JP7808049B2

JP7808049B2 - 本態性原発性高血圧症の診断及び治療のための方法

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Publication number: JP7808049B2
Application number: JP2022572504A
Authority: JP
Inventors: ハラルドホルストハインツヴィルヘルムシュミット; マハムドハッサンマハムドエルバトリック; ヘルマンアロイスマルティンムケ
Original assignee: Academisch Ziekenhuis Maastricht
Current assignee: Academisch Ziekenhuis Maastricht
Priority date: 2020-05-25
Filing date: 2021-05-21
Publication date: 2026-01-28
Anticipated expiration: 2041-05-21
Also published as: US20230228764A1; EP4158351A1; WO2021239623A1; WO2021239627A1; US11480583B2; CA3179126A1; US20220128574A1; JP2023529074A; EP4158353A1

Description

本発明は、内科疾患の分子診断及びそれらの治療の分野に属する。より具体的には、本発明は、高血圧症、より具体的には本態性原発性高血圧症、より一層具体的には、ＮＯＸ５依存性高血圧症を検出するための方法及び手段を提供する。本発明はまた、高血圧症、具体的には本態性原発性高血圧症、より具体的にはＮＯＸ５依存性高血圧症の治療のための方法を提供する。本発明はまた、療法を診断と組み合わせた、より具体的には、対象からの試料中でＮＯＸ５のレベルが決定され、ＮＯＸ５レベルがある特定の閾値を上回る場合、ＮＯＸ５阻害剤又はＮＯＸ５のレベルを低下させる化合物で対象が治療される、セラグノスティクスを提供する。さらに、本発明はまた、診断を療法と組み合わせた、より具体的には、対象からの試料中でＮＯＸ５の（血漿中）レベルが決定され、決定されたＮＯＸ５レベルが所定の閾値レベルを超えたとき、対象においてＮＯＸ５阻害剤又はＮＯＸ５活性の結果を逆転させる化合物で対象が治療される、セラグノスティクスを提供する。最後に、本発明は、ＮＯＸ５依存性高血圧症に対する診断方法及び治療的処置を開発するのに適切な、動物モデルに関する。

高血圧症は、心筋梗塞、脳卒中及び他の慢性状態並びに死のリスク因子として医学的に大きな関連性がある（Olsen MH, Angell SY, Asma S, Boutouyrie P, Burger D, Chirinos JA, et al. A call to action and a lifecourse strategy to address the global burden of raised blood pressure on current and future generations: the Lancet Commission on hypertension. Lancet. 2016;388(10060):2665-712. Epub 2016/09/28. doi: 10.1016/S0140-6736(16)31134-5. PubMed PMID: 27671667）。二次性高血圧症（腎動脈狭窄、副腎腺腫、褐色細胞腫及び腎トランスポーターに影響する数多くのシグナル遺伝子変異に起因する（Oparil S, Acelajado MC, Bakris GL, Berlowitz DR, Cifkova R, Dominiczak AF, et al. Hypertension. Nat Rev Dis Primers. 2018;4:18014. Epub 2018/03/23. doi: 10.1038/nrdp.2018.14. PubMed PMID: 29565029; PubMed Central PMCID: PMCPMC6477925））を有する患者の５％を例外として、全症例の残りの９５％において、高血圧症の原因は不明である。これらの、いわゆる「本態性原発性高血圧症」の症例では、治療は対症的な血管拡張性薬物療法及び生活習慣の管理に焦点を置く必要がある。治療抵抗性高血圧症においては、対症的な降圧療法でさえ無効な場合があるが、治療必要数は多く、たくさんの患者が脳卒中及び心筋梗塞などの有害事象を今もなお経験している（Ogden LG, He J, Lydick E, Whelton PK. Long-term absolute benefit of lowering blood pressure in hypertensive patients according to the JNC VI risk stratification. Hypertension. 2000;35(2):539-43. Epub 2000/02/19. doi: 10.1161/01.hyp.35.2.539. PubMed PMID: 10679494）。

数十年間提案されてきた高血圧症の１つの分子機序は、酸化ストレス、すなわち、反応性酸素種（ＲＯＳ，reactive oxygen species）の非生理学的生成であり、反応性酸素種は、血管中で、内皮由来弛緩因子である一酸化窒素（ＮＯ）による血管拡張に干渉する（Gryglewski RJ, Palmer RM, Moncada S. Superoxide anion is involved in the breakdown of endothelium-derived vascular relaxing factor. Nature. 1986;320(6061):454-6. Epub 1986/04/03. doi: 10.1038/320454a0. PubMed PMID: 3007998）。しかしながら、この仮説を立証する、又は機序ベース若しくはさらに治癒的でさえある臨床療法のためにこれを利用するための、高血圧症に関連したＲＯＳの細胞供給源は、これまでに特定されていない。

高血圧症リスク遺伝子を探索する近年のゲノムワイド関連研究（ＧＷＡＳ，genome-wide association study）（Kraja AT, Cook JP, Warren HR, Surendran P, Liu C, Evangelou E, et al. New Blood Pressure-Associated Loci Identified in Meta-Analyses of 475 000 Individuals. Circ Cardiovasc Genet. 2017;10(5). Epub 2017/10/17. doi: 10.1161/CIRCGENETICS.117.001778. PubMed PMID: 29030403; PubMed Central PMCID: PMCPMC5776077）は、ＲＯＳ形成に特化した唯一の知られている酵素ファミリーである、ＮＡＤＰＨオキシダーゼ（ＮＯＸ，NADPH oxidase）、特に、遺伝子Ｎｏｘ４及びＮｏｘ５を指摘している。これは前臨床研究と合致しており、該前臨床研究では、高血圧促進剤を動物に注入しない条件において、高血圧症の惹起という点で他の血管ＮＯＸアイソフォーム、すなわち、ＮＯＸ１及びＮＯＸ２を除外している（Yogi A, Mercure C, Touyz J, Callera GE, Montezano AC, Aranha AB, et al. Renal redox-sensitive signaling, but not blood pressure, is attenuated by Nox1 knockout in angiotensin II-dependent chronic hypertension. Hypertension. 2008;51(2):500-6. Epub 2008/01/16. doi: 10.1161/HYPERTENSIONAHA.107.103192. PubMed PMID: 18195161、Murdoch CE, Alom-Ruiz SP, Wang M, Zhang M, Walker S, Yu B, et al. Role of endothelial Nox2 NADPH oxidase in angiotensin II-induced hypertension and vasomotor dysfunction. Basic Res Cardiol. 2011;106(4):527-38. Epub 2011/04/30. doi: 10.1007/s00395-011-0179-7. PubMed PMID: 21528437; PubMed Central PMCID: PMCPMC3105229、Sag CM, Schnelle M, Zhang J, Murdoch CE, Kossmann S, Protti A, et al. Distinct Regulatory Effects of Myeloid Cell and Endothelial Cell NAPDH Oxidase 2 on Blood Pressure. Circulation. 2017;135(22):2163-77. Epub 2017/03/17. doi: 10.1161/CIRCULATIONAHA.116.023877. PubMed PMID: 28298457; PubMed Central PMCID: PMCPMC5444427）。ＮＯＸ４については、このアイソフォームは広く発現しているが、血圧又は高血圧症とは無関係に思われ（Kleinschnitz C, Grund H, Wingler K, Armitage ME, Jones E, Mittal M, et al. Post-stroke inhibition of induced NADPH oxidase type 4 prevents oxidative stress and neurodegeneration. PLoS biology. 2010;8(9). Epub 2010/09/30. doi: 10.1371/journal.pbio.1000479. PubMed PMID: 20877715）、むしろ血管保護的である（Ray R, Murdoch CE, Wang M, Santos CX, Zhang M, Alom-Ruiz S, et al. Endothelial Nox4 NADPH oxidase enhances vasodilatation and reduces blood pressure in vivo. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 2011;31(6):1368-76. Epub 2011/03/19. doi: 10.1161/ATVBAHA.110.219238. PubMed PMID: 21415386）。ＮＯＸ５については、この酵素はヒト血管の血管内皮細胞中で生理学的に発現し、糖尿病性腎症と関連している可能性がある（Holterman CE, Thibodeau JF, Towaij C, Gutsol A, Montezano AC, Parks RJ, et al. Nephropathy and elevated BP in mice with podocyte-specific NADPH oxidase 5 expression. J Am Soc Nephrol. 2014;25(4):784-97. doi: 10.1681/ASN.2013040371. PubMed PMID: 24262797; PubMed Central PMCID: PMCPMC3968494、Jha JC, Banal C, Okabe J, Gray SP, Hettige T, Chow BSM, et al. NADPH Oxidase Nox5 Accelerates Renal Injury in Diabetic Nephropathy. Diabetes. 2017;66(10):2691-703. Epub 2017/07/28. doi: 10.2337/db16-1585. PubMed PMID: 28747378、Jha JC, Dai A, Holterman CE, Cooper ME, Touyz RM, Kennedy CR, et al. Endothelial or vascular smooth muscle cell-specific expression of human NOX5 exacerbates renal inflammation, fibrosis and albuminuria in the Akita mouse. Diabetologia. 2019;62(9):1712-26. Epub 2019/06/22. doi: 10.1007/s00125-019-4924-z. PubMed PMID: 31222503）。しかし、血管平滑筋細胞でヒトＮＯＸ５を発現しているマウスは正常血圧である（Montezano AC, De Lucca Camargo L, Persson P, Rios FJ, Harvey AP, Anagnostopoulou A, et al. NADPH Oxidase 5 Is a Pro-Contractile Nox Isoform and a Point of Cross-Talk for Calcium and Redox Signaling-Implications in Vascular Function. J Am Heart Assoc. 2018;7(12). Epub 2018/06/17. doi: 10.1161/JAHA.118.009388. PubMed PMID: 29907654; PubMed Central PMCID: PMCPMC6220544）。このように、高血圧症におけるＮＯＸ５の役割は未だに不明瞭なままである。

単一の標的から視点を移し、ネットワーク医学（Barabasi AL, Gulbahce N, Loscalzo J. Network medicine: a network-based approach to human disease. Nat Rev Genet. 2011;12(1):56-68. Epub 2010/12/18. doi: 10.1038/nrg2918. PubMed PMID: 21164525; PubMed Central PMCID: PMCPMC3140052）によれば、大半の、特に複雑な疾患において、単一のタンパク質ではなくタンパク質モジュール、すなわち、インタラクトームの部分グラフが実際に関係していると予測されている（Alcaraz N, List M, Batra R, Vandin F, Ditzel HJ, Baumbach J. De novo pathway-based biomarker identification. Nucleic Acids Res. 2017;45(16):e151. Epub 2017/09/22. doi: 10.1093/nar/gkx642. PubMed PMID: 28934488; PubMed Central PMCID: PMCPMC5766193、Batra R, Alcaraz N, Gitzhofer K, Pauling J, Ditzel HJ, Hellmuth M, et al. On the performance of de novo pathway enrichment. NPJ Syst Biol Appl. 2017;3:6. Epub 2017/06/27. doi: 10.1038/s41540-017-0007-2. PubMed PMID: 28649433; PubMed Central PMCID: PMCPMC5445589、Menche J, Sharma A, Kitsak M, Ghiassian SD, Vidal M, Loscalzo J, et al. Disease networks. Uncovering disease-disease relationships through the incomplete interactome. Science. 2015;347(6224):1257601. Epub 2015/02/24. doi: 10.1126/science.1257601. PubMed PMID: 25700523; PubMed Central PMCID: PMCPMC4435741）。したがって、我々は、３つの相補的で不偏のインシリコでのアプローチを使用して、ＮＯＸの高血圧症及びＮＯ依存性血管拡張との関連を再調査し、マウスと、可能であればヒト患者試料の両方においてあらゆる予測を検証することに着手した。

Olsen MH, Angell SY, Asma S, Boutouyrie P, Burger D, Chirinos JA, et al. A call to action and a lifecourse strategy to address the global burden of raised blood pressure on current and future generations: the Lancet Commission on hypertension. Lancet. 2016;388(10060):2665-712. Epub 2016/09/28. doi: 10.1016/S0140-6736(16)31134-5. PubMed PMID: 27671667 Oparil S, Acelajado MC, Bakris GL, Berlowitz DR, Cifkova R, Dominiczak AF, et al. Hypertension. Nat Rev Dis Primers. 2018;4:18014. Epub 2018/03/23. doi: 10.1038/nrdp.2018.14. PubMed PMID: 29565029; PubMed Central PMCID: PMCPMC6477925 Ogden LG, He J, Lydick E, Whelton PK. Long-term absolute benefit of lowering blood pressure in hypertensive patients according to the JNC VI risk stratification. Hypertension. 2000;35(2):539-43. Epub 2000/02/19. doi: 10.1161/01.hyp.35.2.539. PubMed PMID: 10679494 Gryglewski RJ, Palmer RM, Moncada S. Superoxide anion is involved in the breakdown of endothelium-derived vascular relaxing factor. Nature. 1986;320(6061):454-6. Epub 1986/04/03. doi: 10.1038/320454a0. PubMed PMID: 3007998 Kraja AT, Cook JP, Warren HR, Surendran P, Liu C, Evangelou E, et al. New Blood Pressure-Associated Loci Identified in Meta-Analyses of 475 000 Individuals. Circ Cardiovasc Genet. 2017;10(5). Epub 2017/10/17. doi: 10.1161/CIRCGENETICS.117.001778. PubMed PMID: 29030403; PubMed Central PMCID: PMCPMC5776077 Yogi A, Mercure C, Touyz J, Callera GE, Montezano AC, Aranha AB, et al. Renal redox-sensitive signaling, but not blood pressure, is attenuated by Nox1 knockout in angiotensin II-dependent chronic hypertension. Hypertension. 2008;51(2):500-6. Epub 2008/01/16. doi: 10.1161/HYPERTENSIONAHA.107.103192. PubMed PMID: 18195161 Murdoch CE, Alom-Ruiz SP, Wang M, Zhang M, Walker S, Yu B, et al. Role of endothelial Nox2 NADPH oxidase in angiotensin II-induced hypertension and vasomotor dysfunction. Basic Res Cardiol. 2011;106(4):527-38. Epub 2011/04/30. doi: 10.1007/s00395-011-0179-7. PubMed PMID: 21528437; PubMed Central PMCID: PMCPMC3105229 Sag CM, Schnelle M, Zhang J, Murdoch CE, Kossmann S, Protti A, et al. Distinct Regulatory Effects of Myeloid Cell and Endothelial Cell NAPDH Oxidase 2 on Blood Pressure. Circulation. 2017;135(22):2163-77. Epub 2017/03/17. doi: 10.1161/CIRCULATIONAHA.116.023877. PubMed PMID: 28298457; PubMed Central PMCID: PMCPMC5444427 Kleinschnitz C, Grund H, Wingler K, Armitage ME, Jones E, Mittal M, et al. Post-stroke inhibition of induced NADPH oxidase type 4 prevents oxidative stress and neurodegeneration. PLoS biology. 2010;8(9). Epub 2010/09/30. doi: 10.1371/journal.pbio.1000479. PubMed PMID: 20877715 Ray R, Murdoch CE, Wang M, Santos CX, Zhang M, Alom-Ruiz S, et al. Endothelial Nox4 NADPH oxidase enhances vasodilatation and reduces blood pressure in vivo. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 2011;31(6):1368-76. Epub 2011/03/19. doi: 10.1161/ATVBAHA.110.219238. PubMed PMID: 21415386 Holterman CE, Thibodeau JF, Towaij C, Gutsol A, Montezano AC, Parks RJ, et al. Nephropathy and elevated BP in mice with podocyte-specific NADPH oxidase 5 expression. J Am Soc Nephrol. 2014;25(4):784-97. doi: 10.1681/ASN.2013040371. PubMed PMID: 24262797; PubMed Central PMCID: PMCPMC3968494 Jha JC, Banal C, Okabe J, Gray SP, Hettige T, Chow BSM, et al. NADPH Oxidase Nox5 Accelerates Renal Injury in Diabetic Nephropathy. Diabetes. 2017;66(10):2691-703. Epub 2017/07/28. doi: 10.2337/db16-1585. PubMed PMID: 28747378 Jha JC, Dai A, Holterman CE, Cooper ME, Touyz RM, Kennedy CR, et al. Endothelial or vascular smooth muscle cell-specific expression of human NOX5 exacerbates renal inflammation, fibrosis and albuminuria in the Akita mouse. Diabetologia. 2019;62(9):1712-26. Epub 2019/06/22. doi: 10.1007/s00125-019-4924-z. PubMed PMID: 31222503 Montezano AC, De Lucca Camargo L, Persson P, Rios FJ, Harvey AP, Anagnostopoulou A, et al. NADPH Oxidase 5 Is a Pro-Contractile Nox Isoform and a Point of Cross-Talk for Calcium and Redox Signaling-Implications in Vascular Function. J Am Heart Assoc. 2018;7(12). Epub 2018/06/17. doi: 10.1161/JAHA.118.009388. PubMed PMID: 29907654; PubMed Central PMCID: PMCPMC6220544 Barabasi AL, Gulbahce N, Loscalzo J. Network medicine: a network-based approach to human disease. Nat Rev Genet. 2011;12(1):56-68. Epub 2010/12/18. doi: 10.1038/nrg2918. PubMed PMID: 21164525; PubMed Central PMCID: PMCPMC3140052 Alcaraz N, List M, Batra R, Vandin F, Ditzel HJ, Baumbach J. De novo pathway-based biomarker identification. Nucleic Acids Res. 2017;45(16):e151. Epub 2017/09/22. doi: 10.1093/nar/gkx642. PubMed PMID: 28934488; PubMed Central PMCID: PMCPMC5766193 Batra R, Alcaraz N, Gitzhofer K, Pauling J, Ditzel HJ, Hellmuth M, et al. On the performance of de novo pathway enrichment. NPJ Syst Biol Appl. 2017;3:6. Epub 2017/06/27. doi: 10.1038/s41540-017-0007-2. PubMed PMID: 28649433; PubMed Central PMCID: PMCPMC5445589 Menche J, Sharma A, Kitsak M, Ghiassian SD, Vidal M, Loscalzo J, et al. Disease networks. Uncovering disease-disease relationships through the incomplete interactome. Science. 2015;347(6224):1257601. Epub 2015/02/24. doi: 10.1126/science.1257601. PubMed PMID: 25700523; PubMed Central PMCID: PMCPMC4435741

