JP7804584B2 - ポリ（３－ヒドロキシアルカノエート）の製造方法 - Google Patents
ポリ（３－ヒドロキシアルカノエート）の製造方法Info
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Description
本発明は、ポリ（３－ヒドロキシアルカノエート）産生微生物を培養することによるポリ（３－ヒドロキシアルカノエート）の製造方法に関する。
ポリ（３－ヒドロキシアルカノエート）（以下ではＰＨＡと称する場合がある）は微生物が菌体内に貯蔵するバイオポリエステルである。プラスチック材料として利用されており、使用後は生分解性を有するため、環境に与える負荷が低い材料として近年注目されている。
ＰＨＡの製造には、ＰＨＡ産生能力を有する微生物を培養して当該微生物にＰＨＡを蓄積させる方法が行なわれている。その培養の際には、当該微生物によって好適に資化される炭素源を与えることが必要である。その炭素源の代表的なものとして、糖質、油脂、遊離脂肪酸などが挙げられる。
例えば、特許文献１では、パーム油を炭素源として用いて、ＰＨＡ産生能力を有する微生物を培養することが記載されている。
パーム油を炭素源として用いてＰＨＡ産生微生物を培養すると、ＰＨＡを効率良く製造できることが知られている。しかしながら、パーム油は比較的高価な油脂であるため、パーム油以外の入手しやすい油脂を炭素源として用いてＰＨＡを製造することが求められている。
そこで、各種油脂を炭素源として用いたＰＨＡ産生微生物の培養を試みたところ、パーム油と同程度のＰＨＡ生産速度を達成できる油脂と、パーム油よりも明らかにＰＨＡ生産速度が遅くなる油脂があることが判明した。そして、ＰＨＡの生産速度が遅くなる油脂は、概して、油脂の構成脂肪酸中の不飽和脂肪酸の含有割合が比較的高い油脂であることが判明した。
このような不飽和脂肪酸の含有割合が比較的高い油脂は、例えば菜種油など、食品用途で広く使用されており、使用後の食用油は多量に廃棄されている。そのような食用油を有効利用する観点から、不飽和脂肪酸の含有割合が比較的高い油脂をＰＨＡ製造における炭素源として使用することが望まれる。
本発明は、以上に鑑み、ＰＨＡ産生微生物を培養してＰＨＡを産生させるにあたって、不飽和脂肪酸の含有割合が比較的高い油脂を炭素源として使用しながら、高いＰＨＡ生産速度を達成することを目的とする。
本発明者らは、ＰＨＡ産生微生物の炭素源として、パーム油など不飽和脂肪酸の含有割合が比較的低い油脂Ａと、菜種油など不飽和脂肪酸の含有割合が比較的高い油脂Ｂの双方を利用し、かつ、培養の初期の段階では油脂Ａを使用することで、油脂Ｂを利用しているにも関わらず、油脂Ａの単独使用と同程度の高いレベルのＰＨＡ生産速度を達成できることを見出し、本発明に至った。
すなわち本発明は、炭素源の存在下でポリ（３－ヒドロキシアルカノエート）産生微生物を培養することによるポリ（３－ヒドロキシアルカノエート）の製造方法であって、前記培養において、炭素源として油脂Ａ及び油脂Ｂを使用し、前記培養全体で油脂Ａと油脂Ｂの合計使用量に対する油脂Ｂの使用量は１０重量％以上である、製造方法に関する。
油脂Ａ：前記ポリ（３－ヒドロキシアルカノエート）産生微生物中のポリ（３－ヒドロキシアルカノエート）蓄積量が１６重量％に到達するまで使用する油脂の総体を指し、油脂Ａ全体において、構成脂肪酸である不飽和脂肪酸の平均含有割合が２５重量％以上７５重量％未満である。
油脂Ｂ：油脂Ｂにおける構成脂肪酸である不飽和脂肪酸の含有割合は、油脂Ａ全体における不飽和脂肪酸の前記平均含有割合より高い。
好ましくは、前記ポリ（３－ヒドロキシアルカノエート）産生微生物中のポリ（３－ヒドロキシアルカノエート）蓄積量が１６重量％を超えて８５重量％未満のある時点以降に使用する炭素源は、油脂Ｂである。
好ましくは、油脂Ｂは、不飽和脂肪酸の含有割合が６０重量％以上９８重量％以下の油脂である。
好ましくは、前記培養全体で油脂Ａと油脂Ｂの合計使用量に対する油脂Ｂの使用量は４０重量％以上である。
好ましくは、前記ポリ（３－ヒドロキシアルカノエート）産生微生物の培養を、前記ポリ（３－ヒドロキシアルカノエート）産生微生物中のポリ（３－ヒドロキシアルカノエート）蓄積量が８０重量％以上に達するまで実施する。
好ましくは、前記ポリ（３－ヒドロキシアルカノエート）産生微生物を含む培地に、油脂Ａ及び／又は油脂Ｂを連続添加しながら培養を行う。
好ましくは、前記ポリ（３－ヒドロキシアルカノエート）産生微生物を含む培地に、油脂Ａを連続添加しながら培養を行った後、油脂Ｂを連続添加しながら培養を継続する。
好ましくは、前記ポリ（３－ヒドロキシアルカノエート）は、少なくとも３－ヒドロキシブチレート単位を含む。
好ましくは、前記ポリ（３－ヒドロキシアルカノエート）は、３－ヒドロキシブチレート単位の単独重合体、又は、３－ヒドロキシブチレート単位と他のヒドロキシアルカノエート単位との共重合体を含む。より好ましくは、前記他のヒドロキシアルカノエート単位が、３－ヒドロキシヘキサノエート単位である。
好ましくは、前記ポリ（３－ヒドロキシアルカノエート）産生微生物が細菌である。より好ましくは、前記ポリ（３－ヒドロキシアルカノエート）産生微生物がカプリアビダス属に属する細菌である。
油脂Ａ：前記ポリ（３－ヒドロキシアルカノエート）産生微生物中のポリ（３－ヒドロキシアルカノエート）蓄積量が１６重量％に到達するまで使用する油脂の総体を指し、油脂Ａ全体において、構成脂肪酸である不飽和脂肪酸の平均含有割合が２５重量％以上７５重量％未満である。
油脂Ｂ：油脂Ｂにおける構成脂肪酸である不飽和脂肪酸の含有割合は、油脂Ａ全体における不飽和脂肪酸の前記平均含有割合より高い。
好ましくは、前記ポリ（３－ヒドロキシアルカノエート）産生微生物中のポリ（３－ヒドロキシアルカノエート）蓄積量が１６重量％を超えて８５重量％未満のある時点以降に使用する炭素源は、油脂Ｂである。
好ましくは、油脂Ｂは、不飽和脂肪酸の含有割合が６０重量％以上９８重量％以下の油脂である。
好ましくは、前記培養全体で油脂Ａと油脂Ｂの合計使用量に対する油脂Ｂの使用量は４０重量％以上である。
好ましくは、前記ポリ（３－ヒドロキシアルカノエート）産生微生物の培養を、前記ポリ（３－ヒドロキシアルカノエート）産生微生物中のポリ（３－ヒドロキシアルカノエート）蓄積量が８０重量％以上に達するまで実施する。
好ましくは、前記ポリ（３－ヒドロキシアルカノエート）産生微生物を含む培地に、油脂Ａ及び／又は油脂Ｂを連続添加しながら培養を行う。
好ましくは、前記ポリ（３－ヒドロキシアルカノエート）産生微生物を含む培地に、油脂Ａを連続添加しながら培養を行った後、油脂Ｂを連続添加しながら培養を継続する。
好ましくは、前記ポリ（３－ヒドロキシアルカノエート）は、少なくとも３－ヒドロキシブチレート単位を含む。
好ましくは、前記ポリ（３－ヒドロキシアルカノエート）は、３－ヒドロキシブチレート単位の単独重合体、又は、３－ヒドロキシブチレート単位と他のヒドロキシアルカノエート単位との共重合体を含む。より好ましくは、前記他のヒドロキシアルカノエート単位が、３－ヒドロキシヘキサノエート単位である。
好ましくは、前記ポリ（３－ヒドロキシアルカノエート）産生微生物が細菌である。より好ましくは、前記ポリ（３－ヒドロキシアルカノエート）産生微生物がカプリアビダス属に属する細菌である。
本発明によれば、ＰＨＡ産生微生物を培養してＰＨＡを産生させるにあたって、不飽和脂肪酸の含有割合が比較的高い油脂を炭素源として使用しながら、高いＰＨＡ生産速度を達成することができる。
以下に、本発明の具体的な実施態様を詳細に説明するが、本発明はこれら実施態様に限定されるものではない。
本実施形態は、炭素源の存在下でＰＨＡ産生微生物を培養することによるＰＨＡの製造方法に関する。
