JP7801754B2

JP7801754B2 - 被験検体中の目的核酸配列を測定するための測定方法

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Publication number: JP7801754B2
Application number: JP2022021829A
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Inventors: 健田窪
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Publication date: 2026-01-19
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Description

本発明は、被験検体中の目的核酸配列を測定するための測定装置および測定方法に関する。

従来、例えば新型コロナウイルス（SARS-CoV-2）等のウイルス感染の確定診断の手法として採用されている、ポリメラーゼ連鎖反応（Polymerase Chain Reaction、ＰＣＲ）において、ＴａｑＭａｎ（登録商標）プローブ法を用いたリアルタイムＰＣＲが知られている（例えば、特許文献１ならびに非特許文献１および２）。

ＴａｑＭａｎプローブは、５’端に蛍光物質を有し、３’端にはクエンチャーを有する。この状態では、クエンチャーが蛍光物質の近くに存在しているので、励起光を与えても、蛍光物質の蛍光発生が抑制される。目的核酸配列が存在すると、ＰＣＲにおけるアニーリングステップで、プライマーとＴａｑＭａｎプローブとが目的核酸配列に結合する。その後の伸長ステップでは、Ｔａｑポリメラーゼが遺伝子を合成し、ＴａｑポリメラーゼがＴａｑＭａｎプローブのところまで届くと、５’→３’エキソヌクレアーゼ活性により、ＴａｑＭａｎプローブが分解される。ＴａｑＭａｎプローブが分解されると、クエンチャーが蛍光物質の蛍光発生を抑制しなくなるので、励起光を与えると、蛍光物質が蛍光を発するようになる。ＰＣＲの増幅が進むにしたがい、蛍光の発光強度が増大する。

一方、液相での拡散過程および界面での化学反応の解析や、多孔質電極の解析等に用いる手法として、電気化学インピーダンス法（Electrochemical Impedance Spectroscopy、ＥＩＳ）が知られている。（以下、「ＥＩＳ法」という。）ＥＩＳ法は、耐食性評価、電析プロセスの評価、各種センサの性能評価、電池等のエネルギー変換デバイスの性能評価、および、誘電材料の電気特性評価等の様々な分野において用いられていることが報告されている。

このような中、ＤＮＡ鎖を増幅して検出を行うＤＮＡの分析および定量手法であるＰＣＲにおいて、ＥＩＳ法で測定対象物中の目的とするＤＮＡを検出する手法が提案されている（例えば、特許文献２および非特許文献３）。

この手法は、ＥＩＳ法による、インピーダンスを計測することによって溶液中に存在する対象物質を検出する方法である。対象物質のＤＮＡをＰＣＲで増幅し、その過程で、ルテニウム等金属錯体を二本鎖ＤＮＡに挿入させ、溶液中の媒介物質により、電極との電子の授受、すなわち酸化還元反応を起こす。この酸化還元反応をインピーダンスで測定する。例えば、対象物質が初期値から増加すると、当初存在していたインピーダンス変動物質が対象物質に取り込まれることから減少し、インピーダンス観測物質の電荷移動性を変動させる。この電荷移動性の変動をインピーダンス応答という形で検出することにより、対象物質の増加を検出する。

特許文献２および非特許文献３では、所定の測定サイクルが終了した後に、サイクル毎の電荷移動抵抗（Charge Transfer Resistance）Ｒ_ｃｔの増加量を確認し、Ｒ_ｃｔが急激に増加し始めた時点付近で、二本鎖ＤＮＡが顕著に増加したと判断している。

Ｒ_ｃｔは、電荷移動反応の速度が電流と比例関係にあることから、反応の起こりにくさの指針となる。電荷移動反応が起こりやすい場合にはＲ_ｃｔが小さくなり、起こりにくい場合にはＲ_ｃｔが大きくなる。Ｒ_ｃｔは、ＥＩＳ法で得られたインピーダンスをコールコールプロットで描いたときの半円状プロットの直径がほぼＲ_ｃｔとなり、コールコールプロットから直感的にも分かりやすくなっている。

なおコールコールプロットは、インピーダンスの実部を横軸にし、インピーダンスの虚部を負を上向きにして縦軸に表示した、ナイキストプロットの一種であり、電気回路の構成に応じて特徴的な軌跡が描かれ、スペクトルの概要を視覚的に捉えやすくなっている。ＥＩＳ法の一つであるＦＲＡ（Frequency Response Analyzer、周波数応答解析装置）法による自動計測では、一般に、コールコールプロットを作成する機能を備えている。

特開２０１３－１８８１６４号公報国際公開ＷＯ２０１９／０２６５１７号公報

Proc Natl Acad Sci U S A. 1991 Aug 15; 88(16): 7276-7280. 「リアルタイムＰＣＲの原理」、［online］、タカラバイオ株式会社［２０２２年１月７日検索］、インターネット＜ＵＲＬ：https://catalog.takara-bio.co.jp/product/basic_info.php?unitid=U100009037＞応用物理学会編特別ＷＥＢコラム『新型コロナウイルス禍に学ぶ応用物理』、［online］、公益社団法人応用物理学会［２０２２年１月７日検索］、インターネット＜ＵＲＬ：https://www.jsap.or.jp/columns-covid19/covid19_4-3-3＞

特許文献１ならびに非特許文献１および２のようなＴａｑＭａｎプローブ法では、蛍光測定を行うために、励起光を発生するための光源と、目的とする波長の蛍光のみを検出する受光部が必要であり、装置が高額化かつ大型化するという課題があった。

特許文献２および非特許文献３では、対象物質であるＤＮＡをＰＣＲで増幅した際に、金属錯体が二本鎖ＤＮＡに取り込まれる結果として、媒介物質を介しての酸化還元反応が減ることによりシグナルが減る現象をとらえていた。したがって、対象物質の含有量とシグナルとが反比例する関係にあるので、本質的には検出感度が低くなる傾向があった。