本発明は、対象における本態性動脈性高血圧症、特に、対象におけるＮＯＸ５依存性高血圧症を診断するための新規の方法であって、対象からの体液試料中又は組織試料中においてＮＡＤＰＨオキシダーゼ５（ＮＯＸ５，NADPH oxidase 5）のレベルが決定され、ＮＯＸ５のレベルが所定の閾値レベルを上回る場合、前記対象が本態性動脈性高血圧症、特にＮＯＸ５依存性高血圧症を有すると結論づけられる、方法に関する。

特定の実施形態において、所定の閾値レベルは、１ｍｌ当たり１６０ｐｇである。

本発明は、本態性動脈性高血圧症を罹患している対象から得られた血漿試料中において、１ｍｌ当たり少なくとも１６０ｐｇのニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸（ＮＡＤＰＨ，nicotinamide adenine dinucleotide phosphate）オキシダーゼ５（ＮＯＸ５）濃度の存在について試験することによる、対象におけるＮＯＸ５依存性高血圧症を診断する方法に関する。

例示的な実施形態において、本発明に係る診断の方法は、
（ａ）血漿試料から内皮マイクロパーティクルを単離するステップと、
（ｂ）タンパク質検出アッセイを使用してステップ（ａ）の前記内皮マイクロパーティクル中のＮＯＸ５を測定し、前記血漿試料中のＮＯＸ５の濃度を血漿試料１ｍｌ当たりのＮＯＸ５のｐｇとして決定するステップと
を含み、ステップ（ｂ）で決定されたＮＯＸ５の前記濃度が前記血漿試料１ｍｌ当たり少なくともＮＯＸ５１６０ｐｇである場合、（ヒト）対象がＮＯＸ５依存性高血圧症を罹患していると診断される。

本発明はさらに、本態性動脈性高血圧症、特にＮＯＸ５依存性高血圧症を有する対象の治療における使用のための、セピアプテリン、Ｌ－シトルリン、Ｌ－アルギニン、テトラヒドロビオプテリン、葉酸及びＮＯＸ５阻害剤、特に、ＮＯＸ５阻害剤５，１２－ジヒドロキノキサリノ（２，３－Ｂ）キノキサリン（ＭＬ０９０）から選択される化合物に関する。

本発明はさらに、本態性動脈性高血圧症を有する対象を治療する方法における使用のための、セピアプテリン、葉酸、Ｌ－シトルリン、Ｌ－アルギニン及びテトラヒドロビオプテリンから選択される化合物であって、本態性動脈性高血圧症を有する前記対象が、血漿１ｍｌ当たり少なくともＮＯＸ５１６０ｐｇのＮＯＸ５血漿中濃度を有することを特徴とする、化合物に関する。

本発明はさらに、治療抵抗性高血圧症を有する対象を治療する方法における使用のための、セピアプテリン、葉酸、Ｌ－シトルリン、Ｌ－アルギニン及びテトラヒドロビオプテリンから選択される化合物に関する。

本発明はさらに、ＮＯＸ５依存性高血圧症を有する対象を治療する方法における使用のための、セピアプテリン、葉酸、Ｌ－シトルリン、Ｌ－アルギニン及びテトラヒドロビオプテリンから選択される化合物に関する。

さらなる実施形態において、本発明は、ＮＯＸ５及び脱共役ＮＯＳ依存性（本態性動脈性）高血圧症における使用のための治療薬及び診断薬を発見及び開発するための、高齢ＮＯＸ５ノックイン動物モデルの使用に関する。

本発明はまた、対象におけるＮＯＸ５依存性高血圧症における使用のための治療薬及び検出のための方法を発見及び開発するための、ノックインヒトＮｏｘ５遺伝子を有するマウスの使用に関する。

～高血圧症における、内皮ＮＯ－ｃＧＭＰシグナル伝達の直接のネイバーとしてのＮＯＸ５の特定、及び臨床的検証。Ａ．ＮＯＸアイソフォーム（灰色のノード）及びＮＯ－ｃＧＭＰ関連タンパク質（明るい灰色のノード）をシードノードとして使用し、ＳＰＤに基づいて剪定された第１のネイバーサブネットワーク（中段のパネル）により、ＮＯＸモジュールを構築した。得られたＮＯＸモジュールを、全体モジュール性最適化（左のパネル）及び集積的局所法（右のパネル）の２つの疾患モジュール特定法を用いて確認した。いずれの方法によっても、ＮＯＸ５がＮＯ－ｃＧＭＰシグナル伝達に最も近いリンクとして特定され、ＮＯＸ１～４及び他のすべての知られているＲＯＳ源が除外された（図示せず）。Ｂ．正常血圧（ＮＴ，normo-tensive）の正常アルブミン尿対象並びに高血圧症（ＨＴ，hypertensive）の正常アルブミン尿及び微量アルブミン尿患者の血漿から単離された内皮マイクロパーティクル（ＭＰ，microparticle）中のＮＯＸ５レベルを、ＥＬＩＳＡによって測定した。Ｃ．ＮＯＸ５レベルは、正常血圧対象（n = 10）と比較して、正常アルブミン尿を有する高血圧症患者（n = 20）において上昇した。ＮＯＸ５レベルは、微量アルブミン尿を有する高血圧症患者（n = 20）においてより一層高かった。一元配置ＡＮＯＶＡと続くTukeyの多重比較検定とにより、群間の比較を行った。Ｄ．すべての高血圧症患者の下位群分析により、二峰性分布（p = 0.0007、両側Ｆ検定、調整済み決定係数 = 0.9973）が示される。すべてのデータはｎ回の独立な実験の平均±Ｓ．Ｅ．Ｍ．で表され、^*P < 0.05、^***P < 0.001である。～高血圧症におけるＮＯＸ５の前臨床的検証。Ａ．若齢ＷＴマウスとＮＯＸ５ＫＩマウスのいずれも正常血圧であったが、ＫＩマウスのみが加齢時に高血圧症になる。Ｂ及びＣ．若齢のＷＴ（n = 19）とＫＩ（n = 20）の間で、収縮期（Ｂ）及び拡張期（Ｃ）血圧に有意差はなかった。Ｄ及びＥ．高齢ＫＩマウス（n = 33）は、ＷＴ（n = 31）と比較してより高い収縮期血圧（Ｄ）を有し、一方で同程度の拡張期血圧（Ｅ）を有していた。二元配置反復測定ＡＮＯＶＡと続くSidakの多重比較検定とにより、遠隔測定データを解析した。すべてのデータはｎ匹の個々の動物の平均±Ｓ．Ｅ．Ｍ．で表され、^**P < 0.01である。～内皮ＮＯＸ５は、ＮＯＳを脱共役させることによって内皮細胞機能不全及び高血圧症を誘導する。Ａ．フェニレフリン（Ｐｈｅ，phenylephrine）で予め収縮させた高齢ＫＩマウス（n = 9）の大腿動脈は、ＷＴ（n = 9）と比較して、アセチルコリン（Ａｃｈ，acetylcholine）誘導性弛緩に対する応答性がより低かったが、セピアプテリン（１００μＭ）を用いた前治療によりＫＩ（n = 4）における弛緩が改善し、ＷＴ（n = 3）と差がなかった。Ｂ．Ｐｈｅで予め収縮させた高齢ＫＩマウス（n = 9）の伏在動脈は、ＷＴ（n = 8）と比較して、Ａｃｈ誘導性弛緩の差を示さなかった。二元配置ＡＮＯＶＡと続くSidakの多重比較検定とにより、ミオグラフデータを解析した。Ｃ．ＮＯＸ５誘導性年齢依存性高血圧症の概略的表現。加齢の際、内皮ＮＯＸ５が活性化され、正常なＮＯ－ｃＧＭＰシグナル伝達に干渉し、その結果、血管平滑筋弛緩の障害及び血圧の上昇を生じる。略称：ＥＣ、内皮細胞（endothelial cell）；ＥＴ－１、エンドセリン１（endothelin-1）、Ｈ_４Ｂｉｐ、テトラヒドロビオプテリン（tetrahydrobiopterin）；ＮＡ、ノルアドレナリン（noradrenaline）；ＮＯＳ３、内皮型一酸化窒素合成酵素（endothelial nitric oxide synthase）；ＳＭＣ、平滑筋細胞（smooth muscle cell）；ｓＧＣ、可溶性グアニル酸シクラーゼ（soluble guanylate cyclase）；ＳＮ、交感神経（sympathetic nerve）。すべてのデータはｎ匹の個々の動物の平均±Ｓ．Ｅ．Ｍ．で表され、^***P < 0.001である。健常及び高血圧症対象における血漿中ＡＤＭＡレベル。ＡＤＭＡレベルは、健常対象（n = 10）と比較して高血圧症患者（n = 40）において有意に高かった。対応のない両側Ｔ検定によって２つの群間の比較を行った。すべてのデータは平均±Ｓ．Ｅ．Ｍ．で表され、^**P < 0.01である。～若齢及び高齢のＷＴ及びＫＩマウスにおける平均動脈圧（ＭＡＰ，mean arterial pressure）。Ａ．若齢のＷＴ（n = 19）とＫＩ（n = 20）の間にＭＡＰの有意差はなかった。Ｂ．高齢ＫＩマウス（n = 33）はＷＴ（n = 31）と比較してより高いＭＡＰを有していた。二元配置反復測定ＡＮＯＶＡと続くSidakの多重比較検定とにより、遠隔測定データを解析した。すべてのデータはｎ匹の個々の動物の平均±Ｓ．Ｅ．Ｍ．で表され、^**P < 0.01である。～高齢のＷＴ及びＫＩマウスにおける体重及び臓器重量。Ａ～Ｅ．ＷＴ（n = 24）マウスとＫＩマウス（n = 20）の間で、体重、心臓重量及び腎臓重量の差はなかったが、肺重量／体重比はＫＩマウスでより高かった。対応のない両側Ｔ検定によって群間の比較を行った。すべてのデータはｎ匹の個々の動物の平均±Ｓ．Ｅ．Ｍ．で表され、^*P < 0.05である。～高齢のＷＴ及びＫＩマウスにおける動脈硬化度。Ａ～Ｃ．弛緩時壁張力と動脈管腔直径の間の関係は、胸部大動脈（Ａ）、大腿動脈（Ｂ）及び伏在動脈（Ｃ）において、ＫＩマウス（n = 9）とＷＴマウス（n = 9）の間で差がなかった。すべてのデータはｎ匹の個々の動物の平均±Ｓ．Ｅ．Ｍ．で表される。～高齢のＷＴ及びＫＩマウスの動脈におけるアセチルコリン（Ａｃｈ）誘導性弛緩。Ａ～Ｃ．Ａｃｈ誘導性弛緩は、Ｋ^＋で予め収縮させた高齢ＫＩマウス（n = 9）の大腿動脈（Ａ）ではＷＴ（n = 8～9）と比較して障害されたが、伏在動脈（Ｂ）及び胸部大動脈（インドメタシンあり／なし）（Ｃ）では障害されなかった。Ｄ～Ｆ．Ａｃｈ誘導性弛緩は、エンドセリン１で予め収縮させた高齢ＫＩマウス（n = 9）の大腿動脈（Ｄ）ではＷＴ（n = 8～9）と比較して障害されたが、伏在動脈（Ｅ）及びインドメタシンあり／なしにおける胸部大動脈（Ｆ）では障害されなかった。Ｇ．ＷＴ（n = 9）マウスとＫＩマウス（n = 9）の間で、フェニレフリンで予め収縮させた胸部大動脈（インドメタシンあり／なし）におけるＡｃｈ誘導性弛緩に差はなかった。Ｈ～Ｊ．エンドセリン１を用いて収縮させた動脈におけるＡｃｈ誘導性弛緩は、高齢のＫＩマウス（n = 8～9）とＷＴマウス（n = 8～9）のいずれにおいても、大腿動脈（Ｈ）及び胸部大動脈（Ｉ）では１００μＭＬ－ＮＡＭＥによって逆転したが、伏在動脈（Ｊ）では逆転しなかった。二元配置ＡＮＯＶＡと続くSidakの多重比較検定とにより、ミオグラフデータを解析した。すべてのデータはｎ匹の個々の動物の平均±Ｓ．Ｅ．Ｍ．で表され、^*P < 0.05である。高齢ＫＩマウスの胸部大動脈（ＴＡＯ，thoracic aorta）、大腿動脈（ＦＡ，femoral artery）及び伏在動脈（ＳＡ，saphenous artery）におけるＮＯＸ５のｑＰＣＲ。３つの血管型（n = 3、各々が二重反復試験による）間で、ＮＯＸ５遺伝子発現に差はなかった。一元配置ＡＮＯＶＡによって比較を行った。すべてのデータはｎ匹の個々の動物の平均±Ｓ．Ｅ．Ｍ．で表される。～高齢のＷＴ及びＫＩマウスの動脈における収縮応答。大腿動脈（Ａ～Ｃ）、伏在動脈（Ｄ～Ｆ）及び胸部大動脈（インドメタシンあり／なし）（Ｇ～Ｉ）において、ＷＴマウス（n = 8～9）とＫＩマウス（n = 9）の間で、Ｋ^＋、フェニレフリン及びエンドセリン１に対する収縮応答に差はなかった。両側Ｔ検定によって、Ｋ^＋に対する収縮応答の２群間の比較を行った。二元配置ＡＮＯＶＡと続くSidakの多重比較検定とにより、他のミオグラフデータを解析した。すべてのデータはｎ匹の個々の動物の平均±Ｓ．Ｅ．Ｍ．で表される。～高齢のＷＴ及びＫＩマウスの動脈における内皮依存性弛緩。Ａ～Ｃ．ＷＴマウス（n = 8～9）とＫＩマウス（n = 9）の間で、大腿動脈（Ａ）、伏在動脈（Ｂ）及び胸部大動脈（インドメタシンあり／なし）（Ｃ）においてＮＯドナーＰＡＰＡＮＯ（０．０１～１０μＭ）によって誘導された弛緩に差はなかった。Ｄ．ＷＴマウス（n = 4）とＫＩマウス（n = 4）の間で、大腿動脈においてａｐｏ－ｓＧＣ活性化物質Ｂａｙ６０－２７７０（０．０１～１０μＭ）によって誘導された弛緩に差はなかった。二元配置ＡＮＯＶＡと続くSidakの多重比較検定とにより、ミオグラフデータを解析した。すべてのデータはｎ匹の個々の動物の平均±Ｓ．Ｅ．Ｍ．で表される。～抗酸化剤で治療した高齢ＫＩマウスの大腿動脈におけるアセチルコリン（Ａｃｈ）誘導性弛緩。１０μＭフェニレフリンを用いて収縮させた大腿動脈のセグメント（n = 3～6）において、Ａｃｈ（１０μＭ）の弛緩効果は、１０μＭＮ－アセチルシステイン（ＮＡＣ，N-acetylcysteine）（Ａ）によっても１００μＭテンポール（Ｂ）によっても逆転しなかった。対応のない両側Ｔ検定によって群間の比較を行った。すべてのデータはｎ匹の個々の動物の平均±Ｓ．Ｅ．Ｍ．で表される。～高齢のＷＴ及びＫＩマウスにおける心エコー検査。ＷＴ（n = 28）マウスとＫＩマウス（n = 29）の間で、すべてのパラメータ（Ａ～Ｎ）に差はなかった。対応のない両側Ｔ検定によって群間の比較を行った。すべてのデータはｎ匹の個々の動物の平均±Ｓ．Ｅ．Ｍ．で表される。～高齢のＷＴ及びＫＩマウスにおける動脈直径。ＷＴマウス（n = 9）とＫＩマウス（n = 9）の間で、胸部大動脈（Ａ）、大腿動脈（Ｂ）及びインドメタシンあり又はなしにおける伏在動脈（Ｃ）の直径に差はなかった。対応のない両側Ｔ検定によって群間の比較を行った。すべてのデータはｎ匹の個々の動物の平均±Ｓ．Ｅ．Ｍ．で表される。

ＮＯＸアイソフォームと高血圧症及びＮＯ依存性血管拡張の間の考えられ得る関連性を探索するために、我々は、ＩＩＤ（Kotlyar M, Pastrello C, Malik Z, Jurisica I. IID 2018 update: context-specific physical protein-protein interactions in human, model organisms and domesticated species. Nucleic Acids Res. 2019;47(D1):D581-D9. Epub 2018/11/09. doi: 10.1093/nar/gky1037. PubMed PMID: 30407591; PubMed Central PMCID: PMCPMC6323934）インタラクトームデータベースから得られた実験により検証されたインタラクトームにおいて、シードノードとしてのＮＯＸファミリーメンバー及び一酸化窒素環状ＧＭＰ関連タンパク質の第１のネイバーから、剪定された分子サブネットワークを構築した。これらは、ＮＯＸ１、ＮＯＸ３、ＮＯＸ４、ＮＯＸ５、ＮＯＳ１、ＮＯＳ３、ＧＵＣＹＡ１、ＧＵＣＹＡ２、ＧＵＣＹＢ１、ＰＤＥ５Ａ、ＰＤＥ９Ａ及びＰＲＫＧ１を含んでいたが、ＮＯＸ２及びＮＯＳ２は含んでいなかった。

得られたサブネットワークを、ハブノード（すなわち、ネットワーク全体において相互作用の数が多いことに主に起因して生じたタンパク質）について補正するために、サブネットワーク参加度（ＳＰＤ，subnetwork-participation-degree）に従ってさらに剪定した。この結果、いくつかの接続されたコンポーネントからなる疾患モジュールが得られ、これにより、ＮＯＸ５以外のすべてのＮＯＸアイソフォームが、内皮ＮＯ環状ＧＭＰシグナル伝達の近接ネイバーとしては除外されたことが明らかとなった。ＮＯＸ５は、ＮＯ受容体ＧＵＣＹＡ１、ＧＵＣＹＡ２及びＧＵＣＹＢ１をコードする遺伝子、並びに内皮ＮＯＳ（ＮＯＳ３）と接続した同じコンポーネントに該当した（図１Ａ）。ＩＩＤより、この接続は、ハイスループットアフィニティークロマトグラフィーによって示唆される、物理的な相互作用に基づく（Huttlin EL, Bruckner RJ, Paulo JA, Cannon JR, Ting L, Baltier K, et al. Architecture of the human interactome defines protein communities and disease networks. Nature. 2017;545(7655):505-9. Epub 2017/05/18. doi: 10.1038/nature22366. PubMed PMID: 28514442; PubMed Central PMCID: PMCPMC5531611）。