本開示におけるＰＨＡとは、微生物が生産し得るポリ（３－ヒドロキシアルカノエート）である限り特に限定されないが、炭素数４～１６の３－ヒドロキシアルカン酸から選択される１種のモノマーの単独重合体、炭素数４～１６の３－ヒドロキシアルカン酸から選択される少なくとも１種のモノマーとその他のヒドロキシアルカン酸（例えば、炭素数４～１６の４－ヒドロキシアルカン酸、乳酸等）の共重合体、及び、炭素数４～１６の３－ヒドロキシアルカン酸から選択される２種以上のモノマーの共重合体が好ましい。具体的には、３－ヒドロキシ酪酸（略称：３ＨＢ）のホモポリマーであるＰ（３ＨＢ）、３ＨＢと３－ヒドロキシ吉草酸（略称：３ＨＶ）の共重合体Ｐ（３ＨＢ－ｃｏ－３ＨＶ）（略称：ＰＨＢＶ）、３ＨＢと３－ヒドロキシヘキサン酸（略称：３ＨＨ）の共重合体Ｐ（３ＨＢ－ｃｏ－３ＨＨ）（略称：ＰＨＢＨ）、３ＨＢと４－ヒドロキシ酪酸（略称：４ＨＢ）の共重合体Ｐ（３ＨＢ－ｃｏ－４ＨＢ）、並びに、乳酸（略称：ＬＡ）を構成成分として含むＰＨＡ、例えば３ＨＢとＬＡの共重合体Ｐ（ＬＡ－ｃｏ－３ＨＢ）などが挙げられるが、これらに限定されない。
ＰＨＡは、ポリマーとしての応用範囲が広いという観点から、少なくとも３－ヒドロキシブチレート単位を含むＰＨＡが好ましく、３－ヒドロキシブチレート単位の単独重合体、又は、３－ヒドロキシブチレート単位と他のヒドロキシアルカノエート単位との共重合体がより好ましい。前記共重合体のなかでも、ＰＨＢＶ、ＰＨＢＨがさらに好ましく、ＰＨＢＨが特に好ましい。
なお、生産されるＰＨＡの種類は、使用する微生物の保有するあるいは別途導入されたＰＨＡ合成酵素遺伝子の種類や、その合成に関与する代謝系の遺伝子の種類、培養条件などによって適宜選択しうる。
ＰＨＡ産生微生物は、ＰＨＡ産生能を有する微生物である限り特に限定されず、自然界で見出される微生物であってもよいし、突然変異体または形質転換体であってもよい。具体的には、カピリアビダス・ネケータ（Ｃｕｐｒｉａｖｉｄｕｓ ｎｅｃａｔｏｒ）等のカピリアビダス属、アルカリゲネス・ラタス（Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ ｌａｔａｓ）等のアルカリゲネス属、シュードモナス・プチダ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｐｕｔｉｄａ）、シュードモナス・フルオレッセンス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ）、シュードモナス・エルギノーサ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）、シュードモナス・レジノボランス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｒｅｓｉｎｏｖｏｒａｎｓ）、シュードモナス・オレオボランス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｏｌｅｏｖｏｒａｎｓ）等のシュードモナス属、バチルス・メガテリウム（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ）等のバチルス属、アゾトバクター属、ノカルディア属、アエロモナス・キャビエ（Ａｅｒｏｍｏｎａｓ ｃａｖｉａｅ）、アエロモナス・ハイドロフィラ（Ａｅｒｏｍｏｎａｓｏ ｈｙｄｒｏｐｈｉｌａ）等のアエロモナス属、ラルストニア（Ｒａｌｓｔｏｎｉａ）属、ワウテルシア（Ｗａｕｔｅｒｓｉａ）属、コマモナス（Ｃｏｍａｍｏｎａｓ）属などが挙げられる（Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｒｅｖｉｅｗｓ、４５０－４７２項、１９９０年）。遺伝子工学的な手法を用いて、ＰＨＡ合成酵素遺伝子等を導入することにより、人為的にＰＨＡを生産させる改変を施した生物細胞を用いることもできる。例えばエシェリキア（Ｅｓｈｅｒｉｃｈｉａ）属等のグラム陰性の細菌、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属等のグラム陽性の細菌、サッカロマイセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属、ヤロウィア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）属、キャンディダ（Ｃａｎｄｉｄａ）属等の酵母類、植物などの高等生物細胞も利用できる。多量のＰＨＡを蓄積可能であるため、細菌が好ましく、カピリアビダス属に属する細菌が特に好ましい。
形質転換により導入されるＰＨＡ合成酵素遺伝子としては特に限定されず、アエロモナス・キヤビエ、Ａｅｒｏｍｏｎａｓ ｈｙｄｒｏｐｈｉｌａ、Ｐｓｅｕｒｏｍｏｎａｓ ＳＰ ６１－３、Ｃｕｐｒｉａｖｉｄｕｓ ｎｅｃａｔｏｒ由来のＰＨＡ合成酵素遺伝子や、それらの改変体などが挙げられる。前記改変体とは、１以上のアミノ酸残基が欠失、付加、挿入、又は置換されたアミノ酸配列を有するＰＨＡ合成酵素をコードする塩基配列のことをいう。
ＰＨＡ産生微生物を炭素源の存在下で培養することで、菌体内にＰＨＡを蓄積させることができる。前記炭素源として油脂を使用する。但し、油脂以外の炭素源を油脂と併用してもよい。
前記油脂は、構成脂肪酸とグリセリンとのエステル化合物であるトリグリセリドを含む。構成脂肪酸は、１つ以上の炭素－炭素不飽和結合を有する不飽和脂肪酸、及び／又は、炭素－炭素不飽和結合を持たない飽和脂肪酸を含み得る。前記油脂としては、動物性油脂、植物性油脂、それらの混合油脂、エステル交換油、分別油などを使用でき、特に限定されない。植物性油脂の具体例としては、菜種油、ひまわり油、大豆油、オリーブ油、コーン油、パーム油、パーム核油、綿実油、ゴマ油、ナッツ油、ヤトロファ油、米油などが挙げられる。動物性油脂の具体例としては、ラードなどが挙げられる。これらを単独で、又は、２種以上を混合して使用することができる。
前記油脂の構成脂肪酸は、炭素数２～４の短鎖脂肪酸、炭素数５～１２の中鎖脂肪酸、炭素数１２以上の長鎖脂肪酸を含む。中でも、ラウリン酸、ミリスチン酸、ミリストレイン酸、ペンタデカン酸、パルミチン酸、マルガリン酸、ステアリン酸、オレイン酸、リノール酸、エルカ酸、及びリノレン酸からなる群より選択される少なくとも３種類の構成脂肪酸を含む油脂が好ましい。更には、パルミトレイン酸、ヘプタデカン酸、オレイン酸、リノール酸、リノレン酸、及びエルカ酸からなる群より選択される少なくとも２種類の構成脂肪酸を含む油脂が特に好ましい。
本実施形態では、炭素源として使用する油脂として、構成脂肪酸中の不飽和脂肪酸の含有割合が互いに異なる２種類の油脂を使用する。２種類の油脂を、油脂Ａと、油脂Ｂに分類し、それぞれ以下のように定義する。
油脂Ａ：ポリ（３－ヒドロキシアルカノエート）産生微生物中のポリ（３－ヒドロキシアルカノエート）蓄積量が１６重量％に到達するまで使用する油脂の総体を指し、油脂Ａ全体において、構成脂肪酸である不飽和脂肪酸の平均含有割合が２５重量％以上７５重量％未満である。
油脂Ｂ：油脂Ｂにおける構成脂肪酸である不飽和脂肪酸の含有割合は、油脂Ａ全体における不飽和脂肪酸の前記平均含有割合より高い。
油脂Ａ：ポリ（３－ヒドロキシアルカノエート）産生微生物中のポリ（３－ヒドロキシアルカノエート）蓄積量が１６重量％に到達するまで使用する油脂の総体を指し、油脂Ａ全体において、構成脂肪酸である不飽和脂肪酸の平均含有割合が２５重量％以上７５重量％未満である。
油脂Ｂ：油脂Ｂにおける構成脂肪酸である不飽和脂肪酸の含有割合は、油脂Ａ全体における不飽和脂肪酸の前記平均含有割合より高い。
尚、不飽和脂肪酸の含有割合は、油脂を構成する脂肪酸の総重量に対して不飽和脂肪酸重量が占める割合であり、構成される脂肪酸重量を測定することで算出できる。測定方法は、油脂を強アルカリによりケン化し、遊離脂肪酸とした後、揮発性を高めるために脂肪酸のカルボキシル基をメチルエステル化することで、ガスクロマトグラフィーにより揮発分離し、飽和脂肪酸、不飽和脂肪酸を同定できる。
（油脂Ａ）