本発明は、このような事情に鑑みてなされたものであり、装置が安価で小型であり、検出感度を向上した目的核酸配列を測定するための測定装置および測定方法を提供する。

本発明はかかる課題を解決するため、目的核酸配列を含み得る被計測物のインピーダンスの変化を計測し、被験検体中の目的核酸配列を測定するための測定装置を用いた測定方法であって、前記測定装置が、前記被計測物を収容する容器と、前記容器に設けられ、前記被計測物に接触する少なくとも一対の電極と、前記電極において前記インピーダンスを計測するインピーダンス計測部と、前記被計測物に印加する温度を調節する温度制御部と、を備え、前記被計測物が、前記被験検体と、インピーダンス観測物質と、前記目的核酸配列の標的配列に相補的な配列を持つプローブであって、インピーダンス変動置換基で修飾されたインピーダンス変動前駆物質と、５’→３’エキソヌクレアーゼ活性を有するポリメラーゼと、プライマーと、を含む混合液であり、前記混合液に対してＰＣＲ（Polymerase Chain Reaction）を実施することで、前記５’→３’エキソヌクレアーゼ活性を有するポリメラーゼによって、前記インピーダンス変動前駆物質が分解されてインピーダンス変動物質を生成する、測定方法を提供する。

前記測定方法では、前記測定装置は、前記インピーダンスが、所定の閾値をよぎったか否かを判定する判定部をさらに備える、としてもよい。

前記測定方法では、前記インピーダンス変動物質が、前記インピーダンス観測物質の電荷移動性を増強させるものであり、前記インピーダンス観測物質が、前記電極に対し電荷を発現し、前記インピーダンス変動物質以外とは相互作用を起こさないものである、としてもよい。

前記測定方法では、前記インピーダンス変動物質が、メチレンブルー、ナイルブルー、アントラキノン誘導体、ナフタレン誘導体、金属アンミン錯体、ならびに、有機配位子としてビピリジン誘導体、フェナントロリン誘導体、および／または、ジピリドフェナジン誘導体を含む金属錯体からなる群から選択される酸化還元作用を有する化合物で修飾されているものである、としてもよい。

前記測定方法では、前記インピーダンス観測物質が、フェリシアン化物イオン、フェロシアン化物イオン、フェロセン、および、これらの混合物からなる群から選択される酸化還元性電解質を形成する金属錯体である、としてもよい。

前記測定方法では、前記インピーダンスとして、前記インピーダンスの絶対値、前記インピーダンスの実部および前記インピーダンスの虚部のうち少なくとも１つを用いる、としてもよい。

前記測定方法では、前記インピーダンスとして、前記インピーダンスから算出される電荷移動抵抗の推定値を用いる、としてもよい。

前記測定方法では、前記インピーダンスの計測値に基づくコールコールプロットを、前記コールコールプロット上の２点以上を用いて半円に近似して、当該半円の直径を前記電荷移動抵抗の推定値とするか、前記コールコールプロット上の２点以上を用いた前記インピーダンスの実部の差を前記電荷移動抵抗の推定値とするか、前記コールコールプロット上の２点以上を用いた前記インピーダンスの差の絶対値を前記電荷移動抵抗の推定値とするか、前記コールコールプロットを、前記コールコールプロット上の３点以上を用いて楕円に近似して、当該楕円の実軸方向の直径を前記電荷移動抵抗の推定値とするか、または、前記コールコールプロットを、前記コールコールプロット上の３点以上を用いて円弧に近似して、当該円弧の虚部＝０Ωにおける実部の差を前記電荷移動抵抗の推定値とする、としてもよい。

本発明はまた、ＰＣＲ（Polymerase Chain Reaction）法とＥＩＳ（Electrochemical Impedance Spectroscopy）法とを組み合わせることにより被験検体中の目的核酸配列を測定するための測定方法であって、前記目的核酸配列の標的配列に相補的な配列を持つプローブであって、インピーダンス変動置換基で修飾されたインピーダンス変動前駆物質を用い、前記被験検体と、インピーダンス観測物質と、前記インピーダンス変動前駆物質と、５’エキソヌクレアーゼ活性を有するポリメラーゼとを含む混合液に対してＰＣＲ反応を実施し、前記ポリメラーゼによる前記インピーダンス変動前駆物質のインピーダンス変動物質への分解を惹起し、前記インピーダンス変動物質が、前記インピーダンス観測物質の電荷移動性を増強させることによって観測される前記混合液のインピーダンスの変化をＥＩＳ法によって計測する、測定方法を提供する。

前記測定方法では、前記インピーダンス変動物質が、前記インピーダンス観測物質の電荷移動性を増強させるものであり、前記インピーダンス観測物質が、前記インピーダンスを計測するための電極に対し電荷を発現し、前記インピーダンス変動物質以外とは相互作用を起こさないものである、としてもよい。

本発明の測定装置および測定方法によれば、従来のＰＣＲの良さは維持しつつ、装置を安価で小型な構成とすることができる。また、従来のＥＩＳ法を用いたＰＣＲによる検出方法に比べ、検出感度を向上することができる。

