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JP7803907B2 - メソテリン及びｃｄ１３７結合分子 - Google Patents
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JP7803907B2 - メソテリン及びｃｄ１３７結合分子 - Google Patents

メソテリン及びｃｄ１３７結合分子

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Description

技術分野
本発明は、メソテリン（ＭＳＬＮ）及びＣＤ１３７の両方に結合する抗体分子に関する。抗体分子は、ＭＳＬＮのＣＤＲベースの結合部位と、抗体分子の定常ドメインに位置するＣＤ１３７抗原結合部位とを含む。抗体分子は、例えば、癌の処置に用途が見出される。
発明の背景
細胞シグナル伝達は全ての生物の生命の本質的な部分であり、通常、可溶性又は表面発現リガンドと相互作用する細胞表面受容体が関与する。この相互作用により、受容体、リガンド、又はその両方が変化する。例えば、リガンド結合は、受容体の立体構造変化を誘発し、受容体を二量体又はオリゴマーにクラスター化させることができる。このクラスタリング効果は、次いで、細胞内シグナル伝達経路の活性化をもたらす。ＣＤ１３７などの腫瘍壊死因子受容体スーパーファミリー（ＴＮＦＲＳＦ）のメンバーを含め、この方法で活性化される多くの受容体が存在する。
ＣＤ１３７（４－１ＢＢ；ＴＮＦＲＳＦ９）は、腫瘍壊死因子受容体スーパーファミリー（ＴＮＦＲＳＦ）の共刺激分子である。ＣＤ１３７は、活性化後にＣＤ８＋Ｔ細胞で上方制御されることが広く知られており、活性化ＣＤ４＋ヘルパーＴ細胞、Ｂ細胞、制御性Ｔ細胞、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、ナチュラルキラーＴ（ＮＫＴ）細胞、及び樹状細胞（ＤＣ）においても発現され得る（Bartkowiak & Curran, 2015）。Ｔ細胞の細胞傷
害性の増強におけるＣＤ１３７の主要な機能的役割は、最初に１９９７年に説明され（Shuford et al., 1997）、その後すぐ、抗ＣＤ１３７ｍＡｂが抗癌治療薬として提案された。
ＣＤ１３７は、ＣＲＤ１～４と呼ばれる４つの細胞外システインリッチドメインと、ＣＤ１３７シグナル伝達に関与する細胞質領域とを有する膜貫通タンパク質である。ＣＤ１３７のリガンドはＣＤ１３７Ｌである。ＣＤ１３７／ＣＤ１３７Ｌ複合体の結晶構造は存在しないが、ＣＤ１３７はＣＤ１３７Ｌと三量体／三量体複合体を形成すると予測されている（Won et al., 2010）。ＣＤ１３７Ｌの関与は、受容体三量体の形成とそれに続く複数の受容体三量体のクラスター化をもたらし、ＣＤ１３７シグナル伝達カスケードの活性化につながる。このシグナル伝達カスケードは、活性化誘導細胞死に対する生存シグナルをＴ細胞に提供し（Hurtado et al., 1997）、それにより、効果的なＴ細胞免疫応答の維持及び免疫学的記憶の生成に重要な役割を果たす（Bartkowiak & Curran, 2015）。
白血球生物学におけるＣＤ１３７の役割は、腫瘍免疫学におけるその役割の背後にある明確な生物学的根拠と共に、一般的によく理解されている。ＣＤ１３７は活性化Ｔ細胞によって発現され、抗原特異的ＣＤ４＋及びＣＤ８＋Ｔ細胞を同定するためのマーカーとして使用されている。通常、ＣＤ１３７の発現は、ＣＤ４＋Ｔ細胞よりもＣＤ８＋Ｔ細胞で高くなる（Wen et al., 2002）。ＣＤ８＋Ｔ細胞の場合、インターフェロンガンマ及びインターロイキン２の産生を介した増殖、生存及び細胞傷害性エフェクター機能は、ＣＤ１３７架橋に起因するとされている。ＣＤ１３７架橋は、メモリーＣＤ８＋Ｔ細胞の分化及び維持にも寄与する。ＣＤ４＋Ｔ細胞の一部のサブセットでは、ＣＤ１３７架橋が同様に増殖及び活性化を引き起こし、インターロイキン２などのサイトカインの放出をもたらす（Makkouk et al., 2016）。
腫瘍標的化ｍＡｂを介したナチュラルキラー（ＮＫ）媒介性抗体依存性細胞傷害性（ＡＤＣＣ）は、インビトロ及びインビボでのアゴニスト性抗ＣＤ１３７モノクローナル抗体を介したＣＤ１３７刺激の結果として増強されることが実証されている（Bartkowiak & Curran, 2015）。ＮＫ細胞は、Ｆｃ受容体を介して抗体に結合し、抗体のアイソタイプに
応じて、ＮＫ細胞の活性化を引き起こし、細胞傷害性顆粒の放出及び標的細胞の溶解を引き起こすことができる（Kohrt et al., 2012）。Kohrtらは、組み合わせて投与した場合
にＡＤＣＣを増強することによって、抗ＣＤ１３７アゴニスト性抗体が、治療用抗体であるリツキシマブ、トラスツズマブ、及びセツキシマブの抗腫瘍活性を増強することを実証した（Kohrt et al., 2014; Kohrt et al., 2011）。さらに、ヒトＮＫ細胞は、そのＦｃγＲを介して細胞結合抗体に遭遇した後、ＣＤ１３７の発現をアップレギュレートする。その後の抗ＣＤ１３７抗体によるこれらのＮＫ細胞の刺激は、腫瘍細胞に対するＡＤＣＣを増強することが示されている（Chester et al., 2015;Chester et al., 2016）。
Ｂリンパ球も活性化時にＣＤ１３７を発現する。ＣＤ１３７リガンドのＣＤ１３７への結合は、Ｂ細胞の増殖、生存、及びサイトカイン産生を増強する。ＣＤ１３７発現は、ＣＤ４０がそのリガンドＣＤ１５４（ＣＤ４０リガンド）に結合した後、正常及び悪性のヒトＢ細胞でも誘導され、ＣＤ１３７がその後活性化される場合、Ｂ細胞の生存率の増強をもたらす。
ＣＤ１３７は、腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）の腫瘍応答性サブセットで発現することも実証されている。ＣＤ１３７単剤療法は、ＭＣ３８、ＣＴ２６及びＢ細胞リンパ腫などのいくつかの前臨床免疫原性腫瘍モデルで有効であることが示されている。ＣＤ１３７と化学療法、サイトカイン及びその他のチェックポイント調節因子などの他の抗癌剤との係合により、定着腫瘍の増殖が低減されることが実証されている。具体的には、抗ＣＤ１３７抗体と、抗ＣＤ２０、抗ＥＧＦＲ、及び抗ＨＥＲ－２抗体との組み合わせは、様々な前臨床異種移植モデルにおける腫瘍増殖の低減に相乗効果をもたらすことが示されている（Kohrt et al., 2014; Kohrt et al., 2012; Kohrt et al., 2011）。
腫瘍を標的としたモノクローナル抗体療法と抗ＣＤ１３７アゴニスト抗体による処置を組み合わせることで、リンパ腫（Kohrt et al., 2011）、頭頸部癌、結腸直腸癌（Kohrt et al., 2014）及び乳癌（Kohrt et al., 2012）の前臨床モデルで有望な結果が示されている。しかし、ＣＤ１３７アゴニスト抗体処置に関連する用量を制限する高グレードの肝臓の炎症のため、臨床開発は遅れている。非リガンド遮断ヒトＩｇＧ４アイソタイプ抗体（Chester et al., 2018）であるウレルマブ（BMS-663513）は、臨床試験に入った最初の抗ＣＤ１３７抗体であったが、これらは、顕著なオンターゲットの用量依存的な肝毒性が観察された後に中止された（Chester et al., 2018）。より最近では、固形癌の処置におけるウレルマブの臨床試験が再開され、ウレルマブ処置は、放射線療法（NCT03431948）
、又はリツキシマブ（NCT01775631）、セツキシマブ（NCT02110082）、抗ＰＤ－１抗体ニボルマブ（NCT02253992、NCT02534506、NCT02845323）、及びニボルマブと抗ＬＡＧ－３
抗体BMS986016（NCT02658981）の組み合わせなどの、他の治療用抗体と組み合わされた。しかし、ウレルマブ処置に関連する肝毒性を低減するために、これらの試験でのウレルマブの投与は制限されなければならず、有効性の結果は期待外れであった（Chester et al., 2018）。
ヒトＩｇＧ２アイソタイプ抗体であるファイザーの抗ＣＤ１３７抗体ウトミルマブ（PF-05082566）では、進行癌の第Ｉ相臨床試験において、０．０３ｍｇ／ｋｇから１０ｍｇ
／ｋｇまでの用量範囲で用量制限毒性（ＤＬＴ）は観察されていない（Chester et al.2016; Segal et al., 2018）。しかし、この抗体による全体的な客観的応答率は、固形腫瘍を有する患者においてわずか３．８％であり、ウトミルマブはウレルマブよりも効力及び臨床的有効性が弱い一方、安全性プロファイルがより良好であることを示している可能性
がある（Chester et al., 2018; Segal et al., 2018）。ウトミルマブは、放射線療法（NCT03217747）又は化学療法との組み合わせ、並びに抗ＰＤ－Ｌ１抗体アベルマブ（NCT02554812）及び抗ＰＤ－１抗体ペンブロリズマブ（NCT02179918）を含む他の抗体療法との
組み合わせで、安全性、忍容性、用量制限毒性（ＤＬＴ）、最大耐量（ＭＴＤ）、及び異なる処置の組み合わせの有効性を評価するために試験された。これらの試験は進行中であり、初期の結果では、５ｍｇ／ｋｇまでの用量でＤＬＴを示さず、ウトミルマブとペンブロリズマブの組み合わせで２６％の患者応答率を示している。ウトミルマブとアベルマブ及び他の免疫腫瘍療法との３つの組み合わせも試験されている（NCT02554812、NCT03217747）。
ＭＳＬＮは、健康な個体の胸膜、腹膜及び心膜（Hassan et al., 2005）を覆う中皮細
胞上に比較的低レベルで発現するが、中皮腫、扁平上皮癌、膵臓癌、肺癌、胃癌、乳癌、子宮内膜癌及び卵巣癌を含む、いくつかの異なる癌では高度に発現する。メソテリンの通常の生物学的機能は知られていない。癌との関連で、ＭＳＬＮの高発現レベルは、卵巣癌、胆管癌、肺腺癌及びトリプルネガティブ乳癌の予後不良と相関している。正常細胞でのＭＳＬＮの発現が限られているのに対し、腫瘍細胞では高発現であるため、モノクローナル抗体を使用した魅力的な治療的標的となる（Hassan et al., 2016）。
ＭＳＬＮは、６９ｋＤａの前駆体タンパク質（６２８アミノ酸）として表される。次に、前駆体タンパク質は、エンドプロテアーゼフューリンによって切断されて、巨核球増強因子（ＭＰＦ）と呼ばれる分泌されたＮ末端領域を放出するが、４０ｋＤａタンパク質の成熟ＭＳＬＮは、グリコシルホスファチジルイノシトール（ＧＰＩ）リンカーを介して細胞膜に付着したままである。ヒトＭＳＬＮは、ＭＳＬＮのマウス及びカニクイザルのオルソログとそれぞれ６０％及び８７％のアミノ酸同一性を共有している。
膜に結合した成熟ＭＳＬＮは、膜アンカー配列を欠く変異体を作製するか、又は腫瘍壊死因子α変換酵素（ＴＡＣＥ）によるプロテアーゼ切断を行うことにより、代替スプライシングの結果として細胞からシェディングする（Sapede et al., 2008；Zhang et al., 2011）。可溶性シェッドＭＳＬＮは、患者の血清、及び悪性中皮腫、卵巣癌、又は高転移
性癌を含む腫瘍の間質に見られる。中皮腫患者の血中及び胸水中の可溶性ＭＳＬＮレベルの測定は、処置及び進行に対する患者の応答を監視することにつき米国ＦＤＡに承認されている（Hollevoet et al., 2012、Creany et al., 2015）。
ＭＳＬＮを標的とするいくつかの抗体ベースの療法が開発され、臨床試験で、主に中皮腫、膵臓癌及び非小細胞肺癌で試験されている（Hassan et al., 2016）。採用された戦
略には、抗体依存性細胞媒介性細胞傷害性（ＡＤＣＣ）活性を伴うアマツキシマブなどの抗ＭＳＬＮ抗体の使用、並びに毒素にコンジュゲートした抗体又は抗体フラグメントを含む、ＳＳ１Ｐ－ＰＥ３８及びアネツマブ－ラブタンシンなどの抗体薬物複合体（ＡＤＣ）の使用による、直接的な腫瘍細胞死滅が含まれる。
ＭＳＬＮを標的とする非コンジュゲート抗体は、好ましい安全性プロファイルを示しているが、その治療効果は限られている。一方、ＡＤＣは抗腫瘍活性においてより強力であることが示されているが、用量制限毒性と関連している。ＭＳＬＮ及び共刺激タンパク質ＣＤ４０を標的とするＡＢＢＶ－４２８、ＭＳＬＮ－ＣＤ３二重特異性Ｔ細胞エンゲージャー（ＢＩＴＥ）、並びにＭＳＬＮ－ＣＤ４７二重特異性分子を含む、免疫系に関与することを目的としたいくつかの二重特異性分子も開発中である。
発明の記載
上記の背景セクションで説明したように、ＣＤ１３７アゴニスト分子の臨床開発は、用量を制限する高グレードの肝臓の炎症（ウレルマブ）又は低い臨床効果（ウトミルマブ）のいずれかに関連する処置のため、阻止されてきた。
本発明者らは、高活性を示すが、用量を制限する肝臓の炎症とは関連しないＣＤ１３７アゴニスト分子が当技術分野で必要であることを認識した。そのような分子は、分子の効力、ひいては有効性を最適化する用量で個体に投与され得、例えば、免疫療法剤として癌の処置に使用され得る。
理論に拘束されることを望むものではないが、肝臓に存在するＴ細胞は、抗ＣＤ１３７アゴニスト分子によって活性化され、肝臓の炎症を引き起こす可能性を有し得ると考えられている。ＣＤ８＋Ｔ細胞は、敗血症／ウイルス感染症後の肝臓の炎症及びアポトーシスを促進することが示されている（Wesche-Soldato et al., 2007）。しかし、この効果は
ＣＤ１３７に特有のものではなかった。マウスにおける抗ＣＤ１３７アゴニスト抗体療法は、肝臓へのＣＤ１３７依存性Ｔ細胞浸潤をもたらすことが示されている（Dubrot J et al., 2010）。これらの研究の結果を総合すると、ウレルマブなどの高活性の抗ＣＤ１３
７アゴニスト抗体が活性化ＣＤ８＋Ｔ細胞の肝臓への浸潤を引き起こし、それにより、肝臓の炎症を引き起こし得ることが示されている。
上記の背景セクションで説明したように、ＣＤ１３７リガンドのＣＤ１３７への最初のライゲーションは、受容体の三量体化、続いて受容体のクラスター化、活性化、及びその後の強力な抗腫瘍免疫細胞活性の開始につながる一連のイベントを開始すると考えられている。したがって、治療剤がＣＤ１３７の活性化を効率的に達成するためには、いくつかの受容体単量体が、三量体リガンドによる架橋を模倣する方法で一緒に架橋される必要があると予想される。
本発明者らは、ＭＳＬＮの相補性決定領域（ＣＤＲ）ベースの抗原結合部位及び抗体分子の定常ドメインに位置するＣＤ１３７抗原結合部位を含む抗体分子を単離した。本発明者らは、そのような抗体分子が、インビトロでＣＤ１３７及びＭＳＬＮの両方に結合した場合に、ＣＤ１３７のクラスター化及びシグナル伝達を誘導することができることを示した。
理論に拘束されることを望むものではないが、抗体分子は、ＣＤＲベースの抗原結合部位を介してＭＳＬＮに結合し、腫瘍細胞表面上のいくつかの抗体分子の架橋をもたらし、続いて、抗体分子のＣＤ１３７抗原結合部位が、腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）などの免疫細胞の表面上のＣＤ１３７に結合し、ＣＤ１３７のクラスター化及び活性化を生じ、それにより、免疫活性化を生じると考えられている。活性化された免疫細胞は、次いで、腫瘍に作用し、腫瘍免疫療法をもたらすことができる。
腫瘍細胞表面に存在するＭＳＬＮの濃度は、ＣＤ１３７アゴニスト作用のレベルに影響を与えると考えられている。具体的には、ＭＳＬＮの濃度がより高くなると、細胞表面全体で抗体分子の結合及び架橋が増加し、その結果、ＣＤ１３７アゴニスト作用が増加すると考えられている。
本発明の抗体分子のＣＤ１３７アゴニスト活性は、ＭＳＬＮへの抗体分子の同時結合に依存している。したがって、抗体分子によるＣＤ１３７の活性化は、腫瘍の微小環境に限定されると予想される。したがって、本発明の抗体分子は、本明細書では「条件的アゴニスト」とも呼ばれる。これに関連して、抗体分子の条件的アゴニスト活性は、その定常ドメインにＣＤ１３７抗原結合部位を含む抗体の固有の特性ではないことに注意されたい。
むしろ、本発明者らによって実施されたスクリーニングプログラム中に単離された分子の多くはＣＤ１３７に結合したが、ＣＤ１３７のクラスター化及び活性化のために架橋を必要とせず、架橋の非存在下において限定的なＣＤ１３７のクラスター化及び活性化を誘導した。腫瘍微小環境に局在する本発明の抗体分子の条件的アゴニスト活性のために、これらの分子は肝臓の炎症を引き起こすとは予想されない。
ＣＤ１３７などのＴＮＦ受容体に特異的な従来の抗体は、典型的には、固有のアゴニスト活性を有しないか、非常に穏やかであり、より高いレベルのＴＮＦ受容体メンバーのクラスター化及び活性化を誘導するため、プロテインＡ若しくはＧなどの外部架橋剤又は二次抗体を使用した抗体－ＴＮＦＲＳＦメンバー複合体の二次架橋、又は原形質膜に局在するＦｃγ受容体への抗体の結合を要する（Wajant, 2015）。架橋の非存在下におけるＴＮＦ受容体特異的抗体の低レベルのアゴニスト活性又はアゴニスト活性の欠如は、通常の二価抗体が、ＴＮＦ受容体の活性化には不十分な２つの単量体ＴＮＦ受容体を最大限に架橋できるという事実によって説明できる。したがって、インビボでの有効性のために、ＣＤ１３７を標的とする単一特異性抗体は、ＣＤ１３７特異的抗体の架橋及びその後のＣＤ１３７受容体のクラスター化及び活性化を達成するために、ＣＤ１３７発現Ｔ細胞に近接したＦｃγ受容体発現細胞の存在を要する。しかし、Ｆｃγ受容体媒介性架橋は非効率的であると考えられている。さらに、Ｆｃγ受容体を発現する細胞は全身に存在するため、ＣＤ１３７を発現する免疫細胞の抗体架橋及び活性化は、例えば腫瘍微小環境などの特定の部位に限定されない。さらに、そのようなＣＤ１３７抗体のアイソタイプは、架橋のためのＦｃγ受容体への効果的な結合を媒介するように選択する必要がある。しかしながら、これは、ＡＤＣＣなどのＦｃγ受容体によって媒介されるエフェクター機能を誘発する抗体をもたらし、それにより、抗体によって活性化されることを意図した免疫細胞を排除し得る。
対照的に、本発明の抗体分子は、例えば、従来の抗体分子によって必要とされるようなＦｃγ受容体架橋を必要とせずに、ＭＳＬＮの存在下で条件的にＣＤ１３７を活性化することができる。さらに、ＭＳＬＮへの結合を介した本発明の抗体分子の架橋は、Ｆｃγ受容体媒介性架橋よりも効率的であると予想される。Ｆｃγ受容体結合を抑制するための変異は、当技術分野で公知であり、好ましくは本発明の抗体分子に含まれる。したがって、ＭＳＬＮの非存在下では、本発明の抗体分子は、ＣＤ１３７アゴニスト活性を示さず、したがって、肝臓の炎症を誘発するとは予想されない。
本発明者らはさらに、１つ以上のＦｃγ受容体への結合を低減又は抑制するように改変された、上記に詳述されるようなＭＳＬＮ及びＣＤ１３７抗原結合部位を含む抗体分子が、インビボでのマウス腫瘍モデルにおける腫瘍増殖を抑制できることを示した。これらの抗体分子はＡＤＣＣ活性を抑制又は低減しているため、ＣＤ１３７を発現するＴ細胞を活性化することにより、抗体分子が腫瘍の増殖を抑制したと予想される。
抗体分子は、単量体のＣＤ１３７よりも高い親和性で二量体のＣＤ１３７に結合することが示されている。
本明細書において言及される「親和性」は、ＫＤによって測定される、抗体分子とその同族抗原の間の結合相互作用の強度を指し得る。当業者には容易に明らかであるように、抗体分子が抗原と複数の結合相互作用を形成することができる場合（例えば、抗体分子が抗原を二価的に結合することができ、任意選択により、抗原が二量体である場合）ＫＤによって測定される親和性は、結合力によっても影響を受ける可能性があり、ここで、結合力は、抗体－抗原複合体の全体的な強度を指す。
Ｔ細胞によるＣＤ１３７の発現は、活性化の際にアップレギュレートされる。理論に縛
られることを望むものではないが、活性化されたＴ細胞上でのＣＤ１３７の高発現のために、ＣＤ１３７はそのような細胞の表面上で二量体、三量体及び高次多量体の形態になると考えられている。対照的に、ナイーブＴ細胞などのナイーブ免疫細胞は、細胞表面に低レベル又は無視できるレベルのＣＤ１３７を発現するため、存在するＣＤ１３７は単量体形態である可能性がある。したがって、ＣＤ１３７に高い親和性で結合するが、単量体のＣＤ１３７には高い親和性で結合しない抗体分子は、例えば肝臓に存在するナイーブ免疫細胞に対抗して、活性化Ｔ細胞などの活性化免疫細胞に優先的に結合すると予想される。
さらに、本発明の抗体分子は、溶液中のＭＳＬＮよりも固定化されたＭＳＬＮに対してより高い親和性で結合することが示されている。具体的には、本発明の抗体分子は、高い結合活性でＭＳＬＮに結合し、したがって、抗原の複数のコピーが表面に固定化されている場合のように、抗体が２つのＭＳＬＮ分子に結合できる場合、溶液中のＭＳＬＮの場合に予想されるように、ＭＳＬＮが単量体形態である場合よりも、ＭＳＬＮにより強く結合すると考えられる。したがって、理論に拘束されることを望むものではないが、本発明の抗体分子は、単量体のＭＳＬＮに対する抗体の親和性が低いために、インビボで溶液中のシェッドＭＳＬＮに結合したままではなく、したがって、腫瘍部位からすぐに除去されず、したがって、腫瘍細胞の表面にＭＳＬＮを結合することにより、治療効果を発揮する時間がより長くなると考えられる。
本発明の抗体分子は、ＭＳＬＮ上の異なるエピトープ／領域に結合する。これは、一部の抗体分子がリガンドＭＵＣ１６のＭＳＬＮへの結合を遮断きる一方で、他の抗体分子は遮断できないという事実から明らかである。
本発明の一部の抗体分子は、ＣＤ１３７よりもＭＳＬＮに対して同等又はより高い親和性を有することが示されている。これは、ＭＳＬＮを発現している腫瘍に抗体分子を局在化させるのに有益であると考えられている。抗体分子のＭＳＬＮへの結合は、抗体架橋、免疫細胞の表面で発現するＣＤ１３７への結合、続いてＣＤ１３７のクラスター化及び活性化をもたらし、最終的に免疫細胞の活性化をもたらすと予想される。
本発明の抗体分子は、ヒト及びカニクイザルＭＳＬＮ、並びにヒト及びカニクイザルＣＤ１３７の両方に高い親和性で結合できることも示されている。この交差反応性は、前臨床開発中にカニクイザルで抗体分子の投与及び安全性試験を実施できるため、有利である。
マウス同系腫瘍モデルでのインビボ研究は、ヒトＭＳＬＮのＦａｂ結合部位及びＣＨ３ドメインのマウスＣＤ１３７結合部位を含む抗体分子は、アイソタイプ対照抗体又は単剤療法又は併用療法として送達される二重特異性抗体分子の構成要素と比較して、より大きな抗腫瘍効果を有することを示した（実施例１３を参照）。抗体分子は、腫瘍増殖及び延命効果の有意な低減を示すことによって有利な特徴を示し、異なるレベルのＭＳＬＮを発現する腫瘍における抗腫瘍応答を刺激することができた。これらの分子による処置後、用量依存性の抗腫瘍応答も観察された。全体として、抗体は、腫瘍増殖を減少させ、動物の生存率を増加させることにおいて、対照分子と比較してインビボで有利な特徴を示した。
さらに、抗体分子による処置後、肝臓の肝毒性は観察されなかった。他の抗ＣＤ１３７アゴニスト抗体による処置が肝毒性をもたらすことが文献で示されているため、これは有利である。機構研究は、抗体分子が腫瘍微小環境内のＴ細胞の活性化を刺激する一方で、対照ＣＤ１３７アゴニストは腫瘍微小環境外のより大きなＴ細胞活性化を刺激し、この有利な特徴をさらに支持することを示した。
本発明者らによって同定された抗体分子のさらなる有利な特徴は、ＭＳＬＮとＣＤ１３
７の抗原結合部位の両方が抗体構造自体の中に含まれていることである。特に、抗体分子は、リンカー又は他の手段を介して他のタンパク質を抗体分子に融合させて、その両方の標的に二価で結合することができる分子をもたらすことを必要としない。これは多くの利点を有する。具体的には、本発明者らによって同定された抗体分子は、それらが追加の融合部分を含まないため、標準的な抗体の産生に使用されるものと同様の方法を使用して産生することができる。リンカーは時間の経過と共に分解し、抗体分子の不均一な集団をもたらし得るため、この構造は、抗体の安定性の向上にもつながることが期待されている。融合した１つのタンパク質のみを有する集団内の抗体は、ＣＤ１３７とＭＳＬＮの両方に結合することによる架橋の結果として、細胞結合ＭＳＬＮ又はクラスターに優先的に結合し、ＣＤ１３７を介してシグナル伝達をすることができない場合がある。リンカーの切断／分解は、個体への治療薬の投与前又は投与後に（例えば、酵素的切断又は個体のインビボｐＨを介して）起こり得、それにより、個体内を循環している間にその有効性の低下をもたらす。本発明者らによって同定された抗体分子にはリンカーがないため、抗体分子は、投与の前及び後の両方で同数の結合部位を保持すると予想される。さらに、本発明者らによって同定された抗体分子の構造は、分子の免疫原性の観点からも好ましい。これは、融合タンパク質若しくはリンカー、又はその両方の導入が、分子が個体に投与される場合に免疫原性を誘発し得、その結果、治療薬の有効性が低下するからである。
したがって、本発明は、以下を提供する。
［１］
（ａ）ＭＳＬＮの相補性決定領域（ＣＤＲ）ベースの抗原結合部位；及び
（ｂ）抗体分子のＣＨ３ドメインに位置するＣＤ１３７抗原結合部位
を含み、
ＣＤＲベースの抗原結合部位が、
（ｉ）それぞれ配列番号４２、３３、４４、２０、２２、及び８０［FS28-256-271］；
（ｉｉ）それぞれ配列番号１４、１６、２７、２０、２２及び２４［FS28-024-052］；
（ｉｉｉ）それぞれ配列番号４２、３３、４４、２０、２２、及び４０［FS28-256-021］；
（ｉｖ）それぞれ配列番号４２、３３、４４、２０、２２、及び３７［FS28-256-012］；（ｖ）それぞれ配列番号５０、３３、５２、２０、２２及び４０［FS28-256-023］；
（ｖｉ）それぞれ配列番号４２、３３、４４、２０、２２及び４１［FS28-256-024］；
（ｖｉｉ）それぞれ配列番号５０、３３、５２、２０、２２及び４１［FS28-256-026］；（ｖｉｉｉ）それぞれ配列番号４２、３３、４４、２０、２２、及び８０［FS28-256-027］；
（ｉｘ）それぞれ配列番号３８、３３、３５、２０、２２、及び４０［FS28-256-001］；（ｘ）それぞれ配列番号３８、３３、３５、２０、２２、及び４１［FS28-256-005］；
（ｘｉ）それぞれ配列番号４６、３３、４８、２０、２２及び３７［FS28-256-014］；
（ｘｉｉ）それぞれ配列番号５０、３３、５２、２０、２２及び３７［FS28-256-018］；（ｘｉｉｉ）それぞれ配列番号３１、３３、３５、２０、２２及び３７［FS28-256］；
（ｘｉｖ）それぞれ配列番号１４、１６、２５、２０、２２及び２４［FS28-024-051］；（ｘｖ）それぞれ配列番号１４、１６、２９、２０、２２及び２４［FS28-024-053］；又は
（ｘｖｉ）それぞれ配列番号１４、１６、１８、２０、２２及び２４［FS28-024］
に記載のＣＤＲ１～６を含み；
ＣＤＲ配列が、ImMunoGeneTics（ＩＭＧＴ）の番号付けスキームに従って定義され；
ＣＤ１３７抗原結合部位が、それぞれ、ＣＨ３ドメインのＡＢ及びＥＦ構造ループに位置する第１の配列及び第２の配列を含み、第１及び第２の配列が、それぞれ配列番号１０及び１１［FS22-172-003］に記載の配列を有する、
メソテリン（ＭＳＬＮ）及びＣＤ１３７に結合する抗体分子。
［２］
（ａ）ＭＳＬＮの相補性決定領域（ＣＤＲ）ベースの抗原結合部位；及び
（ｂ）抗体分子のＣＨ３ドメインに位置するＣＤ１３７抗原結合部位
を含み、
ＣＤＲベースの抗原結合部位が、
（ｉ）それぞれ配列番号４３、５、４５、２１、２３、及び８０［FS28-256-271］；
（ｉｉ）それぞれ配列番号１５、１７、２８、２１、２３及び２４［FS28-024-052］；
（ｉｉｉ）それぞれ配列番号４３、３４、４５、２１、２３及び４０［FS28-256-021］；（ｉｖ）それぞれ配列番号４３、３４、４５、２１、２３及び３７［FS28-256-012］；
（ｖ）それぞれ配列番号５１、３４、５３、２１、２３及び４０［FS28-256-023］；
（ｖｉ）それぞれ配列番号４３、３４、４５、２１、２３及び４１［FS28-256-024］；
（ｖｉｉ）それぞれ配列番号５１、３４、５３、２１、２３及び４１［FS28-256-026］；（ｖｉｉｉ）それぞれ配列番号４３、３４、４５、２１、２３及び８０［FS28-256-027］；
（ｉｘ）それぞれ配列番号３９、３４、３６、２１、２３及び４０［FS28-256-001］；
（ｘ）それぞれ配列番号３９、３４、３６、２１、２３及び４１［FS28-256-005］；
（ｘｉ）それぞれ配列番号４７、３４、４９、２１、２３及び３７［FS28-256-014］；
（ｘｉｉ）それぞれ配列番号５１、３４、５３、２１、２３及び３７［FS28-256-018］；（ｘｉｉｉ）それぞれ配列番号３２、３４、３６、２１、２３及び３７［FS28-256］；
（ｘｉｖ）それぞれ配列番号１５、１７、２６、２１、２３及び２４［FS28-024-051］；（ｘｖ）それぞれ配列番号１５、１７、３０、２１、２３及び２４［FS28-024-053］；又は
（ｘｖｉ）それぞれ配列番号１５、１７、１９、２１、２３及び２４［FS28-024］
に記載のＣＤＲ１～６を含み；
ＣＤＲ配列が、Kabatに従って定義され；
ＣＤ１３７抗原結合部位が、それぞれ、ＣＨ３ドメインのＡＢ及びＥＦ構造ループに位置する第１の配列及び第２の配列を含み、第１及び第２の配列が、それぞれ配列番号１０及び１１［FS22-172-003］に記載の配列を有する、
メソテリン（ＭＳＬＮ）及びＣＤ１３７に結合する抗体分子。
［３］抗体分子が、［１］又は［２］の（ｉ）に記載のＣＤＲ１～６を含む、［１］又は［２］に記載の抗体分子。
［４］抗体分子が、［１］又は［２］の（ｉｉ）に記載のＣＤＲ１～６を含む、［１］又は［２］に記載の抗体分子。
［５］抗体分子が、重鎖可変（ＶＨ）ドメイン及び／又は軽鎖可変（ＶＬ）ドメイン、好ましくは、ＶＨドメイン及びＶＨドメインを含む、［１］から［４］のいずれか一項に記載の抗体分子。
［６］抗体分子が、免疫グロブリン重鎖及び／又は免疫グロブリン軽鎖、好ましくは、免疫グロブリン重鎖及び免疫グロブリン軽鎖を含む、［１］から［５］のいずれか一項に記載の抗体分子。
［７］抗体分子が、ＶＨドメイン及び／又はＶＬドメインを含み、好ましくは、ＶＨドメイン及びＶＨドメインが、
（ｉ）それぞれ配列番号１７７及び７６［FS28-256-271］；
（ｉｉ）それぞれ配列番号５８及び５４［FS28-024-052］；
（ｉｉｉ）それぞれ配列番号７０及び６８［FS28-256-021］；
（ｉｖ）それぞれ配列番号７０及び６４［FS28-256-012］；
（ｖ）それぞれ配列番号７４及び６８［FS28-256-023］；
（ｖｉ）それぞれ配列番号７０及び７８［FS28-256-024］；
（ｖｉｉ）それぞれ配列番号７４及び７８［FS28-256-026］；
（ｖｉｉｉ）それぞれ配列番号７０及び７６［FS28-256-027］；
（ｉｘ）それぞれ配列番号６６及び６８［FS28-256-001］；
（ｘ）それぞれ配列番号６６及び７８［FS28-256-005］；
（ｘｉ）それぞれ配列番号７２及び６４［FS28-256-014］；
（ｘｉｉ）それぞれ配列番号７４及び６４［FS28-256-018］；
（ｘｉｉｉ）それぞれ配列番号６２及び６４［FS28-256］；
（ｘｉｖ）それぞれ配列番号５６及び５４［FS28-024-051］
（ｘｖ）それぞれ配列番号６０及び５４［FS28-024-053］；又は
（ｘｖｉ）それぞれ配列番号１２及び５４［FS28-024］
に記載のものである、［５］から［６］のいずれか一項に記載の抗体分子。
［８］抗体分子が、それぞれ配列番号１７７及び７６［FS28-256-271］に記載のＶＨドメイン及びＶＬドメインを含む、［７］に記載の抗体分子。
［９］抗体分子が、それぞれ配列番号５８及び５４［FS28-024-052］に記載のＶＨドメイン及びＶＬドメインを含む、［７］に記載の抗体分子。
［１０］第１の配列が、抗体分子のＣＨ３ドメインの１４位と１７位の間に位置し、アミノ酸残基の番号付けは、ＩＭＧＴ番号付けスキームに従う、［１］から［９］のいずれか一項に記載の抗体分子。
［１１］第１の配列が、抗体分子のＣＨ３ドメインの１５、１６、１６．５、１６．４、１６．３、１６．２、及び１６．１位に位置し、アミノ酸残基の番号付けは、ＩＭＧＴ番号付けスキームに従う、［１０］に記載の抗体分子。
［１２］第２の配列が、抗体分子のＣＨ３ドメインの９２から９８位に位置し、アミノ酸残基の番号付けは、ＩＭＧＴ番号付けスキームに従う、［１］から［１１］のいずれか一項に記載の抗体分子。
［１３］抗体分子が、ＣＨ３ドメインのＣＤ構造ループに位置する第３の配列をさらに含む、［１］から［１２］のいずれか一項に記載の抗体分子。
［１４］第３の配列が、抗体分子のＣＨ３ドメインの４３から７８位に位置し、アミノ酸残基の番号付けは、ＩＭＧＴ番号付けスキームに従う、［１３］に記載の抗体分子。
［１５］第３の配列が、配列番号１５７に記載の配列を有する、［１３］から［１４］のいずれか一項に記載の抗体分子。
［１６］抗体分子が、配列番号８［FS22-172-003］に記載のＣＨ３ドメイン配列を含む、［１］から［１５］のいずれか一項に記載の抗体分子。
［１７］抗体分子が、ヒトＩｇＧ１分子である、［１］から［１６］のいずれか一項に記載の抗体分子。
［１８］抗体分子が、抗体：
（ｉ）それぞれ配列番号３及び８４に記載のFS22-172-003-AA/FS28-256-271；
（ｉｉ）それぞれ配列番号１０２及び８５に記載のFS22-172-003-FS28-024-052；
（ｉｉｉ）それぞれ配列番号１２５及び８２に記載のFS22-172-003-FS28-256-021；
（ｉｖ）それぞれ配列番号１２５及び１１６に記載のFS22-172-003-AA/FS28-256-012；
（ｖ）それぞれ配列番号１２５及び８２に記載のFS22-172-003-AA/FS28-256-023；又は
（ｖｉ）それぞれ配列番号１２５及び８３に記載のFS22-172-003-AA/FS28-256-024
（ｖｉｉ）それぞれ配列番号１３３及び８３に記載のFS22-172-003-AA/FS28-256-026；
（ｖｉｉｉ）それぞれ配列番号１２５及び８４に記載のFS22-172-003-AA/FS28-256-027；（ｉｘ）それぞれ配列番号１２０及び８２に記載のFS22-172-003-AA/FS28-256-001；
（ｘ）それぞれ配列番号１２０及び８３に記載のFS22-172-003-AA/FS28-256-005；
（ｘｉ）それぞれ配列番号１２９及び１１６に記載のFS22-172-003-AA/FS28-256-014；
（ｘｉｉ）それぞれ配列番号１３３及び１１６に記載のFS22-172-003-AA/FS28-256-018；（ｘｉｉｉ）それぞれ配列番号１１４及び１１６に記載のFS22-172-003-AA/FS28-256；
（ｘｉｖ）それぞれ配列番号９８及び８５に記載のFS22-172-003-AA/FS28-024-051；
（ｘｖ）それぞれ配列番号１０６及び８５に記載のFS22-172-003-AA/FS28-024-053；又は（ｘｖｉ）それぞれ配列番号９４及び８５に記載のFS22-172-003-AA/FS28-024
の重鎖及び軽鎖を含む、［１］から［１７］のいずれか一項に記載の抗体分子。
［１９］抗体分子が、それぞれ配列番号８４及び３に記載のFS22-172-003-AA/FS28-256-271の軽鎖及び重鎖を含む、［１８］に記載の抗体分子。
［２０］抗体分子が、それぞれ配列番号８５及び１０２に記載のFS22-172-003-AA/FS28-024-052の軽鎖及び重鎖を含む、［１８］に記載の抗体分子。
［２１］抗体のＣＨ２ドメインの１１４位のプロリン（Ｐ）が、アラニン（Ａ）で置換され、アミノ酸残基の番号付けは、ＩＭＧＴ番号付けスキームに従う、［１８］から［２０］のいずれか一項に記載の抗体分子。
［２２］ＭＳＬＮが、細胞表面に結合したＭＳＬＮである、［１］から［２１］のいずれか一項に記載の抗体分子。
［２３］抗体分子が、可溶性ＭＳＬＮより高い親和性で固定化されたＭＳＬＮに結合する、［２２］に記載の抗体分子。
［２４］
（ｉ）抗体分子が、８ｎＭのｋＤ又はより高い親和性で固定化されたＭＳＬＮに結合する；及び／又は
（ｉｉ）抗体分子が、１５ｎＭのｋＤ又はより低い親和性で可溶性ＭＳＬＮに結合する。［２３］に記載の抗体分子。
［２５］抗体分子が、ＭＳＬＮ及びヒトＣＤ１３７に結合する、［１］から［２４］のいずれか一項に記載の抗体分子。
［２６］ＭＳＬＮが、配列番号３７５に記載の配列からなるか、又はそれを含む、［２５］に記載の抗体分子。
［２７］ヒトＣＤ１３７が、配列番号３７３に記載の配列からなるか、又はそれを含む、［２５］又は［２６］に記載の抗体分子。
［２８］抗体分子が、［１］又は［２］の（ｉｉ）又は（ｘｉｖ）から（ｘｖｉ）のいずれか１つに記載のＣＤＲ１～６を含み、抗体が、ＭＵＣ１６のＭＳＬＮへの結合を遮断
する、［１］から［２７］のいずれか一項に記載の抗体分子。
［２９］抗体分子が、［１］又は［２］の（ｉ）又は（ｉｉｉ）から（ｘｉｉｉ）のいずれか１つに記載のＣＤＲ１～６を含み、抗体が、ＭＵＣ１６のＭＳＬＮへの結合を遮断しない、［１］から［２７］のいずれか一項に記載の抗体分子。
［３０］ＭＵＣ１６がヒトＭＵＣ１６である、［２８］又は［２９］に記載の抗体分子。
［３１］抗体分子が、腫瘍細胞表面に結合したＭＳＬＮの存在下で免疫細胞上のＣＤ１３７を活性化することができる、［１］から［３０］のいずれか一項に記載の抗体分子。
［３２］免疫細胞上のＣＤ１３７への及び腫瘍細胞表面に結合したＭＳＬＮへの抗体分子の結合が、免疫細胞上のＣＤ１３７のクラスター化を引き起こす、［１］から［３１］のいずれか一項に記載の抗体分子。
［３３］免疫細胞が、Ｔ細胞、Ｂ細胞、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、ナチュラルキラーＴ（ＮＫＴ）細胞、又は樹状細胞（ＤＣ）である、［３１］又は［３２］に記載の抗体分子。
［３４］免疫細胞がＴ細胞である、請求項［３３］に記載の抗体分子。
［３５］抗体分子が、１つ以上のＦｃγ受容体への抗体分子のＣＨ２ドメイン又は抗体分子の結合を低減又は抑制するように修飾されている、［１］から［３４］のいずれか一項に記載の抗体分子。
［３６］抗体分子が、１つ以上のＦｃγ受容体に結合しない、［１］から［３５］のいずれか一項に記載の抗体分子。
［３７］Ｆｃγ受容体が、ＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩａ、ＦｃγＲＩＩｂ及びＦｃγＲＩＩＩからなる群から選択される、［３５］又は［３６］に記載の抗体分子。
［３８］［１］から［３７］のいずれか一項に記載の抗体分子と生物活性分子とを含む、コンジュゲート。
［３９］［１］から［３７］のいずれか一項に記載の抗体分子と検出可能な標識とを含む、コンジュゲート。
［４０］［１］から［３７］のいずれか一項に記載の抗体分子をコードする、１つ又は複数の核酸分子。
［４１］核酸分子が、
（Ｉ）それぞれ配列番号４及び９１に記載のFS22-172-003-AA/FS28-256-271；
（ｉｉ）それぞれ配列番号１０３及び８６に記載のFS22-172-003-AA/FS28-024-052；
（ｉｉｉ）それぞれ配列番号１２６及び１２２に記載のFS22-172-003-AA/FS28-256-021；（ｉｖ）それぞれ配列番号１２６及び１１７に記載のFS22-172-003-AA/FS28-256-012；
（ｖ）それぞれ配列番号１３４及び１２２に記載のFS22-172-003-AA/FS28-256-023；
（ｖｉ）それぞれ配列番号１２６及び９０に記載のFS22-172-003-AA/FS28-256-024；
（ｖｉｉ）それぞれ配列番号１３４及び９０に記載のFS22-172-003-AA/FS28-256-026；
（ｖｉｉｉ）それぞれ配列番号１２６及び９１に記載のFS22-172-003-AA/FS28-256-027；
（ｉｘ）それぞれ配列番号１２１及び１２２に記載のFS22-172-003-AA/FS28-256-001；
（ｘ）それぞれ配列番号１２１及び９０に記載のFS22-172-003-AA/FS28-256-005；
（ｘｉ）それぞれ配列番号１３０及び１１７に記載のFS22-172-003-AA/FS28-256-014；
（ｘｉｉ）それぞれ配列番号１３４及び１１７に記載のFS22-172-003-AA/FS28-256-018；（ｘｉｉｉ）それぞれ配列番号１１５及び１１７に記載のFS22-172-003-AA/FS28-256；
（ｘｉｖ）それぞれ配列番号９９及び８６に記載のFS22-172-003-AA/FS28-024-051；
（ｘｖ）それぞれ配列番号１０７及び８６に記載のFS22-172-003-AA/FS28-024-053；又は（ｘｖｉ）それぞれ配列番号９５及び８６に記載のFS22-172-003-AA/FS28-024
の重鎖核酸配列及び／又は軽鎖核酸配列を含む、［１］から［３７］のいずれか一項に記載の抗体分子をコードする、１つ又は複数の核酸分子。
［４２］［４０］又は［４１］のいずれか一項に記載の１つ又は複数の核酸分子を含む、１つ又は複数のベクター。
［４３］［４０］又は［４１］のいずれか一項に記載の１つ又は複数の核酸分子、又は［４２］に記載の１つ又は複数のベクターを含む、組換え宿主細胞。
［４４］抗体分子の産生条件下で［４３］の組換え宿主細胞を培養することを含む、［１］から［３７］のいずれか一項に記載の抗体分子を産生する方法。
［４５］抗体分子を単離及び／又は精製することをさらに含む、［４４］に記載の方法。
［４６］［１］から［３９］のいずれか一項に記載の抗体分子又はコンジュゲートと、薬学的に許容される賦形剤とを含む、医薬組成物。
［４７］個体の癌を処置する方法における使用のための［１］から［３９］のいずれか一項に記載の抗体分子又はコンジュゲート。
［４８］治療有効量の、［１］から［３９］のいずれか一項に記載の抗体分子又はコンジュゲートを個体に投与することを含む、個体の癌を処置する方法。
［４９］癌の処置のための医薬の調製における、［１］から［３９］のいずれか一項に記載の抗体分子又はコンジュゲートの使用。
［５０］癌が、卵巣癌、膵臓癌、肺癌、又は中皮腫である、［４７］から［４９］のいずれか一項に記載の使用のための抗体分子若しくはコンジュゲート、方法、又は使用。
［５１］処置が、抗体分子又はコンジュゲートを第２の治療剤と組み合わせて個体に投与することを含む、［４７］に記載の使用のための抗体分子又はコンジュゲート。
［５２］方法が、治療有効量の第２の治療を個体に投与することをさらに含む、［４８］に記載の方法。
図面の簡単な説明
図１は、ｍＡｂ２がＭＳＬＮ陽性ＮＣＩ－Ｈ２２６細胞によって架橋された場合に、ヒトＭＳＬＮの異なる領域に結合するＦａｂを含むｍＡｂ２が、ＣＤ８＋Ｔ細胞のＣＤ１３７媒介性活性化を駆動し、ヒトＩＬ－２の放出をもたらす、Ｔ細胞活性化アッセイの結果を示す。これらの結果は、FS28-185系統（Ｂ）のＦａｂを含むｍＡｂ２がこのアッセイで機能的活性を有しないことを示す。系統FS28-024（Ａ）及びFS28-256（Ｃ）からのＦａｂを含むｍＡｂ２は全て、ナノモル濃度以下から１．５ｎＭの濃度のｍＡｂ２の存在下で、ｈＩＬ－２放出の増加を示す。 図２は、様々な濃度の可溶性ＭＳＬＮ（ｓＭＳＬＮ）（ｓＭＳＬＮなし、２ｎＭ、及び２０ｎＭのｓＭＳＬＮ）の存在下でのＴ細胞活性化アッセイの結果を示す。膜結合ＭＳＬＮに対する優先的な結合を示したｍＡｂ２（FS28-024-051、FS28-024-052、FS28-024-053、FS28-256-021、及びFS28-256-023を含むｍＡｂ２）は、ｓＭＳＬＮが存在しない場合と比較してＥＣ５０の有意なシフトが２０ｎＭのｓＭＳＬＮの存在下で観察されたFS22-172-003-AA/FS28-256-027（Ｆ）よりも可溶性ＭＳＬＮ（Ａ～Ｅ）の存在による影響が少なかった。 図３Ａ及びＢは、ｍＡｂ２がＯＶＣＡＲ－３細胞によって架橋された場合に、ｍＡｂ２がＣＤ８＋Ｔ細胞のＣＤ１３７媒介性活性化を駆動する、Ｔ細胞活性化アッセイの結果を示す。これらの結果は、ｍＡｂ２が細胞膜上でより低いＭＳＬＮ密度を発現している細胞との関連でＣＤ１３７媒介性アゴニスト作用を駆動できることを示す。モックｍＡｂ２形式（FS22-172-003/HelD1.3）の抗ＣＤ１３７ Ｆｃａｂ FS22-172-003もこのアッセイで試験され、ＩＬ－２放出の欠如は、分子のＦａｂアームを介して架橋された場合にのみ、抗ヒトＣＤ１３７ Ｆｃａｂが機能的であることを示した。 図４は、配列最適化ｍＡｂ２ FS22-172-003-AA/FS28-256-271（Ａ）、FS22-172-003-AA/FS28-256-272（Ｂ）、及びFS22-172-003-AA/FS28-256-273（Ｃ）が２０ｎＭまでのｓＭＳＬＮの存在下又は非存在下でヒトＭＳＬＮを発現するＮＣＩ－Ｈ２２６細胞と架橋した、ＣＤ８＋Ｔ細胞活性化アッセイの結果を示す。ｍＡｂ２ FS22-172-003-AA/FS28-256-271sMSLNの場合、２０ｎＭまでの濃度は、観察されたＥＣ５０において、Ｔ細胞活性化活性につき最小の低減をもたらした。ｍＡｂ２ FS22-172-003-AA/FS28-256-272及びFS22-172-003-AA/FS28-256-273は、２０ｎＭのｓＭＳＬＮの存在下で、Ｔ細胞活性化活性において、ＥＣ５０の６．６倍の低減を示した親クローンFS22-172-003-AA/FS28-256-027（Ｄ）のように、観察されたＥＣ５０で４倍より大きい低減を有する、より顕著な低減を示した。 図５は、ｍＡｂ２ FS22m-063-AA/FS28m-228-010 and FS22m-063-AA/FS28m-228が２ｎＭの可溶性マウスＭＳＬＮの存在下又は非存在下でＣＴ２６．Ｇ１０、ＣＴ２６．Ｂ２又はＰａｎｃ０２細胞と架橋した場合のＴ細胞活性化アッセイにおけるＩＦＮγ放出を示す（ＡからＤ）。ｍＡｂ２ FS22m-063-AA/FS28m-228の実験には、以下の陰性対照が含まれていた：ＣＤ１３７標的化Ｆｃａｂを欠くＩｇＧ１形式の抗ＭＳＬＮ対照抗体、及びモックｍＡｂ２ FS22m-063/HelD1.3（すなわち、ＭＳＬＮ標的化のないＣＤ１３７ Ｆｃａｂ）。結果は、このアッセイでは、比較的高濃度の可溶性ＭＳＬＮであっても、ｍＡｂ２の効力にごくわずかな影響しかなかったことを示した。このデータはまた、試験したＭＳＬＮ発現細胞株の全てにわたってナノモル濃度以下の効力（ＥＣ５０）を示した。 図６は、G1/4420（ヒトＩｇＧ１アイソタイプ対照抗体）（Ａ）又はFS22m-063-AA/FS28m-228（抗マウスCD137/MSLN mAb2）（Ｂ）で処置されたマウスのＣＴ２６．Ｂ２同系マウス腫瘍モデルにおける、個体の腫瘍体積の測定値を示す。FS22m-063-AA/FS28m-228による処置は、アイソタイプ対照と比較して、腫瘍増殖の低下をもたらした。 図７は、G1/4420（ヒトＩｇＧ１アイソタイプ対照抗体）又はFS22m-063-AA/FS28m-228（抗マウスCD137/MSLN mAb2）で処置されたＣＴ２６．Ｂ２同系マウス腫瘍モデルにおける、マウスのカプラン・マイヤー生存プロットを示す。FS22m-063-AA/FS28m-228による処置は、ヒトＩｇＧ１アイソタイプ対照抗体による処置と比較して、生存率の有意な改善を示した。（対数順位分析、＊＊ｐ＜０．０１） 図８は、G1/4420（ヒトＩｇＧ１アイソタイプ対照抗体）（Ａ）又はFS22m-063-AA/FS28m-228（抗マウスCD137/MSLN mAb2）（Ｂ）で処置されたマウスのＣＴ２６．Ｇ１０同系マウス腫瘍モデルにおける、個体の腫瘍体積の測定値を示す。FS22m-063-AA/FS28m-228で処置されたマウスは、アイソタイプ対照と比較して腫瘍増殖の低下を示し、アイソタイプ対照処置群の（１／２０、５％）と比較して、研究終了時に４／２０（２５％）のマウスに触知可能な腫瘍は存在しなかった。 図９は、G1/4420（ヒトＩｇＧ１アイソタイプ対照抗体）又はFS22m-063-AA/FS28m-228（抗マウスCD137/MSLN mAb2）で処置されたＣＴ２６．Ｇ１０同系マウス腫瘍モデルにおける、マウスのカプラン・マイヤー生存プロットを示す。FS22m-063-AA/FS28m-228による処置は、ヒトＩｇＧ１アイソタイプ対照抗体による処置と比較して、生存率の有意な改善を示した。（対数順位分析、＊＊ｐ＜０．０１） 図１０は、G1-AA/4420（ＩｇＧ対照；２０μｇ、２０ｇマウスで１ｍｇ／ｋｇに相当）、G1/Lob12.3（野生型ヒトＩｇＧ１抗ＣＤ１３７陽性対照；２０μｇ、２０ｇマウスで１ｍｇ／ｋｇに相当）、及びFS22m-063-AA/FS28m-228-010（抗マウスCD137/MSLN mAb2）で処置されたマウスのＣＴ２６．Ｇ１０同系マウス腫瘍モデルにおける、個体の腫瘍体積の測定値を示す。FS22m-063-AA/FS28m-228-010による処置は、ヒトＩｇＧ１アイソタイプ対照処置マウスと比較して腫瘍増殖の用量依存性の減少を示した。 図１１は、G1-AA/4420（ヒトＩｇＧ１対照；２０μｇ、２０ｇマウスで１ｍｇ／ｋｇに相当）、G1/Lob12.3（野生型ヒトＩｇＧ１抗ＣＤ１３７陽性対照；２０μｇ、２０ｇマウスで１ｍｇ／ｋｇに相当）、及びFS22m-063-AA/FS28m-228-010（抗マウスCD137/MSLN mAb2）で処置されたＣＴ２６．Ｇ１０同系マウス腫瘍モデルにおける、マウスのカプラン・マイヤー生存プロットを示す。試験した全ての用量レベルでのFS22m-063-AA/FS28m-228-010による処置は、ＩｇＧ対照と比較して、生存率の有意な改善をもたらし、生存率の改善は用量依存性であった。（処置群をG1-AA/4420アイソタイプ対照と比較する対数順位対分析、ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１）。 図１２は、（Ａ）G1-AA/HelD1.3（ヒトＩｇＧ１対照）、（Ｂ）FS22m-063-AA/HelD1.3（「モック」ｍＡｂ２形式の抗マウスＣＤ１３７ Ｆｃａｂ）、（Ｃ）FS22m-063-AA/4420（ｍＡｂ２形式の抗マウスＣＤ１３７ Ｆｃａｂ）、（Ｄ）G1-AA/FS28m-228-010（抗マウスＭＳＬＮ抗体）、（Ｅ）FS22m-063-AA/HelD1.3プラスG1-AA/FS28m-228-010の組み合わせ（「モック」ｍＡｂ２形式の抗マウスＣＤ１３７ Ｆｃａｂプラス抗マウスＭＳＬＮ Ｆａｂ）、及び（Ｆ）FS22m-063-AA/FS28m-228-010（抗マウスCD137/MSLN mAb2）で処置されたマウスのＣＴ２６．Ｇ１０同系マウス腫瘍モデルにおける、個体の腫瘍体積の測定値を示す。結果は、FS22m-063-AA/FS28m-228-010で処置されたマウスの７／２０（３５％）が研究終了時に触知可能な腫瘍を有しなかった一方で、G1-AA/FS28m-228-010（１／２０、５％）を除いて、他の処置剤を投与された全てのマウスは、試験終了時に６２．５ｍｍ３以上の腫瘍を有していた。 図１３は、G1-AA/HelD1.3（ＩｇＧ対照）、FS22m-063-AA/HelD1.3（非バインダーＦａｂ、抗ＨｅｌＤ１．３を伴う「モック」ｍＡｂ２形式の抗マウスＣＤ１３７ Ｆｃａｂ）、FS22m-063-AA/4420（非バインダーＦａｂ、抗４４２０を伴う「モック」ｍＡｂ２形式の抗マウスＣＤ１３７ Ｆｃａｂ）、G1-AA/FS28m-228-010（抗マウスＭＳＬＮ抗体）、FS22m-063-AA/HelD1.3プラスG1-AA/FS28m-228-010の組み合わせ（抗マウスＣＤ１３７ Ｆｃａｂプラス抗マウスＭＳＬＮ抗体）、及びFS22m-063-AA/FS28m-228-010（抗マウスCD137/MSLN mAb2）で処置されたＣＴ２６．Ｇ１０同系マウス腫瘍モデルにおける、マウスのカプラン・マイヤー生存プロットを示す。結果は、２つの「モック」ｍＡｂ２形式の抗マウスＣＤ１３７ Ｆｃａｂのうち１つ、又は抗マウスＭＳＬＮ抗体で処置されたマウス、及び組み合わせ処置群のマウスは、アイソタイプ対照で処置されたマウスと比較して、生存率の改善は見られなかった一方、FS22m-063-AA/FS28m-228-010-で処置されたマウスは、アイソタイプ対照で処置されたマウスと比較して、生存率の改善を示したことを示す。（処置群をG1-AAHelD1.3アイソタイプ対照と比較する対数順位対分析、＊＊＊＊ｐ＜０．０００１）。 図１４は、非担癌C57BL/6マウスモデルにおける抗ヒトCD137/MSLN mAb2及び抗マウスCD137/MSLN mAb2の薬物動態プロファイルを示す。Ａ：単回静脈内投与後の１０ｍｇ／ｋｇヒトＩｇＧ１アイソタイプ対照（G1/4420）と比較した、１０ｍｇ／ｋｇでの抗マウスCD137/MSLN mAb2（FS22m-063-AA/FS28m-228-010）を示す（群あたりｎ＝３）。ヒトＩｇＧ１アイソタイプ対照及びFS22m-063-AA/FS28m-228-010 mAb2はいずれも、投与後１４４時間でそれぞれ７０．３０μｇ／ｍｌ及び１８．１１μｇ／ｍｌの高レベルの曝露を維持していた。定量下限（ＬＬＯＱ）は５．４８ｎｇ／ｍＬで示されている。Ｂ：非担癌C57BL/6マウスに投与された単回静脈内投与後、６．７ｍｇ／ｋｇヒトＩｇＧ１アイソタイプ対照（G1/4420）と比較した、６．７ｍｇ／ｋｇの静脈内投与に続く、抗ヒトCD137/MSLN mAb2（FS22-172-003-AA/FS28-256-271）のレベルを示す。ヒトＩｇＧ１アイソタイプ対照及び抗ヒトCD137/MSLN mAb2はいずれも、投与後１４４時間でそれぞれ２８．３６μｇ／ｍｌ及び６０．２６μｇ／ｍｌの高レベルの曝露を維持していた。定量下限（ＬＬＯＱ）は１．８２ｎｇ／ｍＬで示されている。