我々によるインシリコでのＮＯＸ疾患モジュールの発見を別角度から確認するため、我々は、全体モジュール性最適化及び集積的局所探索という、いずれも近年のモジュール特定ＤＲＥＡＭチャレンジにおいて最上位の成績を有する２つのさらなるコンピュータネットワークモジュール特定法を採用した（Choobdar S, Ahsen ME, Crawford J, Tomasoni M, Fang T, Lamparter D, et al. Assessment of network module identification across complex diseases. Nat Methods. 2019;16(9):843-52. Epub 2019/09/01. doi: 10.1038/s41592-019-0509-5. PubMed PMID: 31471613; PubMed Central PMCID: PMCPMC6719725）。簡潔に述べると、全体モジュール性最適化アプローチは、複数のモジュール検出アルゴリズムを組み合わせることで、個々のアルゴリズムに起因する最適ではないパーティションを回避する（Arenas A, Fernandez A, Gomez S. Analysis of the structure of complex networks at different resolution levels. New Journal of Physics. 2008;10(5):053039. doi: 10.1088/1367-2630/10/5/053039）。集積的局所法は、SPICiアルゴリズム（Jiang P, Singh M. SPICi: a fast clustering algorithm for large biological networks. Bioinformatics. 2010;26(8):1105-11. Epub 2010/02/27. doi: 10.1093/bioinformatics/btq078. PubMed PMID: 20185405; PubMed Central PMCID: PMCPMC2853685）を使用することで、シードノード周辺のモジュールの局所密度を最適化する。３つのインシリコでの方法すべてにより、我々は、ＮＯＸ５を除くすべてのＮＯＸ遺伝子が内皮一酸化窒素環状ＧＭＰシグナル伝達の直接のネイバーとしては除外されるという、同じ結論に辿り着いた（図１Ａ）。

ヒト高血圧症に対するこの原因内皮ＮＯＸ５仮説を検証するために、我々は、本態性原発性高血圧症及び３０ｍＬ／分／１．７３ｍ^２以上のベースライン推算糸球体濾過量（ｅＧＦＲ，estimated glomerular filtration rate）を有する継続外来患者を登録した。研究対象を、健常（n = 10）、正常アルブミン尿（normo-albuminuria）を有する高血圧症患者（n = 20）及び中等度に上昇したアルブミン尿（moderately increased albuminuria）（以前は微量アルブミン尿と称されていた）を有する高血圧症患者（n = 20）の３群に分けた。患者のベースライン特性を表１に掲載する。ＮＯＸ５タンパク質レベルを測定するために、循環内皮マイクロパーティクル、すなわち、細胞活性化又は細胞死が生じると内皮細胞から放出され、内皮タンパク質を運搬する膜小胞（Dignat-George F, Boulanger CM. The many faces of endothelial microparticles. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 2011;31(1):27-33. Epub 2010/12/17. doi: 10.1161/ATVBAHA.110.218123. PubMed PMID: 21160065）を参加者の血漿から単離した（図１Ｂ）。我々は、正常血圧対象に対して、高血圧症対象の内皮マイクロパーティクルにおいてより高いＮＯＸ５タンパク質レベルを観察し、高血圧症対象内においては、微量アルブミン尿を有する患者がより一層高いＮＯＸ５タンパク質レベルを示した（図１Ｃ）。これらのデータは、ＮＯＸ５レベルが高血圧症と関連しており、疾患重症度と相関することを示唆する。高血圧症とは、すべてが同様の表現型、すなわち、血圧の上昇に至る異なる分子機序を包含し得る、かなり包括的な用語である。ＮＯＸ５依存性高血圧症はそのようなエンドタイプである可能性があるが、患者全体の一部にのみ適用される（Aguirre-Plans J, Pinero J, Menche J, Sanz F, Furlong LI, Schmidt H, et al. Proximal Pathway Enrichment Analysis for Targeting Comorbid Diseases via Network Endopharmacology. Pharmaceuticals (Basel). 2018;11(3). Epub 2018/06/23. doi: 10.3390/ph11030061. PubMed PMID: 29932108; PubMed Central PMCID: PMCPMC6160959、Mazein A, Ostaszewski M, Kuperstein I, Watterson S, Le Novere N, Lefaudeux D, et al. Systems medicine disease maps: community-driven comprehensive representation of disease mechanisms. NPJ Syst Biol Appl. 2018;4:21. Epub 2018/06/07. doi: 10.1038/s41540-018-0059-y. PubMed PMID: 29872544; PubMed Central PMCID: PMCPMC5984630、Burns NS, Miller PW. Learning What We Didn't Know - The SPRINT Data Analysis Challenge. N Engl J Med. 2017;376(23):2205-7. Epub 2017/04/27. doi: 10.1056/NEJMp1705323. PubMed PMID: 28445656）。したがって、我々は全高血圧症患者の下位群分析を実施したところ、実際にＮＯＸ５レベルは二峰性分布を示した（図１Ｄ）。これに基づくと、約４人に１人の高血圧症患者が高ＮＯＸ５メカノタイプに該当することになり、ＰＰＩ相互作用により、これはＮＯ－ｃＧＭＰシグナル伝達機能不全を引き起こすと考えられる。さらに我々は、ＮＯＳ脱共役及び内皮細胞機能不全のバイオマーカーである血漿中ＡＤＭＡレベル（Forstermann U, Munzel T. Endothelial nitric oxide synthase in vascular disease: from marvel to menace. Circulation. 2006;113(13):1708-14. Epub 2006/04/06. doi: 10.1161/CIRCULATIONAHA.105.602532. PubMed PMID: 16585403）を決定した。健常対象と比較して高血圧症患者においてＡＤＭＡレベルが有意に増加したことを我々は見出したが（図４）、これは過去の知見（Perticone F, Sciacqua A, Maio R, Perticone M, Maas R, Boger RH, et al. Asymmetric dimethylarginine, L-arginine, and endothelial dysfunction in essential primary hypertension. J Am Coll Cardiol. 2005;46(3):518-23. Epub 2005/08/02. doi: 10.1016/j.jacc.2005.04.040. PubMed PMID: 16053968、Sonmez A, Celebi G, Erdem G, Tapan S, Genc H, Tasci I, et al. Plasma apelin and ADMA Levels in patients with essential primary hypertension. Clin Exp Hypertens. 2010;32(3):179-83. Epub 2010/05/28. doi: 10.3109/10641960903254505. PubMed PMID: 20504125）と一致する。

表１中、トリグリセリドはｍｇ／ｄＬで表示し、血糖値はｍｇ／ｄＬであり、尿酸はｍｇ／ｄＬであり、アディポネクチンはｍｇ／ｄＬである。

我々は、マウスの内皮ＮＯ－ｃＧＭＰシグナル伝達機能不全及び高血圧症におけるＮＯＸ５の考えられ得る役割を検証した。しかし、マウスにはＮｏｘ５遺伝子がない。本発明はまた、対象におけるＮＯＸ５依存性高血圧症における使用のための、治療薬及び検出のための方法を発見及び開発するための、ノックインヒトＮｏｘ５遺伝子を有するマウスの使用に関する。したがって我々は、生理学的な内皮細胞の位置でヒトＮｏｘ５を発現しているノックインマウスモデル（Casas AI, Kleikers PW, Geuss E, Langhauser F, Adler T, Busch DH, et al. Calcium-dependent blood-brain barrier breakdown by NOX5 limits postreperfusion benefit in stroke. J Clin Invest. 2019;130:1772-8. Epub 2019/03/19. doi: 10.1172/JCI124283. PubMed PMID: 30882367; PubMed Central PMCID: PMCPMC6436900）を分析した（図２Ａ）。しかし、両性の若齢（９～１５週齢）ＮＯＸ５ＫＩマウス（n = 19～20）において、収縮期血圧、拡張期血圧及び平均動脈圧（ＭＡＰ）は、歳及び性別が一致する野生型（ＷＴ，wild type）マウスと差がなかった（図２Ｂ、２Ｃ及び図５Ａ）。だが加齢すると（６８～８７週）、歳及び性別が一致するＷＴマウス（n = 31）と比較して、ＫＩマウス（n = 33）において収縮期血圧及び平均動脈圧が終日にわたり有意に上昇した（図２Ｄ及び図５Ｂ）。心臓重量対体重比（図６Ａ）がＫＩマウスに心肥大がなかったことを示すように、拡張期血圧は不変であったが（図２Ｅ）、これは高血圧症の後期（年齢依存性）発症と整合する。さらに、心肥大は必ずしも高血圧症と共に存在するとは限らない。例えば、ｅＮＯＳノックアウト（ＫＯ，knock-out）マウスなどの他の高血圧症動物モデルは、心肥大を有さない（Bubikat A, De Windt LJ, Zetsche B, Fabritz L, Sickler H, Eckardt D, et al. Local atrial natriuretic peptide signaling prevents hypertensive cardiac hypertrophy in endothelial nitric-oxide synthase-deficient mice. J Biol Chem. 2005;280(22):21594-9. Epub 2005/03/29. doi: 10.1074/jbc.M501103200. PubMed PMID: 15793309、Godecke A, Decking UK, Ding Z, Hirchenhain J, Bidmon HJ, Godecke S, et al. Coronary hemodynamics in endothelial NO synthase knockout mice. Circ Res. 1998;82(2):186-94. Epub 1998/02/19. doi: 10.1161/01.res.82.2.186. PubMed PMID: 9468189）。このことは、すべての高血圧症患者（下位群）が心肥大を有するとは限らないという臨床観察（Devereux RB, Pickering TG, Alderman MH, Chien S, Borer JS, Laragh JH. Left ventricular hypertrophy in hypertension. Prevalence and relationship to pathophysiologic variables. Hypertension. 1987;9(2 Pt 2):1153-60. Epub 1987/02/01. doi: 10.1161/01.hyp.9.2_pt_2.ii53. PubMed PMID: 2879790、Park JB, Schiffrin EL. Small artery remodeling is the most prevalent (earliest?) form of target organ damage in mild essential primary hypertension. J Hypertens. 2001;19(5):921-30. Epub 2001/06/08. doi: 10.1097/00004872-200105000-00013. PubMed PMID: 11393676、Cuspidi C, Sala C, Negri F, Mancia G, Morganti A, Italian Society of H. Prevalence of left-ventricular hypertrophy in hypertension: an updated review of echocardiographic studies. J Hum Hypertens. 2012;26(6):343-9. Epub 2011/11/25. doi: 10.1038/jhh.2011.104. PubMed PMID: 22113443）とも一致する。注目すべきことに、群内においてオスのマウスとメスのマウスの間で血圧の差はなかった。

まとめると、我々による観察は、マウスにおいて、内皮におけるＮＯＸ５の発現が加齢の際に収縮期動脈血圧の選択的な上昇につながることを示している。高血圧症表現型を誘導するＮＯＸ５の潜在能力を確証した我々は、インシリコでのネットワーク分析から示唆された血管ＮＯ－ｃＧＭＰシグナル伝達との機序的なつながりを検証する方向に進んだ。

我々は、両性の高齢のノックイン(ＫＩ)及び野生型(ＷＴ)マウス（n = 9）から単離された胸部大動脈、大腿動脈及び伏在動脈において、構造的な平滑筋及び内皮血管運動特性を分析した。まとめると、これらの血管は、それぞれ、大型の弾性導管動脈、筋性導管動脈及び小型で抵抗を生じる太さの筋性動脈の全範囲を範囲に含む。高齢動物の胸部大動脈、大腿動脈及び伏在動脈において、ＫＩマウスとＷＴマウスの間で、弛緩時壁張力と動脈管腔直径の間の関係に差はなかった（図７Ａ～Ｃ）。したがって、ＫＩマウスの血圧表現型が、導管又は抵抗動脈の硬化又は内向きの組織修復に起因する可能性は低い。このことは、動脈の構造的硬化が本態性高血圧症の齧歯類モデルにおいて一般的ではないという、過去の研究（Bezie Y, Lamaziere JM, Laurent S, Challande P, Cunha RS, Bonnet J, et al. Fibronectin expression and aortic wall elastic modulus in spontaneously hypertensive rats. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 1998;18(7):1027-34. Epub 1998/07/22. doi: 10.1161/01.atv.18.7.1027. PubMed PMID: 9672062、Hayoz D, Rutschmann B, Perret F, Niederberger M, Tardy Y, Mooser V, et al. Conduit artery compliance and distensibility are not necessarily reduced in hypertension. Hypertension. 1992;20(1):1-6. Epub 1992/07/01. doi: 10.1161/01.hyp.20.1.1. PubMed PMID: 1618544、Lacolley P, Ghodsi N, Glazer E, Challande P, Brissac AM, Safar ME, et al. Influence of graded changes in vasomotor tone on the carotid arterial mechanics in live spontaneously hypertensive rats. Br J Pharmacol. 1995;115(7):1235-44. Epub 1995/08/01. doi: 10.1111/j.1476-5381.1995.tb15031.x. PubMed PMID: 7582551; PubMed Central PMCID: PMCPMC1908801、Intengan HD, Schiffrin EL. Structure and mechanical properties of resistance arteries in hypertension: role of adhesion molecules and extracellular matrix determinants. Hypertension. 2000;36(3):312-8. Epub 2000/09/16. doi: 10.1161/01.hyp.36.3.312. PubMed PMID: 10988257）と一致する。また、とりわけ高齢高血圧症患者からの臨床データが本発見と整合する（Bussy C, Boutouyrie P, Lacolley P, Challande P, Laurent S. Intrinsic stiffness of the carotid arterial wall material in essential hypertensives. Hypertension. 2000;35(5):1049-54. Epub 2000/05/20. doi: 10.1161/01.hyp.35.5.1049. PubMed PMID: 10818063、Laurent S, Girerd X, Mourad JJ, Lacolley P, Beck L, Boutouyrie P, et al. Elastic modulus of the radial artery wall material is not increased in patients with essential primary hypertension. Arterioscler Thromb. 1994;14(7):1223-31. Epub 1994/07/01. doi: 10.1161/01.atv.14.7.1223. PubMed PMID: 8018679、Laurent S, Hayoz D, Trazzi S, Boutouyrie P, Waeber B, Omboni S, et al. Isobaric compliance of the radial artery is increased in patients with essential primary hypertension. J Hypertens. 1993;11(1):89-98. Epub 1993/01/01. doi: 10.1097/00004872-199301000-00013. PubMed PMID: 8382244、Laurent S. Arterial wall hypertrophy and stiffness in essential hypertensive patients. Hypertension. 1995;26(2):355-62. Epub 1995/08/01. doi: 10.1161/01.hyp.26.2.355. PubMed PMID: 7635546）。

内皮依存性ＮＯ－ｃＧＭＰ媒介弛緩に対する内皮ＮＯＸ５の効果を検証するために、動脈セグメントを脱分極（Ｋ^＋）、α１－アドレナリン活性化（フェニレフリン）、又はエンドセリン１のいずれかによって予め収縮させ、次いで、古典的内皮由来弛緩因子刺激物質であるアセチルコリン（Ａｃｈ）によって血管弛緩を誘導した（Furchgott RF, Zawadzki JV. The obligatory role of endothelial cells in the relaxation of arterial smooth muscle by acetylcholine. Nature. 1980;288(5789):373-6. Epub 1980/11/27. doi: 10.1038/288373a0. PubMed PMID: 6253831）。大腿動脈では、Ｋ^＋、フェニレフリン、エンドセリン１のいずれで予め収縮させたかによらず、Ａｃｈ誘導性弛緩応答の振幅は、ＷＴマウスと比較してＫＩマウスにおいて有意に小さかった（図３Ａ、８Ａ及び８Ｄ）。逆に、伏在動脈（図３Ｂ、８Ｂ及び８Ｅ）及び胸部大動脈（図８Ｃ、８Ｆ及び８Ｇ）では、Ａｃｈ誘導性弛緩応答はＫＩマウスとＷＴマウスの間で差がなかった。我々の研究を過去の研究と比較すると、両マウス群の伏在動脈のＡｃｈ誘導性弛緩は減弱しているようであった（Chennupati R, Lamers WH, Koehler SE, De Mey JG. Endotheliumdependent hyperpolarization-related relaxations diminish with age in murine saphenous arteries of both sexes. Br J Pharmacol. 2013;169(7):1486-99. Epub 2013/03/16. doi: 10.1111/bph.12175. PubMed PMID: 23488619; PubMed Central PMCID: PMCPMC3724106、Chennupati R, Meens MJ, Marion V, Janssen BJ, Lamers WH, De Mey JG, et al. Endothelial arginine resynthesis contributes to the maintenance of vasomotor function in male diabetic mice. PLoS One. 2014;9(7):e102264. Epub 2014/07/18. doi: 10.1371/journal.pone.0102264. PubMed PMID: 25033204; PubMed Central PMCID: PMCPMC4102520、Chennupati R, Meens MJ, Janssen BJ, van Dijk P, Hakvoort TBM, Lamers WH, et al. Deletion of endothelial arginase 1 does not improve vasomotor function in diabetic mice. Physiol Rep. 2018;6(11):e13717. Epub 2018/06/12. doi: 10.14814/phy2.13717. PubMed PMID: 29890043; PubMed Central PMCID: PMCPMC5995309）。この不一致について、２つの説明が考えられる。１点目は、我々は非常に老いたマウスを使用し、他の研究では若齢マウスを使用している点である（Chennupati R, Lamers WH, Koehler SE, De Mey JG. Endotheliumdependent hyperpolarization-related relaxations diminish with age in murine saphenous arteries of both sexes. Br J Pharmacol. 2013;169(7):1486-99. Epub 2013/03/16. doi: 10.1111/bph.12175. PubMed PMID: 23488619; PubMed Central PMCID: PMCPMC3724106、Chennupati R, Meens MJ, Marion V, Janssen BJ, Lamers WH, De Mey JG, et al. Endothelial arginine resynthesis contributes to the maintenance of vasomotor function in male diabetic mice. PLoS One. 2014;9(7):e102264. Epub 2014/07/18. doi: 10.1371/journal.pone.0102264. PubMed PMID: 25033204; PubMed Central PMCID: PMCPMC4102520、Chennupati R, Meens MJ, Janssen BJ, van Dijk P, Hakvoort TBM, Lamers WH, et al. Deletion of endothelial arginase 1 does not improve vasomotor function in diabetic mice. Physiol Rep. 2018;6(11):e13717. Epub 2018/06/12. doi: 10.14814/phy2.13717. PubMed PMID: 29890043; PubMed Central PMCID: PMCPMC5995309）。２点目は、我々は混合型の遺伝的背景（８０％１２９／Ｓｖ及び２０％Ｃ５７ＢＩ６）を有するマウスを使用したが、過去のデータは、内皮依存性弛緩が１２９／ＳｖマウスとＣ５７ＢＩ６マウスとで似ていることを示している点である（Ryan MJ, Didion SP, Davis DR, Faraci FM, Sigmund CD. Endothelial dysfunction and blood pressure variability in selected inbred mouse strains. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 2002;22(1):42-8. Epub 2002/01/15. doi: 10.1161/hq0102.101098. PubMed PMID: 11788459）。