本発明の測定装置の好適な一実施形態としての基本構成例を模式的に示す斜視図である。本発明の測定装置の好適な一実施形態としての基本構成例を模式的に示す側断面図である。本発明の測定装置の好適な一実施形態としての基本構成例のインピーダンス計測部および判定部を示す図である。インピーダンス計測部の一例を示す図である。本発明の被計測物中に含まれるプローブ（インピーダンス変動前駆物質）の模式図である。本発明の被計測物中に含まれるプライマーの模式図である。本発明の対象物質となる目的核酸配列の模式図である。ＰＣＲのアニーリングステップにおいて、プライマーとプローブが目的核酸配列に結合する様子を示す模式図である。ＰＣＲの伸長ステップにおいて、ポリメラーゼが相補鎖を合成する様子を示す模式図である。伸長反応が進み、ポリメラーゼがプローブを分解する様子を示す模式図である。プローブが分解される様子を示す模式図である。ＰＣＲサイクル数とインピーダンスとの関係を示すグラフ図である。ＥＩＳ法の測定対象物である被計測物の一般的な等価回路の一例を示す図である。好適な一実施形態において、ＥＩＳ法におけるコールコールプロットの一例を模式的に示す概略図である。好適な一実施形態に係るコールコールプロットにおいて、高低２つの周波数で半円に近似して、その半円の直径をインピーダンスから推定した電荷移動抵抗Ｒ_ｃｔとする際の電荷移動抵抗Ｒ_ｃｔの求め方を模式的に示す概略図である。好適な一実施形態に係るコールコールプロットにおいて、高低２つの周波数で計測したインピーダンスにおける実部の差、または、インピーダンスの差の絶対値をインピーダンスから推定した電荷移動抵抗Ｒ_ｃｔとすることを模式的に示す概略図である。好適な一実施形態に係るコールコールプロットにおいて、３つの周波数で楕円に近似して、その楕円の実軸方向の直径をインピーダンスから推定した電荷移動抵抗Ｒ_ｃｔとすることを模式的に示す概略図である。好適な一実施形態に係るコールコールプロットにおいて、３つの周波数で円弧に近似して、その円弧の虚部＝０Ωにおける実部の差をインピーダンスから推定した電荷移動抵抗Ｒ_ｃｔとすることを模式的に示す概略図である。

以下、図面を参照して、本発明の測定装置および測定方法の好適な実施形態について説明する。ただし、本発明は、以下の記載に限定されるものではなく、特許請求の範囲に記載され、または、発明を実施するための形態に開示された発明の要旨に基づき、当業者において様々な変形や変更が可能である。そのような変形や変更もまた、本発明の範囲に含まれる。

本明細書において言及される全ての文献はその全体が引用により本明細書に取り込まれる。

＜測定装置の構成＞
図１は、本発明の測定装置１の好適な一実施形態としての基本構成例を模式的に示す斜視図である。測定装置１は、被計測物２（図２を参照）を収容する容器３と、容器３に設けられ、被計測物２に接触する少なくとも一対の電極４とを備える。図２は、測定装置１の側断面図である。容器３内には、被計測物２が収容される。容器３毎に被計測物２を収容することで、試験試料のコンタミネーション防止が図れる。電極４上には、一例としてシール部５を介して、被計測物２に印加する温度を調節する温度制御部６が設けられる。測定装置１は、電極４において被計測物２のインピーダンスＺを計測するインピーダンス計測部７と、インピーダンスＺが、所定の閾値Ｚ_ｔｈをよぎったか否かを判定する判定部８とを備える。測定装置１は、時間経過と共に、目的核酸配列９（図７を参照）を含み得る被計測物２のインピーダンスＺの変化を計測し、目的核酸配列９の有無を判定する。

電極４は、インピーダンス変動物質Ｂ（図１１を参照）の電荷移動変動をより強く発現させるため、その溶液側表面に、インピーダンス変動物質Ｂと親和性を有する化合物Ｃを配することが好ましい。この親和性を有する化合物Ｃは、電極４表面を修飾するように配され、例えば、薄膜層として存在することが好ましい。インピーダンス変動物質Ｂが化合物Ｃの薄膜層内に留まるような構造をとることができる場合は、薄膜層内に存在していたインピーダンス変動物質Ｂの量が変動することにより、膜抵抗も変動することとなり、急激なインピーダンスＺの変動として検出することができる。なお、インピーダンス変動物質Ｂは、薄膜層内に留まっているだけでなく、薄膜層を通過して電極４に到達している場合においても、その量の変動がインピーダンスＺの変動として検出することができる。

親和性を有する化合物Ｃとしては、ＰＣＲ反応液成分、増幅成分、生体由来物質等に対する相互作用の小さい化合物であることが好ましく、例えば、ポリマー、ＳＡＭ膜が挙げられる。構造表面は、例えば水酸基、エーテル基、アルデヒド基、カルボニル基、カルボキシル基、ニトロ基、リン酸基、スルホン酸基等の官能基が配置される。ポリマー材料である場合、その主鎖あるいは、側鎖、あるいはその両方に官能基が配置される。具体的には、ポリビニルアルコール、ポリエチレングリコール、ポリエステル、ポリアクリル酸、ポリアクリルアミド、多糖類等が挙げられる。

電極４に化合物Ｃを配する方法は周知の方法を適用することができる。周知の手法を用いて、電極４上に電解重合、光重合、熱重合、ラジカル重合等を適用して化合物Ｃを形成させることも可能である。薄膜層は、インピーダンス観測物質Ａが出入り可能で、インピーダンス変動物質Ｂが吸脱着可能なポーラス構造を有する材料であることが望ましく、０．００１～１０μｍの厚さであることが好ましい。

電極４は、電気化学計測用の電極であれば材料は特に限定されないが、電極４表面に化合物Ｃを配する場合は、グラファイト、カーボンナノチューブ、カーボンブラック等から構成されるカーボン電極、金電極、ＩＴＯ等の導電性酸化物電極であることが好ましい。

図３に示すように、インピーダンス計測部７は、被計測物２の特定の周波数におけるインピーダンスＺを、例えば四端子法により計測する。この特定の周波数は、単一の周波数でもよいし、複数の周波数を切り替えて複数回の計測としてもよい。インピーダンス計測部７は、例えば、図４に示すように、特定の周波数の信号を印加する信号源10と、その周波数の電流および電圧（共にベクトル値）を計測する電流電圧計測手段11とを有し、インピーダンスＺは電圧／電流で求めることができる。インピーダンスＺの測定には、例えば上記のＦＲＡを用いることができる。なお、インピーダンス計測部７は、測定装置１に含めてもよいし、測定装置１の外部の装置としてもよい。本実施形態では、例えば、ＰＣＲサイクルごとにインピーダンスＺの計測を行う。