詳細な説明
本発明は、ＭＳＬＮ及びＣＤ１３７の両方に結合する抗体分子に関する。具体的には、本発明の抗体分子は、ＭＳＬＮのＣＤＲベースの抗原結合部位と、抗体分子の定常ドメインに位置するＣＤ１３７抗原結合部位とを含む。
抗体分子は、好ましくは、ＭＳＬＮ及びＣＤ１３７に特異的に結合する。「特異的」という用語は、抗体分子がその特異的結合パートナー（ここではＭＳＬＮ及びＣＤ１３７）以外の分子への有意な結合を示さない状況を指し得る。「特異的」という用語は、抗体分子が、ＭＳＬＮ及びＣＤ１３７上のエピトープなどの、いくつかの抗原によって運ばれる特定のエピトープに特異的である場合にも適用でき、この場合、抗体分子は、エピトープを運ぶ様々な抗原に結合できる。好ましい実施形態において、本発明の抗体分子は、ＯＸ４０、ＧＩＴＲ、ＣＤ４０、ＣＥＡＣＡＭ－５、Ｅ－カドヘリン、トロンボモジュリン、又はＥｐＣＡＭに結合しないか、又はそれらに有意な結合を示さない。
「抗体分子」という用語は、天然であるか、部分的又は全体的に合成的に産生されるかを問わず、免疫グロブリンを説明する。抗体分子は、ヒト又はヒト化、好ましくはヒトであり得る。抗体分子は、好ましくはモノクローナル抗体分子である。抗体の例は、免疫グロブリンＧなどの免疫グロブリンアイソタイプ、及びＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３及びＩｇＧ４などのそれらのアイソタイプサブクラス、並びにそれらのフラグメントである。抗体分子は、他のポリペプチド及び／又は血清成分に結合することができる抗体などの汚染物質を含まないという意味で、単離され得る。
したがって、本明細書で使用される「抗体分子」という用語は、抗体フラグメントを含む。ただし、前記フラグメントは、ＭＳＬＮのＣＤＲベースの抗原結合部位及び定常ドメインに位置するＣＤ１３７抗原結合部位を含む。
抗体分子は、天然のものであっても、部分的又は全体的に合成的に産生されたものであってもよい。例えば、抗体分子は、組換え抗体分子であり得る。
抗体分子は、抗体分子の１つ以上の定常ドメイン、好ましくは１つ以上のＣＨ３ドメインにおいて、ＭＳＬＮのための１つ以上のＣＤＲベースの抗原結合部位及びＣＤ１３７のための１つ以上の抗原結合部位を含む。
抗体分子は、免疫グロブリン又はその抗原結合フラグメントであり得る。例えば、抗体分子は、ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＥ又はＩｇＭ分子、好ましくはＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３又はＩｇＧ４分子などのＩｇＧ分子、より好ましくはＩｇＧ１又はＩｇＧ２分子、最も好ましくはＩｇＧ１分子、又はそのフラグメントであり得る。好ましい実施形態において、抗体分子は完全免疫グロブリン分子である。
他の実施形態において、抗体分子は、ＭＳＬＮのためのＣＤＲベースの抗原結合部位と、定常ドメインに位置するＣＤ１３７のための抗原結合部位とを含む、抗原結合フラグメントであり得る。例えば、抗原結合フラグメントは、ｓｃＦｖがＭＳＬＮに結合し、ＦｃがＯＸ４０又はＣＨ３ドメインに結合したｓｃＦｖを含むミニボディに結合する、ｓｃＦｖ－Ｆｃ融合物であり得る（Hu et al.(1996), Cancer Res., 56(13):3055-61）。
抗体及びそれらの構築及び使用のための方法は当技術分野で周知であり、例えば、Holliger and Hudson, 2005に記載されている。モノクローナル抗体及び他の抗体で、組換え
ＤＮＡ技術の技法を使用して、元の抗体の特異性を保持する他の抗体又はキメラ分子を産生することができる。そのような技術は、ある抗体分子のＣＤＲ又は可変領域を異なる抗体分子に導入することを含み得る（欧州特許出願公開第Ａ－１８４１８７号、英国特許出願公開第２１８８６３８Ａ号及び欧州特許出願公開第Ａ－２３９４００号）。
好ましい実施形態において、抗体分子は、ｍＡｂ２（ＴＭ）二重特異性抗体である。本明細書で言及されるｍＡｂ２二重特異性抗体は、その可変領域のそれぞれにＣＤＲベースの抗原結合部位、及び抗体分子の定常ドメインに少なくとも１つの抗原結合部位を含む、ＩｇＧ免疫グロブリンである。
好ましい実施形態において、抗体は、ＭＳＬＮ及びＣＤ１３７に結合する抗体分子であり、抗体分子は、
（ｉ）それぞれが免疫グロブリンＶＨドメイン及び免疫グロブリンＶＬドメインによって形成されるＭＳＬＮのための２つのＣＤＲベースの抗原結合部位；及び
（ｉｉ）抗体分子の２つのＣＨ３ドメインに位置するＣＤ１３７に結合する２つの抗原結合部位
を含む。
より好ましい実施形態において、抗体は、ＭＳＬＮ及びＣＤ１３７に結合する完全免疫グロブリン分子、例えば完全ＩｇＧ１分子であり、抗体分子は、
（ｉ）それぞれが免疫グロブリンＶＨドメイン及び免疫グロブリンＶＬドメインによって形成されるＭＳＬＮのための２つのＣＤＲベースの抗原結合部位；及び
（ｉｉ）抗体分子の２つのＣＨ３ドメインに位置するＣＤ１３７に結合する２つの抗原結合部位
を含み、ここで、免疫グロブリン分子は、ＣＨ１、ＣＨ２及びＣＬドメインをさらに含む。
ＣＤＲベースの抗原結合部位は、抗体可変領域の抗原結合部位である。ＣＤＲベースの抗原結合部位は、３つの軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）ＣＤＲ又は３つの重鎖可変ドメイン（ＶＨ）ＣＤＲなどの、３つのＣＤＲによって形成され得る。好ましくは、ＣＤＲベースの抗原結合部位は、６つのＣＤＲ、３つのＶＬ ＣＤＲ及び３つのＶＨ ＣＤＲによって形成される。抗原の結合に対する異なるＣＤＲの寄与は、異なる抗原結合部位によって変動し得る。
抗原結合部位の３つのＶＨドメインＣＤＲは、免疫グロブリンＶＨドメイン内に位置し得、そして３つのＶＬドメインＣＤＲは、免疫グロブリンＶＬドメイン内に位置し得る。例えば、ＣＤＲベースの抗原結合部位は、抗体可変領域に位置し得る。
抗体分子は、ＭＳＬＮに対して１つ、又は好ましくは１つを超える、例えば２つのＣＤＲベースの抗原結合部位を有する。したがって、抗体分子は、１つのＶＨ及び１つのＶＬドメインを含み得るが、好ましくは、２つのＶＨ及び２つのＶＬドメイン、すなわち、例えば天然に存在するＩｇＧ分子の場合のように、２つのＶＨ／ＶＬドメイン対を含む。
ＣＤＲベースの抗原結合部位は、抗体FS22-172-003-AA/FS28-256-271、FS22-172-003-AA/FS28-024-052、FS22-172-003-AA/FS28-256-021、FS22-172-003-AA/FS28-256-012、FS22-172-003-AA/FS28-256-023、FS22-172-003-AA/FS28-256-024、FS22-172-003-AA/FS28-256-026、FS22-172-003-AA/FS28-256-027、FS22-172-003-AA/FS28-256-001、FS22-172-003-AA/FS28-256-005、FS22-172-003-AA/FS28-256-014、FS22-172-003-AA/FS28-256-018、FS22-172-003-AA/FS28-256、FS22-172-003-AA/FS28-024-051、FS22-172-003-AA/FS28-024-053、又はFS22-172-003-AA/FS28-024、好ましくは、抗体FS22-172-003-AA/FS28-256-271又はFS22-172-003-AA/FS28-024-052、最も好ましくは、抗体FS22-172-003-AA/FS28-256-271の、３つのＶＨ ＣＤＲ又は３つのＶＬ ＣＤＲ、好ましくは３つのＶＨ ＣＤＲ及び３つのＶＬ ＣＤＲを含み得る。
ＣＤＲの配列は、通常の技術を使用して、抗体分子のＶＨ及びＶＬドメイン配列から容易に決定され得る。抗体FS22-172-003-AA/FS28-256-271、FS22-172-003-AA/FS28-024-052、FS22-172-003-AA/FS28-256-021、FS22-172-003-AA/FS28-256-012、FS22-172-003-AA/FS28-256-023、FS22-172-003-AA/FS28-256-024、FS22-172-003-AA/FS28-256-026、FS22-172-003-AA/FS28-256-027、FS22-172-003-AA/FS28-256-001、FS22-172-003-AA/FS28-256-005、FS22-172-003-AA/FS28-256-014、FS22-172-003-AA/FS28-256-018、FS22-172-003-AA/FS28-256、FS22-172-003-AA/FS28-024-051、FS22-172-003-AA/FS28-024-053、及びFS22-172-003-AA/FS28-024のＶＨ及びＶＬドメイン配列は、本明細書に記載され、前記抗体の３つのＶＨ及び３つのＶＬドメインＣＤＲは、したがって、前記配列から決定され得る。ＣＤＲ配列は、例えば、Kabat et al., 1991又は国際的なImMunoGeneTics情報システム（ＩＭＧＴ）（Lefranc et al., 2015）に従って決定され得る。
ＣＨ２ドメインにＬＡＬＡ変異を含有する抗体のＶＨドメイン及びＶＬドメインの配列は、ＬＡＬＡ変異を含有しない抗体と同じである。例えば、抗体FS22-172-003-AA/FS28-256-271のＶＨ及びＶＬ配列は、抗体FS22-172-003/FS28-256-271のＶＨ及びＶＬ配列と同
じである。同様に、ＣＨ２ドメインにＬＡＬＡ変異を含有する抗体のＶＨドメインＣＤＲ１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３、及びＶＬドメインＣＤＲ１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３は、ＬＡＬＡ変異を含有しない抗体と同じである。例えば、抗体FS22-172-003-AA/FS28-256-271のＶＨドメインＣＤＲ１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３、及びＶＬドメインＣＤＲ１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３配列は、抗体FS22-172-003/FS28-256-271のＶＨドメインＣＤＲ１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ
３、及びＶＬドメインＣＤＲ１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３配列と同じである。
ＩＭＧＴ番号付けによる抗体分子のＶＨドメインＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３配列は、それぞれ抗体分子のＶＨドメインの２７～３８、５６～６５、及び１０５～１１７位に位置する配列であり得る。
Kabat番号付けによる抗体分子のＶＨドメインＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３配列は
、それぞれＶＨドメインの３１～３５、５０～６５、及び９５～１０２位に位置する配列であり得る。
ＩＭＧＴ番号付けによる抗体分子のＶＬドメインＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３配列は、それぞれＶＬドメインの２７～３８、５６～６５、及び１０５～１１７位に位置する配列であり得る。
Kabat番号付けによる抗体分子のＶＬドメインＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３配列は
、それぞれＶＬドメインの２４～３４、５０～５６、及び８９～９７位に位置する配列であり得る。
例えば、
（ｉ）FS22-172-003-AA/FS28-256-271のＶＨドメインＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３の配列は、それぞれ配列番号４２、３３、及び４４に記載される通りであり得；
（ｉｉ）FS22-172-003-AA/FS28-024-052のＶＨドメインＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３の配列は、それぞれ配列番号１４、１６、及び２７に記載される通りであり得；
（ｉｉｉ）FS22-172-003-AA/FS28-256-021のＶＨドメインＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３の配列は、それぞれ配列番号４２、３３、及び４４に記載される通りであり得；
（ｉｖ）FS22-172-003-AA/FS28-256-012のＶＨドメインＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３の配列は、それぞれ配列番号４２、３３、及び４４に記載される通りであり得；
（ｖ）FS22-172-003-AA/FS28-256-023のＶＨドメインＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３の配列は、それぞれ配列番号５０、３３、及び５２に記載される通りであり得；
（ｖｉ）FS22-172-003-AA/FS28-256-024のＶＨドメインＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３の配列は、それぞれ配列番号４２、３３、及び４４に記載される通りであり得；
（ｖｉｉ）FS22-172-003-AA/FS28-256-026のＶＨドメインＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３の配列は、それぞれ配列番号５０、３３、及び５２に記載される通りであり得；
（ｖｉｉｉ）FS22-172-003-AA/FS28-256-027のＶＨドメインＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３の配列は、それぞれ配列番号４２、３３、及び４４に記載される通りであり得；
（ｉｘ）FS22-172-003-AA/FS28-256-001のＶＨドメインＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３の配列は、それぞれ配列番号３８、３３、及び３５に記載される通りであり得；
（ｘ）FS22-172-003-AA/FS28-256-005のＶＨドメインＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３の配列は、それぞれ配列番号３８、３３、及び３５に記載される通りであり得；
（ｘｉ）FS22-172-003-AA/FS28-256-014のＶＨドメインＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３の配列は、それぞれ配列番号４６、３３、及び４８に記載される通りであり得；
（ｘｉｉ）FS22-172-003-AA/FS28-256-018のＶＨドメインＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３の配列は、それぞれ配列番号５０、３３、及び５２に記載される通りであり得；
（ｘｉｉｉ）FS22-172-003-AA/FS28-256のＶＨドメインＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３の配列は、それぞれ配列番号３１、３３、及び３５に記載される通りであり得；
（ｘｉｖ）FS22-172-003-AA/FS28-024-051のＶＨドメインＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３の配列は、それぞれ配列番号１４、１６、及び２５に記載される通りであり得；
（ｘｖ）FS22-172-003-AA/FS28-024-053のＶＨドメインＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３の配列は、それぞれ配列番号１４、１６、及び２９に記載される通りであり得；
（ｘｖｉ）FS22-172-003-AA/FS28-024のＶＨドメインＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３の配列は、それぞれ配列番号１４、１６、及び１８に記載される通りであり得；
ここで、ＣＤＲ配列は、ＩＭＧＴ番号付けスキームに従って定義される。
（ｉ）FS22-172-003-AA/FS28-256-271のＶＬドメインＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３の配列は、それぞれ配列番号２０、２２、及び８０に記載される通りであり得；
（ｉｉ）FS22-172-003-AA/FS28-024-052のＶＬドメインＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３の配列は、それぞれ配列番号２０、２２、２４に記載される通りであり得；
（ｉｉｉ）FS22-172-003-AA/FS28-256-021のＶＬドメインＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３の配列は、それぞれ配列番号２０、２２、４０に記載される通りであり得；
（ｉｖ）FS22-172-003-AA/FS28-256-012のＶＬドメインＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３の配列は、それぞれ配列番号２０、２２、３７に記載される通りであり得；
（ｖ）FS22-172-003-AA/FS28-256-023のＶＬドメインＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３の配列は、それぞれ配列番号２０、２２、４０に記載される通りであり得；
（ｖｉ）FS22-172-003-AA/FS28-256-024のＶＬドメインＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３の配列は、それぞれ配列番号２０、２２、４１に記載される通りであり得；
（ｖｉｉ）FS22-172-003-AA/FS28-256-026のＶＬドメインＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３の配列は、それぞれ配列番号２０、２２、４１に記載される通りであり得；
（ｖｉｉｉ）FS22-172-003-AA/FS28-256-027のＶＬドメインＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤ
Ｒ３の配列は、それぞれ配列番号２０、２２、８０に記載される通りであり得；
（ｉｘ）FS22-172-003-AA/FS28-256-001のＶＬドメインＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３の配列は、それぞれ配列番号２０、２２、４０に記載される通りであり得；
（ｘ）FS22-172-003-AA/FS28-256-005のＶＬドメインＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３の配列は、それぞれ配列番号２０、２２、４１に記載される通りであり得；
（ｘｉ）FS22-172-003-AA/FS28-256-014のＶＬドメインＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３の配列は、それぞれ配列番号２０、２２、３７に記載される通りであり得；
（ｘｉｉ）FS22-172-003-AA/FS28-256-018のＶＬドメインＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３の配列は、それぞれ配列番号２０、２２、３７に記載される通りであり得；
（ｘｉｉｉ）FS22-172-003-AA/FS28-256のＶＬドメインＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３の配列は、それぞれ配列番号２０、２２、３７に記載される通りであり得；
（ｘｉｖ）FS22-172-003-AA/FS28-024-051のＶＬドメインＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３の配列は、それぞれ配列番号２０、２２、２４に記載される通りであり得；
（ｘｖ）FS22-172-003-AA/FS28-024-053のＶＬドメインＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３の配列は、それぞれ配列番号２０、２２、２４に記載される通りであり得；
（ｘｖｉ）FS22-172-003-AA/FS28-024のＶＬドメインＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３の配列は、それぞれ配列番号２０、２２、２４に記載される通りであり得；
ここで、ＣＤＲ配列は、ＩＭＧＴ番号付けスキームに従って定義される。
例えば、
（ｉ）FS22-172-003-AA/FS28-256-271のＶＨドメインＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３の配列は、それぞれ配列番号４３、５、及び４５に記載される通りであり得；
（ｉｉ）FS22-172-003-AA/FS28-024-052のＶＨドメインＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３の配列は、それぞれ配列番号１５、１７及び２８に記載される通りであり得；
（ｉｉｉ）FS22-172-003-AA/FS28-256-021のＶＨドメインＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３の配列は、それぞれ配列番号４３、３４、４５に記載される通りであり得；
（ｉｖ）FS22-172-003-AA/FS28-256-012のＶＨドメインＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３の配列は、それぞれ配列番号４３、３４及び４５に記載される通りであり得；
（ｖ）FS22-172-003-AA/FS28-256-023のＶＨドメインＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３の配列は、それぞれ配列番号５１、３４及び５３に記載される通りであり得；
（ｖｉ）FS22-172-003-AA/FS28-256-024のＶＨドメインＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３の配列は、それぞれ配列番号４３、３４及び４５に記載される通りであり得；
（ｖｉｉ）FS22-172-003-AA/FS28-256-026のＶＨドメインＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３の配列は、それぞれ配列番号５１、３４及び５３に記載される通りであり得；
（ｖｉｉｉ）FS22-172-003-AA/FS28-256-027のＶＨドメインＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３の配列は、それぞれ配列番号４３、３４及び４５に記載される通りであり得；
（ｉｘ）FS22-172-003-AA/FS28-256-001のＶＨドメインＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３の配列は、それぞれ配列番号３９、３４及び３６に記載される通りであり得；
（ｘ）FS22-172-003-AA/FS28-256-005のＶＨドメインＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３の配列は、それぞれ配列番号３９、３４及び３６に記載される通りであり得；
（ｘｉ）FS22-172-003-AA/FS28-256-014のＶＨドメインＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３の配列は、それぞれ配列番号４７、３４及び４９に記載される通りであり得；
（ｘｉｉ）FS22-172-003-AA/FS28-256-018のＶＨドメインＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３の配列は、それぞれ配列番号５１、３４及び５３に記載される通りであり得；
（ｘｉｉｉ）FS22-172-003-AA/FS28-256のＶＨドメインＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３の配列は、それぞれ配列番号３２、３４及び３６に記載される通りであり得；
（ｘｉｖ）FS22-172-003-AA/FS28-024-051のＶＨドメインＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３の配列は、それぞれ配列番号１５、１７及び２６に記載される通りであり得；
（ｘｖ）FS22-172-003-AA/FS28-024-053のＶＨドメインＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３の配列は、それぞれ配列番号１５、１７及び３０に記載される通りであり得；
（ｘｖｉ）FS22-172-003-AA/FS28-024のＶＨドメインＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３の配列は、それぞれ配列番号１５、１７及び１９に記載される通りであり得；
ここで、ＣＤＲ配列は、Kabat番号付けスキームに従って定義される。
（ｉ）FS22-172-003-AA/FS28-256-271のＶＬドメインＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３の配列は、それぞれ配列番号２１、２３、及び８０に記載される通りであり得；
（ｉｉ）FS22-172-003-AA/FS28-024-052のＶＬドメインＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３の配列は、それぞれ配列番号２１、２３及び２４に記載される通りであり得；
（ｉｉｉ）FS22-172-003-AA/FS28-256-021のＶＬドメインＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３の配列は、それぞれ配列番号２１、２３及び４０に記載される通りであり得；
（ｉｖ）FS22-172-003-AA/FS28-256-012のＶＬドメインＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３の配列は、それぞれ配列番号２１、２３及び３７に記載される通りであり得；
（ｖ）FS22-172-003-AA/FS28-256-023のＶＬドメインＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３の配列は、それぞれ配列番号２１、２３及び４０に記載される通りであり得；
（ｖｉ）FS22-172-003-AA/FS28-256-024のＶＬドメインＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３の配列は、それぞれ配列番号２１、２３及び４１に記載される通りであり得；
（ｖｉｉ）FS22-172-003-AA/FS28-256-026のＶＬドメインＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３の配列は、それぞれ配列番号２１、２３及び４１に記載される通りであり得；
（ｖｉｉｉ）FS22-172-003-AA/FS28-256-027のＶＬドメインＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３の配列は、それぞれ配列番号２１、２３及び８０に記載される通りであり得；
（ｉｘ）FS22-172-003-AA/FS28-256-001のＶＬドメインＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３の配列は、それぞれ配列番号２１、２３及び４０に記載される通りであり得；
（ｘ）FS22-172-003-AA/FS28-256-005のＶＬドメインＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３の配列は、それぞれ配列番号２１、２３及び４１に記載される通りであり得；
（ｘｉ）FS22-172-003-AA/FS28-256-014のＶＬドメインＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３の配列は、それぞれ配列番号２１、２３及び３７に記載される通りであり得；
（ｘｉｉ）FS22-172-003-AA/FS28-256-018のＶＬドメインＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３の配列は、それぞれ配列番号２１、２３及び３７に記載される通りであり得；
（ｘｉｉｉ）FS22-172-003-AA/FS28-256のＶＬドメインＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３の配列は、それぞれ配列番号２１、２３及び３７に記載される通りであり得；
（ｘｉｖ）FS22-172-003-AA/FS28-024-051のＶＬドメインＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３の配列は、それぞれ配列番号２１、２３及び２４に記載される通りであり得；
（ｘｖ）FS22-172-003-AA/FS28-024-053のＶＬドメインＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３の配列は、それぞれ配列番号２１、２３及び２４に記載される通りであり得；
（ｘｖｉ）FS22-172-003-AA/FS28-024のＶＬドメインＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３の配列は、それぞれ配列番号２１、２３及び２４に記載される通りであり得；
ここで、ＣＤＲ配列は、Kabat番号付けスキームに従って定義される。
ＣＤＲベースの抗原結合部位は、抗体FS22-172-003-AA/FS28-256-271、FS22-172-003-AA/FS28-024-052、FS22-172-003-AA/FS28-256-021、FS22-172-003-AA/FS28-256-012、FS22-172-003-AA/FS28-256-023、FS22-172-003-AA/FS28-256-024、FS22-172-003-AA/FS28-256-026、FS22-172-003-AA/FS28-256-027、FS22-172-003-AA/FS28-256-001、FS22-172-003-AA/FS28-256-005、FS22-172-003-AA/FS28-256-014、FS22-172-003-AA/FS28-256-018、FS22-172-003-AA/FS28-256、FS22-172-003-AA/FS28-024-051、FS22-172-003-AA/FS28-024-053、又はFS22-172-003-AA/FS28-024、好ましくは、抗体FS22-172-003-AA/FS28-256-271又はFS22-172-003-AA/FS28-024-052、最も好ましくは、抗体FS22-172-003-AA/FS28-256-271のＶＨ又はＶＬドメイン、好ましくはＶＨ及びＶＬドメインを含み得る。
抗体FS22-172-003-AA/FS28-256-271、FS22-172-003-AA/FS28-024-052、FS22-172-003-AA/FS28-256-021、FS22-172-003-AA/FS28-256-012、FS22-172-003-AA/FS28-256-023、FS22-172-003-AA/FS28-256-024、FS22-172-003-AA/FS28-256-026、FS22-172-003-AA/FS28-256-027、FS22-172-003-AA/FS28-256-001、FS22-172-003-AA/FS28-256-005、FS22-172-003-AA/FS28-256-014、FS22-172-003-AA/FS28-256-018、FS22-172-003-AA/FS28-256、FS22-172-003-AA/FS28-024-051、FS22-172-003-AA/FS28-024-053、及びFS22-172-003-AA/FS28-024のＶＨドメインは、それぞれ、配列番号１７７、５８、７０、７０、７４、７０、７４、７０、６６、６６、７２、７４、６２、５６、６０、及び１２に記載の配列を有し得る。
抗体FS22-172-003-AA/FS28-256-271、FS22-172-003-AA/FS28-024-052、FS22-172-003-AA/FS28-256-021、FS22-172-003-AA/FS28-256-012、FS22-172-003-AA/FS28-256-023、FS22-172-003-AA/FS28-256-024、FS22-172-003-AA/FS28-256-026、FS22-172-003-AA/FS28-256-027、FS22-172-003-AA/FS28-256-001、FS22-172-003-AA/FS28-256-005、FS22-172-003-AA/FS28-256-014、FS22-172-003-AA/FS28-256-018、FS22-172-003-AA/FS28-256、FS22-172-003-AA/FS28-024-051、FS22-172-003-AA/FS28-024-053、及びFS22-172-003-AA/FS28-024のＶＬドメインは、それぞれ、配列番号７６、５４、６８、６４、６８、７８、７８、７６、６８、７８、６４、６４、６４、５４、５４及び、５４に記載の配列を有し得る。
抗体分子は、好ましくはヒトＭＳＬＮ、より好ましくはヒト及びカニクイザルＭＳＬＮに結合する。本発明の抗体分子は、好ましくは、細胞の表面に発現されたＭＳＬＮに結合することができる。細胞は好ましくは腫瘍細胞である。
上記の背景のセクションで説明したように、成熟ＭＳＬＮは腫瘍細胞からシェディングし、腫瘍部位から除去される。このシェッドＭＳＬＮは、シェッドＭＳＬＮに結合した後、腫瘍部位からも除去される抗ＭＳＬＮ結合分子のシンクとして機能することができる。腫瘍細胞の表面に存在するＭＳＬＮに優先的に結合する分子を選択するために、本発明者らは、ＭＳＬＮに対して高い結合活性を有する抗体分子を選択した。具体的には、本発明者らは、溶液中のＭＳＬＮよりも高い親和性で固定化されたＭＳＬＮに結合する抗体分子を選択した。高い結合活性でＭＳＬＮに結合する抗体分子は、単量体形態であると予想される腫瘍細胞からシェディングするＭＳＬＮとは対照的に、ＭＳＬＮの複数のコピーが存在し、抗体分子による二価結合に利用できると予想される腫瘍細胞に存在するＭＳＬＮに優先的に結合すると考えられる。したがって、理論に拘束されることを望むものではないが、本発明の抗体分子は、腫瘍部位からより遅く除去され、したがって、それらの治療効果を発揮するためのより長い時間枠を有することが予想される。
抗体分子は、好ましくは、溶液中のＭＳＬＮよりも高い親和性で固定化されたＭＳＬＮに結合する。固定化されたＭＳＬＮは、表面プラズモン共鳴における使用のためのチップなどの表面に固定化されたＭＳＬＮであり得る。溶液中のＭＳＬＮは、本明細書では可溶性ＭＳＬＮとも呼ばれ、固定化されていない。可溶性ＭＳＬＮは、好ましくは単量体形態、すなわち単量体メソテリンである。
同種抗原に対する抗体の親和性は、抗体が前記抗原と相互作用する平衡解離定数（ＫＤ）として表すことができる。ＫＤ値が高いほど、抗原に対する抗体分子の親和性は低くなる。
抗体分子は、好ましくは、９ｎＭ、８ｎＭ、７ｎＭ、又は６ｎＭの親和性（ＫＤ）で、又はより高い親和性で、固定化されたＭＳＬＮに結合する。好ましくは、抗体分子は、７ｎＭ若しくは６ｎｍのＫＤ、又はそれより低いＫＤ値で、固定化されたＭＳＬＮに結合する。
抗体分子は、好ましくは、１５ｎＭの親和性（ＫＤ）で、又はそれより低い親和性で、溶液中のＭＳＬＮに結合する。より好ましくは、抗体分子は、１６ｎＭ、１７ｎＭ、又は
１８ｎＭの親和性（ＫＤ）で、又はそれより低い親和性で、固定化されたＭＳＬＮに結合する。
好ましい実施形態において、抗体分子は、固定化されたＭＳＬＮに、６ｎＭの親和性（ＫＤ）又はそれより高い親和性で結合し、溶液中のＭＳＬＮに、１８ｎＭの親和性（ＫＤ）又はそれより低い親和性で結合する。
表面結合ＭＳＬＮを含む細胞に対する抗体分子の結合親和性は、細胞への抗体分子の最大半量結合（ＥＣ５０）を達成するために必要な抗体分子の濃度を決定することによって測定され得る。細胞への抗体分子の最大半量結合を達成するために必要な抗体分子の濃度を決定するための適切な方法は、当技術分野で公知であり、本実施例に開示されている（例えば、実施例７を参照）。上記で説明したように、表面結合ＭＳＬＮを含む腫瘍細胞への結合が、可溶性ＭＳＬＮの存在によって影響を受けないか、又は影響が少ない抗体分子は、腫瘍環境におけるシェッドＭＳＬＮの存在という点で好ましい。したがって、好ましい実施形態において、２０ｎＭの可溶性ＭＳＬＮの存在下での表面結合ＭＳＬＮを含む細胞（例えば、腫瘍細胞）への抗体の最大半量結合（ＥＣ５０）を達成するために必要な抗体分子の濃度は、可溶性ＭＳＬＮの非存在下での細胞への抗体の最大半量結合（ＥＣ５０）を達成するために必要な抗体分子の濃度より、２０倍未満、１５倍未満、１０倍未満、９倍未満、８倍未満、７倍未満、６倍未満、５倍未満、４倍未満、又は３倍未満高い。
細胞結合ＭＳＬＮを含む細胞への、ＭＵＣ１６のＭＳＬＮへの結合を遮断しない抗体分子の結合は、可溶性ＭＳＬＮの存在による影響がより少ないことが示されている。したがって、ＭＵＣ１６のＭＳＬＮへの結合ができない、又はそれを遮断しない抗体分子が好ましい可能性がある。
固定化されたＭＳＬＮは、配列番号１４２に記載の配列を有し得る。溶液中のＭＳＬＮは、配列番号１４２に記載の配列を有し得る。
本発明の抗体分子はまた、カニクイザルＭＳＬＮに結合することが示されている。これは、カニクイザルで抗体分子を用いて有効性及び毒性の研究を実施するのに有益であると考えられており、これは、ヒトにおける抗体分子及び有効性と毒性を予測するものであり得る。
抗体分子は、固定化されたヒトＭＳＬＮ及び固定化されたカニクイザルＭＳＬＮに同様の親和性で結合し得る。さらに、抗体分子は、溶液中のヒトＭＳＬＮ及び溶液中のカニクイザルＭＳＬＮに同様の親和性で結合し得る。これは、カニクイザルで抗体分子を用いて実施された有効性及び毒性の研究が、ヒトにおける抗体分子及び有効性と毒性を予測することを保証するために有益であると考えられている。
したがって、好ましい実施形態において、抗体分子は、抗体分子が固定化されたヒトＭＳＬＮに結合する親和性よりも、１０倍以下、好ましくは５倍以下、より好ましくは３倍以下低い又は高い親和性で固定化されたカニクイザルＭＳＬＮに結合する。さらに、抗体分子は、好ましくは、抗体分子が溶液中のヒトＭＳＬＮに結合する親和性よりも、１０倍以下、好ましくは５倍以下、より好ましくは２倍以下低い又は高い親和性で溶液中のカニクイザルＭＳＬＮに結合する。
抗体分子は、リガンド結合について様々な活性を有することが示されている。例えば、抗体分子は、ＭＵＣ１６のＭＳＬＮへの結合を遮断し得る、又は遮断し得ない。
抗体分子は、抗体FS22-172-003-AA/FS28-024-051、FS22-172-003-AA/FS28-024-052、FS
22-172-003-AA/FS28-024-053、又はFS22-172-003-AA/FS28-024のＣＤＲ１～６、ＶＨドメイン及び／又はＶＬドメイン、又はその変異体を含み得、ここで、抗体分子は、ＭＵＣ１６のＭＳＬＮへの結合を遮断する。
或いは、抗体分子は、抗体FS22-172-003-AA/FS28-256-271、FS22-172-003-AA/FS28-256-021、FS22-172-003-AA/FS28-256-012、FS22-172-003-AA/FS28-256-023、FS22-172-003-AA/FS28-256-024、FS22-172-003-AA/FS28-256-026、FS22-172-003-AA/FS28-256-027、FS22-172-003-AA/FS28-256-001、FS22-172-003-AA/FS28-256-005、FS22-172-003-AA/FS28-256-014、FS22-172-003-AA/FS28-256-018、又はFS22-172-003-AA/FS28-256のＣＤＲ１～６、ＶＨドメイン及び／又はＶＬドメイン、又はその変異体を含み得、ここで、抗体分子は、ＭＵＣ１６のＭＳＬＮへの結合を遮断しない。
ＭＵＣ１６のＭＳＬＮへの結合を遮断する抗体分子の能力を決定するのに適した方法は当技術分野で公知であり、ＥＬＩＳＡ及び細胞ベースのアッセイ、例えば、抗体が、ＮＣＩ－Ｈ２２６細胞などのＭＳＬＮを発現する細胞への結合について、ＭＵＣ１６との結合に対し競合するアッセイを含む。
本発明の抗体分子は、ＣＤ１３７抗原結合部位を含む。ＣＤ１３７抗原結合部位は、抗体分子の定常ドメイン、好ましくはＣＨ３ドメインに位置している。ＣＤ１３７抗原結合部位は、抗体分子の定常ドメインに１つ以上の修飾された構造ループを含む。標的抗原の抗原結合部位を作製するための抗体定常ドメイン構造ループの操作は当技術分野で知られており、例えば、Wozniak-Knopp G et al. (2010) Protein Eng Des. 23 (4): 289-297；国際公開第２００６／０７２６２０号及び国際公開第２００９／１３２８７６号に記載される。本発明の抗体分子に含まれるＣＤ１３７定常ドメイン抗原結合部位は、広範な選択及び親和性成熟プログラムに従って同定され、単量体よりも二量体のヒトＣＤ１３７に優先的に結合する。