２５６ｎＭエンドセリン１で収縮させた胸部大動脈及び大腿動脈のセグメントにおいて、Ａｃｈの弛緩効果は１００μＭＬ－ＮＡＭＥ（ＮＯ合成酵素の薬理学的阻害剤）によって逆転し、これはＫＩ及びＷＴマウスの標本間で有意差はなかった（図８Ｈ及び８Ｉ）。両種のマウスの伏在動脈において、Ｌ－ＮＡＭＥはＡｃｈの弛緩効果を変えなかった（図８Ｊ）。このことは、これらの抵抗を生じる太さの動脈において、Ａｃｈ誘導性弛緩が内皮依存性過分極によって媒介されるがＮＯによっては媒介されないという、我々の以前の発見（Chennupati R, Lamers WH, Koehler SE, De Mey JG. Endotheliumdependent hyperpolarization-related relaxations diminish with age in murine saphenous arteries of both sexes. Br J Pharmacol. 2013;169(7):1486-99. Epub 2013/03/16. doi: 10.1111/bph.12175. PubMed PMID: 23488619; PubMed Central PMCID: PMCPMC3724106、Chennupati R, Meens MJ, Marion V, Janssen BJ, Lamers WH, De Mey JG, et al. Endothelial arginine resynthesis contributes to the maintenance of vasomotor function in male diabetic mice. PLoS One. 2014;9(7):e102264. Epub 2014/07/18. doi: 10.1371/journal.pone.0102264. PubMed PMID: 25033204; PubMed Central PMCID: PMCPMC4102520、Chennupati R, Meens MJ, Janssen BJ, van Dijk P, Hakvoort TBM, Lamers WH, et al. Deletion of endothelial arginase 1 does not improve vasomotor function in diabetic mice. Physiol Rep. 2018;6(11):e13717. Epub 2018/06/12. doi: 10.14814/phy2.13717. PubMed PMID: 29890043; PubMed Central PMCID: PMCPMC5995309）と整合している。

血管運動機能に対するこの内径特異的効果が、全身の動脈樹にわたるＮＯＸ５の発現差異に起因するかを調べるため、我々は定量的ＰＣＲによってＮＯＸ５遺伝子発現を測定した。しかし、ＮＯＸ５ＫＩマウスの胸部大動脈、大腿動脈及び伏在動脈の間でＮＯＸ５遺伝子発現に差はなかった（図９）。これらのデータは、ＮＯＸ５に起因する内皮ＮＯ－ｃＧＭＰシグナル伝達の加齢依存性機能不全を示唆するとともに、この効果が全身の動脈樹にわたって一様に分布していないことを示唆する。

次に我々は、一方で、下位にある動脈平滑筋層における慢性的変化が、高齢ＮＯＸ５ＫＩマウスにおいて観察された血圧及び血管運動表現型に寄与していた可能性があるかを検証した。しかし、Ｋ^＋に対する収縮応答並びにフェニレフリン及びエンドセリン１に対する感受性及び最大応答性は、すべての動脈セグメントにおいてＫＩマウスとＷＴマウスの間で差がなかった（図１０Ａ～Ｉ）。また、インドメタシンによるアゴニスト誘導性収縮応答の鈍化は、ＫＩ及びＷＴマウスの胸部大動脈において類似していた（図１０Ｇ～Ｉ）。

ＮＯ－ｃＧＭＰシグナル伝達のどの構成要素が最も影響を受けた可能性が高いかを検証するため、我々は内皮ＮＯ合成酵素（Gebhart V, Reiss K, Kollau A, Mayer B, Gorren ACF. Site and mechanism of uncoupling of nitric-oxide synthase: Uncoupling by monomerization and other misconceptions. Nitric Oxide. 2019;89:14-21. Epub 2019/04/26. doi: 10.1016/j.niox.2019.04.007. PubMed PMID: 31022534）、又は酸化型若しくはヘム未結合ａｐｏ－ｓＧＣを産するＮＯ受容体可溶性グアニル酸シクラーゼ（Mendes-Silverio CB, Leiria LO, Morganti RP, Anhe GF, Marcondes S, Monica FZ, et al. Activation of haem-oxidized soluble guanylyl cyclase with BAY 60-2770 in human platelets lead to overstimulation of the cyclic GMP signaling pathway. PLoS One. 2012;7(11):e47223. Epub 2012/11/13. doi: 10.1371/journal.pone.0047223. PubMed PMID: 23144808; PubMed Central PMCID: PMCPMC3493568、Stasch JP, Schmidt PM, Nedvetsky PI, Nedvetskaya TY, H SA, Meurer S, et al. Targeting the heme-oxidized nitric oxide receptor for selective vasodilatation of diseased blood vessels. J Clin Invest. 2006;116(9):2552-61. Epub 2006/09/07. doi: 10.1172/JCI28371. PubMed PMID: 16955146; PubMed Central PMCID: PMCPMC1555649）の酸化的損傷に対する、脱共役効果について調べた。ｓＧＣ／ａｐｏ－ｓＧＣについて調べるため、ＮＯドナー化合物及びｓＧＣ刺激物質ＰＡＰＡ／ＮＯ（０．０１～１０μＭ）（Hrabie JA, Klose JR, Wink DA, Keefer LK. New nitric oxide-releasing zwitterions derived from polyamines. The Journal of Organic Chemistry. 1993;58(6):1472-6. doi: 10.1021/jo00058a030）、並びにａｐｏｓＧＣ活性化物質ＢＡＹ６０－２７７０（０．０１～１０μＭ）（Mendes-Silverio CB, Leiria LO, Morganti RP, Anhe GF, Marcondes S, Monica FZ, et al. Activation of haem-oxidized soluble guanylyl cyclase with BAY 60-2770 in human platelets lead to overstimulation of the cyclic GMP signaling pathway. PLoS One. 2012;7(11):e47223. Epub 2012/11/13. doi: 10.1371/journal.pone.0047223. PubMed PMID: 23144808; PubMed Central PMCID: PMCPMC3493568）に対する弛緩応答を分析した。ＰＡＰＡ／ＮＯ（図１３Ａ～Ｃ）応答もＢＡＹ６０－２７７０（図１１Ｄ）応答も、ＷＴマウスとＫＩマウスの間で差はなかった。これらの観察結果は、ｓＧＣが高齢ＮＯＸ５ＫＩマウスにおいて機能不全性ではないことを示唆した。

内皮ＮＯＳの脱共役は、ＮＯＸ形成の減少及びスーパーオキシド生成の増加を特徴とする内皮細胞機能不全の主要因と考えられ、ＲＯＳがＮＯＳ補因子テトラヒドロビオプテリン（Ｈ_４Ｂｉｐ）を酸化するときに主に生じる（Kietadisorn R, Juni RP, Moens AL. Tackling endothelial dysfunction by modulating NOS uncoupling: new insights into its pathogenesis and therapeutic possibilities. Am J Physiol Endocrinol Metab. 2012;302(5):E481-95. Epub 2011/12/15. doi: 10.1152/ajpendo.00540.2011. PubMed PMID: 22167522）。我々がフェニレフリン、Ｈ_４Ｂｉｐ前駆体セピアプテリン（１００μＭ）で予め収縮させた高齢ＮＯＸ５ＫＩマウスの大腿動脈をインキュベートしたとき、Ａｃｈ誘導性弛緩は大いに改善し、ＷＴにおけるそれと区別不能になった（図３Ａ）。また、高齢ＮＯＸ５ＫＩマウスの大腿動脈は、ＷＴより高いスーパーオキシド生成を呈し（ＤＨＥ染色で示される）、この増加は、ＮＯＳ阻害剤Ｌ－ＮＡＭＥによる前治療で阻害された。

我々はまた、ＮＯＸ５ＫＩマウスの大腿動脈におけるＡｃｈ誘導性弛緩の障害が浴媒に抗酸化剤を添加することによって逆転し得るかを検証した。しかし、１０μＭＮ－アセチルシステインも１００μＭテンポールも効果的ではなかった（図１２）。まとめると、これらのデータは、内皮ＮＯＸ５は内皮ＮＯＳの脱共役によって内皮細胞機能不全を誘導し、筋性導管動脈の内皮依存性弛緩の障害、ひいては収縮期高血圧症に至らしめることを示唆する（図３Ｃ）。

要約すれば、ヒト遺伝子、ヒト臨床、及び遺伝的前臨床機序的検証に基づき、我々はここに、加齢に関連するヒト収縮期高血圧症の初めて特定された原因分子機序を報告する。このエンドタイプは４人の患者中約１人に影響を与え、分子的には、内皮ＮＯ合成酵素のＮＯＸ５誘導性脱共役と、筋性導管動脈における続く内皮依存性血管拡張の障害とからなる。循環マイクロパーティクルにおけるＮＯＸ５のレベルの上昇を検出することは、治療的介入に向けて患者を階層化するための、機序ベースの液体生検マーカーとして役立つと思われる。我々によるインビボ検証に基づけば、そのような介入は、Ｈ_４Ｂｉｐ前駆体及びＮＯＳ再共役剤であるセピアプテリン及びＮＯＸ５阻害剤を含み得る（Altenhofer S, Kleikers PW, Radermacher KA, Scheurer P, Rob Hermans JJ, Schiffers P, et al. The NOX toolbox: validating the role of NADPH oxidases in physiology and disease. Cell Mol Life Sci. 2012;69(14):2327-43. Epub 2012/06/01. doi: 10.1007/s00018-012-1010-9. PubMed PMID: 22648375; PubMed Central PMCID: PMCPMC3383958、Altenhofer S, Radermacher KA, Kleikers PW, Wingler K, Schmidt HH. Evolution of NADPH Oxidase Inhibitors: Selectivity and Mechanisms for Target Engagement. Antioxid Redox Signal. 2015;23(5):406-27. doi: 10.1089/ars.2013.5814. PubMed PMID: 24383718; PubMed Central PMCID: PMCPMC4543484、Augsburger F, Filippova A, Rasti D, Seredenina T, Lam M, Maghzal G, et al. Pharmacological characterization of the seven human NOX isoforms and their inhibitors. Redox Biol. 2019;26:101272. Epub 2019/07/23. doi: 10.1016/j.redox.2019.101272. PubMed PMID: 31330481; PubMed Central PMCID: PMCPMC6658998、Dao VT, Elbatreek MH, Altenhofer S, Casas AI, Pachado MP, Neullens CT, et al. Isoform-selective NADPH oxidase inhibitor panel for pharmacological target validation. Free Radic Biol Med. 2019. Epub 2019/12/29. doi: 10.1016/j.freeradbiomed.2019.12.038. PubMed PMID: 31883469）。

ここで我々は、内皮細胞及び白血球においてヒトＮＯＸ５を発現するＫＩマウスモデルを使用したが、これはヒトにおけるＮＯＸ５発現の生理学的パターンをかなりの程度模倣する（Casas AI, Kleikers PW, Geuss E, Langhauser F, Adler T, Busch DH, et al. Calcium-dependent blood-brain barrier breakdown by NOX5 limits postreperfusion benefit in stroke. J Clin Invest. 2019;130:1772-8. Epub 2019/03/19. doi: 10.1172/JCI124283. PubMed PMID: 30882367; PubMed Central PMCID: PMCPMC6436900）。マウスにおけるヒトＮＯＸ５の発現は、加齢と共に重度の収縮期高血圧症に至った。これは、全身の動脈樹における硬化、構造的組織修復、又は血管収縮神経刺激に対する感受性の増加に起因するものでなかった。これはむしろ、ＮＯＳの脱共役を介した、中間の太さの筋性導管動脈における、ＮＯ媒介内皮依存性弛緩の領域選択的かつ特異的な減衰によるものであった。

まとめると、我々によるデータは、ＮＯＸ５の上昇、例えば、酸化によって改変されたタンパク質によるＲＯＳ過剰生成、及びＮＯＸ５を阻害しＮＯＳを再共役させるネットワーク薬学アプローチによる機序ベースの機能修復の検出に基づいて注意深く階層化された高血圧症患者における、セラグノスティクス（Frangos S, Buscombe JR. Why should we be concerned about a “g”? European Journal of Nuclear Medicine and Molecular Imaging. 2019;46(2):519-. doi: 10.1007/s00259-018-4204-z）戦略を目指した概念実証型臨床試験を正当化する。これは、本態性原発性高血圧症という表現型の疾患定義に対する分子的再定義の初めてのケースであり、現在、治療必要数の多い適応症における精密医療への第一歩である。これは、高血圧症全体のおよそ４分の１に当てはまる可能性がある。

高血圧症が主要なリスク要因である（Hornsten C, Weidung B, Littbrand H, Carlberg B, Nordstrom P, Lovheim H, et al. High blood pressure as a risk factor for incident stroke among very old people: a population-based cohort study. J Hypertens. 2016;34(10):2059-65. Epub 2016/07/20. doi: 10.1097/HJH.0000000000001048. PubMed PMID: 27434102; PubMed Central PMCID: PMCPMC5398900）脳卒中においてＮＯＸ５も予後不良に関与し（Casas AI, Kleikers PW, Geuss E, Langhauser F, Adler T, Busch DH, et al. Calcium-dependent blood-brain barrier breakdown by NOX5 limits postreperfusion benefit in stroke. J Clin Invest. 2019;130:1772-8. Epub 2019/03/19. doi: 10.1172/JCI124283. PubMed PMID: 30882367; PubMed Central PMCID: PMCPMC6436900）、アテローム性動脈硬化症と相関がある（Guzik TJ, Chen W, Gongora MC, Guzik B, Lob HE, Mangalat D, et al. Calcium-dependent NOX5 nicotinamide adenine dinucleotide phosphate oxidase contributes to vascular oxidative stress in human coronary artery disease. J Am Coll Cardiol. 2008;52(22):1803-9. Epub 2008/11/22. doi: 10.1016/j.jacc.2008.07.063. PubMed PMID: 19022160; PubMed Central PMCID: PMCPMC2593790）ということから、本アプローチは、血圧を低下させるだけでなく、高血圧症の２つの大きな結果である脳卒中及び心筋梗塞も減らす可能性がある。

より広いスケールで、疾患モジュールの発見、前臨床的検証及び臨床的検証のための我々による今回の３重のインタラクトームベースのアプローチは、広範な一般的又は複雑な疾患に適用可能と思われる。我々はここで、ＮＯＸ５をＲＯＳとＮＯシグナル伝達の障害の間のミッシングリンクとして特定する。完全なモジュールは、ｃＧＭＰ依存性タンパク質キナーゼＰＫＧ１に加え、ＮＯＸ５、ＮＯＳ３、ＮＯ受容体ｓＧＣの異なるサブユニット、並びにホスホジエステラーゼＰＤＥ５及びＰＤＥ９からなる。このようなモジュールの調節不全は、異なるタンパク質コンポーネントを標的とする複数の薬物によって最も良好に治療される可能性がある。今回の場合、ＷＴマウスは薬理学的なＮＯＸ５阻害及びセピアプテリンによる治療、すなわち、ＮＯＳ再共役を模倣する。

疾患モジュール構築は、生物医学及びバイオインフォマティクスの境界にある若い研究分野である。我々は、臨床的に検証されたタンパク質に基づくシード遺伝子ベースのアプローチから始めた。ＮＯＸは、老齢患者におけるＧＷＡＳ（Kraja AT, Cook JP, Warren HR, Surendran P, Liu C, Evangelou E, et al. New Blood Pressure-Associated Loci Identified in Meta-Analyses of 475 000 Individuals. Circ Cardiovasc Genet. 2017;10(5). Epub 2017/10/17. doi: 10.1161/CIRCGENETICS.117.001778. PubMed PMID: 29030403; PubMed Central PMCID: PMCPMC5776077）によって示唆されたが、より若齢の患者（Li H, Han X, Hu Z, Huang J, Chen J, Hixson JE, et al. Associations of NADPH oxidase-related genes with blood pressure changes and incident hypertension: The GenSalt Study. J Hum Hypertens. 2018;32(4):287-93. Epub 2018/02/22. doi: 10.1038/s41371-018-0041-6. PubMed PMID: 29463833; PubMed Central PMCID: PMCPMC5889722）ではそうではなく、ＲＯＳ形成に特化した唯一知られている酵素ファミリーである（Elbatreek MH, Pachado MP, Cuadrado A, Jandeleit-Dahm K, Schmidt H. Reactive Oxygen Comes of Age: Mechanism-Based Therapy of Diabetic End-Organ Damage. Trends Endocrinol Metab. 2019. Epub 2019/04/01. doi: 10.1016/j.tem.2019.02.006. PubMed PMID: 30928357）。ＮＯ－ｃＧＭＰ経路は、血圧制御及び高血圧症の顕著な特徴であるその機能不全にとって重要である（Hermann M, Flammer A, Luscher TF. Nitric oxide in hypertension. J Clin Hypertens (Greenwich). 2006;8(12 Suppl 4):17-29. Epub 2006/12/16. doi: 10.1111/j.1524-6175.2006.06032.x. PubMed PMID: 17170603）。我々のアプローチにより、重要なことにＮｏｘ５をただ１つのＲＯＳ源として有する、十分に揃ったＮＯ－ｃＧＭＰシグナル伝達コンポーネントを含むモジュールが見出された。我々はこれらの発見を、２つの相補的なインシリコでのネットワークモジュール検出アプローチによって独立に確認した。

