囲のＰＥＩ：プラスミド重量比を有するか、又は約５：１～約０．１：１の範囲のＰＥＩ：プラスミド重量比を有する。特定の実施形態において、プラスミド／ＰＥＩ混合物は、約１：１～約５：１の範囲、又は約５：１～約１：１の範囲のＰＥＩ：プラスミド重量比を有する。他の詳細な実施形態において、遊離ＰＥＩ／プラスミド／ＰＥＩ細胞培養液は、約１：１～約５：１の範囲、又は約５：１～約１：１の範囲のＰＥＩ：プラスミド重量比を有する。

[0139]組成物を産生するために使用される核酸（プラスミド）の量及び細胞形質導入の方法は様々である。詳細な実施形態において、全ＰＥＩ中の窒素（Ｎ）のプラスミド中のリン酸塩（Ｐ）に対するモル比は、遊離ＰＥＩ／プラスミド／ＰＥＩ細胞培養液中で約１：１～約５０：１（Ｎ：Ｐ）の範囲にあるか、又は全ＰＥＩ中の窒素（Ｎ）のプラスミド中のリン酸塩（Ｐ）に対するモル比は、遊離ＰＥＩ／プラスミド／ＰＥＩ細胞培養液中で約１：１～１０：１（Ｎ：Ｐ）であるか、又は全ＰＥＩ中の窒素（Ｎ）のプラスミド中のリン酸塩（Ｐ）に対するモル比は、遊離ＰＥＩ／プラスミド／ＰＥＩ細胞培養液中で約５：１、６：１、７：１、８：１、９：１、又は１０：１（Ｎ：Ｐ）である。追加の詳細な実施形態において、タンパク質をコードするか、又は目的の転写物に転写される核酸を含むプラスミドの合計量、及びＡＡＶパッケージングタンパク質をコードする核酸及び／又はヘルパータンパク質をコードする核酸を含む１つ又は複数のプラスミドは細胞１ｍＬあたり約０．１μｇ～約１５μｇの範囲にある。

[0140]核酸（プラスミド）／ＰＥＩの混合物の細胞への適用は、核酸（プラスミド）／ＰＥＩの混合物が細胞に接触するように核酸（プラスミド）／ＰＥＩ混合物を細胞に加えることにより行われる。核酸（プラスミド）／ＰＥＩ溶液の混合物が加えられる（接触する）細胞は、接着細胞又は懸濁液中の細胞であり得る。そのような細胞には、他の細胞との共培養が含まれ得る。

[0141]細胞は、細胞形質導入を達成するために、限定されない核酸（プラスミド）／ＰＥＩの混合物とある時間の間、接触させる。典型的には、細胞の遊離ＰＥＩとの接触は、細胞が核酸（プラスミド）／ＰＥＩ混合物と接触するのと同時に（又はその直後）、又は接触した後に起きる。細胞の核酸（プラスミド）／ＰＥＩ混合物との接触と細胞の遊離ＰＥＩとの接触の間に時間間隔がある場合、その時間間隔は約１秒～約１４０時間、典型的には約１秒～約９６時間、より典型的には約１秒～約４８又は約７２時間、最も典型的には約１秒～約２４時間、それ以下、例えば約１６、約１２、約８、又は約６時間、それ以下であり得る。

[0142]長期間接触した場合、細胞はＰＥＩの細胞毒性に影響されて、死（生存不能）細胞の量が増加し、それによりトランスフェクション効率が低下し得る。細胞を全ＰＥＩと接触させた後のインキュベーション時間は、数秒～数日までの範囲であり得る。特に、例えば、約１分～約４８時間；約１分～約２４時間；約１分～約１６時間；約１分～約８時間；約１分～約４時間；約１分～約１２０分；約５分～約６０分；約１０分～約４５分；又は約１０分～約３０分の期間、細胞を核酸（プラスミド）／ＰＥＩ、又は全ＰＥＩと接触させることができる。

[0143]ＰＥＩの細胞毒性を低減するために、細胞を核酸（プラスミド）／ＰＥＩと接触させた後、培養培地を新鮮な培養培地と交換してもよい。トランスフェクション後の培養培地交換により、細胞トランスフェクション効率を大きく損なうことなくＰＥＩ細胞毒性を最小化できる。

[0144]トランスフェクションのための細胞は、プラスミド／ＰＥＩ混合物との接触、及び／若しくは増強剤との接触、及び／若しくは遊離ＰＥＩとの接触前又は接触時のいずれかで、約１×１０^５細胞／ｍＬ～約１×１０^８細胞／ｍＬの範囲の密度を有する。典型的には、細胞は、約２×１０^５細胞／ｍＬ～約５×１０^６細胞／ｍＬの範囲の密度を有する。より典型的には、細胞は、約３×１０^５細胞／ｍＬ～約４×１０^６細胞／ｍＬ、例えば約４×１０^５細胞／ｍＬ～約３×１０^６細胞／ｍＬ、又は約５×１０^５細胞／ｍＬ～約２×１０^６細胞／ｍＬの範囲の密度を有する。他の実施形態において、細胞は、約５×１０^５細胞／ｍＬ～約５×１０^６細胞／ｍＬ、例えば、約６×１０^５細胞／ｍＬ～約４×１０^６細胞／ｍＬ、又は約７×１０^５細胞／ｍＬ～約３×１０^６細胞／ｍＬの範囲の密度を有する。さらなる実施形態において、細胞は、約１×１０^６細胞／ｍＬ～約５×１０^６細胞／ｍＬ、例えば、約１×１０^６細胞／ｍＬ～約４×１０^６細胞／ｍＬ、又は約２×１０^６細胞／ｍＬ～約３×１０^６細胞／ｍＬの範囲の密度を有する。

[0145]トランスフェクションのための細胞は、プラスミド／ＰＥＩ混合物との接触、及び／若しくは増強剤との接触、及び／若しくは遊離ＰＥＩとの接触前又は接触時のいずれかで、任意選択で対数（指数）増殖期にあってもよい。トランスフェクションのための細胞は、プラスミド／ＰＥＩ混合物との接触、及び／若しくは増強剤との接触、及び／若しくは遊離ＰＥＩとの接触前又は接触時のいずれかで、任意選択で６０％又は６０％を超える生存率、例えば７０％、８０％、９０％、又は９０％を超える生存率を有していてもよい。

[0146]本明細書に記載されるように接触され得る細胞には、ヒト細胞のような哺乳動物細胞が含まれ得る。そのような細胞は、インビトロで成長又は生存率を維持できるか、又はインビトロ組織培養に適合した初代細胞又は細胞株であり得る。細胞株の例には、ＨＥＫ２９３Ｆ（２９３Ｆ）及びＨＥＫ２９３Ｔ（２９３Ｔ）細胞などのＨＥＫ２９３細胞を含む、ＨＥＫ（ヒト胎児腎臓）細胞が含まれる。

[0147]より一般的には、本明細書に記載されるように接触されるような細胞は、「宿主細胞」と呼ばれ得る。「宿主細胞」は、ＡＡＶパッケージングタンパク質などのパッケージングタンパク質をコードする核酸（プラスミド）、ヘルパータンパク質をコードする核酸（プラスミド）、タンパク質をコードするか若しくは目的の転写物に転写される核酸（プラスミド）、又は他のトランスファー核酸（プラスミド）のレシピエントとして使用され得るか、又は使用されている、例えば、微生物、酵母細胞、昆虫細胞、及び哺乳動物細胞を意味する。この用語には、形質導入又はトランスフェクトされた元の細胞の子孫が含まれる。したがって、本明細書で使用される「宿主細胞」は、一般に、外因性核酸配列で形質導入又はトランスフェクトされた細胞を指す。単一の親細胞の子孫は、自然変異、偶発的変異、又は計画的な変異により、形態又はゲノム若しくは全核酸相補体が元の親と必ずしも完全に同一ではない場合があることが理解される。

[0148]細胞の生存率を維持するか、細胞の成長及び／又は増殖を提供するのに適した多数の細胞増殖培地が市販されているか、又は容易に生産することができる。そのような培地の例には、生存率を維持するための又は哺乳動物（例えば、ヒト）細胞の増殖を提供するための培地のような無血清真核生物増殖培地が含まれる。非限定的な例には、ＨａｍのＦ１２又はＦ１２Ｋ培地（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）、フリースタイル（ＦｒｅｅＳｔｙｌｅ）（商標）（ＦＳ）Ｆ１７培地（Ｔｈｅｒｍｏ－ＦｉｓｈｅｒＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）、ＭＥＭ、ＤＭＥＭ、ＲＰＭＩ－１６４０（Ｔｈｅｒｍｏ－ＦｉｓｈｅｒＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）及びそれらの混合物が含まれる。そのような培地には、哺乳動物（例えば、ヒト）細胞に必須のアミノ酸のようなビタミン及び／又は微量ミネラル及び／又は塩及び／又はアミノ酸を補充することができる。

[0149]「増強剤」は、他に本明細書で「トランスフェクションエンハンサー」又は同じ文脈で単に「エンハンサー」とも呼ばれるが、核酸（プラスミド）を用いた細胞形質導入／トランスフェクションを増加させる化合物である。詳細な実施形態において、増強剤は、バルプロ酸、その塩又は誘導体を含むか、又はからなる。特定の実施形態において、バルプロ酸塩は、ナトリウム塩又はカリウム塩を含むか、又はからなる。特定の実施形態において、バルプロ酸誘導体は、それに連結又はコンジュゲートされたアミノ酸を含むか、又はからなる。増強剤のさらなる例には、例えば限定されることなく、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる米国特許出願公開第２０１３／０３１６４００号及び２０１７／００１６０４３号に記載されるもの、並びに当技術分野で公知の他のトランスフェクションエンハンサーが含まれる。

[0150]バルプロ酸を含む増強剤は、例えば、限定されることなく、約０．１ｍＭ～約２５ｍＭの範囲の濃度、又はそれによって包含される任意の下位範囲又は濃度値で使用することができる。特定の実施形態において、増強剤の濃度は、約０．５ｍＭ～約１０ｍＭである。特定の実施形態において、増強剤の濃度は、約０．５ｍＭ～約５ｍＭである。特定の実施形態において、増強剤の濃度は、約１ｍＭ～約４ｍＭ、約１ｍＭ～約３ｍＭ、又は約１ｍＭ～約２ｍＭである。

[0151]「形質導入」及び「トランスフェクト」という用語は、核酸（プラスミド）のような分子の宿主細胞への導入を指す。細胞は、外因性核酸が細胞膜内に導入されたときに「形質導入」又は「トランスフェクト」されている。したがって、「形質導入細胞」は、「核酸」又は「ポリヌクレオチド」が導入された細胞、又は外因性核酸が導入されたその子孫である。詳細な実施形態において、「形質導入された」細胞（例えば、哺乳動物において、細胞又は組織又は器官細胞）は、外因性分子、例えば核酸（例えば、導入遺伝子）の取り込みの後の細胞における遺伝的変化である。「形質導入された」又は「トランスフェクトされた」細胞（複数可）を増殖させ、導入された核酸を転写及び／又はタンパク質を発現させることができる。

[0152]「形質導入された」又は「トランスフェクトされた」細胞において、核酸（プラスミド）は、レシピエント細胞のゲノム核酸に組み込まれてもよいし、組み込まれなくてもよい。導入された核酸がレシピエント細胞又は生物の核酸（ゲノムＤＮＡ）に組み込まれるようになると、その細胞又は生物の内で安定に維持され、さらにレシピエント細胞又は生物の子孫細胞又は生物に受け継がれるか、又は遺伝し得る。最後に、導入された核酸は、レシピエント細胞又は宿主生物の染色体外に、又は一時的にのみ存在する可能性がある。多数の技術が知られている（例えば、Ｇｒａｈａｍら、（１９７３）Ｖｉｒｏｌｏｇｙ、５２：４５６、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、（１９８９）ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ、ａｌａｂｏｒａｔｏｒｙｍａｎｕａｌ、ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、ＮｅｗＹｏｒｋ、Ｄａｖｉｓら、（１９８６）ＢａｓｉｃＭｅｔｈｏｄｓｉｎＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙ、Ｅｌｓｅｖｉｅｒ、及びＣｈｕら、（１９８１）Ｇｅｎｅ１３：１９７を参照されたい。このような技術は、１つ又は複数の外因性ＤＮＡ部分を適切な宿主細胞に導入するために使用できる。