抗体分子のＣＤ１３７抗原結合部位は、第１及び第２の配列であって、第１及び第２の配列が、それぞれ、抗体分子の定常ドメイン、好ましくはＣＨ３ドメインの、ＡＢ及びＥＦ構造ループ中に位置する配列を含む。第１の配列及び第２の配列は、好ましくは、それぞれ、配列番号１０及び１１に記載のFS22-172-003の第１及び第２の配列である。第１及び第２の配列は、好ましくは、それぞれ、抗体分子のＣＨ３ドメインの１４位と１７位、及び９１位と９９位の間に位置し、ここで、残基の番号付けは、ＩＭＧＴ番号付けに従う。
抗体分子のＣＤループ配列は、好ましくは未修飾、すなわち野生型である。したがって、ＣＤループ配列は、好ましくは、配列番号１５７に示される配列を有する。ＣＤループ配列は、好ましくは、抗体分子のＣＨ３ドメインの４３から７８位に位置し、ここで、残基の番号付けは、ＩＭＧＴ番号付けに従う。
好ましい実施形態において、抗体分子は、配列番号８に記載のFS22-172-003のＣＨ３ドメイン配列を含むか、それらを有するか、又はそれらからなる、ＣＨ３ドメインを含む。
抗体分子のＣＨ３ドメインは、任意選択により、ＣＨ３ドメイン配列のＣ末端のすぐ隣に追加のリジン残基（Ｋ）を含み得る。
モノクローナル抗体及び他の抗体で、組換えＤＮＡ技術の技法を使用して、元の抗体の特異性を保持する他の抗体又はキメラ分子を産生することができる。そのような技術は、ＣＤＲ又は可変領域を異なる免疫グロブリンに導入することを含み得る。ある免疫グロブリンのＣＤＲの別の免疫グロブリンへの導入は、例えば、欧州特許出願公開第Ａ－１８４
１８７号、英国特許出願公開第２１８８６３８Ａ号、及び欧州特許出願公開第Ａ－２３９４００号に記載されている。同様の技術を使用して、本発明による抗体分子のＣＤ１３７抗原結合部位を構成する定常ドメイン配列を、別の抗体分子の定常ドメイン、例えば、ＣＨ３ドメインに導入し得、それにより、その定常ドメインにＣＤ１３７抗原結合部位を含む抗体分子が生じる。或いは、抗体分子の定常ドメイン配列全体を、本発明による抗体分子の定常ドメイン配列で置換して、その定常ドメインにＣＤ１３７抗原結合部位を含む抗体分子を調製し得る。同様に、抗体分子の定常ドメイン配列のフラグメントを、ＣＤ１３７抗原結合部位を含む本発明による抗体分子の定常ドメイン配列の対応するフラグメントで置換し得る。
抗体分子は、好ましくはヒトＣＤ１３７、より好ましくはヒト及びカニクイザルＣＤ１３７、さらにより好ましくは二量体のヒト及びカニクイザルＣＤ１３７に結合する。抗体分子によって結合されるＣＤ１３７の部分は、好ましくはＣＤ１３７細胞外ドメインである。ヒト及びカニクイザルＣＤ１３７の細胞外ドメインは、それぞれ配列番号１４９及び１５３に記載の配列を含むか、又はそれらからなり得る。抗体分子は、好ましくは、細胞の表面に発現されたＣＤ１３７に結合することができる。細胞は、好ましくは、ＣＤ８＋若しくはＣＤ４＋Ｔ細胞又は制御性Ｔ（Ｔｒｅｇ）細胞などの免疫細胞、好ましくはＣＤ８＋Ｔ細胞、又はＢ細胞、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、ナチュラルキラーＴ（ＮＫＴ）細胞、樹状細胞（ＤＣ）、又は腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）である。
上記の背景セクションで説明したように、抗ＣＤ１３７抗体ウレルマブによる患者の処置は、用量を制限する高悪性度の肝臓の炎症と関連していた。理論に拘束されることを望むものではないが、ウレルマブ処置で見られる肝臓の炎症は、肝臓に存在するＴ細胞の活性化、又は患者の肝臓における活性化Ｔ細胞の浸潤及び蓄積によるものであり得ると考えられる。肝臓の炎症が低減された、又は全くない分子を選択するために、本発明者らは、ＣＤ１３７に対して高い結合活性を有するＦｃａｂを選択した。具体的には、本発明者らは、単量体のＣＤ１３７よりも高い親和性で二量体のＣＤ１３７に結合するＦｃａｂを選択した。Ｔ細胞によるＣＤ１３７の発現は、プライミング及び活性化の際にアップレギュレートされる。活性化されたＴ細胞上でのＣＤ１３７のより高発現のために、ＣＤ１３７はそのような細胞の表面上で二量体、三量体及び高次多量体の形態になると考えられている。対照的に、不活性なＴ細胞によるＣＤ１３７発現は、低いか、検出できないことさえある。したがって、ＣＤ１３７は、これがそのようなＴ細胞の表面に発現している限り、単量体形態である可能性が高いと考えられる。したがって、ＣＤ１３７に高い結合活性で結合するCD137/MSLN mAb2は、肝臓に存在する不活性Ｔ細胞などの不活性Ｔ細胞とは対照
的に、活性化Ｔ細胞に優先的に結合し、したがって、低減された肝臓の炎症を示すか、肝臓の炎症を示さないと考えられる。この予想は、抗マウスCD137/MSLN mAb2で処置された
マウスの肝臓の薬理学を決定することによって確認され、これは、処置が肝毒性をもたらさなかったことを示した（実施例１３）。
抗体分子は、好ましくは、６０ｎＭ、５０ｎＭ、４０ｎＭ、３０ｎＭ、２０ｎＭ、１０ｎＭ、５ｎＭ、４ｎＭ、３ｎＭ、又は２ｎＭの親和性（ＫＤ）、又はそれより高い親和性で、二量体のヒトＣＤ１３７に結合する。
好ましい実施形態において、抗体分子は、単量体のＣＤ１３７よりも高い親和性で二量体のＣＤ１３７に結合する。好ましい実施形態において、抗体分子は、単量体のＣＤ１３７に対する抗体分子の親和性よりも、少なくとも５０倍、６０倍、７０倍、８０倍、９０倍、１００倍、１１０倍、１２０倍、１３０倍、１４０倍、１５０倍、１６０倍、１７０倍又は２００倍高い親和性で二量体のＣＤ１３７に結合する。
単量体のヒトＣＤ１３７は、例えば、配列番号１４９に示される配列を有し得る。
FS22-172系統の抗体分子も、二量体のカニクイザルＣＤ１３７に結合することが示されている。カニクイザルＣＤ１３７、並びにヒトＣＤ１３７に結合することは、ヒトへの投与の前に、有効性及び毒性につきカニクイザルで抗体分子を試験できるため、有益である。
好ましい実施形態において、抗体分子は、２５０ｎＭ、２００ｎＭ、１５０ｎＭ、１４０ｎＭ、１２０ｎＭ、１００ｎＭ、９０ｎＭ、８０ｎＭ、７０ｎＭ、６０ｎＭ、５０ｎＭ、４０ｎＭ、３０ｎＭ、２０ｎＭ、１０ｎＭ、５ｎＭ、４ｎＭ、３ｎＭ、又は２ｎＭの親和性（ＫＤ）、又はそれより高い親和性で、二量体のカニクイザルＣＤ１３７に結合し得る。好ましくは、抗体分子は、２ｎＭの親和性（ＫＤ）、又はそれより高い親和性で、カニクイザルＣＤ１３７に結合する。
抗体分子は、同様の親和性で二量体のヒトＣＤ１３７及び二量体のカニクイザルＣＤ１３７に結合し得る。これは、カニクイザルで抗体分子を用いて実施された有効性及び毒性の研究が、ヒトにおける抗体分子及び有効性と毒性を予測することを保証するために有益であると考えられている。
したがって、好ましい実施形態において、抗体分子は、抗体分子が二量体のヒトＣＤ１３７に結合する親和性よりも、１０倍以下、好ましくは５倍以下低い又は高い親和性で二量体のカニクイザルＣＤ１３７に結合する。
ヒト又はカニクイザルＣＤ１３７などの、同種抗原に対する抗体分子の結合親和性は、例えば、Biacoreなどの表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）によって決定することができる。
抗体分子は、ＣＤ１３７とそのリガンドであるＣＤ１３７Ｌとの間、好ましくはヒトＣＤ１３７とヒトＣＤ１３７Ｌとの間の相互作用を遮断することができ得る。ＣＤ１３７ＬのＣＤ１３７への結合を遮断する抗体分子の能力は、ＥＬＩＳＡを使用して決定され得る。
さらに、抗体分子は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、又はＩｇＧ４分子のＣＨ２ドメインなどの免疫グロブリンＧ分子のＣＨ２ドメインを含み得る。好ましくは、抗体分子は、ＩｇＧ１分子のＣＨ２ドメインを含む。ＣＨ２ドメインは、配列番号１５４に記載の配列を有し得る。ＣＨ２ドメインは、Ｆｃγ受容体及び補体に結合することが知られている。ＣＨ２ドメインのＦｃγ受容体への結合には抗体依存性細胞媒介性傷害性（ＡＤＣＣ）が必要である一方、補体への結合には補体依存性細胞傷害性（ＣＤＣ）が必要である。
抗体分子のＣＨ２ドメインは、好ましくは、ＣＨ２ドメインの１つ以上のＦｃγＲＩ、ＦｃγＩＩｌａ、ＦｃγＲＩＩｂ、ＦｃγＲＩＩＩなどのＦｃγ受容体、及び／又は補体への結合を低減又は抑制する１つ以上の変異を含む。本発明者らは、Ｆｃγ受容体への結合を減少させる、又は抑制することにより、抗体分子によって媒介されるＡＤＣＣが減少する、又は排除されると仮定する。同様に、補体への結合を減少させる、又は抑制することは、抗体分子によって媒介されるＣＤＣを減少又は排除することが期待される。理論に拘束されることを望むものではないが、これは、抗体分子が患者に投与される場合に、肝炎症を軽減又は回避することが期待される。１つ以上のＦｃγ受容体及び／又は補体へのＣＨ２ドメインの結合を減少させる、又は抑制する変異は、当技術分野で公知である（Wang et al., 2018）。これらの変異には、Bruhns et al., 2009及びHezareh et al., 2001に記載される「ＬＡＬＡ変異」が含まれ、これは、ＣＨ２ドメインの１．３位及び１．２位のロイシン残基をアラニン（Ｌ１．３Ａ及びＬ１．２Ａ）で置換することを含む。或いは、ＣＨ２ドメインの８４．４位のアスパラギン（Ｎ）をアラニン、グリシン、又はグル
タミン（Ｎ８４．４Ａ、Ｎ８４．４Ｇ、又はＮ８４．４Ｑ）に変異させることによる、保存されたＮ結合型グリコシル化部位の変異を通じたα－グリコシル抗体の生成は、ＩｇＧ１エフェクター機能を低下させることも知られている（Wang et al., 2018）。さらなる
代替として、補体活性化（Ｃ１ｑ結合）及びＡＤＣＣは、ＣＨ２ドメインの１１４位のプロリンをアラニン又はグリシン（Ｐ１１４Ａ又はＰ１１４Ｇ）に変異させることによって低減することが知られている（Idusogie et al., 2000；Klein et al., 2016）。これら
の変異は、ＡＤＣＣ又はＣＤＣ活性がさらに低下した、又は全くない抗体分子を生成するために組み合わせることもできる。
したがって、抗体分子は、ＣＨ２ドメインを含み得、ここで、ＣＨ２ドメインは、
（ｉ）１．３位及び１．２位のアラニン残基；及び／又は
（ｉｉ）１１４位のアラニン又はグリシン；及び／又は
（ｉｉｉ）８４．４位のアラニン、グルタミン又はグリシン；
を含み、ここで、アミノ酸残基の番号付けは、ＩＭＧＴ番号付けスキームに従う。
好ましい実施形態において、抗体分子はＣＨ２ドメインを含み、ここで、ＣＨ２ドメインは、
（ｉ）１．３位のアラニン残基；及び
（ｉｉ）１．２位のアラニン残基；
を含み、ここで、アミノ酸残基の番号付けは、ＩＭＧＴ番号付けスキームに従う。
例えば、ＣＨ２ドメインは、配列番号１５５に記載の配列を有し得る。
代替的な好ましい実施形態において、抗体分子はＣＨ２ドメインを含み、ここで、ＣＨ２ドメインは、
（ｉ）１．３位のアラニン残基；
（ｉｉ）１．２位のアラニン残基；及び
（ｉｉｉ）１１４位のアラニン；
を含み、ここで、アミノ酸残基の番号付けは、ＩＭＧＴ番号付けスキームに従う。
例えば、ＣＨ２ドメインは、配列番号１５６に記載の配列を有し得る。
代替的な好ましい実施形態において、抗体分子は、抗体
（ｉ）それぞれ配列番号３及び８４に記載のFS22-172-003-AA/FS28-256-271；
（ｉｉ）それぞれ配列番号１０２及び８５に記載のFS22-172-003-AA/FS28-024-052；
（ｉｉｉ）それぞれ配列番号１２５及び８２に記載のFS22-172-003-AA/FS28-256-021；
（ｉｖ）それぞれ配列番号１２５及び１１６に記載のFS22-172-003-AA/FS28-256-012；
（ｖ）それぞれ配列番号１３３及び８２に記載のFS22-172-003-AA/FS28-256-023；
（ｖｉ）それぞれ配列番号１２５及び８３に記載のFS22-172-003-AA/FS28-256-024；
（ｖｉｉ）それぞれ配列番号１３３及び８３に記載のFS22-172-003-AA/FS28-256-026；
（ｖｉｉｉ）それぞれ配列番号１２５及び８４に記載のFS22-172-003-AA/FS28-256-027；（ｉｘ）それぞれ配列番号１２０及び８２に記載のFS22-172-003-AA/FS28-256-001；
（ｘ）それぞれ配列番号１２０及び７８に記載のFS22-172-003-AA/FS28-256-005；
（ｘｉ）それぞれ配列番号１２９及び１１６に記載のFS22-172-003-AA/FS28-256-014；
（ｘｉｉ）それぞれ配列番号１３３及び１１６に記載のFS22-172-003-AA/FS28-256-018；（ｘｉｉｉ）それぞれ配列番号１１４及び１１６に記載のFS22-172-003-AA/FS28-256；
（ｘｉｖ）それぞれ配列番号９８及び８５に記載のFS22-172-003-AA/FS28-024-051；
（ｘｖ）それぞれ配列番号１０６及び８５に記載のFS22-172-003-AA/FS28-024-053；又は（ｘｖｉ）それぞれ配列番号９４及び８５に記載のFS22-172-003-AA/FS28-024
の、重鎖及び／又は軽鎖、好ましくは、重鎖及び軽鎖を含み得る。
より好ましい実施形態において、抗体分子は、抗体FS22-172-003-AA/FS28-256-271又はFS22-172-003-AA/FS28-024-052、最も好ましくは、抗体FS22-172-003-AA/FS28-256の、重鎖及び／又は軽鎖、好ましくは、重鎖及び軽鎖を含み得、ここで、これらの抗体の重鎖及び軽鎖配列は上記の通りである。
本発明の抗体分子はまた、本明細書に記載の第１、第２又は第３の配列、ＡＢ、ＣＤ又はＥＦ構造ループ配列、ＣＨ３ドメイン、ＣＨ２ドメイン、ＣＤＲ、ＶＨドメイン、ＶＬドメイン、軽鎖及び／又は重鎖配列の変異体を含み得る。適切な変異体は、配列の変更又は変異、及びスクリーニングの方法によって得ることができる。好ましい実施形態において、１つ以上の変異体配列を含む抗体分子は、ＭＳＬＮ及びＣＤ１３７に対する結合特異性及び／又は結合親和性などの、親抗体分子の１つ以上の機能的特徴を保持する。例えば、１つ以上の変異体配列を含む抗体分子は、好ましくは、（親）抗体分子と同じ親和性、又はより高い親和性で、ＭＳＬＮ及び／又はＣＤ１３７に結合する。親抗体分子は、変異体抗体分子に組み込まれているアミノ酸置換、欠失、及び／又は挿入を含まない抗体分子である。
抗体FS22-172-003-AA/FS28-256-021、FS22-172-003-AA/FS28-256-012、FS22-172-003-AA/FS28-256-023、FS22-172-003-AA/FS28-256-024、FS22-172-003-AA/FS28-256-026、FS22-172-003-AA/FS28-256-027、FS22-172-003-AA/FS28-256-001、FS22-172-003-AA/FS28-256-005、FS22-172-003-AA/FS28-256-014、FS22-172-003-AA/FS28-256-018、又はFS22-172-003-AA/FS28-256のＣＤＲ１～６、ＶＨドメイン、及び／又は重鎖を含む抗体分子は、ＶＨドメインの５５位又は５７位にアミノ酸置換を含み得、ここで、アミノ酸残基の番号付けは、ＩＭＧＴ番号付けスキームに従う。
例えば、抗体分子は、抗体FS22-172-003-AA/FS28-256-027のＣＤＲ１～６、ＶＨドメイン及び／又は重鎖を含み得、ここで、抗体分子は、ＶＨドメインの５５位にアミノ酸置換を含み、アミノ酸残基の番号付けは、ＩＭＧＴ番号付けスキームに従う。
例えば、本発明の抗体分子は、本明細書に記載の構造ループ、ＣＨ３ドメイン、ＣＨ２ドメイン、ＣＤＲ、ＶＨドメイン、ＶＬドメイン、軽鎖又は重鎖配列に対し、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、少なくとも９９．１％、少なくとも９９．２％、少なくとも９９．３％、少なくとも９９．４％、少なくとも９９．５％、少なくとも９９．６％、少なくとも９９．７％、少なくとも９９．８％、又は少なくとも９９．９％の配列同一性を有する、第１、第２又は第３の配列、ＡＢ、ＣＤ又はＥＦ構造ループ配列、ＣＨ３ドメイン、ＣＨ２ドメイン、ＣＤＲ、ＶＨドメイン、ＶＬドメイン、軽鎖及び／又は重鎖配列を含み得る。
好ましい実施形態において、本発明の抗体分子は、本明細書に記載のＣＨ３ドメイン配列に対し、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、少なくとも９９．１％、少なくとも９９．２％、少なくとも９９．３％、少なくとも９９．４％、少なくとも９９．５％、少なくとも９９．６％、少なくとも９９．７％、少なくとも９９．８％、又は少なくとも９９．９％の配列同一性を有するＣＨ３ドメイン配列を含む。
さらに好ましい実施形態において、抗体分子は、本明細書に記載のＣＨ２ドメイン配列に対し、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、少なくとも９９．１％、少なくとも９９．２％、少なくとも９９．３％、少なくとも９９．４％、少なくとも９９．５％、少なくとも９９．６％、少なくとも９９．７％、少なくとも９９．８％、又は少なくとも９９．９％の配列同一性を有するＣ
Ｈ２ドメイン配列を有するか、又はそれを含む。
配列同一性は、一般的に、アルゴリズムＧＡＰ（Wisconsin GCGパッケージ、Accelerys
Inc、米国サンディエゴ（San Diego USA））を参照して定義される。ＧＡＰは、NeedlemanとWunschのアルゴリズムを使用して、２つの完全配列を整列させ、一致の数を最大化し、ギャップの数を最小化する。一般的に、ギャップ生成ペナルティが１２に等しく、ギャップ拡張ペナルティが４に等しいデフォルトのパラメーターが使用される。ＧＡＰの使用が好ましい場合もあるが、他のアルゴリズム、例えば、ＢＬＡＳＴ（Altschul et al., 1990の方法を使用）、ＦＡＳＴＡ（Pearson and Lipman, 1988の方法を使用）、又はSmith-Watermanアルゴリズム（Smith and Waterman, 1981）、又は上掲Altschul et al.(1990)のＴＢＬＡＳＴＮプログラムも、一般的にデフォルトパラメーターを使用して用いられ得る。特に、psi-Blastアルゴリズム（Altschul et al., 1997）が使用され得る。
本発明の抗体分子はまた、本明細書に記載の第１、第２又は第３の配列、ＡＢ、ＣＤ又はＥＦ構造ループ配列、ＣＨ３ドメイン、ＣＨ２ドメイン、ＣＤＲ、ＶＨドメイン、ＶＬドメイン、軽鎖又は重鎖配列と比較して、１つ以上のアミノ酸配列変更（アミノ酸残基の付加、欠失、置換及び／又は挿入）、好ましくは、２０個以下の変更、１５個以下の変更、１０個以下の変更、５つ以下の変更、４つ以下の変更、３つ以下の変更、２つ以下の変更、又は１つの変更を有する、第１、第２又は第３の配列、ＡＢ、ＣＤ又はＥＦ構造ループ配列、ＣＨ３ドメイン、ＣＨ２ドメイン、Ｆｃａｂ、ＣＤＲ、ＶＨドメイン、ＶＬドメイン、軽鎖及び／又は重鎖を含み得る。特に、変更は、ＶＨ及びＶＬドメイン配列の外側の抗体分子の１つ以上のフレームワーク領域、及び／又はＣＨ３ドメインの１つ以上のフレームワーク領域においてなされ得る。例えば、変更は、第１、第２、及び第３の配列として、又はＡＢ、ＣＤ又はＥＦ構造ループ配列として、本明細書に記載される配列の外側のＣＨ３ドメインに存在し得る。
抗体分子は、本明細書に開示されるようなＶＨ ＣＤＲ１、ＶＨ ＣＤＲ２、ＶＨ ＣＤＲ３、ＶＬ ＣＤＲ１、ＶＬ ＣＤＲ２、及び／又はＶＬ ＣＤＲ３と比較して、１つ以上のアミノ酸配列変更（アミノ酸残基の付加、欠失、置換及び／又は挿入）、好ましくは、３つ以下の変更、２つ以下の変更、又は１つの変更を有する、ＶＨ ＣＤＲ１、ＶＨ
ＣＤＲ２、ＶＨ ＣＤＲ３、ＶＬ ＣＤＲ１、ＶＬ ＣＤＲ２、及び／又はＶＬ ＣＤＲ３を含み得る。
好ましい実施形態において、本発明の抗体分子は、本明細書に開示されるＣＨ３ドメインと比較して、１つ以上のアミノ酸配列変更（アミノ酸残基の付加、欠失、置換及び／又は挿入）、好ましくは、２０個以下の変更、１５個以下の変更、１０個以下の変更、５つ以下の変更、４つ以下の変更、３つ以下の変更、２つ以下の変更、又は１つの変更を伴う、ＣＨ３ドメイン配列を含み得る。
１つ以上のアミノ酸が別のアミノ酸で置換されている好ましい実施形態において、置換は、例えば以下の表に従う、保存的置換であり得る。いくつかの実施形態において、中央の列の同じカテゴリーのアミノ酸は、互いに置換されており、すなわち、非極性アミノ酸は、例えば、別の非極性アミノ酸で置換されている。いくつかの実施形態において、右端の列の同じ行のアミノ酸が互いに置換されている。
いくつかの実施形態において、置換は、機能的に保存的であり得る。すなわち、いくつかの実施形態において、置換は、同等の非置換抗体分子と比較して、置換を含む抗体分子の１つ以上の機能的特性（例えば、結合親和性）に影響を与えない（又は実質的に影響を与えない）可能性がある。
本発明の抗体分子は、好ましくは、抗体分子が架橋されていない場合よりも、例えばＭＳＬＮへの結合を介して、抗体分子が架橋されている場合に、増加したＴ細胞活性化を誘導する。
Ｔ細胞を活性化する抗体分子の能力は、Ｔ細胞活性化アッセイを使用して測定してもよい。Ｔ細胞は活性化するとＩＬ－２を放出する。したがって、Ｔ細胞活性化アッセイは、ＩＬ－２放出を測定して、抗体分子又は抗体分子によって誘導されるＴ細胞活性化のレベルを決定し得る。
例えば、Ｔ細胞を活性化する抗体分子の能力は、抗体分子が架橋されている場合、Ｔ細胞活性化アッセイにおいてＴ細胞によるＩＬ－２の最大半量の放出を達成するために必要な抗体分子の濃度を測定することによって決定され得る。これは、以下の抗体分子のＥＣ５０と呼ばれる。低いＥＣ５０は、Ｔ細胞活性化アッセイにおいてＴ細胞による最大半量のＩＬ－２の放出を達成するために、より低い濃度の抗体分子が必要であること、したがって、抗体分子がより高いＴ細胞活性化活性を有することを示す。抗体分子は、例えば、抗ＣＨ２抗体を使用して架橋され得る。
好ましい実施形態において、抗体分子は、Ｔ細胞活性化アッセイにおいて、同じアッセイにおけるFS22-172-003-AA/FS28-256-271又はFS22-172-003-AA/FS28-024-052のＥＣ５０の１０倍、５倍、４倍、３倍、又は２倍以内であるＥＣ５０を有する。
代替的な好ましい実施形態において、抗体分子は、Ｔ細胞活性化アッセイにおいて、同じアッセイにおけるFS22-172-003-AA/FS28-256-271又はFS22-172-003-AA/FS28-024-052のＥＣ５０の１０倍、５倍、４倍、３倍、又は２倍以内であるＥＣ５０を有し、
例えば、抗体分子は、Ｔ細胞活性化アッセイにおいて、５ｎＭ以下、４ｎＭ以下、３ｎＭ以下、２ｎＭ以下、１ｎＭ以下、又は０．５ｎＭ以下のＥＣ５０を有し得る。
さらに、又は或いは、Ｔ細胞を活性化する抗体分子の能力は、抗体分子の存在下でのＴ細胞活性化アッセイにおいて、Ｔ細胞によって放出されるＩＬ－２の最大濃度を測定することによって決定され得、ここで、抗体分子は架橋されている。
好ましい実施形態において、架橋の存在下の抗体分子の存在下でのＴ細胞活性化アッセ
イにおいて、Ｔ細胞によって放出されるＩＬ－２の最大濃度は、同じアッセイにおいてFS22-172-003-AA/FS28-256-271又はFS22-172-003-AA/FS28-024-052の存在下でＴ細胞によって放出されるＩＬ－２の最大濃度の３倍、２倍、又は１．５倍以内である。
Ｔ細胞活性化アッセイは、例えば実施例８に記載されるようなＣＤ８＋Ｔ細胞アッセイなどの、本明細書に記載されるようなＴ細胞アッセイであり得る。
例えば、Ｔ細胞活性化アッセイは、ヒト末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）から単離されたＣＤ８＋Ｔ細胞に基づくＩＬ－２放出アッセイであり得る。例えば、Ｔ細胞活性化アッセイは、白血球枯渇コーンからヒトＰＢＭＣを単離することを含み得る。ＰＢＭＣを単離するための方法は当技術分野で公知であり、本実施例に記載されている。次に、ＣＤ８＋Ｔ細胞がＰＢＭＣから単離され得る。ＰＢＭＣからＣＤ８＋Ｔ細胞を単離するための方法は、当技術分野で公知であり、本実施例に記載されている。
次に、ＣＤ８＋Ｔ細胞は、抗ヒトＣＤ３抗体でコーティングされた多層プレートに添加され得る。各試験抗体分子の適切な希釈液が調製され、ウェルに添加され得る。次に、Ｔ細胞は、試験抗体と共に、３７℃、５％ＣＯ２で、２４時間インキュベートされ得る。上清を収集し、アッセイして、上清中のＩＬ－２の濃度が測定され得る。溶液中のＩＬ－２の濃度を決定するための方法は当技術分野で公知であり、本実施例に記載されている。ヒトＩＬ－２の濃度は、抗体分子の対数濃度に対してプロットされ得る。得られた曲線は、対数（アゴニスト）対応答方程式を使用して適合され得る。
抗体分子は、生物活性分子又は検出可能な標識にコンジュゲートされ得る。この場合、抗体分子はコンジュゲートと呼ばれ得る。そのようなコンジュゲートにより、本明細書に記載されるような疾患の処置及び／又は診断における用途が見出される。
例えば、生物活性分子は、サイトカイン、好ましくはヒトサイトカインなどの免疫系モジュレーターであり得る。例えば、サイトカインは、Ｔ細胞の活性化及び／又は増殖を刺激するサイトカインであり得る。抗体分子にコンジュゲートするためのサイトカインの例には、ＩＬ－２、ＩＬ－１０、ＩＬ－１２、ＩＬ－１５、ＩＬ－２１、ＧＭ－ＣＳＦ及びＩＦＮ－ガンマが含まれる。
或いは、生物活性分子は、サイトカイン、例えば、ＴＧＦ－ベータ又はＩＬ－６のリガンドトラップなどの、リガンドトラップであり得る。
さらなる代替として、生物活性分子は、ＣＤ１３７Ｌ、ＯＸ４０Ｌ、ＴＲＡＩＬ、ＣＤ４０Ｌ、ＣＤ２７Ｌ、又はＧＩＴＲＬなどのリガンドであり得る。
さらなる代替として、生物活性分子は、チューブリン重合の阻害剤（例えば、オーリスタチン）、チューブリン解重合剤（例えば、メイタンシン）、ＤＮＡ鎖切断誘導剤（例えば、カリケアマイシン）、ＤＮＡアルキル化剤（例えば、デュオカルマイシン）、又はＲＮＡポリメラーゼ阻害剤（アルファアマニチンなど）などの薬物であり得る。
抗体分子にコンジュゲートされ得る適切な検出可能な標識は当技術分野で公知であり、ヨウ素１２５、ヨウ素１３１、イットリウム９０、インジウム１１１、テクネチウム９９などの放射性同位体；フルオレセイン、ローダミン、フィコエリトリン、テキサスレッド（Texas Red）並びにシアニン色素誘導体（例えば、Cy7及びAlexa750）などの、蛍光色素；ジアミノベンジジンなどの発色色素；ラテックスビーズ；西洋ワサビペルオキシダーゼなどの酵素標識；スペクトル的に分離された吸収又は発光特性を備えた蛍光体又はレーザー色素；並びに特定の同族の検出可能部分（例えば、標識されたアビジン）への結合を介
して検出され得る、ビオチンなどの化学部分を含む。
抗体分子は、ジスルフィド又はペプチド結合などの任意の適切な共有結合又は非共有結合によって、生物活性分子又は検出可能な標識にコンジュゲートされ得る。生物活性分子がサイトカインである場合、サイトカインは、ペプチドリンカーによって抗体分子に結合され得る。適切なペプチドリンカーは当技術分野で公知であり、長さは５から２５アミノ酸、５から２０アミノ酸、５から１５アミノ酸、１０から２５アミノ酸、１０から２０アミノ酸、又は１０から１５アミノ酸であり得る。
いくつかの実施形態において、生物活性分子は、切断可能なリンカーによって抗体分子にコンジュゲートされ得る。リンカーは、治療部位での抗体分子からの生物活性分子の放出を可能にし得る。リンカーには、アミド結合（例えば、ペプチドリンカー）、ジスルフィド結合、又はヒドラゾンが含まれ得る。例えば、ペプチドリンカーは部位特異的プロテアーゼによって切断され得、ジスルフィド結合は細胞質ゾルの還元環境によって切断され得、ヒドラゾンは酸媒介性加水分解によって切断され得る。
コンジュゲートは、抗体分子と、生物活性分子とを含む融合タンパク質であり得る。この場合、生物活性分子は、ペプチドリンカー又はペプチド結合によって抗体分子にコンジュゲートされ得る。抗体分子が多鎖分子である場合、例えば、抗体分子がＦｃａｂであるか、若しくはＦｃａｂを含む場合、又はｍＡｂ２である場合、生物活性分子は、抗体分子の１つ以上の鎖にコンジュゲートされ得る。例えば、生物活性分子は、ｍＡｂ２分子の重鎖の一方又は両方にコンジュゲートされ得る。融合タンパク質には、産生及び精製が容易であるという利点があり、臨床グレードの材料の産生が容易になる。
本発明はまた、本発明の抗体分子をコードする単離された１つ又は複数の核酸分子を提供する。当業者は、当技術分野で周知の方法を使用してそのような核酸分子を調製することに困難はないであろう。
代替的な好ましい実施形態において、核酸分子は、抗体FS22-172-003-AA/FS28-256-271、FS22-172-003-AA/FS28-024-052、FS22-172-003-AA/FS28-256-021、FS22-172-003-AA/FS28-256-012、FS22-172-003-AA/FS28-256-023、FS22-172-003-AA/FS28-256-024、FS22-172-003-AA/FS28-256-026、FS22-172-003-AA/FS28-256-027、FS22-172-003-AA/FS28-256-001、FS22-172-003-AA/FS28-256-005、FS22-172-003-AA/FS28-256-014、FS22-172-003-AA/FS28-256-018、FS22-172-003-AA/FS28-256、FS22-172-003-AA/FS28-024-051、FS22-172-003-AA/FS28-024-053、又はFS22-172-003-AA/FS28-024、好ましくは、抗体FS22-172-003-AA/FS28-256-271又はFS22-172-003-AA/FS28-024-052、最も好ましくは、抗体FS22-172-003-AA/FS28-256-271の、重鎖及び／又は軽鎖、好ましくは、重鎖及び軽鎖をコードし得る。
抗体FS22-172-003-AA/FS28-256-271、FS22-172-003-AA/FS28-024-052、FS22-172-003-AA/FS28-256-021、FS22-172-003-AA/FS28-256-012、FS22-172-003-AA/FS28-256-023、FS22-172-003-AA/FS28-256-024、FS22-172-003-AA/FS28-256-026、FS22-172-003-AA/FS28-256-027、FS22-172-003-AA/FS28-256-001、FS22-172-003-AA/FS28-256-005、FS22-172-003-AA/FS28-256-014、FS22-172-003-AA/FS28-256-018、FS22-172-003-AA/FS28-256、FS22-172-003-AA/FS28-024-051、FS22-172-003-AA/FS28-024-053、及びFS22-172-003-AA/FS28-024、の重鎖をコードする核酸分子は、それぞれ、配列番号４、１０３、１２６、１２６、１３４、１２６、１３４、１２６、１２１、１２１、１３０、１３４、１１５、９９、１０７、及び９５に記載されている。
抗体FS22-172-003-AA/FS28-256-271、FS22-172-003-AA/FS28-024-052、FS22-172-003-AA/FS28-256-021、FS22-172-003-AA/FS28-256-012、FS22-172-003-AA/FS28-256-023、FS22
-172-003-AA/FS28-256-024、FS22-172-003-AA/FS28-256-026、FS22-172-003-AA/FS28-256-027、FS22-172-003-AA/FS28-256-001、FS22-172-003-AA/FS28-256-005、FS22-172-003-AA/FS28-256-014、FS22-172-003-AA/FS28-256-018、FS22-172-003-AA/FS28-256、FS22-172-003-AA/FS28-024-051、FS22-172-003-AA/FS28-024-053、及びFS22-172-003-AA/FS28-024、の軽鎖をコードする核酸分子は、それぞれ、配列番号９１、８６、１２２、１１７、１２２、９０、９０、９１、１２２、９０、１１７、１１７、１１７、８６、８６及び８６に記載されている。
核酸が本発明の抗体分子の重鎖及び軽鎖をコードする場合、２つのドメイン又は鎖は、２つの別個の核酸分子上にコードされ得る。
単離された核酸分子を使用して、本発明の抗体分子を発現させ得る。核酸は、一般的に、発現のための組換えベクターの形態で提供される。したがって、本発明の別の態様は、上記のような核酸を含むベクターを提供する。プロモーター配列、転写終結フラグメント、ポリアデニル化配列、エンハンサー配列、マーカー遺伝子及び必要に応じて他の配列を含む、適切な調節配列を含有する適切なベクターを選択又は構築することができる。好ましくは、ベクターは、宿主細胞における核酸の発現を駆動するための適切な調節配列を含む。ベクターは、必要に応じて、プラスミド、ウイルス性、例えば、ファージ、又はファージミドであり得る。
本明細書に記載の核酸分子又はベクターは、宿主細胞に導入され得る。核酸又はベクターを宿主細胞に導入するための技術は、当技術分野で十分に確立されており、任意の適切な技術が使用され得る。組換え抗体分子の産生に適した様々な宿主細胞が当技術分野で公知であり、細菌、酵母、昆虫又は哺乳動物の宿主細胞が含まれる。好ましい宿主細胞は、ＣＨＯ、ＮＳ０、又はＨＥＫ細胞などの哺乳動物細胞、例えば、ＨＥＫ２９３細胞である。
本発明の別の態様は、宿主細胞において抗体分子をコードする核酸を発現すること、及び任意選択により、そのように産生された抗体分子を単離及び／又は精製することを含む、本発明の抗体分子を産生する方法を提供する。宿主細胞を培養するための方法は、当技術分野で周知である。この方法は、抗体分子を単離及び／又は精製することをさらに含み得る。組換え抗体分子を精製するための技術は当技術分野で周知であり、例えば、ＨＰＬＣ、ＦＰＬＣ又はアフィニティークロマトグラフィー（例えばプロテインＡ又はプロテインＬを使用するもの）が含まれる。いくつかの実施形態において、精製は、抗体分子上のアフィニティータグを使用して実施され得る。方法はまた、抗体分子を、任意選択により、薬学的に許容される賦形剤又は以下に記載される他の物質と共に、医薬組成物へと製剤化することを含み得る。
上記で説明したように、ＭＳＬＮは、腫瘍細胞の表面に発現しており、可溶性ＭＳＬＮの高発現レベルは、いくつかの癌の予後不良と相関している。抗ＭＳＬＮ抗体は抗癌治療剤として研究されてきた。これらの抗ＭＳＬＮ抗体は、ＡＤＣＣ活性を介して直接細胞死滅を誘導するか、ＡＤＣの形態で使用される。
したがって、本明細書に記載の抗体分子は、癌の処置における用途が見出されることが予想される。したがって、本発明の関連する態様は、
（ｉ）個体の癌を処置する方法における使用のための本明細書に記載の抗体分子、
（ｉｉ）個体の癌の処置における使用のための医薬品の製造における本明細書に記載の抗体分子の使用；及び
（ｉｖ）個体の癌の処置方法であって、本明細書に記載の治療有効量の抗体分子を個体に投与することを含む方法
を提供する。
個体は、患者、好ましくはヒト患者であり得る。
本発明の抗体分子は、可溶性ＭＳＬＮと比較して、癌細胞の表面に存在するＭＳＬＮに優先的に結合することが示されている。したがって、本発明の抗体分子を使用して処置される癌は、好ましくは、ＭＳＬＮを発現するか、又はＭＳＬＮを発現すると決定されている。より好ましくは、処置される癌の細胞は、それらの細胞表面にＭＳＬＮを含むか、又は含むと決定されている、すなわち、細胞表面に結合したＭＳＬＮを含むと決定されている。
癌は、好ましくは、ＣＤ１３７を発現する腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）を含むか、又は含むと決定されている。具体的には、ＴＩＬは、好ましくは、それらの細胞表面上にＣＤ１３７を含むか、又は含むと決定されている。
細胞表面上の抗原の存在を決定するための方法は当技術分野で公知であり、例えば、フローサイトメトリーを含む。
癌は、原発癌又は二次癌であり得る。したがって、本明細書に記載の抗体分子は、癌が原発性腫瘍及び／又は腫瘍転移である、個体の癌を処置する方法における使用のためのものであり得る。
本発明の抗体分子を使用して処置される癌は、固形癌であり得る。
癌は、中皮腫、膵臓癌、卵巣癌、肺癌（小細胞肺癌及び非小細胞肺癌など）、食道癌、乳癌、胃癌、胆管癌、結腸癌、胸腺癌、子宮内膜癌、頭頸部癌、肉腫（二相性滑膜肉腫、カポジ肉腫、骨肉腫、横紋筋肉腫、又は軟部組織肉腫など）、線維形成性の小円形細胞腫瘍、白血病（急性リンパ性白血病、慢性リンパ性白血病、急性顆粒球性白血病、慢性顆粒球性白血病、有毛細胞白血病、又は骨髄性白血病など）、副腎皮質癌、膀胱癌、脳癌、子宮頸癌、子宮頸部過形成、精巣絨毛癌、本態性血小板増加症、泌尿生殖器癌、神経膠腫、神経膠芽腫、リンパ腫（ホジキン病又は非ホジキンリンパ腫など）、悪性カルチノイド癌、悪性高カルシウム血症、黒色腫（悪性黒色腫とも呼ばれる）、悪性膵臓インスリノーマ、甲状腺髄様癌、多発性骨髄腫、菌状息肉腫、神経芽細胞腫、真性多血症、原発性脳癌、原発性マクログロブリン血症、前立腺癌、腎細胞癌、皮膚癌、扁平上皮癌、胃癌、精巣癌、甲状腺癌、及びウィルムス腫瘍からなる群から選択され得る。
好ましくは、癌は、中皮腫、膵臓癌、卵巣癌、肺癌、食道癌、乳癌、胃癌、胆管癌、結腸癌、胸腺癌、子宮内膜癌、頭頸部癌、二相性滑膜肉腫、及び線維形成性の小円形細胞腫瘍からなる群から選択される。
より好ましくは、癌は、中皮腫、膵臓癌、卵巣癌、及び肺癌からなる群から選択される。
癌は、悪性癌細胞の異常な増殖を特徴とする。乳癌などの特定の種類の癌に言及される場合、これは、乳房組織などの関連組織の悪性細胞の異常な増殖を指す。乳房に位置するが、卵巣組織などの別の組織の悪性細胞の異常増殖の結果である二次癌は、本明細書で言及されるような乳癌ではなく、卵巣癌である。
癌において、処置は、完全な癌の寛解を含む癌の成長の阻害、及び／又は癌の転移の阻害、及び癌の再発の阻害を含み得る。癌の増殖は、一般的に、癌内のより発達した形態へ
の変化を示す多数の指標のいずれかを指す。したがって、癌増殖の阻害を測定するための指標には、癌細胞の生存の低下、腫瘍の体積又は形態の減少（例えば、コンピューター断層撮影（ＣＴ）、超音波検査、又は他の画像化方法を使用して決定される）、腫瘍増殖の遅延、腫瘍血管系の破壊、遅延型過敏性皮膚検査のパフォーマンスの改善、抗癌免疫細胞又は他の抗癌免疫応答の活性の増加、及び腫瘍特異的抗原のレベルの減少が含まれる。個体の癌性腫瘍に対する免疫応答を活性化又は増強することにより、癌の増殖、特に対象にすでに存在する癌の増殖に抵抗する個体の能力を改善し、及び／又は個体の癌増殖の傾向を低下させ得る。
抗体分子は単独で投与され得るが、抗体分子は通常、抗体分子に加えて少なくとも１つの成分を含み得る医薬組成物の形態で投与される。したがって、本発明の別の態様は、本明細書に記載の抗体分子を含む医薬組成物を提供する。抗体分子を医薬組成物に製剤化することを含む方法も提供される。
医薬組成物は、抗体分子に加えて、薬学的に許容される賦形剤、担体、緩衝剤、安定剤、又は当業者に周知の他の材料を含み得る。本明細書で使用される「薬学的に許容される」という用語は、健全な医学的判断の範囲内で、合理的な利益／リスク比に見合った、過度の毒性、刺激、アレルギー反応、又はその他の問題若しくは合併症のない、対象（例えば、ヒト）の組織と接触して使用するのに適した、化合物、材料、組成物、及び／又は剤形に関する。各担体、賦形剤などもまた、製剤の他の成分と適合性があるという意味で「許容可能」でなければならない。担体又は他の材料の正確な性質は、投与経路に依存し、これは、以下で論じられるように、注入、注射、又は他の適切な経路によるものであり得る。
非経口、例えば皮下又は静脈内投与（例えば、注射による）の場合、抗体分子を含む医薬組成物は、発熱物質を含まず、適切なｐＨ、等張性及び安定性を備えた、非経口的に許容される水溶液の形態であり得る。関連技術を有する当業者は、例えば、塩化ナトリウム注射、リンガー注射、乳酸リンガー注射などの等張性ビヒクルを使用して、適切な溶液を調製することが十分に可能である。リン酸、クエン酸及びその他の有機酸などの緩衝剤；アスコルビン酸及びメチオニンなどの酸化防止剤；保存剤（塩化オクタデシルジメチルベンジルアンモニウム；塩化ヘキサメトニウム；塩化ベンザルコニウム；塩化ベンゼトニウム；フェノール、ブチル、又はベンジルアルコール；メチル又はプロピルパラベンなどのアルキルパラベン；カテコール；レゾルシノール；シクロヘキサノール；３’－ペンタノール；及びｍ－クレゾール）；低分子量ポリペプチド；血清アルブミン、ゼラチン、又は免疫グロブリンなどのタンパク質；ポリビニルピロリドンなどの親水性ポリマー；グリシン、グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン、アルギニン、又はリジンなどのアミノ酸；単糖、二糖、及びグルコース、マンノース、デキストリを含む他の炭水化物；ＥＤＴＡなどのキレート剤；ショ糖、マンニトール、トレハロース又はソルビトールなどの糖；ナトリウムなどの塩形成対イオン；金属錯体（例えば、Ｚｎ－タンパク質複合体）；及び／又はTWEEN（商標）、PLURONICS（商標）又はポリエチレングリコール（ＰＥＧ）などの非イオン性界面活性剤を含む、保存剤、安定剤、緩衝剤、酸化防止剤及び／又は他の添加剤を必要に応じて使用してもよい。
いくつかの実施形態において、抗体分子は、投与前に再構成するために凍結乾燥形態で提供され得る。例えば、凍結乾燥された抗体分子は、個体に投与する前に、滅菌水で再構成され且つ生理食塩水と混合され得る。
投与は「治療有効量」であり得、これは個体への利点を示すのに十分である。実際に投与される量、並びに投与の速度及び時間経過は、処置される対象の性質及び重症度、処置される特定の個体、個体の臨床状態、障害の原因、組成物の送達部位、抗体分子のタイプ
、投与方法、投与のスケジュール、並びに医師に知られている他の要因に依存する。処置の処方、例えば、投与量の決定などは、一般医及び他の医師の責任の範囲内であり、症状の重症度及び／又は処置されている疾患の進行に依存し得る。抗体分子の適切な用量は当技術分野で周知である（Ledermann et al., 1991; Bagshawe et al., 1991）。投与され
る抗体分子に対して適切な、本明細書又はPhysician’s Desk Reference (2003)に示されている特定の投与量が使用され得る。抗体分子の治療有効量又は適切な用量は、動物モデルにおけるインビトロ活性及びインビボ活性を比較することによって決定することができる。マウス及び他の試験動物における有効投与量をヒトに外挿するための方法は公知である。正確な用量は、処置される領域のサイズ及び位置、並びに抗体分子の正確な性質を含む、多数の要因に依存する。
典型的な抗体用量は、全身投与の場合は１００μｇから１ｇの範囲であり、局所投与の場合は１μｇから１ｍｇの範囲である。最初により高い負荷用量、続いて１つ以上のより低い用量が投与され得る。これは、成人個体の単回処置用の用量であり、比例的に小児及び乳児用に調整され得、分子量に比例して他の抗体形式にも調整できる。
処置は、医師の裁量により、毎日、週に２回、週に１回、又は月に１回繰り返され得る。個体の処置スケジュールは、抗体組成物の薬物動態学的及び薬力学的特性、投与経路、並びに処置される状態の性質に依存し得る。
処置は定期的であり得、投与間の期間は、約２週間以上、例えば、約３週間以上、約４週間以上、約月１回以上、約５週間以上、又は約６週間以上であってもよい。例えば、処置は２から４週間ごと、又は４から８週間ごとであり得る。適切な製剤及び投与経路は上に記載されている。
癌処置において、本明細書に記載の抗体分子は、問題の癌の処置に適切であることが示されているか、適切であると期待される抗癌療法又は治療剤などの、別の抗癌療法又は治療剤と組み合わせて、個体に投与され得る。例えば、抗体分子は、化学療法剤、放射線療法、免疫療法剤、抗腫瘍ワクチン、腫瘍溶解性ウイルス、養子細胞移植（ＡＣＴ）療法（養子ＮＫ細胞療法など）又はキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）、自己腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）、若しくはガンマ／デルタＴ細胞による治療、又はホルモン療法のための薬剤と組み合わせて個体に投与され得る。
理論に拘束されることを望むものではないが、本明細書に記載の抗体分子は、ＴＮＦＲＳＦ受容体などの免疫細胞抗原のための第２の抗原結合部位を含み、抗癌療法におけるアジュバントとして作用し得ると考えられている。具体的には、例えば、化学療法及び／又は放射線療法と組み合わせた、又は抗腫瘍ワクチンと組み合わせた、抗体分子の個体への投与は、化学療法及び／又は放射線療法、又は抗腫瘍ワクチン単独で達成されるよりも、癌に対してより大きな免疫応答を誘発すると考えられる。
本明細書に記載されるような抗体分子と組み合わせた投与のための１つ以上の化学療法剤は、タキサン、細胞傷害性抗生物質、チロシンキナーゼ阻害剤、ＰＡＲＰ阻害剤、Ｂ－Ｒａｆ酵素阻害剤、ＭＥＫ阻害剤、ｃ－ＭＥＴ阻害剤、ＶＥＧＦＲ阻害剤、ＰＤＧＦＲ阻害剤、アルキル化剤、プラチナ類似体、ヌクレオシド類似体、葉酸代謝拮抗剤、サリドマイド誘導体、抗悪性腫瘍化学療法剤などからなる群から選択され得る。タキサンは、ドセタキセル、パクリタキセル及びｎａｂ－パクリタキセルを含み；細胞傷害性抗生物質は、アクチノマイシン、ブレオマイシン、並びにドキソルビシン、ミトキサントロン及びバルルビシンなどのアントラサイクリンを含み；チロシンキナーゼ阻害剤は、エルロチニブ、ゲフィチニブ、アキシチニブ、ＰＬＸ３３９７、イマチニブ、コベミチニブ及びトラメチニブを含み；ＰＡＲＰ阻害剤は、ピラパリブを含み；Ｂ－Ｒａｆ酵素阻害剤は、ベムラフ
ェニブ及びダブラフェニブを含み；アルキル化剤は、ダカルバジン、シクロホスファミド及びテモゾロミドを含み；プラチナ類似体は、カルボプラチン、シスプラチン及びオキサリプラチンを含み；ヌクレオシド類似体は、アザシチジン、カペシタビン、フルダラビン、フルオロウラシル及びゲムシタビンを含み；葉酸代謝拮抗剤は、メトトレキサート及びペメトレキセドを含む。本発明における使用に適した他の化学療法剤には、デファクチニブ、エンチノスタット、エリブリン、イリノテカン、及びビンブラスチンが含まれる。
本明細書に記載の抗体分子と共に投与するための好ましい治療剤は、ペントスタチン、シクロホスファミド、シスプラチン、ペメトレキセド、パクリタキセル、カルボプラチン、ゲムシタビン、ドキソルビシン、ビノレルビン、ドセタキセル、又はエトポシドである。
本明細書に記載されるような抗体分子と組み合わせた投与のための放射線療法は、外部照射療法（強度変調放射線療法（ＩＭＲＴ）、定位放射線療法（ＳＢＲＴ）、画像誘導放射線療法（ＩＧＲＴ）、術中放射線療法（ＩＯＲＴ）、電子療法又は電子ビーム療法（ＥＢＴ）、表面放射線療法（ＳＲＴ）など）、又は内部照射療法（近接照射療法、放射性同位体又は放射性核種療法、ＳＩＲＴなど）であり得る。好ましくは、放射線療法は、従来の外部照射療法、外部ビーム放射線療法（ＥＢＲＴ）、定位放射線療法、又は近接照射療法である。
本明細書に記載されるような抗体分子と組み合わせた投与のための免疫療法剤は、治療用抗体分子、核酸、サイトカイン、又はサイトカインベースの治療剤であり得る。例えば、治療用抗体分子は、免疫調節分子、例えば、阻害性チェックポイント分子又は免疫共刺激分子、自然免疫系の受容体、又は腫瘍抗原、例えば、細胞表面腫瘍抗原又は可溶性腫瘍抗原に結合し得る。治療用抗体分子が結合し得る免疫調節分子の例には、ＣＴＬＡ－４、ＬＡＧ－３、ＴＩＧＩＴ、ＴＩＭ－３、ＶＩＳＴＡ、ＰＤ－Ｌ１、ＰＤ－１、又はＫＩＲなどの阻害性チェックポイント分子、ＯＸ４０、ＣＤ４０、ＧＩＴＲ、ＣＤ２７、又はＩＣＯＳなどの免疫共刺激分子、ＣＤ４７、ＣＤ７３、ＣＳＦ－１Ｒ、ＨＶＥＭ、ＴＧＦＢ、又はＣＳＦ－１などの他の免疫調節分子が含まれる。治療用抗体分子が結合し得る自然免疫系の受容体の例には、ＴＬＲ１、ＴＬＲ２、ＴＬＲ４、ＴＬＲ５、ＴＬＲ７、ＴＬＲ９、ＲＩＧ－Ｉ様受容体（例えば、ＲＩＧ－Ｉ及びＭＤＡ－５）、及びＳＴＩＮＧが含まれる。