油脂Ａは、ポリ（３－ヒドロキシアルカノエート）産生微生物中のポリ（３－ヒドロキシアルカノエート）蓄積量が１６重量％に到達するまで使用する油脂の総体を指すものであり、油脂Ａ全体における不飽和脂肪酸の平均含有割合が２５重量％以上７５重量％未満の範囲内にある。当該不飽和脂肪酸の平均含有割合は、３０重量％以上７０重量％以下であることが好ましく、４０重量％以上６５重量％以下であることがより好ましく、５０重量％以上６０重量％以下であることがさらに好ましい。
油脂Ａは、ポリ（３－ヒドロキシアルカノエート）産生微生物中のポリ（３－ヒドロキシアルカノエート）蓄積量が１６重量％に到達するまで使用する油脂の総体を指すものであり、油脂Ａ全体における不飽和脂肪酸の平均含有割合が２５重量％以上７５重量％未満の範囲内にある。当該不飽和脂肪酸の平均含有割合は、３０重量％以上７０重量％以下であることが好ましく、４０重量％以上６５重量％以下であることがより好ましく、５０重量％以上６０重量％以下であることがさらに好ましい。
油脂Ａは、油脂Ａ全体におけるパルミチン酸の平均含有割合が２０重量％以上６５重量％以下であることが好ましく、２５重量％以上６０重量％以下であることがより好ましく、３０重量％以上５５重量％以下であることがさらに好ましい。
油脂Ａは、前記不飽和脂肪酸の平均含有割合を満足する限り、例えば、植物性油脂など入手可能な油脂１種類から構成されるものであってもよいし、入手可能な油脂２種類以上の油脂から構成されるものであってもよい。単独で油脂Ａに該当する油脂の例として、パーム油や、ラードを挙げることができる。
油脂Ａが２種類以上の油脂から構成される場合、油脂Ａ全体として、前述した不飽和脂肪酸の平均含有割合を満足すればよい。油脂Ａを構成する個々の油脂における不飽和脂肪酸の含有割合は特に限定されず、２５重量％以上７５重量％未満の範囲内になくてもよい。また、油脂Ａが２種類以上の油脂から構成される場合、２種類以上の油脂は混合して培地に添加してもよいし、また、混合せずに、同時に又は順次、培地に添加してもよい。
尚、本実施形態における「ポリ（３－ヒドロキシアルカノエート）産生微生物の培養」とは、ポリ（３－ヒドロキシアルカノエート）産生微生物にポリ（３－ヒドロキシアルカノエート）を高濃度に蓄積させることを目的に行う最終段階の「本培養」を指す。「本培養」の前に行う「前培養」及び「種母培養」は、本実施形態における「培養」には含まれない。そのため、「前培養」及び「種母培養」で使用する炭素源は、「油脂Ａ」に包含されない。
（油脂Ｂ）
油脂Ｂは、ポリ（３－ヒドロキシアルカノエート）産生微生物中のポリ（３－ヒドロキシアルカノエート）蓄積量が１６重量％を超えたある時点以降に使用される炭素源であって、油脂Ｂにおける不飽和脂肪酸の含有割合が、油脂Ａ全体における不飽和脂肪酸の平均含有割合より高いものを指す。油脂Ｂの不飽和脂肪酸の含有割合（重量％）と油脂Ａ全体における不飽和脂肪酸の平均含有割合（重量％）の差分は、特に限定されないが、油脂Ａと油脂Ｂを併用することによる効果をより良く達成する観点から、５重量％以上であることが好ましく、１０重量％以上であることがより好ましく、２０重量％以上であることが更に好ましい。
油脂Ｂは、ポリ（３－ヒドロキシアルカノエート）産生微生物中のポリ（３－ヒドロキシアルカノエート）蓄積量が１６重量％を超えたある時点以降に使用される炭素源であって、油脂Ｂにおける不飽和脂肪酸の含有割合が、油脂Ａ全体における不飽和脂肪酸の平均含有割合より高いものを指す。油脂Ｂの不飽和脂肪酸の含有割合（重量％）と油脂Ａ全体における不飽和脂肪酸の平均含有割合（重量％）の差分は、特に限定されないが、油脂Ａと油脂Ｂを併用することによる効果をより良く達成する観点から、５重量％以上であることが好ましく、１０重量％以上であることがより好ましく、２０重量％以上であることが更に好ましい。
油脂Ｂの不飽和脂肪酸の含有割合は、これと併用する特定の油脂Ａ全体における不飽和脂肪酸の平均含有割合との関係において定義されており、具体的な数値は限定されない。油脂Ｂの不飽和脂肪酸の含有割合の具体的な数値は、これと併用する特定の油脂Ａ全体における不飽和脂肪酸の平均含有割合より高い数値である限り特に限定されず、７５重量％以上であってもよいし、２５重量％以上７５重量％未満の範囲内にあってもよい。例えば、後述する実施例８で示すように、不飽和脂肪酸の含有割合が５８重量％である油脂Ａに対し、不飽和脂肪酸の含有割合が６６重量％である油脂Ｂを使用することができる。
好適な一態様では、油脂Ｂの不飽和脂肪酸の含有割合は、６０重量％以上９８重量％以下であることが好ましく、６５重量％以上９６重量％以下であることがより好ましく、７０重量％以上９５重量％以下であることがさらに好ましく、７５重量％以上９４重量％以下であることが特に好ましい。
油脂Ｂは、その不飽和脂肪酸の含有割合が油脂Ａ全体における不飽和脂肪酸の平均含有割合より高い限り、例えば、植物性油脂など入手可能な油脂１種類から構成されるものであってもよいし、入手可能な油脂２種類以上から構成されるものであってもよい。油脂Ｂに該当する油脂の例として、菜種油を挙げることができる。また、油脂Ｂは、前記要件を満足する限り、廃棄された食用油等であってもよい。
本発明者らの検討によって、不飽和脂肪酸の含有割合が比較的高い油脂Ｂは、これを炭素源として単独で使用してＰＨＡ産生微生物を培養すると、ＰＨＡ生産速度が遅くなることが判明している。
しかし、本実施形態では特定条件で油脂Ａと油脂Ｂを併用することにより、良好なＰＨＡ生産速度を達成することができる。このため、油脂Ｂを、ＰＨＡ産生微生物の炭素源として有効利用することが可能となる。油脂Ｂを有効利用する観点から、油脂Ｂの使用割合は多いほど好ましい。具体的には、前記培養全体で使用する油脂Ａと油脂Ｂの合計使用量に対する油脂Ｂの使用量は１０重量％以上であり、４０重量％以上であってもよく、６０重量％以上であってもよく、８０重量％以上であってもよい。油脂Ｂの使用量の上限値は特に限定されないが、９７重量％以下であることが好ましく、９５重量％以下がより好ましく、９０重量％以下がさらに好ましい。以上のように高い割合で油脂Ｂを使用しても、油脂Ａを単独使用した場合と同等レベルの高いＰＨＡ生産速度を達成することができる。
しかし、本実施形態では特定条件で油脂Ａと油脂Ｂを併用することにより、良好なＰＨＡ生産速度を達成することができる。このため、油脂Ｂを、ＰＨＡ産生微生物の炭素源として有効利用することが可能となる。油脂Ｂを有効利用する観点から、油脂Ｂの使用割合は多いほど好ましい。具体的には、前記培養全体で使用する油脂Ａと油脂Ｂの合計使用量に対する油脂Ｂの使用量は１０重量％以上であり、４０重量％以上であってもよく、６０重量％以上であってもよく、８０重量％以上であってもよい。油脂Ｂの使用量の上限値は特に限定されないが、９７重量％以下であることが好ましく、９５重量％以下がより好ましく、９０重量％以下がさらに好ましい。以上のように高い割合で油脂Ｂを使用しても、油脂Ａを単独使用した場合と同等レベルの高いＰＨＡ生産速度を達成することができる。
また、培養全体で使用する油脂Ａと油脂Ｂの合計使用量に対する油脂Ａの使用量は、特に限定されないが、ＰＨＡ生産速度の改善を達成する観点から、３重量％以上であることが好ましく、５重量％以上がより好ましく、１０重量％以上がさらに好ましい。前記油脂Ａの使用量の上限値は、９０重量％以下であり、６０重量％以下であってもよく、４０重量％以下であってもよく、２０重量％以下であってもよい。
（炭素源の使用態様）
本実施形態では、ＰＨＡ産生微生物の培養において、少なくとも、ポリ（３－ヒドロキシアルカノエート）蓄積量が１６重量％に到達するまでは、炭素源として、不飽和脂肪酸の含有割合が比較的低い油脂Ａを使用する。その後、ポリ（３－ヒドロキシアルカノエート）蓄積量が１６重量％を超えたある時点以降は、炭素源として、不飽和脂肪酸の含有割合が比較的高い油脂Ｂを使用する。