判定部８は、例えば、図示しない演算処理手段としてのＣＰＵ（中央演算装置）や、記憶手段としてのメモリを備え、メモリに記憶されたソフトウェアプログラムにより、インピーダンスＺの計測値を入力として、インピーダンスＺが所定の閾値Ｚ_ｔｈをよぎったか否かによって被験検体中の目的核酸配列９の有無を出力したり、後述する方法による目的核酸配列９の定量結果を出力したりする。

＜被計測物＞
被計測物２は、目的核酸配列９を含み得る被験検体と、インピーダンス観測物質Ａと、プローブ12（図５を参照）としてのインピーダンス変動前駆物質と、５’→３’エキソヌクレアーゼ活性を有するポリメラーゼと、プライマー13（図６を参照）とを含む混合液である。

（目的核酸配列）
本実施形態の測定装置１および測定方法は、被験検体中の目的核酸配列９が核酸、核酸構造を分子内に有する化合物に好適に用いることができ、特にＰＣＲ法による核酸の増幅物である、二本鎖ＤＮＡの増加をモニタリングするのに適している。

ＲＮＡウイルスの感染を検出する場合には、被験検体（宿主）から試験試料を採取する。採取した試験試料からＲＮＡを抽出した後、ｃＤＮＡを合成し、鋳型ＤＮＡとして用いる。

（インピーダンス観測物質）
インピーダンス観測物質Ａは、電極４に対し電荷を発現する、インピータンス計測の対象となるものであり、インピーダンス変動物質Ｂ以外とは相互作用を起こさないもの、起こしても極めて小さいものであることが好ましい。溶液中でのインピーダンス観測物質Ａの移動度の変動が、電極４に対してインピーダンスの変動として認識される。

インピーダンス観測物質Ａは、例えば、フェリシアン化物イオン、フェロシアン化物イオン、フェロセン、および、これらの混合物からなる群から選択される酸化還元性電解質を形成する金属錯体である。

（プローブ）
プローブ12は、図５に示すように、目的核酸配列９の標的塩基配列に相補的な塩基配列を持つヌクレオチドであって、インピーダンス変動置換基Ｂ’で修飾されたインピーダンス変動前駆物質である。（図５では、インピーダンス変動置換基Ｂ’としてルテニウム錯体を例示している。）

インピーダンス変動置換基Ｂ’は、インピーダンス観測物質Ａの電荷移動性を変動させる化合物から誘導される基である。インピーダンス観測物質Ａの電荷移動性を変動させる化合物は、インピーダンス観測物質Ａの電荷移動性を増強する化合物であってもよく、インピーダンス観測物質Ａの電荷移動性を減弱する化合物であってもよいが、感度の点からインピーダンス観測物質Ａの電荷移動性を増強する化合物が好ましい。インピーダンス観測物質Ａの電荷移動性を変動させる化合物としては、メチレンブルー、ナイルブルー、アントラキノン誘導体、ナフタレン誘導体、金属アンミン錯体、ならびに、有機配位子としてビピリジン誘導体、フェナントロリン誘導体、および／または、ジピリドフェナジン誘導体を含む金属錯体からなる群から選択される酸化還元作用を有する化合物等が挙げられる。金属錯体として、例えば、ルテニウム錯体等を用いることができ、ルテニウム錯体として、例えば、ビピリジン、ジピリドフェナジンを配位子としたルテニウム錯体や、ビス（２，２’－ビピリジン）ジピリド［３，２－ａ：２’，３’－ｃ］フェナジンルテニウム（ＩＩ）(Ｒｕ（ｂｐｙ）_２ＤＰＰＺ錯体)等を用いることができる。なお、後記のインピーダンス変動物質Ｂが塩基対にインターカレートすることは好ましくないため、例えば芳香族環３個以上が縮環した縮合環がインピーダンス変動置換基Ｂ’中にある場合は、縮合環部分にリンカーを介してプローブ12のヌクレオチドと結合することが好ましい。例えば、インピーダンス観測物質Ａの電荷移動性を変動させる化合物として、ビス（２，２’－ビピリジン）ジピリド［３，２－ａ：２’，３’－ｃ］フェナジンルテニウム（ＩＩ）(Ｒｕ（ｂｐｙ）_２ＤＰＰＺ錯体)を用いる場合、有機配位子のうちジピリド［３，２－ａ：２’，３’－ｃ］フェナジン部分にリンカーを介してプローブ12のヌクレオチドと結合することが好ましい。または、フェナントロリン骨格またはジピリドフェナジン骨格にかさ高い置換基を導入したフェナントロリン誘導体またはジピリドフェナジン誘導体を有機配位子としてもよい。

インピーダンス変動置換基Ｂ’による修飾は周知の方法を用いることができ、修飾するのはプローブ12のヌクレオチドの３’端でも５’端でもよいが、修飾のしやすさや安価であることからプローブ12のヌクレオチドの５’端を修飾することが好ましい。インピーダンス観測物質Ａの電荷移動性を変動させる化合物が有する官能基と直接プローブ12のヌクレオチドの５’端または３’端を修飾してもよく、クロスリンカーまたはスペーサー等を介してインピーダンス観測物質Ａの電荷移動性を変動させる化合物をプローブ12のヌクレオチドの５’端または３’端を修飾してもよい。

例えば、目的核酸配列９の標的配列に相補的な配列を持つヌクレオチドの５’端の塩基中のアミノ基を、Ｓ－アセチルチゴグリコール酸Ｎ－スクシンイミジル(ＳＡＴＡ)等のクロスリンカーと反応させたものと、インピーダンス観測物質Ａの電荷移動性を変動させる化合物中の有機配位子の炭素原子に結合した水素原子１つを臭素原子で置換したものとを反応させることで、インピーダンス変動置換基Ｂ’で修飾されたインピーダンス変動前駆物質を得ることができる。