[0153]「ベクター」という用語は、小さなキャリア核酸分子、プラスミド、ウイルス（例えば、ＡＡＶベクター）、又は核酸の挿入又は取り込みによって操作され得る他の媒体を指す。そのようなベクターは、ポリヌクレオチドの細胞への導入／移入、及び細胞内に挿入されたポリヌクレオチドの転写又は翻訳のための、遺伝子操作（すなわち、「クローニングベクター」）に使用できる。「発現ベクター」は、宿主細胞内の発現に必要な、必要な調節領域を持つ遺伝子又は核酸配列を含む、特殊ベクターである。ベクター核酸配列は、一般に、少なくとも細胞内での増殖のための複製起点と、任意選択で異種ポリヌクレオチド配列、発現制御要素（例えば、プロモーター、エンハンサー）、イントロン、ＩＴＲ（複数可）、選択マーカー（例えば、抗生物質耐性）、ポリアデニル化シグナルのような追加要素を含む。本発明の目的について、本明細書に記載の「ベクター」は、本明細書でこの用語が使用されるように「プラスミド」の範囲内にある。

[0154]ウイルスベクターは、ウイルスゲノムを含む１つ又は複数の核酸要素に由来するか、又は基づく。特定のウイルスベクターには、レンチウイルス、偽型レンチウイルス、及びアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターなどのパルボウイルスベクターが含まれる。

[0155]組換えウイルス、例えば、レンチ又はパルボウイルス（例えば、ＡＡＶ）ベクターのようなベクターの修飾因子、並びに組換えポリヌクレオチド及びポリペプチドのような配列の修飾因子としての「組換え（の）」という用語は、その組成物が、通常は自然界では起こらない方法で操作されていること（つまり、エンジニアリングされていること）を意味する。ＡＡＶベクターなどの組換えベクターの特定の例は、野生型ウイルス（例えば、ＡＡＶ）ゲノムに通常存在しないポリヌクレオチドがウイルスゲノム内に挿入される、すなわち異種である場合であろう。「組換え（の）」という用語は、ウイルス及びＡＡＶベクターなどのベクター、並びにポリヌクレオチドなどの配列を指すように本明細書で常に使用されるわけではないが、いかなるそのような省略にもかかわらず、ポリヌクレオチドを含む組換え型が明示的に含まれる。

[0156]組換えウイルス「ベクター」又は「ＡＡＶベクター」は、ウイルス（例えば、ＡＡＶ）から野生型ゲノムを取り除く分子法を使用して、転写物に転写されるか、又はタンパク質をコードする核酸のような非天然型核酸と置換することによるＡＡＶのような、ウイルスの野生型ゲノムに由来している。典型的には、ＡＡＶの場合、ＡＡＶゲノムの１つ又は両方の逆位末端反復（ＩＴＲ）配列がＡＡＶベクターに保持される。「組換え」ウイルスベクター（例えば、ＡＡＶ）は、ウイルスゲノムの全部又は一部が、ウイルス（例えば、ＡＡＶ）ゲノム核酸に関して非天然型（すなわち、異種）配列で置換されているため、ウイルス（例えば、ＡＡＶ）ゲノムと区別される。したがって、非天然型配列の組み込みでは、ウイルスベクター（例えば、ＡＡＶ）が「組換え」ベクターと定義され、ＡＡＶの場合は「ｒＡＡＶベクター」と呼ぶことができる。

[0157]組換えベクター（例えば、レンチ、パルボ、ＡＡＶ）配列は、本明細書で呼ぶところのエクスビボ、インビトロ又はインビボでの細胞のその後の感染（形質導入）のための「粒子」として、パッケージ化することができる。組換えベクター配列がＡＡＶ粒子にキャプシド化又はパッケージ化される場合、粒子は「ｒＡＡＶ」とも呼ばれ得る。そのような粒子には、ベクターゲノムをキャプシド化又はパッケージ化するタンパク質が含まれる。特定の例には、ウイルスエンベロープタンパク質が含まれ、ＡＡＶの場合、ＡＡＶＶＰ１、ＶＰ２及びＶＰ３などのキャプシドタンパク質が含まれる。

[0158]ベクター「ゲノム」は、ウイルス（例えば、ＡＡＶ）粒子を形成するために最終的にパッケージ化又はキャプシド化される組換えプラスミド配列の部分を指す。組換えプラスミドを使用して組換えベクターを構築又は製造する場合、ベクターゲノムには、組換えプラスミドのベクターゲノム配列に対応しない「プラスミド」の部分は含まない。組換えプラスミドのこの非ベクターゲノム部分は「プラスミドバックボーン」と呼ばれ、増殖と組換えウイルスの産生に必要なプロセスであるプラスミドのクローニングと増幅に重要であるが、それ自体はウイルス（例えば、ＡＡＶ）粒子にパッケージ化又はキャプシド化されない。したがって、ベクター「ゲノム」とは、ウイルス（例えば、ＡＡＶ）によってパッケージ化又はキャプシド化された核酸を指す。

[0159]「空のキャプシド」及び「空の粒子」という用語は、ＡＡＶタンパク質シェルを含むが、タンパク質をコードするか又はＡＡＶＩＴＲに隣接する目的の転写物に転写される核酸の全部又は一部を欠くＡＡＶビリオンを指す。したがって、空のキャプシドは、タンパク質をコードするか又は目的の転写物に転写された核酸を宿主細胞に移入するようには機能しない。しかしながら、空のキャプシド製剤は、ＥＬＩＳＡのような他の用途に有用である。

[0160]「パッケージングタンパク質」という用語は、ＡＡＶがその複製に依存する非ＡＡＶ由来のウイルス及び／又は細胞機能を指す。したがって、この用語は、ＡＡＶ遺伝子転写の活性化、段階特異的ＡＡＶｍＲＮＡスプライシング、ＡＡＶＤＮＡ複製、Ｃａｐ発現産物の合成及びＡＡＶキャプシドアセンブリーに関与する部分を含む、ＡＡＶ複製に必要なタンパク質及びＲＮＡを網羅する。ウイルスベースのアクセサリー機能は、アデノウイルス、ヘルペスウイルス（単純ヘルペスウイルス１型以外）、ワクシニアウイルスなどの既知のヘルパーウイルスのいずれかに由来し得る。

[0161]本明細書で使用される「ＡＡＶパッケージングタンパク質」は、生産的なＡＡＶ複製のためにトランスで機能するＡＡＶ由来配列を指す。したがって、ＡＡＶパッケージングタンパク質は、主要なＡＡＶオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）、ｒｅｐ及びｃａｐによってコードされる。ｒｅｐタンパク質は、とりわけ、ＤＮＡ複製のＡＡＶオリジンの認識、結合、及びニッキング；ＤＮＡヘリカーゼ活性；並びにＡＡＶ（又は他の異種）プロモーターからの転写の調節を含む、多くの機能を持っていることが示されている。ｃａｐ（キャプシド）タンパク質は、必要なパッケージング機能を提供する。本明細書において、ＡＡＶパッケージングタンパク質は、ＡＡＶベクターにはないＡＡＶ機能をトランスで補完するために使用される。

[0162]「ＡＡＶパッケージングタンパク質をコードする核酸」とは、一般に、形質導入組換えＡＡＶベクターを産生するために使用される、ＡＡＶベクターから欠失したＡＡＶ機能を提供するヌクレオチド配列を含む核酸分子を指す。ＡＡＶパッケージングタンパク質をコードする核酸は、一般的にＡＡＶｒｅｐ及び／又はｃａｐ遺伝子の一過性発現を提供し、ＡＡＶ複製に必要である失われたＡＡＶ機能を補完するために使用される；しかし、核酸構築物はＡＡＶＩＴＲが欠如しており、複製もパッケージ化もできない。ＡＡＶパッケージングタンパク質をコードする核酸は、プラスミド、ファージ、トランスポゾン、コスミド、ウイルス、又はビリオンの形態であり得る。Ｒｅｐ及びＣａｐ発現産物の両方をコードする一般的に使用されるプラスミドｐＡＡＶ／Ａｄ及びｐＩＭ２９＋４５など、多くの核酸構築物が記載されている。例えば、Ｓａｍｕｌｓｋｉら（１９８９）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６３：３８２２－３８２８；及びＭｃＣａｒｔｙら（１９９１）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６５：２９３６－２９４５を参照されたい。Ｒｅｐ及び／又はＣａｐ発現産物をコードする多くのベクターが記載されている（例えば、米国特許第５，１３９，９４１号及び第６，３７６，２３７号）。

[0163]「ヘルパータンパク質をコードする核酸」という用語は、一般に、ヘルパー機能（複数可）を提供するタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む核酸分子（複数可）を指す。ヘルパータンパク質（複数可）をコードする核酸（複数可）を含むベクターを適切な宿主細胞にトランスフェクトすることができ、ここではベクターは宿主細胞におけるＡＡＶビリオン産生を支援することができる。アデノウイルス、ヘルペスウイルス、ワクシニアウイルス粒子など、自然界に存在する感染性ウイルス粒子は、この用語から明示的に除外される。

[0164]したがって、ヘルパータンパク質ベクターは、プラスミド、ファージ、トランスポゾン又はコスミドの形態であり得る。特に、アデノウイルス遺伝子の全相補体はヘルパー機能に必要がないことが実証されている。例えば、ＤＮＡ複製が不能で遺伝子合成が遅いアデノウイルス変異体は、ＡＡＶ複製を許容することが示されている。Ｉｔｏら、（１９７０）Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．９：２４３；Ｉｓｈｉｂａｓｈｉら、（１９７１）Ｖｉｒｏｌｏｇｙ４５：３１７。

[0165]Ｅ２Ｂ及びＥ３領域内の変異体は、ＡＡＶ複製を支援することが示されているが、これは、Ｅ２Ｂ及びＥ３領域がおそらくヘルパー機能の提供に関与していないことを示している。Ｃａｒｔｅｒら：（１９８３）Ｖｉｒｏｌｏｇｙ１２６：５０５。しかしながら、Ｅｌ領域に欠陥があるか、又はＥ４領域を欠失したアデノウイルスは、ＡＡＶ複製をサポートできない。したがって、アデノウイルスヘルパータンパク質については、ＡＡＶ複製にはＥＩＡ及びＥ４領域が直接又は間接的に必要である可能性が高い。Ｌａｕｇｈｌｉｎら、（１９８２）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．４１：８６８；Ｊａｎｉｋら、（１９８１）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ７８：１９２５；Ｃａｒｔｅｒら、（１９８３）Ｖｉｒｏｌｏｇｙ１２６：５０５。他の特徴付けられたＡｄ変異体には、ＥＩＢ（Ｌａｕｇｈｌｉｎら（１９８２）、上記参照；Ｊａｎｉｋら（１９８１）、上記参照；Ｏｓｔｒｏｖｅら、（１９８０）Ｖｉｒｏｌｏｇｙ１０４：５０２）；Ｅ２Ａ（Ｈａｎｄａら、（１９７５）Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．２９：２３９；Ｓｔｒａｕｓｓら、（１９７６）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．１７：１４０；Ｍｙｅｒｓら、（１９８０）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．３５：６６５；Ｊａｙら、（１９８１）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ７８：２９２７；Ｍｙｅｒｓら、（１９８１）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５６：５６７）；Ｅ２Ｂ（Ｃａｒｔｅｒ，Ａｄｅｎｏ－ＡｓｓｏｃｉａｔｅｄＶｉｒｕｓＨｅｌｐｅｒＦｕｎｃｔｉｏｎｓ，ｉｎＩＣＲＣＨａｎｄｂｏｏｋｏｆＰａｒｖｏｖｉｒｕｓｅｓ（Ｐ．Ｔｉｊｓｓｅｎ編、１９９０））；Ｅ３（Ｃａｒｔｅｒら（１９８３）、上記参照）；及びＥ４（Ｃａｒｔｅｒら（１９８３）、上記参照；Ｃａｒｔｅｒ（１９９５））が含まれる。

[0166]Ｅ１Ｂに変異を有するアデノウイルスにより提供されるヘルパータンパク質の研究により、ＥｌＢ５５ｋはＡＡＶビリオン産生に必要であるが、Ｅ１Ｂ１９ｋは必要ではないことが報告されている。さらに、国際公開第９７／１７４５８号及びＭａｔｓｈｕｓｈｉｔａら、（１９９８）ＧｅｎｅＴｈｅｒａｐｙ５：９３８－９４５には、様々なＡｄ遺伝子をコードするヘルパー機能ベクターが記載されている。ヘルパーベクターの例には、アデノウイルスＶＡＲＮＡコード領域、アデノウイルスＥ４ＯＲＦ６コード領域、アデノウイルスＥ２Ａ７２ｋＤコード領域、アデノウイルスＥ１Ａコード領域、及びインタクトのＥＩＢＳ５ｋコード領域が欠如したアデノウイルスＥ１Ｂ領域が含まれる（例えば、国際公開第０１／８３７９７号を参照されたい）。

[0167]「導入遺伝子」は、本明細書において、細胞又は生物に意図されるか又は導入された核酸を便宜上に指すために使用される。導入遺伝子には、転写物に転写されるか、ポリペプチド又はタンパク質をコードする遺伝子などの任意の核酸が含まれる。