本実施形態では、ＰＨＡ産生微生物の培養において、少なくとも、ポリ（３－ヒドロキシアルカノエート）蓄積量が１６重量％に到達するまでは、炭素源として、不飽和脂肪酸の含有割合が比較的低い油脂Ａを使用する。その後、ポリ（３－ヒドロキシアルカノエート）蓄積量が１６重量％を超えたある時点以降は、炭素源として、不飽和脂肪酸の含有割合が比較的高い油脂Ｂを使用する。
このように培養の初期の段階で油脂Ａを使用し、その後、油脂Ｂを使用することで、単独使用ではＰＨＡ生産速度が遅くなる油脂Ｂを利用しながらも、高レベルのＰＨＡ生産速度を達成することができる。そのメカニズムは不明であるが、培養の初期の段階ではＰＨＡの蓄積よりもＰＨＡ産生微生物の増殖が優先し、この細胞増殖段階では、不飽和脂肪酸の含有割合が比較的低い油脂Ａのほうが炭素源として適しているが、増殖がある程度進行しＰＨＡの蓄積が優先するようになると、炭素源の種類の影響は軽減され、油脂Ｂも炭素源として有効であるためと推測される。
ＰＨＡ蓄積量が１６重量％を超えた後、ある程度の時間は、油脂Ａと同じ不飽和脂肪酸の含有割合を有する油脂を継続使用することが好ましいが、いずれかの時点で、不飽和脂肪酸の含有割合が比較的高い油脂Ｂに変更する。好適な一態様によると、ＰＨＡ産生微生物中のＰＨＡ蓄積量が１６重量％を超えて８５重量％未満のある時点以降に使用する炭素源は、油脂Ｂであることが好ましい。これにより、単独使用ではＰＨＡ生産速度が遅くなる油脂Ｂを、ＰＨＡ産生微生物を培養する際の炭素源として有効利用することができる。前記ＰＨＡ産生微生物中のＰＨＡ蓄積量は、２０重量％以上８０重量％以下が好ましく、２５重量％以上５０重量％以下がより好ましく、２５重量％以上４５重量％以下がさらに好ましく、３０重量％以上４０重量％以下が特に好ましい。
尚、ＰＨＡ産生微生物中のＰＨＡ蓄積量は、培養液から一定量を回収し、油脂を取り除くため有機溶剤と混合後、水で洗浄して乾燥させて得た乾燥菌体の重量と、同量の培養液から回収したＰＨＡの重量を測定し、以下の式で算出することが可能である。
ＰＨＡ蓄積量（％）＝［一定量の培養液から回収したＰＨＡ重量（ｇ）］／［一定量の培養液から得られる乾燥菌体重量（ｇ）］×１００
ＰＨＡ蓄積量（％）＝［一定量の培養液から回収したＰＨＡ重量（ｇ）］／［一定量の培養液から得られる乾燥菌体重量（ｇ）］×１００
本実施形態の好適な一態様によると、油脂Ａの存在下で培養を開始し、培養の途中で（ＰＨＡ産生微生物中のＰＨＡ蓄積量が最終的なレベルに到達する前に）、炭素源の種類を変更して、油脂Ｂの存在下で培養を継続し、ＰＨＡ産生微生物中のＰＨＡ蓄積量が最終的なレベルに到達した時に培養を終了することが好ましい。このように培養の初期では油脂Ａを炭素源として利用し、培養の途中から油脂Ｂを炭素源として利用することで、単独使用ではＰＨＡ生産速度が遅くなる油脂Ｂを炭素源として利用しているにも関わらず、高レベルのＰＨＡ生産速度を容易に達成することができる。
前記好適な一態様において、炭素源を油脂Ａから油脂Ｂに変更するタイミングは特に限定されず、ＰＨＡ産生微生物中のＰＨＡ蓄積量や、油脂Ｂの使用割合に応じて適宜決定することができるが、例えば、ＰＨＡ産生微生物中のＰＨＡ蓄積量が１６重量％を超えて８５重量％未満のある時点であってよく、２０重量％以上８０重量％以下のある時点が好ましく、２５重量％以上５０重量％以下のある時点がより好ましく、３０重量％以上４５重量％以下のある時点がさらに好ましく、３０重量％以上４０重量％以下の範囲内にある時点が特に好ましい。このようなタイミングで炭素源の種類を変更することによって、油脂Ｂの使用量を増加させつつ、高いＰＨＡ生産速度を達成することかできる。
培養を終了する時のＰＨＡ産生微生物中のＰＨＡ蓄積量は特に限定されず、適宜決定すればよいが、８０重量％以上であることが好ましく、９０重量％以上であることがより好ましい。
ＰＨＡ産生微生物を含む培地への油脂Ａ又は油脂Ｂの添加方法は、一括添加であってもよく、連続添加であってもよいが、連続添加であることが好ましい。即ち、ＰＨＡ産生微生物の培養は、ＰＨＡ産生微生物を含む培地に、油脂Ａ及び／又は油脂Ｂを連続添加しながら行うことが好ましい。ここで「連続添加」とは、経時的に途切れることなく継続して添加する態様の他、断続的に、一時的な休止期間を置きながら繰り返し添加する態様も含む。
連続添加の具体的な一態様によると、ＰＨＡ産生微生物を含む培地に、油脂Ａを連続添加して分散させつつ培養を行った後、炭素源の種類を変更して、油脂Ｂを連続添加して分散させつつ培養を継続することが好ましい。
（培地）
ＰＨＡ産生微生物の培養で使用する培地としては、微生物の成長増殖に資する栄養源を含んだ液体の培地であれば良い。上述した炭素源の他、炭素源以外の窒素源、無機塩類、その他の有機栄養源を含む液体にＰＨＡ産生微生物を混合して、攪拌、振とうなどにより分散させることが好ましい。
ＰＨＡ産生微生物の培養で使用する培地としては、微生物の成長増殖に資する栄養源を含んだ液体の培地であれば良い。上述した炭素源の他、炭素源以外の窒素源、無機塩類、その他の有機栄養源を含む液体にＰＨＡ産生微生物を混合して、攪拌、振とうなどにより分散させることが好ましい。
窒素源としては、例えば、アンモニア、塩化アンモニウム、硫酸アンモニウム、リン酸アンモニウム等のアンモニウム塩の他、ペプトン、肉エキス、酵母エキス等が挙げられる。無機塩類としては、例えば、リン酸２水素カリウム、リン酸水素２ナトリウム、リン酸マグネシウム、硫酸マグネシウム、塩化ナトリウム等が挙げられる。その他の有機栄養源としては、例えば、グリシン、アラニン、セリン、スレオニン、プロリン等のアミノ酸、ビタミンＢ１、ビタミンＢ１２、ビタミンＣ等のビタミン等が挙げられる。
このような栄養源を含む培地、炭素源、及び、ＰＨＡ産生微生物を容器内で分散させることにより、培養液が得られる。培養の条件は、上述した炭素源及びその添加方法以外は、通常の微生物培養法に従うことができ、培養スケール、通気攪拌条件、培養温度、培養時ｐＨ、培養時間などは特に限定されない。
（ＰＨＡ回収）
培養を適切な時間行って菌体内にＰＨＡを蓄積させた後、周知の方法を用いて菌体からＰＨＡを回収すればよい。その回収方法は特に限定されないが、例えば、次のような方法によって実施することができる。一例として、培養終了後、培養液から遠心分離機等で菌体を分離し、その菌体を蒸留水、メタノール等により洗浄し、乾燥させる。この乾燥菌体から、クロロホルム等の有機溶剤を用いてＰＨＡを抽出する。このＰＨＡを含んだ溶液から、濾過等によって菌体成分を除去し、そのろ液にメタノールやヘキサン等の貧溶媒を加えてＰＨＡを沈殿させる。さらに、濾過や遠心分離によって上澄み液を除去し、乾燥させてＰＨＡを回収することができる。
培養を適切な時間行って菌体内にＰＨＡを蓄積させた後、周知の方法を用いて菌体からＰＨＡを回収すればよい。その回収方法は特に限定されないが、例えば、次のような方法によって実施することができる。一例として、培養終了後、培養液から遠心分離機等で菌体を分離し、その菌体を蒸留水、メタノール等により洗浄し、乾燥させる。この乾燥菌体から、クロロホルム等の有機溶剤を用いてＰＨＡを抽出する。このＰＨＡを含んだ溶液から、濾過等によって菌体成分を除去し、そのろ液にメタノールやヘキサン等の貧溶媒を加えてＰＨＡを沈殿させる。さらに、濾過や遠心分離によって上澄み液を除去し、乾燥させてＰＨＡを回収することができる。
別の例として、培養液から遠心分離機等で菌体を分離し、その菌体を蒸留水、メタノール等により洗浄する。続いて、洗浄サンプルをラウリル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）溶液と混合し、超音波破砕により細胞膜を破壊し、遠心分離機等で菌体成分とＰＨＡを分離し、ＰＨＡを乾燥させることによりＰＨＡを回収することもできる。
本実施形態によると、単独使用ではＰＨＡ生産速度が遅くなる不飽和脂肪酸の含有割合が比較的高い油脂を利用しながら、良好な生産速度でＰＨＡを製造することが可能になる。
以下に実施例を掲げて本発明をさらに詳細に説明するが、本発明はこれら実施例に限定されるものではない。
（使用油脂）