プローブ12の塩基配列は目的核酸配列９に応じて適宜決定されるが、プローブ12の塩基数は少なくとも２０塩基であることが好ましく、３０塩基程度であることがより好ましい。プローブ12の塩基数の上限値は例えば１００塩基以下程である。例えば、インピーダンス変動置換基Ｂ’を５’端に修飾する場合、３’端に標的配列に非特異的な塩基配列を付加して、所望とする塩基数のプローブ12を得てもよい。

また、プローブ12は、電気化学的検出だけでなく、光学的検出にも使えるようにするため、蛍光を発する化合物や置換基で修飾されてもよい。

（ポリメラーゼ）
ポリメラーゼとしては、５’→３’エキソヌクレアーゼ活性を有するポリメラーゼが使用でき、特に、ＰＣＲに常用されている、ＴａｑＤＮＡポリメラーゼ等の各種耐熱性ポリメラーゼが使用できる。

被計測物２である混合液には、上記のほか、必要に応じて、ＰＣＲに常用されている、緩衝液、塩および添加剤の１種または２種以上を、常用されている濃度で含んでいてもよい。

（インピーダンス変動物質）
インピーダンス変動置換基Ｂ’で修飾したプローブ12は、分子量が大きく拡散係数が小さいため、インピーダンス観測物質Ａの電荷移動性に作用せず、被計測物２のインピーダンスＺは変動しない。

被計測物２である混合液に目的核酸配列９が存在し、混合液に対してＰＣＲ反応が実施されると、まず、ＰＣＲのアニーリングステップでは、プライマー13およびプローブ12が、目的塩基配列９の所定領域に相補的に結合し、続くＰＣＲの伸長ステップでは、ポリメラーゼの作用により、プローブ12が分解され、インピーダンス変動物質Ｂを生成する。このインピーダンス変動物質Ｂは、プローブ12のヌクレオチドの５’端または３’端の１塩基がインピーダンス変動置換基Ｂ’で修飾されたものであり、分子量がインピーダンス変動前駆物質に比して小さく、拡散係数が大きいため、インピーダンス観測物質Ａの電荷移動性を増強または減弱させる作用が大きくなる。

（プライマー）
プライマー13は、図６に示すように、目的核酸配列９の標的塩基配列に相補的な塩基配列を持つヌクレオチドであり、目的核酸配列９に応じて、適宜公知の方法で設計したものを使用できる。

＜目的核酸配列の検出方法＞
インピーダンス変動置換基Ｂ’で修飾したプローブ12は、分子量が大きいので拡散係数が小さいため、インピーダンス観測物質Ａの電荷移動性に作用せず、被計測物２のインピーダンスＺは変動しない。

ＰＣＲのアニーリングステップでは、被計測物２中に目的核酸配列９が存在すると、図８に示すように、プローブ12およびプライマー13が、目的核酸配列９の所定領域に相補的に結合する。

ＰＣＲの伸長ステップでは、図９に示すように、伸長反応で、ポリメラーゼが相補鎖を合成する。

さらに伸長反応が進むと、図１０に示すように、ポリメラーゼがプローブ12のところまで届き、ポリメラーゼがプローブ12をインピーダンス変動物質Ｂへ分解する。

図１１に示すように、プローブ12が分解されると、インピーダンス変動物質Ｂの作用により、被計測物２のインピーダンスＺが低下する。より具体的には、インピーダンス変動置換基Ｂ’で修飾されたプローブ12が分解されることで、インピーダンス変動置換基Ｂ’の修飾１個当たりの塩基の数が１塩基となり（インピーダンス変動物質Ｂ）、分子量が小さくなるので、拡散係数が増大する。拡散係数が増大することにより、インピーダンス観測物質Ａの電荷移動性を例えば増強させる作用が大きくなり、インピーダンス観測物質ＡのインピーダンスＺが低下する。図１２に示すように、ＰＣＲの増幅が進むにしたがい、さらにインピーダンスＺが低下する。

被計測物２中に目的核酸配列９が存在しない場合は、プローブ12は分解されないので、ＰＣＲサイクル数が増えても、被計測物２のインピーダンスＺは変動しない。

したがって、図１２において、インピーダンスＺが、所定の閾値Ｚ_ｔｈをよぎった場合に、被計測物２中に目的核酸配列９が存在すると判定することができる。一方、所定のＰＣＲサイクル数の後も、インピーダンスＺが所定の閾値Ｚ_ｔｈをよぎらない場合は、被計測物２中に目的核酸配列９が存在しないと判定することができる。

ＰＣＲ条件は、特に限定されないが、例えば、９８℃２分間の初期変性ステップを行った後に、９８℃１０秒間の変性ステップ、５５℃２０秒間のアニーリングステップ、および、６８℃３０秒間の伸長ステップを１サイクルとして、４０サイクル繰り返す。インピーダンス計測は、伸長ステップ後に行うことが好ましく、伸長ステップ直後、すなわち伸長ステップ後、次の変性ステップの前に行うことがより好ましい。インピーダンス計測の温度は適宜選択でき、インピーダンス計測はＰＣＲサイクルごとに一定の温度で行うことが好ましい。

閾値Ｚ_ｔｈは、例えば、ある特定の被計測物２に対して予備実験をした結果から適宜決定することで、以後、同様の被計測物２に対して適用することができる。

＜目的核酸配列の定量測定＞
目的核酸配列９の定量測定は、リアルタイムＰＣＲで周知の絶対定量法および相対定量法と同様の方法で行うことができる。絶対定量法では、例えば、Ｙ軸にＣ_Ｔ値（増幅曲線が閾値に達した時のＰＣＲサイクル数）、Ｘ軸にスタンダード量を取った検量線を書き、目的核酸配列９の量を定量すればよい。相対定量法では、例えば、希釈率またはテンプレート量の対数値（Ｘ軸）に対してＣ_Ｔ値（Ｙ軸）をプロットし、それぞれの検量線を作成すればよい。