内皮マイクロパーティクルは、高血圧症及びその進行と関連する十分に確立された代替バイオマーカーである（Helbing T, Olivier C, Bode C, Moser M, Diehl P. Role of microparticles in endothelial dysfunction and arterial hypertension. World J Cardiol. 2014;6(11):1135-9. Epub 2014/11/28. doi: 10.4330/wjc.v6.i11.1135. PubMed PMID: 25429325; PubMed Central PMCID: PMCPMC4244610、Shantsila E. Endothelial microparticles: a universal marker of vascular health? J Hum Hypertens. 2009;23(5):359-61. Epub 2008/11/21. doi: 10.1038/jhh.2008.138. PubMed PMID: 19020535）。これらはＲＯＳを生成し、ＮＯＸを含有し、内皮細胞機能不全を誘発し及び内皮依存性弛緩を障害する（Burger D, Turner M, Munkonda MN, Touyz RM. Endothelial Microparticle-Derived Reactive Oxygen Species: Role in Endothelial Signaling and Vascular Function. Oxid Med Cell Longev. 2016;2016:5047954. Epub 2016/06/18. doi: 10.1155/2016/5047954. PubMed PMID: 27313830; PubMed Central PMCID: PMCPMC4893592）。ヒト内皮細胞において、臨床で使用されるアンジオテンシン１型受容体遮断薬及びアンジオテンシン変換酵素阻害剤の標的であるアンジオテンシンIIと、高血圧症促進性オータコイドであるエンドセリン１とが、ＮＯＸ５発現（遺伝子及びタンパク質）及び活性を増加させる（Montezano AC, Burger D, Paravicini TM, Chignalia AZ, Yusuf H, Almasri M, et al. Nicotinamide adenine dinucleotide phosphate reduced oxidase 5 (Nox5) regulation by angiotensin II and endothelin-1 is mediated via calcium/calmodulin-dependent, rac-1-independent pathways in human endothelial cells. Circ Res. 2010;106(8):1363-73. Epub 2010/03/27. doi: 10.1161/CIRCRESAHA.109.216036. PubMed PMID: 20339118; PubMed Central PMCID: PMCPMC3119893）。ＮＯＸ５は、内皮細胞におけるその生理学的な血管発現に加え、高血圧症患者のヒト腎近位尿細管細胞においてもより高いレベルへと増加し（Yu P, Han W, Villar VA, Yang Y, Lu Q, Lee H, et al. Unique role of NADPH oxidase 5 in oxidative stress in human renal proximal tubule cells. Redox Biol. 2014;2:570-9. Epub 2014/04/02. doi: 10.1016/j.redox.2014.01.020. PubMed PMID: 24688893; PubMed Central PMCID: PMCPMC3969603）、このことが、ＮＯＸ５、血圧及び微量アルブミン尿の観察された相関に寄与している可能性がある。平滑筋細胞におけるＮＯＸ５の誘導は高血圧症それ自体を引き起こさないが、アテローム性動脈硬化症病変の進行と相関し、罹病した冠動脈は高いＮＯＸ５発現及び活性を示す（Guzik TJ, Chen W, Gongora MC, Guzik B, Lob HE, Mangalat D, et al. Calcium-dependent NOX5 nicotinamide adenine dinucleotide phosphate oxidase contributes to vascular oxidative stress in human coronary artery disease. J Am Coll Cardiol. 2008;52(22):1803-9. Epub 2008/11/22. doi: 10.1016/j.jacc.2008.07.063. PubMed PMID: 19022160; PubMed Central PMCID: PMCPMC2593790）。高血圧症とは、異なる血圧上昇機序に対する、かなり包括的な用語である。これらのうちの一部が不良な臨床成績と関係し、一部はそうではない可能性がある。しかし、ＮＯＸ５依存性高血圧症は、この分子機序もまた高血圧症関連臨床成績、脳卒中（Casas AI, Kleikers PW, Geuss E, Langhauser F, Adler T, Busch DH, et al. Calcium-dependent blood-brain barrier breakdown by NOX5 limits postreperfusion benefit in stroke. J Clin Invest. 2019;130:1772-8. Epub 2019/03/19. doi: 10.1172/JCI124283. PubMed PMID: 30882367; PubMed Central PMCID: PMCPMC6436900）、心筋梗塞（Hahn NE, Meischl C, Kawahara T, Musters RJ, Verhoef VM, van der Velden J, et al. NOX5 expression is increased in intramyocardial blood vessels and cardiomyocytes after acute myocardial infarction in humans. Am J Pathol. 2012;180(6):2222-9. Epub 2012/04/17. doi: 10.1016/j.ajpath.2012.02.018. PubMed PMID: 22503554）及び腎不全（Yu P, Han W, Villar VA, Yang Y, Lu Q, Lee H, et al. Unique role of NADPH oxidase 5 in oxidative stress in human renal proximal tubule cells. Redox Biol. 2014;2:570-9. Epub 2014/04/02. doi: 10.1016/j.redox.2014.01.020. PubMed PMID: 24688893; PubMed Central PMCID: PMCPMC3969603、Holterman CE, Thibodeau JF, Kennedy CR. NADPH oxidase 5 and renal disease. Curr Opin Nephrol Hypertens. 2015;24(1):81-7. Epub 2014/11/22. doi: 10.1097/MNH.0000000000000081. PubMed PMID: 25415612）に至るか又はこれを増悪させることから、疾患に関係があると思われる。

ＧＷＡＳにより、Ｎｏｘ４及びＮｏｘ５の２つのＮＯＸ候補遺伝子が提唱された。Ｎｏｘ４のノックアウトは血圧表現型を伴わず（Kleinschnitz C, Grund H, Wingler K, Armitage ME, Jones E, Mittal M, et al. Post-stroke inhibition of induced NADPH oxidase type 4 prevents oxidative stress and neurodegeneration. PLoS biology. 2010;8(9). Epub 2010/09/30. doi: 10.1371/journal.pbio.1000479. PubMed PMID: 20877715、Bouabout G, Ayme-Dietrich E, Jacob H, Champy MF, Birling MC, Pavlovic G, et al. Nox4 genetic inhibition in experimental hypertension and metabolic syndrome. Arch Cardiovasc Dis. 2018;111(1):41-52. Epub 2017/11/09. doi: 10.1016/j.acvd.2017.03.011. PubMed PMID: 29113787）、多くのモデルにおいて、Ｎｏｘ４はむしろ血管保護的であった（Ray R, Murdoch CE, Wang M, Santos CX, Zhang M, Alom-Ruiz S, et al. Endothelial Nox4 NADPH oxidase enhances vasodilatation and reduces blood pressure in vivo. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 2011;31(6):1368-76. Epub 2011/03/19. doi: 10.1161/ATVBAHA.110.219238. PubMed PMID: 21415386、Schroder K, Zhang M, Benkhoff S, Mieth A, Pliquett R, Kosowski J, et al. Nox4 is a protective reactive oxygen species generating vascular NADPH oxidase. Circ Res. 2012;110(9):1217-25. Epub 2012/03/30. doi: 10.1161/CIRCRESAHA.112.267054. PubMed PMID: 22456182、Veith C, Kraut S, Wilhelm J, Sommer N, Quanz K, Seeger W, et al. NADPH oxidase 4 is not involved in hypoxia-induced pulmonary hypertension. Pulm Circ. 2016;6(3):397-400. Epub 2016/09/30. doi: 10.1086/687756. PubMed PMID: 27683617; PubMed Central PMCID: PMCPMC5019094）。ＮＯＸ４の酵素反応産物であるＨ_２Ｏ_２はＮＯＳを活性化し（Brandes RP, Takac I, Schroder K. No superoxide--no stress?: Nox4, the good NADPH oxidase! Arterioscler Thromb Vasc Biol. 2011;31(6):1255-7. Epub 2011/05/20. doi: 10.1161/ATVBAHA.111.226894. PubMed PMID: 21593458）、それ自体がもう１つの内皮由来弛緩因子である（Miura H, Bosnjak JJ, Ning G, Saito T, Miura M, Gutterman DD. Role for hydrogen peroxide in flow-induced dilation of human coronary arterioles. Circ Res. 2003;92(2):e31-40. Epub 2003/02/08. doi: 10.1161/01.res.0000054200.44505.ab. PubMed PMID: 12574154、Leurgans TM, Bloksgaard M, Brewer JR, Bagatolli LA, Fredgart MH, Rosenstand K, et al. Endothelin-1 shifts the mediator of bradykinin-induced relaxation from NO to H₂O₂ in resistance arteries from patients with cardiovascular disease. Br J Pharmacol. 2016;173(10):1653-64. Epub 2016/02/26. doi: 10.1111/bph.13467. PubMed PMID: 26914408; PubMed Central PMCID: PMCPMC4842913、Shimokawa H. Hydrogen peroxide as an endothelium-derived hyperpolarizing factor. Pflugers Arch. 2010;459(6):915-22. Epub 2010/02/09. doi: 10.1007/s00424-010-0790-8. PubMed PMID: 20140449）。これによりＮｏｘ５は候補遺伝子とされ、ＮＯ－ｃＧＭＰシグナル伝達と関連づけられた第１ネイバー分析によりこのことが確かめられた。ＮＯＸ４とは異なり、ＮＯＸ５は、セピアプテリン可逆的な様式（Mitchell BM, Dorrance AM, Webb RC. GTP cyclohydrolase 1 inhibition attenuates vasodilation and increases blood pressure in rats. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 2003;285(5):H2165-70. Epub 2003/07/12. doi: 10.1152/ajpheart.00253.2003. PubMed PMID: 12855421）におけるＨ_４Ｂｉｐの酸化により、高血圧症において内皮ＮＯ合成酵素を脱共役させることができるスーパーオキシドを生成する（Landmesser U, Dikalov S, Price SR, McCann L, Fukai T, Holland SM, et al. Oxidation of tetrahydrobiopterin leads to uncoupling of endothelial cell nitric oxide synthase in hypertension. J Clin Invest. 2003;111(8):1201-9. Epub 2003/04/17. doi: 10.1172/JCI14172. PubMed PMID: 12697739; PubMed Central PMCID: PMCPMC152929、Dumitrescu C, Biondi R, Xia Y, Cardounel AJ, Druhan LJ, Ambrosio G, et al. Myocardial ischemia results in tetrahydrobiopterin (BH₄) oxidation with impaired endothelial function ameliorated by BH₄. Proc Natl Acad Sci U S A. 2007;104(38):15081-6. Epub 2007/09/13. doi: 10.1073/pnas.0702986104. PubMed PMID: 17848522; PubMed Central PMCID: PMCPMC1986616）。高血圧症におけるＮＯＸ５のこの役割に対する機序的検討が、マウスゲノムには存在しないＮＯＸ５を発現する前臨床マウスＫＩモデルにおいて、ＮＯＸ５が内皮移動及び血管新生にとって重要である内皮細胞という生理学的細胞型で実施された（Pi X, Xie L, Portbury AL, Kumar S, Lockyer P, Li X, et al. NADPH oxidase-generated reactive oxygen species are required for stromal cell-derived factor-1alphastimulated angiogenesis. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 2014;34(9):2023-32. Epub 2014/07/06. doi: 10.1161/ATVBAHA.114.303733. PubMed PMID: 24990230; PubMed Central PMCID: PMCPMC4149803）。平滑筋細胞内で非生理学的にＮＯＸ５を発現するマウスにおいて、血圧は正常であり、アンジオテンシンII誘導性圧迫効果は増強されない（Montezano AC, De Lucca Camargo L, Persson P, Rios FJ, Harvey AP, Anagnostopoulou A, et al. NADPH Oxidase 5 Is a Pro-Contractile Nox Isoform and a Point of Cross-Talk for Calcium and Redox Signaling-Implications in Vascular Function. J Am Heart Assoc. 2018;7(12). Epub 2018/06/17. doi: 10.1161/JAHA.118.009388. PubMed PMID: 29907654; PubMed Central PMCID: PMCPMC6220544）。特に興味深いのはＮＯＸ５の領域選択的な効果であるが、これは、加齢内皮細胞機能不全における血管の不均一性を暗示していた（Barton M, Cosentino F, Brandes RP, Moreau P, Shaw S, Luscher TF. Anatomic heterogeneity of vascular aging: role of nitric oxide and endothelin. Hypertension. 1997;30(4):817-24. Epub 1997/10/23. doi: 10.1161/01.hyp.30.4.817. PubMed PMID: 9336378、Matz RL, de Sotomayor MA, Schott C, Stoclet JC, Andriantsitohaina R. Vascular bed heterogeneity in age-related endothelial dysfunction with respect to NO and eicosanoids. Br J Pharmacol. 2000;131(2):303-11. Epub 2000/09/19. doi: 10.1038/sj.bjp.0703568. PubMed PMID: 10991924; PubMed Central PMCID: PMCPMC1572322）。ＮＯＸ５は、ＫＩマウスの筋性大腿導管動脈には存在するが、小型で抵抗を生じる太さの伏在動脈には存在せず、したがって、動脈パルス圧の上昇を伴う収縮期高血圧症が選択的に生じ得る。この効果は我々の抗酸化剤によるエクスビボでの実験では逆転されなかったが、これは、ＮＯＸ５由来スーパーオキシドによってＮＯＳ脱共役が既にインビボで慢性的に確立されていたことによると考えられる。前臨床において、セピアプテリン又はＨ_４ＢｉｐはＮＯＳ脱共役によって誘導されて上昇した血圧を低下させる（Wang S, Xu J, Song P, Wu Y, Zhang J, Chul Choi H, et al. Acute inhibition of guanosine triphosphate cyclohydrolase 1 uncouples endothelial nitric oxide synthase and elevates blood pressure. Hypertension. 2008;52(3):484-90. Epub 2008/07/23. doi: 10.1161/HYPERTENSIONAHA.108.112094. PubMed PMID: 18645049; PubMed Central PMCID: PMCPMC3523107、Podjarny E, Hasdan G, Bernheim J, Rashid G, Green J, Korzets Z, et al. Effect of chronic tetrahydrobiopterin supplementation on blood pressure and proteinuria in 5/6 nephrectomized rats. Nephrol Dial Transplant. 2004;19(9):2223-7. Epub 2004/07/15. doi: 10.1093/ndt/gfh383. PubMed PMID: 15252157）。

我々の発見の臨床的次元に関して、高血圧症患者において血漿中ＡＤＭＡレベルが上昇したという我々の観察結果は、ＮＯＳ脱共役を支持するものであるが（Perticone F, Sciacqua A, Maio R, Perticone M, Maas R, Boger RH, et al. Asymmetric dimethylarginine, L-arginine, and endothelial dysfunction in essential primary hypertension. J Am Coll Cardiol. 2005;46(3):518-23. Epub 2005/08/02. doi: 10.1016/j.jacc.2005.04.040. PubMed PMID: 16053968、Sonmez A, Celebi G, Erdem G, Tapan S, Genc H, Tasci I, et al. Plasma apelin and ADMA Levels in patients with essential primary hypertension. Clin Exp Hypertens. 2010;32(3):179-83. Epub 2010/05/28. doi: 10.3109/10641960903254505. PubMed PMID: 20504125）、ＮＯＸ５ＫＩマウスにおいて前臨床で我々が得たのと類似したＮＯＸ５との機序的なつながりについて、単離されたヒト血管のエクスビボでの分析又はセピアプテリンを用いた介在的な治験が必要となると思われる。実際、セピアプテリン類似体、すなわち、葉酸及びＨ_４Ｂｉｐは、内皮機能を改善することにより上昇した血圧を低下させるのに臨床的に有効である（Porkert M, Sher S, Reddy U, Cheema F, Niessner C, Kolm P, et al. Tetrahydrobiopterin: a novel antihypertensive therapy. J Hum Hypertens. 2008;22(6):401-7. Epub 2008/03/07. doi: 10.1038/sj.jhh.1002329. PubMed PMID: 18322548、McRae MP. High-dose folic acid supplementation effects on endothelial function and blood pressure in hypertensive patients: a meta-analysis of randomized controlled clinical trials. J Chiropr Med. 2009;8(1):15-24. Epub 2009/08/04. doi: 10.1016/j.jcm.2008.09.001. PubMed PMID: 19646382; PubMed Central PMCID: PMCPMC2697578）。葉酸は、単独（Kong X, Huang X, Zhao M, Xu B, Xu R, Song Y, et al. Platelet Count Affects Efficacy of Folic Acid in Preventing First Stroke. J Am Coll Cardiol. 2018;71(19):2136-46. Epub 2018/05/12. doi: 10.1016/j.jacc.2018.02.072. PubMed PMID: 29747834）又は降圧薬との組合せ（Huo Y, Li J, Qin X, Huang Y, Wang X, Gottesman RF, et al. Efficacy of folic acid therapy in primary prevention of stroke among adults with hypertension in China: the CSPPT randomized clinical trial. JAMA. 2015;313(13):1325-35. Epub 2015/03/17. doi: 10.1001/jama.2015.2274. PubMed PMID: 25771069、Wang WW, Wang XS, Zhang ZR, He JC, Xie CL. A Meta-Analysis of Folic Acid in Combination with Anti-Hypertension Drugs in Patients with Hypertension and Hyperhomocysteinemia. Front Pharmacol. 2017;8:585. Epub 2017/09/16. doi: 10.3389/fphar.2017.00585. PubMed PMID: 28912716; PubMed Central PMCID: PMCPMC5584015）において、高血圧症患者における心血管及び脳血管事象のリスクを低減させる。

全体として、インシリコでのネットワークアプローチ並びにさらなる臨床的及び前臨床的検証を使用した我々の発見は、酸化ストレス、内皮細胞機能不全及び収縮期高血圧症の間の長期にわたって観察された相関を説明する。ヒト化内皮細胞ＮＯＸ５ＫＩマウスは、ヒト加齢高血圧症及び内皮細胞機能不全の最初の機序ベースの動物モデルである。理想的には、例えば、内皮マイクロパーティクル液体生検試料に基づく機序的バイオマーカー階層化と組み合わせたＮＯＸ５阻害及びＮＯＳ再共役は、治療上では、対症的な血管拡張薬を不要のものとする治癒的降圧療法のための、ファースト・イン・クラスの機序ベースのアプローチである。

要約すると、高血圧症は、高齢者における死及び身体障害の最も重要な原因である。しかし、１０症例のうち９症例において、分子的原因は今もなお不明のままである。この群は、通常は原発性動脈性高血圧症と称される。

本明細書において、我々は、現在もなお治療抵抗性高血圧症とみなされている、原発性動脈性高血圧症症例の少なくとも大部分の背後にある機序を特定する。

我々は、反応性酸素種（ＲＯＳ）による内皮依存性血管拡張の障害を伴うこの機序を特定した。我々は、ＲＯＳ形成Ｎｏｘ遺伝子が高血圧症と関連していることを見出しており、本明細書において、齧歯類には存在しないＮｏｘ５をヒト血管拡張性内皮一酸化窒素（ＮＯ）シグナル伝達の唯一のネイバーとして特定する。

我々は、高血圧症患者において、疾患重症度と相関して、内皮マイクロパーティクルが二峰性分布を伴うより高いレベルのＮＯＸ５を含有することを見出した。

高レベルの循環ＮＯＸ５レベルを有する対象は、ＮＯＸ５阻害剤又はセピアプテリン、Ｌ－シトルリン、Ｌ－アルギニン、テトラヒドロビオプテリン及び葉酸からなる群から選択される化合物で効果的に治療できるであろうと思われた。適切なＮＯＸ５阻害剤の一例は、ＭＬ０９０である。

我々は、内皮細胞中でヒトＮＯＸ５を発現するマウスは、加齢時に、脱共役したＮＯ合成酵素に起因する重度の収縮期高血圧症及び内皮依存性血管拡張の障害を発症することを見出した。我々は、内皮型ＮＯ合成酵素のＮＯＸ５誘導性脱共役が加齢高血圧症エンドタイプの原因機序及び治療標的であると結論する。我々は、Ｎｏｘ５ノックインマウスが高血圧症の最初の機序ベースの動物モデルであると結論する。