以下の実施例、比較例、及び参考例で使用した油脂１～１１について、各油脂を構成する脂肪酸の含有割合と、飽和脂肪酸の合計含有割合、及び、不飽和脂肪酸の合計含有割合を表１に示す。尚、油脂１はパーム油、油脂３は菜種油、油脂１０はラードである。
以下の実施例、比較例、及び参考例で使用した油脂１～１１について、各油脂を構成する脂肪酸の含有割合と、飽和脂肪酸の合計含有割合、及び、不飽和脂肪酸の合計含有割合を表１に示す。尚、油脂１はパーム油、油脂３は菜種油、油脂１０はラードである。
（ＰＨＡ蓄積量の算出方法）
ＰＨＡ蓄積量（重量％）は、一定量の培養液を有機溶剤と混合後、水で洗浄して乾燥させて得た乾燥菌体の重量と、同量の培養液から回収したＰＨＡの重量を測定し、以下の式で算出した。
ＰＨＡ蓄積量（重量％）＝［各実施例、比較例、又は参考例で得られたＰＨＡ重量（ｇ）］／［各実施例、比較例、又は参考例における乾燥菌体重量（ｇ）］×１００
ＰＨＡ蓄積量（重量％）は、一定量の培養液を有機溶剤と混合後、水で洗浄して乾燥させて得た乾燥菌体の重量と、同量の培養液から回収したＰＨＡの重量を測定し、以下の式で算出した。
ＰＨＡ蓄積量（重量％）＝［各実施例、比較例、又は参考例で得られたＰＨＡ重量（ｇ）］／［各実施例、比較例、又は参考例における乾燥菌体重量（ｇ）］×１００
（ＰＨＡ生産性の算出方法）
ＰＨＡ生産性（％）は、下記式にて、油脂１のみを用いてＰＨＡを生産した参考例１又は参考例５における培養溶液１リットル当たりから得られたＰＨＡ重量（ｇ）に対する、各実施例、比較例、又は参考例における培養溶液１リットル当たりから得られたＰＨＡ重量（ｇ）の比率として算出した。尚、基準とする参考例は、参考例１又は５のうち、同じＰＨＡ産生微生物を用いた参考例を選択する。
ＰＨＡ生産性（％）＝［各実施例、比較例、又は参考例で得られたＰＨＡ重量（ｇ）］／［参考例１又は参考例５で得られたＰＨＡ重量（ｇ）］×１００
ＰＨＡ生産性（％）は、下記式にて、油脂１のみを用いてＰＨＡを生産した参考例１又は参考例５における培養溶液１リットル当たりから得られたＰＨＡ重量（ｇ）に対する、各実施例、比較例、又は参考例における培養溶液１リットル当たりから得られたＰＨＡ重量（ｇ）の比率として算出した。尚、基準とする参考例は、参考例１又は５のうち、同じＰＨＡ産生微生物を用いた参考例を選択する。
ＰＨＡ生産性（％）＝［各実施例、比較例、又は参考例で得られたＰＨＡ重量（ｇ）］／［参考例１又は参考例５で得られたＰＨＡ重量（ｇ）］×１００
（比較例１～７及び参考例１～４）
ＰＨＡ産生微生物として、ＫＮＫ－００５株（米国特許第７３８４７６６号参照）を用いて、下記に示した方法で（１）前培養、（２）種母培養、及び（３）本培養を順次実施した。本培養では、炭素源である油脂として、表２に示す各油脂を単独で使用した。
ＰＨＡ産生微生物として、ＫＮＫ－００５株（米国特許第７３８４７６６号参照）を用いて、下記に示した方法で（１）前培養、（２）種母培養、及び（３）本培養を順次実施した。本培養では、炭素源である油脂として、表２に示す各油脂を単独で使用した。
（１）前培養
まず、ＫＮＫ－００５株のグリセロールストック ２０μＬを前培養培地２０ｍＬに接種し、３０℃、１８時間培養した。
尚、前培養培地は、１ｗ／ｖ％ Ｍｅａｔ－ｅｘｔｒａｃｔ、１ｗ／ｖ％ Ｂａｃｔｏ－Ｔｒｙｐｔｏｎｅ、０．２ｗ／ｖ％ Ｙｅａｓｔ－ｅｘｔｒａｃｔ、０．９ｗ／ｖ％ Ｎａ２ＨＰＯ４・１２Ｈ２Ｏ、０．１５ｗ／ｖ％ ＫＨ２ＰＯ４、（ｐＨ６．８）とした。
まず、ＫＮＫ－００５株のグリセロールストック ２０μＬを前培養培地２０ｍＬに接種し、３０℃、１８時間培養した。
尚、前培養培地は、１ｗ／ｖ％ Ｍｅａｔ－ｅｘｔｒａｃｔ、１ｗ／ｖ％ Ｂａｃｔｏ－Ｔｒｙｐｔｏｎｅ、０．２ｗ／ｖ％ Ｙｅａｓｔ－ｅｘｔｒａｃｔ、０．９ｗ／ｖ％ Ｎａ２ＨＰＯ４・１２Ｈ２Ｏ、０．１５ｗ／ｖ％ ＫＨ２ＰＯ４、（ｐＨ６．８）とした。
（２）種母培養
得られた前培養液を、１．８Ｌの種母培養培地を入れた３Ｌジャーファーメンター（丸菱バイオエンジ製ＭＤＬ－８Ｃ）に１．０ｖ／ｖ％接種した。運転条件は、培養温度３０℃、攪拌速度５００ｒｐｍ、通気量１．８Ｌ／ｍｉｎとし、ｐＨは６．５～６．６の間でコントロールしながら２４時間培養し、種母培養を行なった。ｐＨコントロールには１４％水酸化アンモニウム水溶液を使用した。
尚、種母培養培地は、１．１ｗ／ｖ％ Ｎａ２ＨＰＯ４・１２Ｈ２Ｏ、０．１９ｗ／ｖ％ ＫＨ２ＰＯ４、１．２９ｗ／ｖ％ （ＮＨ４）２ＳＯ４、０．１ｗ／ｖ％ ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、２．５ｗ／ｖ％ パームオレインオイル、０．５ｖ／ｖ％ 微量金属塩溶液（０．１Ｎ塩酸に１．６ｗ／ｖ％ ＦｅＣｌ３・６Ｈ２Ｏ、１ｗ／ｖ％ ＣａＣｌ２・２Ｈ２Ｏ、０．０２ｗ／ｖ％ ＣｏＣｌ２・６Ｈ２Ｏ、０．０１６ｗ／ｖ％ ＣｕＳＯ４・５Ｈ２Ｏ、０．０１２ｗ／ｖ％ ＮｉＣｌ２・６Ｈ２Ｏを溶かしたもの）、とした。炭素源はパームオレインオイルを１０ｇ／Ｌの濃度で一括添加した。
得られた前培養液を、１．８Ｌの種母培養培地を入れた３Ｌジャーファーメンター（丸菱バイオエンジ製ＭＤＬ－８Ｃ）に１．０ｖ／ｖ％接種した。運転条件は、培養温度３０℃、攪拌速度５００ｒｐｍ、通気量１．８Ｌ／ｍｉｎとし、ｐＨは６．５～６．６の間でコントロールしながら２４時間培養し、種母培養を行なった。ｐＨコントロールには１４％水酸化アンモニウム水溶液を使用した。
尚、種母培養培地は、１．１ｗ／ｖ％ Ｎａ２ＨＰＯ４・１２Ｈ２Ｏ、０．１９ｗ／ｖ％ ＫＨ２ＰＯ４、１．２９ｗ／ｖ％ （ＮＨ４）２ＳＯ４、０．１ｗ／ｖ％ ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、２．５ｗ／ｖ％ パームオレインオイル、０．５ｖ／ｖ％ 微量金属塩溶液（０．１Ｎ塩酸に１．６ｗ／ｖ％ ＦｅＣｌ３・６Ｈ２Ｏ、１ｗ／ｖ％ ＣａＣｌ２・２Ｈ２Ｏ、０．０２ｗ／ｖ％ ＣｏＣｌ２・６Ｈ２Ｏ、０．０１６ｗ／ｖ％ ＣｕＳＯ４・５Ｈ２Ｏ、０．０１２ｗ／ｖ％ ＮｉＣｌ２・６Ｈ２Ｏを溶かしたもの）、とした。炭素源はパームオレインオイルを１０ｇ／Ｌの濃度で一括添加した。
（３）本培養
得られた種母培養液を、２．５Ｌの本培養培地を入れた５Ｌジャーファーメンター（丸菱バイオエンジ製Ｂｉｏｎｅｅｒ－Ｎｅｏ）に５．０ｖ／ｖ％接種した。運転条件は、培養温度３４℃、攪拌速度６００ｒｐｍ、通気量６．０Ｌ／ｍｉｎとし、ｐＨは６．５から６．６の間でコントロールした。ｐＨコントロールには２５％水酸化アンモニウム水溶液を使用した。
炭素源として、表２に示した各油脂を培養期間中、断続的に添加しながら本培養を行った。本培養は４８時間行い、培養終了後、培養液を一定量回収し、蒸留水、メタノールで洗浄後に真空乾燥し、乾燥菌体重量を測定した。前記と同様に菌体を洗浄後、ＳＤＳを用いて菌体構成成分を溶かし、超音波破砕によりＰＨＡと菌体成分を分離し、ＰＨＡのみを回収することでＰＨＡ蓄積量を測定した。これに基づきＰＨＡ生産性を算出し、表２に示した。
尚、本培養培地は、０．３８５ｗ／ｖ％ Ｎａ２ＨＰＯ４・１２Ｈ２Ｏ、０．０６７ｗ／ｖ％ ＫＨ２ＰＯ４、０．２９１ｗ／ｖ％ （ＮＨ４）２ＳＯ４、０．１ｗ／ｖ％ ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、０．５ｖ／ｖ％ 微量金属塩溶液（０．１Ｎ塩酸に１．６ｗ／ｖ％ ＦｅＣｌ３・６Ｈ２Ｏ、１ｗ／ｖ％ ＣａＣｌ２・２Ｈ２Ｏ、０．０２ｗ／ｖ％ ＣｏＣｌ２・６Ｈ２Ｏ、０．０１６ｗ／ｖ％ ＣｕＳＯ４・５Ｈ２Ｏ、０．０１２ｗ／ｖ％ ＮｉＣｌ２・６Ｈ２Ｏを溶かしたもの）、０．０５ｗ／ｖ％ ＢＩＯＳＰＵＲＥＸ２００Ｋ（消泡剤：コグニスジャパン社製）とした。
得られた種母培養液を、２．５Ｌの本培養培地を入れた５Ｌジャーファーメンター（丸菱バイオエンジ製Ｂｉｏｎｅｅｒ－Ｎｅｏ）に５．０ｖ／ｖ％接種した。運転条件は、培養温度３４℃、攪拌速度６００ｒｐｍ、通気量６．０Ｌ／ｍｉｎとし、ｐＨは６．５から６．６の間でコントロールした。ｐＨコントロールには２５％水酸化アンモニウム水溶液を使用した。