以上のように目的核酸配列９の検出および定量測定が可能な本実施形態の測定装置１および測定方法によれば、大規模な連続解析やリアルタイム分析を実現することができる。

＜インピーダンスの計測値＞
図１３は、ＥＩＳ法の測定対象物である被計測物２の一般的な等価回路の一例を示す図である。このような等価回路については、ＥＩＳ法における従来技術で知られているところであり、簡単に説明する。被計測物２の種類によっては、図中の等価回路と異なる場合もある。

溶液抵抗Ｒ_ｓは、被計測物２の抵抗率等で決まる電気抵抗成分である。電荷移動抵抗Ｒ_ｃｔは、電極４界面での被計測物２の反応による抵抗である。電気二重層静電容量Ｃ_ｄｌは、被計測物２の静電容量成分を表す。ワールブルグインピーダンスＷは、拡散抵抗を表す。

被計測物２中の電荷移動を担う物質が取り込まれるような条件において、一例として、被計測物２のインピーダンスＺの計測に基づく電荷移動抵抗Ｒ_ｃｔに関する計測により、被計測物２の化学的性質の変化の進捗を知ることができる。

このような等価回路のインピーダンスＺは、例えば、数ｋＨｚ程度以上の高い周波数における計測では、ほぼ溶液抵抗Ｒ_ｓとなる。等価回路で、電気二重層静電容量Ｃ_ｄｌが短絡と近似できる周波数領域に相当するからである。

電気二重層静電容量Ｃ_ｄｌによる容量リアクタンスの絶対値に対して電荷移動抵抗Ｒ_ｃｔの絶対値が無視できない程度の大きさとなるような周波数、例えば、数百Ｈｚから数Ｈｚ程度の周波数領域では、コールコールプロットにおいて半円状のインピーダンスを示す。計測を行う周波数として、当該半円の頂点付近になる周波数を選択すれば、インピーダンスの虚部は電荷移動抵抗Ｒ_ｃｔの半分程度になる。すなわち、一つの周波数による計測におけるインピーダンスの虚部によって、インピーダンス計測を行うことが可能である。また、当該半円の頂点付近になる周波数を複数選択して計測を行い、そのインピーダンスの虚部の値の平均をとることなども可能である。

周波数が低いと、電気二重層静電容量Ｃ_ｄｌが開放と近似できる周波数領域に近づくため、等価回路のインピーダンスは、溶液抵抗Ｒ_ｓと電荷移動抵抗Ｒ_ｃｔの和に近づく。すなわち、計測を行う周波数としてこのような低い周波数を選択すれば、インピーダンスの実部は溶液抵抗Ｒ_ｓと電荷移動抵抗Ｒ_ｃｔの和に近くなる。つまり、一つの周波数による計測におけるインピーダンスの実部によって、インピーダンス計測を行うことが可能である。また、当該電気二重層静電容量Ｃ_ｄｌが開放と近似できる周波数を複数選択して計測を行い、そのインピーダンスの実部の値の平均をとることなども可能である。さらに、インピーダンスの実部の代わりにインピーダンスの絶対値を用いることも可能であり、特に、当該周波数においてインピーダンスの虚部がゼロではない場合に有効な場合がある。

例えば、数Ｈｚ以下のようなさらに低い周波数領域では、ワールブルグインピーダンスＷによる変化が支配的になるようなインピーダンスの変化を示す。すなわち、周波数が低くなるにつれて、インピーダンスの実部と虚部が共に増加するような変化が生じる。

図１４は、ＥＩＳ法におけるコールコールプロットの一例を模式的に示す概略図である。このコールコールプロットから分かるように、インピーダンスの絶対値｜Ｚ｜と、インピーダンスの実部Ｚ_ｒｅａｌとの間には大きな相違はない。インピーダンスの虚部も同様の傾向を示す。

図１５は、コールコールプロットにおいて、高低２つの周波数で半円に近似して、その半円の直径をインピーダンスから推定した電荷移動抵抗Ｒ_ｃｔとする際の電荷移動抵抗Ｒ_ｃｔの求め方を模式的に示す概略図である。図中、溶液抵抗Ｒ_ｓ、および、中心点が実軸上にある半円上の１点ａ－ｊｂの２点が定まれば、ｂ：（ａ－Ｒ_ｓ）＝（Ｒ_ｓ＋Ｒ_ｃｔ－ａ）：ｂなので、以下の式により、高低２つの周波数ｆで計測したインピーダンスから推定した電荷移動抵抗Ｒ_ｃｔが求められる。溶液抵抗Ｒ_ｓは、例えば少なくとも１回、例えば１ｋＨｚ以上の高い周波数におけるインピーダンスの計測により溶液抵抗Ｒ_ｓに相当するインピーダンスを計測すればよく、例えば、周波数ｆ＝１ｋＨｚにおけるインピーダンス計測値の実部Ｚ_ｒｅａｌとすることができる。

インピーダンスの絶対値、虚部、実部のいずれかを用いる場合は、１つの周波数の計測結果でも複数の周波数の計測結果でもよいことを前述した。一方、この半円への近似による方法では、最低２つの周波数（コールコールプロット上の２点）における計測結果が必要である。さらに、より多くの周波数における計測結果を用いて半円への近似を行い、それらの平均を取るなどの方法も可能である。

図１６は、コールコールプロットにおいて、高低２つの周波数で計測したインピーダンスにおける実部の差、またはインピーダンスの差の絶対値（ベクトル差の絶対値）を、インピーダンスから推定した電荷移動抵抗Ｒ_ｃｔとすることを模式的に示す概略図である。この方法においても、最低２つの周波数（コールコールプロット上の２点）における計測結果が必要である。さらに、より多くの周波数における計測結果を用いて、それらの平均を取るなどの方法も可能である。