したがって、一実施形態において、本発明は、対象における本態性動脈性高血圧症を診断するための新規の方法であって、対象からの体液試料中又は組織試料中においてＮＡＤＰＨオキシダーゼ５（ＮＯＸ５）のレベルが決定され、ＮＯＸ５のレベルが所定の閾値レベルを上回る場合、前記対象が（ＮＯＸ５依存性）本態性動脈性高血圧症を有すると結論づけられる、方法に関する。この方法は、これまでに治療抵抗性高血圧症と呼ばれていた疾病を有する対象を特定する。それらの症例は、ＮＯＸ５阻害剤又はセピアプテリン、Ｌ－シトルリン、Ｌ－アルギニン、テトラヒドロビオプテリン及び葉酸からなる群から選択される化合物で今や有効に治療され得る。それらの症例は、分子構造（Ｉ）：

を有するＮＯＸ５阻害剤ＭＬ０９０（５，１２－ジヒドロキノキサリノ（２，３－Ｂ）キノキサリン）で今や有効に治療され得る。

本発明はさらに、本態性動脈性高血圧症を罹患している対象から得られた血漿試料中において、１ｍｌ当たり少なくとも１６０ｐｇのニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸（ＮＡＤＰＨ）オキシダーゼ５（ＮＯＸ５）濃度の存在について試験することによる、対象におけるＮＯＸ５依存性高血圧症を診断する方法に関する。

さらなる実施形態において、本発明は、本態性動脈性高血圧症を罹患している対象から得られた血漿試料中において、１ｍｌ当たり少なくとも１６０ｐｇのニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸（ＮＡＤＰＨ）オキシダーゼ５（ＮＯＸ５）濃度の存在について試験することによる、対象におけるＮＯＸ５依存性高血圧症を診断する方法であって、前記対象が、少なくとも１４０ｍｍＨｇの収縮期血圧、少なくとも９０ｍｍＨｇの拡張期血圧、又は降圧薬の使用として定義される高血圧症に罹患している、方法を提供する。

さらなる実施形態において、本発明は、本態性動脈性高血圧症を罹患している対象から得られた血漿試料中において、１ｍｌ当たり少なくとも１６０ｐｇのニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸（ＮＡＤＰＨ）オキシダーゼ５（ＮＯＸ５）濃度の存在について試験することによる、対象におけるＮＯＸ５依存性高血圧症を診断する方法であって、前記対象が、アンギナ、心筋梗塞、うっ血性心不全、末梢血管疾患、炎症性疾患及び血管炎に罹りやすいいずれかの疾患のいずれかの病歴又は臨床的証拠を有しておらず、かつ、対象がステージ４又はステージ５の慢性腎臓病を有していない、方法を提供する。

本発明はさらに、対象からの体液試料中又は組織試料中においてＮＯＸ５のレベルを決定することを含む、対象におけるＮＯＸ５依存性高血圧症を診断する方法であって、ＮＯＸ５のレベルが１ｍｌ当たり１６０ｐｇを上回る場合、前記対象がＮＯＸ５依存性高血圧症を有すると結論づけられる、方法に関する。

さらなる実施形態において、本発明は、対象からの体液試料中又は組織試料中においてＮＯＸ５のレベルを決定することを含む、対象におけるＮＯＸ５依存性高血圧症を診断する方法であって、ＮＯＸ５のレベルが１ｍｌ当たり１６０ｐｇを上回る場合、前記対象がＮＯＸ５依存性高血圧症を有すると結論づけられ、前記体液試料又は組織試料が血漿試料である、方法に関する。

さらなる実施形態において、本発明は、対象からの体液試料中又は組織試料中においてＮＯＸ５のレベルを決定することを含む、対象におけるＮＯＸ５依存性高血圧症を診断する方法であって、ＮＯＸ５のレベルが１ｍｌ当たり１６０ｐｇを上回る場合、前記対象がＮＯＸ５依存性高血圧症を有すると結論づけられ、前記対象が、少なくとも１４０ｍｍＨｇの収縮期血圧、少なくとも９０ｍｍＨｇの拡張期血圧、又は降圧薬の使用として定義される高血圧症に罹患している、方法を提供する。

さらなる実施形態において、本発明は、対象からの体液試料中又は組織試料中においてＮＯＸ５のレベルを決定することを含む、対象におけるＮＯＸ５依存性高血圧症を診断する方法であって、ＮＯＸ５のレベルが１ｍｌ当たり１６０ｐｇを上回る場合、前記対象がＮＯＸ５依存性高血圧症を有すると結論づけられ、前記対象が、アンギナ、心筋梗塞、うっ血性心不全、末梢血管疾患、炎症性疾患及び血管炎に罹りやすいいずれかの疾患のいずれかの病歴又は臨床的証拠を有しておらず、かつ、対象がステージ４又はステージ５の慢性腎臓病を有していない、方法を提供する。

本発明はさらに、本態性動脈性高血圧症、特に、ＮＯＸ５依存性高血圧症を有する対象の治療における使用のための、セピアプテリン、Ｌ－シトルリン、Ｌ－アルギニン、テトラヒドロビオプテリン、葉酸及びＮＯＸ５阻害剤、特に、ＮＯＸ５阻害剤５，１２－ジヒドロキノキサリノ（２，３－Ｂ）キノキサリン（ＭＬ０９０）からなる群から選択される化合物に関する。

さらなる実施形態において、本発明はさらに、本態性動脈性高血圧症を有する対象を治療する方法における使用のための、セピアプテリン、葉酸、Ｌ－シトルリン、Ｌ－アルギニン及びテトラヒドロビオプテリンから選択される化合物であって、本態性動脈性高血圧症を有する前記対象が、血漿１ｍｌ当たり少なくともＮＯＸ５１６０ｐｇのＮＯＸ５血漿中濃度を有することを特徴とし、前記本態性動脈性高血圧症がＮＯＸ５依存性高血圧症である、化合物に関する。

さらなる実施形態において、本発明は、本態性動脈性高血圧症を有する対象を治療する方法における使用のための、セピアプテリン、葉酸、Ｌ－シトルリン、Ｌ－アルギニン及びテトラヒドロビオプテリンから選択される化合物であって、本態性動脈性高血圧症を有する前記対象が、血漿１ｍｌ当たり少なくともＮＯＸ５１６０ｐｇのＮＯＸ５血漿中濃度を有することを特徴とする、セピアプテリンである化合物に関する。

さらなる実施形態において、本発明は、本態性動脈性高血圧症を有する対象を治療する方法における使用のための、セピアプテリン、葉酸、Ｌ－シトルリン、Ｌ－アルギニン及びテトラヒドロビオプテリンから選択される化合物であって、本態性動脈性高血圧症を有する前記対象が、血漿１ｍｌ当たり少なくともＮＯＸ５１６０ｐｇのＮＯＸ５血漿中濃度を有することを特徴とし、前記対象が、毎分２０～２００ｍｇのアルブミン排泄速度として定義される中等度に上昇したアルブミン尿を有する、化合物に関する。

さらなる実施形態において、本発明は、本態性動脈性高血圧症を有する対象を治療する方法における使用のための、セピアプテリン、葉酸、Ｌ－シトルリン、Ｌ－アルギニン及びテトラヒドロビオプテリンから選択される化合物であって、本態性動脈性高血圧症を有する前記対象が、血漿１ｍｌ当たり少なくともＮＯＸ５１６０ｐｇのＮＯＸ５血漿中濃度を有することを特徴とし、本発明に係る方法の少なくとも１つによって前記対象がＮＯＸ５依存性高血圧症に罹患していると診断される、化合物に関する。

さらなる実施形態において、本発明は、本態性動脈性高血圧症を有する対象を治療する方法における使用のための、セピアプテリン、葉酸、Ｌ－シトルリン、Ｌ－アルギニン及びテトラヒドロビオプテリンから選択される化合物であって、本態性動脈性高血圧症を有する前記対象が、血漿１ｍｌ当たり少なくともＮＯＸ５１６０ｐｇのＮＯＸ５血漿中濃度を有することを特徴とし、前記対象が少なくとも５３歳である、化合物に関する。

さらなる実施形態において、本発明は、本態性動脈性高血圧症を有する対象を治療する方法における使用のための、セピアプテリン、葉酸、Ｌ－シトルリン、Ｌ－アルギニン及びテトラヒドロビオプテリンから選択される化合物であって、本態性動脈性高血圧症を有する前記対象が、血漿１ｍｌ当たり少なくともＮＯＸ５１６０ｐｇのＮＯＸ５血漿中濃度を有することを特徴とし、前記対象が少なくとも５７歳である、化合物に関する。

さらなる実施形態において、本発明は、本態性動脈性高血圧症を有する対象を治療する方法における使用のための、セピアプテリン、葉酸、Ｌ－シトルリン、Ｌ－アルギニン及びテトラヒドロビオプテリンから選択される化合物であって、本態性動脈性高血圧症を有する前記対象が、血漿１ｍｌ当たり少なくともＮＯＸ５１６０ｐｇのＮＯＸ５血漿中濃度を有することを特徴とし、前記対象が、健常対象の群の非対称型ジメチルアルギニンの平均血漿中濃度と比較してより高い非対称型ジメチルアルギニンの血漿中濃度を有する、化合物に関する。

さらなる実施形態において、本発明は、本態性動脈性高血圧症を有する対象を治療する方法における使用のための、セピアプテリン、葉酸、Ｌ－シトルリン、Ｌ－アルギニン及びテトラヒドロビオプテリンから選択される化合物であって、本態性動脈性高血圧症を有する前記対象が、血漿１ｍｌ当たり少なくともＮＯＸ５１６０ｐｇのＮＯＸ５血漿中濃度を有することを特徴とし、前記対象が、１リットル当たり少なくとも０．５３マイクロモル、好ましくは１リットル当たり少なくとも０．５８マイクロモル、より好ましくは１リットル当たり少なくとも０．６３マイクロモルの非対称型ジメチルアルギニンの血漿中濃度を有する、化合物に関する。

さらなる実施形態において、本発明は、本態性動脈性高血圧症を有する対象を治療する方法における使用のための、セピアプテリン、葉酸、Ｌ－シトルリン、Ｌ－アルギニン及びテトラヒドロビオプテリンから選択される化合物であって、本態性動脈性高血圧症を有する前記対象が、血漿１ｍｌ当たり少なくともＮＯＸ５１６０ｐｇのＮＯＸ５血漿中濃度を有することを特徴とし、前記対象が、少なくとも１４０ｍｍＨｇの収縮期血圧、少なくとも９０ｍｍＨｇの拡張期血圧、又は降圧薬の使用として定義される高血圧症に罹患している、化合物に関する。

さらなる実施形態において、本発明は、治療抵抗性高血圧症を有する対象を治療する方法における使用のための、セピアプテリン、葉酸、Ｌ－シトルリン、Ｌ－アルギニン及びテトラヒドロビオプテリンから選択される化合物であって、前記対象が、血漿１ｍｌ当たり少なくともＮＯＸ５１６０ｐｇのＮＯＸ５血漿中濃度を有する、化合物に関する。

さらなる実施形態において、本発明は、治療抵抗性高血圧症を有する対象を治療する方法における使用のための、セピアプテリン、葉酸、Ｌ－シトルリン、Ｌ－アルギニン及びテトラヒドロビオプテリンから選択される化合物であって、セピアプテリンである化合物に関する。

さらなる実施形態において、本発明は、治療抵抗性高血圧症を有する対象を治療する方法における使用のための、セピアプテリン、葉酸、Ｌ－シトルリン、Ｌ－アルギニン及びテトラヒドロビオプテリンから選択される化合物であって、前記対象が、毎分２０～２００ｍｇのアルブミン排泄速度として定義される中等度に上昇したアルブミン尿を有する、化合物に関する。

さらなる実施形態において、本発明は、治療抵抗性高血圧症を有する対象を治療する方法における使用のための、セピアプテリン、葉酸、Ｌ－シトルリン、Ｌ－アルギニン及びテトラヒドロビオプテリンから選択される化合物であって、本発明に係る方法の少なくとも１つによって前記対象がＮＯＸ５依存性高血圧症に罹患していると診断される、化合物に関する。

さらなる実施形態において、本発明は、治療抵抗性高血圧症を有する対象を治療する方法における使用のための、セピアプテリン、葉酸、Ｌ－シトルリン、Ｌ－アルギニン及びテトラヒドロビオプテリンから選択される化合物であって、前記対象が少なくとも５３歳である、化合物に関する。

さらなる実施形態において、本発明は、治療抵抗性高血圧症を有する対象を治療する方法における使用のための、セピアプテリン、葉酸、Ｌ－シトルリン、Ｌ－アルギニン及びテトラヒドロビオプテリンから選択される化合物であって、前記対象が少なくとも５７歳である、化合物に関する。

さらなる実施形態において、本発明は、治療抵抗性高血圧症を有する対象を治療する方法における使用のための、セピアプテリン、葉酸、Ｌ－シトルリン、Ｌ－アルギニン及びテトラヒドロビオプテリンから選択される化合物であって、前記対象が、健常対象の群の非対称型ジメチルアルギニンの平均血漿中濃度と比較してより高い非対称型ジメチルアルギニンの血漿中濃度を有する、化合物に関する。

さらなる実施形態において、本発明は、治療抵抗性高血圧症を有する対象を治療方法における使用のための、セピアプテリン、葉酸、Ｌ－シトルリン、Ｌ－アルギニン及びテトラヒドロビオプテリンから選択される化合物であって、前記対象が、１リットル当たり少なくとも０．５３マイクロモル、好ましくは１リットル当たり少なくとも０．５８マイクロモル、より好ましくは１リットル当たり少なくとも０．６３マイクロモルの非対称型ジメチルアルギニンの血漿中濃度を有する、化合物に関する。

さらなる実施形態において、本発明は、治療抵抗性高血圧症を有する対象を治療する方法における使用のための、セピアプテリン、葉酸、Ｌ－シトルリン、Ｌ－アルギニン及びテトラヒドロビオプテリンから選択される化合物であって、前記対象が、少なくとも１４０ｍｍＨｇの収縮期血圧、少なくとも９０ｍｍＨｇの拡張期血圧、又は降圧薬の使用として定義される高血圧症に罹患している、化合物に関する。

さらなる実施形態において、本発明は、ＮＯＸ５依存性高血圧症を有する対象を治療する方法における使用のための、セピアプテリン、葉酸、Ｌ－シトルリン、Ｌ－アルギニン及びテトラヒドロビオプテリンから選択される化合物であって、前記対象が、血漿１ｍｌ当たり少なくともＮＯＸ５１６０ｐｇのＮＯＸ５血漿中濃度を有する、化合物に関する。

さらなる実施形態において、本発明は、ＮＯＸ５依存性高血圧症を有する対象を治療する方法における使用のための、セピアプテリン、葉酸、Ｌ－シトルリン、Ｌ－アルギニン及びテトラヒドロビオプテリンから選択される化合物であって、セピアプテリンである化合物に関する。

さらなる実施形態において、本発明は、ＮＯＸ５依存性高血圧症を有する対象を治療する方法における使用のための、セピアプテリン、葉酸、Ｌ－シトルリン、Ｌ－アルギニン及びテトラヒドロビオプテリンから選択される化合物であって、前記対象が、毎分２０～２００ｍｇのアルブミン排泄速度として定義される中等度に上昇したアルブミン尿を有する、化合物に関する。

さらなる実施形態において、本発明は、ＮＯＸ５依存性高血圧症を有する対象を治療する方法における使用のための、セピアプテリン、葉酸、Ｌ－シトルリン、Ｌ－アルギニン及びテトラヒドロビオプテリンから選択される化合物であって、本発明に係る方法の少なくとも１つによって前記対象がＮＯＸ５依存性高血圧症に罹患していると診断される、化合物に関する。

さらなる実施形態において、本発明は、ＮＯＸ５依存性高血圧症を有する対象を治療する方法における使用のための、セピアプテリン、葉酸、Ｌ－シトルリン、Ｌ－アルギニン及びテトラヒドロビオプテリンから選択される化合物であって、前記対象が少なくとも５３歳である、化合物に関する。

さらなる実施形態において、本発明は、ＮＯＸ５依存性高血圧症を有する対象を治療する方法における使用のための、セピアプテリン、葉酸、Ｌ－シトルリン、Ｌ－アルギニン及びテトラヒドロビオプテリンから選択される化合物であって、前記対象が少なくとも５７歳である、化合物に関する。

さらなる実施形態において、本発明は、ＮＯＸ５依存性高血圧症を有する対象を治療する方法における使用のための、セピアプテリン、葉酸、Ｌ－シトルリン、Ｌ－アルギニン及びテトラヒドロビオプテリンから選択される化合物であって、前記対象が、健常対象の群の非対称型ジメチルアルギニンの平均血漿中濃度と比較してより高い非対称型ジメチルアルギニンの血漿中濃度を有する、化合物に関する。

さらなる実施形態において、本発明は、ＮＯＸ５依存性高血圧症を有する対象を治療する方法における使用のための、セピアプテリン、葉酸、Ｌ－シトルリン、Ｌ－アルギニン及びテトラヒドロビオプテリンから選択される化合物であって、前記対象が、１リットル当たり少なくとも０．５３マイクロモル、好ましくは１リットル当たり少なくとも０．５８マイクロモル、より好ましくは１リットル当たり少なくとも０．６３マイクロモルの非対称型ジメチルアルギニンの血漿中濃度を有する、化合物に関する。

さらなる実施形態において、本発明は、ＮＯＸ５依存性高血圧症を有する対象を治療する方法における使用のための、セピアプテリン、葉酸、Ｌ－シトルリン、Ｌ－アルギニン及びテトラヒドロビオプテリンから選択される化合物であって、前記対象が、少なくとも１４０ｍｍＨｇの収縮期血圧、少なくとも９０ｍｍＨｇの拡張期血圧、又は降圧薬の使用として定義される高血圧症に罹患している、化合物に関する。

さらなる実施形態において、本発明は、対象におけるＮＯＸ５依存性高血圧症における使用のための治療薬及び検出のための方法を発見及び開発するための、ノックインヒトＮｏｘ５遺伝子を有するマウスの使用であって、前記マウスが少なくとも６８週齢である、使用に関する。

さらなる実施形態において、本発明は、対象におけるＮＯＸ５依存性高血圧症における使用のための治療薬及び検出のための方法を発見及び開発するための、ノックインヒトＮｏｘ５遺伝子を有するマウスの使用であって、前記マウスが１２９／ＳＶマウスである、使用に関する。