炭素源として、表２に示した各油脂を培養期間中、断続的に添加しながら本培養を行った。本培養は４８時間行い、培養終了後、培養液を一定量回収し、蒸留水、メタノールで洗浄後に真空乾燥し、乾燥菌体重量を測定した。前記と同様に菌体を洗浄後、ＳＤＳを用いて菌体構成成分を溶かし、超音波破砕によりＰＨＡと菌体成分を分離し、ＰＨＡのみを回収することでＰＨＡ蓄積量を測定した。これに基づきＰＨＡ生産性を算出し、表２に示した。
尚、本培養培地は、０．３８５ｗ／ｖ％ Ｎａ２ＨＰＯ４・１２Ｈ２Ｏ、０．０６７ｗ／ｖ％ ＫＨ２ＰＯ４、０．２９１ｗ／ｖ％ （ＮＨ４）２ＳＯ４、０．１ｗ／ｖ％ ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、０．５ｖ／ｖ％ 微量金属塩溶液（０．１Ｎ塩酸に１．６ｗ／ｖ％ ＦｅＣｌ３・６Ｈ２Ｏ、１ｗ／ｖ％ ＣａＣｌ２・２Ｈ２Ｏ、０．０２ｗ／ｖ％ ＣｏＣｌ２・６Ｈ２Ｏ、０．０１６ｗ／ｖ％ ＣｕＳＯ４・５Ｈ２Ｏ、０．０１２ｗ／ｖ％ ＮｉＣｌ２・６Ｈ２Ｏを溶かしたもの）、０．０５ｗ／ｖ％ ＢＩＯＳＰＵＲＥＸ２００Ｋ（消泡剤：コグニスジャパン社製）とした。
表２より次のことが分かる。比較例１～７で使用した各油脂は、油脂中の不飽和脂肪酸の含有割合が高く、これらの油脂を炭素源として単独で使用した結果、ＰＨＡ生産性が８０％未満と低くなったことが分かる。一方、参考例１～４で使用した各油脂は、不飽和脂肪酸の含有割合が７５重量％未満と低く、これらの油脂を炭素源として単独で使用した結果、ＰＨＡ生産性が８０％以上と良好であったことが分かる。
（実施例１）
次に記載する点以外は、比較例１～７及び参考例１～４と同じ条件で、（１）前培養、（２）種母培養、及び（３）本培養を順次実施した。本培養では、炭素源として、まず、第一油脂（油脂１）を断続的に添加しながら本培養を開始した。微生物中のＰＨＡ蓄積量が１５重量％に達した時点で、炭素源を第二油脂（油脂２）に切り替えて、第二油脂を断続的に添加しながら本培養を継続した。本培養の開始から４８時間経過した時に培養を終了した。表３に、本培養で使用した炭素源中の第一油脂及び第二油脂それぞれの割合と、算出したＰＨＡ生産性の数値を示した。
当該実施例では、油脂１全量と、ＰＨＡ蓄積量が１５重量％から１６重量％に達するまでに使用した微量の油脂２が、油脂Ａに該当する。この時、油脂Ａの不飽和脂肪酸の平均含有割合は、約５８％である。また、油脂２が油脂Ｂに該当する。
次に記載する点以外は、比較例１～７及び参考例１～４と同じ条件で、（１）前培養、（２）種母培養、及び（３）本培養を順次実施した。本培養では、炭素源として、まず、第一油脂（油脂１）を断続的に添加しながら本培養を開始した。微生物中のＰＨＡ蓄積量が１５重量％に達した時点で、炭素源を第二油脂（油脂２）に切り替えて、第二油脂を断続的に添加しながら本培養を継続した。本培養の開始から４８時間経過した時に培養を終了した。表３に、本培養で使用した炭素源中の第一油脂及び第二油脂それぞれの割合と、算出したＰＨＡ生産性の数値を示した。
当該実施例では、油脂１全量と、ＰＨＡ蓄積量が１５重量％から１６重量％に達するまでに使用した微量の油脂２が、油脂Ａに該当する。この時、油脂Ａの不飽和脂肪酸の平均含有割合は、約５８％である。また、油脂２が油脂Ｂに該当する。
（実施例２）
本培養で、第二油脂として油脂８を使用したこと以外は、実施例１と同じ条件で、（１）前培養、（２）種母培養、及び（３）本培養を順次実施した。表３に、本培養で使用した炭素源中の第一油脂及び第二油脂それぞれの割合と、算出したＰＨＡ生産性の数値を示した。
当該実施例では、油脂１全量と、ＰＨＡ蓄積量が１５重量％から１６重量％に達するまでに使用した微量の油脂８が、油脂Ａに該当する。この時、油脂Ａの不飽和脂肪酸の平均含有割合は、約５６％である。また、油脂８が油脂Ｂに該当する。
本培養で、第二油脂として油脂８を使用したこと以外は、実施例１と同じ条件で、（１）前培養、（２）種母培養、及び（３）本培養を順次実施した。表３に、本培養で使用した炭素源中の第一油脂及び第二油脂それぞれの割合と、算出したＰＨＡ生産性の数値を示した。
当該実施例では、油脂１全量と、ＰＨＡ蓄積量が１５重量％から１６重量％に達するまでに使用した微量の油脂８が、油脂Ａに該当する。この時、油脂Ａの不飽和脂肪酸の平均含有割合は、約５６％である。また、油脂８が油脂Ｂに該当する。
（実施例３～４）
本培養で、第一油脂及び第二油脂としてそれぞれ表３に記載のものを使用し、第一油脂から第二油脂への切り替えを、微生物中のＰＨＡ蓄積量が２０重量％に達した時点で実施したこと以外は、実施例１と同じ条件で、（１）前培養、（２）種母培養、及び（３）本培養を順次実施した。表３に、本培養で使用した炭素源中の第一油脂及び第二油脂それぞれの割合と、算出したＰＨＡ生産性の数値を示した。
尚、当該実施例では、第一油脂（油脂１）が油脂Ａに該当し、第二油脂（油脂２）が油脂Ｂに該当する。以下の実施例５～９も同様である。
本培養で、第一油脂及び第二油脂としてそれぞれ表３に記載のものを使用し、第一油脂から第二油脂への切り替えを、微生物中のＰＨＡ蓄積量が２０重量％に達した時点で実施したこと以外は、実施例１と同じ条件で、（１）前培養、（２）種母培養、及び（３）本培養を順次実施した。表３に、本培養で使用した炭素源中の第一油脂及び第二油脂それぞれの割合と、算出したＰＨＡ生産性の数値を示した。
尚、当該実施例では、第一油脂（油脂１）が油脂Ａに該当し、第二油脂（油脂２）が油脂Ｂに該当する。以下の実施例５～９も同様である。
（実施例５～８）
本培養で、第一油脂及び第二油脂としてそれぞれ表３に記載のものを使用し、第一油脂から第二油脂への切り替えを、微生物中のＰＨＡ蓄積量が３０～３４重量％に達した時点で実施したこと以外は、実施例１と同じ条件で、（１）前培養、（２）種母培養、及び（３）本培養を順次実施した。表３に、本培養で使用した炭素源中の第一油脂及び第二油脂それぞれの割合と、算出したＰＨＡ生産性の数値を示した。
本培養で、第一油脂及び第二油脂としてそれぞれ表３に記載のものを使用し、第一油脂から第二油脂への切り替えを、微生物中のＰＨＡ蓄積量が３０～３４重量％に達した時点で実施したこと以外は、実施例１と同じ条件で、（１）前培養、（２）種母培養、及び（３）本培養を順次実施した。表３に、本培養で使用した炭素源中の第一油脂及び第二油脂それぞれの割合と、算出したＰＨＡ生産性の数値を示した。
（実施例９）
本培養で、第一油脂から第二油脂への切り替えを、微生物中のＰＨＡ蓄積量が７９重量％に達した時点で実施したこと以外は、実施例１と同じ条件で、（１）前培養、（２）種母培養、及び（３）本培養を順次実施した。表３に、本培養で使用した炭素源中の第一油脂及び第二油脂それぞれの割合と、算出したＰＨＡ生産性の数値を示した。
本培養で、第一油脂から第二油脂への切り替えを、微生物中のＰＨＡ蓄積量が７９重量％に達した時点で実施したこと以外は、実施例１と同じ条件で、（１）前培養、（２）種母培養、及び（３）本培養を順次実施した。表３に、本培養で使用した炭素源中の第一油脂及び第二油脂それぞれの割合と、算出したＰＨＡ生産性の数値を示した。
表３より次のことが分かる。実施例１～９は、油脂中の不飽和脂肪酸の含有割合が２５重量％以上７５重量％未満の第一油脂を炭素源として用いて本培養を開始し、本培養の途中で、炭素源を、不飽和脂肪酸の含有割合が第一油脂より高い第二油脂に切り替えて本培養を継続したものである。いずれも、ＰＨＡ生産性が８０％以上と良好であったことが分かる。特に実施例３～８は、単独使用でのＰＨＡ生産性が低い第二油脂を８０重量％以上も使用しているにも関わらず、ＰＨＡ生産性が９０％以上と極めて高くなっている。
不飽和脂肪酸の含有割合が比較的高い油脂は、表２の比較例１～７や参考例４で示したように単独で使用するとＰＨＡ生産性が低くなるにも関わらず、不飽和脂肪酸の含有割合が２５重量％以上７５重量％未満の油脂と組み合わせて順次使用することで良好なＰＨＡ生産性を達成できることが分かる。