本明細書に記載されるような抗体分子と組み合わせた投与のための核酸は、ｓｉＲＮＡであり得る。
サイトカイン又はサイトカインベースの治療は、ＩＬ－２、コンジュゲートＩＬ－２のプロドラッグ、ＧＭ－ＣＳＦ、ＩＬ－７、ＩＬ－１２、ＩＬ－９、ＩＬ－１５、ＩＬ－１８、ＩＬ－２１、及びＩ型インターフェロンからなる群から選択され得る。
癌の処置のための抗腫瘍ワクチンは、クリニックで実施され、且つ科学文献で詳細に議論されている（Rosenberg, S. 2000など）。これは主に、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ－ＣＳＦ）を伴う場合と伴わない場合の両方で、ワクチン接種方法としてこれらの細胞を使用することにより、自己又は同種異系の癌細胞によって発現される様々な細胞マーカーに応答するように免疫系を刺激する戦略を含む。ＧＭ－ＣＳＦは、抗原提示において強い反応を引き起こし、前記戦略で使用される場合、特によく機能する。
化学療法剤、放射線療法、免疫療法剤、抗腫瘍ワクチン、腫瘍溶解性ウイルス、ＡＣＴ療法、又はホルモン療法剤は、好ましくは、問題の癌のための化学療法剤、放射線療法、免疫療法剤、抗腫瘍ワクチン、腫瘍溶解性ウイルス、ＡＣＴ療法、又はホルモン療法剤、
すなわち、問題の癌の処置に効果的であることが示されている、化学療法剤、放射線療法、免疫療法剤、抗腫瘍ワクチン、腫瘍溶解性ウイルス、ＡＣＴ療法、又はホルモン療法剤である。問題の癌に効果的であることが示されている、適切な化学療法剤、放射線療法、免疫療法剤、抗腫瘍ワクチン、腫瘍溶解性ウイルス、ＡＣＴ療法、又はホルモン療法剤の選択は、十分に当業者の能力の範囲内である。
本発明のさらなる態様及び実施形態は、以下の実験的例示を含む本開示を与えられた当業者には明らかであろう。
本明細書で言及されている全ての文書は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
本明細書で使用される場合、「及び／又は」は、２つの特定の特徴又は構成要素のそれぞれの特定の開示として、他方の有無にかかわらず解釈されるべきである。例えば、「Ａ及び／又はＢ」は、ちょうどそれぞれが本明細書に個別に記載されているかのように、（ｉ）Ａ、（ｉｉ）Ｂ、並びに（ｉｉｉ）Ａ及びＢ、のそれぞれの特定の開示として解釈されるべきである。
文脈上が別段の指示がない限り、上記の特徴の説明及び定義は、本発明のいずれの特定の態様又は実施形態にも限定されず、記載される全ての態様及び実施形態に等しく適用される。
本発明の他の態様及び実施形態は、文脈上別段の指示がない限り、「含む」という用語を「からなる」又は「から本質的になる」という用語に置き換えて、上記の態様及び実施形態を提供する。
ここで、本発明の特定の態様及び実施形態を、例として、上記の図面を参照して説明する。
実施例
実施例１：抗原選択及び特性評価
ＭＳＬＮ及びＣＤ１３７の両方に結合し、ＣＤ１３７のアゴニズムをもたらすことが可能なｍＡｂ２を識別するために使用される選択及びスクリーニング方法は、様々なＭＳＬＮ及びＣＤ１３７抗原の使用を必要とする。これらの抗原の産生については、以下でより詳細に記載される。
１．１ 組換えＣＤ１３７抗原
ＣＤ１３７などの腫瘍壊死因子受容体スーパーファミリー（ＴＮＦＲＳＦ）メンバーは、同族リガンドに結合する場合、クラスターを形成する多量体を形成する傾向があることで知られている（Croft,M.2003）。それらの機能のために凝集するこの傾向は、ファージ及び酵母ディスプレイなどのインビトロ選択で使用するため、及び選択されたタンパク質の特性評価のために、溶液中で凝集しない可溶性組換えタンパク質を産生することを困難にする。
市販されている抗原の大部分は、不適切であると見なされたため、以下の組換え二量体及び単量体ＣＤ１３７抗原（表１を参照）は、選択に使用するために自社生産された。
単量体抗原は、ＥｃｏＲＩ－ＨＦ及びＢａｍＨＩ－ＨＦ制限酵素を使用して、Ａｖｉタグ配列及び６つのＣ末端ヒスチジン残基と共に、ヒト（配列番号１４９に示すように）又はマウスＣＤ１３７（配列番号１５０に示すように）の細胞外ドメインをコードするＤＮＡを修飾ｐＦＵＳＥベクター（InvivoGen、pfuse-mIgG2A-Fc2）にクローニングすること
によって作製された。ベクターをＨＥＫ２９３－６Ｅ細胞（National Research Council of Canada）にトランスフェクトし、発現したＣＤ１３７をHisTrap（商標）excelニッケ
ルカラム（GE Healthcare Life Sciences、29048586）及びサイズ排除クロマトグラフィ
ー（ＳＥＣ）を使用して精製し、抗原が単一種であり、凝集体を含まないことを確実にした。
二量体抗原を産生するために、Ａｖｉタグ配列と共にｍＩｇＧ２ａ Ｆｃドメインと融合したヒト、マウス又はカニクイザルＣＤ１３７の細胞外ドメインをコードするＤＮＡ構築物を修飾pFUSE vectorにクローニングし、ＨＥＫ２９３－６Ｅ細胞にトランスフェクトした。組換えＣＤ１３７は、MabSelect SuRe（商標）プロテインＡカラム（GE Healthcare Life Sciences, 11003494）及びサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）を使用して
精製し、抗原が単一種であり、凝集体を含まないことを確実にした。
二量体及び単量体抗原はそれぞれ、BirA biotin-protein ligase reaction kit（Avidity LLC、BirA500）を使用してビオチン化し、単一ビオチン分子で標識された単量体ＣＤ
１３７抗原及び２つの単量体の各々一つずつの２つのビオチン分子で標識された二量体ＣＤ１３７抗原を産生した。３ｍｇの抗原を７．８μｌのＢｉｒＡ酵素混合物と、酵素対基質のモル比を１：５０で混合した。次に、製造業者の推奨に従って添加剤を添加し（１４２μｌのBiomix A、１４２μｌのBiomix B、１４２μのビオチン）、反応混合物を室温で２時間インキュベートした。ビオチン化タンパク質の完全性を維持するために、Amicon
３０μｍフィルター（Merck, UFC503096）を使用して、反応混合物を直ちにＤＰＢＳ（ThermoFisher Scientific 14190-169）に緩衝液交換をした。
タンパク質は、ＳＥＣによってさらに精製され、ＢｉｒＡ酵素の除去、及び高分子量の凝集体を含まない最終的な高品質の単分散タンパク質調製物の生成を確実にした。材料は、サイズ排除高速液体クロマトグラフィー（ＳＥ－ＨＰＬＣ）、ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ－ＰＡＧＥ）、及び多角度光散乱検出器付きサイズ排除クロマト
グラフィー（ＳＥＣ－ＭＡＬＳ）によって、安定性及び純度を分析された。タンパク質の完全なビオチン化は、ストレプトアビジンシフトＳＤＳ－ＰＡＧＥゲルで確認された。組換えヒト及びマウス抗原は、インビトロで、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）により、抗ＣＤ１３７陽性対照抗体（それぞれ、２０Ｈ４．９（米国特許第７２８８６３８号）及びＬｏｂ１２．３（University of Southampton））、及びフローサイトメトリーによるヒト
及びマウスＣＤ１３７リガンド発現ＤＯ１１．１０細胞に結合することが確認された。細胞をＣＤ１３７抗原と共に１時間インキュベートした後、蛍光標識した抗マウスＦｃフラグメント抗体を使用して細胞結合を検出した。選択プロトコルで使用される材料について可能な限り高い純度を確実にするために、抗原の徹底的なタンパク質特性評価は、タンパク質凝集体の存在は、割合が２％を超えないことを確実にするために実行された。
１．２ 細胞発現ＣＤ１３７抗原
ＤＯ１１．１０細胞（National Jewish Health）発現完全長マウス（配列番号３７４）又はヒトＣＤ１３７（配列番号３７３）、それぞれ「DO11.10.mCD137」及び「DO11.10.hCD137」と指定され、表２に列挙されたように選択されたＦｃａｂの選択及びさらなる特性評価のために、その天然形態に最も類似した膜結合立体配座で抗原を提示するために産生された。
レンチウイルス形質導入は、Lenti-X HTX Packaging System（Clontech、カタログ番号631249）を使用して、ヒト又はマウスＣＤ１３７受容体を過剰発現するこれらのＤＯ１１．１０細胞を産生するために使用された。ヒトＣＤ１３７ ｃＤＮＡ又はマウスＣＤ１３７ ｃＤＮＡを含有するLenti-X expression vector（ｐＬＶＸ）（Clontech、カタログ
番号631253）は、Lenti-X HTX Packaging Mixと共にLenti-X 293T Cell Line（Clontech
、カタログ番号632180）に同時トランスフェクトして、ウイルスを生成した。次に、ＤＯ１１．１０細胞株にこれらのレンチウイルスベクターを形質導入した。
これらの細胞でのヒトＣＤ１３７又はマウスＣＤ１３７の発現は、フローサイトメトリーによる細胞への２０Ｈ４．９、及びＬｏｂ１２．３抗ＣＤ１３７陽性対照抗体それぞれの結合によって確認された。細胞をヒト又はマウスの陽性対照抗体と１時間インキュベートした後、蛍光標識した抗ヒトＦｃ検出抗体（Stratech Scientific Ltd、カタログ番号109-546-098-JIR）を使用して細胞結合を検出した。
１．３ ヒト、ｃｙｎｏ及びマウスのメソテリン抗原
‘hMSLN-His Acro’と命名された組換えビオチン化ヒトＭＳＬＮ－Ｈｉｓ抗原を、Ｃ末端１８アミノ酸を欠くAcrobiosystems（カタログ番号MSN-H8223）から得た。完全長の単
量体ヒトＭＳＬＮ抗原が生成され、ファージ選択のために社内でビオチン化された。カニクイザル及びマウスのＭＳＬＮは、ヒト及びカニクイザルのＭＳＬＮに結合できる結合体の分離及びマウスのＭＳＬＮ結合体の分離を可能にするためにそれぞれ製造された。
簡単に説明すると、ＭＳＬＮ抗原は、ＥｃｏＲＩ－ＨＦ及びＢａｍＨＩ－ＨＦ制限酵素
を使用して、６つのＣ末端ヒスチジン残基及びＡｖｉタグ配列と共に、全長ヒト（配列番号１４２）（hMSLN-His-Avi）、カニクイザル（配列番号１４３）（cMSLN-His-Avi）、又はマウス（配列番号１４４）（mMSLN-His-Avi）ＭＳＬＮをコードするＤＮＡを修飾ｐＦ
ＵＳＥベクター（InvivoGen、pfuse-mIgG2A-Fc2）にクローニングすることによって作製
された。そのベクターをＨＥＫ２９３－６Ｅ細胞（National Research Council of Canada）にトランスフェクトし、HisTrap（商標）エクセルニッケルカラム（GE Healthcare Life Sciences 29048586、）を使用して発現MSLNを精製した。その抗原の各々を、BirA biotin-protein ligase reaction kit（Avidity LLC、BirA500）を使用してビオチン化し、
単一ビオチン分子で標識された単量体ＭＳＬＮ抗原を産生した。
続いて、HisTrap（商標）エクセルニッケルカラムを使用して、組換えヒト、ｃｙｎｏ
、又はマウスＭＳＬＮを精製し、過剰な遊離ビオチンを除去した。
これらの抗原のＳＥＣ－ＨＰＬＣは１０％未満の凝集を示し、ＰＡＧＥは抗原が単量体であることを確認した。ＥＬＩＳＡ及び表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）を使用して、ビオチン化されたＭＳＬＮ抗原が、ＳＳ１ ｓｃＦｖ 米国特許第７，０８１，５１８Ｂ１号（Hassan et al.2002）及びＭＯＲ６６２６（国際公開第２００９／０６８２０４Ａ１号
）と同様のＣＤＲを含有するＭＳＬＮ特異的陽性対照抗体ＳＳ１（ＶＨ配列番号１４０；ＶＬ配列番号１４１）によって結合され得ることを確認した。このデータに基づいて、全ての抗原はナイーブ選択に適していると見なされた
実施例２：抗ヒトＣＤ１３７ Ｆｃａｂの選択及び特性評価
２．１ 抗ヒトＣＤ１３７ Ｆｃａｂのナイーブ選択
ヒトＣＤ１３７に結合するＦｃａｂを選択するために、酵母及びファージディスプレイ選択キャンペーンを採用して、同定されたＦｃａｂの多様性を最大化した。細胞表面は、両方ともヒトＣＤ１３７及び組換え二量体ヒトＣＤ１３７を表示し、二量体又は多量体ＣＤ１３７タンパク質に対して結合活性駆動型選択圧を発揮するために、様々な抗原提示を提供するために使用された。単量体ＣＤ１３７への高親和性ではなく、ＣＤ１３７複合体へ結合活性で結合するＦｃａｂを取得することは、そのようなＦｃａｂがＴ細胞刺激の後に、ＣＤ１３７のアップレギュレーションが生じる活性化及びプライミングされたＴ細胞を優先的に標的化すると考えられるため、有益であると考えられた。理論に拘束されることを望むものではないが、ＣＤ１３７膜発現のレベルが非常に低い又は無視できるＴ細胞は、タンパク質の大部分が二量体、三量体、又はそれ以上の多量体状態である高度にアップレギュレートされたＣＤ１３７を有する活性化Ｔ細胞とは異なり、単量体状態のＣＤ１３７を持つ可能性が高いと仮定された。結合活性駆動型選択の結果として、Fcabは優先的に活性化されたＴ細胞に結合し、ナイーブＴ細胞又はＣＤ１３７の低発現を示す他の細胞にはうまく結合しないであろう。結合活性のＣＤ１３７ Ｆｃａｂを選択することにより、潜在的な標的外Ｔ細胞の活性化が減少し、それに伴う毒性が減少する。
ヒトＩｇＧ１のＣＨ１からＣＨ３ドメインを表示するナイーブ酵母ライブラリーを酵母表示による選択に使用した。ライブラリーは全て、ＣＨ３ドメインのランダム化されたＡＢループ（ＩＭＧＴ番号付けによる位置１４から１８の残基を含む）及びランダム化されたＥＦループ（ＩＭＧＴ番号付けによる位置９２から１０１の残基を含む）を含んだ。ライブラリーのうちの２つは、ＣＨ３ドメインのＡＢループの１６位に５つのアミノ酸残基を挿入することをさらに含んだ（ＩＭＧＴ番号付けによる１６．５から１６．１位の残基）。
ライブラリー選択から同定された酵母単一クローンを、細胞をビオチン化組換え二量体ヒト抗原又はマウスＦｃフラグメントとインキュベートし、組換えｈＣＤ １３７抗原のＦｃ部分に結合する酵母クローンと区別することを含むフローサイトメトリー抗原結合ア
ッセイを使用して、抗原結合についてスクリーニングした。ヒット数を増やすために、誘導温度を上げる、選択ストリンジェンシーを下げる、又はラウンド数を減らすなど、様々な抗原濃度及び条件で選択を繰り返した。固有配列を有する９つのＦｃａｂクローンが特定された。
２．２ 「モック」ｍＡｂ２形式における抗ヒトＣＤ１３７ Ｆｃａｂの調製
８５個の抗ヒトＣＤ１３７ Ｆｃａｂクローンを含むＩｇＧ１分子からなる「モック」ｍＡｂ２抗体を作製し、ｍＡｂ２形式におけるＦｃａｂの特性評価を可能にした。モックｍＡｂ２は、抗鶏卵リゾチーム抗体ＨｅｌＤ１．３のＣＨ３ドメインの対応する領域に対して、ＡＢ、ＣＤ及びＥＦループを含むＣＨ３ドメインＦｃａｂの一部を置換することにより調製した。ＨｅｌＤ１．３抗体の生成は、Tello et al.1993に記載されている。抗体ＨｅｌＤ１．３の重鎖及び軽鎖配列は、それぞれ配列番号１３８及び１３９に示されている。モックｍＡｂ２分子は、ＨＥＫ２９３－６Ｅ細胞中での一過性発現によって産生され、ｍＡｂSelectSureカラムを使用したプロテインＡ親和性クロマトグラフィーによって精製された。次いで、これらのｍＡｂ２を、バイオレイヤー干渉法（ＢＬＩ）により、ヒト組換え抗原（ビオチン化hCD137-mFc-Avi）との結合について試験した。
２．３ ヒトＮＦ－κＢレポーターアッセイにおける選択された抗ＣＤ１３７モックｍＡｂ２の活性
ＴＮＦＲシグナル伝達には多量体化及びクラスター化が必要である（Bitra et al.,2017）。ＣＤ１３７は、ＮＦ－κＢ同族のリガンドであるＣＤ１３７Ｌと相互作用する場合
、ＮＦ－κＢシグナル伝達経路をクラスター化し活性化する。アゴニスト分子は、ＣＤ１３７のクラスター化及び活性化を促進するリガンドを模倣し、それによってＮＦ－κＢシグナル伝達経路を活性化する。一部のアゴニスト性抗体は、例えば、ウレルマブのように、結合時にＣＤ１３７クラスター化を本質的に引き起こすことができ、一方で、他の抗体は、例えば、ウトミルマブのように、ＣＤ１３７クラスター化を誘導するために抗体自体の追加の架橋を必要とするものも知られている（Fisher et al.,2012）。エフェクター細胞上のＦｃガンマ受容体は、インビボでそのような架橋を誘導することが知られているが、これは非効率的であり、治療上の関心のある部位から離れて発生する可能性がある。用量制限毒性はウレルマブに関連しているがウトリムマブには関連していないため、本質的にアゴナイズする能力を持たない抗ＣＤ１３７結合Ｆｃａｂを選択するが、ＣＤ１３７クラスター化を誘導するために追加の架橋を必要とするもののみを選択することにした。そこで、架橋抗体により細胞表面に発現させたＣＤ１３７のクラスター化することにより、細胞内のＮＦ－κＢシグナル伝達経路の活性化を検出できるが、抗体が架橋されていない場合には、ほとんど活性を示さないアッセイを開発した。次に、このアッセイは、ＦｃａｂがＢＬＩによって組換え抗原に結合することが見出されたかどうかにかかわらず、抗ＣＤ１３７ ＦｃａｂクローンｍＡｂ２形式のアゴニスト性機能活性を試験するために使用された。タンパク質Ｌを架橋剤として使用して、アッセイにおけるＦａｂ部分を介して、モックｍＡｂ２架橋を促進し、ＮＦ－κＢ活性化を測定した。
HEK.FRT.luc.hCD137細胞は、ＥｃｏＲＩ－ＨＦ及びＸｈｏＩ制限酵素を使用して、ヒトＣＤ１３７配列（配列番号１４９）をコードするｃＤＮＡ配列をｐＭＳＣＶ－ｎｅｏｍｙｃｉｎベクター（Takara Clontech、カタログ番号634401）にサブクローニングすること
により作製した。RetroPack PT67細胞株（Clontech、Cat.631510）を、製造元のプロトコルに従ってレトロウイルス粒子を産生するために使用した。その後、このレトロウイルスを用いて、ルシフェラーゼの発現を制御するＮＦ－κＢ感受性プロモーターを含有するQiagen Cignal Lenti NFkBリポーター（ｌｕｃ）（Qiagen、カタログ番号336851）レンチウイルスを用いて、Flp-In T-REx 293 HEK細胞株（Life Technologies、R780-07）を形質導入することによって以前に産生されたＨＥＫ．ＦＲＴ．ｌｕｃ細胞を形質導入した。これらのHEK.FRT.luc.hCD137細胞を使用して、選択において同定されたＣＤ１３７結合体を含
有するモックｍＡｂ２をスクリーニングした。
各モックｍＡｂ２の２μＭ希釈をＤＰＢＳ（Life Technologies、14190169）中で調製
し、レポーター細胞培地（ＤＭＥＭ（Gibco、Cat.61965-026）；１０％ＦＣＳ（Gibco、Cat.10270-106）；PennStrep１個（Gibco、Cat.15140-122）；ブラスチシジン１５μｇ／
ｍｌ（Melford Laboratories Ltd、Cat.B1105）；ピューロマイシン５μｇ／ｍｌ（Life technologies、Cat.A11113803）；ゼオシン１００μｇ／ｍｌ（InvivoGen、Cat.11006-33-0）；ジェネチシン５００μｇ／ｍｌ（Life Technologies、Cat.10131-027）中で１：３にさらに希釈した。タンパク質Ｌ（Life Technologies、21189）を、人工架橋剤として使用し、ｍＡｂ２分子と１：４のモル比で混合した。２４時間のインキュベーション後、細胞を１００μｌのPromega Bio-Glo（商標）ルシフェラーゼアッセイ試薬（Promegaカタログ番号G7941）で製造元の指示に従って処置し、Gen5 Software、BioTekを備えたプレートリーダーで０．５秒の積分時間で発光を測定した。発光値は、架橋Ｆｃａｂによって誘導されるＣＤ１３７のクラスター化によるＮＦ－κＢシグナル伝達経路の活性化に応答して産生されるルシフェラーゼの尺度である。発光値をＦｃａｂの対数濃度に対してプロットし、得られた曲線をGraphPad Prismの対数（アゴニスト）対応答式を使用して適合させた。
ヒットは、架橋されていない場合と比較して、タンパク質Ｌで架橋された場合に、ルシフェラーゼシグナルが少なくとも１０倍増加することによって識別されるとともに、これらのクローンは、ＣＤ１３７のクラスター化及びそれに続く下流シグナル伝達経路の活性化を誘導できると判断された。試験した全てのクローンのうち、ＦＳ２２－１７２を含め、２つは架橋時、ルシフェラーゼのこの１０倍の増加を誘導できたが、ＥＣ５０はどちらも決定できなかった。両方ともＤＯ１１．１０Ｔ細胞活性化アッセイにおいてのさらなる特性評価のために選択された。驚くべきことに、ＢＬＩによってＣＤ１３７標的に結合しているにもかかわらず、架橋状態にある残りのクローンは、活性が観察されなかったことから、おそらくそれらがＣＤ１３７上の無関係なエピトープで結合していたか、又はそのようなクローンの親和性が、ＮＦ－κＢシグナル伝達カスケードを開始するのに十分強くＣＤ１３７に結合するのに十分ではなかったことを示している。全体として、ナイーブ選択から２つのＦｃａｂ（ＦＳ２２－１７２を含む）が同定され、架橋する場合、ＮＦ－κＢレポーターアッセイで目的の機能を示し、架橋しない場合ほとんど活性がなかった。
実施例３：抗ヒトＣＤ１３７ Ｆｃａｂの親和性成熟及びその後の特性評価
３．１ ＦＳ２２－１７２の親和性成熟
ＦＳ２２－１７２Ｆｃａｂクローンから４つの酵母ディスプレイライブラリーを構築した。各クローンのＣＨ３ドメインのＡＢループでＥＬＬＡプライマーを使用して７つの残基（ＩＭＧＴによる位置１５～１６．１）をランダム化し、ライブラリーＦＳ２２－１７２ＡＢを作成した。ＣＨ３ドメインのＥＦループでＥＬＬＡプライマーを使用して５つの残基（ＩＭＧＴによる位置９２～９４及び９７～９８）をランダム化し、ライブラリーＦＳ２２－１７２ＥＦを得た。
ライブラリーＦＳ２２－１７２ＡＢ及びＦＳ２２－１７２ＥＦについて、二量体ｈＣＤ１３７－ｍＦｃ－Ａｖｉ抗原又は単量体ｈＣＤ１３７－Ａｖｉ－Ｈｉｓ抗原を使用して、親和性成熟クローンについて選択するために酵母ライブラリーで３回又は４回の選択ラウンドを実行した。単量体抗原を二量体抗原と交代して、クローンが抗原に対する親和性を保持し、結合力を介してのみに結合しないようにした。単量体又は二量体抗原の使用、及び使用される濃度は、フローサイトメトリーによって各ラウンド中に経験的に決定され、単量体又は二量体抗原に対する濃縮が前のラウンドで観察されたかどうかによって決定された。可能な場合はいつでも、親分子と比較して親和性成熟クローンを単離するために、親分子の上のソーティングゲートを使用した。選択圧は、二量体抗原の１ｎＭまで増加し
た。各選択ラウンド中に、個々のクローンを寒天プレートにスポットして、選択の進行状況を評価した。各クローンを個別に増殖及び誘導し、次に、その結合及び構造パラメーターを、前述のように、ビオチン化二量体抗原及び抗ＣＨ２構造マーカーを使用してフローサイトメトリーによって決定した。このスクリーニングカスケードに続いて、選択アウトプットからのクローンのサンプルに基づいて選択の成功の決定を可能にし、その後可溶性タンパク質として生成することができる個々のクローンの早期スクリーニングを可能にした。
酵母単一クローンを、前述のように抗原結合フローサイトメトリーでビオチン化組換え抗原への結合についてスクリーニングした。３０個の固有のループ配列をＦＳ２２－１７２ＡＢライブラリーから分離した。ＦＳ２２－１７２ＥＦライブラリーは、親クローンを上回る結合改善を示したクローンは含まれていなかった。
３．２ 「モック」ｍＡｂ２形式における抗ヒトＣＤ１３７ Ｆｃａｂの構築
ＨｅｌＤ１．３における抗ヒトＣＤ１３７ Ｆｃａｂを含む「モック」ｍＡｂ２抗体は、ｍＡｂ２形式の親和性成熟Ｆｃａｂのさらなる特性評価のために調製された。これらのｍＡｂ２は、実施例２．２で記載したように調製した。CD137/HelD1.3「モック」ｍＡｂ
２をＨＥＫ２９３－６Ｅ細胞中で一過性発現によって産生し、mAb Select SuReプロテイ
ンＡカラムを使用して精製した。
３．３ ヒトＮＦ－κＢレポーター細胞アッセイにおけるモックｍＡｂ２形式におけるヒトＦｃａｂの活性
列挙されたモックｍＡｂ２（ＨｅｌＤ１．３）形式の親和性成熟抗ヒトＣＤ１３７ Ｆｃａｂの機能的活性を、実施例２．３に記載された同様のＮＦ－κＢルシフェラーゼアッセイで試験した。Gen5 Software、BioTekを備えたプレートリーダーで０．５秒の積分時
間で発光を測定した。予想通り、Ｆｃａｂはタンパク質Ｌ架橋（－ＸＬ）なしでは活性を示さなかった。全ての親和性成熟ＣＤ１３７ Ｆｃａｂは、親ＣＤ１３７ Ｆｃａｂよりも大きな改善を示し、このアッセイにおいては陽性であるが、ＥＣ５０値の計算は不可能であった（実施例２．３参照）ＦＳ２２－１７２－００３は、たんぱく質Ｌ（＋ＸＬ）で架橋した場合、最も低いＥＣ５０（３２．６４ｎＭ）で各ファミリーから最高の活性を示した。
３．４ 表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）による抗ヒトＣＤ１３７ Ｆｃａｂの特異性決定
他の関連するＴＮＦＳＦＲファミリーメンバーと比較したヒトＣＤ１３７に対する抗ヒトＣＤ１３７ Ｆｃａｂの特異性を試験した。Ｆｃａｂのうち８つを、モックｍＡｂ２（ＨｅｌＤ１．３）形式で試験し、他のヒトＴＮＦＲＳＦ受容体：ＣＤ４０、ＯＸ４０及びＧＩＴＲへの結合を試験することにより、Biacore T200（GE Healthcare）でＳＰＲによ
って測定された。アミンカップリング（アミンカップリングキット、GE Healthcare、BR-1000-50）を使用して、Biacore CM5チップ（GE Healthcare、カタログ番号２９１４９６
０３）でヒトＣＤ４０、ＧＩＴＲ、及びＯＸ４０を約１０００ＲＵにコーティングした。１μＭから開始のモックｍＡｂ２形式での抗ヒトＣＤ１３７ Ｆｃａｂの希釈液（FS22-172-003/HelD1.3）を、ＨＢＳ－ＥＰ＋緩衝液（BR100669）で調製し、３０μｌ／分で３分間注入した後、緩衝液中で４分間解離した。チップを、１０ｍＭグリシンｐＨ２．５を３０μｌ／分で１２秒間注入することにより再生した。異なるＴＮＦＲＳＦメンバーに特異的な抗体を、Biacoreチップコーティングを検証するための陽性対照として使用した。デ
ータを、二重参照減算し、BIAevaluation３．２ソフトウェアを使用して分析した。Ｆｃ
ａｂは、試験したＴＮＦＲＳＦ受容体のいずれにも結合せず、ＣＤ１３７に対する特異性を示した。結果として、Ｆｃａｂ、又はこれらのＦｃａｂから抗原結合部位を含むｍＡｂ２は、ＣＤ１３７以外のいかなるものへ結合も誘発することは期待されていない。
３．５ ＳＰＲによるヒト、カニクイザル及びマウスＣＤ１３７に対するモックｍＡｂ２形式における抗ヒトＣＤ１３７ Ｆｃａｂの結合親和性
ヒト、カニクイザル（ｃｙｎｏ）及びマウスＣＤ１３７に対するモックｍＡｂ２形式（実施例３．２参照）における抗ヒトＣＤ１３７ Ｆｃａｂの親和性をＳＰＲで測定し、Ｆｃａｂが動物試験での試験に有用であり得るかどうかを決定した。抗ヒトＦａｂ捕捉抗体を、製造業者の推奨（GE Healthcare、ヒトＦａｂキャプチャーキット、#28958325）に従って、平均表面密度６０００ＲＵになるように、ＣＭ５シリーズＳチップ（GE Healthcare#BR-1005-30）の４つのフローセル全てに固定化した。２５℃及び１０μｌ／分の流速での固定化は、６０００ＲＵの平均最終応答を達成した。各ｍＡｂ２は、ＨＢＳ－ＥＰ＋緩衝液（GE Healthcare#BR1006-69）で希釈したｍＡｂ２の３μｇ／ｍｌ溶液を３０μｌ／
分で６０秒間注入することにより、約１５０ＲＵまで捕捉した。次に、ＨＢＳ－ＥＰ＋緩衝液中の異なる濃度のヒト、Ｃｙｎｏ又はマウスＣＤ１３７抗原（非ビオチン化ヒト、ｃｙｎｏ又はマウスＣＤ１３７－ｍＦｃ－Ａｖｉ又はヒトＣＤ１３７－Ａｖｉ－Ｈｉｓ）を、６０μｌ／分で３分間チップ上に流し、次いで１０分間解離させた。各抗原濃度の後、１０ｍＭグリシンｐＨ２．１を３０μｌ／分の流速で３０秒間注射することにより、チップを再生した。緩衝液ＨＢＳ－ＥＰ＋を、参照減算のために、最高濃度の抗原の前及び最低濃度の抗原の後に注入し、ランダムな濃度の１つを２回繰り返した。結合速度論を、１：１ラングミュアモデルに適合させて、各サンプルにつき平衡結合（ＫＤ）を生成した。データ分析は、BiaEvaluationソフトウェアバージョン３．２を使用して実行された。結
果を表３に示す。
結果の分析は、それぞれの親分子と比較して、全ての親和性成熟クローンによるヒト及びカニクイザルＣＤ１３７の両方に対する結合が改善されていることが明らかになった。単量体のヒトＣＤ１３７抗原に対する結合親和性は、二量体のヒト及びｃｙｎｏＦｃ融合抗原よりも弱かった（少なくとも１００倍）。実施例２．１で議論したように、Ｆｃａｂは、ＣＤ１３７の単量体型よりも二量体に優先的に結合するように選択され、このデータは、選択戦略が成功したことを確認する。この速度論的挙動により、刺激されていないＴ細胞上で最小限のレベルで発現する単量体ＣＤ１３７に結合する可能性が低くなり、その結果、いくつかの抗ＣＤ１３７モノクローナル抗体療法に関連する肝臓又は全身毒性のリスクが低減される。
データはまた、抗ヒトＣＤ１３７ Ｆｃａｂが、ヒト二量体ＣＤ１３７と同等の親和性でカニクイザル二量体ＣＤ１３７に結合したことを示す。
マウス二量体ＣＤ１３７に結合するＦｃａｂの能力も試験した。どのクローンもマウス
抗原に強い結合を示さなかった（表３に示すように、Ｎ／ＡはＫＤが計算できなかったことを示す）。
３．６ 抗ヒトＣＤ１３７ Ｆｃａｂの親和性成熟及び特性評価の概要
要約すると、親和性成熟抗ＣＤ１３７ Ｆｃａｂを生成し、ｍＡｂ２形式に調製され、その後特性評価された。ＣＨ３ドメインにこれらのＣＤ１３７抗原結合ドメイン含有ｍＡｂ２は、ヒトＮＦ－κＢリポーター細胞アッセイにおいて高いレベルの活性を示し、この活性は架橋依存性であることが示された。
抗ヒトＣＤ１３７抗原結合ドメイン含有ｍＡｂ２はまた、ＣＤ１３７に特異的であり、他のＴＮＦＲＳＦ受容体には結合しないことが示された。ｍＡｂ２は、ヒト単量体ＣＤ１３７抗原よりもヒト二量体ＣＤ１３７抗原に優先的に結合することが示された。最後に、これらのｍＡｂ２は、ヒト二量体ＣＤ１３７と同等の親和性を持つカニクイザル二量体ＣＤ１３７に結合することが示された。
抗ヒトＣＤ１３７抗原結合ドメイン含有ｍＡｂ２は、ＣＤ１３７をクラスター化し、活性化するために架橋を必要とすると実証したことから、次の目的は、ＣＤ１３７に加えてヒトＭＳＬＮを結合するｍＡｂ２を調製することであった。Ｆａｂアームを介したヒトＭＳＬＮへのｍＡｂ２の結合は、抗体分子の架橋を引き起こし、その結果、ＣＤ１３７のクラスター化及び活性化につながり、この活性化はヒトＭＳＬＮ発現の存在に依存するはずであるという仮説が立てられた。
ＣＤ１３７に加えて、ヒトＭＳＬＮを結合するｍＡｂ２を調製するために、ＭＳＬＮに結合することができるｍＡｂを生成することが最初に必要であった。これらのｍＡｂの生成について以下に記載する。
実施例４：抗ヒトＭＳＬＮ抗体の分離：抗原、選択及びスクリーニング
メソテリンは、６９ｋＤａの前駆体として合成され、タンパク質分解的に３０ｋＤａのＮＨ２末端分泌型（巨核球増強因子又はＭＰＦと呼ばれる）及び４０ｋＤａの膜結合型メソテリン（ＭＳＬＮ）に加工されたグリコシルホスファチジルイノシトール（ＧＰＩ）結合型糖タンパク質である。腫瘍細胞表面からシェディングし、選択的スプライシング又は膜結合型ＭＳＬＮの腫瘍壊死因子変換酵素（ＴＡＣＥ）によって生成されたＭＳＬＮの可溶性形態が患者血清中に見られる。この腫瘍シェッド抗原は、治療用抗体のデコイとして機能することができる「シンク」を作ることが知られており（Lee et al.,2018）、これ
は、抗体が腫瘍上のＭＳＬＮに結合することを可能にするために克服されなければならないようなものである。このシンク効果を回避するために、可溶性ＭＳＬＮと比較して、固定化されたＭＳＬＮに優先的に結合する新規抗メソテリン抗体が得られ、これは、シンク内の可溶性ＭＳＬＮよりも膜結合ＭＳＬＮに優先的に結合することを意味することを意図していた。この目的のために、ＭＳＬＮ抗原の異なる形態がファージ選択及びその後のスクリーニングキャンペーンで使用された。様々な親和性で膜結合ヒト及びｃｙｎｏＭＳＬＮに結合し、ＭＳＬＮの異なる領域を標的とすることができた抗体のパネルが特定された。ELISA、Biacoreブロッキングアッセイ及び細胞結合を含む一連のスクリーニングアッセイ、及びＭＳＬＮへの結合領域を比較するアッセイを実行した。
４．１ ファージミドライブラリの選択
ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３（MSM Technologies）でランダム化されたヒトＩｇＧ１生殖細胞系列のＦａｂドメインを表示する合成ナイーブファージミドライブラリを、実施例１．３に記載されたＭＳＬＮ抗原を用いた選択に使用した。
Ｆａｂライブラリーは、ビオチン化されたヒト、ｃｙｎｏ又はマウスMSLN-His-Avi又は
hMSLN-His Acroに結合したファージを分離するために、Streptavidin Dynabeads（Thermo
Fisher、11205D）、Dynabeadsに結合したNeutravidin-binding protein（Thermo Fisher、31000）又は、anti-His Dynabeads（Thermo Fisher、10103D）を使用して、３回又は４回のラウンドごとに複数のキャンペーンで最初に選択された。選択キャンペーンはまた、ヒト及びｃｙｎｏ交差反応性クローンを分離する目的で、ヒトＭＳＬＮ選択ラウンドをｃｙｎｏＭＳＬＮ抗原と交互に行う、自社生産の完全長ＭＳＬＮ抗原を使用して実行した。マウスＭＳＬＮ（R&D mMSLN-His 8604-MS）への結合体の選択も実行した。標準的なファ
ージ選択及びファージ回収手順を使用した。
ＭＳＬＮ抗原の異なる領域に結合するクローンを取得するために、上記の初期選択キャンペーンから抗ＭＳＬＮ抗体を使用してエピトープマスキング戦略を採用した。簡単に説明すると、ナイーブＦａｂライブラリーの第１ラウンドの選択は、５００ｎＭのビオチン化ヒトMSLN-His-Aviを使用して実行した。ラウンド２及びラウンド３において、５００ｎＭ（ラウンド２）又は１００ｎＭ（ラウンド３）のビオチン化ｃｙｎｏMSLN-His-Aviのファージ結合を、初期選択キャンペーンから分離されたナイーブ抗メソテリンｍＡｂタンパク質の混合物の存在下で試験した。これらのエピトープマスキング選択は、アウトプット力価の低下をもたらし、これは、選択戦略が、より少ない結合体が同定されたように作用していることを示し、以前の選択キャンペーンからのクローンと比較して、ＭＳＬＮの追加領域を標的とする３つの追加のクローンの同定を導いた。
４．２ 抗ＭＳＬＮ抗体を同定するためのスクリーニング
全選択のラウンド３及びラウンド４のアウトプットからの約２０００クローンを、２５ｎＭ固定化ビオチン化hMSLN-His Acro、完全長ビオチン化ヒト又はｃｙｎｏMSLN-His-Aviへの結合について、ファージＥＬＩＳＡによってスクリーニングし、一連の選択で使用された抗原と一致する。無関係なビオチン化Ｈｉｓタグ抗原で固定化したストレプトアビジンプレート又はプレートを陰性対照として含めた。陰性対照に対するシグナルよりも少なくとも４倍高いＭＳＬＮ結合シグナルを有するクローンを選択し、それらの可変領域を配列決定し、１５６の固有ＶＨ／ＶＬ配列の組合せを同定し、次いで、可溶性発現のために選択した。クローンを、エピトープマスキング選択を含む全ての選択キャンペーンから選択した。各クローンについて、ＶＨ及びＶＬをそれぞれ、ＣＨ１、ＣＨ２（ＣＨ２ドメインおいてＬＡＬＡ変異を有する（Bruhns et al.,2009;Hezareh et al.,2001）及びＣＨ３ドメイン又はＣＬドメインのいずれかを含むｐＴＴ５発現ベクター（National Research Council of Canada）に個別にクローン化した。得られたＬＡＬＡ変異を有するｐＴＴ５
－ＦＳ２８ ＶＨ（ＡＡ）及びｐＴＴ５－ＦＳ２８ ＶＬベクターをＨＥＫ２９３－６Ｅ細胞に一過性にコトランスフェクトし、クローンを完全なＩｇＧ１分子として産生した。同様の方法を使用して、ＳＳ１及び抗鶏卵卵白リゾチーム抗体ＨｅｌＤ１．３のＶＨ及びＶＬ領域をクローニングし、ＩｇＧ１ ＬＡＬＡ形式で発現させ、G1-AA/SS1（配列番号
１４０（重鎖）及び１４１（軽鎖））及びG1-AA/HelD1.3（配列番号１３８（重鎖）及び
１３９（軽鎖））を生じ、それぞれ陽性及び陰性対照とした。
４．３ 組換えＭＳＬＮへの結合についてのスクリーニング
４．３．１ 結合ＥＬＩＳＡ
可溶性抗ＭＳＬＮ結合クローン又は精製クローン含有ＨＥＫ２９３上清を、ヒトMSLN-His Acro、hMSLN-His-Avi、及び一部のキャンペーンでは、cMSLN-His-Aviとの結合につい
てＥＬＩＳＡによりスクリーニングした。簡単に説明すると、hMSLN-His Acro、hMSLN-His-Avi、cMSLN-His-Avi、又は無関係のＨｉｓタグ付き抗原を、２５ｎＭで、４℃で一晩maxisorpプレートにコーティングした。翌日、プレートを０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０及び２％Marvelミルク（Marvel dried milk）含有の３００μｌのＰＢＳで遮断した。上清又は
精製タンパク質含有抗ＭＳＬＮｍＡｂを室温で１時間インキュベートし、それらの結合を西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）にコンジュゲートしたマウス抗ヒトＦｃ－ＩｇＧ
抗体で検出した。無関係な抗原への結合、又はヒト及びカニクイザル抗原の両方と交差反応しなかったクローンを廃棄した。さらに、完全長ＭＳＬＮ抗原、MSLN-His-Aviではなく、短縮型ＭＳＬＮ抗原、hMSLN-His Acroに結合したクローンは、完全長の抗原がＭＳＬＮ－発現細胞の細胞表面上に抗原立体構造をより代表するものであると予想されたので、採用されなかった。
抗体がＭＳＬＮへの結合に特異性を有することを確認するために、抗ＭＳＬＮ結合クローンもグリコシル化及び脱グリコシル化ＭＳＬＮへの異なる結合について試験した。ビオチン化されたhMSLN-His-Aviは、ＰＮＧａｓｅ Ｆ酵素（NEB、P0704L）を使用して、２４時間３７℃で脱グリコシル化し、アミコン超遠心フィルター（Millipore、UFC901024）を使用して精製し、２５ｎＭでmaxisorpプレート上にコーティングした。固有の抗メソテリンｍＡｂのＭＳＬＮへのＥＬＩＳＡ結合を、マウス抗ヒトFc-IgG-HRP（Sigma、A0170）を使用して検出した。グリコシル化されたＭＳＬＮ抗原と比較して、脱グリコシル化されたＭＳＬＮ抗原への結合シグナルの２倍以上の減少を示したクローンは、ナイーブ抗ＭＳＬＮ結合ｍＡｂのパネルから除外された。
４．３．２ BIAcoreスクリーニング
ヒトMSLN-His-Aviは、アミンカップリングキット（GE Healthcare、BR10050）を使用して、約２００応答ユニット（ＲＵ）でＣＭ５シリーズＳ BIAcore sensor chip（GE Healthcare、BR100530）のフローセル２に固定化された。フローセル１は減算のためにブランクのままにした。ＨＥＫ２９３上清又は精製タンパク質は、ＨＢＳ－ＥＰ＋（GE Healthcare）で、サンプルあたり約５０ｎＭのＭＳＬＮｍＡｂに調整した。サンプルをフローセ
ル１及び２上に２．５分間３０μｌ／分で注入し、次いで、ＨＢＳ－ＥＰバッファー中で２．５分間解離させた。再生は、１０ｍＭグリシンｐＨ１．５（GE Healthcare、BR100354）を３０μｌ／分の速度で３０秒間注入することにより達成された。減算したデータ（
フローセル２－フローセル１）を、BIAevaluation ３．２ソフトウェア（GE Healthcare
）を使用して分析した。結合ＥＬＩＳＡからこのアッセイで試験された８６のクローンのうち３９のクローンは、５０ｎＭで１０ＲＵを超える結合応答を示したため、再発現、精製、及びさらなるスクリーニングのために選択された。
４．３．３ 結合したＭＳＬＮの領域に基づく抗体のビニング
ELISA及びBiacoreスクリーニングデータに基づいて、次に、オクテット（ForteBio）のバイオレイヤー干渉法（ＢＬＩ）により、別のｍＡｂの存在下でｍＡｂのヒトＭＳＬＮへの結合を試験するビニングアッセイでクローンを試験した。
簡単に説明すると、ビオチン化hMSLN-His-Avi（５μｇ／ｍｌ）をストレプトアビジン
チップ（ForteBIO、18-5020）に５分間結合させた。G1-AA/SS1を１ｘ動的バッファー（ForteBIO、18-1092）で２００ｎＭに希釈し、hMSLN-His-Aviに５分間結合させた。次に、２００ｎＭの試験ｍＡｂ及び２００ｎＭのG1-AA/SS1を含有する混合物の結合を５分間評価
した。これは、ＳＳ１の非存在下で可能な結合の最大範囲を決定するために、結合されたG1-AA/SS1の非存在下で、hMSLN-His-Aviへ試験ｍＡｂの結合と比較した（すなわち、結合のための競争がなかった場合）。両方の抗体がＭＳＬＮの同じ領域への結合を競合した場合、試験抗体は結合できない。
G1-AA/SS1を用いたこれらのビニング実験は、試験したＦＳ２８バインダーの大部分（
２３個中１９個）が、G1-AA/SS1の存在下で、ＭＳＬＮと結合することができず、したが
って、G1-AA/SS1と類似の領域に結合していることに起因する可能性があることを明らか
にした。Ｆａｂ形式においてＳＳ１抗体のＭＳＬＮ結合部位が報告されており（Ma et al.,2012）、ＭＵＣ１６結合にも関与するアミノ酸７から６４を含むＮ末端領域と定義されている。ＳＳ１との結合について部分的又は全く競合を示さなかった追加のクローン、Ｆ
Ｓ２８－１８５及びＦＳ２８－２５６が同定された。これらのクローンを互いにビニングすると、これらのクローンは、２つの追加の独立したビンを表し、すなわちＭＳＬＮのさらに２つの異なる領域に結合することが可能であることが明らかになった。ＦＳ２８－１８５は１つのビン（「ビン２」）に割り当てられ、ＦＳ２８－２５６は別のビン（「ビン３」）に割り当てられた。これらの結果は、ＭＳＬＮの複数の領域に結合する抗体が同定されたため、セクション１．２のエピトープマスキング選択が成功したことを示した。
４．３．４ 親和性
実施例４．３．３に記載の各ビンについて、結合動態は、ヒト又はｃｙｎｏMSLN-His-Aviが５０又は１００ＲＵで固定化されたことを除いて、実施例４．３．２に記載された同様の方法を使用して決定された。クローンは、３倍希釈で８１ｎＭから０．３３ｎＭの濃度範囲で試験された。結合体がランク付けされ、各ビンから最良のもの、ビン１からＦＳ２８－０２４；ビン２からＦＳ２８－１８５、及びビン３のＦＳ２８－２５６が選択された。これらのクローンは全てｃｙｎｏ交差反応性であったが（データは示さず）、これらの試験条件下では親和性は計算されなかった。表４に示されるように、固定化されたＭＳＬＮの５０ＲＵで得られた親和性は、固定化されたＭＳＬＮ抗原の１００ＲＵで得られた親和性よりも低く、より高いレベルのＭＳＬＮでの結合の増加を示した。
４．４ ＭＵＣ１６－ＭＳＬＮブロッキングアッセイ
ＦＳ２８－０２４、ＦＳ２８－１８５、及びＦＳ２８－２５６を、ブロッキングアッセイにおいて、ＭＵＣ１６のメソテリンへの結合を遮断する能力について試験した。ＳＳ１は、ＭＳＬＮへのＭＵＣ１６結合を遮断することが文献から知られている（Ma et al.,2012）。ＳＳ１と同様のＣＤＲを含有し、ＭＵＣ１６結合を遮断すると予想されるG1-AA/SS1、及び対照ＩｇＧ１抗体s（G1AA/HelD1.3）は、それぞれ陽性対照及び陰性対照として含まれていた。
簡単に説明すると、組換えヒトＭＵＣ１６（R&D Systems、5809-MU-050）を、１ｘＰＢＳ中０．６５μｇ／ｍｌで、４℃で一晩maxisorpプレートにコーティングした。プレートを１ｘＰＢＳで３回洗浄し、２％Tween２０及び２％Marvelミルク含有の３００μｌのＰ
ＢＳで遮断した。抗ＭＳＬＮｍＡｂｓ（０．２３ｎＭから５００ｎＭ、３倍希釈）の濃度を、ビオチン化hMSLN-His-Avi抗原（最終濃度２μｇ／ｍｌ）と１００μｌの容量で１時
間、室温で予め混合した。ブロッキング溶液を除去した後、ｍＡｂ／ＭＳＬＮ混合物をプレートに加え、室温で１時間インキュベートした。プレートをＰＢＳＴ（１ｘＰＢＳ及び０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０）で３回洗浄し、ストレプトアビジン－ＨＲＰ（Thermo Scientific、21126、１ｘＰＢＳで１：１０００希釈）と室温で１時間インキュベートした。最後に、プレートをＰＢＳＴで３回、ＰＢＳで３回洗浄した。ＭＵＣ１６に結合したＭＳＬＮを、１００μｌのＴＭＢを１５分間添加した後、１００μｌの１Ｍ硫酸溶液を添加することで視覚化した。４５０～６３０ｎｍ（Gen5 software、BioTek）で吸光度を読み取っ
た。
ビン１のクローンＦＳ２８－０２４は、G1-AA/SS1のそれと類似したＭＵＣ１６－ＭＳ
ＬＮ相互作用の用量依存的な遮断を示した。ＦＳ２８－２５６は、陰性対照G1-AA/HelD1.3と類似したブロッキング活性を示さなかった。一方、ＦＳ２８－１８５はＭＵＣ１６の
ＭＳＬＮへの結合を促進した。これらの結果は、ＭＳＬＮの３つの異なる領域に結合したクローンがリガンドブロッキングアッセイにおいて、３つの異なる挙動を示した点で、実施例４．３．３におけるビニングデータと一致した。
結論として、結果は、ＭＳＬＮの３つの異なる領域（ビン）に結合するクローンパネルが選択されたことを示す。ＭＳＬＮの１つの領域に結合する抗体は、ＭＵＣ １６のＭＳＬＮへの結合を遮断するが、他の２つの領域に結合する抗体は遮断しない。
４．５ 特異性
抗体のパネルによって結合されたＭＳＬＮの異なる領域に照らして、ＭＳＬＮへの結合に対するそれらの特異性が試験された。ＦＳ２８－０２４、ＦＳ２８－１８５、及びＦＳ２８－２５６の特異性は、ＣＥＡＣＡＭ－５、Ｅ－カドヘリン、トロンボモジュリン及びＥｐＣＡＭなどの細胞接着に関与する他の分子への結合とＭＳＬＮへの結合を比較することにより、ＥＬＩＳＡによって試験された。
実施例４．３．１に記載されているのと類似のプロトコルを使用し、maxisorpプレートを１μｇ／ｍｌの組換えヒトMSLN-His-Avi、ヒトCEACAM-5-His-Fc（Sino Biological、1077-H03H）、ヒトＥ－カドヘリン（R&D systems、8505-EC）、ヒトトロンボモジュリン（Peprotech、100-58）又はヒトEpCAM-hFc（自社生産）でコーティングした。０．０２から
１０００ｎＭ（３倍希釈）の濃度範囲で試験された抗ＭＳＬＮｍＡｂの結合は、抗ヒトＦａｂ－ＨＲＰ（Sigma、A0293）を使用して検出された。ＦＳ２８－０２４、ＦＳ２８－１８５、ＦＳ２８－２５６はヒトMSLN-His-Aviに結合した（ＥＣ５０は０．５ｎＭあたり、最大結合シグナルは３）が、１０００ｎＭまで試験された細胞接着分子への結合は観察されなかった。予想通り、陽性対照抗体はそれぞれの標的に結合しした。したがって、抗ＭＳＬＮ抗体は高レベルの特異性を示した。
４．６ 細胞結合
選択された抗メソテリンｍＡｂ（ＦＳ２８－０２４、ＦＳ２８－１８５及びＦＳ２８－２５６）のパネルを、ヒト肺癌細胞株ＮＣＩ－Ｈ２２６の内因性細胞表面ＭＳＬＮへの結合について分析した。