[0168]「発現制御要素」とは、作動可能に連結された核酸の発現に影響を及ぼす核酸配列（複数可）を指す。プロモーター及びエンハンサーなどの本明細書に記載の発現制御要素を含む制御要素、ＡＡＶベクターを含むベクター配列は、１つ又は複数の「発現制御要素」を含むことができる。典型的には、そのような要素は、適切な異種ポリヌクレオチド転写及び、適切な場合、翻訳を促進するために含まれる（例えば、プロモーター、エンハンサー、イントロンのスプライシングシグナル、ｍＲＮＡのインフレーム翻訳を可能にする遺伝子の正しいリーディングフレームの維持、及び停止コドンなど）。そのような要素は典型的にはシスで作用し、「シス作用」要素と呼ばれるが、トランスで作用することもある。

[0169]発現制御は、転写、翻訳、スプライシング、メッセージ安定性などのレベルであり得る。典型的には、転写を調節する発現制御要素は、転写された核酸の５’末端（すなわち「上流」）付近に並置される。発現制御要素は、転写された配列の３’末端（つまり、「下流」）又は転写物内（例えば、イントロンの中）に配置することもできる。発現制御要素は、転写された配列に隣接するか、又は転写された配列から離れた位置に（例えば、ポリヌクレオチドから１～１０、１０～２５、２５～５０、５０～１００、１００～５００、又はそれ以上のヌクレオチド）かなりの距離でも配置できる。それにもかかわらず、ＡＡＶベクターなどの特定のベクターの長さの制限により、発現制御要素は、典型的には転写された核酸から１～１０００ヌクレオチド以内にあるだろう。

[0170]機能的に、作動可能に連結された核酸の発現は、要素が核酸の転写、及び必要に応じて転写物の翻訳を調節するように、要素（例えば、プロモーター）によって少なくとも部分的に制御可能である。発現制御要素の具体例はプロモーターであり、通常、転写された配列の５’に位置する。プロモーターは典型的には、プロモーターが存在しない場合に発現される量と比較して、作動可能に連結された核酸から発現される量を増加させる。

[0171]本明細書で使用される「エンハンサー」は、異種ポリヌクレオチドに隣接して位置する配列を指し得る。エンハンサー要素は、典型的にはプロモーター要素の上流に位置するが、機能することもあり、核酸配列の下流又は内部に位置することができる。したがって、エンハンサー要素は、核酸の上流又は下流に１００塩基対、２００塩基対、又は３００塩基対以上に位置することができる。エンハンサー要素は、典型的にはプロモーター要素によって与えられる発現よりも作動可能に連結された核酸の発現を増加させる。

[0172]発現構築物は、特定の細胞又は組織型で発現を促す役割を果たす調節要素を含み得る。発現制御要素（例えば、プロモーター）には、本明細書で「組織特異的発現制御要素／プロモーター」と呼ばれる特定の組織又は細胞型で活性なものが含まれる。組織特異的発現制御要素は典型的には、特定の細胞又は組織で活性である（例えば、肝臓）。発現制御要素は、特定の細胞、組織、又は器官の型に固有の転写活性化因子タンパク質、又は転写の他の調節因子によって認識されるため、特定の細胞、組織、又は器官で典型的には活性である。そのような調節要素は、当業者に知られている（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら（１９８９）及びＡｕｓｕｂｅｌら（１９９２）を参照されたい）。

[0173]本発明のプラスミドへの組織特異的調節要素の組み込みは、核酸の発現のための少なくとも部分的な組織親和性を提供する。肝臓で活性なプロモーターの例には、とりわけ、ＴＴＲプロモーター（例えば、変異ＴＴＲプロモーター）、ヒトα１アンチトリプシン（ｈＡＡＴ）プロモーター；アルブミン、Ｍｉｙａｔａｋｅら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．、７１：５１２４－３２（１９９７）；Ｂ型肝炎ウイルスコアプロモーター、Ｓａｎｄｉｇら、ＧｅｎｅＴｈｅｒ．３：１００２－９（１９９６）；α－フェトプロテイン（ＡＦＰ）、Ａｒｂｕｔｈｎｏｔら、Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ．Ｔｈｅｒ．、７：１５０３－１４（１９９６）］がある。肝臓で活性なエンハンサーの例には、アポリポタンパク質Ｅ（ａｐｏＥ）ＨＣＲ－１及びＨＣＲ－２がある（Ａｌｌａｎら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２７２：２９１１３－１９（１９９７））。

[0174]発現制御要素には、多くの異なる細胞型においてポリヌクレオチドの発現を促すことができる遍在性又は無差別的なプロモーター／エンハンサーも含まれる。そのような要素には、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）の最初期プロモーター／エンハンサー配列、ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）プロモーター／エンハンサー配列、及び様々な哺乳類細胞タイプで活性な他のウイルスプロモーター／エンハンサー、又は自然界に存在しない合成要素（例えば、Ｂｏｓｈａｒｔら、Ｃｅｌｌ、４１：５２１－５３０（１９８５）を参照されたい）、ＳＶ４０プロモーター、ジヒドロ葉酸レダクターゼプロモーター、細胞質β－アクチンプロモーター、並びにホスホグリセロールキナーゼ（ＰＧＫ）プロモーターが含まれるが、これらに限定されない。

[0175]発現制御要素はまた、調節可能であるように発現を付与することができる。すなわち、シグナル又は刺激により、作動可能に連結された異種ポリヌクレオチドの発現を上昇又は減少させる。シグナル又は刺激に応答して作動可能に連結されたポリヌクレオチドの発現を上昇させる調節可能な要素は、「誘導性要素」とも呼ばれる（すなわち、シグナルによって誘導される）。特定の例には、ホルモン（例えば、ステロイド）誘導性プロモーターが含まれるが、これに限定されない。典型的には、このような要素によって与えられる上昇又は減少の量は、存在するシグナル又は刺激の量に比例する；シグナル又は刺激の量が多いほど、発現の上昇又は減少が大きくなる。特定の非限定的な例には、亜鉛誘導性ヒツジメタロチオニン（ＭＴ）プロモーター；ステロイドホルモン誘導性マウス乳腺腫瘍ウイルス（ＭＭＴＶ）プロモーター；Ｔ７ポリメラーゼプロモーターシステム（国際公開第９８／１００８８号）；テトラサイクリン抑制システム（Ｇｏｓｓｅｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８９：５５４７－５５５１（１９９２））；テトラサイクリン誘導システム（Ｇｏｓｓｅｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ２６８：１７６６～１７６９（１９９５）；Ｈａｒｖｅｙら、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．２：５１２－５１８（１９９８）もまた参照されたい）；ＲＵ４８６誘導システム（Ｗａｎｇら、Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．１５：２３９－２４３（１９９７）及びＷａｎｇら、ＧｅｎｅＴｈｅｒ．４：４３２－４４１（１９９７））；及びラパマイシン誘導システム（Ｍａｇａｒｉら、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．１００：２８６５－２８７２（１９９７）；Ｒｉｖｅｒａら、Ｎａｔ．Ｍｅｄｉｃｉｎｅ．２：１０２８－１０３２（１９９６））が含まれる。この文脈で有用かもしれない他の調節可能な制御要素は、特定の生理学的状態、例えば体温、急性期、発生によって調節されるものがある。

[0176]発現制御要素には、核酸の天然要素（複数可）も含まれる。異種ポリヌクレオチドの発現が天然の発現を模倣することが望ましい場合、天然の制御要素（例えば、プロモーター）を使用してもよい。異種ポリヌクレオチドの発現が時間的又は発生的に、又は組織特異的な方法で、又は特定の転写刺激に応答して調節される場合、天然要素を使用してもよい。イントロン、ポリアデニル化部位又はＫｏｚａｋコンセンサス配列などの他の天然の発現制御要素も使用できる。

[0177]「作動可能に連結された」という用語は、コード配列の発現に必要な調節配列が、コード配列の発現をもたらすようにコード配列に対して適切な位置に配置されることを意味する。この同じ定義は時折、発現ベクター内のコーディング配列及び転写制御要素（例えば、プロモーター、エンハンサー、及び終結要素）の配置に適用される。この定義は時折、ハイブリッド核酸分子が生成される第１及び第２の核酸分子の核酸配列の配置にも適用される。

[0178]核酸と作動可能に連結した発現制御要素の例において、その関係は、制御要素が核酸の発現を調節するようなものである。より詳細には、例えば、作動可能に連結された２つのＤＮＡ配列は、少なくとも１つのＤＮＡ配列が他の配列に生理学的効果を及ぼすことができるような関係で２つのＤＮＡが配置（シス又はトランス）されることを意味する。

[0179]したがって、ベクターの追加要素には、ＡＡＶＩＴＲシーケンスの１つ又は複数のコピー、又はイントロンなどの配列に隣接する、発現制御（例えば、プロモーター／エンハンサー）要素、転写終結シグナル又は停止コドン、５’又は３’非翻訳領域（例えば、ポリアデニル化（ｐｏｌｙＡ）配列）が含まれるが、これらに限定されない。

[0180]さらなる要素には、例えば、パッケージングを改善し、混入核酸の存在を低減する、例えば、フィラー又はスタッファーポリヌクレオチド（ｆｉｌｌｅｒｏｒｓｔｕｆｆｅｒｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ）配列が含まれる。ＡＡＶベクターは、典型的には、一般に約４ｋｂ～約５．２ｋｂ又はそれよりわずかに大きいサイズ範囲を有するＤＮＡの挿入物を許容する。したがって、より短い配列については、ウイルス粒子へのＡＡＶベクターのパッケージングに許容可能なウイルスゲノム配列の長さをほぼ又は通常のサイズに調整するために、スタッファー又はフィラーを含める。様々な実施形態において、フィラー／スタッファー核酸配列は、核酸の非翻訳（非タンパク質コード化）セグメントである。４．７Ｋｂ未満の核酸配列について、フィラー又はスタッファーポリヌクレオチド配列は、配列と組み合わされる（例えば、ベクターに挿入される）と、約３．０～５．５Ｋｂ、又は約４．０～５．０Ｋｂ、又は約４．３～４．８Ｋｂの全長を有する長さである。

[0181]イントロンはまた、ウイルス粒子へのＡＡＶベクターパッケージングの長さを達成するために、フィラー又はスタッファーポリヌクレオチド配列として機能することができる。フィラー又はスタッファーポリヌクレオチド配列として機能するイントロン及びイントロン断片もまた、発現を増強できる。

[0182]「核酸」又は「プラスミド」によってコードされる「ポリペプチド」、「タンパク質」及び「ペプチド」には、天然に存在する野生型タンパク質と同様に、完全長の天然配列、及び天然の全長タンパク質のある程度の機能性を保持している限り、機能的部分配列、修飾型、配列変異体が含まれる。例えば、タンパク質は欠失、置換又は付加を有し、少なくとも部分的な機能又は活性を保持することができる。

[0183]用語「修飾」又は「変異体」及びそれらの文法的なバリエーションは、核酸又はポリペプチドが参照配列から逸脱することを意味する。したがって、修飾及び変異体配列は、参照配列と実質的に同じ、より大きい又はより小さい発現、活性又は機能を有し得るが、少なくとも参照配列の部分的な活性又は機能を保持する。

[0184]修飾の非限定的な例には、１つ又は複数のヌクレオチド又はアミノ酸置換が含まれる（例えば、１～３、３～５、５～１０、１０～１５、１５～２０、２０～２５、２５～３０、３０～４０、４０～５０、５０～１００、１００～１５０、１５０～２００、２００～２５０、２５０～５００、５００～７５０、７５０～８５０以上のヌクレオチド又は残基）。

[0185]アミノ酸修飾の例には、保存的アミノ酸置換又は参照配列の欠失（例えば、部分配列又は断片）がある。詳細な実施形態において、修飾された配列又は変異体配列は、修飾されていない配列の機能又は活性の少なくとも一部を保持する。

[0186]転写される核酸の全ての哺乳動物及び非哺乳動物の形態、及びタンパク質をコードする核酸が含まれる。したがって、本発明は、ヒトの遺伝子及びタンパク質と実質的に同様に機能する、非哺乳動物、ヒト以外の哺乳動物、及びヒト由来の遺伝子及びタンパク質を含む。

[0187]本明細書に記載の細胞トランスフェクション及び／又は組換えウイルス（例えば、ＡＡＶ）ベクターの産生後、所望であれば、ウイルス（例えば、ｒＡＡＶ）ビリオンを細胞／細胞培養液から収集／収穫し、任意選択で精製及び／又は、様々な従来の方法を使用してトランスフェクトされた細胞から単離することができる。そのような方法には、カラムクロマトグラフィー、ＣｓＣＩ勾配などが含まれる。例えば、陰イオン交換カラム、親和性カラム及び／又は陽イオン交換カラムでの精製などの複数のカラム精製ステップを使用することができる。（例えば、国際公開第０２／１２４５５号及び米国特許出願公開第２００３０２０７４３９号を参照されたい）。或いは、又はさらに、ＣｓＣｌ勾配ステップが使用できる（例えば、米国特許出願公開第２０１２０１３５５１５号；及び２０１３００７２５４８号を参照されたい）。さらに、感染性ウイルスの使用がパッケージング及び／又はヘルパータンパク質の発現に使用される場合、様々な方法を使用して、残ったウイルスを不活化することができる。例えば、アデノウイルスは、約６０℃の温度に、例えば２０分以上、加熱することにより不活性化することができる。ヘルパーアデノウイルスは熱に不安定であるが、ＡＡＶは熱安定性であるため、この処理はヘルパーウイルスを効果的に不活性化する。