さらなる実施形態において、本発明は、対象におけるＮＯＸ５依存性高血圧症における使用のための治療薬及び検出のための方法を発見及び開発するための、ノックインヒトＮｏｘ５遺伝子を有するマウスの使用であって、本態性動脈性高血圧症がＮＯＸ５依存性高血圧症である、使用に関する。

さらなる実施形態において、本発明は、対象におけるＮＯＸ５依存性高血圧症における使用のための治療薬及び検出のための方法を発見及び開発するための、ノックインヒトＮｏｘ５遺伝子を有するマウスの使用であって、前記マウスが、８０％１２９／ＳＶを含む遺伝的背景を有する、使用に関する。

さらなる実施形態において、本発明は、対象におけるＮＯＸ５依存性高血圧症における使用のための治療薬及び検出のための方法を発見及び開発するための、ノックインヒトＮｏｘ５遺伝子を有するマウスの使用であって、前記マウスが、８０％１２９／ＳＶ及び２０％Ｃ５７ＢＩ６からなる遺伝的背景を有する、使用に関する。

したがって、具体的には、マウスは、８０％１２９／ＳＶを含む混合型の遺伝的背景を有する。より具体的には、マウスは、８０％１２９／ＳＶ及び２０％Ｃ５７ＢＩ６からなる混合型の遺伝的背景を有する。

具体的には、マウスは、８０％１２９／ＳＶを含む混合型の遺伝的背景を有する。より具体的には、マウスは、８０％１２９／ＳＶ及び２０％Ｃ５７ＢＩ６からなる混合型の遺伝的背景を有する。

さらなる実施形態において、本発明は、対象におけるＮＯＸ５依存性高血圧症における使用のための治療薬及び検出のための方法を発見及び開発するための、ノックインヒトＮｏｘ５遺伝子を有するマウスの使用であって、前記ノックインヒトＮｏｘ５遺伝子がプロモーターｔｉｅ２によって制御される、使用に関する。

さらなる実施形態において、本発明は、対象におけるＮＯＸ５依存性高血圧症における使用のための治療薬及び検出のための方法を発見及び開発するための、ノックインヒトＮｏｘ５遺伝子を有するマウスの使用であって、ヒトＮＯＸ５が前記マウスの内皮細胞及び白血球において発現している、使用に関する。

一実施形態は、ノックインヒトＮｏｘ５遺伝子を有するマウスの使用であって、前記ノックインヒトＮｏｘ５遺伝子がプロモーターｔｉｅ２によって制御される、使用である。

一実施形態は、ノックインヒトＮｏｘ５遺伝子を有するマウスの使用であって、ヒトＮＯＸ５が前記マウスの内皮細胞及び白血球において発現している、使用である。

さらなる実施形態において、本発明は、所定の閾値レベルが、本態性動脈性高血圧症を有していない健常対象から同一の方法を使用して採取した試料において決定されたＮＯＸ５のレベルである、上記の方法に関する。より一層好ましい実施形態において、閾値レベルは、１ｍｌ当たり１６０ｐｇのＮＯＸ５である。より一層好ましい実施形態において、対象はまた、微量アルブミン尿を有する。本明細書で記載される方法で使用される試料は、体液試料又は組織試料であってもよく、好ましくは、試料は血管内皮細胞を含み、より一層好ましくは、試料は循環内皮マイクロパーティクルを含む。さらなる実施形態において、本発明は、ＮＯＸ５のレベルがＮｏｘ５メッセンジャーＲＮＡのレベルを測定することによって決定される、上記の方法を提供する。

さらなる実施形態において、本発明は、ＮＯＸ５のレベルが脱共役一酸化窒素合成酵素（ＮＯＳ）のレベルを測定することによって決定される、上記の方法を提供する。

さらなる実施形態において、本発明は、脱共役ＮＯＳのレベルが非対称型ジメチルアルギニン(ＡＤＭＡ，asymmetric dimethylarginine)のレベルを測定することによって決定される、上記の方法を提供する。

さらなる実施形態において、本発明は、試料が、血漿、血液及び血清を含む群から選択される、上記の方法を提供する。

さらなる実施形態において、本発明は、試料が、白血球を含有する多血小板血漿を含む、上記の方法を提供する。

さらなる実施形態において、本発明は、試料が少血小板血漿を含む、上記の方法を提供する。

本発明はさらに、本態性動脈性高血圧症を有する対象の治療における使用のための、セピアプテリン、Ｌ－シトルリン、Ｌ－アルギニン、テトラヒドロビオプテリン、葉酸及びＮＯＸ５阻害剤からなる群から選択される化合物に関する。

さらなる実施形態において、本発明は、治療前に、本明細書に記載される方法を使用して対象が本態性動脈性高血圧症と診断される、上記の使用のための化合物に関する。

さらなる実施形態において、本発明は、治療が、セピアプテリン、Ｌ－シトルリン、Ｌ－アルギニン、テトラヒドロビオプテリン、葉酸及びＮＯＸ５阻害剤からなる群から選択される化合物の対象への投与を含む、上記の使用のための化合物であって、前記化合物のレベルが、試料が採取された体液又は組織において規格化されるような量で投与される、化合物に関する。

さらなる実施形態において、本発明は、治療が、本明細書に記載されるＮＯＸ５のレベルを測定するステップを含む、上記の使用のための化合物に関する。

さらなる実施形態において、本発明は、ＮＯＸ５及び脱共役ＮＯＳ依存性本態性動脈性高血圧症における使用のための治療薬及び診断薬を発見及び開発するための、高齢ＮＯＸ５ノックイン動物モデルの使用に関する。
［実施例］

研究設計。
ヒト対象のサンプルサイズをG*Powerソフトウェアによって決定した。マウスについては、我々は式n = 2x s2x(Za/2+Zb)2/D2（L. Sachs, Angewandte Statistik, Springer, 1983, Berlijn, Springer Verlag）による検出力分析を使用した。アンギナ、心筋梗塞、うっ血性心不全、末梢血管疾患、炎症性疾患、又は血管炎に罹りやすいいずれかの疾患の病歴又は臨床的証拠を有するヒト対象を除外した。適当な調査により、二次性高血圧症の原因を除外した。ステージ４及び５の慢性腎臓病（ＧＦＲ＜３０ｍＬ／分／１．７３ｍ^２）を有する患者も除外した。血圧及びアルブミン尿値に基づいて、ヒト試料を異なる群に割り当てた。遺伝子型に従ってマウスを各実験群に割り当てた。調査者は実験群について情報を秘匿された。反復実験は成功であった。すべての実験を、独立な生体試料を用いて少なくとも３回再現した。

インシリコでの方法
我々は、ＮＯＸファミリーメンバー及び一酸化窒素環状ＧＭＰ関連タンパク質をシードノードとして使用して、ＩＩＤ（Kotlyar M, Pastrello C, Malik Z, Jurisica I. IID 2018 update: context-specific physical protein-protein interactions in human, model organisms and domesticated species. Nucleic Acids Res. 2019;47(D1):D581-D9. Epub 2018/11/09. doi: 10.1093/nar/gky1037. PubMed PMID: 30407591; PubMed Central PMCID: PMCPMC6323934）データベース（インタラクトーム）から得た実験により検証されたタンパク質－タンパク質相互作用から分子サブネットワークを抽出した。このシードの組は、ＮＯＸ１、ＮＯＸ３、ＮＯＸ４、ＮＯＸ５、ＮＯＳ１、ＮＯＳ３、ＧＵＣＹＡ１、ＧＵＣＹＡ２、ＧＵＣＹＢ１、ＰＤＥ５Ａ、ＰＤＥ９Ａ及びＰＲＫＧ１を含む。我々は、インタラクトームからシード遺伝子のすべての第１ネイバーによって導出された、サブネットワークを得た。次いで、導出されたサブネットワークを、完全なインタラクトームにおけるノード（タンパク質）次数によって規格化されたサブネットワーク内のノード次数として定義される、サブネットワーク参加度（ＳＰＤ）に従って剪定した。ＳＰＤは、あるタンパク質の相互作用があるサブネットワークにおいてどれだけ豊富であるかを定量化する。このようにして我々は、接続されたコンポーネント及びいくつかの単一ノードの組によって表現される、重みつきの疾患モジュールを明らかにした。ほとんどのモジュール特異的相互作用を含みつつほとんどの非特異的なノードを除外することから、我々は、剪定ステップにおけるカットオフ値として、ノードの百分率の積算合計８０％に対応するＳＰＤカットオフ値を選択した。最終的なサブネットワークは、５６種のタンパク質及び８３通りのタンパク質－タンパク質相互作用からなっていた。

さらに我々は、モジュール特定ＤＲＥＡＭチャレンジ（Choobdar S, Ahsen ME, Crawford J, Tomasoni M, Fang T, Lamparter D, et al. Assessment of network module identification across complex diseases. Nat Methods. 2019;16(9):843-52. Epub 2019/09/01. doi: 10.1038/s41592-019-0509-5. PubMed PMID: 31471613; PubMed Central PMCID: PMCPMC6719725）による２つのトップクラスの疾患ネットワークモジュール特定法をインタラクトームに適用した。我々は、全体的及び局所的という２つの相補的な方法のカテゴリーからこれらの方法を選択した。これら２つの方法の間の主な違いは、全体的方法はＰＰＩネットワークの全体的な構造情報を活用するのに対し、局所的方法は、局所的なネイバー情報のみを考慮する。MONETツールに同梱されているＤＲＥＡＭチャレンジの全体モジュール性最適化法（Ｍ１）及びSPICiツール（Jiang P, Singh M. SPICi: a fast clustering algorithm for large biological networks. Bioinformatics. 2010;26(8):1105-11. Epub 2010/02/27. doi: 10.1093/bioinformatics/btq078. PubMed PMID: 20185405; PubMed Central PMCID: PMCPMC2853685）による集積的局所法（Ｌ１）を選択し（それらのカテゴリーでは最良の成績を有する）、インタラクトーム中の疾患モジュールを見出すために適用した。Ｍ１は、複数のモジュール検出アルゴリズムを組み合わせることで、個々のアルゴリズムに起因する最適でないパーティションを回避し（Arenas A, Fernandez A, Gomez S. Analysis of the structure of complex networks at different resolution levels. New Journal of Physics. 2008;10(5):053039. doi: 10.1088/1367-2630/10/5/053039）、本ツールにおいてシードノードがまったくなくても顕著に動作する、アンサンブルアプローチである点に留意されたい。集積的Ｌ１法は、自動的に選択された高い重みつき次数を有する局所シードから始めて、ひたすらにネットワークのクラスター形成を行う。このアルゴリズムは、シードノードの隣接領域におけるモジュールの局所密度を改善する。

ヒト研究参加者
我々は、２００８年４月から２００８年１２月にTaipei Veterans General Hospitalにて、本態性原発性高血圧症及び３０ｍＬ／分／１．７３ｍ^２以上のベースライン推算ＧＦＲを有する継続外来患者を登録した過去の研究（Hsu CY, Huang PH, Chiang CH, Leu HB, Huang CC, Chen JW, et al. Increased circulating endothelial apoptotic microparticle to endothelial progenitor cell ratio is associated with subsequent decline in glomerular filtration rate in hypertensive patients. PLoS One. 2013;8(7):e68644. Epub 2013/07/23. doi: 10.1371/journal.pone.0068644. PubMed PMID: 23874701; PubMed Central PMCID: PMCPMC3709900、Huang PH, Huang SS, Chen YH, Lin CP, Chiang KH, Chen JS, et al. Increased circulating CD31+/annexin V+ apoptotic microparticles and decreased circulating endothelial progenitor cell levels in hypertensive patients with microalbuminuria. J Hypertens. 2010;28(8):1655-65. Epub 2010/06/04. doi: 10.1097/HJH.0b013e32833a4d0a. PubMed PMID: 20520578）に基づき、本研究を設計した。高血圧症を、１４０ｍｍＨｇ以上の収縮期血圧、９０ｍｍＨｇ以上の拡張期血圧、又は降圧薬の使用と定義した。本発明に係る、対象における本態性動脈性高血圧症、特に、対象におけるＮＯＸ５依存性高血圧症を診断するための方法であって、前記対象が、少なくとも１４０ｍｍＨｇの収縮期血圧、少なくとも９０ｍｍＨｇの拡張期血圧、又は降圧薬の使用として定義される高血圧症に罹患している方法の、一実施形態に従った。

アンギナ、心筋梗塞、うっ血性心不全、末梢血管疾患、炎症性疾患、又は血管炎に罹りやすいいずれかの疾患の病歴又は臨床的証拠を有する対象を除外した。適当な調査により、二次性高血圧症の原因を除外した。ステージ４及び５の慢性腎臓病（ＧＦＲ＜３０ｍＬ／分／１．７３ｍ^２）を有する患者も除外した。各人の問診中及び医療ファイルから、心血管疾患のリスク因子、過去及び現在の心血管系事象、並びに現行の投薬計画を含む診療歴を得た。体重、身長、及び腹囲を測定し、肥満度指数（ＢＭＩ）を計算した。患者を１５分以上座位とした後、医師が水銀血圧計で上腕血圧を測定した。３回の測定値の平均を分析に使用した。

血液及び尿の測定
測定のための８時間の夜間絶食の後、すべての患者から静脈血試料を採取した。採取後すぐに、血液試料を３０００ｒｐｍで１０分間遠心分離し、血漿試料を分析まで－７０℃で凍結させておいた。それぞれの標準及び血漿試料を２回分析し、その後のすべての分析において平均値を使用した。ラテックス増強免疫比濁アッセイ（Dade Behring社, Marburg, Germany）を使用して、血漿中高感度Ｃ反応性タンパク質（ｈｓ－ＣＲＰ）レベルを決定した。２種の抗体（Cortez Diagnostics社, Calabasas, CA, USA）を用いたサンドイッチ免疫測定法（ＥＩＭＡ）によって、血漿中Ｎ末端プロｂ型ナトリウム利尿ペプチド（ＮＴ－ｐｒｏＢＮＰ，N-terminal pro b-type natriuretic peptide）を決定した。ADMA Fast ELISAキット（DLD Diagnostika社, Hamburg, Germany）を使用して、血漿中ＡＤＭＡレベルを測定した。アルブミン排泄速度の測定のために、夜間尿試料を得た。正常アルブミン尿を２０ｍｇ／分未満のアルブミン排泄速度として定義し、中等度に上昇したアルブミン尿（以前は微量アルブミン尿として知られていた）を２０～２００ｍｇ／分のアルブミン排泄速度として定義し、重度アルブミン尿（以前は顕性アルブミン尿として知られていた）を２００ｍｇ／分を超えるアルブミン排泄速度として定義した。

内皮マイクロパーティクル抽出及びＮＯＸ５の測定
ＣＤ１４４＋マイクロパーティクルを、改変を加えた上で記載の通りに単離した（Shang F, Wang SC, Hsu CY, Miao Y, Martin M, Yin Y, et al. MicroRNA-92a Mediates Endothelial Dysfunction in CKD. J Am Soc Nephrol. 2017;28(11):3251-61. Epub 2017/07/12. doi: 10.1681/ASN.2016111215. PubMed PMID: 28696247; PubMed Central PMCID: PMCPMC5661278、Chen Z, Wen L, Martin M, Hsu CY, Fang L, Lin FM, et al. Oxidative stress activates endothelial innate immunity via sterol regulatory element binding protein 2 (SREBP2) transactivation of microRNA-92a. Circulation. 2015;131(9):805-14. Epub 2015/01/01. doi: 10.1161/CIRCULATIONAHA.114.013675. PubMed PMID: 25550450; PubMed Central PMCID: PMCPMC4351177）。簡潔に述べると、Dynabeads G（Invitrogen社, Carlsbad, CA）を０．１％ＢＳＡを含有するＰＢＳで洗浄し、次いで、ＰＢＳで再構成した。内皮細胞を特異的に標的とする抗ＣＤ１４４抗体（Santa Cruz Biotechnology社, Dallas, TX）を、洗浄しておいたDynabeads Gと２時間混合し、次いで、１：２００希釈の血漿試料と共に４℃で終夜インキュベートした。沈殿後、Dynabeads GをＰＢＳ及び１％ Tween-20で３回洗浄した。ＦＡＣＳ分析によって決定したＣＤ１４４＋ＭＰの純度は、７０％±５．６％であった。大きさの参照としてＦＩＴＣ共役ビーズを使用して当該粒子の大きさを評価したところ、直径が０．５μｍ未満であった。市販の酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ，enzyme-linked immunosorbent assay、Cusabio Technology社, Houston, Texas）キットを使用して、製造業者による使用説明書に従い、ヒトＮＡＤＰＨオキシダーゼ５（ＮＯＸ５）レベルを測定した。２００８年の採取日から２０１４年のＮＯＸ５についての試験まで、試料を－７０℃で保存した（全部で５０試料が利用可能であった）。試験のアッセイ内及びアッセイ間変動係数は、それぞれ８％未満及び１０％未満であった。

動物
マウスは天然においてＮＯＸ５遺伝子を発現しないため、我々は、過去に記載されているヒト化ＮＯＸ５ノックイン（ＫＩ）マウス（Casas AI, Kleikers PW, Geuss E, Langhauser F, Adler T, Busch DH, et al. Calcium-dependent blood-brain barrier breakdown by NOX5 limits postreperfusion benefit in stroke. J Clin Invest. 2019;130:1772-8. Epub 2019/03/19. doi: 10.1172/JCI124283. PubMed PMID: 30882367; PubMed Central PMCID: PMCPMC6436900）を作製し、検証した。マウスは、記載されている通り、１２９／ＳＶマウス、具体的には、８０％１２９／ＳＶ／２０％Ｃ５７ＢＩ６マウスであった（Casas AI, Kleikers PW, Geuss E, Langhauser F, Adler T, Busch DH, et al. Calcium-dependent blood-brain barrier breakdown by NOX5 limits postreperfusion benefit in stroke. J Clin Invest. 2019;130:1772-8. Epub 2019/03/19. doi: 10.1172/JCI124283. PubMed PMID: 30882367; PubMed Central PMCID: PMCPMC6436900）。簡潔に述べると、Ｔｉｅ２プロモーターの制御下でヒポキサンチンホスホリボシルトランスフェラーゼ（Ｈｐｒｔ，hypoxanthine phospho-ribosyl-transferase）標的トランスジェニックアプローチを使用して、モデルを開発した。したがって、我々のＮＯＸ５ＫＩマウスは、内皮細胞及び白血球においてＮＯＸ５を発現し、これはＮＯＸ５のヒトにおける生理学的発現を模倣する。ＫＩマウス組織におけるＮＯＸ５の発現は、定量的リアルタイムＰＣＲによって過去に検証され、野生型（ＷＴ）マウスと比較されている（Casas AI, Kleikers PW, Geuss E, Langhauser F, Adler T, Busch DH, et al. Calcium-dependent blood-brain barrier breakdown by NOX5 limits postreperfusion benefit in stroke. J Clin Invest. 2019;130:1772-8. Epub 2019/03/19. doi: 10.1172/JCI124283. PubMed PMID: 30882367; PubMed Central PMCID: PMCPMC6436900）。オス及びメスのマウスの歳及び性別が一致する群（９～１５週齢、n = 19～20及び６８～８７週齢、n = 31～33）を使用した。すべてのマウスは温度制御室（２２℃）中で水及び食物を自由に利用できるようにされ、１２時間の明暗サイクル中に置かれた。