図１７は、コールコールプロットにおいて、３つの周波数で楕円に近似して、その楕円の実軸方向の直径をインピーダンスから推定した電荷移動抵抗Ｒ_ｃｔとすることを模式的に示す概略図である。具体的な対象物における実測結果では、半円が縦につぶれたようなコールコールプロットになることも多いので、楕円に近似することによってより正確な近似を行うことができる場合がある。この方法においては、最低３つの周波数（コールコールプロット上の３点）における計測結果が必要である。さらに、より多くの周波数における計測結果を用いて、それらの平均を取るなどの方法も可能である。なお、具体的な対象物における実測結果において、もし半円が縦に伸びたようなコールコールプロットであっても（すなわち、実軸方向の直径が短径であっても）、同様に近似が可能である。

図１８は、コールコールプロットにおいて、３つの周波数で円弧に近似して、その円弧の虚部＝０Ωにおける実部の差をインピーダンスから推定した電荷移動抵抗Ｒ_ｃｔとすることを模式的に示す概略図である。半円の中心が実軸よりも下側にあるような状態に近いコールコールプロットにおいては、円弧に近似することによってより正確な近似を行うことができる場合もある。この方法においても、最低３つの周波数（コールコールプロット上の３点）における計測結果が必要である。さらに、より多くの周波数における計測結果を用いて、それらの平均を取るなどの方法も可能である。

かように、インピーダンスから推定する電荷移動抵抗Ｒ_ｃｔの求め方は例示しているだけでも５通りある。被計測物２のインピーダンスＺの求め方は、インピーダンスの実部・虚部・絶対値を加えて、例示しているだけでも８通りあることになるが、これらに限定するものではない。

以下の実施例において、ゲノムＤＮＡの調製、ＰＣＲ等は、当業者に周知慣用の方法を用いて行うことができる。例えば、Molecular Cloning:a Laboratory Manual, 4th ed.（Michael R. Green and Joseph Sambrook）等を参照されたい。

＜ＰＣＲおよびインピーダンス計測＞
ＰＣＲは一例として、表１（組成）、表２（反応条件）および表３（配列）に示す条件で実施する。ヒトβアクチン遺伝子座を含むヒト細胞由来ゲノムＤＮＡをヒト細胞から調製し、鋳型ＤＮＡとして用いる。ＫＯＤＦＸ（東洋紡株式会社）を用いて製造者の指示に従ってＰＣＲを行う。また、ＰＣＲ用プライマーおよびインピーダンス観測物質（フェリシアン化物およびフェロシアン化物）は、市販のものを用いる。

インピーダンス変動前駆物質（Ｒｕ錯体修飾プローブ）は、例えば以下の文献に記載の方法にしたがって調製する。
Jing-Tang Linら、”A Sulfhydryl-Reactive Ruthenium (II) Complex and Its Conjugation to Protein G as a Universal Reagent for Fluorescent Immunoassays”、PLOS ONE、Volume 7、Issue 4、2012年4月

目的核酸配列の測定は、インピーダンスを計測可能な測定装置を用いて行う（図３）。インピーダンスは、ＰＣＲを行いながら、インピーダンス観測物質の変化を指標にして計測する（図１２、図１４）。インピーダンスの計測は、表２の伸長ステップ後に行う。インピーダンスの計測条件は、一例として、電圧１００ｍＶ、周波数は１０ｋＨｚ～０．１Ｈｚとする。

別の一例として、ＰＣＲは、表４（組成）、表５（反応条件）および表６（配列）に示す条件で実施することもできる。表５では、アニーリングステップと伸長ステップを一つのステップとして実行しているが、このような場合でも同様に本発明を適用可能である。ヒトβアクチン遺伝子座を含むヒト細胞由来ゲノムＤＮＡをヒト細胞から調製し、鋳型ＤＮＡとして用いる。ＰｒｅｍｉｘＥｘＴａｑ（登録商標）（タカラバイオ株式会社）を用いて製造者の指示に従ってＰＣＲを行う。また、ＰＣＲ用プライマーおよびインピーダンス観測物質（フェリシアン化物およびフェロシアン化物）は、市販のものを用いる。そのほかの条件は、インピーダンスの計測を、表５のアニーリングおよび伸長ステップ後に行う以外は実施例１と同様にして、ＰＣＲを行いながら、インピーダンスを計測し、目的核酸配列の測定を行う。

ＰＣＲにおいて、インピーダンス変動前駆物質の核酸配列として、配列番号７に記載のものを用いる代わりに、配列番号８に記載のものを用いる以外は、実施例２と同様に、ＰＣＲを行いながら、インピーダンスを計測し、目的核酸配列の測定を行う。

以上、本発明を実施形態および実施例に基づいて説明したが、本発明は種々の変形実施をすることができる。種々の変形実施も本発明の範囲に含まれる。

１測定装置
２被計測物
３容器
４電極
５シール部
６温度制御部
７インピーダンス計測部
８判定部
９目的核酸配列
10 信号源
11 電流電圧計測手段
12 プローブ（インピーダンス変動前駆物質）
13 プライマー
Ｂインピーダンス変動物質
Ｂ’ インピーダンス変動置換基
Ｒ_ｓ溶液抵抗
Ｒ_ｃｔ電荷移動抵抗
Ｚインピーダンス
Ｚ_ｔｈ閾値