[0188]「単離された」という用語は、組成物の改変として使用される場合、組成物が人間の手によって作られるか、又は天然に存在するインビボ環境から、完全に又は少なくとも部分的に、分離されることを意味する。一般的に、単離された組成物は、それらが自然界で通常付随する１つ又は複数の物質、例えば、タンパク質、核酸、脂質、炭水化物、細胞膜などの１つ又は複数の汚染物質を実質的に含まない。

[0189]ＲＮＡ分子に関して、「単離された」という用語は主に、上で定義された単離されたＤＮＡ分子によりコードされるＲＮＡ分子を指す。或いは、この用語は、「実質的に純粋な」形態で存在するように、自然状態（すなわち、細胞内又は組織内）で会合するであろうＲＮＡ分子から十分に分離されたＲＮＡ分子を指してもよい（「実質的に純粋」という用語は、以下で定義される）。

[0190]タンパク質に関して、「単離されたタンパク質」又は「単離及び精製されたタンパク質」という用語は、本明細書において時々使用される。この用語は、主に、単離された核酸分子の発現によって産生されるタンパク質を指す。或いは、この用語は、「実質的に純粋な」形態で存在するように、自然に関連するであろう他のタンパク質から十分に分離されたタンパク質を指してもよい。

[0191]「単離された」という用語は、人間の手によって産生される組み合わせ、例えば組換えベクター（例えば、ｒＡＡＶ）配列、又はベクターゲノム及び医薬製剤をパッケージング又はキャプシド化するウイルス粒子を除外しない。「単離された」という用語は、ハイブリッド／キメラ、マルチマー／オリゴマー、修飾（例えば、リン酸化、グリコシル化、脂質化）又は誘導体形態、又は人の手で産生された宿主細胞で発現された形態など、組成物の代替的な物理形態も除外しない。

[0192]「実質的に純粋な」という用語は、少なくとも５０～６０重量％の目的の化合物（例えば、核酸、オリゴヌクレオチド、タンパク質など）を含む調製物を指す。調製物は、少なくとも７５重量％、又は約９０～９９重量％の目的の化合物を含み得る。純度は、目的の化合物に適した方法（例えば、クロマトグラフィー法、アガロース又はポリアクリルアミドゲル電気泳動、ＨＰＬＣ分析など）により測定される。

[0193]核酸分子、発現ベクター（例えば、ベクターゲノム）、プラスミドは、組換えＤＮＡ技術法を使用することにより調製されてもよい。ヌクレオチド配列情報を利用することにより、様々な手段により単離された核酸分子を調製することができる。例えば、核酸（例えば、プラスミド）は、細胞発現又はインビトロ翻訳及び化学合成技術を介して、様々な標準的なクローニング、組換えＤＮＡ技術を使用して作成することができる。純度は、配列決定、ゲル電気泳動などによって決定できる。例えば、核酸は、ハイブリダイゼーション又はコンピューターベースのデータベーススクリーニング技術を使用して単離することができる。そのような技術には：（１）ゲノムＤＮＡ又はｃＤＮＡライブラリーとプローブとのハイブリダイゼーションにより、相同ヌクレオチド配列を検出する；（２）例えば、発現ライブラリーを使用して、構造的特徴を共有するポリペプチドを検出するための抗体スクリーニング；（３）目的の核酸配列にアニーリングできるプライマーを使用したゲノムＤＮＡ又はｃＤＮＡのポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）；（４）関連する配列の配列データベースのコンピューター検索；（５）サブトラクション核酸ライブラリーのディファレンシャルスクリーニングが含まれるが、これらに限定されない。

[0194]核酸は、任意の便宜的なクローニングベクターでＤＮＡとして維持され得る。一実施形態において、核酸はプラスミド内で維持される。或いは、核酸は、哺乳動物細胞での発現に適したベクターで維持され得る。

[0195]核酸、プラスミド、ベクター、発現ベクター（例えば、ｒＡＡＶ）、及び組換えウイルス粒子の方法及び使用により、遺伝病の治療が可能になる。欠乏状態の疾患については、遺伝子導入を使用することにより、置換療法のために正常な遺伝子を罹患組織に持ち込むことができると同時に、アンチセンス変異を使用して疾患の動物モデルを作成することができる。不均衡な疾患状態については、遺伝子導入を使用することにより、モデル系での疾患状態を作成することもでき、それを使用して疾患状態の中和を図ることができる。核酸配列の部位特異的組み込みを使用して欠陥を修正することもまた可能である。

[0196]ＡＡＶ血清型及びその変異体を含むレンチ及びパルボウイルスベクターのようなウイルスベクターは、細胞がコードされたタンパク質を発現するようにタンパク質をコードする核酸をエクスビボ、インビトロ及びインビボで細胞に送達する手段を提供する。ＡＡＶは、細胞に侵入して核酸／遺伝物質を導入させて、核酸／遺伝物質が細胞内で安定して維持することができるため、遺伝子治療ベクターとして有用なウイルスである。さらに、これらのウイルスは、例えば特定の部位に核酸／遺伝物質を導入することができる。ＡＡＶはヒトの病原性疾患に関連していないため、ＡＡＶベクターは実質的なＡＡＶの病因又は疾患を引き起こすことなく、ヒト患者に異種ポリヌクレオチド配列（例えば、治療用タンパク質及び薬剤）を送達することができる。

[0197]使用され得るウイルスベクターには、複数の血清型のアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクター（例えば、ＡＡＶ－１～ＡＡＶ－１２など）及びハイブリッド／キメラＡＡＶベクター、レンチウイルスベクター及び偽型レンチウイルスベクター（例えば、エボラウイルス、水疱性口内炎ウイルス（ＶＳＶ）、ネコ免疫不全ウイルス（ＦＩＶ））、単純ヘルペスウイルスベクター、アデノウイルスベクター（組織特異的プロモーター／エンハンサーの有無にかかわらず）、ワクシニアウイルスベクター、レトロウイルスベクター、レンチウイルスベクター、非ウイルスベクターなどが含まれるが、これらに限定されない。

[0198]ＡＡＶ及びレンチウイルス粒子は、効果的な遺伝子送達のための媒体として有利に使用され得る。そのようなビリオンは、細胞の分裂及び非分裂についての指向性を含むような用途のための多くの望ましい特徴を有する。これらのベクターを用いた初期の臨床経験も、持続的な毒性がないことが実証され、免疫応答も最小限であるか検出不可能であった。ＡＡＶは、受容体を介したエンドサイトーシス又はトランスサイトーシスにより、インビボ及びインビトロで幅広く様々な細胞に感染することが知られている。これらのベクター系は、網膜上皮、肝臓、骨格筋、気道、脳、関節、及び造血幹細胞を標的とするヒトにおいて試験されている。例えば、プラスミドＤＮＡ又はミニサークルに基づく非ウイルスベクターもまた、適切な遺伝子導入ベクターである。

[0199]したがって、本発明の様々な実施形態において、ベクターは、アデノウイルスベクターのようなレンチウイルス又はパルボウイルスベクターを含む。詳細な実施形態において、組換えベクターはパルボウイルスベクターである。パルボウイルスは、一本鎖ＤＮＡゲノムを持つ小さなウイルスである。「アデノ随伴ウイルス」（ＡＡＶ）はパルボウイルス科である。

[0200]ＡＡＶベクター及びレンチウイルスベクターは、病因に関連するウイルス遺伝子を典型的には含まない。そのようなベクターは、典型的には、例えばｒｅｐ及び／又はｃａｐ遺伝子など、１つ又は複数の野生型ＡＡＶ遺伝子の全体又は一部が削除されているが、レスキュー、複製、及び組換えベクターのＡＡＶベクター粒子へのパッケージングに必要な少なくとも１つの機能的な隣接ＩＴＲ配列を保持している。例えば、ベクターの必須部分、例えばＩＴＲ及びＬＴＲ要素のみがそれぞれ含まれる。したがって、ＡＡＶベクターゲノムには、複製及びパッケージングのためにシスに必要な配列（例えば、機能的なＩＴＲ配列）が含まれるであろう。

[0201]組換えＡＡＶベクター、並びにその方法及び使用には、任意のウイルス株又は血清型が含まれる。非限定的な例として、組換えＡＡＶベクターは、例えば、ＡＡＶ－１、－２、－３、－４、－５、－６、－７、－８、－９、－１０、－１１、－１２、又はＡＡＶ－２ｉ８などの任意のＡＡＶゲノムに基づくことができる。そのようなベクターは、同じ株又は血清型（又はサブグループ又は変異体）に基づいていても、互いに異なっていてもよい。非限定的な例として、１つの血清型ゲノムに基づく組換えＡＡＶベクターは、ベクターをパッケージする１つ又は複数のキャプシドタンパク質と同一であり得る。さらに、組換えＡＡＶベクターゲノムは、ベクターをパッケージングする１つ又は複数のＡＡＶキャプシドタンパク質とは異なるＡＡＶ（例えば、ＡＡＶ２）血清型ゲノムに基づいていてもよい。例えば、ＡＡＶベクターゲノムはＡＡＶ２に基づくことができ、３つのキャプシドタンパク質の少なくとも１つは例えば、ＡＡＶ１、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、又はＡＡＶ－２ｉ８又はその変異体であり得る。ＡＡＶ変異体には、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２ＡＡＶ－２ｉ８、配列番号１及び配列番号２のキャプシドの変異体及びキメラが含まれる。

[0202]詳細な実施形態において、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターには、例えば、国際公開第２０１３／１５８８７９号（国際出願ＰＣＴ／ＵＳ２０１３／０３７１７０）、国際公開第２０１５／０１３３１３号（国際出願ＰＣＴ／ＵＳ２０１４／０４７６７０）及び米国特許出願公開第２０１３／００５９７３２号（米国特許出願第１３／５９４，７７３、ＬＫ０１、ＬＫ０２、ＬＫ０３などを開示）に記載されるような、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、ＡＡＶ－２ｉ８、配列番号１及び配列番号２、並びにその変異体（例えば、アミノ酸挿入、付加、置換及び欠失などのキャプシド変異体）が含まれる。

[0203]ＡＡＶ及びＡＡＶ変異体（例えば、キャプシド変異体）血清型（例えば、ＶＰ１、ＶＰ２、及び／又はＶＰ３配列）は、例えば、ＡＡＶ１～ＡＡＶ１２を含む他のＡＡＶ血清型と異なる場合と異ならない場合とがある（例えば、ＡＡＶ１～ＡＡＶ１２血清型のいずれかのＶＰ１、ＶＰ２、及び／又はＶＰ３配列とは異なる）。

[0204]本明細書で使用される場合、「血清型」という用語は、他のＡＡＶ血清型と血清学的に異なるキャプシドを有するＡＡＶを指すために使用される区別法である。血清学的特徴は、別のＡＡＶと比較して、１つのＡＡＶに対する抗体間の交差反応性の欠如に基づいて決定される。そのような交差反応性の差異は、通常、キャプシドタンパク質配列／抗原決定基の違いによる（例えば、ＡＡＶ血清型のＶＰ１、ＶＰ２、及び／又はＶＰ３配列の違いによる）。キャプシド変異体を含むＡＡＶ変異体は、参照ＡＡＶ又は他のＡＡＶ血清型と血清学的に区別されない可能性があるにもかかわらず、参照又は他のＡＡＶ血清型と比較して少なくとも１つのヌクレオチド又はアミノ酸残基が異なる。

[0205]従来の定義では、血清型は、目的のウイルスを中和活性について全ての既存及び特徴付けられた血清型の血清特異性に対して試験し、目的のウイルスを中和する抗体は見出されなかったことを意味する。より天然に存在するウイルス分離株が発見される、及び／又はキャプシド変異体が生成されると、現在存在する血清型のいずれかと血清学的な違いがある場合とない場合があり得る。したがって、新しいウイルス（例えば、ＡＡＶ）に血清学的な違いがない場合、この新しいウイルス（例えば、ＡＡＶ）は、対応する血清型のサブグループ又は変異体になるであろう。多くの場合、キャプシド配列が改変された変異ウイルスに対して、それらが血清型の従来の定義に従って他の血清型であるかどうかを判定するための中和活性についての血清学的検査はまだ行われていない。したがって、便宜のために及び繰り返しを避けるために、「血清型」という用語は、血清学的に異なるウイルス（例えば、ＡＡＶ）並びに、血清学的に異なっておらず、ある血清型のサブグループ又は変異体の内にあり得るウイルス（例えば、ＡＡＶ）の両方を広く指す。