血圧記録（遠隔測定）
ＮＯＸ５ＫＩ及びＷＴマウスをイソフルランで麻酔し（導入時、３～４％；維持時、１．５～２．５％）、心エコー検査（超音波検査）を実施した（図１３）。遠隔測定用送信機を埋入するため、超音波検査から５日後、マウスを同じプロトコルで麻酔し、０．０５ｍｇ／ｋｇブプレノルフィンの皮下注射を１２時間毎に繰り返すことにより、術前鎮痛を行った。各マウスを加熱パッド（UNO温度制御ユニット、UNO Roestvaststaal社）上に置き、直腸プローブを使用して体温をモニタリングし、フィードバック制御された赤外光を使用して３７．０℃に維持した。頸動脈を覆う皮膚を切開した。この切開により、側腹部の皮下空間に、血圧、心拍数、及び運動活性をモニタリングする遠隔測定用送信機（TA11PA-C10；Data Sciences社, St. Paul, MN）を挿入するためのポケットが作り出された。左頸動脈を解離し、３本の結紮糸（５－０、シルク）を、血管を塞ぐための、内頸動脈と外頸動脈の分岐と、血管を一時的に塞ぐための、心臓と、カテーテルを固定するための、これらの中間とに設置した。動脈において切られた小孔を介してカテーテルを挿入し、大動脈弓へと進入させた。次いで、側腹部のポケットを予め温めておいた３ｍＬの食塩水で満たし、ポケット中に送信機を設置した。次いで、polysorb 5-0縫合糸を使用して創傷を塞いだ。すべての外科手術手技は、無菌条件下で行われた。６時間後に０．０５ｍｇ／ｋｇブプレノルフィンを、２４及び４８時間後に５ｍｇ／ｋｇカプロフェンを皮下注射することにより、術後鎮痛を行った。測定を開始する前に７～１４日間マウスを回復させた。マウスを静かな部屋に個別に収容した。１時間当たり７５秒の１０サイクルで、７２時間の期間にわたって血圧を測定した（Wang Y, Thorin E, Luo H, Tremblay J, Lavoie JL,Wu Z, et al. EPHB4 Protein Expression in Vascular Smooth Muscle Cells Regulates Their Contractility, and EPHB4 Deletion Leads to Hypotension in Mice. J Biol Chem. 2015;290(22):14235-44. Epub 2015/04/24. doi: 10.1074/jbc.M114.621615. PubMed PMID: 25903126; PubMed Central PMCID: PMCPMC4447992、Xu P, Costa-Goncalves AC, Todiras M, Rabelo LA, Sampaio WO, Moura MM, et al. Endothelial dysfunction and elevated blood pressure in MAS gene-deleted mice. Hypertension. 2008;51(2):574-80. Epub 2008/01/09. doi: 10.1161/HYPERTENSIONAHA. 107.102764. PubMed PMID: 18180400、Shirey-Rice JK, Klar R, Fentress HM, Redmon SN, Sabb TR, Krueger JJ, et al. Norepinephrine transporter variant A457P knock-in mice display key features of human postural orthostatic tachycardia syndrome. Dis Model Mech. 2013;6(4):1001-11. Epub 2013/04/13. doi: 10.1242/dmm.012203. PubMed PMID: 23580201; PubMed Central PMCID: PMCPMC3701219）。送信機からの無線信号を、完全自動化データ取得システム（Dataquest A.R.T.；Data Sciences社）を用いて連続的にモニタリングした。ＣＯ_２／Ｏ_２吸入によってマウスを屠殺し、さらなる分析のために臓器を取り出した。臓器及び体重を図６に提示する。

ミオグラフ
マウスを屠殺後、胸部大動脈、大腿動脈及び伏在動脈を血管周囲脂肪組織から解離し、ワイヤーミオグラフ（DMT社, Aarhus, DK）にマウントした。臓器チャンバーを、９５％Ｏ_２／５％ＣＯ_２で連続的にエアレーションし３７℃に維持したKrebs-Ringer炭酸水素緩衝化塩溶液（ＫＲＢ，Krebs-Ringer bicarbonate-buffered salt solution）で満たした。過去に記載されている生理学的に関連性のある内腔内径（Lazor R, Feihl F, Waeber B, Kucera P, Perret C. Endothelin-1 does not mediate the endothelium-dependent hypoxic contractions of small pulmonary arteries in rats. Chest. 1996;110(1):189-97. Epub 1996/07/01. doi: 10.1378/chest.110.1.189. PubMed PMID: 8681627）を模倣するため、受動的な伸張措置を実施した。動脈の収縮及び弛緩応答を、胸部大動脈及び大腿動脈では１００ｍｍＨｇの拡張圧に相当する内腔直径で、抵抗を生じる太さの伏在動脈ではこの直径の９０％で記録した。これは、拡張期動脈血圧が高齢のＫＩマウスとＷＴマウスの間で有意差がなかったことから正当化される。同等の直径－張力関係から鑑みて、これらの直径は２つのマウス株間で有意差がなかった（図１４）。円筒管に対するラプラスの法則P=T/R（Ｐは経壁圧、Ｔは壁張力、Ｒは管の内腔半径）に従い、直径・張力関係を構築した。結果として、１）半径の変化（ワイヤーミオグラフィー）の印加に応答した張力の変化又は２）経壁圧の変化（圧力ミオグラフィー）に応答した半径の変化を記録することにより、壁硬化を等しく決定することができる（Bloksgaard M, Leurgans TM, Spronck B, Heusinkveld MHG, Thorsted B, Rosenstand K, et al. Imaging and modeling of acute pressure-induced changes of collagen and elastin microarchitectures in pig and human resistance arteries. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 2017;313(1):H164-H78. Epub 2017/04/23. doi: 10.1152/ajpheart.00110.2017. PubMed PMID: 28432057、Pourageaud F, De Mey JG. Structural properties of rat mesenteric small arteries after 4-wk exposure to elevated or reduced blood flow. Am J Physiol. 1997;273(4):H1699-706. Epub 1997/11/15. doi: 10.1152/ajpheart.1997.273.4.H1699. PubMed PMID: 9362233）。ここで、前者のアプローチが後者より高いスループットを有することから、我々は前者のアプローチを使用した。応力－歪み関係とより一層良好な「増分弾性（ヤング）係数」（壁厚の記録がさらに必要となる）のみが、動脈硬化度の変化に対する構造的特性の寄与と物質的特性の寄与とを区別する際に役立つ。単離された胸部大動脈の一部について、この血管において内皮由来血管作動性因子として作用し得るプロスタグランジンの産生を阻害する、１０μＭインドメタシンの非存在下及び部分的に連続的な存在下で研究を行った。４０ｍＭＫ^＋に対する収縮応答と、後続でアセチルコリン（Ａｃｈ）（０．０１～１００μＭ）、ＰＡＰＡ／ＮＯ（０．０１～１０μＭ）又はＢａｙ６０－２７７０（０．０１～１０μＭ）誘導性弛緩を伴うフェニレフリン（０．０１～１００μＭ）及びエンドセリン１（１～２５６ｎＭ）の濃度－応答曲線とについて、血管を試験した。血管セグメントの壁張力を、LabChart Pro（ADInstruments社, Oxford, UK）を用いて連続的に記録した。

スーパーオキシド形成の測定：ＤＨＥ標識
蛍光色素ジヒドロエチジウム（ＤＨＥ，dihydroethidium）（Thermo Scientific Technology社, The Netherlands）を使用して、大腿動脈においてスーパーオキシドを測定した。凍った状態の大腿動脈凍結切片をＰＢＳ中の４％パラホルムアルデヒド（ＰＦＡ，paraformaldehyde）で固定し、次いで、２μＭＤＨＥと共に３７℃で３０分間インキュベートした。３回のＰＢＳを用いた洗浄ステップの後、薄片を２μｇ／ｍｌＤＡＰＩ（Sigma-Aldrich社, The Netherlands）と共に１０分間インキュベートした。切片をＰＢＳ中で洗浄し、次いで、Dako Fluorescence Mounting Medium（S3023、Agilent Technologies社）を使用してマウントした。免疫蛍光シグナルを、Leica DMI3000 B蛍光顕微鏡を使用して目視した。ＤＨＥ染色を実施する前に、一部の動脈を３７℃で３０分間、５００μＭＬ－ＮＡＭＥによって前処理した。

ＲＮＡ抽出、ｃＤＮＡ合成及び定量的リアルタイムＰＣＲ
胸部大動脈、大腿動脈及び伏在動脈をマウスから単離し、すぐにRNAlater溶液（Thermo Fisher Scientific社）中に浸した。RNeasy（登録商標）Micro Kit（Qiagen社）を使用し、製造業者によるプロトコルに従ってＲＮＡを抽出した。High Capacity cDNA Reverse Transcription Kit（Thermo Fisher Scientific社）を使用して、２０μｌの反応物中における１μｇの全ＲＮＡからｃＤＮＡを合成した。合成後、ｃＤＮＡを－２０℃で保存した。

CFX96TM Real-Time PCR Detection System（Bio-Rad社）上でＲＴ－ｑＰＣＲを実施した。すべての反応を、各々TaqMan（登録商標） Universal PCR Master Mix（Applied Biosystems-Life Technologies社）を使用し、製造業者による使用説明書に従って、２０μｌの総量で３重反復にて実施した。３μｌのｃＤＮＡを鋳型として使用し、予め設計された、β－アクチン及びＮｏｘ５のTaqMan（登録商標）プライマーを使用した。使用したプライマーについての具体的なアッセイＩＤを補足表１に示す。標準的なＰＣＲ条件は、以下の通りであった：９５℃で１０分、その後９５℃で１５秒及び６０℃で１分、５９回反復。ｍＲＮＡの量を、測定されたβ－アクチンｍＲＮＡの発現に対して規格化した。

統計解析
すべてのヒト及び動物のデータを、数値変数については平均±ＳＥＭ、カテゴリー変数については数字（百分率）として表す。２つのマウス群間における連続変数の比較をStudentの対応のない両側ｔ検定によって実施し、３つのヒト群間の比較を一元配置分散分析（ＡＮＯＶＡ，analysis of variance）と続くTukeyの多重比較検定（事後検定）とによって実施した。ヒト群間のカテゴリー変数の比較を、χ^２（カイ二乗）によって評価した。２つのマウス群間における遠隔測定データの比較を二元配置反復測定ＡＮＯＶＡによって行い、ミオグラフの比較を通常の二元配置ＡＮＯＶＡと続くSidakの多重比較検定とによって行った。ヒト対象におけるＮＯＸ５レベルの下位群分析のために、ビン幅をSturgesの規則（Scott DW. Sturges' rule. Wire computational statistics. 2009;1(3):303-6. doi: https://doi.org/10.1002/wics.35）を使用して計算する、頻度分析を実行した。データのモダリティを評価するため、出力頻度を単一のガウシアン及び２つのガウス分布の和にフィッティングし、帰無仮説をガウシアンとし、対立仮説を２つのガウシアンの和として両側Ｆ検定を実施した。さらに、調整済みの決定係数値を比較して、試料についての最良のフィッティング分布を選択した。試料の二峰性の性質を考慮し、式「振幅*SD/0.3989」を使用して各ガウス分布下の面積を計算し、その後、ＮＯＸ５メカノタイプの割合を２つの分布間の比として報告した。GraphPad Prism Version 8.2（GraphPad Software社, San Diego, CA）を使用してデータを解析した。０．０５未満のｐ値を、多重検定補正後に統計的有意性を示すものとした。

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Claims

本態性動脈性高血圧症に罹患している対象におけるニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸（ＮＡＤＰＨ，nicotinamide adenine dinucleotide phosphate）オキシダーゼ５（ＮＯＸ５，NAPDH oxidase 5）依存性高血圧症の診断を補助する方法であって、
（ａ）血漿試料から内皮マイクロパーティクルを単離するステップ、及び
（ｂ）タンパク質検出アッセイを使用してステップ（ａ）の前記内皮マイクロパーティクル中のＮＯＸ５を測定し、前記血漿試料中のＮＯＸ５の濃度を血漿試料１ｍｌ当たりのＮＯＸ５のｐｇとして決定するステップ
によって、前記対象からの血漿試料中のＮＯＸ５のレベルを決定するステップを含み、ステップ（ｂ）で決定されたＮＯＸ５の前記濃度が前記血漿試料１ｍｌ当たり少なくともＮＯＸ５１６０ｐｇである場合、前記対象がＮＯＸ５依存性高血圧症に罹患していることを示す、前記方法。
セピアプテリン、葉酸、及びテトラヒドロビオプテリンから選択される化合物を含む、本態性動脈性高血圧症を有する対象の治療剤であって、前記対象が、請求項１に記載の方法によって、ＮＯＸ５依存性高血圧症に罹患していることが示された対象である、前記治療剤。
Ｌ－シトルリン及びＬ－アルギニンから選択される化合物を含む、本態性動脈性高血圧症を有する対象の治療剤であって、前記対象が、請求項１に記載の方法によって、ＮＯＸ５依存性高血圧症に罹患していることが示された対象である、前記治療剤。
ＮＯＸ５阻害剤を含む、本態性動脈性高血圧症を有する対象の治療剤であって、前記対象が、請求項１に記載の方法によって、ＮＯＸ５依存性高血圧症に罹患していることが示された対象である、前記治療剤。
本態性動脈性高血圧症がＮＯＸ５依存性高血圧症である、請求項２～４のいずれかに記載の治療剤。
対象が治療抵抗性高血圧症を有する、請求項２～４のいずれかに記載の治療剤。
セピアプテリン、葉酸、及びテトラヒドロビオプテリンから選択される化合物を含む、ＮＯＸ５依存性高血圧症を有する対象の治療剤であって、前記対象が、請求項１に記載の方法によって、ＮＯＸ５依存性高血圧症に罹患していることが示された対象である、前記治療剤。
Ｌ－シトルリン及びＬ－アルギニンから選択される化合物を含む、ＮＯＸ５依存性高血圧症を有する対象の治療剤であって、前記対象が、請求項１に記載の方法によって、ＮＯＸ５依存性高血圧症に罹患していることが示された対象である、前記治療剤。
ＮＯＸ５阻害剤を含む、ＮＯＸ５依存性高血圧症を有する対象の治療剤であって、前記対象が、請求項１に記載の方法によって、ＮＯＸ５依存性高血圧症に罹患していることが示された対象である、前記治療剤。
セピアプテリンである、請求項２又は７に記載の治療剤。
対象が、毎分２０～２００ｍｇのアルブミン排泄速度として定義される中等度に上昇したアルブミン尿を有する、請求項２～１０のいずれかに記載の治療剤。
対象が少なくとも５３歳である、請求項２～１１のいずれかに記載の治療剤。
対象が少なくとも５７歳である、請求項２～１２のいずれかに記載の治療剤。
対象が、健常対象の群の非対称型ジメチルアルギニンの平均血漿中濃度と比較してより高い非対称型ジメチルアルギニンの血漿中濃度を有する、請求項２～１３のいずれかに記載の治療剤。
対象が、１リットル当たり少なくとも０．５３マイクロモルの非対称型ジメチルアルギニンの血漿中濃度を有する、請求項２～１４のいずれかに記載の治療剤。
対象が、少なくとも１４０ｍｍＨｇの収縮期血圧として定義される高血圧症、少なくとも９０ｍｍＨｇの拡張期血圧として定義される高血圧症、又は降圧薬の使用として定義される高血圧症に罹患している、請求項１に記載の方法。
対象が、アンギナ、心筋梗塞、うっ血性心不全、末梢血管疾患、炎症性疾患及び血管炎に罹りやすいいずれかの疾患のいずれかの病歴又は臨床的証拠を有しておらず、かつ、前記対象がステージ４又はステージ５の慢性腎臓病を有していない、請求項１又は１６に記載の方法。
セピアプテリン、葉酸、テトラヒドロビオプテリン、Ｌ－シトルリン、Ｌ－アルギニン及びＮＯＸ５阻害剤から選択される化合物を含む、本態性動脈性高血圧症又はＮＯＸ５依存性高血圧症を有する対象の治療剤であって、前記対象が、請求項１に記載の方法によって、ＮＯＸ５依存性高血圧症に罹患していることが示された対象である、前記治療剤。
本態性動脈性高血圧症又はＮＯＸ５依存性高血圧症を有する対象の治療のための医薬の製造における、セピアプテリン、葉酸、テトラヒドロビオプテリン、Ｌ－シトルリン、Ｌ－アルギニン及びＮＯＸ５阻害剤から選択される化合物の使用であって、前記対象が、請求項１に記載の方法によって、ＮＯＸ５依存性高血圧症に罹患していることが示された対象である、前記使用。
ＮＯＸ５阻害剤が５，１２－ジヒドロキノキサリノ（２，３－ｂ）キノキサリン（ＭＬ０９０）である、請求項４又は９に記載の治療剤。
対象が、１リットル当たり少なくとも０．５８マイクロモルの非対称型ジメチルアルギニンの血漿中濃度を有する、請求項１５に記載の治療剤。
対象が、１リットル当たり少なくとも０．６３マイクロモルの非対称型ジメチルアルギニンの血漿中濃度を有する、請求項２１に記載の治療剤。
対象が、少なくとも１４０ｍｍＨｇの収縮期血圧として定義される高血圧症、少なくとも９０ｍｍＨｇの拡張期血圧として定義される高血圧症、又は降圧薬の使用として定義される高血圧症に罹患している、請求項２～１５のいずれかに記載の治療剤。
対象が、アンギナ、心筋梗塞、うっ血性心不全、末梢血管疾患、炎症性疾患及び血管炎に罹りやすいいずれかの疾患のいずれかの病歴又は臨床的証拠を有しておらず、かつ、前記対象がステージ４又はステージ５の慢性腎臓病を有していない、請求項２～１５及び２３のいずれかに記載の治療剤。