不飽和脂肪酸の含有割合が比較的高い油脂は、表２の比較例１～７や参考例４で示したように単独で使用するとＰＨＡ生産性が低くなるにも関わらず、不飽和脂肪酸の含有割合が２５重量％以上７５重量％未満の油脂と組み合わせて順次使用することで良好なＰＨＡ生産性を達成できることが分かる。
（比較例８）
次に記載する点以外は、実施例１と同じ条件で、（１）前培養、（２）種母培養、及び（３）本培養を順次実施した。実施例１の本培養での油脂１と油脂２の添加順序を逆にして、まず、炭素源として油脂２を断続的に添加しながら本培養を開始した。微生物中のＰＨＡ蓄積量が３０重量％に達した時点で、炭素源を油脂１に切り替えて、油脂１を断続的に添加しながら本培養を継続した。本培養の開始から４８時間経過した時に培養を終了した。表４に、本培養で使用した炭素源中の油脂１及び油脂２それぞれの割合と、算出したＰＨＡ生産性の数値を示した。
次に記載する点以外は、実施例１と同じ条件で、（１）前培養、（２）種母培養、及び（３）本培養を順次実施した。実施例１の本培養での油脂１と油脂２の添加順序を逆にして、まず、炭素源として油脂２を断続的に添加しながら本培養を開始した。微生物中のＰＨＡ蓄積量が３０重量％に達した時点で、炭素源を油脂１に切り替えて、油脂１を断続的に添加しながら本培養を継続した。本培養の開始から４８時間経過した時に培養を終了した。表４に、本培養で使用した炭素源中の油脂１及び油脂２それぞれの割合と、算出したＰＨＡ生産性の数値を示した。
（比較例９）
本培養で、油脂２から油脂１への切り替えを、微生物中のＰＨＡ蓄積量が８０重量％に達した時点で実施したこと以外は、比較例８と同じ条件で、（１）前培養、（２）種母培養、及び（３）本培養を順次実施した。表４に、本培養で使用した炭素源中の油脂１及び油脂２それぞれの割合と、算出したＰＨＡ生産性の数値を示した。
本培養で、油脂２から油脂１への切り替えを、微生物中のＰＨＡ蓄積量が８０重量％に達した時点で実施したこと以外は、比較例８と同じ条件で、（１）前培養、（２）種母培養、及び（３）本培養を順次実施した。表４に、本培養で使用した炭素源中の油脂１及び油脂２それぞれの割合と、算出したＰＨＡ生産性の数値を示した。
表４より次のことが分かる。比較例８及び９では、実施例１～９とは異なり、油脂中の不飽和脂肪酸の含有割合が比較的高い油脂（油脂２）を炭素源として用いて本培養を開始し、本培養の途中で、炭素源を、不飽和脂肪酸の含有割合が２５重量％以上７５重量％未満の油脂（油脂１）に切り替えて本培養を継続したものである。結果、ＰＨＡ生産性が８０％未満と低く、比較例１～７と同程度であった。特に比較例８は、単独使用でＰＨＡ生産性が最も高い油脂１を８０重量％以上も使用しているにも関わらず、ＰＨＡ生産性が７６％と極めて低くなっている。
以上より、良好なＰＨＡ生産性を得るには、培養の初期に使用する炭素源は、不飽和脂肪酸の含有割合が比較的高い油脂ではなく、実施例１～９のように不飽和脂肪酸の含有割合が２５重量％以上７５重量％未満の油脂であることが望ましいことが分かる。
以上より、良好なＰＨＡ生産性を得るには、培養の初期に使用する炭素源は、不飽和脂肪酸の含有割合が比較的高い油脂ではなく、実施例１～９のように不飽和脂肪酸の含有割合が２５重量％以上７５重量％未満の油脂であることが望ましいことが分かる。
（比較例１０～１２及び参考例５～７）
ＰＨＡ産生微生物として、Ｃｕｐｒｉａｖｉｄｕｓ ｎｅｃａｔｏｒ Ｈ１６株を用い、本培養の炭素源として、表５に示す各油脂を単独で使用したこと以外は、比較例１～７及び参考例１～４と同じ条件で、（１）前培養、（２）種母培養、及び（３）本培養を順次実施した。表５に、算出したＰＨＡ生産性の数値を示した。
ＰＨＡ産生微生物として、Ｃｕｐｒｉａｖｉｄｕｓ ｎｅｃａｔｏｒ Ｈ１６株を用い、本培養の炭素源として、表５に示す各油脂を単独で使用したこと以外は、比較例１～７及び参考例１～４と同じ条件で、（１）前培養、（２）種母培養、及び（３）本培養を順次実施した。表５に、算出したＰＨＡ生産性の数値を示した。
表５より次のことが分かる。油脂中の不飽和脂肪酸の含有割合が比較的高い油脂を炭素源として単独で使用した比較例１０～１２では、ＰＨＡ生産性が８０％未満と低くなった。一方、不飽和脂肪酸の含有割合が７５重量％未満と低い油脂を炭素源として単独で使用した参考例５～７では、ＰＨＡ生産性が８０％以上と良好であったことが分かる。即ち、比較例１０～１２及び参考例５～７では、比較例１～７及び参考例１～４とは異なるＰＨＡ産生微生物を使用したが、炭素源の種類とＰＨＡ生産性の関係は同じ傾向にあることが分かる。
（実施例１０）
次に記載する点以外は、比較例１０～１２及び参考例５～７と同じ条件で、（１）前培養、（２）種母培養、及び（３）本培養を順次実施した。本培養では、炭素源として、まず、第一油脂（油脂１）を断続的に添加しながら本培養を開始した。微生物中のＰＨＡ蓄積量が１５重量％に達した時点で、炭素源を第二油脂（油脂２）に切り替えて、第二油脂を断続的に添加しながら本培養を継続した。本培養の開始から４８時間経過した時に培養を終了した。表６に、本培養で使用した炭素源中の第一油脂及び第二油脂それぞれの割合と、算出したＰＨＡ生産性の数値を示した。
次に記載する点以外は、比較例１０～１２及び参考例５～７と同じ条件で、（１）前培養、（２）種母培養、及び（３）本培養を順次実施した。本培養では、炭素源として、まず、第一油脂（油脂１）を断続的に添加しながら本培養を開始した。微生物中のＰＨＡ蓄積量が１５重量％に達した時点で、炭素源を第二油脂（油脂２）に切り替えて、第二油脂を断続的に添加しながら本培養を継続した。本培養の開始から４８時間経過した時に培養を終了した。表６に、本培養で使用した炭素源中の第一油脂及び第二油脂それぞれの割合と、算出したＰＨＡ生産性の数値を示した。
（実施例１１）
本培養で、第二油脂として油脂８を使用したこと以外は、実施例１０と同じ条件で、（１）前培養、（２）種母培養、及び（３）本培養を順次実施した。表６に、本培養で使用した炭素源中の第一油脂及び第二油脂それぞれの割合と、算出したＰＨＡ生産性の数値を示した。
本培養で、第二油脂として油脂８を使用したこと以外は、実施例１０と同じ条件で、（１）前培養、（２）種母培養、及び（３）本培養を順次実施した。表６に、本培養で使用した炭素源中の第一油脂及び第二油脂それぞれの割合と、算出したＰＨＡ生産性の数値を示した。
（実施例１２～１３）
本培養で、第一油脂及び第二油脂としてそれぞれ表６に記載のものを使用し、第一油脂から第二油脂への切り替えを、微生物中のＰＨＡ蓄積量が２０重量％に達した時点で実施したこと以外は、実施例１０と同じ条件で、（１）前培養、（２）種母培養、及び（３）本培養を順次実施した。表６に、本培養で使用した炭素源中の第一油脂及び第二油脂それぞれの割合と、算出したＰＨＡ生産性の数値を示した。
本培養で、第一油脂及び第二油脂としてそれぞれ表６に記載のものを使用し、第一油脂から第二油脂への切り替えを、微生物中のＰＨＡ蓄積量が２０重量％に達した時点で実施したこと以外は、実施例１０と同じ条件で、（１）前培養、（２）種母培養、及び（３）本培養を順次実施した。表６に、本培養で使用した炭素源中の第一油脂及び第二油脂それぞれの割合と、算出したＰＨＡ生産性の数値を示した。
（実施例１４～１８）
本培養で、第一油脂及び第二油脂としてそれぞれ表６に記載のものを使用し、第一油脂から第二油脂への切り替えを、微生物中のＰＨＡ蓄積量が３０～３４重量％に達した時点で実施したこと以外は、実施例１０と同じ条件で、（１）前培養、（２）種母培養、及び（３）本培養を順次実施した。表６に、本培養で使用した炭素源中の第一油脂及び第二油脂それぞれの割合と、算出したＰＨＡ生産性の数値を示した。