簡単に説明すると、ＮＣＩ－Ｈ２２６細胞（ATCC CRL-5826）を、Accutase（Gibco、A11105-01）を使用してＴ１７５細胞培養フラスコから回収した。細胞を１２００ｒｐｍで
３分間遠心分離し、ＤＰＢＳ（Life Technologies、14190169）及び１％ＢＳＡ（Sigma-Aldrich、A7906）からなる氷冷ＦＡＣＳバッファーに２×１０６細胞／ｍｌで再懸濁し、
１ウェルあたり５０μｌを９６ウェルＶ底プレート（Costar、3894）に播種した。試験した全てのｍＡｂは、１２０μｌのＦＡＣＳバッファーで濃度範囲０．０１～２００ｎＭで希釈した（４倍希釈）。次に、ＮＣＩ－Ｈ２２６細胞を遠心分離し、上清を除去し、細胞を各ｍＡｂ希釈液１００μｌに再懸濁し、４℃で４５分間インキュベートした。細胞を１５０μｌのＦＡＣＳバッファーで遠心分離により２回洗浄し、ＦＡＣＳバッファーで１：１０００に希釈したヤギ抗ヒトＩｇＧ（γ鎖特異的）Ｆ（ａｂ’）２フラグメント－Ｒ－フィコエリトリン抗体（Sigma、P8047）を含有する１００μｌに再懸濁し、４℃で４５分間インキュベートした。細胞を１５０μｌのＦＡＣＳバッファーで１回、次に１５０μｌのＤＰＢＳで洗浄し、ＤＡＰＩ（Biotium、40043）含有の１５０μｌのＤＰＢＳに１：１０．０００で再懸濁し、BDCantoII又はiQue（Intellicyt）で読み取った。FlowJo v10を
使用してデータを分析し、各ウェルの生細胞のＰＥについてシグナル幾何平均を決定した。
ｍＡｂ２ＦＳ２８－０２４は、陽性対照G1-AA/SS1がしたように、ＮＣＩ－Ｈ２２６細
胞の細胞表面ＭＳＬＮに結合した。比較すると、ＦＳ２８－１８５及びＦＳ２８－２５６は細胞表面ＭＳＬＮへの結合が弱いことを示した。
ナイーブスクリーニング手順の概要
ナイーブファージライブラリの初期スクリーニングによって同定された１５６のｍＡｂから、最初に完全長、脱グリコシル化された組換えＭＳＬＮへの結合並びにｃｙｎｏＭＳＬＮへの結合能を確認した一連のスクリーニングアッセイに基づいて、３つの抗ヒトＭＳＬＮ ｍＡｂクローン（ＦＳ２８－０２４、ＦＳ２８－１８５及びＦＳ２８－２５６）を選択した。第２に、それらが結合したＭＳＬＮの領域（ビン）の多様性及びＭＵＣ１６遮断活性に基づいて、クローンをグループ化し、これらのグループ内から最も高い親和性結合体を選択した。得られたｍＡｂクローンＦＳ２８－０２４、ＦＳ２８－１８５、及びＦＳ２８－２５６のパネルは、ＭＳＬＮの３つの異なる領域に結合し、そのうちの１つ（ビン１、ＦＳ２８－０２４）は、インビトロでＭＵＣ１６のＭＳＬＮへの結合を遮断した。５つの抗ＭＳＬＮ抗体のパネルは、ＭＳＬＮへの特異的結合、組換え及び細胞表面ＭＳＬＮに対する異なる親和性を示し、以下の実施例５に記載されるように、さらなる特性評価及び／又は最適化のために選択された。
実施例５：ナイーブ抗ＭＳＬＮｍＡｂの親和性成熟及び配列最適化
５．１ ＮＮＫウォーク戦略を使用したクローンＦＳ２８－０２４の親和性成熟
ＦＳ２８－０２４はナノモル濃度以下の親和性でヒトＭＳＬＮに結合したが、ｃｙｎｏＭＳＬＮに対する親和性は約５倍低かった。ｃｙｎｏ ＭＳＬＮへの結合を改善するために、ＶＨ ＣＤＲ３領域の５つの残基に対するＮＮＫウォーク戦略が使用された。
ＦＳ２８－０２４ＶＨ及びＶＬの配列が最適化された。倹約的突然変異誘発ライブラリー（Parsimonious mutagenesis libraries）は、ＶＨ ＣＤＲ３のＲＡＴＬＦ残基（Kabat番号付け９５～９９）で１度に１つのアミノ酸残基を多様化することによって生成され
、合計５つの個別のライブラリーを得た。ライブラリーは、対象の位置にある全ての可能なアミノ酸を表すために、低冗長性ＮＮＫコドンを用いて作製された。ライブラリーを作製するために使用した。Quickchange Lightning Site‐Directed Mutagenesis Kit （Agilent、200518）のガイドラインに従って、順方向及び逆方向プライマーを設計した。各変異体は、ＨＥＫ２９３細胞で小規模に発現され、上清は、ヒト及びｃｙｎｏMSLN-His-Aviへの結合の保持又は改善について、BIAcoreによってスクリーニングされた。スクリーニ
ングされた８４のクローンのうち、結合を保持しているクローンはほとんどなく、それらの大部分はＴ９８残基の置換であった。４つのクローン、ＦＳ２８－０２４－０５１、ＦＳ２８－０２４－０５２、ＦＳ２８－０２４－０５３、及びＦＳ２８－０２４－０６０を再発現、精製し、ヒト及びｃｙｎｏＭＳＬＮに対する親和性を決定した。１つのクローン、ＦＳ２８‐０２４－０５３のみが単一Ｔ９８Ｖ変異（Kabat番号付け）により達成され
たｃｙｎｏ交差反応性の改善を示した。４つのクローンを全て、代替配列及び特性を提供し得るため先に進めた。
５．２ ＦＳ２８－１８５及びＦＳ２８－２５６の親和性成熟
ＦＳ２８－０２４と比較して、クローンＦＳ２８－１８５及びＦＳ２８－２５６は、組換えＭＳＬＮ及び細胞表面ＭＳＬＮの両方に対して弱い親和性を示したため、親和性成熟に供された。
ＶＨ及びＶＬ ＣＤＲ３領域は、ＮＮＫプライマーを使用して、５から６つのアミノ酸
の重複カセットをランダム化することにより、ｓｃＦｖ形式で並列に親和性成熟させた。ＦＳ２８－１８５についてランダム化された領域は、ＶＨＧ９５－Ｍ１００Ｆ及びＶＬＳ９１－Ａ９５であり、ＦＳ２８－２５６については、ＶＨＹ９５－Ｌ１００Ｂ及びＶＬＳ９１－Ｉ９６（Kabat番号付け）であった。ライブラリー生成前に、ＣＤＲ１及びＣＤＲ
３領域（ＦＳ２８－２５６ＶＬ ＣＤＲ３ライブラリーを除く）の可能性のあるメチオニン酸化及び脱アミド化部位で、倹約的突然変異誘発を実行した。ナイーブキャンペーンについて記載されているように、第１ラウンドで、２０ｎＭのビオチン化ヒトMSLN-His-Avi、第２ラウンドで２０又は２ｎＭのｃｙｎｏMSLN-His-Aviどちらかを使用し、２つのラウンドの選択を実行した。次いで、可溶性ｓｃＦｖ（一点濃度）を、卵巣癌細胞株ＯＶＣＡＲ－３（ATCC（登録商標）HTB-161（商標）への結合について試験した。ＯＶＣＡＲ－３
細胞を、StemPro Accustase（Gibco、A11105-01）を使用して回収し、１２００ｒｐｍで
３分間遠心分離し、ＦＡＣＳバッファー（２％ＢＳＡ含有ＤＰＳ）中に２ｘ１０６細胞／ｍｌで再懸濁した。１００μｌのＯＶＣＡＲ－３細胞を９６ウェルＶ底プレートに加えた。プレートを１２００ｒｐｍで３分間遠心分離し、バッファーを廃棄した。１５０μｌのｓｃＦｖを細胞に加え、４℃で１時間インキュベートした。親クローンＦＳ２８－１８５及び２５６のＳｃＦｖが対照として含まれていた。洗浄後、細胞を１００μｌのPenta His Alexa-Fluor 647（Qiagen、109-546-098）に再懸濁し、洗浄してから、Sytox Green Nucleic Acid Stain（Invitrogen S7020、１：１００００希釈）含有の１００μｌのＤＰＢＳに再懸濁した。サンプルはiQue（Intellicyt Corporation、IQue Plus）で実行され、
ＡＰＣの幾何平均が記録された。
ＦＳ２８－１８５及びＦＳ２８－２５６の両方で、ＯＶＣＡＲ－３細胞への結合が改善された親和性成熟クローンが同定された。細胞結合（８５０を超えるＭＦＩ）及び配列多様性に基づいて、１０個のクローンをＦＳ２８‐２５６ＶＨ ＣＤＲ３から、９個のクローンをＶＬ ＣＤＲ３選択から選択した。このアッセイで試験された３８個のＦＳ２８－１８５親和性成熟クローンのうち、１４個がＶＨ ＣＤＲ３選択から、１つがＶＬ ＣＤＲ３選択から選択された。選択されたクローンは、ｍＡｂ２二重特異性抗体形式でさらに特徴付けられた。
５．３ ｍＡｂ２に基づくＦＳ２８－１８５及びＦＳ２８－２５６の生成
抗ＭＳＬＮ結合体のさらなる特性評価のために、親クローンと同様に、ＦＳ２８‐０２４、ＦＳ２８‐１８５又は２５６の親和性成熟ＶＨ又はＶＬ領域をｍＡｂ２形式で産生した。得られたｍＡｂ２は、ＣＨ２ドメインにおけるＬＡＬＡ突然変異及び、ＣＨ３ドメインにおけるヒトＣＤ１３７受容体結合部位含有ＦＳ２８－０２４、ＦＳ２８－１８５又はＦＳ２８－２５６クローンのＣＤＲ、又はそれらに由来する親和性成熟変異体を含むＩｇＧ１抗体である。得られたｍＡｂ２分子の重鎖及び軽鎖配列は、以下の配列番号で示される。
FS22-172-003-AA/FS28-024ｍＡｂ２：配列番号９４及び８５
FS22-172-003-AA/FS28-024-051ｍＡｂ２：配列番号９８及び８５
FS22-172-003-AA/FS28-024-052ｍＡｂ２：配列番号１０２及び８５
FS22-172-003-AA/FS28-024-053ｍＡｂ２：配列番号１０６及び８５
FS22-172-003-AA/FS28-024-060ｍＡｂ２：配列番号１０８及び８５
FS22-172-003-AA/FS28-026ｍＡｂ２：２７０配列番号１０９及び８７
FS22-172-003-AA/FS28-091ｍＡｂ２：配列番号１１０及び８８
FS22-172-003-AA/FS28-185ｍＡｂ２：配列番号１１１及び８９
FS22-172-003-AA/FS28-256ｍＡｂ２：配列番号１１４及び１１６
FS22-172-003-AA/FS28-256-001ｍＡｂ２：配列番号１２０及び８２
FS22-172-003-AA/FS28-256-005ｍＡｂ２：配列番号１２０及び８３
FS22-172-003-AA/FS28-256-012ｍＡｂ２：配列番号１２５及び１１６
FS22-172-003-AA/FS28-256-014ｍＡｂ２：配列番号１２９及び１１６
FS22-172-003-AA/FS28-256-018ｍＡｂ２：配列番号１３３及び１１６
FS22-172-003-AA/FS28-256-021ｍＡｂ２：配列番号１２５及び８２
FS22-172-003-AA/FS28-256-023ｍＡｂ２：配列番号１３３及び８２
FS22-172-003-AA/FS28-256-024ｍＡｂ２：配列番号１２５及び８３
FS22-172-003-AA/FS28-256-026ｍＡｂ２：配列番号１３３及び８３
FS22-172-003-AA/FS28-256-027ｍＡｂ２：配列番号１２５及び８４
FS22-172-003-AA/FS28-256-271ｍＡｂ２：３及び８４
FS22-172-003-AA/FS28-256-272ｍＡｂ２：１５８及び８４
FS22-172-003-AA/FS28-256-273mAb２:１６３及び８４
これらのｍＡｂ２を、ＨＥＫ２９３－６Ｅ細胞において、一過性の発現によって産生し、ここで示されたのは、ｍＡｂ Select SuReプロテインＡカラムを使用して精製された。
５．４ ＦＳ２８－２５６親和性成熟クローンの配列最適化
全てのＦＳ２８‐２５６系統クローンは、ＶＨ ＣＤＲ２（ＩＭＧＴ番号付けＮ５５－Ｘ－Ｓ５７、ここでＸは任意の残基である）に潜在的Ｎ‐結合グリコシル化部位を含んでいた。クローンＦＳ２８－２５６－０２７の４つの変異体は、ＶＨ ＣＤＲ２のＮ５５をアラニン、ヒスチジン、セリン、及びスレオニンに置換することによって得た。これらのクローンは、それぞれFS28-256-271、FS28-256-272、FS28-256-273、及びFS28-256-274と命名された。それらのクローンを固定化及び溶液中のＭＳＬＮへの結合についてＳＰＲにより特徴付けした。表５にＳＰＲの結果を示す。FS28-256-274は固定化されたＭＳＬＮに対して、他のクローンよりもはるかに弱い親和性を有し、従って進行しなかった。FS28-256-272及びＦＳFS28-256-273は、可溶性ＭＳＬＮとより強く、又は固定化されたＭＳＬＮと類似の強度で結合した。その結果、それらの両クローンの細胞表面に発現されたＭＳＬＮへの結合は、可溶性ＭＳＬＮの存在によって影響を受ける可能性が高い。対照的に、FS28-256-271は、固定化されたＭＳＬＮに対して最も強い結合及び可溶性ＭＳＬＮに対してより弱い結合を有し、そのため、それはＭＳＬＮの溶液中よりも固定化されたＭＳＬＮを優先的に標的とした。
Ｆｃａｂ及びｍＡｂの選択及びスクリーニングの概要
以前の実施例で同定された抗ＣＤ１３７ Ｆｃａｂは、タンパク質Ｌ（実施例２）などの外部架橋剤のいずれかによって架橋された場合に、ＮＦ－κＢレポーターアッセイにお
いてアゴニスト活性を有することが示された。同定された抗ヒトＣＤ１３７ Ｆｃａｂのパネルのうち、このクローンが最も好ましい機能的及び生物物理的特性を示すことから、ＭＳＬＮ標的化ＦａｂとのペアリングのためにＦＳ２２‐１７２‐００３が選択された。
このＣＤ１３７駆動アゴニスト活性を腫瘍微小環境に局在化させるために、腫瘍関連抗原であるメソテリン（ＭＳＬＮ）を特異的に標的とするＦａｂとｍＡｂ２形式のＦｃａｂをペアリングすることが決定された。腫瘍細胞でのＭＳＬＮの発現は、ｍＡｂ２の架橋をもたらし、そのためにＦｃａｂがＣＤ１３７に結合する場合に、アゴニスト活性を誘導することができるだろうと予想されるため、これは有益であってもよい。
先の実施例で同定したように、ＭＳＬＮの異なる領域に結合し、可溶性メソテリンよりも固定化されたＭＳＬＮに優先的に結合するＭＳＬＮ結合Ｆａｂのパネルを選択した。
実施例６：ｍＡｂ２標的ＣＤ１３７及びメソテリン（ＭＳＬＮ）の産生
抗ＣＤ１３７ ＦｃａｂＦＳ ２２－１７２－００３を含むＩｇＧ１分子からなるCD137/MSLNｍＡｂ２、及び抗ＭＳＬＮＦａｂのパネル（表６に列挙）を産生し、ｍＡｂ２形式でのペアリングの特性評価を可能にした。それらは、ＭＳＬＮ結合抗体のＣＨ３ドメインの対応する領域に対して、ＡＢ、ＣＤ及びＥＦループを含むＣＨ３ドメインＦｃａｂの一部を置換することによって調製された。これらのCD137/MSLNｍＡｂ２は、ＣＨ２ドメイン（ＡＡ）においてＬＡＬＡ変異を含んでいた。ｍＡｂ２のアイソタイプは、ヒトＩｇＧ１であり、これは結合する細胞に対してＡＤＣＣを誘導することができる。CD137/MSLNｍＡｂ２がＣＤ１３７を発現する免疫細胞に結合するため、ＬＡＬＡ変異を含めることによって、免疫細胞に対するＡＤＣＣを誘導するｍＡｂ２の可能性を低減することを決定した。さらに、エフェクター細胞上のＦｃγ受容体は、インビボで抗体の架橋を誘導することが知られているが、これは非効率的であり、治療対象部位から離れた場所で起こり得る。臨床におけるＣＤ１３７抗体は用量制限毒性と関連しているので、ＣＤ１３７／ＭＳＬＮｍＡｂ２がＭＳＬＮと結合して架橋することを介してのみアゴニスト活性を発揮するように、ＬＡＬＡ変異を含めることが決定された。全てのｍＡｂ２及び対照抗体は、ＨＥＫ２９３－６Ｅ細胞における一過性発現によって産生され、ｍＡｂSelect SureプロテインＡカ
ラムを用いて精製された。次に、ｍＡｂ２をＳＥＣ－ＨＰＬＣによって純度について評価し、分子の単量体割合が９８％を超えることを確認した。
実施例７：CD137/MSLNｍＡｂ２の特性評価
ＣＤ１３７及びＭＳＬＮに対するＣＤ１３７／ＭＳＬＮｍＡｂ２の結合強度は、BIAcore装置を使用して、表面プラズモン共鳴により、同様に、内因性にＭＳＬＮを発現する関
連細胞株上でフローサイトメトリーによる細胞表面ＭＳＬＮへの結合を試験した。膜結合したＭＳＬＮの選択的スプライシング又は腫瘍壊死因子－ａ変換酵素（ＴＡＣＥ）によって生成されたＭＳＬＮの可溶性形態がＭＳＬＮ陽性の癌患者の血清中に見られるので、これが療法用抗体のデコイとして作用し得ると仮定されている（Lee et al.,2018）。ｍＡ
ｂ２の結合特性及び結合活性、特に可溶性及び固定化されたＭＳＬＮへの結合親和性の違いを調査した。これは、２つの方法で設定されたBIAcore結合実験で測定された。最初に
、細胞表面に存在する抗原と結合するｍＡｂ２の動態プロファイルを再現するために、組換え抗原をＳＰＲチップ上に中程度の密度で固定し、続いてｍＡｂ２を様々な濃度（実施例７．１を参照）で注入した。次に、細胞表面に結合したMSLNへのmAb２結合に対する循
環可溶性MSLNに起因する潜在的シンク効果をシミュレートするために、mAb２をチップ上
に捕捉し、組換え抗原を様々な濃度（実施例7.2を参照）で流した。さらに、ＭＳＬＮ陽
性患者血清（Onda et al.,2006、10.1158/1078-0432.CCR-05-1477）に典型的に見られる
代表的なレベルで添加した可溶性組換えＭＳＬＮの効果も、細胞表面に発現したＭＳＬＮへの結合試験及びＣＤ８＋Ｔ細胞アッセイで徹底的に調べた。
７．１ 結合活性条件下でのヒトＭＳＬＮへのＣＤ１３７／ＭＳＬＮｍＡｂ２の結合－抗原捕捉法
BIAcoreチップ上に固定化されたＭＳＬＮに対する全てのｍＡｂ２の結合を試験して、
抗体が強く結合することを可能にするために高濃度の固定化抗原が利用可能な結合活性条
件下で、ヒトＭＳＬＮへの結合親和性を決定した。ＣＭ５チップ（GE Healthcare BR-1005-30）を、製造元の指示に従って、約１００ＲＵでhMSLN-His-Aviでコーティングした。
表６に記載されているCD137/MSLNｍＡｂ２のパネル、及び対照抗体G1-AA/HelD1.3及びG1-AA/SS1（Hassan et al.2002）は、３００ｎＭから始まる３倍希釈系列の濃度範囲で、流
速７０μｌ／分で注入された。会合時間は５分であり、解離時間は１０分であった。泳動用バッファーはＨＢＳ－ＥＰ（GE Healthcare BR100188）であった。ｐＨ１．５の塩化グリシンを流速３０μｌ／分で３０秒間注入することにより、フローセルを再生した。意図的にブランクのままにしたフローセル（抗原コーティングなし）に対して、二重参照によりデータを分析した。結合速度論を、１：１ラングミュアモデルに適合させて、結合会合（ｋａ）及び解離（ｋｄ）速度を生成した。平衡結合定数（ＫＤ）を、解離速度を各サンプルの会合速度で割ることによって計算した。データ分析は、BiaEvaluationソフトウェ
アバージョン３．２を使用して実行された。結果を表７に示す。
ＦＳ２８－１８５及びＦＳ２８－２５６親ＭＳＬＮＦａｂアーム含有FS22-172-003-AA/FS28-185及びFS22-172-003-AA/FS28-256ｍＡｂ２は、３６から５０ｎＭの間の結合親和性を示した。それ以外では、ＦＳ２８－２５６の親和性成熟子孫含有の全てのｍＡｂ２は、１０ｎＭ未満のＭＳＬＮ結合親和性（ＫＤ）を示した。実際、ナノモル濃度以下のＫＤは、系統ＦＳ２８－０２４からＭＳＬＮＦａｂアーム含有ｍＡｂ２について決定した。
ｍＡｂ２FS22-172-003-AA/FS28-256-271について、ｃｙｎｏ交差反応性は、定常状態の動態解析を使用したＳＰＲによって決定した。ＣＭ５チップ（GE Healthcare BR-1005-30）を、製造元の指示に従って、約５０ＲＵでhMSLN-His-Avi又はcMSLN-His-Aviでコーティングした。ｍＡｂ ２ を、２４３ｎＭから始まる３倍希釈系列の濃度範囲で、流速１０μｌ／分で注入した。定常状態までの会合時間は１０００秒で、解離時間は３０秒であった。泳動用バッファーはＨＢＳ－ＥＰ（GE Healthcare BR100188）であった。ｐＨ１．５の塩化グリシンを流速３０μｌ／分で３０秒間注入することにより、フローセルを再生した。意図的にブランクのままにしたフローセル（抗原コーティングなし）に対して、二重参照によりデータを分析した。定常状態親和性モデルは、BiaEvaluationソフトウェアバージ
ョン３．２を使用して、動態データを分析するために使用された。ｃＭＳＬＮ－Ａｖｉ－Ｈｉｓへの結合は、ｈＭＳＬＮ－Ａｖｉ－Ｈｉｓへの結合の３倍以内であった。
７．２ 可溶性ヒトＭＳＬＮに対するCD137/MSLNｍＡｂ２の結合－抗体捕捉法
表７に記載されたCD137/MSLNｍＡｂ２並びに対照抗体G1-AA/HelD1.3及びG1-AA/SS1は、ＳＰＲによってヒトＭＳＬＮ及びカニクイザルＭＳＬＮへの結合についての試験もして、そこで抗体を捕捉して溶液中のＭＳＬＮに対しての結合を評価した（溶液中のＫＤ）。タンパク質Ｇ（GE Healthcare 29179315）を使用して、約１００ＲＵでｍＡｂ又はｍＡｂ２サンプルを捕捉し、その後、hMSLN-His-Avi又はcMSLN-His-Aviを、１０００ｎＭで開始する３倍希釈系列の濃度範囲で、流速７０μｌ／分で注入した。会合時間は５分であり、解離時間は５分であった。泳動用バッファーはＨＢＳ－ＥＰ（GE Healthcare BR100188）であった。ｐＨ２．１の塩化グリシンを流速３０μｌ／分で１５秒間注入することにより、フローセルを再生した。実施例７．１に記載のようにデータを分析した。結果を表７に示す。抗体捕捉法から、ｍＡｂ２の大部分は結合親和性を顕著に低下させ、固定化されたＭＳＬＮ対可溶性ＭＳＬＮに対する異なる結合を有する結合活性抗ＭＳＬＮ抗体を生成するために実施したスクリーニング戦略を支持した。可溶性ＭＳＬＮの結合に対するＫＤ値が、最高のｍＡｂ２FS22-172-003-AA/FS28-024-060に対して４．２７ｎＭ、及び最低の親和性を有したｍＡｂ２FS22-172-003-AA/FS28-256に対して１．２μＭの間であった。
試験された全てのｍＡｂ２は、ｍＡｂ２FS22-172-003-AA/FS28-024-060を除いて、ヒトＭＳＬＮとの親和性の１０倍以内でｃｙｎｏ交差反応性を示したが、これはヒトＭＳＬＮと比較して、５４倍少ない交差反応性を示したため、それ以上の追求は行わなかった。
全てのｍＡｂ２のＭＳＬＮ結合Ｆａｂアームの親和性（ＫＤで測定するとして）は、抗原捕捉（固定化されたＭＳＬＮ）及び抗体捕捉（溶液中のＭＳＬＮ）法の両方により確認されている。溶液中ＫＤ値対固定化ＫＤ値は、各抗体で異なった。これらのＫＤ値から比を計算し、その結合が可溶性ＭＳＬＮ（表７）の存在によって変化するかどうかに関してのその挙動の各ｍＡｂ２に対する指標を与えた。理論に拘束されることを望むものではないが、ｍＡｂ２が効率的に架橋できるようにするために、克服する必要がある結合親和性の閾値があると仮定するが、固定化されたＭＳＬＮ対溶液ＭＳＬＮへの結合親和性の違いは、シェッドＭＳＬＮ駆動のシンク効果によって、どのようにこの機能が影響を受け得るかに関して、重要な役割を果たす。
７．３ ＣＤ１３７に対するBiacore結合：ｍＡｂ２形式における保持された結合親和性
ＭＳＬＮに対する結合強度に加えて、ヒトＣＤ１３７に対するＣＤ１３７ ＦｃａｂのＫＤはまた、新しいＦａｂと対になった場合、Ｆｃａｂの結合特性が保持されることを証明するために試験した。Biacore CM5チップをHuman Fab Capture Kit （GE Healthcare 28958325）を使用し、製造者の条件に従って、抗ヒトＦａｂでコーティングし、表面密度
を約９０００ＲＵとした。FS22-172-003-AA/FS28-024-052及びFS22-172-003-AA/FS28-256-271のサンプルを約１００ＲＵまで捕捉し、その後、ヒトＣＤ１３７抗原（ｈＣＤ１３７－ｍＦｃ－Ａｖｉ）を８１ｎＭで開始する３倍希釈系列の濃度範囲で流速７０μｌ／分で流した。会合時間は５分であり、解離時間は５分であった。泳動用バッファーはＨＢＳ－ＥＰであった。ｐＨ２．１の１０ｍＭ塩化グリシンを流速３０μｌ／分で３０秒間２回繰り返し注入をすることにより、フローセルを再生した。データ分析は、以前の実施例で記載したように実行した（例えば、実施例７．１参照）。表８の結果は、同様のＦｃａｂであるが、異なるＦａｂを含有するｍＡｂ２間のＣＤ１３７に対する一貫した親和性を示す。抗ＣＤ１３７ Ｆｃａｂは、結合活性結合相互作用を介して、単量体ＣＤ１３７よりも二量体又は多量体ＣＤ１３７に優先的に結合するように選択された。この結合活性作用機序は、ＣＤ１３７をはるかに低いレベルで発現する他の細胞よりも、活性化Ｔ細胞などのアップレギュレーションされたＣＤ１３７発現を有する細胞を優先的に標的化するのに有益であると仮定される。これは、毒性などの望ましくない影響をもたらす可能性のある腫瘍外Ｔ細胞活性化を最小限にするのに有益であってもよい。さらに、Ｆｃａｂは、ＣＤ１３７に結合することによってだけではアゴニスト作用を誘導することができないように、架橋された場合にのみ活性を有するように設計された。これらのCD137/MSLNｍＡｂ２との関連で、分子の両方の特異性の動的作用モードは、ｍＡｂ２が腫瘍細胞上に高レベルで発現するアップレギュレーションされたＭＳＬＮに優先的に結合し、続いてアップレギュレーションされたＣＤ１３７発現を伴う活性化Ｔ細胞に結合する結果となってもよいと考えられる。分子のＦｃａｂドメインの結合動態のために、ｍＡｂ２分子が最初にＴ細胞上のＣＤ１３７に結合する場合、ＭＳＬＮ媒介架橋の欠如は、Ｔ細胞アゴニスト作用が誘発されないことを確実にする。
７．４ 細胞表面に発現されたＭＳＬＮに対する結合及び可溶性ＭＳＬＮによる干渉
細胞表面ＭＳＬＮへの結合を確認するために、ヒト肺癌細胞株ＮＣＩ－Ｈ２２６の内因性細胞表面ＭＳＬＮへの結合について表９に列挙されたｍＡｂ２を分析した。加えて、ＭＳＬＮは血中で、シェッド可溶性形態で見出され得るので、この循環ＭＳＬＮは、我々のmAb２の曝露及び最終的には効力に影響を与え得る危険性がある。可溶性ＭＳＬＮの存在
が最小限の影響を与えることを確認するために、悪性中皮腫及び肺癌患者を、ＭＳＬＮ陽性と定義するための診断的価値があることが判明した可溶性ＭＳＬＮの１０～２０倍のレベルである２０ｎＭの可溶性ＭＳＬＮ（Cui et al.,2014）の存在下で、ＮＣＩ－Ｈ２２
６細胞への追加の結合実験を実行した。簡単に説明すると、ＮＣＩ－Ｈ２２６細胞（ATCC
CRL-5826）を、Accutase（Gibco、A11105-01）を使用してＴ１７５細胞培養フラスコか
ら回収した。可溶性ＭＳＬＮで補足する際に抗体調製プロトコルをわずかに変更した：抗体を２ｘの最終濃度を得るために、９６ウェルＶ底プレートで、ＦＡＣＳバッファー中で希釈し、次いで、各ウェルから６０μｌを、ＦＡＣＳバッファー単独又は、６０μｌの４０ｎＭ組換えhMSLN-His（R&D systems、3265-MS-050）（最終濃度２０ｎＭのｈＭＳＬＮ
を与える）を含有するＦＡＣＳバッファーのいずれかに添加し、１００μｌを細胞に添加する前に、室温で１時間プレインキュベートした。
いずれの場合も、細胞を１２００ｒｐｍで３分間遠心分離し、ＤＰＢＳ（Life Technol
ogies、14190169）及び１％ ＢＳＡ（Sigma-Aldrich、A7906）からなる氷冷ＦＡＣＳバ
ッファーに２ｘ１０６細胞／ｍｌで再懸濁し、ウェル当たり５０μｌを９６ウェルＶ底プレート（Costar、3894）に播種した。試験された全ての抗体を、１２０μｌのＦＡＣＳバッファーで濃度範囲０．０１～２００ｎＭ（４倍希釈液）で希釈した。次に、ＮＣＩ－Ｈ２２６細胞を遠心分離し、上清を除去し、細胞を各ｍＡｂ希釈液１００μｌに再懸濁し、４℃で４５分間インキュベートした。細胞を１５０μｌのＦＡＣＳバッファーで遠心分離により２回洗浄し、ＦＡＣＳバッファーで１：１０００に希釈したヤギ抗ヒトＩｇＧ（γ鎖特異的）Ｆ（ａｂ’）２フラグメント－Ｒ－フィコエリトリン抗体（Sigma、P8047）を含有する１００μｌに再懸濁し、４℃で４５分間インキュベートした。細胞を１５０μｌのＦＡＣＳバッファーで１回、次に１５０μｌのＤＰＢＳで洗浄し、ＤＡＰＩ（Biotium
、40043）含有の１５０μｌのＤＰＢＳに１：１０．０００で再懸濁し、BDCantoII又はiQue（Intellicyt）で読み取った。FlowJo v10を使用してデータを分析し、各ウェルの生細胞のPEについてシグナル幾何平均を決定した。
表９の細胞結合の結果によれば、内因性に発現している細胞株ＮＣＩ－Ｈ２２６上の細胞表面ＭＳＬＮへの結合は、ＥＣ５０値が０．３から４７ｎＭを超える範囲で全てのｍＡｂ２について確認された。細胞結合親和性に対する可溶性組換えＭＳＬＮの存在の影響は、一般的に低く、ほとんどのクローンで観察されたＥＣ５０においてわずかな（３倍未満）増加であった。
FS22-172-003-AA/FS28-256は、可溶性ＭＳＬＮの存在下及び非存在下で、試験した他のクローンの大部分よりもＥＣ５０が高く、親ＦＳ２８－２５６抗体の結合が弱いことを示唆する。ただし、この親抗体の親和性成熟変異体は、より強い結合を示した。特に、FS28-256-001、FS28-256-005、FS28-256-012、FS28-256-014、FS28-256-018、FS28-256-023、FS28-256-024及びFS28-256-026などのＦＳ２８－２５６由来クローン含有ｍＡｂ２の細胞結合親和性は親よりもはるかに優れており、可溶性ＭＳＬＮの存在による影響を受けなかった。これは、過剰の可溶性ＭＳＬＮの存在下でも、ほとんどのｍＡｂ２が膜結合型のＭＳＬＮに優先的に結合したことを示す。FS28-024-060及びFS28-256-027含有ｍＡｂ２は、可溶性ＭＳＬＮの存在下で細胞に結合する場合、最も影響を受け、溶液中のＭＳＬＮに対してより高い親和性結合体がシェッドＭＳＬＮの存在によって影響を受ける可能性が高いことを示唆する。親ＦＳ２８－１８５クローン（すなわちFS22-172-003-AA/FS28-185）含有ｍＡｂ２も、高いＥＣ５０値を有し、可溶性の組換えＭＳＬＮの存在下及び非存在下で弱い結合を示した。親クローンの親和性成熟変異体も試験した。可溶性ＭＳＬＮの非存在下での結合の改善は、ｍＡｂ２においてこれらの親和性成熟クローンについて観察された。
７．５ 広範囲の内因性メソテリン発現レベルを有するｍＡｂ２結合細胞株
ある範囲のＭＳＬＮ細胞密度を発現する細胞に結合する抗ＭＳＬＮＦａｂクローンFS28-256-271の能力を実証するために、以下のヒト癌細胞を使用した実施例７．３に記載されたものと類似の細胞結合フローサイトメトリーアッセイでｍＡｂ２を試験した：NCI-H226[H226]（ATCC（登録商標）CRL-5826）、OVCAR-3[OVCAR3]（ATCC（登録商標）HTB-161）、及びAsPC-1[AsPC-1]（ATCC（登録商標）CRL-1682（商標））。実施例２に記載されたＭＳＬＮ陰性細胞株ＨＥＫ．ＦＲＴも陰性対照として使用した。各細胞株におけるＭＳＬＮの相対的発現を決定するために、抗体結合能（ＡＢＣ）を、製造元が推奨するプロトコル（Quantum（商標）Simply Cellular（登録商標）#816 Bangs Labs）に従って使用した。細
胞株を、試験した細胞の中で最も高いＭＳＬＮを有するＨ２２６（ABC 315,478）、中レ
ベルを有するＯＶＣＡＲ３（ABC 103,444）、低レベルを有するＡｓＰＣ－１（ABC 20,999）をＭＳＬＮ発現レベルの順にランク付けした。
細胞結合アッセイの結果を表１０に示す。発現レベルに関しては、FS28-256-271は、試験した細胞株の中で最も高いＭＳＬＮ発現を示すＨ２２６に強く結合する。ｍＡｂ２は、ＯＶＣＡＲ－３及びＡｓＰＣ－１細胞に対して同等の結合を有する。予想通り、FS28-256-271はＭＳＬＮを発現する細胞に選択的に結合するが、陰性のＨＥＫ．ＦＲＴ細胞株には結合しない。その結果、ＣＤ１３７／ＭＳＬＮｍＡｂ２は、膜ＭＳＬＮ発現をある範囲で発現する細胞に作用する可能性を有するだろう。
実施例８：CD137/MSLNｍＡｂ２の機能的活性
内在性レベルのＭＳＬＮを有する細胞株がCD137/MSLNｍＡｂ２を架橋し、ＣＤ１３７アゴニスト作用及びその後のＴ細胞活性化をもたらすことを実証するために、ＩＬ－２又はＴＮＦγサイトカイン放出がこのアッセイのエンドポイントとして使用される細胞傷害性ＣＤ８＋Ｔ細胞アッセイが開発された。実施例７に記載のＮＣＩ－Ｈ２２６、ＯＶＣＡＲ－３、ＡｓＰＣ－１及びＨＥＫ．ＦＲＴは、このＴ細胞アッセイにおいて、CD137/MSLNｍＡｂ２を試験するために使用された。
Ｔ細胞を単離するために、血小板提供の副産物である白血球枯渇錐体から末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を単離した。簡単に説明すると、白血球錐体の内容物をＰＢＳで洗い流し、フィコール（Sigma-Aldrich、1440-02）勾配に重ねた。ＰＢＭＣを遠心分離により分離し、フィコール勾配を通過しなかった細胞を回収した。ＰＢＭＣをさらにＰＢＳで洗浄し、残りの赤血球を、製造元の指示に従って１０ｍｌ １Ｘの赤血球溶解バッファー（eBioscience、00-4300-54）の添加により溶解した。ＣＤ８＋Ｔ細胞を、ＣＤ８＋Ｔ細胞単離
キットＩＩ（Miltenyi Biotec Ltd、130-096-495）を製造業者の指示に従って使用して、溶出液中に存在するＰＢＭＣから単離した。
抗ＣＤ３抗体とのインキュベーションは、Ｔ細胞の初期活性化を促進するための最初のシグナルとして使用された。９６ウェル平底組織培養プレートを、ＰＢＳ中の８μｇ／ｍｌ抗ＣＤ３抗体（クローンＵＣＨＴ１、R&D Systems、MAB100-SP）で、４℃で一晩コーティングした。次にプレートを２００μｌのＰＢＳで３回洗浄した。
８．１ ＭＳＬＮ架橋にＮＣＩ－Ｈ２２６を使用したＣＤ８＋Ｔ細胞アッセイ
次に、細胞傷害性ＣＤ８＋Ｔ細胞を上記のようにＰＢＭＣから単離した。ＮＣＩ－Ｈ２２６細胞を２×１０４細胞／ウェルで、抗ＣＤ３抗体（８μｇ／ｍｌ）でコーティングした９６ウェル平底プレート上に１００μｌのＴ細胞培養培地（１０％ＦＢＳ（Life Technologies）、１Ｘペニシリンストレプトマイシン（Life Technologies、15140122）、１ｍＭピルビン酸ナトリウム（Gibco、11360-070）、１０ｍＭヘペス（Sigma-Aldrich、H0887
）、２ｍＭＬ－グルタミン（Sigma-Aldrich、G7513）及び５０μＭ ２－メルカプトエタノール（Gibco,M6250）を含むＲＰＭＩ培地（Life Technologies、61870-044））でプレ
ーティングした。４時間のインキュベーション後に細胞を接着した後、全てのＴ細胞培養培地を除去し、Ｔ細胞を４．０×１０５細胞／ｍｌの濃度で含有する５０μｌのＴ細胞培養培地で置換し、２．０×１０４細胞／ウェルを得た。ｍＡｂ２を、６０ｎＭで開始する２倍の最終濃度でＴ細胞培地中に希釈し、１：３又は１：７の段階希釈を実行した。５０μｌのｍＡｂ２滴定を２００μｌの総アッセイ体積及び１倍の抗体濃度のために細胞に添加した。このアッセイで試験された分子の詳細は表１１に提供され、各アッセイでは、G1-AA/20H4.9を陽性対照として使用した（データは示さず）。
このアッセイを、３７℃、５％ＣＯ２で７２時間インキュベートした。上清を収集し、Meso Scale DiscoveryのV-PLEX IL-2キット（K151QQD-4）を使用して、製造元の指示に従ってアッセイした。ヒトＩＬ－２（ｈＩＬ－２）の濃度を抗体の対数濃度に対してプロットし、得られた曲線をGraphPad Prismの対数（アゴニスト）対応答式を使用して適合させた。
表１１は、アッセイの異なる反復を横切るＴ細胞活性化アッセイにおいて観察されたＩＬ－２放出のＥＣ５０値及び最大応答を示す。実施されたアッセイの数のために、複数のドナーからのＴ細胞を使用した。いずれの場合も、各アッセイで陽性対照と陰性対照を使用して、アッセイとドナー間で一貫したデータセットを確保した。陽性対照の抗ヒトＣＤ１３７抗体である２０Ｈ４．９は、０．５ｎＭのＥＣ５０でｈＩＬ－２放出の増加を示す。オフターゲットＣＤ１３７媒介性Ｔ細胞アゴニスト作用の欠如は、上記と同様であるが、ＭＳＬＮ陽性ＮＣＩ－Ｈ２２６の代わりにＭＳＬＮ細胞を発現するように形質導入されなかったＨＥＫ－ＦＲＴを使用した、ＣＤ８＋Ｔ細胞アッセイで確認された。臨床で他の一部のＣＤ１３７分子において観察される用量制限毒性の事例のため、特にＣＤ１３７抗体では、オフターゲット活性化の回避が非常に望ましく、したがって、この要因を使用して、選択したｍＡｂ２の組み合わせを決定した。以下のｍＡｂ２は、ＩＬ－２放出の増加を示し、それぞれがナノモル濃度以下のＥＣ５０を示した：FS22-172-003-AA/FS28-024-051、FS22-172-003-AA/FS28-024-052、FS22-172-003-AA/FS28-024-053、FS22-172-003-AA/FS28-024-060、FS22-172-003-AA/FS28-256-021、FS22-172-003-AA/FS28-256-023、FS22-172-003-AA/FS28-256-026、FS22-172-003-AA/FS28-256-027。図１は、Ｔ細胞活性化アッセイについてＩＬ－２放出の代表的なプロットを示す。これらの結果は、ＦＳ２８－１８５系統（図１Ｂ）のＦａｂを含むｍＡｂ２がこの特定のアッセイで機能的活性を示さなかったことを示唆している。驚いたことに、FS28-185系統のＦａｂと対になっている全てのｍＡｂ２は、非常に制限され低減したＩＬ－２放出を示すか、全く示さなかった。これは、その系統のＦａｂはＭＳＬＮに結合できる一方、ＭＳＬＮのこの特定の領域への結合は、このアッセイでＭＳＬＮ架橋の効力が高まるような方法でCD137/MSLN mAb２を架橋できないようであることを示唆している。系統FS28-024（図１Ａ）のＦａｂ、並びに系統FS28-256（図１Ｃ）のFS28-256-021、FS28-256-023、FS28-256-023、FS28-256-026、及びFS28-256-027のFabを含む全てのｍＡｂ２は、ナノモル濃度以下のＥＣ５０でｈＩＬ－２放出の
増加を示す。
可溶性ＭＳＬＮの存在下でＮＣＩ－Ｈ２２６を使用したＣＤ８＋Ｔ細胞アッセイ
上記のＣＤ８＋Ｔ細胞機能アッセイは、２０ｍＭ濃度のｈＭＳＬＮ－Ｈｉｓの存在下で反復され、これは、悪性中皮腫及び肺癌患者を、ＭＳＬＮ陽性と定義するための診断的価値があることが判明した可溶性ＭＳＬＮの１０～２０倍のレベルである（Cui et al., 2014）。
図２は、可溶性ＭＳＬＮの存在下又は非存在下におけるｍＡｂ２のサブセットの活性を示す。予想通り、可溶性ＭＳＬＮは、可溶性ＭＳＬＮに対して固定化されたＭＳＬＮに優先的に結合するＦａｂと対になったｍＡｂ2の効力を変化させない。具体的には、ＭＳＬ
Ｎ Ｆａｂ FS28-024-051、FS28-024-052、FS28-024-053、FS28-256-021、及びFS28-256-023を含むｍＡｂ２は、２０ｎＭまでの可溶性ＭＳＬＮの存在による影響を受けず、これは、実施例７．１及び７．２に記載の親和性及び細胞結合データと一致している。
興味深いことに、ｍＡｂ２ FS22-172-003-AA/FS28-256-027は、ＥＣ５０の有意なシフトを生じる２０ｎＭの可溶性ＭＳＬＮと共にインキュベートした場合に効力の最大の損失
を示した。これは、FS28-256-027が固定化されたＭＳＬＮと可溶性ＭＳＬＮの両方に対して高い親和性を示した実施例７．１及び７．２の親和性の結果と一致しており、可溶性ＭＳＬＮへの高い親和性は望ましくないという理論をサポートしている。結果は、膜ＭＳＬＮに優先的に結合するクローンが可溶性ＭＳＬＮの存在によって妨害されにくいという前述の仮説と一致している。これに関連して、クローンFS28-256-027は、固定化されたＭＳＬＮと溶液中のＭＳＬＮの両方への高親和性結合を示し、ｍＡｂ２ FS22-172-003-AA/FS28-256-027での機能的データは、２０ｎＭのｓＭＳＬＮで処置された場合のＥＣ５０の有意なシフトを明らかにする。ＭＳＬＮ Ｆａｂ FS28-024-051、FS28-024-052、FS28-024-053、FS28-256-021、及びFS28-256-023を含む残りのｍＡｂ２は、２０ｎＭまでの存在下で影響を受けず、これは、上記の親和性及び細胞結合データと一致している。
８．２ 架橋にＯＶＣＡＲ－３を使用したＣＤ８＋Ｔ細胞アッセイ
メソテリン陽性の癌は広範囲の発現レベルを有するため、細胞表面のＭＳＬＮ密度が低い細胞を使用して、実施例８．１でナノモル濃度以下の効力を有すると同定されたいくつかのｍＡｂ2の機能を評価することが望ましい。これを達成するために、上記の実施例８
．１に記載されているようにＴ細胞活性化アッセイを実施したが、今回はＯＶＣＡＲ－３細胞株（ATCC（登録商標）ＨＴＢ－１６１）を使用した。これらは、ＮＣＩ－Ｈ２２６細胞よりも低レベルのＭＳＬＮを内因的に発現するＭＳＬＮ陽性卵巣癌細胞である。実施例８．１に記載のものと同じプロトコルに従い、次の変更を加えた：細胞のサイズ及び形態の違いのため、ＯＶＣＡＲ－３細胞を１００μｌのＴ細胞培養培地中、抗ＣＤ３抗体でコーティングされた（８μｇ／ｍｌ）９６ウェル平底プレート上にウェル当たり１×１０４細胞で播種した。４時間のインキュベーション後に細胞を接着した後、全てのＴ細胞培養培地を除去し、Ｔ細胞を８．０×１０５細胞／ｍｌの濃度で含有する５０μｌのＴ細胞培養培地で置換し、４．０×１０４細胞／ウェルを得た。結果は、ＯＶＣＡＲ－３細胞と架橋した場合にＩＬ－２放出を駆動する全ての試験済みのｍＡｂ２の能力を確認する（図３を参照）。これらのデータは、これらのｍＡｂ２が異なる腫瘍細胞株にわたる広範囲のＭＳＬＮ密度にわたって機能する可能性があることを示唆している。ＨｅｌＤ１．３モックｍＡｂ２形式（FS22-172-003/HelD1.3）のＦｃａｂ FS22-172-003も、ＭＳＬＮに結合しないため、このアッセイで試験され、ＩＬ－２放出の欠如は、Ｆａｂアーム（この場合はＭＳＬＮ）を介して架橋された場合にのみ、抗ヒトＣＤ１３７ Ｆｃａｂが機能的であることを示した。
８．３ 配列最適化ＦＳ２８－２５６親和性成熟クローンの機能的スクリーニング
実施例８．２に記載のFS28-256系統の抗ＭＳＬＮ Ｆａｂを含む全てのｍＡｂ２は、実施例５．４に記載されているように除去されたＶＨ ＣＤＲ２の潜在的なＮ結合型グリコシル化部位を含有する。次の置換を有する３つのｍＡｂ２変異体が産生された：ＩＭＧＴの命名法に従って、それぞれアミノ酸置換Ｎ５５Ａ、Ｎ５５Ｈ、又はＨ５５Ｓを含む、FS22-172-003-AA/FS28-256-271、FS22-172-003-AA/FS28-256-272、及びFS22-172-003-AA/FS28-256-273。これらの配列最適化ｍＡｂ２の効力を実証するために、ＣＤ８＋Ｔ細胞活性化アッセイを、実施例８．１に記載されているようにＭＳＬＮ＋ＮＣＩ－Ｈ２２６細胞との共培養で実施した。ｍＡｂ２は、可溶性ＭＳＬＮの存在下でも試験された。
図４及び表１２は、これらのｍＡｂ２の効力、及び分子の全体的な効力に対する可溶性ＭＳＬＮの影響を示す。mAb2 FS22-172-003-AA/FS28-256-271は、試験した３つのｍＡｂ
２のうち、最小の効力の減少を示した。実施例８．１及び７．２に記載のデータと一致して、溶液中のＭＳＬＮと比較して、固定化されたＭＳＬＮにより高い親和性で結合するＭＳＬＮ Ｆａｂは、可溶性ＭＳＬＮの存在による影響が少なかった。ｍＡｂ２ FS22-172-003-AA/FS28-256-271は、可溶性ＭＳＬＮの非存在下と比較して、可溶性ＭＳＬＮの存在下でのＥＣ５０の最小の変化を示し、ＥＣ５０の３倍の減少が観察された。実施例７．１で報告された親和性測定と一致して、このｍＡｂ２は、溶液中のＭＳＬＮと比較して固定化されたＭＳＬＮに対してより強い親和性を示した。また、実施例７．１と一致して、ｍＡｂ２ FS22-172-003-AA/FS28-256-272及びFS22-172-003-AA/FS28-256-273は、より強い親和性で溶液中のＭＳＬＮに結合し、これは、図４に示すように、可溶性ＭＳＬＮが存在しない場合と比較した、可溶性ＭＳＬＮの存在下でこのアッセイにおけるこれらのクローンのＥＣ５０への大きな影響に変換された。したがって、mAb2 FS22-172-003-AA/FS28-256-271がさらなる特性評価のために選択された。
８．４ 広範囲のＭＳＬＮレベルを発現する内因性細胞株及び複数のＰＢＭＣドナーにわたる発現依存性CD137/MSLN mAb2の効力
実施例８．１及び８．２で言及したように、癌患者は不均一なレベルのＭＳＬＮを発現する。したがって、様々なレベルのＭＳＬＮを発現する細胞の範囲にわたってFS22-172-003-AA/FS28-256-271 mAb2の効力を決定することが望ましい。ＣＤ８＋Ｔ細胞アッセイは
、実施例８．１及び８．２に記載されているように実施した。７２時間後のＩＬ－２測定に加え、９６時間後にV-PLEXヒトＩＦＮγＭＳＤキット（Meso Scale Discovery、K151QOD-4）を製造元の指示に従って使用してＩＦＮγ産生も測定した。
表１３に報告されている全てのアッセイにおいて、ｍＡｂ２ FS22-172-003-AA/FS28-256-271は、ＩＬ－２（７２時間）及びＩＦＮγ（９６時間）の産生に対するナノモル濃度以下の効力によって証明されるように、異なるレベルのＭＳＬＮを発現する細胞によって架橋されると強力なＴ細胞活性化を誘導できた（表１３を参照）。興味深いことに、ＩＬ－２及びＩＦＮγの産生は、例えば、低レベルのＭＳＬＮを発現する細胞（ＡｓＰＣ－１）と架橋した場合、架橋細胞に存在するＭＳＬＮの量と共に減少した。この減少は、ＩＬ－２産生と比較してＩＦＮγを測定した場合にはそれほど顕著ではなかったが、全ての場合において、ｍＡｂ２はナノモル濃度以下（subnanomoalar）の効力を示した。さらに、
ｍＡｂ２をＭＳＬＮ陰性ＨＥＫ．ＦＲＴ細胞との共培養で試験した場合、サイトカイン産生の欠如から証明されるように、ｍＡｂ２はアゴニスト活性を誘発しなかった。全体として、これらの結果は、ｍＡｂ２が低レベルのＭＳＬＮでもＴ細胞活性化を誘導できること、及びｍＡｂ２によって誘導されるＴ細胞活性化のレベルが、ｍＡｂ２を架橋するために存在するＭＳＬＮのレベルに依存することを示唆しており、したがって、ｍＡｂ２の効力が細胞上のＭＳＬＮ発現密度と相関していることを示す。
実施例９：抗マウスＣＤ１３７ Ｆｃａｂの産生
インビボでマウス及びヒトのＣＤ１３７配列間の配列相同性が低いことから、インビボのマウスモデルにおいて試験する定常ドメインにＣＤ１３７抗原結合領域を含有するｍＡｂ２の活性を可能にするために、マウスＣＤ１３７に特異的に結合するＦｃａｂを生成し、特性評価した。
９．１ 抗マウスＣＤ１３７ Ｆｃａｂのナイーブ選択
ヒトＣＤ１３７に結合するＦｃａｂを選択するために、ヒトＣＤ１３７に結合するＦｃａｂの選択について前述したものと同様に、酵母ディスプレイ選択キャンペーンを採用した（実施例２．１を参照）。組換えマウス二量体を抗原として使用した（実施例１を参照）。
ヒトＣＤ１３７に結合するＦｃａｂの選択に以前に使用されたヒトＩｇＧ１のＣＨ１からＣＨ３ドメインを表示する４つのナイーブ酵母ライブラリーを、マウスＣＤ１３７に結合するＦｃａｂの選択に使用した。抗マウスＣＤ１３７バインダーを同定するために、合計５３回の別個のラウンドの選択が実施された。インハウスで産生した組換え二量体ビオチン化マウスＣＤ１３７（mCD137-mFc-Avi）抗原を使用して、酵母ナイーブライブラリーからバインダーを選択した。
９．２ ナイーブ選択からの抗マウスＣＤ１３７ Ｆｃａｂ特性評価
マウスＣＤ１３７に対する抗マウスＣＤ１３７ Ｆｃａｂの特異性は、ＨｅｌＤ１．３「モック」ｍＡｂ２形式で試験し、Ｆｃａｂの他のマウスＴＮＦＲＳＦ受容体（ＣＤ４０、ＯＸ４０、ＧＩＴＲ）への結合を試験することにより、Octet QKeシステムのＢＬＩに
よって測定した。１０ｎｇ／μｌのマウスＣＤ４０、ＧＩＴＲ、ＯＸ４０受容体をコーティングするためのストレプトアビジンバイオセンサー（PALL ForteBio 18-5021）（全てR&D Systemsから入手し、Thermoscientific #21328のEZ-Link Sulfo-NHS-SS-Biotinキットを使用してビオチン化した）。モックｍＡｂ２形式の抗マウスＣＤ１３７ Ｆｃａｂは、少なくとも１μＭの最終濃度まで、動的バッファー（PALL 18-1092）で１：１に希釈した。抗原でコーティングされたセンサーをｍＡｂ２溶液に１８０秒間浸した後、１×動的バッファーに１８０秒間浸した。各ＴＮＦＲＳＦ受容体の抗体を陽性対照として使用した。ＦｃａｂクローンFS22m-055、FS22m-063、FS22m-066、FS22m-075、FS22m-135、FS22m-055、FS22m-063、FS22m-066は、試験したＴＮＦＲＳＦ受容体のいずれにも結合せず、したがって、そのマウスＣＤ１３７に対する特異性を示した。
マウスＣＤ１３７配列を発現するHEK.FRT.luc細胞（配列番号１５０）は、実施例２．