[0206]様々な例示的な実施形態において、参照血清型に関連するＡＡＶベクターは、１つ又は複数のＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、ＡＡＶ－２ｉ８、配列番号１又は配列番号２と少なくとも８０％以上（例えば、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．１％、９９．２％、９９．３％、９９．４％、９９．５％など）同一な配列（例えば、ＩＴＲ、又はＶＰ１、ＶＰ２、及び／又はＶＰ３配列のような）を含むか、又はからなるポリヌクレオチド、ポリペプチド又はその部分配列を有する。

[0207]本発明の組成物、方法及び使用には、ＡＡＶ配列（ポリペプチド及びヌクレオチド）、及びＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、又はＡＡＶ－２ｉ８のような参照ＡＡＶ血清型と１００％未満の配列同一性を示すその部分配列が含まれるが、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、又はＡＡＶ－２ｉ８、遺伝子又はタンパク質などのような既知のＡＡＶ遺伝子又はタンパク質とは異なり、同一ではない。一実施形態において、ＡＡＶポリペプチド又はその部分配列は、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、ＡＡＶ－２ｉ８、配列番号１又は配列番号２のような任意の参照ＡＡＶ配列又はその部分配列（例えば、ＶＰ１、ＶＰ２及び／又はＶＰ３キャプシド又はＩＴＲ）と少なくとも７５％以上同一、例えば８０％、８５％、８５％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．１％、９９．２％、９９．３％、９９．４％、９９．５％など、１００％まで同一である配列を含むか、又はからなる。特定の態様において、ＡＡＶ変異体は、１、２、３、４、５、５～１０、１０～１５、１５～２０個又はそれ以上のアミノ酸置換を有する。

[0208]ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、ＡＡＶ－２ｉ８、配列番号１又は配列番号２を含む組換えＡＡＶベクター、及び変異体、関連、ハイブリッド及びキメラ配列は、１つ又は複数の機能的ＡＡＶＩＴＲ配列に隣接した１つ又は複数の核酸配列（導入遺伝子）を含むように、当業者に知られている組換え技術を使用して構築することができる。

[0209]核酸（プラスミド）、ベクター、組換えベクター（例えば、ｒＡＡＶ）、及び組換えウイルス粒子を医薬組成物に組み込むことができる。そのような医薬組成物は、とりわけ、インビボ又はエクスビボでの対象への投与及び送達に有用である。詳細な実施形態において、医薬組成物は、医薬的に許容される担体又は賦形剤を含む。そのような賦形剤には、組成物を受けている個人に有害な免疫応答をそれ自体で誘発せず、過度の毒性なく投与できる、任意の医薬品が含まれる。

[0210]本明細書で使用される「医薬的に許容される」及び「生理学的に許容される」という用語は、１つ又は複数の投与経路、インビボ送達又は接触に適した、生物学的に許容される製剤、気体、液体又は固体、又はそれらの混合物を意味する。「医薬的に許容される」又は「生理学的に許容される」組成物は、生物学的又はその他の点で望ましくないものではない材料である。例えば、その材料は実質的に望ましくない生物学的効果を引き起こすことなく対象に投与することができる。したがって、そのような医薬組成物は、例えば、対象に核酸、ベクター、ウイルス粒子又はタンパク質を投与することに使用され得る。

[0211]医薬的に許容される賦形剤には、水、生理食塩水、グリセロール、糖及びエタノールなどの液体が含まれるが、これらに限定されない。医薬的に許容される塩、例えば、塩酸塩、臭化水素酸塩、リン酸塩、硫酸塩のような鉱酸塩；酢酸塩、プロピオン酸塩、マロン酸塩、安息香酸塩のような有機酸の塩もまたその中に含まれてもよい。さらに、湿潤剤又は乳化剤、ｐＨ緩衝物質などの補助物質が、そのような媒体に存在してもよい。

[0212]医薬組成物は、塩として提供されてもよく、塩酸、硫酸、酢酸、乳酸、酒石酸、リンゴ酸、コハク酸などを含むがこれらに限定されない、多くの酸で形成することができる。塩は、対応する遊離塩基の形態よりも水溶液又は他のプロトン性溶媒により溶けやすい傾向がある。他の場合において、製剤は凍結乾燥粉末であり：１～５０ｍＭヒスチジン、０．１％～２％スクロース、及び２～７％マンニトールのいずれか又は全てを含んでもよく、４．５～５．５のｐＨ範囲で、使用前に緩衝液と混ぜ合わせる。

[0213]医薬組成物には、医薬投与又はインビボ接触又は送達に適合した、溶媒（水性又は非水性）、溶液（水性又は非水性）、エマルジョン（例えば、水中油又は油中水）、懸濁液、シロップ、エリキシル、分散媒体及び懸濁媒体、コーティング、等張剤並びに吸収促進剤又は遅延剤が含まれる。水性及び非水性溶媒、溶液及び懸濁液は、懸濁化剤及び増粘剤を含んでもよい。そのような医薬的に許容される担体には、錠剤（コーティング又は非コーティング）、カプセル（ハード又はソフト）、マイクロビーズ、粉末、顆粒、及び結晶が含まれる。補助的な活性化合物（例えば、防腐剤、抗菌剤、抗ウイルス剤、抗真菌剤）もまた、組成物に組み込むことができる。

[0214]医薬組成物は、特定の投与又は送達経路に適合するように製剤化することができる。したがって、医薬組成物は、様々な経路による投与に適した担体、希釈剤、又は賦形剤を含む。

[0215]組成物及び方法は無菌条件であってもよい。そのようなプロセスに適した容器内で組成物を作製し、方法を行うことができる。このような容器には、皿、フラスコ、ローラーボトル、バッグ、バイオリアクター、容器、チューブ、バイアルなどが含まれる。容器は、ポリスチレン、ポリブチレン、ポリプロピレンなどのガラス、プラスチック及びポリマーを含むがこれらに限定されない材料で作られ得る。

[0216]組成物及び方法のステップは、指定された順序、又は再編成された順序で行ってもよい。方法のステップは、段階的に、又は時間を挟んで間隔を置いて行うことができる。言い換えると、方法のステップが行われ、その後、次のステップ間の時間間隔が生じてもよく、そのような間隔は、例えば、約１秒～約６０秒；約１分～約６０分；約１時間～約２４時間；約１日～約７日；又は約１週間～約４８週間の範囲である。

[0217]アデノウイルスベクターの生成のためのプロトコルは、米国特許第５，９９８，２０５号；第６，２２８，６４６号；第６，０９３，６９９号；及び第６，１００，２４２号；及び国際特許第９４／１７８１０号及び国際特許第９４／２３７４４号に記載されており、これらはその全体が参照により本明細書に組み込まれる。

[0218]本発明は、ヒト及び獣医学医療用途のための細胞及びベクターの産生に有用である。したがって、適切な対象には、ヒトのような哺乳動物、並びに非ヒト哺乳動物が含まれる。「対象」という用語は、動物、典型的にはヒト、非ヒト霊長類（類人猿、テナガザル、ゴリラ、チンパンジー、オランウータン、マカク）、家畜（イヌ及びネコ）、農業動物（トリやアヒル、ウマ、ウシ、ヤギ、ヒツジ、ブタのような家禽）、及び実験動物（マウス、ラット、ウサギ、モルモット）のような哺乳類を指す。ヒト対象には、胎児、新生児、乳児、少年、成人の対象が含まれる。対象には、動物疾患モデル、例えば、ＨｅｍＡなどの血液凝固疾患のマウス及び他の動物モデル、並びに当業者に知られている他の動物モデルが含まれる。

[0219]本明細書で使用される「単位剤形」は、治療される対象についての単位用量として適した物理的に分離した単位を指す；各ユニットは、１つ又は複数の用量で投与された場合に、所望の効果（例えば、予防効果又は治療効果）を生じるように計算される医薬担体（賦形剤、希釈剤、媒体又は充填剤）と任意選択で関連する所定の量を含む。単位剤形は、液体組成物、又は凍結乾燥又は凍結乾燥状態の組成物を含み得る、例えば、アンプル及びバイアル内にあってもよい；例えば、滅菌液体担体を、インビボでの投与又は送達の前に加えることができる。個々の単位剤形は、複数回投与キット又は容器に含めることができる。組換えベクター（例えば、ｒＡＡＶ）配列、組換えウイルス粒子、及びそれらの医薬組成物は、投与の容易さ及び投与量の均一性のために、単一又は複数の単位剤形に包装することができる。

[0220]本発明は、包装材料及びその中に１つ又は複数の構成物を備えたキットを提供する。キットは、典型的には、その中に構成物の説明又は構成物の使用説明書を含むラベル又はパッケージ挿入物を含む。キットは、そのような構成物のコレクション、例えば、核酸（プラスミド）、ＰＥＩ、増強剤、細胞を含むことができる。

[0221]キットは、キットの１つ又は複数の構成物を収容する物理的構造を指す。包装材料は、構成物を滅菌状態に維持することができ、そのような目的に一般的に使用される材料（例えば、紙、段ボール、ガラス、プラスチック、ホイル、アンプル、バイアル、チューブなど）で作ることができる。

[0222]ラベル又は挿入物は、その中の１つ又は複数の構成物の識別情報を含むことができる。ラベル又は挿入物には、製造業者、ロット番号、製造場所と日付、有効期限を示す情報を含めることができる。ラベル又は挿入物には、製造業者情報、ロット番号、製造業者の場所及び日付を示す情報を含めることができる。ラベル又は挿入物には、方法、使用、又は製造プロトコルについて、１つ又は複数のキット構成物を使用するための取扱説明書を含めることができる。取扱説明書には、組成物の作成又は本明細書に記載の方法のいずれかを行うための説明を含めることができる。

[0223]ラベル又は挿入物には、構成物、キット若しくは包装材料（例えば、箱）とは別個に又は添付した、又はキット構成物を含むアンプル、チューブ若しくはバイアルに取り付けた、「印刷物」、例えば紙若しくは厚紙、が含まれる。ラベル又は挿入物には、バーコード印刷ラベル、ディスク、ＣＤ－又はＤＶＤ－ＲＯＭ／ＲＡＭなどの光ディスク、ＤＶＤ、ＭＰ３、磁気テープ、又はＲＡＭ及びＲＯＭのような電子ストレージメディア、又は磁気／光ストレージメディア、フラッシュメディア、メモリタイプカードなどこれらのハイブリッドのようなコンピューター可読媒体が付加的に含まれてもよい。

[0224]他に定義されない限り、本明細書で使用される全ての技術及び科学用語は、本発明が属する分野の当業者によって一般に理解されるものと同じ意味を有する。本明細書に記載のものと同様又は同等の方法及び材料が本発明の実施又は試験に使用され得るが、適切な方法及び材料は本明細書に記載されている。

[0225]本明細書に引用される全ての特許、特許出願、刊行物、及び他の参考文献、ＧｅｎＢａｎｋ引用及びＡＴＣＣ引用は、その全体が参照により組み込まれる。矛盾する場合、定義を含む明細書が支配する。

[0226]本発明の生体分子に関連する様々な用語は、上記及び同様に本明細書及び特許請求の範囲全体にわたって使用されている。

[0227]本明細書に開示される特徴の全ては、任意の組み合わせで組み合わされてもよい。明細書で開示される各々の特徴は、同じ、同等、又は同様の目的を果たす代替的特徴に置き換えることができる。したがって、他に明記しない限り、開示される特徴（例えば、ＰＥＩ、プラスミド、ベクター（例えば、ｒＡＡＶ、又は組換えウイルス粒子）は、同等又は同様の特徴の属の一例である。

[0228]本明細書で使用される単数形「ａ」、「ａｎｄ」、及び「ｔｈｅ」は、文脈が明らかに他を示していない限り、複数の指示対象を含む。したがって、例えば、「プラスミド」又は「核酸」への参照には複数のそのようなプラスミド又は核酸が含まれ、「ベクター」への参照には複数のそのようなベクターが含まれ、「ウイルス」又は「粒子」への参照には複数のそのようなウイルス／粒子が含まれ、「増強剤」への参照は複数のそのような薬剤が含まれる。

[0229]本明細書で使用される場合、全ての数値又は数値範囲は、文脈が明らかに他を示していない限り、そのような範囲内の整数及びその値の小数部分又は範囲内の整数を含む。したがって、８０％以上の属性への参照には、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％など、並びに８１．１％、８１．２％、８１．３％、８１．４％、８１．５％など、８２．１％、８２．２％、８２．３％、８２．４％、８２．５％など、及びその他を含む。