Claims

目的核酸配列を含み得る被計測物のインピーダンスの変化を計測し、被験検体中の目的核酸配列を測定するための測定装置を用いた測定方法であって、
前記測定装置が、
前記被計測物を収容する容器と、
前記容器に設けられ、前記被計測物に接触する少なくとも一対の電極と、
前記電極において前記インピーダンスを計測するインピーダンス計測部と、
前記被計測物に印加する温度を調節する温度制御部と、
を備え、
前記被計測物が、
前記被験検体と、
インピーダンス観測物質と、
前記目的核酸配列の標的配列に相補的な配列を持つプローブであって、インピーダンス変動置換基で修飾されたインピーダンス変動前駆物質と、
５’→３’エキソヌクレアーゼ活性を有するポリメラーゼと、
プライマーと、
を含む混合液であり、
前記混合液に対してＰＣＲ（Polymerase Chain Reaction）を実施することで、前記５’→３’エキソヌクレアーゼ活性を有するポリメラーゼによって、前記インピーダンス変動前駆物質が分解されてインピーダンス変動物質を生成する、測定方法。
前記測定装置は、前記インピーダンスが、所定の閾値をよぎったか否かを判定する判定部をさらに備える、請求項１に記載の測定方法。
前記インピーダンス変動物質が、前記インピーダンス観測物質の電荷移動性を増強させるものであり、
前記インピーダンス観測物質が、前記電極に対し電荷を発現し、前記インピーダンス変動物質以外とは相互作用を起こさないものである、請求項１または２に記載の測定方法。
前記インピーダンス変動物質が、メチレンブルー、ナイルブルー、アントラキノン誘導体、ナフタレン誘導体、金属アンミン錯体、ならびに、有機配位子としてビピリジン誘導体、フェナントロリン誘導体、および／または、ジピリドフェナジン誘導体を含む金属錯体からなる群から選択される酸化還元作用を有する化合物で修飾されているものである、請求項１～３のいずれか１項に記載の測定方法。
前記インピーダンス観測物質が、フェリシアン化物イオン、フェロシアン化物イオン、フェロセン、および、これらの混合物からなる群から選択される酸化還元性電解質を形成する金属錯体である、請求項１～４のいずれか１項に記載の測定方法。
前記インピーダンスとして、前記インピーダンスの絶対値、前記インピーダンスの実部および前記インピーダンスの虚部のうち少なくとも１つを用いる、請求項１～５のいずれか１項に記載の測定方法。
前記インピーダンスとして、前記インピーダンスから算出される電荷移動抵抗の推定値を用いる、請求項１～５のいずれか１項に記載の測定方法。
前記インピーダンスの計測値に基づくコールコールプロットを、前記コールコールプロット上の２点以上を用いて半円に近似して、当該半円の直径を前記電荷移動抵抗の推定値とするか、
前記コールコールプロット上の２点以上を用いた前記インピーダンスの実部の差を前記電荷移動抵抗の推定値とするか、
前記コールコールプロット上の２点以上を用いた前記インピーダンスの差の絶対値を前記電荷移動抵抗の推定値とするか、
前記コールコールプロットを、前記コールコールプロット上の３点以上を用いて楕円に近似して、当該楕円の実軸方向の直径を前記電荷移動抵抗の推定値とするか、または、
前記コールコールプロットを、前記コールコールプロット上の３点以上を用いて円弧に近似して、当該円弧の虚部＝０Ωにおける実部の差を前記電荷移動抵抗の推定値とする、請求項７に記載の測定方法。
ＰＣＲ（Polymerase Chain Reaction）法とＥＩＳ（Electrochemical Impedance Spectroscopy）法とを組み合わせることにより被験検体中の目的核酸配列を測定するための測定方法であって、
前記目的核酸配列の標的配列に相補的な配列を持つプローブであって、インピーダンス変動置換基で修飾されたインピーダンス変動前駆物質を用い、
前記被験検体と、インピーダンス観測物質と、前記インピーダンス変動前駆物質と、５’エキソヌクレアーゼ活性を有するポリメラーゼとを含む混合液に対してＰＣＲ反応を実施し、
前記ポリメラーゼによる前記インピーダンス変動前駆物質のインピーダンス変動物質への分解を惹起し、
前記インピーダンス変動物質が、前記インピーダンス観測物質の電荷移動性を増強させることによって観測される前記混合液のインピーダンスの変化をＥＩＳ法によって計測する、測定方法。
前記インピーダンス変動物質が、前記インピーダンス観測物質の電荷移動性を増強させるものであり、
前記インピーダンス観測物質が、前記インピーダンスを計測するための電極に対し電荷を発現し、前記インピーダンス変動物質以外とは相互作用を起こさないものである、請求項９に記載の測定方法。
前記インピーダンス変動物質が、メチレンブルー、ナイルブルー、アントラキノン誘導体、ナフタレン誘導体、金属アンミン錯体、ならびに、有機配位子としてビピリジン誘導体、フェナントロリン誘導体、および／または、ジピリドフェナジン誘導体を含む金属錯体からなる群から選択される酸化還元作用を有する化合物で修飾されているものである、請求項９または１０に記載の測定方法。
前記インピーダンス観測物質が、フェリシアン化物イオン、フェロシアン化物イオン、フェロセン、および、これらの混合物からなる群から選択される酸化還元性電解質を形成する金属錯体である、請求項９～１１のいずれか１項に記載の測定方法。
前記インピーダンスとして、前記インピーダンスの絶対値、前記インピーダンスの実部および前記インピーダンスの虚部のうち少なくとも１つを用いる、請求項９～１２のいずれか１項に記載の測定方法。
前記インピーダンスとして、前記インピーダンスから算出される電荷移動抵抗の推定値を用いる、請求項９～１２のいずれか１項に記載の測定方法。
前記インピーダンスの計測値に基づくコールコールプロットを、前記コールコールプロット上の２点以上を用いて半円に近似して、当該半円の直径を前記電荷移動抵抗の推定値とするか、
前記コールコールプロット上の２点以上を用いた前記インピーダンスの実部の差を前記電荷移動抵抗の推定値とするか、
前記コールコールプロット上の２点以上を用いた前記インピーダンスの差の絶対値を前記電荷移動抵抗の推定値とするか、
前記コールコールプロットを、前記コールコールプロット上の３点以上を用いて楕円に近似して、当該楕円の実軸方向の直径を前記電荷移動抵抗の推定値とするか、または、
前記コールコールプロットを、前記コールコールプロット上の３点以上を用いて円弧に近似して、当該円弧の虚部＝０Ωにおける実部の差を前記電荷移動抵抗の推定値とする、請求項１４に記載の測定方法。