３で前述したものと同じ方法に従って産生された。前に選択された抗マウスＣＤ１３７ Ｆｃａｂを含有するｍＡｂ２は、実施例２．３に記載された方法に従って、この細胞株、HEK.FRT.luc.mCD137を使用してスクリーニングした。５６のｍＡｂ２が試験され、そのうち２９がＮＦ－κＢ活性につき陽性であった。ＬＡＬＡ変異を有するヒトＩｇＧ１ Ｆｃ（G1AA/Lob12.3）を含有するＬｏｂ１２．３を、陽性対照抗マウスＣＤ１３７ ｍＡｂとして使用し、発光の増加を示し、アッセイの有効性を確認した。ＬＡＬＡ変異を有するヒトＩｇＧ１ Ｆｃも含有するＨｅｌＤ１．３を、陰性対照ヒトＩｇＧアイソタイプとして使用して、このアッセイにおけるヒトＩｇＧモックＦａｂからの干渉を除外した。可能な場合、ＥＣ５０を計算し、活性においてプラトーに達しなかったｍＡｂ２は、古典的なＳ字状の活性動態を示したｍＡｂ２の有利になるよう無視された。ｍＡｂ２は、プロテインＬ架橋時の活性のＥＣ５０及び倍率変化の順にランク付けした。FS22m-063は、架橋時に
最高のＥＣ５０（１．４４ｎＭ）を有し、架橋時に活性の倍率変化が最も大きい（２７倍）ことに基づいて選択された。
実施例１０：抗マウスＭＳＬＮ抗体の選択及び特性評価
１０．１ 抗マウスＭＳＬＮ ｍＡｂのナイーブ選択
マウスとヒトのＭＳＬＮ間のアミノ酸同一性は低い（６０％）。マウスにおけるインビボの概念証明（ＰｏＣ）研究を可能にするために、本発明者らは、実施例４及び５に記載の抗ヒトＭＳＬＮ ｍＡｂと同様の特性を有する抗マウスＭＳＬＮ ｍＡｂを単離することに着手した。
ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３（MSM Technologies）でランダム化されたヒトＩｇＧ１生殖細胞系列のＦａｂドメインを表示する合成ナイーブファージミドライブラリを使用したファージ選択を、セクション１．２に記載されるようなビオチン化マウスＭＳＬＮ－Ｈｉｓ－Ａｖｉ（配列番号１４３、セクション１．１を参照）による選択に使用した。減少濃度のビオチン化ｍＭＳＬＮ－Ｈｉｓ－Ａｖｉで４ラウンドの選択を実施し、抗ヒトＭ
ＳＬＮ選択と同様に、後続のキャンペーンでエピトープマスキング戦略を実施した。さらに、組換え抗原を使用した第１ラウンドの後、ＨＥＫ２９３－ｍＭＳＬＮ細胞が生成され、ラウンド２、３、及び４で使用された。
簡単に説明すると、マウスＭＳＬＮ（配列番号１４５）配列をコードするｃＤＮＡは、pcDNA5/FRT/TOベクター（Life Technologies、V652020）にサブクローニングされ、次に
、Ｆｌｐリコンビナーゼ発現プラスミドｐＯＧ４４（Life Technologies、V600520）で、Flp-In TREx 293細胞株（Life Technologies、R78007）に同時トランスフェクトされた。細胞を、１０％ＦＢＳ、１００μｇ／ｍｌハイグロマイシンＢ（Melford Laboratories Ltd、Z2475）及び１５μｇ／ｍｌブラストサイジン（Melford Laboratories Ltd、B1105）を含有するDMEMで、安定的に形質転換された細胞のコロニーが形成されるまで３～４週間増殖させた。これらのコロニーを１μｇ／ｍｌのドキシサイクリン（Sigma Aldrich、D9891）の存在下で増幅し、抗マウスＭＳＬＮ（LS Bio、LS-C179484）を使用してＭＳＬＮの発現について試験した。
濃縮された集団からの合計４７の個々のｍＡｂを抗原結合についてスクリーニングし、４５の固有の陽性結合剤をサブクローニングし、実施例１．３で前述したようにＩｇＧ１
ＬＡＬＡ形式の可溶性ｍＡｂとして発現させた。ｍＡｂは、ＥＬＩＳＡによって固定化されたｍＭＳＬＮ－Ｈｉｓ－Ａｖｉへの特異的結合について特徴付けられ、Biacore分析
を使用した動態実験において、約５０又は２００ＲＵの固定化されたｍＭＳＬＮ－Ｈｉｓ－Ａｖｉへの親和性に基づいてランク付けされた。これにより、１から２５ｎＭの範囲の親和性を有する、FS28m-228を含むｍＡｂのパネルが特定された。さらに、セクション２
．１．３に記載されるように、ＭＳＬＮの異なる領域への結合を試験した。MOR6626クロ
ーン（国際公開第２００９／０６８２０４ Ａ１号）のＶＨ及びＶＬをクローニングすることによって生成されたマウス交差反応性ｍＡｂ G1-AA/MOR6626を陽性対照として使用
した。FS28m-228を含む大半のクローンは、すでにMOR6626に結合しているＭＳＬＮに結合できなかった一方、FS28-194又はFS28-261などの他のクローンは、それぞれ部分的又は完全な結合を示した。このように、異なる領域（ビン）に結合するクローンが単離された。
概要：抗マウスＦｃａｂ及びｍＡｂの選択及びスクリーニング
以前の実施例で同定された抗マウスＣＤ１３７ Ｆｃａｂは、タンパク質Ｌ（実施例９）などの外部架橋剤のいずれかによって架橋された場合に、ＮＦ－κＢレポーターアッセイにおいてアゴニスト活性を有することが示された。同定された抗ヒトＣＤ１３７ Ｆｃａｂのパネルのうち、このクローンが最も好ましい機能的及び生物物理的特性を示すことから、マウスＭＳＬＮ標的ＦａｂとのペアリングのためにFS22m-066が選択された。
ファージ選択及び抗体スクリーニング戦略により、ある範囲の親和性を有し、ｍＭＳＬＮの異なる領域に結合する抗マウスメソテリン結合クローンのパネルが特定された。抗ヒトＭＳＬＮバインダーと同様に、クローンは可溶性ｍＭＳＬＮよりも固定化されたｍＭＳＬＮへの結合に有利な結合特性を示し、マウスのインビボでのＰｏＣ研究において、研究に適した分子となった。
実施例１１：抗マウスCD137/MSLN mAb2の産生
実施例１０に記載されているように、ナイーブ抗マウスＭＳＬＮ抗体のパネルが発見され、有益な結合及び標的化特性についてスクリーニングされた。実施例９に記載のように、抗マウスＣＤ１３７ Ｆｃａｂを選択した。抗マウスＣＤ１３７ Ｆａｂ（FS22m-063
）及び抗マウスＭＳＬＮ Ｆａｂ（FS28m-228及びFS28m-228-010）を使用して、同系マウス腫瘍モデルにおけるＭＳＬＮ標的化ＣＤ１３７アゴニスト作用の完全なインビトロ特性評価及びインビボ概念証明のためにマウスｍＡｂ２を生成した。Ｆａｂは、結合親和性、結合活性、及び機能的活性の間の関係を調査するために選択された。重鎖のＣＨ２領域に
ＬＡＬＡ変異を有するｍＡｂ２は、Ｆｃガンマ受容体駆動性の架橋及びエフェクター機能の寄与を最小限に抑えることを目的として、実施例６に記載のように構築され、識別子FS22m-063-AA/FS28m-228（配列番号１３６（軽鎖）、１３７（重鎖））、及びFS22m-063-AA/FS28m-228-010（それぞれ、配列番号１３６（軽鎖）及び１６６（重鎖））が付された。ｍＡｂ２をＨＥＫ２９３－６Ｅ細胞中で一過性発現によって産生し、mAb Select Sureプ
ロテインＡカラムを使用して精製した。
１１．１ 結合速度論
抗ヒトＭＳＬＮバインダーと同様に、固定化されたＭＳＬＮ及び可溶性ＭＳＬＮへの結合に対するｍＡｂ２の親和性は、Biacore装置を使用したＳＰＲによって試験された。
固定化されたに結合するための手順は、５０ＲＵで固定化されたｍＭＳＬＮ－Ｈｉｓ－Ａｖｉを用いた実施例７．１及び７．２に記載の方法と同様であった。可溶性ＭＳＬＮの親和性を決定するために、ｍＡｂ２を、抗ヒトＦｃを介して捕捉した。簡単に説明すると、２５μｇ／ｍｌの抗ヒトＩｇＧ（Ｆｃ）抗体（GE Healthcare、Human Antibody Capture Kit、BR100839）を、BiacoreセンサーチップＣＭ５（GE Healthcare、BR100530）上に
固定化し、およそ７５０ＲＵの最終応答を達成した。ＨＢＳ－ＥＰバッファー（GE Healthcare、BR100188）で５０ｎＭに希釈したｍＡｂ２分子を、３０μｌ／分で個別に注入し
、約１００ＲＵの応答を達成した。HBS-EPバッファーで希釈した組換えｍＭＳＬＮ－Ｈｉｓ－Ａｖｉ抗原を、２４３ｎＭから０．１１ｎＭの濃度範囲で３倍希釈して、７０μｌ／ｍｉｎで５分間注入し、次に、バッファー中で５分間解離させた。再生は、３Ｍ塩化マグネシウム（GE Healthcare、Human Antibody Capture Kit、BR100839）を３０μｌ／分の
速度で３０秒間注入することによって達成された。
速度論的データを表１４に示す。FS22m-063-AA/FS28m-228-010は、おそらく結合活性の結合相互作用の強化により、可溶性シェッドＭＳＬＮよりも膜結合ＭＳＬＮに対しより強い結合を示した。親和性成熟ｍＡｂ２ FS22m-063-AA/FS28m-228-010は、固定化されたＭＳＬＮ及び溶液中のＭＳＬＮの両方への結合の改善を示した。ＭＳＬＮを血中に循環させることによるシンク効果を回避するのに有益であると考えられる、固定化されたＭＳＬＮに優先的に結合するため、FS28m-228-010が選択された。このクローンは、ヒトＦａｂ FS28-256-271と同様に、固定化されたＭＳＬＮを１桁のナノモル濃度範囲で結合し、溶液
中のＭＳＬＮよりも固定化されたＭＳＬＮを優先的に標的化した。
１１．２ マウスＭＳＬＮ陽性細胞を使用したマウスCD137/MSLN mAb2の機能的活性
活性化細胞傷害性ＣＤ８＋Ｔ細胞は、癌細胞を直接殺傷するのに関与し、それらの細胞表面にＣＤ１３７を発現する（Ye et al.,2014）。ＣＤ１３７のクラスター化は、下流のシグナル伝達及びさらなるＣＤ８＋Ｔ細胞の活性化の誘導に不可欠であることが知られている。したがって、ＣＤ８＋Ｔ細胞活性化アッセイを使用して、ｍＡｂ２がＣＤ１３７のクラスター化及び下流シグナル伝達を駆動する能力を評価した。ＣＤ８＋Ｔ細胞の活性化
は、オバルブミンペプチド２５７－２６４に特異的なＴ細胞受容体を有するＣ５７ ＢＬ／６－Ｔｇ（ＴｃｒａＴｃｒｂ）１１００Ｍｊｂ／Ｃｒｌ ＯＴ－Ｉマウス（Jackson Laboratory、カタログ番号００３８３１）から単離された遺伝子改変ＯＴ－１Ｔ細胞の抗原刺激によって達成され、ＩＦＮγの放出によって決定された。
Ｔ細胞を単離するために、脾臓細胞を新鮮なＯＴ－１マウス脾臓から単離した。簡単に説明すると、Ｃ５７ＢＬ／６ ＯＴ－１マウスの各脾臓を収集し、ＰＢＳに保存した後、６ウェル組織培養プレートのウェルに移し、２本の針で機械的に破砕した。破砕した脾臓を７０μｍの細胞ストレーナーに通し、ストレーナーをＰＢＳですすいだ。次に、細胞懸濁液を遠心分離によってペレット化し、上清を除去し、赤血球を製造元の指示に従って１０ｍｌの１×赤血球溶解緩衝液（eBioscience、00-4300-54）の添加により溶解した。脾
細胞を、Ｔ細胞活性化のために、ウェルあたり２×１０６細胞で、ウェルあたり１０×１０６細胞で６ウェルプレートにプレーティングした１０ｎＭのSIINFEKLペプチドを含有する培地（ＩＭＤＭ、５％ＦＣＳ、５０μＭ ２－メルカプトエタノール、１×Penstrep）にプレーティングした。プレートは、５％ＣＯ２と共に３７℃で４８時間インキュベートした。４８時間後、ＣＤ８Ｔ細胞を、製造元の指示に従って、CD8+T cell Isolation Kit（Milentyi Biotec、130-104-075）を用いて単離した。単離及び活性化されたＣＤ８Ｔ細胞を、３０Ｕ／ｍｌ ＩＬ－２（Peprotech、AF-200-02）を補充した培地（ＩＭＤＭ、５％ＦＣＳ、５０μＭ ２－メルカプトエタノール、１×Penstrep）にプレーティングし、さらに３日間、毎日各分割でｍｌあたり１×１０６未満に維持した。３日間の拡大培養後、細胞を次のアッセイで使用した。
この実施例で使用されているＣＤ８＋Ｔ細胞は、２匹の別個の動物に由来し、脾細胞の拡大培養は１８ヶ月間隔で行われたため、検体ＡとＢの間でＴ細胞の活性化における変動が予想される。
全長マウスメソテリン（配列番号１４５）を発現するＣＴ２６結腸癌細胞（ATCC、CRL-2638）は、膜結合立体構造で抗原を提示するように産生された。ｐｃＤＮＡ３．１ベクター（＋）（Thermo Fisher Scientific、カタログ番号V79020）を使用してこれらの細胞を生成するために、Lipofection（Lipofectamine 3000、Thermo Fisher Scientific、カタ
ログ番号L3000008）を使用した。製造元のプロトコルに従って、ＣＴ２６細胞にマウスＭＳＬＮ ｃＤＮＡを含有するｐｃＤＮＡ３．１ベクターをトランスフェクトした。その後、完全培地（ＲＰＭＩ、１０％ＦＢＳ）中、選択抗生物質（６００μｇ／ｍｌ）としてジェネテシンを使用して、安定したトランスフェクションを達成した。
ＣＴ２６細胞でのマウスＭＳＬＮの発現は、陽性対照抗体MOR6626を使用したフローサ
イトメトリーによって確認された。細胞を陽性対照抗体と１時間インキュベートした後、蛍光標識した抗ヒトＩｇＧ検出抗体（Stratech Scientific Ltd、カタログ番号109-546-098-JIR）を使用して細胞結合を検出した。クローン集団を拡大培養し、続いて同じフローサイトメトリー手順を使用して相対的な発現レベルを決定するために分析し、その後、異なるレベルでマウスＭＳＬＮを発現する２つのクローンを抗マウスＭＳＬＮ Ｆａｂ：ＣＴ２６．Ｂ２（高ＭＳＬＮ発現）及びＣＴ２６．Ｇ１０（中／低ＭＳＬＮ発現）を研究するためのツールとして進めた。一連のＭＳＬＮ発現を有する細胞を提供するために、ＭＳＬＮを内因的に発現するＰａｎｃ０２細胞ＮＩＣ／ＮＩＨ（Maryland、USA）も使用した
。これらの細胞は、インビトロ及びエクスビボでより低いレベルのＭＳＬＮを発現し、ＩＨＣによって決定される細胞質ゾル発現を示した（データは示さず）。メソテリン発現は、その後、ＩＨＣによってエクスビボでも確認された（データは示さず）
ＣＴ２６．Ｂ２、ＣＴ２６．Ｇ１０、及びＰａｎｃ０２細胞を、ＳＩＩＮＦＥＫＬペプチド（５００ｎＭ）とインキュベートし、５０μｌの培地中、ウェルあたり２×１０４の
ＯＴ－１細胞をＭＳＬＮ＋細胞に添加した。試験抗体は、６０ｎＭ（最終濃度の４倍）から開始する１：４滴定で調製し、５０μｌの抗体ミックスを各ウェルに添加し、それに応じて最終アッセイ量を２００μｌにした。このアッセイを、３日間、５％ＣＯ２と共に３７℃でインキュベートした。３日後、上清を回収し、ｍＩＦＮγ（eBioscience、カタロ
グ番号88-7314-88）につき製造元の指示に従ってＥＬＩＳＡを実施した。
このＴ細胞アッセイでは、可溶性マウスＭＳＬＮの非存在下及び存在下で、マウスCD137/MSLN mAb2をスクリーニングした。市販のマウスmMSLN-His Biolegend（#594008）、Ｃ
Ｔ２６．Ｇ１０腫瘍を保有するマウスの血清分析により、血中のＭＳＬＮ濃度の中央値は１００ｐＭであると決定された（データは示さず）。したがって、可溶性ＭＳＬＮとの干渉を研究するために、最大２ｎＭを機能アッセイで使用した。
表１５及び図５に示すように、ｍＡｂ２ FS22m-063-AA/FS28m-228-010は、ＣＴ２６．Ｇ１０細胞株によって架橋された場合、親のFS22m-063-AA/FS28m-228よりも高い効力を示した。以下の陰性対照も１つのアッセイで試験されたが、予想通り、サイトカインの読み取りを生じなかった：モックｍＡｂ２形式のFS22m-063 Fcab（HelD1.3）、及びＭＳＬＮ
標的化陽性対照（G1/MOR6626）。図５に示すように、２ｎＭの可溶性ＭＳＬＮの存在は、最小限のＩＦＮγ放出への影響を有し、全てのＥＣ５０値は、操作されたＭＳＬＮ＋ ＣＴ２６細胞よりも膜ＭＳＬＮの発現が少ないＰａｎｃ０２細胞を除いて、低ピコモル濃度範囲にあった。ヒトｍＡｂ２と同様に、ｍＡｂ２によって誘導されるＴ細胞活性化のレベルは、架橋細胞に存在するＭＳＬＮのレベルに依存する。
実施例１２：インビボでの概念証明
ｍＡｂ２は、Ｔ細胞アッセイにおいて機能を有することが示され、同系免疫応答性腫瘍モデルにおいてインビボでのｍＡｂ２ FS22m-063-AA/FS28m-228の機能を試験することが望ましかった。
１２．１ ＣＴ２６．Ｂ２同系腫瘍モデルにおけるインビボでのFS22m-063-AA/FS28m-228の有効性
高ＭＳＬＮ発現腫瘍モデルにおけるFS22m-063-AA/FS28m-228の抗腫瘍効果を決定するために、９～１０週齢のＢａｌｂ／Ｃ雌マウス（Charles River）は、試験開始前の１週間
順応させた。全ての動物は、マイクロチップを付けられ、固有の識別子が与えられた。各コホートには１５匹又は２０匹のマウスがいた。ＣＴ２６．Ｂ２細胞を拡大培養し、細胞バンクを生成し、次に、ＩＭＰＡＣＴ Ｉプロトコルを使用して、病原体について、IDEXX Bioresearchによって事前スクリーニングし、病原体がないことが示された。各動物は
、左脇腹に１００μｌの無血清培地中の１×１０５細胞の皮下注射を受けた。腫瘍細胞接種後の１７日目に、腫瘍を有しないマウスは試験から除外された。
FS22m-063-AA/FS28-228 mAb2（配列番号３６０及び３６１）又はヒトＩｇＧ１アイソタ
イプ対照（G1-AA/4420）に、ＤＰＢＳ＋１ｍＭアルギニン＋０．０５％Ｔｗｅｅｎ ８０で、２００μｌの抗体を１用量あたり２００μｇの固定濃度（２０ｇマウスでおよそ１０ｍｇ／ｋｇ）で注射した。ｍＡｂ２分子は、接種後１７、１９、及び２１日目に腹腔内注射することによりマウスに投与した一方、対照ヒトＩｇＧ１抗体は、接種後７、９、及び１１日目にマウスに投与した。腫瘍体積の測定は、カリパスを使用して週３回行われ、腫瘍の最長軸及び最短軸の最長軸及び最短軸を決定した。次の計算式を使用して、腫瘍体積を計算した。
ＬＸ（Ｓ２）／２
（ここで、Ｌ＝最長軸、Ｓ＝最短軸）
研究のエンドポイントは、腫瘍の体積及び状態に基づいた人道的なエンドポイントによって決定された。
図６に示すように、FS22m-063-AA/FS28m-228 mAb2による処置は、アイソタイプ対照（G1/4420）で処置されたマウスと比較して、腫瘍増殖の視覚的な遅延を示した。
エンドポイントまでの時間（生存）分析は、GraphPad Prism 8.0ソフトウェアを使用して実行された。図７及び表１５に示すデータは、対数順位（Mantel-Cox）検定を使用して分析された。データは、対数順位分析により、FS22m-063-AA/FS28m-228 mAb2がアイソタ
イプ対照（G1/4420）と比較して有意な延命効果を誘発することを示した。ＩｇＧ１対照
群の生存期間中央値は３３．５日であったが、FS22m-063-AA/FS28m-228の生存期間中央値には達しなかった。
１２．２ ＣＴ２６．Ｇ１０同系腫瘍モデルにおけるインビボでのFS22m-063-AA/FS28m-228の有効性
FS22m-063-AA/FS28m-228 mAb2の有効性は、ＣＴ２６．Ｇ１０同系腫瘍モデルでも試験
された。ＣＴ２６．Ｇ１０細胞は、ＣＴ２６．Ｂ２細胞と比較して低レベルのＭＳＬＮを発現する。ＣＴ２６．Ｇ１０細胞株を使用してマウスに接種したこと以外は、実施例１２．１に記載したのと同じ手順に従った。マウスには、接種後１２、１４、及び１６日目にFS22m-063-AA/FS28m-228 mAb2、及び／又は接種後７、９、及び１１日目にG1/4420対照抗体を、２００μｌの腹腔内注射で投与した。マウスに２００μｇ／匹の固定用量を投与した（２０ｇマウスでおよそ１０ｍｇ／ｋｇに相当）。
図８に示すように、FS22m-063-AA/FS28m-228 mAb2で処置したマウスは、アイソタイプ
対照で処置したマウスと比較して腫瘍増殖の低下を示し、FS22m-063-AA/FS28m-228処置マウスでは、G1/4420処置群と比較して、腫瘍体積の増加に顕著な遅延が観察された。さら
に、マウスの１／２０（５％）は、G1/4420による処置後に腫瘍がなかったのに対し、マ
ウスの４／２０（２０％）は、FS22m-063-AA/FS28m-228による処置後、研究終了時に腫瘍
がなかった。さらに、図９及び表１６に示すように、これは、対数順位対分析を使用して評価した場合、腫瘍のない生存率の有意な改善に変換された。具体的には、生存期間中央値は、FS22m-063-AA/FS28m-228で、２５日（G1/4420）から２９日に増加した。
ｍＡｂ２及びアイソタイプ対照にはＬＡＬＡ変異が含まれており、ＬＡＬＡ変異により抗体がＦｃγ受容体に結合する能力が大幅に低下したため、観察された腫瘍増殖阻害はＡＤＣＣ活性の結果ではなかった可能性がある。したがって、ＬＡＬＡ変異を含む抗ＭＳＬＮ ｍＡｂのみで処置されたマウスでは抗腫瘍活性は見られないと想定される。しかし、ＬＡＬＡ変異を含むｍＡｂ２は、ＬＡＬＡ変異が存在する場合でも、有意な腫瘍増殖阻害が可能であった。これは、細胞表面のＭＳＬＮに結合するＦａｂアームによるｍＡｂ２の架橋が、免疫細胞上のＣＤ１３７のクラスター化及び活性化を駆動し、ｍＡｂ２の抗腫瘍活性が得られるためと考えられる。
実施例１３：インビボでの親和性成熟抗マウスCD137/MSLN（FS22m-063-AA/FS28m-228-010）mAb2の特性評価
１３．１ ＣＴ２６．Ｇ１０同系マウス腫瘍モデルにおける親和性成熟CD137/MSLN mAb2
の用量応答活性
FS22m-063-AA/FS28m-228 mAb2で処置した場合、高レベルのマウスＭＳＬＮ（ＣＴ２６
．Ｂ２）を発現する同系腫瘍モデル、及び低レベルのマウスＭＳＬＮ（ＣＴ２６．Ｇ１０）を発現する腫瘍において、有意な抗腫瘍効果及び生存率の改善が観察された（実施例１２）。したがって、親和性成熟FS22m-063-AA/FS28m-228-010の抗腫瘍効果を、ある範囲の用量（６、２０、６０、及び２００μｇ／マウス、２０ｇマウスでおよそ０．３、１、３及び１０ｍｇ／ｋｇに相当）で、インビボで調査することが望ましい。
９～１１週齢及び体重１７．０～２５．２ｇの各Ｂａｌｂ／ｃ雌マウス（Charles River）は、試験開始前の１週間順応させた。全ての動物は、マイクロチップを付けられ、固
有の識別子が与えられた。各コホートには２０匹のマウスがいた。実施例１１．２に記載のＣＴ２６．Ｇ１０結腸癌細胞株を拡大培養し、細胞バンクを生成した。各動物は、左脇腹に１００μｌの無血清培地中の１×１０５細胞の皮下注射を受けた。腫瘍細胞接種後の１２日目に、腫瘍を有しないマウスは試験から除外された。
FS22m-063-AA/FS28m-228-010 mAb2を調製し、上記の用量範囲に従って固定された最終
濃度でマウスに腹腔内（ＩＰ）注射した。ヒトＩｇＧ１アイソタイプ対照（G1-AA/4420）及び抗ＣＤ１３７陽性対照抗体Ｌｏｂ１２．３（G1/Lob12.3）は、両方ヒトＩｇＧ１骨格で、ＬＡＬＡを含み、２０μｇ（２０ｇマウスで約１ｍｇ／ｋｇ）の用量で含まれた。全ての抗体は、ＤＰＢＳ＋１ｍＭアルギニン＋０．０５％Ｔｗｅｅｎ８０で調製した。各マ
ウスは、腫瘍接種後１２日目、１４日目及び１６日目に２００μｌのＩＰ注射により、ｍＡｂ２分子又は対照抗体を投与された。実施例１２．１に記載されているようにカリパスを使用して腫瘍体積測定を週に３回行い、マウスを綿密に監視した。研究のエンドポイントは、腫瘍の体積及び状態に基づいた人道的なエンドポイントによって決定された。
STATA/IC 15.1ソフトウェアを使用して、腫瘍増殖速度の分析のための混合モデルを実
行した。統計的有意性は、全ての群を比較した混合モデル分析を使用した研究の全時間にわたる増殖速度につき対で示された。対象となる処置の各ペアに個別のモデルを適合させた。このモデルは、次の通りである。
ｌｏｇ１０（体積）＝Ａ＋Ｂ×（日数－開始日）＋ε
ＡとＢは、それぞれ切片及び傾きである。それらはマウスごとに異なり、群に対する固定効果及び動物に対する変量効果が含まれる。
Ａ＝Ａ０＋Ａ１Ｔ＋εＡ
Ｂ＝Ｂ０＋Ｂ１Ｔ＋εＢ
Ｔは、一方の群に値０、もう一方の群に１の値を持つ処置群を表すダミー変数である。変量効果は正規分布で分布する。
εＡ～（０、σＡ）、εＢ～Ｎ（０、σＢ）
ここで、σＡ及びσＢは、それぞれ切片と傾きの動物間のばらつきの標準偏差である。動物間のばらつきも、通常、標準偏差で分布する σ：ε～（０，σ）。
処置の各ペアについて、上記のモデルをデータに適合させた。Ａ１及びＢ１について、ゼロからの差の（両側）ｐ値が計算された。０．０５未満のｐ値は、処置群間の差につき、統計的に有意な証拠である。
図１０に示すように、FS22m-063-AA/FS28m-228-010 mAb2は、アイソタイプ対照で処置
したマウスと比較して、全ての用量レベルで腫瘍増殖を低減した。６２．５ｍｍ３以下の腫瘍を保有する全ての動物は、研究の終了時に完全応答動物として計数された（表１７を参照）。FS22m-063-AA/FS28m-228-010 mAb2をそれぞれ１０、３、１、０．３ｍｇ／ｋｇ
で処置した動物の３０％、２０％、２０％、１０％は、抗ＣＤ１３７抗体、G1/Lob12.3（１５％）及びG1-AA/4420アイソタイプ対照で処置された動物（０％）と比較して、腫瘍がないと見なされた。
さらに、表１７は、混合モデル分析を使用した研究の全過程にわたる増殖速度の対比較を示し、全ての群をヒトＩｇＧ１アイソタイプ対照処置群と比較している。明白な毒性又は有害効果の兆候を示したマウスはなく、全ての処置はマウスで十分に許容された。
生存分析（図１１及び表１８）は、全ての用量レベルで、FS22m-063-AA/FS28m-228-010
mAb2が、アイソタイプ対照（G1-AA/4420）で処置したマウスと比較して、有意な抗腫瘍
反応を誘発したことを示し、この応答は用量依存的であるようであった。さらに、表１８は、各群の生存期間中央値の概要を示し、ここで、１０ｍｇ／ｋｇ、３ｍｇ／ｋｇ、１ｍｇ／ｋｇ、及び０．３ｍｇ／ｋｇのマウスCD137/MSLN mAb2による処置で、生存期間中央
値は、２９．５日（G1-AA/4420）からそれぞれ３６．５、３７．５、３５及び３１日に増加した。
CD137/MSLN mAb2形式のFS28m-228 MSLN Fabと同様、CD137/MSLN mAb2形式のFS28m-228-010 Fabも、アイソタイプ対照と比較して、腫瘍増殖の有意な減少をもたらした。さらに
、ｍＡｂ２による生存率の用量依存性の有意な改善は、ＦａｂアームによるｍＡｂ２のＭＳＬＮ標的への架橋が、ＣＤ１３７のアゴニスト作用、ひいてはインビボで観察される抗腫瘍効果を駆動することを示唆している。
１３．２ ＣＴ２６．Ｇ１０同系腫瘍モデルにおける構成部分と比較したFS22m-063-AA/FS28m-228-010の抗腫瘍効果
FS22m-063-AA/FS28m-228-010は、担癌マウスにおいて有意な抗腫瘍効果及び生存率の改善を示しており、ｍＡｂ２がその個々の構成部分と比較してインビボで優れた抗腫瘍活性
を示したかどうかを決定することが望ましい。マウスＭＳＬＮ抗体（G1-AA/FS28m-228-010）、「モック」ｍＡｂ２形式のＣＤ１３７ Ｆｃａｂ（FS22m-063-AA/HelD1.3及びFS22m-063-AA/4420）、マウスＭＳＬＮ抗体及びモックｍＡｂ２形式のＣＤ１３７ Ｆｃａｂの組み合わせ（すなわちG1-AA/FS28m-228-010プラスFS22m-063-AA/HelD1.3）、並びにFS22m-063-AA/FS28m-228-010 mAb2による処置は、ヒトアイソタイプ対照抗体（G1-AA/HelD1.3
）による処置と比較された。
実施例１３．１に従ってマウスを準備し、ＣＴ２６．Ｇ１０結腸癌細胞株を接種した。１０匹のマウスがいたFS22m-063-AA/4420を除き、全てのコホートには２０匹のマウスが
いた。
FS22m-063-AA/FS28-228-010 mAb2、G1-AA/FS28m-228-010、FS22m-063-AA/HelD1.3、FS22m-063-AA/4420及びG1-AA/HelD1.3抗体は、全て用量あたり２００μｇ（２０ｇマウスで
およそ１０ｍｇ／ｋｇ）で調製され、固定用量でマウスに腹腔内（ＩＰ）注射された。さらに、ＣＤ１３７モックｍＡｂ２及びＭＳＬＮ抗体の両方が、組み合わせ群に対して用量あたり２００μｇ（２０ｇマウスでおよそ１０ｍｇ／ｋｇ）で調製された。全ての抗体は、ＤＰＢＳ＋１ｍＭアルギニン＋０．０５％Ｔｗｅｅｎ８０で調製した。実施例１３．１の投与レジメンと同様に、各マウスは、腫瘍接種後１２日目、１４日目及び１６日目（ｑ２ｄｘ３）に、２００μｌの腹腔内注射により抗体を投与された。実施例１２．１に記載されているようにカリパスを使用して腫瘍体積測定を週に３回行い、マウスを綿密に監視した。研究のエンドポイントは、腫瘍の体積及び状態に基づいた人道的なエンドポイントによって決定された。
図１２に示すように、FS22m-063-AA/FS28m-228-010 mAb2による処置は、G1-AA/HelD1.3アイソタイプ対照で処置されたマウスと比較して、腫瘍増殖を有意に減少させた。６２．５ｍｍ３以下の腫瘍を保有する全ての動物は、研究の終了時に完全応答動物として計数された（表１９を参照）。G1-AA/FS28m-228-010で処置されたマウスの１／２０（５％）及
びG1-AA/HelD1.3アイソタイプ対照の０／２０（０％）、FS22m-063-AA/HelD1.3、FS22m-063-AA/4420、並びにFS22m-063-AA/HelD1.3プラスG1-AA/FS28m-228-010の組み合わせで処
置されたマウスと比較して、FS22m-063-AA/FS28-228-010 mAb2で処置された動物の７／２０（３５％）は、研究終了時に処置に対する完全応答者であると見なされた。
さらに、表１９は、混合モデル分析を使用した研究の全過程にわたる増殖速度の対比較を示し、全ての群をG1-AA/HelD1.3アイソタイプ対照と比較している。
生存分析（図１３及び表２０）は、G1-AA/HelD1.3抗体と比較して、FS22m-063-AA/FS28m-228-010 mAb2が有意な延命効果を誘導する一方、構成成分は生存優位性をもたらさないことを示した。さらに、FS22m-063-AA/FS28m-228-010 mAb2による処置は、G1-AA/HelD1.3（２９日）、FS22m-063-AA/HelD1.3（３０日）、FS22m-063-AA/4420（２９日）、G1-AA/FS28m-228-010（３０日）及びFS22m-063-AA/HelD1.3とG1-AA/FS28m-228-010の組み合わせ
（２９日）と比較して、改善された４２．５日の生存期間中央値をもたらした。
これらのデータは、ｍＡｂ２の個々の成分を単独で、又は組み合わせて投与した場合には観察されないレベルで、ｍＡｂ２が腫瘍増殖阻害をもたらすため、ＣＤ１３７及びＭＳＬＮの両方を標的とする二重特異性分子がインビボ活性に必要であることを示す。
１３．３ ＣＴ２６．Ｇ１０同系マウス担癌モデルにおける抗マウスＣＤ１３７／ＭＳＬＮ ｍＡｂ２の肝臓薬理
臨床試験中のウレルマブを伴う固形腫瘍患者の抗ＣＤ１３７ ｍＡｂ処置は、投与されたウレルマブの用量に関連することが示されている重度の処置関連免疫事象をもたらした。これらの免疫事象の影響は、重度の肝毒性として肝臓に現れた（Segal, N. H., et al., 2017）。
ＣＤ１３７アゴニスト性ツール抗体を使用して動物に投与した、マウスで行われた前臨床機構の研究は、同様の肝毒性を示している。これらの研究は、結果として生じる肝毒性におけるＴ細胞とＣＤ１３７の必要性を示した（Niu, L., et al. 2007及びDubrot J, et
al. 2010）。十分に理解されていないものの、骨髄とＴ細胞コンパートメント間の相互
作用は、肝障害及び肝毒性につながる炎症カスケードの開始に重要であることが示されている（Bartkowiak, T et al., 2018）。したがって、これらの動物モデルは、他のＣＤ１３７アゴニスト、例えばＣＤ１３７／ＭＳＬＮ ｍＡｂ２の投与後のヒト患者における肝毒性のリスクを予測するにおいて、臨床にとって変換される関連性を有する。
実施例１３．１及び１３．２に記載されたＣＴ２６．Ｇ１０同系腫瘍研究からのマウスは、FS22m-063-AA/FS28m-228-010 mAb2の反復投与後、毒性の明白な兆候を示さなかった
。これらの動物において、肝毒性マウスと相関する免疫活性化が、実施例１３．１及び１３．２に示されるものと同様の投与レジメンに従って投与されたかどうかを決定するために、投与後４つの時点でマウスを選別し、組織学的評価のために剖検時に肝臓サンプルを採取した。
実施例１３．１に記載されるようにマウスを準備し、ＣＴ２６．Ｇ１０結腸癌細胞株をマウスに接種した。各コホートは２４匹のマウスで構成された。FS22m-063-AA/FS28-228-010 mAb2（CD137/MSLN）及びG1-AA/4420（ヒトＩｇＧ１アイソタイプ対照）抗体は、ＤＰＢＳ＋１ｍＭアルギニン＋０．０５％Ｔｗｅｅｎ８０中、用量当たり２００μｇ（２０ｇマウスでおよそ１０ｍｇ／ｋｇ）で調製され、固定用量でマウスに腹腔内（ＩＰ）注射した。各マウスは、腫瘍接種後１２日目、１４日目及び１６日目に、２００μｌの腹腔内注射により抗体を投与された。実施例１２．１に記載されているようにカリパスを使用して腫瘍体積測定を週に３回行い、マウスを綿密に監視した。最後の投与から２、５、８及び１１日後に１群あたり６匹のマウスを剖検し、肝臓サンプルをホルマリン固定し、パラフィン包埋した。次に、肝臓の切片を切り取り、ヘマトキシリン及びエオシン染色による組織病理学的評価、及び独立の認定獣医病理医による肝臓の炎症及び損傷のスコアリングに供した。
スコアリングシステムを使用して、ヘマトキシリン及びエオシンで染色された切片の肝臓病理を評価した。肝臓は、多発性混合炎症細胞、多発性変性肝細胞、肝細胞有糸分裂の増加、及び門脈混合炎症細胞浸潤に対応する病理についてスコア化された。各群内で最小、軽度、及び中程度の効果を示すマウスの頻度を表２１に示す。
FS22m-063-AA/FS28-228-010 mAb2で処置された動物は、最小の肝臓病変、具体的には、・ 実質全体に位置する最小の多発性混合炎症細胞（主に顆粒球）
・ 実質全体に散在する最小の変性肝細胞
・ 最小の変性肝細胞
・ 門脈管における最小の混合炎症細胞
を示した。
これらの所見は、抗ＣＤ１３７アゴニスト抗体の他の例で観察されたように、肝毒性を表さない。さらに、ｍＡｂ２がＭＳＬＮ結合を介して媒介される架橋によりＣＤ１３７をアゴナイズし、ＭＳＬＮが主に腫瘍細胞の細胞表面で過剰発現するが、肝臓では過剰発現しないことを考えると（Ordonez 2003、14576474）、ＣＤ１３７のアゴニスト作用は腫瘍微小環境に限定されると予想される。
１３．４ ＣＴ２６．Ｇ１０同系マウス腫瘍モデルにおける抗マウスCD137/MSLN mAb2の
作用機序
CD137/MSLN mAb2（実施例１３．３）の反復投与後に観察された制限された肝臓薬理に
より、また、FS22m-063-AA/FS28m-228-010で観察された抗腫瘍応答の薬理をさらに理解するために、ＭＳＬＮ陽性同系腫瘍モデルにおけるCD137/MSLN mAb2の作用機序を調査した
。
実施例１３．１に記載されるようにマウスを準備し、ＣＴ２６．Ｇ１０結腸癌細胞株を接種した。各コホートは２０匹のマウスで構成された。FS22m-063-AA/FS28-228-010（CD137/MSLN）mAb2、ヒトＩｇＧ１アイソタイプ対照（G1-AA/4420）及び抗ＣＤ１３７アゴニ
スト抗体（クローン３Ｈ３；G1/3H3）も比較のために含まれていた。３つの抗体は全て、ＤＰＢＳ＋１ｍＭアルギニン＋０．０５％Ｔｗｅｅｎ８０中、用量あたり１３４μｇ（２０ｇマウスでおよそ６．７ｍｇ／ｋｇ）で調製し、マウスに腹腔内（ＩＰ）注射した。各マウスは、腫瘍接種後２０日目に１３４μｇの固定用量で１回の２００μｌ腹腔内注射によって抗体を投与された。実施例１２．１に記載されているようにカリパスを使用して腫瘍体積測定を週に３回行い、マウスを綿密に監視した。
腫瘍接種から２０日目の投与後、２４、７２、１４４及び１９２時間で、１群あたり６
匹のマウスを剖検した。脾臓、血液、及び腫瘍組織は、FS22m-063-AA/FS28-228-010、G1-AA/4420、又はG1/3H3のいずれかで処置されたＣＴ２６．Ｇ１０担癌マウスから分析のた
めに採取された。Ｔ細胞活性化及び増殖マーカーは、ＣＤ１３７アゴニスト作用の下流効果であることが知られている（Fisher et al., 2012）ため、全てのサンプルは、フロー
サイトメトリーによってＴ細胞の存在量及び増殖について調査された。さらに、可溶性ＭＳＬＮ発現の検出及び定量化のために、血液からの血清も収集された。脾臓及び腫瘍組織は、標準的な機械的及び酵素的方法によって単一細胞懸濁液へと分解され、赤血球は、赤血球溶解バッファー（Miltenyi Biotec Ltd.、130-094-183）で１回溶解した。血液は終
末心臓出血によって収集され、半分はフローサイトメトリーによる単一細胞分析のためにＥＤＴＡ含有チューブに収集され、血液の半分は可溶性ＭＳＬＮの分析のために凝固活性化因子／血清チューブに収集された。ＥＤＴＡ含有チューブに収集された全血は、製造元の指示に従って、赤血球溶解バッファー（Miltenyi Biotec Ltd.、130-094-183）で３回
溶解された。血清チューブに収集した血液は遠心分離によって分画し、可溶性ＭＳＬＮの分析のために血清を除去した。
次に、脾臓、腫瘍、及び血液からの単一細胞を同じように処置し、細胞をＰＢＳで１回洗浄し、サンプルを固定可能生存率色素（eBioscience、65-0865-14）で染色した。続い
て、細胞を、Ｆｃブロック（eBioscience、16-0161-85、1：25）の存在下で、表２２に示す抗体染色パネル（細胞内マーカー、Ｋｉ６７及びＦｏｘＰ３を除く全て）を使用して、細胞表面マーカーについて４°Ｃで４５分間染色した。次に、製造元の指示に従って、細胞を固定し、eBioscience FoxP3染色キット（eBioscience、00-5523-00）で、透過処理した。細胞を細胞内マーカーＫｉ６７及びＦｏｘＰ３抗体を含む１００μｌの透過性バッファーに再懸濁し、暗所で、４℃で一晩インキュベートした。BD Fortessaフローサイトメ
ーターで取得する前に、細胞を透過処理バッファーで１回洗浄し、０．５％ＢＳＡを含む１２０μｌのＰＢＳに再懸濁した。データはBD FACS Divaソフトウェアを使用して取得し、FlowJo（V10）、及びMicrosoft Excelで分析した。データは、投与後１４４時間でのＣＤ８＋Ｔ細胞の存在量及び増殖を、親集団のパーセンテージとして示す。
表２３に示すように、G1/3H3及びFS22m-063-AA/FS28-228-010 mAb2の投与後１４４時間で、対照処置群（G1-AA/4420）と比較して、腫瘍内のＣＤ８＋Ｔ細胞のパーセンテージの増加が観察された。腫瘍内のＣＤ８＋Ｔ細胞の平均パーセンテージは、投与後１４４時間で３２．１％（G1-AA/4420）からG1/3H3で５６．１％、FS22m-063-AA/FS28m-228-010で５
８．４％に増加した。
さらに、ＣＤ８＋Ｔ細胞の存在量の増加が血液及び脾臓でも観察されたが、ＩｇＧ１対照と比較してG1/3H3でのみ観察された。投与後１４４時間の血液では、ＣＤ８＋Ｔ細胞の平均パーセンテージは２２．６％（G1-AA/4420）から５７．０％に増加した（G1/3H3）が、この増加はFS22m-063-AA/FS28m-228-010（２５．８％）では観察されなかった。同様に、脾臓では、ＣＤ８＋Ｔ細胞の平均パーセンテージはG1/3H3で２８．８％（G1-AA/4420）から３８．０％に増加したが、この増加はFS22m-063-AA/FS28m-228-010（２９％）では観察されなかった。
これは、FS22m-063-AA/FS28m-228-010 mAb2が、ＭＳＬＮが発現している腫瘍で特異的
にＣＤ８＋Ｔ細胞を増加させる一方、ＣＤ１３７を標的とする抗体であるG1/3H3もＣＤ８＋Ｔ細胞の末梢（血液及び脾臓）での増加を示すことを示唆している。
投与後のＣＤ８＋Ｔ細胞の増殖に違いがあるかどうかを確認するために、腫瘍、血液及び脾臓のＣＤ８＋Ｔ細胞で増殖マーカーＫｉ６７を分析した。表２４に示すように、高パーセンテージのＣＤ８＋Ｔ細胞が対照群でＫｉ６７＋を発現し（平均発現７５．１％）、ＣＴ２６．Ｇ１０モデルの腫瘍における高レベルの増殖ＣＤ８＋Ｔ細胞を示唆している。これは、腫瘍の用量群間でＣＤ８＋Ｔ細胞上のＫｉ６７発現に不明確な違いがある一因であり得る。
比較すると、ＩｇＧ１対照と比較して、G1/3H3の投与後１４４時間で、血液及び脾臓のＣＤ８＋Ｔ細胞でのＫｉ６７＋発現の明らかな増加が観察された。血中では、アイソタイプ対照で処置したマウスはＣＤ８＋Ｔ細胞で１０．４％の平均Ｋｉ６７＋発現を示す一方、G1/3H3投与後のＣＤ８＋Ｔ細胞でのＫｉ６７の平均発現は、投与後１４４時間で８６．３％であることが示されている。比較すると、この増加はFS22m-063-AA/FS28m-228-010では観察されなかった一方、ＣＤ８＋Ｔ細胞での平均Ｋｉ６７＋発現は、血中でｍＡｂ２の投与後に１３．１％で観察された。同様に、脾臓では、アイソタイプ対照の投与後に８．１％、FS22m-063-AA/FS28m-228-010で１１．４％が観察されたのと比較して、G1/3H3の投与後にＣＤ８＋Ｔ細胞の３６．１％で平均Ｋｉ６７＋発現が観察された。
FS22m-063-AA/FS28-228-010、G1-AA/4420又はG1/3H3のいずれかを投与した群あたり６
匹のマウスから収集した血清を、血清に関する製造元の指示に従って、Mesothelin Mouse
SimpleStep ELISA Kit（Abcam、ab204528）を使用して可溶性ＭＳＬＮのレベルについて分析した。データはPrismでプロットされ、血清ＭＳＬＮレベルの濃度が経時的に示され
た。表２５に示すように、投与後１４４時間で、アイソタイプ対照G1-AA/4420と比較して、G1/3H3及びFS22m-063-AA/FS28m-228-010でＭＳＬＮの血清レベルが増加した。この同様の増加がG1/3H3及びFS22m-063-AA/FS28m-228-010 mAb2の両方で観察され、ＭＳＬＮは主
にＣＴ２６．Ｇ１０同系マウスモデルの腫瘍細胞で発現しており、これは、腫瘍におけるＣＤ１３７アゴニスト作用が、血清で検出される可溶性ＭＳＬＮを増加させている可能性があることを示唆している。
まとめると、これらのデータは、FS22m-063-AA/FS28m-228-010が腫瘍内の細胞傷害性ＣＤ８＋Ｔ細胞の腫瘍特異的増加を媒介したことを示す。これはG1/3H3でも観察されたが、FS22m-063-AA/FS28m-228-010 mAb2とは異なり、G1/3H3は血液及び脾臓のＣＤ８＋Ｔ細胞
の末梢での増加も促進した。さらに、これらのＣＤ８＋Ｔ細胞は、G1/3H3の投与後に増殖の増加も示した。ＣＤ８＋Ｔ細胞（細胞傷害性リンパ球とも呼ばれる）の主な役割は、３つの主要なメカニズム：１）サイトカイン、例えば、ＴＮＦα及びＩＦＮγの放出、２）細胞傷害性顆粒の産生及び放出、並びに３）ＦａｓＬの発現、を介した感染細胞又は悪性細胞の死滅である。したがって、処置後の腫瘍におけるＣＤ８＋Ｔ細胞の増加は、腫瘍に対するこれらのメカニズムを介して細胞傷害活性をもたらし得、その結果、この実施例で観察されるように、腫瘍細胞死滅の結果として、メソテリンの放出の増加につながる可能性がある。腫瘍はＣＤ１３７を発現しないため、メソテリンの放出はＴ細胞媒介性細胞傷害性によって引き起こされる間接的なＰＤ応答であると仮定されている。
実施例１４：マウスにおける抗マウスCD137/MSLN mAb2及び抗ヒトCD137/MSLN mAb2の薬物動態
１４．１ 非担癌マウスにおける抗マウスCD137/MSLN mAb2（FS22m-063-AA/FS28-228-010）の薬物動態
マウスにおける抗マウスCD137/MSLN mAb2の薬物動態を決定するために、非担癌Ｃ５７
ＢＬ／６雌マウスに１０ｍｇ／ｋｇの抗マウスCD137/MSLN mAb2（FS22m-063-AA/FS28m-228-010）又はヒトＩｇＧ１対照抗体（G1/4420）を１回静脈内投与し、１４４時間まで監視した。
およそ２０μｌの全血のマイクロサンプリングを０．５、１、６、２４、４８、９６及び１４４時間で実施し、処理して約５μｌの分析用の血清を単離した。各時点で存在する抗体の量は、Gyros Protein TechnologiesのGyrolab xPloreシステム（システム名XPS1055）を使用して決定した。捕捉試薬としてビオチン化ヤギ抗ヒトＩｇＧ－（重鎖及び軽鎖
）サル吸着抗体（Cambridge Biosciences、A80-319B）、及び検出抗体としてヤギ抗ヒト
ＩｇＧ－AlexaFluor（登録商標）６４７（Cambridge Biosciences、2040-31）を用い、Gyrolab Bioaffy 200 CD（Gyros Protein Technologies,、P0004180）を使用してサンドイ
ッチアッセイを実施した。各化合物の４０００ｎｇ／ｍＬから０．０６７７ｎｇ／ｍＬの範囲で作成された標準曲線を、Rexxip ANバッファー（Gyros Protein Technologies、P0004994）中の０．１％マウス血清（Sigma-Aldrich M5905）中で調製して、Rexxip AN（Gyros Protein Technologies、P0004994）で１：１０００に希釈されたサンプルでサンプル
濃度を決定した。時点ごとの個々のマウス（時点ごとに３匹のマウス）からの平均サンプル濃度をプロットした。
図１４Ａは、抗マウスCD137/MSLN mAb2の薬物動態を示し、ｍＡｂ２は、非ＭＳＬＮ結
合ヒトＩｇＧ１抗体よりも投与期間中の全身曝露がわずかに低かったことを示す。これは、標的媒介性クリアランス機構によって説明され得る。
１４．２ 非担癌マウスにおける抗ヒトCD137/MSLN mAb2の薬物動態
比較のため、非担癌Ｃ５７ＢＬ／６雌マウスにおける抗ヒトＣＤ１３７／ＭＳＬＮ ｍＡｂ２の薬物動態プロファイルを決定した。マウスに６．７ｍｇ／ｋｇの抗ヒトCD137/MSLN（FS22-172-003-AA/FS28-256-271）mAb2又はヒトＩｇＧ１対照抗体（G1-AA/4420）を静脈内投与し、１４４時間まで監視した。およそ２０μｌの全血のマイクロサンプリングを０．５、１、６、２４、４８、９６及び１４４時間で実施し、処理して約５μｌの分析用の血清を単離した。分析は、実施例１４．１で記載したように実行した。
図１４Ｂは、抗ヒトCD137/MSLN mAb2の薬物動態を示し、ｍＡｂ２がＭＳＬＮに結合し
ない標準的なヒトＩｇＧ１抗体と同等の血中曝露を有していたことを示す（Bergman et al., 1998）。
配列表
重鎖注釈
ｉ．ｍＡｂ２の重鎖のアミノ酸配列において、可変ドメインは斜体で示され、ＩＭＧＴに従うＣＤＲは太字斜体で示され、Kabatに従うＣＤＲは斜体下線で示され（したがって、
重複するＩＭＧＴ及びKabat ＣＤＲ配列は太字、斜体、且つ下線で示される）、ＣＨ１
ドメインには下線が付され、ヒンジ領域には二重下線が付され、ＣＨ２ドメインは太字で示され（該当する場合、ＬＡＬＡ変異の位置は太字下線で示される）、ＣＨ３ドメインは通常フォントで示され、ＣＨ３構造ループの変更された領域には下線が付されている（ループが変更されていない場合は下線なし）。
ｉｉ．可変ドメインのアミノ酸配列において、ＩＭＧＴに従うＣＤＲは太字斜体で示され、Kabatに従うＣＤＲは斜体下線で示される（したがって、重複するＩＭＧＴ及びKabat ＣＤＲ配列は太字、斜体、且つ下線で示される）。
ｉｉｉ．ＩＭＧＴ及びKabatの両方に従うＣＤＲアミノ酸配列が提供される。
軽鎖注釈
ｉ．ｍＡｂ２の軽鎖のアミノ酸配列において、可変ドメインは斜体で示され、ＩＭＧＴに従うＣＤＲは太字斜体で示され、Kabatに従うＣＤＲは斜体下線で示される（したがって、重複するＩＭＧＴ及びKabat ＣＤＲ配列は太字、斜体、且つ下線で示される）。
ｉｉ．可変ドメインのアミノ酸配列において、ＩＭＧＴに従うＣＤＲは太字斜体で示され、Kabatに従うＣＤＲは斜体下線で示される（したがって、重複するＩＭＧＴ及びKabat ＣＤＲ配列は太字、斜体、且つ下線で示される）。
ｉｉｉ．ＩＭＧＴ及びKabatの両方に従うＣＤＲアミノ酸配列が提供される。
ＣＨ３ドメインのアミノ酸及びｃＤＮＡ配列並びにFS22-172-003 Fcab含有ｍＡｂ２クローン全て及びFS22-172-003 FcabのＣＨ３ ＡＢ及びＥＦ構造ループの改変領域のアミノ酸配列
ＣＨ３ 配列番号８ ＡＡ