[0230]より多い（より大きい）又はより小さい整数への参照は、それぞれの参照数より大きい又は小さい任意の数を含む。したがって、例えば、１００未満への参照には、９９、９８、９７など、１に至るまでの数が含まれ、１０未満の場合は、９、８、７など、１に至るまでの数が含まれる。

[0231]本明細書で使用される場合、全ての数値又は範囲は、文脈が明らかに他を示していない限り、そのような範囲内の値及び整数の小数部分及びそのような範囲内の整数の小数部分を含む。したがって、説明として、１～１０などの数値範囲への参照には、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、並びに１．１、１．２、１．３、１．４、１．５など、及びその他が含まれる。したがって、１～５０の範囲への参照には、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０など、５０を含めて５０に至るまで、並びに１．１、１．２、１．３、１．４、１．５など、２．１、２．２、２．３、２．４、２．５など、及びその他が含まれる。

[0232]一連の範囲への参照は、その一連の内の異なる範囲の境界の値を結合する範囲を含む。したがって、説明のため、例えば１～１０、１０～２０、２０～３０、３０～４０、４０～５０、５０～６０、６０～７５、７５～１００、１００～１５０、１５０～２００、２００～２５０、２５０～３００、３００～４００、４００～５００、５００～７５０、７５０～８５０の一連の範囲への参照には、１～２０、１～３０、１～４０、１～５０、１～６０、１０～３０、１０～４０、１０～５０、１０～６０、１０～７０、１０～８０、２０～４０、２０～５０、２０～６０、２０～７０、２０～８０、２０～９０、５０～７５、５０～１００、５０～１５０、５０～２００、５０～２５０、１００～２００、１００～２５０、１００～３００、１００～３５０、１００～４００、１００～５００、１５０～２５０、１５０～３００、１５０～３５０、１５０～４００、１５０～４５０、１５０～５００など。

[0233]本発明は、多数の実施形態及び態様を説明するために肯定的な言葉を使用して本明細書で一般的に開示される。本発明には、物質又は材料、方法のステップ及び条件、プロトコル、又は手順など、特定の要件が全て又は部分的に除外される実施形態もまた特に含まれる。例えば、本発明の特定の実施形態又は態様において、材料及び／又は方法のステップは除外される。したがって、本発明では、本発明が含まない本発明において明確に除外されていない態様に関しては、本明細書内に一般に表されていないが、それにもかかわらず本明細書で開示されたものとする。

[0234]本発明の多くの実施形態が説明された。それにもかかわらず、当業者は、本発明の趣旨及び範囲から逸脱することなく、本発明に様々な変更及び修正を施して、様々な使用法及び条件に適合させることができる。したがって、以下の実施例は例示を意図したものであり、特許請求された発明の範囲を限定するものでは決してない。

実施例１
代表的な材料と方法
[0235]細胞培養液：ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（Ｒ７９００７）から購入したフリースタイル（商標）２９３Ｆ（ＨＥＫ２９３Ｆ）細胞を、１ｘグルタマックス（ＧｌｕｔａＭＡＸ）（商標）（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、３５０５０－０６１）及び１ｘアンチバイオティック－アンチマイコティック（Ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃ－ａｎｔｉｍｙｃｏｔｉｃ）（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、１５２４０）を補充したフリースタイル（商標）Ｆ１７（Ｆ１７）発現培地（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ａ１３８３５０１）で培養した。細胞は、スピナーフラスコ（Ｃｏｒｎｉｎｇ、３１５２又は３１５３）、振盪フラスコ（Ｃｏｒｎｉｎｇ４３１１４３、又は４３１１４５）又はバイオリアクターで培養した。スピナー／振盪フラスコでは、３７℃のインキュベーターで１７０ｒｐｍの攪拌と８％ＣＯ_２の加湿雰囲気で細胞を培養した；バイオリアクター（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ、ＤＡＳＧＩＰパラレルバイオリアクターシステム、ガラス容器及び使い捨て容器）では、プログラムされたパラメーター（ＤＯ４０％、ｐＨ７．２、１３０ｒｐｍ、１５０ｒｐｍ又は１７０ｒｐｍでの攪拌）によって細胞培養液を制御した。典型的には、０．２５～０．５×１０^６／ｍＬで細胞を播種し、細胞密度がおよそ２～３×１０^６／ｍＬに達したときに新鮮な細胞培養液培地を添加することにより、２～３日ごとに継代培養した。細胞密度及び生存率は、Ｖｉ－ｃｅｌｌ（商標）ＸＲ細胞生存率解析機（ＢｅｃｋｍａｎＣｏｕｌｔｅｒ）を使用して決定した。

[0236]プラスミド：組換えアデノ随伴ウイルスベクター（ｒＡＡＶ）を作製するために３つのプラスミドを使用した：１）ＩＴＲが隣接したｈＦＶＩＩＩを含む導入遺伝子プラスミド、２）ｒｅｐ及びｃａｐ遺伝子を含むパッケージングプラスミド、３）アデノウイルスを含むアデノウイルスヘルパープラスミドＥ２、Ｅ４及びＶＡＲＮＡ遺伝子。全てのプラスミドは、Ａｌｄｅｖｒｏｎにより製造されたものを購入した。

[0237]ＰＥＩ溶液の調製：直鎖ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）「Ｍａｘ」４０ＫＤａ（Ｐｏｌｙｓｃｉｅｎｃｅｓ、２４７６５－２、直鎖ＰＥＩ２５ＫＤａの塩酸塩）をトランスフェクション試薬として使用した。トランスフェクション最適化研究のために、ＰＥＩ“Ｍａｘ”を５ｍＭＴｒｉｓに溶解して０．５ｍｇ／ｍＬ溶液を作成し、溶液をｐＨ７．０、７．１、７．２、７．３、７．４、７．６、７．８、又は８．０を含む異なるｐＨに調整した。いくつかの研究の後、最高のトランスフェクションとｒＡＡＶ産生の理由で、特定されない場合は、ｐＨ７．１のＰＥＩ溶液が全ての研究に選択された。

[0238]ＰＥＩ媒介トランスフェクションにおける増強剤の使用：トランスフェクション及びｒＡＡＶ産生におけるその効果について評価された潜在的なトランスフェクション増強剤は、エクスピフェクタミン（ＥｘｐｉＦｅｃｔａｍｉｎｅ）（商標）２９３トランスフェクションキット（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ａ１４５２５）におけるエンハンサー１及び２、リポフェクタミン（Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ）（登録商標）３０００トランスフェクションキット（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｌ３００００１５）におけるＰ３０００試薬、エフェクテン（Ｅｆｆｅｃｔｅｎｅ）（登録商標）トランスフェクション試薬キット（Ｑｉａｇｅｎ、３０１４２７）におけるエンハンサーであった。また、バルプロ酸、エトポシド、テニポシド、シオマイシンＡ、及びボリノスタットを含む様々な化合物を調べて、ＰＥＩ細胞トランスフェクション及びｒＡＡＶ産生における有効性を試験した。

[0239]ＨＥＫ２９３Ｆ細胞を、スピナーフラスコ又は振盪フラスコ内で、１×グルタマックス（登録商標）サプリメント及び１×アンチバイオティック－アンチマイコティックを加えたＦ１７培地で増殖させた。トランスフェクションの前日、新鮮な培地を加えることにより、細胞を０．５～２×１０^６細胞／ｍＬで播種した。２４時間後、細胞を１～４×１０^６細胞／ｍＬの細胞密度でトランスフェクトした。トランスフェクション用の３つのプラスミド、ｈＦＶＩＩＩ、Ｒｅｐ／ｃａｐ、Ａｄ２ヘルパーをモル比１：１：１、０．５：１：１及び１：２：２、並びに重量比０．７５：０．７５：０．７５、１：１：１及び１．５：１．５：１．５で使用した。トランスフェクションに使用したＤＮＡの総量は、細胞培養液容量１ｍＬあたり０．５～４．２μｇであった。異なる重量比のＰＥＩとＤＮＡを１：１、１．５：１、２：１、２．５：１、３：１でＰＥＩ／ＤＮＡ複合体を調製し、室温で１、５、１０、１５、２０、２５及び３０分間インキュベートし、ＤＮＡ／ＰＥＩ複合体を細胞培養液に加えた。ＤＮＡ／ＰＥＩ複合体の直後に、０．５～５．６μｇ／ｍＬの遊離ＰＥＩ（ＤＮＡ無し）を細胞培養液に加えた。トランスフェクション時又はトランスフェクションの２４時間前又はトランスフェクションの１６～１８時間後に増強剤を細胞に直接加えた。様々な量の増強剤を研究した。細胞及び細胞培養液培地を含むサンプルは、細胞数及び細胞生存率のためにトランスフェクションの４８及び７２時間後に採取され、トランスフェクションの７２時間後に細胞培養液を収穫した。

[0240]バイオリアクターでのｒＡＡＶベクターの生産：２つ又は３つのピッチ付きブレードインペラーを備えた２ＬＤＡＳＧＩＰパラレルバイオリアクターシステム（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ）を使用して、ベクター生産プロセスをスケールアップした。最終的な作業容量は４００ｍＬ又は１．２Ｌに調整された。攪拌を１３０ｒｐｍ、１５０ｒｐｍ又は１７０ｒｐｍに設定し、温度を３７℃に維持した。ｐＨは６．３、６．８、７．２、７．４、７．６、又は８で試験された。最良の細胞増殖とｒＡＡＶ産生のため、ｐＨ７．２が選択された。溶存酸素は、酸素、二酸化炭素、空気の混合ガスを補充することで４０％に維持された。これらのパラメーターは全て、ＤＡＳＧＩＰ制御４．０ソフトウェアを備えたＤＡＳＧＩＰ制御システムによって監視及び制御された。Ｆ１７培地で培養したＨＥＫ２９３Ｆ細胞を、細胞密度０．４×１０^６細胞／ｍＬ、９５％を超える生存率で接種した。播種後３日目に、新鮮な培地を加えて細胞を継代培養した。継代培養後、細胞密度をおよそ０．５～１．７×１０^６細胞／ｍＬに調整した。継代培養の２４時間後、上及び図の説明に記載したように、ＰＥＩ／ＤＮＡ複合体、遊離ＰＥＩ及びトランスフェクションエンハンサーを用いて細胞をトランスフェクトした。細胞密度は、トランスフェクション時で約１～３×１０^６細胞／ｍＬであった。１．２～４．２ｕｇ／ｍＬのＤＮＡ、ＰＥＩ／ＤＮＡの重量比１：１、１．５：１、２：１、２．５：１又は３：１を０．５～４．２ｕｇ／ｍｌの遊離ＰＥＩ及び増強剤とともにプラスミドトランスフェクション及びｒＡＡＶ生産について分析した。トランスフェクション後７２時間で細胞培養液を収穫した。

[0241]ｒＡＡＶベクターの定量：マイクロ流動化（マイクロフルイダイザー（ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｚｅｒ）（商標）、Ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃｓ）又は３回の超音波処理のいずれかにより、トランスフェクトされたＨＥＫ２９３Ｆ細胞収穫物からｒＡＡＶベクターを放出した。細胞片を遠心分離によりペレット化し、上清を収集してリアルタイムＰＣＲで分析した。

[0242]ｒＡＡＶベクターゲノムコピー数は、タックマン（ＴａｑＭａｎ）マスターミックス（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、４３０４４３７）を使用して、リアルタイムポリメラーゼ連鎖反応（Ｑ－ＰＣＲ）（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、ＱｕａｎＳｔｕｄｉｏ７）で決定した。１０μＬの細胞溶解液を最初に２μｌのユニバーサルＲＮＡ（Ｂｉｏｃｈａｉｎ、Ｒ４２３５６５）で処理した後、７．６ＵＤＮａｓｅＩ（Ｑｉａｇｅｎ、７９２５４）で処理し、混入しているパッケージ化されていないＤＮＡを消化した。次に、溶液を０．２％ＳＤＳ／５ｍＭＥＤＴＡ／０．２ＭＮａＣｌで処理し、９５℃で１０分間加熱してＤＮａｓｅＩを不活性化し、ベクターＤＮＡを放出させた。プライマー及びプローブにより、導入遺伝子ｈＦＶＩＩＩ配列が検出された：フォワードプライマー：５’－ＴＧＡＧＧＡＧＧＣＴＧＡＡＧＡＣＴＡＴ－３’（配列番号３）、リバースプライマー５’－ＣＣＡＣＡＧＡＣＣＴＧＡＴＣＴＧＡＡＴＧＡＡ－３’（配列番号４）及びプローブ／５’－６ＦＡＭ／ＴＧＧＡＴＧＴＧＧ／ＺＥＮ／ＴＧＡＧＧＴＴＴＧＡＴＧＡＴＧＡＣＡ／３ＩＡＢｋＦＱ／－３’（配列番号５）。標準は、ｐＡＡＶ－ｈＦＶＩＩＩプラスミドを直線化することにより作成された。全てのサンプルは３重に行った。