本培養で、第一油脂及び第二油脂としてそれぞれ表６に記載のものを使用し、第一油脂から第二油脂への切り替えを、微生物中のＰＨＡ蓄積量が３０～３４重量％に達した時点で実施したこと以外は、実施例１０と同じ条件で、（１）前培養、（２）種母培養、及び（３）本培養を順次実施した。表６に、本培養で使用した炭素源中の第一油脂及び第二油脂それぞれの割合と、算出したＰＨＡ生産性の数値を示した。
（実施例１９）
本培養で、第一油脂から第二油脂への切り替えを、微生物中のＰＨＡ蓄積量が８２重量％に達した時点で実施したこと以外は、実施例１０と同じ条件で、（１）前培養、（２）種母培養、及び（３）本培養を順次実施した。表６に、本培養で使用した炭素源中の第一油脂及び第二油脂それぞれの割合と、算出したＰＨＡ生産性の数値を示した。
本培養で、第一油脂から第二油脂への切り替えを、微生物中のＰＨＡ蓄積量が８２重量％に達した時点で実施したこと以外は、実施例１０と同じ条件で、（１）前培養、（２）種母培養、及び（３）本培養を順次実施した。表６に、本培養で使用した炭素源中の第一油脂及び第二油脂それぞれの割合と、算出したＰＨＡ生産性の数値を示した。
表６より次のことが分かる。実施例１０～１９は、実施例１～９と同様、油脂中の不飽和脂肪酸の含有割合が２５重量％以上７５重量％未満の第一油脂を炭素源として用いて本培養を開始し、本培養の途中で、炭素源を、不飽和脂肪酸の含有割合が比較的高い第二油脂に切り替えて本培養を継続したものである。いずれも、ＰＨＡ生産性が８０％以上と良好であったことが分かる。特に、実施例１２～１８は、単独使用でのＰＨＡ生産性が低い第二油脂を８０重量％以上も使用しているにも関わらず、ＰＨＡ生産性が９０％以上と極めて高くなっている。
不飽和脂肪酸の含有割合が比較的高い油脂は、表５の比較例１０～１２や参考例７で示したように単独で使用するとＰＨＡ生産性が低くなるにも関わらず、不飽和脂肪酸の含有割合が２５重量％以上７５重量％未満の油脂と組み合わせて順次使用することで良好なＰＨＡ生産性を達成できることが分かる。
不飽和脂肪酸の含有割合が比較的高い油脂は、表５の比較例１０～１２や参考例７で示したように単独で使用するとＰＨＡ生産性が低くなるにも関わらず、不飽和脂肪酸の含有割合が２５重量％以上７５重量％未満の油脂と組み合わせて順次使用することで良好なＰＨＡ生産性を達成できることが分かる。
（比較例１３）
次に記載する点以外は、実施例１０と同じ条件で、（１）前培養、（２）種母培養、及び（３）本培養を順次実施した。実施例１０の本培養での油脂１と油脂２の添加順序を逆にして、まず、炭素源として油脂２を断続的に添加しながら本培養を開始した。微生物中のＰＨＡ蓄積量が３２重量％に達した時点で、炭素源を油脂１に切り替えて、油脂１を断続的に添加しながら本培養を継続した。本培養の開始から４８時間経過した時に培養を終了した。表７に、本培養で使用した炭素源中の油脂１及び油脂２それぞれの割合と、算出したＰＨＡ生産性の数値を示した。
次に記載する点以外は、実施例１０と同じ条件で、（１）前培養、（２）種母培養、及び（３）本培養を順次実施した。実施例１０の本培養での油脂１と油脂２の添加順序を逆にして、まず、炭素源として油脂２を断続的に添加しながら本培養を開始した。微生物中のＰＨＡ蓄積量が３２重量％に達した時点で、炭素源を油脂１に切り替えて、油脂１を断続的に添加しながら本培養を継続した。本培養の開始から４８時間経過した時に培養を終了した。表７に、本培養で使用した炭素源中の油脂１及び油脂２それぞれの割合と、算出したＰＨＡ生産性の数値を示した。
（比較例１４）
本培養で、油脂２から油脂１への切り替えを、微生物中のＰＨＡ蓄積量が８０重量％に達した時点で実施したこと以外は、比較例１３と同じ条件で、（１）前培養、（２）種母培養、及び（３）本培養を順次実施した。表７に、本培養で使用した炭素源中の油脂１及び油脂２それぞれの割合と、算出したＰＨＡ生産性の数値を示した。
本培養で、油脂２から油脂１への切り替えを、微生物中のＰＨＡ蓄積量が８０重量％に達した時点で実施したこと以外は、比較例１３と同じ条件で、（１）前培養、（２）種母培養、及び（３）本培養を順次実施した。表７に、本培養で使用した炭素源中の油脂１及び油脂２それぞれの割合と、算出したＰＨＡ生産性の数値を示した。
表７より次のことが分かる。比較例１３及び１４では、実施例１０～１９とは異なり、油脂中の不飽和脂肪酸の含有割合が比較的高い油脂（油脂２）を炭素源として用いて本培養を開始し、本培養の途中で、炭素源を、不飽和脂肪酸の含有割合が２５重量％以上７５重量％未満の油脂（油脂１）に切り替えて本培養を継続したものである。結果、ＰＨＡ生産性が８０％未満と低く、比較例１０～１２と同程度であった。特に比較例１３は、単独使用でＰＨＡ生産性が最も高い油脂１を８０重量％近くも使用しているにも関わらず、ＰＨＡ生産性が７３％と極めて低くなっている。
以上より、良好なＰＨＡ生産性を得るには、培養の初期に使用する炭素源は、不飽和脂肪酸の含有割合が比較的高い油脂ではなく、実施例１０～１９のように不飽和脂肪酸の含有割合が２５重量％以上７５重量％未満の油脂であることが望ましいことが分かる。
以上より、良好なＰＨＡ生産性を得るには、培養の初期に使用する炭素源は、不飽和脂肪酸の含有割合が比較的高い油脂ではなく、実施例１０～１９のように不飽和脂肪酸の含有割合が２５重量％以上７５重量％未満の油脂であることが望ましいことが分かる。
Claims (10)
- 炭素源の存在下でポリ（３－ヒドロキシアルカノエート）産生微生物を培養することによるポリ（３－ヒドロキシアルカノエート）の製造方法であって、
前記培養において、炭素源として油脂Ａ及び油脂Ｂを使用し、
前記製造方法は、
（ｉ）前記ポリ（３－ヒドロキシアルカノエート）産生微生物中のポリ（３－ヒドロキシアルカノエート）蓄積量が１６重量％を超えて８５重量％未満のある時点までは、油脂Ａの存在下で前記ポリ（３－ヒドロキシアルカノエート）産生微生物を培養し、
（ｉｉ）油脂Ａを油脂Ｂに変更し、油脂Ｂの存在下で前記ポリ（３－ヒドロキシアルカノエート）産生微生物の培養を継続することを含み、
前記培養全体で油脂Ａと油脂Ｂの合計使用量に対する油脂Ｂの使用量は１０重量％以上である、製造方法。
油脂Ａ：油脂Ａは１種類以上の油脂を含み、油脂Ａ全体において、構成脂肪酸である不飽和脂肪酸の平均含有割合が２５重量％以上７５重量％未満である。
油脂Ｂ：油脂Ｂにおける構成脂肪酸である不飽和脂肪酸の含有割合は、油脂Ａ全体における不飽和脂肪酸の前記平均含有割合より高い。 - 油脂Ｂは、不飽和脂肪酸の含有割合が６０重量％以上９８重量％以下の油脂である、請求項１に記載の製造方法。
- 前記培養全体で油脂Ａと油脂Ｂの合計使用量に対する油脂Ｂの使用量は４０重量％以上である、請求項１又は２に記載の製造方法。
- 前記ポリ（３－ヒドロキシアルカノエート）産生微生物の培養を、前記ポリ（３－ヒドロキシアルカノエート）産生微生物中のポリ（３－ヒドロキシアルカノエート）蓄積量が８０重量％以上に達するまで実施する、請求項１～３のいずれか１項に記載の製造方法。
- 前記ポリ（３－ヒドロキシアルカノエート）産生微生物を含む培地に、油脂Ａを連続添加しながら培養を行った後、油脂Ｂを連続添加しながら培養を継続する、請求項１～４のいずれか１項に記載の製造方法。
- 前記ポリ（３－ヒドロキシアルカノエート）は、少なくとも３－ヒドロキシブチレート単位を含む、請求項１～５のいずれか１項に記載の製造方法。
- 前記ポリ（３－ヒドロキシアルカノエート）は、３－ヒドロキシブチレート単位の単独重合体、又は、３－ヒドロキシブチレート単位と他のヒドロキシアルカノエート単位との共重合体を含む、請求項１～５のいずれか１項に記載の製造方法。
- 前記他のヒドロキシアルカノエート単位が、３－ヒドロキシヘキサノエート単位である、請求項７に記載の製造方法。
- 前記ポリ（３－ヒドロキシアルカノエート）産生微生物が細菌である、請求項１～８のいずれか１項に記載の製造方法。
- 前記ポリ（３－ヒドロキシアルカノエート）産生微生物がカプリアビダス属に属する細菌である、請求項９記載の製造方法。
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