ＣＨ３ 配列番号９ ＤＮＡ

配列番号１０ ループＡＢ（ＡＡ）ＰＹＩＩＰＰＹ
配列番号１１ ループＥＦ（ＡＡ）ＧＡＤＲＷＬＥ
FS22-172-003-AA/FS28-024 mAb2の重鎖のアミノ酸配列及びｃＤＮＡ配列
配列番号９２ 重鎖ＡＡ（ＬＡＬＡなし）

配列番号９３ 重鎖ＤＮＡ（ＬＡＬＡなし）

配列番号９４ 重鎖ＡＡ（ＬＡＬＡあり）

配列番号９５ 重鎖ＤＮＡ（ＬＡＬＡあり）

配列番号１２ ＶＨドメインＡＡ

配列番号１３ ＶＨドメインＤＮＡ

配列番号１４ ＨＣＤＲ１（ＡＡ）（ＩＭＧＴ）ＧＦＴＬＳＹＳＳ
配列番号１５ ＨＣＤＲ１（ＡＡ）（Kabat）ＹＳＳＭＳ
配列番号１６ ＨＣＤＲ２（ＡＡ）（ＩＭＧＴ）ＩＴＰＳＴＧＹＴ
配列番号１７ ＨＣＤＲ２（ＡＡ）Kabat） ＦＩＴＰＳＴＧＹＴＨＹＡＤＳＶＫＧ
配列番号１８ ＨＣＤＲ３（ＡＡ）（ＩＭＧＴ）ＡＲＲＡＬＴＦＤＹ
配列番号１９ ＨＣＤＲ３（ＡＡ）（Kabat）ＲＡＬＴＦＤＹ
FS22-172-003-AA/FS28-024 mAb2の軽鎖のアミノ酸配列及びｃＤＮＡ配列
配列番号８５ 軽鎖ＡＡ

配列番号８６ 軽鎖ＤＮＡ

配列番号５４ ＶＬドメインＡＡ

配列番号５５ ＶＬドメインＤＮＡ

配列番号２０ ＬＣＤＲ１（ＡＡ）（ＩＭＧＴ）ＱＳＶＳＳＳＹ
配列番号２１ ＬＣＤＲ１（ＡＡ）（Kabat）ＲＡＳＱＳＶＳＳＳＹＬＡ
配列番号２２ ＬＣＤＲ２（ＡＡ）（ＩＭＧＴ）ＧＡＳ
配列番号２３ ＬＣＤＲ２（ＡＡ）（Kabat）ＧＡＳＳＲＡＴ
配列番号２４ ＬＣＤＲ３（ＡＡ）（ＩＭＧＴ）ＱＱＡＳＳＹＰＬＴ
配列番号２４ ＬＣＤＲ３（ＡＡ）（Kabat）ＱＱＡＳＳＹＰＬＴ
FS22-172-003-AA/FS28-024-051 mAb2の重鎖のアミノ酸配列及びｃＤＮＡ配列
配列番号９６ 重鎖ＡＡ（ＬＡＬＡなし）

配列番号９７ 重鎖ＤＮＡ（ＬＡＬＡなし）

配列番号９８ 重鎖ＡＡ（ＬＡＬＡあり）

配列番号９９ 重鎖ＤＮＡ（ＬＡＬＡあり）

配列番号５６ ＶＨドメインＡＡ

配列番号５７ ＶＨドメインＤＮＡ

配列番号１４ ＨＣＤＲ１（ＡＡ）（ＩＭＧＴ）ＧＦＴＬＳＹＳＳ
配列番号１５ ＨＣＤＲ１（ＡＡ）（Kabat）ＹＳＳＭＳ
配列番号１６ ＨＣＤＲ２（ＡＡ）（ＩＭＧＴ）ＩＴＰＳＴＧＹＴ
配列番号１７ ＨＣＤＲ２（ＡＡ）Kabat）ＦＩＴＰＳＴＧＹＴＨＹＡＤＳＶＫＧ
配列番号２５ ＨＣＤＲ３（ＡＡ）（ＩＭＧＴ）ＡＲＲＡＬＩＦＤＹ
配列番号２６ ＨＣＤＲ３（ＡＡ）（Kabat）ＲＡＬＩＦＤＹ
FS22-172-003-AA/FS28-024-051 mAb2の軽鎖のアミノ酸配列及びｃＤＮＡ配列
配列番号８５ 軽鎖ＡＡ

配列番号８６ 軽鎖ＤＮＡ

配列番号５４ ＶＬドメインＡＡ

配列番号５５ ＶＬドメインＤＮＡ

配列番号２０ ＬＣＤＲ１（ＡＡ）（ＩＭＧＴ）ＱＳＶＳＳＳＹ
配列番号２１ ＬＣＤＲ１（ＡＡ）（Kabat）ＲＡＳＱＳＶＳＳＳＹＬＡ
配列番号２２ ＬＣＤＲ２（ＡＡ）（ＩＭＧＴ）ＧＡＳ
配列番号２３ ＬＣＤＲ２（ＡＡ）（Kabat）ＧＡＳＳＲＡＴ
配列番号２４ ＬＣＤＲ３（ＡＡ）（ＩＭＧＴ）ＱＱＡＳＳＹＰＬＴ
配列番号２４ ＬＣＤＲ３（ＡＡ）（Kabat）ＱＱＡＳＳＹＰＬＴ
FS22-172-003-AA/FS28-024-052 mAb2の重鎖のアミノ酸配列及びｃＤＮＡ配列
配列番号１００ 重鎖ＡＡ（ＬＡＬＡなし）

配列番号１０１ 重鎖ＤＮＡ（ＬＡＬＡなし）

配列番号１０２ 重鎖ＡＡ（ＬＡＬＡあり）

配列番号１０３ 重鎖ＤＮＡ（ＬＡＬＡあり）

配列番号５８ ＶＨドメインＡＡ

配列番号５９ ＶＨドメインＤＮＡ

配列番号１４ ＨＣＤＲ１（ＡＡ）（ＩＭＧＴ）ＧＦＴＬＳＹＳＳ
配列番号１５ ＨＣＤＲ１（ＡＡ）（Kabat）ＹＳＳＭＳ
配列番号１６ ＨＣＤＲ２（ＡＡ）（ＩＭＧＴ）ＩＴＰＳＴＧＹＴ
配列番号１７ ＨＣＤＲ２（ＡＡ）Kabat）ＦＩＴＰＳＴＧＹＴＨＹＡＤＳＶＫＧ
配列番号２７ ＨＣＤＲ３（ＡＡ）（ＩＭＧＴ）ＡＲＲＡＬＬＦＤＹ
配列番号２８ ＨＣＤＲ３（ＡＡ）（Kabat）ＲＡＬＬＦＤＹ
FS22-172-003-AA/FS28-024-052 mAb2の軽鎖のアミノ酸配列及びｃＤＮＡ配列
配列番号８５ 軽鎖ＡＡ

配列番号８６ 軽鎖ＤＮＡ

配列番号５４ ＶＬドメインＡＡ

配列番号５５ ＶＬ ＤＮＡ

配列番号２０ ＬＣＤＲ１（ＡＡ）（ＩＭＧＴ）ＱＳＶＳＳＳＹ
配列番号２１ ＬＣＤＲ１（ＡＡ）（Kabat）ＲＡＳＱＳＶＳＳＳＹＬＡ
配列番号２２ ＬＣＤＲ２（ＡＡ）（ＩＭＧＴ）ＧＡＳ
配列番号２３ ＬＣＤＲ２（ＡＡ）（Kabat）ＧＡＳＳＲＡＴ
配列番号２４ ＬＣＤＲ３（ＡＡ）（ＩＭＧＴ）ＱＱＡＳＳＹＰＬＴ
配列番号２４ ＬＣＤＲ３（ＡＡ）（Kabat）ＱＱＡＳＳＹＰＬＴ
FS22-172-003-AA/FS28-024-053 mAb2の重鎖のアミノ酸配列及びｃＤＮＡ配列
配列番号１０４ 重鎖ＡＡ（ＬＡＬＡなし）

配列番号１０５ 重鎖ＤＮＡ
（ＬＡＬＡなし）

配列番号１０６ 重鎖ＡＡ（ＬＡＬＡあり）

配列番号１０７ 重鎖ＤＮＡ
（ＬＡＬＡあり）

配列番号６０ ＶＨドメインＡＡ

配列番号６１ ＶＨドメインＤＮＡ

配列番号１４ ＨＣＤＲ１（ＡＡ）（ＩＭＧＴ）ＧＦＴＬＳＹＳＳ
配列番号１５ ＨＣＤＲ１（ＡＡ）（Kabat）ＹＳＳＭＳ
配列番号１６ ＨＣＤＲ２（ＡＡ）（ＩＭＧＴ）ＩＴＰＳＴＧＹＴ
配列番号１７ ＨＣＤＲ２（ＡＡ）Kabat）ＦＩＴＰＳＴＧＹＴＨＹＡＤＳＶＫＧ
配列番号２９ ＨＣＤＲ３（ＡＡ）（ＩＭＧＴ）ＡＲＲＡＬＶＦＤＹ
配列番号３０ ＨＣＤＲ３（ＡＡ）（Kabat）ＲＡＬＶＦＤＹ
FS22-172-003-AA/FS28-024-053 mAb2の軽鎖のアミノ酸配列及びｃＤＮＡ配列
配列番号８５ 軽鎖ＡＡ