[0243]ウエスタンブロット分析：マイクロ流動化（マイクロフルイダイザー（商標）、Ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃｓ）又は３回の超音波処理のいずれかにより、トランスフェクトされたＨＥＫ２９３Ｆ細胞収穫物からｒＡＡＶベクターを放出した。細胞片を遠心分離によりペレット化し、上清をウエスタンブロット用に収集した。細胞溶解物を４ｘＮｕＰＡＧＥＬＤＳサンプルバッファー（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、ＮＰ０００７）と混合し、その後、９５℃で５分間加熱した。サンプルをＳＤＳ－ＰＡＧＥで分離し、ＰＶＤＦメンブレン（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、ＬＣ２００２）に転写した。オデッセイ（Ｏｄｙｓｓｅｙ）ブロッキングバッファー（Ｌｉ－ＣＯＲＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、９２７－５００００）で１時間ブロッキングした後、膜を室温で２時間、１：５００希釈のマウスモノクローナル抗ＡＡＶＶＰ１，２，３抗体（ＡｍｅｒｉｃａｎＲｅｓｅａｒｃｈＰｒｏｄｕｃｔｓ、Ｉｎｃ．、０３－６５１５８）とともにインキュベートした。３回リンスした後、膜を室温で１時間、１：５０００希釈（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ａ２１０５７）のヤギ抗マウスＩｇＧ、アレクサ・フルオ（ＡｌｅｘａＦｌｕｏ）（登録商標）６８０コンジュゲート二次抗体とともにインキュベートした。オデッセイ（登録商標）ＣＬｘイメージャー（Ｌｉ－ＣＯＲＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）で膜をスキャンした。

実施例２
トランスフェクションエンハンサーによるｒＡＡＶ－ＦＶＩＩＩベクター生産性の向上。
[0244]トランスフェクション試薬としてＰＥＩ「Ｍａｘ」を使用した高効率なＰＥＩベースのトランスフェクション方法は、Ｆ１７培地で３つのプラスミドをＨＥＫ２９３Ｆ細胞にトランスフェクトしてｒＡＡＶベクターを産生するように開発された。最高のｒＡＡＶ生産性を得るためのプラスミドトランスフェクションに最適な細胞培養液ウィンドウが記載されている。しかし、ｒＡＡＶ－ＦＶＩＩＩベクターの生成に使用した場合、ベクターの生産性は比較的低かった（２～３Ｅ＋１０ｖｇ／ｍＬのベクター力価）。低い生産性の原因は、ＦＶＩＩＩ導入遺伝子がｅＧＦＰ、ＦＩＸなどの他の導入遺伝子と比較してとても大きいからであることがある。

[0245]トランスフェクション効率を改善できる薬剤の探索を行った。エクスピフェクタミン（商標）２９３トランスフェクションキット、リポフェクタミン（登録商標）３０００トランスフェクションキット、エフェクテン（商標）トランスフェクション試薬キットを含むいくつかのトランスフェクションキットの異なるトランスフェクションエンハンサーを評価した。データは、エクスピフェクタミン（商標）２９３トランスフェクションキットのトランスフェクションエンハンサーがｒＡＡＶベクターの生産を顕著に増加できることを示している。他のトランスフェクションキットのエンハンサーは、ｒＡＡＶ生産を有意に改善しなかった。エクスピフェクタミン（商標）２９３エンハンサー１及び２は、それぞれ培養量の１：２００及び１：２０で使用された。トランスフェクション時のエクスピフェクタミン（商標）２９３トランスフェクションキットのエンハンサー１及び２は、ｒＡＡＶ力価を、トランスフェクション後１６～１８時間で加えた場合又はエンハンサー無しの場合と比較して２～３倍増加させた（図１）。トランスフェクションの前にエンハンサー１及び２を加えても、ｒＡＡＶの産生は検出可能なほど増加しなかった。エンハンサー１及びエンハンサー２は、Ｅｘｐｉ２９３（商標）発現培地で培養したＥｘｐｉ２９３Ｆ（商標）細胞からのタンパク質発現のためのカチオン性脂質ベースのトランスフェクション試薬キットであるエクスピフェクタミン（商標）２９３トランスフェクションキットの構成物である。エンハンサーは動物由来でなく、化学的に定義された、タンパク質フリーで、無血清の試薬であると製造業者は述べている。これらのエンハンサーは、このキットの元来の設計とは異なる新しい用途で使用された。これらのエンハンサーは、タンパク質を発現する代わりにｒＡＡＶベクターを生成するために使用された。このキットでは、トランスフェクション及びタンパク質発現を高めるために、トランスフェクション後１６～１８時間でエンハンサー１及び２を使用することが勧められている。しかしながら、本明細書で開示された研究は、トランスフェクション時に同時にエンハンサー１とエンハンサー２を加えることにより最高のｒＡＡＶ産生がもたらされ、トランスフェクション後の使用よりも２～３倍高いことを示し、エンハンサーがｒＡＡＶ産生においてタンパク質発現とは異なる役割を果たしていることが示唆される。これらのエンハンサーを本明細書及び国際出願ＰＣＴ／ＵＳ１６／６４４１４に記載されるＰＥＩ媒介トランスフェクション法に加えると、大きな導入遺伝子プラスミドの細胞へのトランスフェクションが増加し、ｒＡＡＶの大幅な増加がもたらされた。

[0246]これらのエンハンサーの存在下又は非存在下での、トランスフェクション時の細胞密度、ＤＮＡ量、ＰＥＩ／ＤＮＡ比、遊離ＰＥＩ量を含む、トランスフェクションパラメーターをさらに最適化した。データは、トランスフェクション時の細胞密度とＰＥＩ／ＤＮＡ比を増加させ、ＤＮＡと遊離ＰＥＩをより少なく使用すると、エンハンサーの存在下で最大のｒＡＡＶ生産性が得られたことを示している。

[0247]図２は、ｑＰＣＲにより決定されたスピナーフラスコ中の異なるＤＮＡ量及びＰＥＩ／ＤＮＡ比を使用したｒＡＡＶ－ＦＶＩＩＩベクター産生を示す。スピナーフラスコ中のＨＥＫ２９３Ｆ細胞に１．２、１．８６、２．８μｇ／ｍＬのＤＮＡをトランスフェクトし、使用したＰＥＩ／ＤＮＡ（Ｎ／Ｐ）比は１：１、１．５：１、２：１、２．５：１、３：１及び１．５μｇ／ｍＬの遊離ＰＥＩであった。エクスピフェクタミン（商標）２９３トランスフェクションキットのエンハンサー１及び２をトランスフェクション時に細胞に加えた。エンハンサー１及びエンハンサー２は、それぞれ培養量の１：２００及び１：２０で使用された。細胞密度は、トランスフェクション時で２．５～３×１０^６細胞／ｍＬであった。ベクターの生産に最適な条件は、１．２μｇ／ｍＬのＤＮＡをトランスフェクション時にＰＥＩ／ＤＮＡ比２～２．５：１及び１．５μｇ／ｍＬの遊離ＰＥＩ並びにエンハンサー１（１：２００希釈）及び２（１：２０希釈）とともに使用することから得られた。

[0248]２ＬＤＡＳＧＩＰバイオリアクターの条件を評価し、より大規模スケールでさらに最適化した。図３は、ｑＰＣＲによって決定された異なるＤＮＡ量とＰＥＩ／ＤＮＡ比を使用したバイオリアクター中のｒＡＡＶ－ＦＶＩＩＩベクター生産を示す。ＨＥＫ２９３Ｆ細胞を、４００ｍＬＦ１７でバイオリアクター中、３７℃、ｐＨ７．２、ＤＯ４０％、１５０ｒｐｍで攪拌し、培養した。細胞にＤＮＡモル比１：１：１及び１．２又は２．８μｇ／ｍＬのＤＮＡ、ＰＥＩ／ＤＮＡ（Ｎ／Ｐ）比１．５：１、２：１、２．５：１又は３：１及び１．５μｇ／ｍＬの遊離ＰＥＩをトランスフェクトした。エクスピフェクタミン（商標）２９３トランスフェクションキットのエンハンサー１及び２をトランスフェクション時に細胞に加えた。エンハンサー１及びエンハンサー２を、それぞれ培養量の１：２００及び１：２０で使用した。トランスフェクション時の細胞密度は２～３×１０^６細胞／ｍＬであった。最高のｒＡＡＶベクターの生産性で得られた条件は、１：１：１のＤＮＡモル比及び１．２μｇ／ｍＬのＤＮＡを２．５～３：１のＰＥＩ／ＤＮＡ比及び１．５μｇ／ｍＬの遊離ＰＥＩ及びエンハンサーとともに使用することであった。

[0249]バイオリアクター中、細胞培養液量を４００ｍＬから１．２Ｌに増加させて、ｒＡＡＶを産生した。ＨＥＫ２９３Ｆ細胞は、３７℃、ｐＨ７．２、ＤＯ４０％、２又は３インペラーで１３０ｒｐｍ、１５０ｒｐｍ又は１７０ｒｐｍで攪拌して培養した。細胞を、１：１：１のＤＮＡモル比、１．２μｇ／ｍＬのＤＮＡ、２．５：１のＰＥＩ／ＤＮＡ（Ｎ／Ｐ）比、及び１．５μｇ／ｍＬの遊離ＰＥＩでトランスフェクトした。エクスピフェクタミン（商標）２９３トランスフェクションキットのエンハンサー１及び２を上記のように使用した。図４は、これらの研究からのｒＡＡＶ力価を示す。このデータは、スピナーフラスコ内の５０ｍＬの小規模スケールから最適化された条件を４００ｍＬにスケールアップし、その後１．２Ｌスケールまでスケールアップできることを実証した。最適化されたＰＥＩを介したトランスフェクション条件で増強剤を使用すると、無血清懸濁培養においてｒＡＡＶベクターの生産性を８～１０倍増加させることができる。このプロセスは高効率で、安全、拡張可能である。

[0250]エンハンサー１及び２の両方がｒＡＡＶ産生を改善するためにトランスフェクションで必要であるかどうかを決定し、これらのエンハンサーの量をさらに定義するために、これらを個別に評価した。データは、エンハンサー１単独でｒＡＡＶの生産性をエンハンサー１と２の両方を組み合わせたものと同じレベルまで改善できることを示している。エンハンサー２単独では、ｒＡＡＶ産生を検出可能なほど増加させなかった（図５）。エンハンサー１及び２の量も減少し、プロセスの最適条件がさらに定義された。エンハンサー１及び２の量を減らすと、ｒＡＡＶ力価が低下した（図５）。トランスフェクション時でのエンハンサー１（１：１００又は１：１５０希釈）及び２（１：１０又は１：１５希釈）の量を増加しても、ｒＡＡＶの生産性を検出できるほど改善しなかった。トランスフェクション時にエンハンサー１及び２を使用することに加えて、トランスフェクションの２４時間後、又は４８時間後、又は２４時間後と４８時間後の両方でそれらを評価し、ｒＡＡＶ力価をさらに増加できるかどうかを決定した。図６は、エンハンサーの反復使用がｒＡＡＶ産生をわずかに増加させたことを示している。

実施例３
バルプロ酸は、ｒＡＡＶ－ＦＶＩＩＩベクターの生産性を改善する。
[0251]バルプロ酸、エトポシド、テニポシド、シオマイシンＡ及びボリノスタットを含む様々な化合物を評価して、トランスフェクション及びｒＡＡＶ産生に対する効果を決定した。これらの化合物の中で、バルプロ酸はｒＡＡＶの生産性を顕著に上昇させた。バルプロ酸は、ヒストン脱アセチル化酵素の阻害剤であり、けいれんを治療するためのＦＤＡ承認薬でもある。異なる濃度のバルプロ酸、０．２５ｍＭ、０．５ｍＭ、１ｍＭ、１．５ｍＭ、２ｍＭ、５ｍＭ、７．５ｍＭ、及び１０ｍＭを、トランスフェクション時にスピナー／振盪フラスコ培養液及びＤＡＳＧＩＰバイオリアクター培養液中で使用した。最適化されたＰＥＩ媒介トランスフェクションでバルプロ酸を使用すると、ｒＡＡＶ－ＦＶＩＩＩベクターの力価がエンハンサー無しの場合と比較して約１０倍増加し、無血清懸濁培養システムのエンハンサー１及び２と同じか又はそれ以上のｒＡＡＶ生産性レベルに達した（図７）。これらのバルプロ酸の研究では、１．２μｇ／ｍＬのＤＮＡ、１：１：１のＤＮＡモル比、２：１又は２．５：１のＰＥＩ／ＤＮＡ重量比、及び１．５μｇ／ｍＬの遊離ＰＥＩを使用した。トランスフェクション時にＰＥＩ／ＤＮＡ複合体及び遊離ＰＥＩを細胞に加えた後、異なる濃度のバルプロ酸を加えた。この研究では、エクスピフェクタミン（商標）２９３トランスフェクションキットのエンハンサーは使用されなかった。図８は、１Ｌバイオリアクター培養液中、例えば５～８ｍＭなどの４ｍＭ以上のバルプロ酸のようにバルプロ酸濃度が増加した場合のＡＡＶベクター生産の改善を示している。