配列番号８６ 軽鎖ＤＮＡ

配列番号５４ ＶＬドメインＡＡ

配列番号５５ ＶＬドメインＤＮＡ

配列番号２０ ＬＣＤＲ１（ＡＡ）（ＩＭＧＴ）ＱＳＶＳＳＳＹ
配列番号２１ ＬＣＤＲ１（ＡＡ）（Kabat）ＲＡＳＱＳＶＳＳＳＹＬＡ
配列番号２２ ＬＣＤＲ２（ＡＡ）（ＩＭＧＴ）ＧＡＳ
配列番号２３ ＬＣＤＲ２（ＡＡ）（Kabat）ＧＡＳＳＲＡＴ
配列番号２４ ＬＣＤＲ３（ＡＡ）（ＩＭＧＴ）ＱＱＡＳＳＹＰＬＴ
配列番号２４ ＬＣＤＲ３（ＡＡ）（Kabat）ＱＱＡＳＳＹＰＬＴ
FS22-172-003-AA/FS28-024-060 mAb2の重鎖及び軽鎖のアミノ酸配列
配列番号１０８ 重鎖ＡＡ（ＬＡＬＡあり）

配列番号８５ 軽鎖ＡＡ

FS22-172-003-AA/FS28-026 mAb2の重鎖及び軽鎖のアミノ酸配列
配列番号１０９ 重鎖ＡＡ（ＬＡＬＡあり）

配列番号８７ 軽鎖ＡＡ

FS22-172-003-AA/FS28-091 mAb2の重鎖及び軽鎖のアミノ酸配列
配列番号１１０ 重鎖ＡＡ（ＬＡＬＡあり）

配列番号８８ 軽鎖ＡＡ

FS22-172-003-AA/FS28-185 mAb2の重鎖及び軽鎖のアミノ酸配列
配列番号１１１ 重鎖ＡＡ（ＬＡＬＡあり）

配列番号８９ 軽鎖ＡＡ

FS22-172-003-AA/FS28-256 mAb2の重鎖のアミノ酸配列及びｃＤＮＡ配列
配列番号１１２ 重鎖ＡＡ（ＬＡＬＡなし）

配列番号１１３ 重鎖ＤＮＡ（ｌａｌａなし）

配列番号１１４ 重鎖ＡＡ（ＬＡＬＡあり）

配列番号１１５ 重鎖ＤＮＡ（ＬＡＬＡあり）

配列番号６２ ＶＨドメインＡＡ

配列番号６３ ＶＨドメインＤＮＡ

配列番号３１ ＨＣＤＲ１（ＡＡ）（ＩＭＧＴ）ＧＦＴＦＴＮＴＹ
配列番号３２ ＨＣＤＲ１（ＡＡ）（Kabat）ＮＴＹＭＳ
配列番号３３ ＨＣＤＲ２（ＡＡ）（ＩＭＧＴ）ＩＳＰＴＹＳＴＴ
配列番号３４ ＨＣＤＲ２（ＡＡ）Kabat）ＮＩＳＰＴＹＳＴＴＮＹＡＤＳＶＫＧ
配列番号３５ ＨＣＤＲ３（ＡＡ）（ＩＭＧＴ）ＡＲＹＮＳＹＱＧＧＬＤＹ
配列番号３６ ＨＣＤＲ３（ＡＡ）（Kabat）ＹＮＳＹＱＧＧＬＤＹ
FS22-172-003-AA/FS28-256 mAb2の軽鎖のアミノ酸配列及びｃＤＮＡ配列
配列番号１１６ 軽鎖ＡＡ

配列番号１１７ 軽鎖ＤＮＡ

配列番号６４ ＶＬドメインＡＡ

配列番号６５ ＶＬドメインＤＮＡ

配列番号２０ ＬＣＤＲ１（ＡＡ）（ＩＭＧＴ）ＱＳＶＳＳＳＹ
配列番号２１ ＬＣＤＲ１（ＡＡ）（Kabat）ＲＡＳＱＳＶＳＳＳＹＬＡ
配列番号２２ ＬＣＤＲ２（ＡＡ）（ＩＭＧＴ）ＧＡＳ
配列番号２３ ＬＣＤＲ２（ＡＡ）（Kabat）ＧＡＳＳＲＡＴ
配列番号３７ ＬＣＤＲ３（ＡＡ）（ＩＭＧＴ）ＱＱＳＹＹＹＰＩＴ
配列番号３７ ＬＣＤＲ３（ＡＡ）（Kabat）ＱＱＳＹＹＹＰＩＴ
FS22-172-003-AA/FS28-256-001 mAb2の重鎖のアミノ酸配列及びｃＤＮＡ配列
配列番号１１８ 重鎖ＡＡ（ＬＡＬＡなし）

配列番号１１９ 重鎖ＤＮＡ（ＬＡＬＡなし）

配列番号１２０ 重鎖ＡＡ（ＬＡＬＡあり）

配列番号１２１ 重鎖ＤＮＡ（ＬＡＬＡあり）

配列番号６６ ＶＨドメインＡＡ

配列番号６７ ＶＨドメインＤＮＡ

配列番号３８ ＨＣＤＲ１（ＡＡ）（ＩＭＧＴ）ＧＦＴＦＴＥＴＹ
配列番号３９ ＨＣＤＲ１（ＡＡ）（Kabat）ＥＴＹＭＳ
配列番号３３ ＨＣＤＲ２（ＡＡ）（ＩＭＧＴ）ＩＳＰＴＹＳＴＴ
配列番号３４ ＨＣＤＲ２（ＡＡ）Kabat）ＮＩＳＰＴＹＳＴＴＮＹＡＤＳＶＫＧ
配列番号３５ ＨＣＤＲ３（ＡＡ）（ＩＭＧＴ）ＡＲＹＮＳＹＱＧＧＬＤＹ
配列番号３６ ＨＣＤＲ３（ＡＡ）（Kabat）ＹＮＳＹＱＧＧＬＤＹ
FS22-172-003-AA/FS28-256-001 mAb2の軽鎖のアミノ酸配列及びｃＤＮＡ配列
配列番号８２ 軽鎖ＡＡ

配列番号１２２ 軽鎖ＤＮＡ

配列番号６８ ＶＬドメインＡＡ

配列番号６９ ＶＬドメインＤＮＡ

配列番号２０ ＬＣＤＲ１（ＡＡ）（ＩＭＧＴ）ＱＳＶＳＳＳＹ
配列番号２１ ＬＣＤＲ１（ＡＡ）（Kabat）ＲＡＳＱＳＶＳＳＳＹＬＡ
配列番号２２ ＬＣＤＲ２（ＡＡ）（ＩＭＧＴ）ＧＡＳ
配列番号２３ ＬＣＤＲ２（ＡＡ）（Kabat）ＧＡＳＳＲＡＴ
配列番号４０ ＬＣＤＲ３（ＡＡ）（ＩＭＧＴ）ＱＱＨＮＱＹＰＮＴ
配列番号４０ ＬＣＤＲ３（ＡＡ）（Kabat）ＱＱＨＮＱＹＰＮＴ
FS22-172-003-AA/FS28-256-005 mAb2の重鎖のアミノ酸配列及びｃＤＮＡ配列
配列番号１１８ 重鎖ＡＡ（ＬＡＬＡなし）

配列番号１１９ 重鎖ＤＮＡ（ＬＡＬＡなし）

配列番号１２０ 重鎖ＡＡ（ＬＡＬＡあり）

配列番号１２１ 重鎖ＤＮＡ（ＬＡＬＡあり）

配列番号６６ ＶＨドメインＡＡ

配列番号６７ ＶＨドメインＤＮＡ

配列番号３８ ＨＣＤＲ１（ＡＡ）（ＩＭＧＴ）ＧＦＴＦＴＥＴＹ
配列番号３９ ＨＣＤＲ１（ＡＡ）（Kabat）ＥＴＹＭＳ
配列番号３３ ＨＣＤＲ２（ＡＡ）（ＩＭＧＴ）ＩＳＰＴＹＳＴＴ
配列番号３４ ＨＣＤＲ２（ＡＡ）Kabat）ＮＩＳＰＴＹＳＴＴＮＹＡＤＳＶＫＧ
配列番号３５ ＨＣＤＲ３（ＡＡ）（ＩＭＧＴ）ＡＲＹＮＳＹＱＧＧＬＤＹ
配列番号３６ ＨＣＤＲ３（ＡＡ）（Kabat）ＹＮＳＹＱＧＧＬＤＹ
FS22-172-003-AA/FS28-256-005 mAb2の軽鎖のアミノ酸配列及びｃＤＮＡ配列
配列番号８３ 軽鎖ＡＡ

配列番号９０ 軽鎖ＤＮＡ

配列番号７８ ＶＬドメインＡＡ

配列番号７９ ＶＬドメインＤＮＡ

配列番号２０ ＬＣＤＲ１（ＡＡ）（ＩＭＧＴ）ＱＳＶＳＳＳＹ
配列番号２１ ＬＣＤＲ１（ＡＡ）（Kabat）ＲＡＳＱＳＶＳＳＳＹＬＡ
配列番号２２ ＬＣＤＲ２（ＡＡ）（ＩＭＧＴ）ＧＡＳ
配列番号２３ ＬＣＤＲ２（ＡＡ）（Kabat）ＧＡＳＳＲＡＴ
配列番号４１ ＬＣＤＲ３（ＡＡ）（ＩＭＧＴ）ＱＱＡＬＧＹＰＨＴ
配列番号４１ ＬＣＤＲ３（ＡＡ）（Kabat）ＱＱＡＬＧＹＰＨＴ
FS22-172-003-AA/FS28-256-012 mAb2の重鎖のアミノ酸配列及びｃＤＮＡ配列
配列番号１２３ 重鎖ＡＡ（ＬＡＬＡなし）

配列番号１２４ 重鎖ＤＮＡ（ＬＡＬＡなし）

配列番号１２５ 重鎖ＡＡ（ＬＡＬＡあり）

配列番号１２６ 重鎖ＤＮＡ（ＬＡＬＡあり）

配列番号７０ ＶＨドメインＡＡ

配列番号７１ ＶＨドメインＤＮＡ

配列番号４２ ＨＣＤＲ１（ＡＡ）（ＩＭＧＴ）ＧＦＴＦＴＨＴＹ
配列番号４３ ＨＣＤＲ１（ＡＡ）（Kabat）ＨＴＹＭＳ
配列番号３３ ＨＣＤＲ２（ＡＡ）（ＩＭＧＴ）ＩＳＰＴＹＳＴＴ
配列番号３４ ＨＣＤＲ２（ＡＡ）Kabat）ＮＩＳＰＴＹＳＴＴＮＹＡＤＳＶＫＧ
配列番号４４ ＨＣＤＲ３（ＡＡ）（ＩＭＧＴ）ＡＲＹＮＡＹＨＡＡＬＤＹ
配列番号４５ ＨＣＤＲ３（ＡＡ）（Kabat）ＹＮＡＹＨＡＡＬＤＹ
FS22-172-003-AA/FS28-256-012 mAb2の軽鎖のアミノ酸配列及びｃＤＮＡ配列
配列番号１１６ 軽鎖ＡＡ

配列番号１１７ 軽鎖ＤＮＡ

配列番号６４ ＶＬドメインＡＡ

配列番号６５ ＶＬドメインＤＮＡ

配列番号２０ ＬＣＤＲ１（ＡＡ）（ＩＭＧＴ）ＱＳＶＳＳＳＹ
配列番号２１ ＬＣＤＲ１（ＡＡ）（Kabat）ＲＡＳＱＳＶＳＳＳＹＬＡ
配列番号２２ ＬＣＤＲ２（ＡＡ）（ＩＭＧＴ）ＧＡＳ
配列番号２３ ＬＣＤＲ２（ＡＡ）（Kabat）ＧＡＳＳＲＡＴ
配列番号３７ ＬＣＤＲ３（ＡＡ）（ＩＭＧＴ）ＱＱＳＹＹＹＰＩＴ
配列番号３７ ＬＣＤＲ３（ＡＡ）（Kabat）ＱＱＳＹＹＹＰＩＴ
FS22-172-003-AA/FS28-256-014 mAb2の重鎖のアミノ酸配列及びｃＤＮＡ配列
配列番号１２７ 重鎖ＡＡ（ＬＡＬＡなし）

配列番号１２８ 重鎖ＤＮＡ（ＬＡＬＡなし）

配列番号１２９ 重鎖ＡＡ（ＬＡＬＡあり）

配列番号１３０ 重鎖ＤＮＡ（ＬＡＬＡあり）

配列番号７２ ＶＨドメインＡＡ

配列番号７３ ＶＨドメインＤＮＡ

配列番号４６ ＨＣＤＲ１（ＡＡ）（ＩＭＧＴ）ＧＦＴＦＴＤＴＹ
配列番号４７ ＨＣＤＲ１（ＡＡ）（Kabat）ＤＴＹＭＳ
配列番号３３ ＨＣＤＲ２（ＡＡ）（ＩＭＧＴ）ＩＳＰＴＹＳＴＴ
配列番号３４ ＨＣＤＲ２（ＡＡ）Kabat）ＮＩＳＰＴＹＳＴＴＮＹＡＤＳＶＫＧ
配列番号４８ ＨＣＤＲ３（ＡＡ）（ＩＭＧＴ）ＡＲＹＮＡＹＡＡＧＬＤＹ
配列番号４９ ＨＣＤＲ３（ＡＡ）（Kabat）ＹＮＡＹＡＡＧＬＤＹ
FS22-172-003-AA/FS28-256-014 mAb2の軽鎖のアミノ酸配列及びｃＤＮＡ配列
配列番号１１６ 軽鎖ＡＡ

配列番号１１７ 軽鎖ＤＮＡ

配列番号６４ ＶＬドメインＡＡ

配列番号６５ ＶＬドメインＤＮＡ

配列番号２０ ＬＣＤＲ１（ＡＡ）（ＩＭＧＴ）ＱＳＶＳＳＳＹ
配列番号２１ ＬＣＤＲ１（ＡＡ）（Kabat）ＲＡＳＱＳＶＳＳＳＹＬＡ
配列番号２２ ＬＣＤＲ２（ＡＡ）（ＩＭＧＴ）ＧＡＳ
配列番号２３ ＬＣＤＲ２（ＡＡ）（Kabat）ＧＡＳＳＲＡＴ
配列番号３７ ＬＣＤＲ３（ＡＡ）（ＩＭＧＴ）ＱＱＳＹＹＹＰＩＴ
配列番号３７ ＬＣＤＲ３（ＡＡ）（Kabat）ＱＱＳＹＹＹＰＩＴ
FS22-172-003-AA/FS28-256-018 mAb2の重鎖のアミノ酸配列及びｃＤＮＡ配列
配列番号１３１ 重鎖ＡＡ（ＬＡＬＡなし）

配列番号１３２ 重鎖ＤＮＡ（ＬＡＬＡなし）

配列番号１３３ 重鎖ＡＡ（ＬＡＬＡあり）

配列番号１３４ 重鎖ＤＮＡ（ＬＡＬＡあり）

配列番号７４ ＶＨドメインＡＡ

配列番号７５ ＶＨドメインＤＮＡ

配列番号５０ ＨＣＤＲ１（ＡＡ）（ＩＭＧＴ）ＧＦＴＦＴＱＴＹ
配列番号５１ ＨＣＤＲ１（ＡＡ）（Kabat）ＱＴＹＭＳ
配列番号３３ ＨＣＤＲ２（ＡＡ）（ＩＭＧＴ）ＩＳＰＴＹＳＴＴ
配列番号３４ ＨＣＤＲ２（ＡＡ）Kabat）ＮＩＳＰＴＹＳＴＴＮＹＡＤＳＶＫＧ
配列番号５２ ＨＣＤＲ３（ＡＡ）（ＩＭＧＴ）ＡＲＹＮＡＹＱＩＧＬＤＹ
配列番号５３ ＨＣＤＲ３（ＡＡ）（Kabat）ＹＮＡＹＱＩＧＬＤＹ
FS22-172-003-AA/FS28-256-018 mAb2の軽鎖のアミノ酸配列及びｃＤＮＡ配列
配列番号１１６ 軽鎖ＡＡ

配列番号１１７ 軽鎖ＤＮＡ

配列番号６４ ＶＬドメインＡＡ

配列番号６５ ＶＬドメインＤＮＡ

配列番号２０ ＬＣＤＲ１（ＡＡ）（ＩＭＧＴ）ＱＳＶＳＳＳＹ
配列番号２１ ＬＣＤＲ１（ＡＡ）（Kabat）ＲＡＳＱＳＶＳＳＳＹＬＡ
配列番号２２ ＬＣＤＲ２（ＡＡ）（ＩＭＧＴ）ＧＡＳ
配列番号２３ ＬＣＤＲ２（ＡＡ）（Kabat）ＧＡＳＳＲＡＴ
配列番号３７ ＬＣＤＲ３（ＡＡ）（ＩＭＧＴ）ＱＱＳＹＹＹＰＩＴ
配列番号３７ ＬＣＤＲ３（ＡＡ）（Kabat）ＱＱＳＹＹＹＰＩＴ
FS22-172-003-AA/FS28-256-021 mAb2の重鎖のアミノ酸配列及びｃＤＮＡ配列
配列番号１２３ 重鎖ＡＡ（ＬＡＬＡなし）

配列番号１２４ 重鎖ＤＮＡ（ＬＡＬＡなし）

配列番号１２５ 重鎖ＡＡ（ＬＡＬＡあり）

配列番号１２６ 重鎖ＤＮＡ（ＬＡＬＡあり）

配列番号７０ ＶＨドメインＡＡ

配列番号７１ ＶＨドメインＤＮＡ

配列番号４２ ＨＣＤＲ１（ＡＡ）（ＩＭＧＴ）ＧＦＴＦＴＨＴＹ
配列番号４３ ＨＣＤＲ１（ＡＡ）（Kabat）ＨＴＹＭＳ
配列番号３３ ＨＣＤＲ２（ＡＡ）（ＩＭＧＴ）ＩＳＰＴＹＳＴＴ
配列番号３４ ＨＣＤＲ２（ＡＡ）Kabat）ＮＩＳＰＴＹＳＴＴＮＹＡＤＳＶＫＧ
配列番号４４ ＨＣＤＲ３（ＡＡ）（ＩＭＧＴ）ＡＲＹＮＡＹＨＡＡＬＤＹ
配列番号４５ ＨＣＤＲ３（ＡＡ）（Kabat）ＹＮＡＹＨＡＡＬＤＹ
FS22-172-003-AA/FS28-256-021 mAb2の軽鎖のアミノ酸配列及びｃＤＮＡ配列
配列番号８２ 軽鎖ＡＡ

配列番号１２２ 軽鎖ＤＮＡ

配列番号６８ ＶＬドメインＡＡ

配列番号６９ ＶＬドメインＤＮＡ

配列番号２０ ＬＣＤＲ１（ＡＡ）（ＩＭＧＴ）ＱＳＶＳＳＳＹ
配列番号２１ ＬＣＤＲ１（ＡＡ）（Kabat）ＲＡＳＱＳＶＳＳＳＹＬＡ
配列番号２２ ＬＣＤＲ２（ＡＡ）（ＩＭＧＴ）ＧＡＳ
配列番号２３ ＬＣＤＲ２（ＡＡ）（Kabat）ＧＡＳＳＲＡＴ
配列番号４０ ＬＣＤＲ３（ＡＡ）（ＩＭＧＴ）ＱＱＨＮＱＹＰＮＴ
配列番号４０ ＬＣＤＲ３（ＡＡ）（Kabat）ＱＱＨＮＱＹＰＮＴ
FS22-172-003-AA/FS28-256-023 mAb2の重鎖のアミノ酸配列及びｃＤＮＡ配列
配列番号１３１ 重鎖ＡＡ（ＬＡＬＡなし）

配列番号１３２ 重鎖ＤＮＡ（ＬＡＬＡなし）

配列番号１３３ 重鎖ＡＡ（ＬＡＬＡあり）

配列番号１３４ 重鎖ＤＮＡ（ＬＡＬＡあり）

配列番号７４ ＶＨドメインＡＡ

配列番号７５ ＶＨドメインＤＮＡ


FS22-172-003-AA/FS28-256-023 mAb2の軽鎖のアミノ酸配列及びｃＤＮＡ配列
配列番号８２ 軽鎖ＡＡ

配列番号１２２ 軽鎖ＤＮＡ

配列番号６８ ＶＬドメインＡＡ

配列番号６９ ＶＬドメインＤＮＡ

配列番号２０ ＬＣＤＲ１（ＡＡ）（ＩＭＧＴ）ＱＳＶＳＳＳＹ
配列番号２１ ＬＣＤＲ１（ＡＡ）（Kabat）ＲＡＳＱＳＶＳＳＳＹＬＡ
配列番号２２ ＬＣＤＲ２（ＡＡ）（ＩＭＧＴ）ＧＡＳ
配列番号２３ ＬＣＤＲ２（ＡＡ）（Kabat）ＧＡＳＳＲＡＴ
配列番号４０ ＬＣＤＲ３（ＡＡ）（ＩＭＧＴ）ＱＱＨＮＱＹＰＮＴ
配列番号４０ ＬＣＤＲ３（ＡＡ）（Kabat）ＱＱＨＮＱＹＰＮＴ
FS22-172-003-AA/FS28-256-024 mAb2の重鎖のアミノ酸配列及びｃＤＮＡ配列
配列番号１２３ 重鎖ＡＡ（ＬＡＬＡなし）

配列番号１２４ 重鎖ＤＮＡ（ＬＡＬＡなし）

配列番号１２５ 重鎖ＡＡ（ＬＡＬＡあり）

配列番号１２６ 重鎖ＤＮＡ（ＬＡＬＡあり）

配列番号７０ ＶＨドメインＡＡ

配列番号７１ ＶＨドメインＤＮＡ

配列番号４２ ＨＣＤＲ１（ＡＡ）（ＩＭＧＴ）ＧＦＴＦＴＨＴＹ
配列番号４３ ＨＣＤＲ１（ＡＡ）（Kabat）ＨＴＹＭＳ
配列番号３３ ＨＣＤＲ２（ＡＡ）（ＩＭＧＴ）ＩＳＰＴＹＳＴＴ
配列番号３４ ＨＣＤＲ２（ＡＡ）Kabat）ＮＩＳＰＴＹＳＴＴＮＹＡＤＳＶＫＧ
配列番号４４ ＨＣＤＲ３（ＡＡ）（ＩＭＧＴ）ＡＲＹＮＡＹＨＡＡＬＤＹ
配列番号４５ ＨＣＤＲ３（ＡＡ）（Kabat）ＹＮＡＹＨＡＡＬＤＹ
FS22-172-003-AA/FS28-256-024 mAb2の軽鎖のアミノ酸配列及びｃＤＮＡ配列
配列番号８３ 軽鎖ＡＡ

配列番号９０ 軽鎖ＤＮＡ

配列番号７８ ＶＬドメインＡＡ

配列番号７９ ＶＬドメインＤＮＡ

配列番号２０ ＬＣＤＲ１（ＡＡ）（ＩＭＧＴ）ＱＳＶＳＳＳＹ
配列番号２１ ＬＣＤＲ１（ＡＡ）（Kabat）ＲＡＳＱＳＶＳＳＳＹＬＡ
配列番号２２ ＬＣＤＲ２（ＡＡ）（ＩＭＧＴ）ＧＡＳ
配列番号２３ ＬＣＤＲ２（ＡＡ）（Kabat）ＧＡＳＳＲＡＴ
配列番号４１ ＬＣＤＲ３（ＡＡ）（ＩＭＧＴ）ＱＱＡＬＧＹＰＨＴ
配列番号４１ ＬＣＤＲ３（ＡＡ）（Kabat）ＱＱＡＬＧＹＰＨＴ
FS22-172-003-AA/FS28-256-026 mAb2の重鎖のアミノ酸配列及びｃＤＮＡ配列
配列番号１３１
重鎖ＡＡ（ＬＡＬＡなし）

配列番号１３２ 重鎖ＤＮＡ（ＬＡＬＡなし）

配列番号１３３ 重鎖ＡＡ（ＬＡＬＡあり）

配列番号１３４ 重鎖ＤＮＡ（ＬＡＬＡあり）

配列番号７４ ＶＨドメインＡＡ

配列番号７５ ＶＨドメインＤＮＡ

配列番号５０ ＨＣＤＲ１（ＡＡ）（ＩＭＧＴ）ＧＦＴＦＴＱＴＹ
配列番号５１ ＨＣＤＲ１（ＡＡ）（Kabat）ＱＴＹＭＳ
配列番号３３ ＨＣＤＲ２（ＡＡ）（ＩＭＧＴ）ＩＳＰＴＹＳＴＴ
配列番号３４ ＨＣＤＲ２（ＡＡ）Kabat）ＮＩＳＰＴＹＳＴＴＮＹＡＤＳＶＫＧ
配列番号５２ ＨＣＤＲ３（ＡＡ）（ＩＭＧＴ）ＡＲＹＮＡＹＱＩＧＬＤＹ
配列番号５３ ＨＣＤＲ３（ＡＡ）（Kabat）ＹＮＡＹＱＩＧＬＤＹ
FS22-172-003-AA/FS28-256-026 mAb2の軽鎖のアミノ酸配列及びｃＤＮＡ配列
配列番号８３ 軽鎖ＡＡ

配列番号９０ 軽鎖ＤＮＡ

配列番号７８ ＶＬドメインＡＡ

配列番号７９ ＶＬドメインＤＮＡ

配列番号２０ ＬＣＤＲ１（ＡＡ）（ＩＭＧＴ）ＱＳＶＳＳＳＹ
配列番号２１ ＬＣＤＲ１（ＡＡ）（Kabat）ＲＡＳＱＳＶＳＳＳＹＬＡ
配列番号２２ ＬＣＤＲ２（ＡＡ）（ＩＭＧＴ）ＧＡＳ
配列番号２３ ＬＣＤＲ２（ＡＡ）（Kabat）ＧＡＳＳＲＡＴ
配列番号４１ ＬＣＤＲ３（ＡＡ）（ＩＭＧＴ）ＱＱＡＬＧＹＰＨＴ
配列番号４１ ＬＣＤＲ３（ＡＡ）（Kabat）ＱＱＡＬＧＹＰＨＴ
FS22-172-003-AA/FS28-256-027 mAb2の重鎖のアミノ酸配列及びｃＤＮＡ配列
配列番号１２３ 重鎖ＡＡ（ＬＡＬＡなし）

配列番号１２４ 重鎖ＤＮＡ（ＬＡＬＡなし）

配列番号１２５ 重鎖ＡＡ（ＬＡＬＡあり）

配列番号１２６ 重鎖ＤＮＡ（ＬＡＬＡあり）

配列番号７０ ＶＨドメインＡＡ

配列番号７１ ＶＨドメインＤＮＡ

配列番号４２ ＨＣＤＲ１（ＡＡ）（ＩＭＧＴ）ＧＦＴＦＴＨＴＹ
配列番号４３ ＨＣＤＲ１（ＡＡ）（Kabat）ＨＴＹＭＳ
配列番号３３ ＨＣＤＲ２（ＡＡ）（ＩＭＧＴ）ＩＳＰＴＹＳＴＴ
配列番号３４ ＨＣＤＲ２（ＡＡ）Kabat）ＮＩＳＰＴＹＳＴＴＮＹＡＤＳＶＫＧ
配列番号４４ ＨＣＤＲ３（ＡＡ）（ＩＭＧＴ）ＡＲＹＮＡＹＨＡＡＬＤＹ
配列番号４５ ＨＣＤＲ３（ＡＡ）（Kabat）ＹＮＡＹＨＡＡＬＤＹ
FS22-172-003-AA/FS28-256-027 mAb2の軽鎖のアミノ酸配列及びｃＤＮＡ配列
配列番号８４ 軽鎖ＡＡ

配列番号９１ 軽鎖ＤＮＡ

配列番号７６ ＶＬドメインＡＡ

配列番号７７ ＶＬドメインＤＮＡ

配列番号２０ ＬＣＤＲ１（ＡＡ）（ＩＭＧＴ）ＱＳＶＳＳＳＹ
配列番号２１ ＬＣＤＲ１（ＡＡ）（Kabat）ＲＡＳＱＳＶＳＳＳＹＬＡ
配列番号２２ ＬＣＤＲ２（ＡＡ）（ＩＭＧＴ）ＧＡＳ
配列番号２３ ＬＣＤＲ２（ＡＡ）（Kabat）ＧＡＳＳＲＡＴ
配列番号８０ ＬＣＤＲ３（ＡＡ）（ＩＭＧＴ）ＱＱＴＶＰＹＰＹＴ
配列番号８０ ＬＣＤＲ３（ＡＡ）（Kabat）ＱＱＴＶＰＹＰＹＴ
マウスｍＡｂ及びｍＡｂ２
FS28m-228 mAbの重鎖のアミノ酸配列
配列番号１３５ 重鎖ＡＡ（ＬＡＬＡあり）

FS28m-228 mAbの軽鎖のアミノ酸配列
配列番号１３６ 軽鎖ＡＡ

FS22m-063-AA/FS28m-228 mAb2の重鎖のアミノ酸配列
配列番号１３７ 重鎖ＡＡ（ＬＡＬＡあり）

FS22m-063-AA/FS28m-228 mAb2の軽鎖のアミノ酸配列
配列番号１３６ 軽鎖ＡＡ

G1AA/HelD1.3 mAbの重鎖のアミノ酸配列
配列番号１３８ 重鎖ＡＡ（ＬＡＬＡあり）

G1AA/HelD1.3 mAbの軽鎖のアミノ酸配列
配列番号１３９ 軽鎖ＡＡ

G1AA/SS1 mAb
配列番号１４０ 重鎖（ＬＡＬＡあり）

配列番号１４１ 軽鎖

ＭＳＬＮ－Ｈｉｓ－Ａｖｉ
メソテリン（ＭＰＦ及びＣ末端なし）（示した）；Ｈｉｓ及びＡｖｉタグ（示さず）
配列番号１４２ ヒト

配列番号１４３ カニクイザル

配列番号１４４ マウス

ＣＤ１３７－ｍＦｃ－Ａｖｉ及びＣＤ１３７－Ａｖｉ－Ｈｉｓ
（細胞外ドメインＣＤ１３７（示した）；ｍＦｃ、Ａｖｉタグ、Ｈｉｓタグ（示さず）
配列番号１４６ ヒト

配列番号１４７ カニクイザル

配列番号１４８ マウス

細胞発現抗原（ＣＤ１３７）
（細胞外ドメイン（斜体）；膜貫通及び細胞内ドメイン（太字））
配列番号１４９ ヒト

配列番号１５０ マウス

配列番号１５３ カニクイザル

過剰発現細胞株－膜結合成熟型のメソテリン（太字斜体で示す）
［Ｎ．Ｂ．ＭＰＦ及びプロペプチドは、メソテリン配列の前後に通常フォントで示す。いずれも膜結合成熟型のメソテリンには存在しない。］
ヒトＭＰＦ＋ＭＳＬＮ
配列番号１５１

マウスＭＰＦ＋ＭＳＬＮ
配列番号１４５

カニクイザルＭＰＦ＋ＭＳＬＮ
配列番号１５２

野生型ＣＨ２ドメインのアミノ酸配列
配列番号１５４ ＣＨ２（ＷＴ）

ＬＡＬＡ変異を含むＣＨ２ドメインのアミノ酸配列（ＬＡＬＡ変異は太字下線）
配列番号１５５ ＣＨ２（ＬＡＬＡ）

ＬＡＬＡ－ＰＡ変異を含むＣＨ２ドメインのアミノ酸配列（ＬＡＬＡ－ＰＡ変異は太字下線）
配列番号１５６ ＣＨ２（ＬＡＬＡ－ＰＡ）

FS22-172-003-AA/FS28-256-271、FS22-172-003-AA/FS28-256-272、及びFS22-172-003-AA/FS28-256-273 mAb2の軽鎖のアミノ酸配列及びｃＤＮＡ配列
配列番号８４ 軽鎖ＡＡ

配列番号９１ 軽鎖ＤＮＡ

配列番号７６ ＶＬドメインＡＡ

配列番号７７ ＶＬドメインＤＮＡ

配列番号２０ ＬＣＤＲ１（ＡＡ）（ＩＭＧＴ）ＱＳＶＳＳＳＹ
配列番号２１ ＬＣＤＲ１（ＡＡ）（Kabat）ＲＡＳＱＳＶＳＳＳＹＬＡ
配列番号２２ ＬＣＤＲ２（ＡＡ）（ＩＭＧＴ）ＧＡＳ
配列番号２３ ＬＣＤＲ２（ＡＡ）（Kabat）ＧＡＳＳＲＡＴ
配列番号８０ ＬＣＤＲ３（ＡＡ）（ＩＭＧＴ）ＱＱＴＶＰＹＰＹＴ
配列番号８０ ＬＣＤＲ３（ＡＡ）（Kabat）ＱＱＴＶＰＹＰＹＴ
FS22-172-003-AA/FS28-256-271 mAb2の重鎖のアミノ酸配列及びｃＤＮＡ配列
配列番号１ 重鎖ＡＡ（ＬＡＬＡなし）

配列番号２ 重鎖ＤＮＡ（ＬＡＬＡなし）

配列番号３ 重鎖ＡＡ（ＬＡＬＡあり）

配列番号４ 重鎖ＤＮＡ（ＬＡＬＡあり）

配列番号１７７ ＶＨドメインＡＡ


配列番号１７８ ＶＨドメインＤＮＡ


配列番号４２ ＨＣＤＲ１（ＡＡ）（ＩＭＧＴ）ＧＦＴＦＴＨＴＹ
配列番号４３ ＨＣＤＲ１（ＡＡ）（Kabat）ＨＴＹＭＳ
配列番号３３ ＨＣＤＲ２（ＡＡ）（ＩＭＧＴ）ＩＳＰＴＹＳＴＴ
配列番号５ ＨＣＤＲ２（ＡＡ）Kabat）ＡＩＳＰＴＹＳＴＴＮＹＡＤＳＶＫＧ
配列番号４４ ＨＣＤＲ３（ＡＡ）（ＩＭＧＴ）ＡＲＹＮＡＹＨＡＡＬＤＹ
配列番号４５ ＨＣＤＲ３（ＡＡ）（Kabat）ＹＮＡＹＨＡＡＬＤＹ
FS22-172-003-AA/FS28-256-272 mAb2の重鎖のアミノ酸配列及びｃＤＮＡ配列
配列番号６ 重鎖ＡＡ（ＬＡＬＡなし）

配列番号７ 重鎖ＤＮＡ（ＬＡＬＡなし）

配列番号１５８ 重鎖ＡＡ（ＬＡＬＡあり）

配列番号１５９ 重鎖ＤＮＡ（ＬＡＬＡあり）

配列番号７０ ＶＨドメインＡＡ

配列番号７１ ＶＨドメインＤＮＡ

配列番号４２ ＨＣＤＲ１（ＡＡ）（ＩＭＧＴ）ＧＦＴＦＴＨＴＹ
配列番号４３ ＨＣＤＲ１（ＡＡ）（Kabat）ＨＴＹＭＳ
配列番号３３ ＨＣＤＲ２（ＡＡ）（ＩＭＧＴ）ＩＳＰＴＹＳＴＴ
配列番号１６０ ＨＣＤＲ２（ＡＡ）Kabat）ＨＩＳＰＴＹＳＴＴＮＹＡＤＳＶＫＧ
配列番号４４ ＨＣＤＲ３（ＡＡ）（ＩＭＧＴ）ＡＲＹＮＡＹＨＡＡＬＤＹ
配列番号４５ ＨＣＤＲ３（ＡＡ）（Kabat）ＹＮＡＹＨＡＡＬＤＹ
FS22-172-003-AA/FS28-256-273 mAb2の重鎖のアミノ酸配列及びｃＤＮＡ配列
配列番号１６１ 重鎖ＡＡ（ＬＡＬＡなし）

配列番号１６２ 重鎖ＤＮＡ（ＬＡＬＡなし）

配列番号１６３ 重鎖ＡＡ（ＬＡＬＡあり）

配列番号１６４ 重鎖ＤＮＡ（ＬＡＬＡあり）

配列番号７０ ＶＨドメインＡＡ

配列番号７１ ＶＨドメインＤＮＡ

配列番号４２ ＨＣＤＲ１（ＡＡ）（ＩＭＧＴ）ＧＦＴＦＴＨＴＹ
配列番号４３ ＨＣＤＲ１（ＡＡ）（Kabat）ＨＴＹＭＳ
配列番号３３ ＨＣＤＲ２（ＡＡ）（ＩＭＧＴ）ＩＳＰＴＹＳＴＴ
配列番号１６５ ＨＣＤＲ２（ＡＡ）Kabat）ＳＩＳＰＴＹＳＴＴＮＹＡＤＳＶＫＧ
配列番号４４ ＨＣＤＲ３（ＡＡ）（ＩＭＧＴ）ＡＲＹＮＡＹＨＡＡＬＤＹ
配列番号４５ ＨＣＤＲ３（ＡＡ）（Kabat）ＹＮＡＹＨＡＡＬＤＹ
FS22m-063-AA/FS28m-228-010 mAb2の重鎖のアミノ酸配列
配列番号１６６ 重鎖ＡＡ（ＬＡＬＡあり）

FS22m-063-AA/FS28m-228-010 mAb2の軽鎖のアミノ酸配列
配列番号１３６ 軽鎖ＡＡ

FS22m-063-AA/HelD1.3 mAb2の重鎖及び軽鎖のアミノ酸配列
配列番号１６７ 重鎖ＡＡ（ＬＡＬＡあり）

配列番号１６８ 軽鎖ＡＡ

FS22-172-003-AA/FS28-185-002 mAb2の重鎖及び軽鎖のアミノ酸配列及びｃＤＮＡ配列
配列番号１６９ 重鎖ＡＡ（ＬＡＬＡあり）

配列番号１７０ 重鎖ＤＮＡ（ＬＡＬＡあり）

配列番号１７１ 軽鎖ＡＡ

配列番号１７２ 軽鎖ＤＮＡ

FS22-172-003-AA/FS28-185-003 mAb2の重鎖のアミノ酸配列及びｃＤＮＡ配列
配列番号１７３ 重鎖ＡＡ（ＬＡＬＡあり）

配列番号１７４ 重鎖ＤＮＡ（ＬＡＬＡあり）

配列番号１７５ 軽鎖ＡＡ

配列番号１７６ 軽鎖ＤＮＡ

ＷＴ Ｆｃａｂ ＣＨ３ドメインのアミノ酸配列（配列番号８１）
ＡＢ、ＣＤ、ＥＦループは下線が付されている

ＷＴ ＣＤループ配列
配列番号１５７
ＷＴ Ｆｃａｂ ＣＤループ－ＳＮＧＱＰＥＮＮＹ
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Claims (16)

  1. メソテリン（ＭＳＬＮ）及びＣＤ１３７に結合する抗体分子であって、
    （ａ）ＭＳＬＮの相補性決定領域（ＣＤＲ）ベースの抗原結合部位；及び
    （ｂ）当該抗体分子のＣＨ３ドメインに位置するＣＤ１３７抗原結合部位
    を含み、
    前記ＣＤＲベースの抗原結合部位が、
    （ｉ）それぞれ配列番号４３、５、４５、２１、２３、及び８０［FS28-256-271］；
    （ｉｉ）それぞれ配列番号１５、１７、２８、２１、２３及び２４［FS28-024-052］；
    （ｉｉｉ）それぞれ配列番号４３、３４、４５、２１、２３、及び４０［FS28-256-021］；
    （ｉｖ）それぞれ配列番号４３、３４、４５、２１、２３、及び３７［FS28-256-012］；
    （ｖ）それぞれ配列番号５１、３４、５３、２１、２３及び４０［FS28-256-023］；
    （ｖｉ）それぞれ配列番号４３、３４、４５、２１、２３及び４１［FS28-256-024］；
    （ｖｉｉ）それぞれ配列番号５１、３４、５３、２１、２３及び４１［FS28-256-026］；
    （ｖｉｉｉ）それぞれ配列番号４３、３４、４５、２１、２３、及び８０［FS28-256-027］；
    （ｉｘ）それぞれ配列番号３９、３４、３６、２１、２３、及び４０［FS28-256-001］；
    （ｘ）それぞれ配列番号３９、３４、３６、２１、２３、及び４１［FS28-256-005］；
    （ｘｉ）それぞれ配列番号４７、３４、４９、２１、２３及び３７［FS28-256-014］；
    （ｘｉｉ）それぞれ配列番号５１、３４、５３、２１、２３及び３７［FS28-256-018］；
    （ｘｉｉｉ）それぞれ配列番号３２、３４、３６、２１、２３及び３７［FS28-256］；
    （ｘｉｖ）それぞれ配列番号１５、１７、２６、２１、２３及び２４［FS28-024-051］；
    （ｘｖ）それぞれ配列番号１５、１７、３０、２１、２３及び２４［FS28-024-053］；又は
    （ｘｖｉ）それぞれ配列番号１５、１７、１９、２１、２３及び２４［FS28-024］
    に記載のＶＨ ＣＤＲ１、ＶＨ ＣＤＲ２、ＶＨ ＣＤＲ３、ＶＬ ＣＤＲ１、ＶＬ ＣＤＲ２、及びＶＬ ＣＤＲ３を含み；
    前記ＣＤＲ配列が、Ｋａｂａｔに従って定義され；
    前記ＣＤ１３７抗原結合部位が、それぞれ、前記ＣＨ３ドメインのＡＢ及びＥＦ構造ループに位置する第１の配列及び第２の配列を含み、前記第１及び第２の配列が、それぞれ配列番号１０及び１１［FS22-172-003］に記載の配列を有し、
    前記第１の配列が、前記ＣＨ３ドメインの１４位と１７位の間に位置し、前記第２の配列が、前記ＣＨ３ドメインの９１位と９９位の間に位置しており、
    前記ＣＨ３ドメインのアミノ酸残基の位置が、ImMunoGeneTics（ＩＭＧＴ）番号付けスキームに従って番号付けられている、
    ＭＳＬＮ及びＣＤ１３７に結合する抗体分子。
  2. 前記抗体分子が、それぞれ配列番号４３、５、４５、２１、２３、及び８０に記載のＶＨ ＣＤＲ１、ＶＨ ＣＤＲ２、ＶＨ ＣＤＲ３、ＶＬ ＣＤＲ１、ＶＬ ＣＤＲ２、及びＶＬ ＣＤＲ３［FS28-256-271］を含む、請求項１に記載の抗体分子。
  3. 前記抗体分子が、それぞれ配列番号１５、１７、２８、２１、２３及び２４に記載のＶＨ ＣＤＲ１、ＶＨ ＣＤＲ２、ＶＨ ＣＤＲ３、ＶＬ ＣＤＲ１、ＶＬ ＣＤＲ２、及びＶＬ ＣＤＲ３［FS28-024-052］を含む、請求項１に記載の抗体分子。
  4. 前記抗体分子が、配列番号８に記載のＣＨ３ドメイン配列［FS22-172-003］を含む、請求項１から３のいずれか一項に記載の抗体分子。
  5. 前記ＣＨ３ドメイン配列が、当該ＣＨ３ドメイン配列のＣ末端のすぐ隣に追加のリジン残基（Ｋ）を含む、請求項４に記載の抗体分子。
  6. 前記抗体分子が、Ｆｃγ受容体に結合しない、請求項１から５のいずれか一項に記載の抗体分子。
  7. 前記抗体分子が、可溶性ＭＳＬＮより高い親和性で固定化されたＭＳＬＮに結合する、請求項１から６のいずれか一項に記載の抗体分子。
  8. 前記抗体分子が、腫瘍細胞表面に結合したＭＳＬＮの存在下で免疫細胞上のＣＤ１３７を活性化することができる、請求項１から７のいずれか一項に記載の抗体分子。
  9. 免疫細胞上のＣＤ１３７への、及び腫瘍細胞表面に結合したＭＳＬＮへの前記抗体分子の結合が、前記免疫細胞上のＣＤ１３７のクラスター化を引き起こす、請求項１から８のいずれか一項に記載の抗体分子。
  10. 請求項１から９のいずれか一項に記載の抗体分子をコードする、１つ又は複数の核酸分子。
  11. 請求項１０に記載の１つ又は複数の核酸分子を含む、１つ又は複数のベクター。
  12. 請求項１０に記載の１つ又は複数の核酸分子、又は請求項１１に記載の１つ又は複数のベクターを含む、組換え宿主細胞。
  13. 前記抗体分子の産生条件下で請求項１２の組換え宿主細胞を培養することを含む、請求項１から９のいずれか一項に記載の抗体分子を産生する方法。
  14. 請求項１から９のいずれか一項に記載の抗体分子と、薬学的に許容される賦形剤とを含む、医薬組成物。
  15. 請求項１から９のいずれか一項に記載の抗体分子を含む、個体における癌の処置のための医薬組成物。
  16. さらに、第２の治療剤を含む、請求項１５に記載の医薬組成物。
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