実施例４
[0252]最適化されたＰＥＩベースのトランスフェクション法のみで使用されるエクスピフェクタミン（商標）２９３トランスフェクションキットのエンハンサー１のみ及びバルプロ酸は、ｒＡＡＶベクター生産性を、同様の技術を使用する現在報告されている生産プロトコルよりも、実質的に約１０倍高く増加させることができる。ｒＡＡＶ生産システムにおいてエンハンサー１又はバルプロ酸のみを使用することにより、無血清懸濁細胞培養液でｒＡＡＶベクターの血清型を効率的に生産するために使用できる新しい拡張可能なｒＡＡＶ生産プラットフォームが提供される。このプロセスは、大きな導入遺伝子を持つｒＡＡＶベクターの産生や、生成が困難なｒＡＡＶベクターの産生に特に適用できる。このプロセスは、十分に拡張可能で、ｃＧＭＰに適合した、ｒＡＡＶの大規模スケール製造に適した用途の広いｒＡＡＶ生産システムである。

実施例５
[0253]図４のデータは、スピナーフラスコでの５０ｍＬの小規模スケールから最適化された条件が４００ｍＬまで、次いで１．２Ｌスケールまでスケールアップされ得ることを実証している。より大きな容量までのさらなる拡張可能性が達成され得る。例えば、本方法は２リットル、２～２０リットル、２０～５０リットル、又は５０～１００リットルまで拡張可能であると考えられる。１００～５００リットル、５００～１０００リットル、又は１０００リットル以上など、さらに大きな容量も考えられる。そのようなスケールアップには、細胞のクローニングと、大量のｒＡＡＶベクターを産生するクローンの選択が含まれ得る。本明細書の本発明の組成物及び方法に適用可能な細胞の信頼でき、再現可能な供給源は、ｒＡＡＶベクターを大量に発現するそのようなクローンのマスター細胞バンクを作成することにより提供される。

[0254]細胞培養液条件、トランスフェクション条件、細胞溶解及び／又はｒＡＡＶベクター収穫物の培養上清収集、不純物の除去、及び引き続く下流精製条件のさらなる改良も、拡張性の実質的な向上に寄与し得る。

実施例６
１．０例示的で、非限定的な、プロセス開発許容基準、概要、フロー説明、及び懸濁液細胞を使用したｒＡＡＶベクター（例えば、ＬＫ０３－ＦＶＩＩＩ）の生産スケールを増加させるために変化させるパラメーター
１．１セルの解凍と増殖

１．２１．２ＬバイオリアクタースケールでのｒＡＡＶベクター生産

２．０プロセスの概要
２．１細胞解凍及び細胞増殖プロセス
２．１．１プロセスフロー図
以下は、上流ｒＡＡＶベクタープロセスの細胞解凍及び細胞増殖部分の代表的なプロセスフロー図である：

２．１．２プロセスフローの説明
以下は、上流ｒＡＡＶベクター（例：ＬＫ０３－ＦＶＩＩＩ）プロセスの細胞解凍及び細胞増殖部分の代表的なプロセスフローの説明である：

２．１．３細胞解凍及び細胞増殖研究中に変化させるパラメーター
２９３－Ｆ細胞解凍及び細胞増殖プロセスの開発中に以下のパラメーターを評価した：

実施例７
２．３１．２Ｌバイオリアクタースケールでの例示的で、非限定的なｒＡＡＶベクター（例えば、ＬＫ０３－ＦＶＩＩＩ）生産、プロセスフロー及びｒＡＡＶベクタータンパク質のスケールの増加に応じて変化させるパラメーター
２．３．１．プロセスフロー図
以下は、ｒＡＡＶベクター（例えば、ＬＫ０３－ＦＶＩＩＩ）の１．２Ｌバイオリアクター生産の代表的なプロセスフロー図である：

２．３．２プロセスフローの説明
以下は、ｒＡＡＶベクター（例えば、ＬＫ０３－ＦＶＩＩＩ）の１．２Ｌバイオリアクター生産のプロセスフローの説明である：

２．３．３ｒＡＡＶベクター（例えば、ＬＫ０３－ＦＶＩＩＩ）生産開発研究中に変化させたパラメーター
ｒＡＡＶベクター（例えば、ＬＫ０３－ＦＶＩＩＩ）の１．２Ｌバイオリアクター生産プロセスの開発中に、以下のパラメーターを評価した：

実施例８
[0255]代表的なＡＡＶキャプシド（ＶＰ１）タンパク質。

Claims

組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）ベクターを産生する細胞を作製する方法であって、
（ａ）構成物（ｉ）、（ｉｉ）及び（ｉｉｉ）：
（ｉ）ＡＡＶパッケージングタンパク質をコードする核酸及び／又はヘルパー機能をコードする核酸を含む１つ又は複数のプラスミド；
（ｉｉ）タンパク質をコードするか又は目的の転写物に転写される導入遺伝子を含むプラスミド；並びに
（ｉｉｉ）ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）溶液
のプラスミド／ＰＥＩ混合物を提供するステップ；
（ｂ）細胞を、ステップ（ａ）のプラスミド／ＰＥＩ混合物と接触させて、プラスミド／ＰＥＩ細胞培養液を産生するステップ；
（ｃ）ステップ（ｂ）の直後に、バルプロ酸、その塩、又はそれに連結又はコンジュゲートされたアミノ酸を含む誘導体を、前記プラスミド／ＰＥＩ細胞培養液に加えて、第２の混合物を産生するステップ；並びに
（ｄ）ステップ（ｃ）の前記第２の混合物をインキュベートし、それによりｒＡＡＶベクターを産生するトランスフェクトされた細胞を作製するステップ
を含む、方法。
ステップ（ｄ）で産生された前記トランスフェクトされた細胞及び／又はステップ（ｄ）で産生されたトランスフェクトされた細胞からの細胞培養培地を収穫するステップ（ｅ）をさらに含む、請求項１に記載の方法。
前記プラスミドでトランスフェクトされた細胞を、培養、拡張、単離又は選択するステップ（ｅ）をさらに含む、請求項１に記載の方法。
アデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）ベクターを作製する方法であって、
（Ａ）請求項１に記載の方法にしたがって、ｒＡＡＶベクターを産生するトランスフェクトされた細胞を作製するステップ、並びに、
（Ｂ）ステップ（ｄ）で産生されたトランスフェクトされた細胞及び／若しくはステップ（ｄ）で産生されたトランスフェクトされた細胞からの細胞培養培地から、組換えＡＡＶベクターを単離及び／又は精製するステップ
を含む、請求項１に記載の方法。
前記導入遺伝子が、野生型又は機能的変異体の血液凝固因子、ａｐｏＥ２、ＴＰＰ１、アルギニノコハク酸合成酵素、銅輸送ＡＴＰａｓｅ２、酸性α－グルコシダーゼ、β－グルコセレブロシダーゼ、α－ガラクトシダーゼ又はＣ１阻害セリンプロテアーゼ阻害剤をコードする、請求項１に記載の方法。
前記野生型又は機能的変異体の血液凝固因子が、因子ＶＩＩ、因子ＶＩＩＩ、又は因子ＩＸである、請求項５に記載の方法。
バルプロ酸、その塩、又はそれに連結又はコンジュゲートされたアミノ酸を含む誘導体が、ステップ（ａ）の前、ステップ（ａ）の時点、又はステップ（ａ）の直後、又はステップ（ａ）の後３時間未満までに加えられる、請求項１に記載の方法。
バルプロ酸、その塩、又はそれに連結又はコンジュゲートされたアミノ酸を含む誘導体が、ステップ（ａ）の後又は（ｂ）の前に２回以上加えられる、請求項１に記載の方法。
前記プラスミド（ｉ）及び（ｉｉ）が、約１：０．０１～約１：１００のモル比範囲にあり、構成物（ｉ）、（ｉｉ）及び（ｉｉｉ）の混合物は、ステップ（ｂ）の前に約１０秒～約４時間の期間にわたって任意選択でインキュベートされる、請求項１に記載の方法。
前記プラスミドが、約０．１：１～約５：１の範囲のＰＥＩ：プラスミド重量比、又は約５：１～約０．１：１の範囲のＰＥＩ：プラスミド重量比である、請求項１に記載の方法。
前記プラスミドが、約１：１～約５：１の範囲のＰＥＩ：プラスミド重量比、又は約５：１～約１：１の範囲のＰＥＩ：プラスミド重量比である、請求項１に記載の方法。
ステップ（ａ）若しくは（ｂ）の前、その時点若しくはその後に、又はステップ（ｃ）の前若しくはその時点若しくはその後に、遊離ＰＥＩを細胞に加えることをさらに含む、請求項１に記載の方法。
前記遊離ＰＥＩが、ＰＥＩ：プラスミドの重量比が約０．１：１～約５：１の範囲にあるように、又は約５：１～約０．１：１の範囲にあるように加えられる、請求項１２に記載の方法。
遊離ＰＥＩ中及びプラスミド／ＰＥＩ混合物中のＰＥＩ中の窒素（Ｎ）の、プラスミド中のリン酸塩（Ｐ）に対するモル比が、約１：１～約５０：１（Ｎ：Ｐ）の範囲にある、請求項１３に記載の方法。
遊離ＰＥＩの量が、全ＰＥＩの約１０％～約９０％である、請求項１３に記載の方法。
前記プラスミド及びＰＥＩが、ステップ（ａ）の前に互いに約１０秒～約４時間インキュベートされている、請求項１に記載の方法。
ステップ（ｄ）のインキュベーションが、少なくとも約４時間である、請求項１に記載の方法。
前記細胞が、哺乳動物細胞を含む、請求項１に記載の方法。
前記細胞が、ヒト胎児腎臓（ＨＥＫ）又はチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞である、請求項１に記載の方法。
前記細胞が、ヒト胎児腎臓（ＨＥＫ）２９３細胞を含む、請求項１に記載の方法。
前記細胞が、ＨＥＫ２９３Ｅ、ＨＥＫ２９３Ｆ又はＨＥＫ２９３Ｔ細胞である、請求項１に記載の方法。
前記細胞が安定的に又は一時的にトランスフェクトされる、請求項１に記載の方法。
前記細胞が、懸濁培養液中にある、請求項１に記載の方法。
前記細胞が接着性である、請求項１に記載の方法。
前記細胞が、無血清培養培地で増殖又は維持される、請求項１に記載の方法。
前記細胞が、前記プラスミド／ＰＥＩ混合物と接触したとき、約１×１０^５細胞／ｍＬ～約１×１０^８細胞／ｍＬの範囲の密度である、請求項１に記載の方法。
前記１つ又は複数のプラスミドが、ＡＡＶパッケージングタンパク質をコードする核酸を含む第１のプラスミド及びヘルパー機能をコードする核酸を含む第２のプラスミドを含む、請求項１に記載の方法。
コードされたＡＡＶパッケージングタンパク質が、ＡＡＶｒｅｐ及び／又はＡＡＶｃａｐを含む、請求項１に記載の方法。
コードされたヘルパー機能が、アデノウイルスＥ２及び／若しくはＥ４タンパク質、ＶＡＲＮＡ、並びに／又は非ＡＡＶヘルパー機能を含む、請求項１に記載の方法。
前記ＡＡＶベクターが、イントロン、発現制御要素、１つ又は複数のアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）逆位末端反復（ＩＴＲ）及び／又はフィラーポリヌクレオチド配列をさらに含む、請求項１に記載の方法。
前記細胞が、前記プラスミド／ＰＥＩ混合物と接触する前に、細胞密度が減少するまで継代培養される、請求項１に記載の方法。
継代培養後２日～５日の期間の間、前記細胞を前記プラスミド／ＰＥＩ混合物と接触させる、請求項１に記載の方法。
産生された組換えＡＡＶベクターの量が、遊離ＰＥＩをプラスミド／ＰＥＩ細胞培養液に加えるステップを用いると、遊離ＰＥＩをプラスミド／ＰＥＩ細胞培養液に加えない場合と比較して少なくとも５０％以上である、請求項１に記載の方法。
産生された組換えＡＡＶベクターの量が、バルプロ酸、その塩、又はそれに連結又はコンジュゲートされたアミノ酸を含む誘導体を加えるステップを用いると、プラスミド／ＰＥＩ細胞培養液にバルプロ酸、その塩、又はそれに連結又はコンジュゲートされたアミノ酸を含む誘導体を添加しない場合と比較して１～５、５～８、８～１０又は１０～１５倍多い、請求項１に記載の方法。
前記バルプロ酸塩が、ナトリウム塩又はカリウム塩を含む、請求項１に記載の方法。