JP7808799B2

JP7808799B2 - Method for producing dendritic cell vaccine

Info

Publication number: JP7808799B2
Application number: JP2020187400A
Authority: JP
Inventors: 利朗白川; 孝一北川; 翔太駒井; 信至佐久間
Original assignee: Kobe University NUC; Josho Gakuen Educational Foundation
Current assignee: Kobe University NUC; Josho Gakuen Educational Foundation
Priority date: 2020-11-10
Filing date: 2020-11-10
Publication date: 2026-01-30
Anticipated expiration: 2040-11-10
Also published as: JP2022076808A

Description

本開示は、樹状細胞ワクチンの製造方法等に関する。 This disclosure relates to a method for producing a dendritic cell vaccine.

がんの治療方法としては、手術療法、放射線療法、薬物療法が三大療法とされており、薬物療法には、抗がん剤などを用いる化学療法、ホルモン剤などを用いるホルモン療法（内分泌療法）、分子標的薬などを用いる分子標的療法などの種類がある。 The three main methods of cancer treatment are surgery, radiation therapy, and chemotherapy. Chemotherapy includes chemotherapy using anticancer drugs, hormone therapy (endocrine therapy) using hormones, and molecular targeted therapy using molecularly targeted drugs.

近年、新たながんの治療方法として免疫療法が注目されている（特許文献１）。免疫療法の中でも、がん細胞を特異的に認識する樹状細胞を用いる樹状細胞ワクチン療法は、副作用が少ないことから、第４のがん治療方法として期待されている。 In recent years, immunotherapy has been attracting attention as a new cancer treatment method (Patent Document 1). Among immunotherapies, dendritic cell vaccine therapy, which uses dendritic cells that specifically recognize cancer cells, is expected to become the fourth cancer treatment method due to its minimal side effects.

特開２０１８－０８３８４９号公報JP 2018-083849 A

がん細胞を特異的に認識する樹状細胞（樹状細胞ワクチン）を作製する際には、がん抗原を樹状細胞に取り込ませる必要があるところ、当該がん抗原の樹状細胞への透過性（取り込み）が低い点が、樹状細胞ワクチン療法の課題の１つとされている。本開示は、樹状細胞ワクチンの製造において、抗原の樹状細胞への取り込みを向上させることを課題とする。 When producing dendritic cells that specifically recognize cancer cells (dendritic cell vaccines), cancer antigens must be taken up by dendritic cells. However, one of the challenges with dendritic cell vaccine therapy is the low permeability (uptake) of these cancer antigens into dendritic cells. The objective of the present disclosure is to improve the uptake of antigens into dendritic cells during the production of dendritic cell vaccines.

本発明者らは、膜透過性ペプチドを側鎖に有する高分子化合物を用いることによって、樹状細胞への抗原の取り込みが向上することを見出し、さらに改良を重ねた。 The inventors discovered that the use of a polymer compound having a membrane-permeable peptide in its side chain improves antigen uptake into dendritic cells, and have continued to make further improvements.

本開示は、例えば以下の項に記載の主題を包含する。
項１．
樹状細胞、下記一般式（１）で表される基を側鎖に有する高分子化合物、及び抗原を混合することを含む、樹状細胞ワクチンの製造方法。
（式中、Ｘ^１は、膜透過性ペプチドから末端アミノ基および末端カルボキシル基を除いた残基を示し、Ｘ^２は、水酸基、アミノ基、炭素数１～４のアルコキシル基又はベンジルオキシ基を示す。）
項２．
前記膜透過性ペプチドが、７～３０個のアルギニンがペプチド結合したアルギニンオリゴマーを有するペプチド、ＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲＰＰＱなるアミノ酸配列を有するペプチド、ＴＲＱＡＲＲＮＲＲＲＲＷＲＥＲＱＲなるアミノ酸配列を有するペプチド、ＲＲＲＲＮＲＴＲＲＮＲＲＲＶＲなるアミノ酸配列を有するペプチド、ＴＲＲＱＲＴＲＲＡＲＲＮＲなるアミノ酸配列を有するペプチド、ＫＬＴＲＡＱＲＲＡＡＡＲＫＮＫＲＮＴＲなるアミノ酸配列を有するペプチド、ＲＱＩＫＩＷＦＱＮＲＲＭＫＷＫＫなるアミノ酸配列を有するペプチド、ＫＭＴＲＡＱＲＲＡＡＡＲＲＮＲＷＴＡＲなるアミノ酸配列を有するペプチド、ＲＱＩＫＩＷＦＱＮＲＲＭＫＷＫＫなるアミノ酸配列を有するペプチド、ＮＡＫＴＲＲＨＥＲＲＲＫＬＡＩＥＲなるアミノ酸配列を有するペプチド、ＤＡＡＴＡＴＲＧＲＳＡＡＳＲＰＴＥＲＰＲＡＰＡＲＳＡＳＲＰＤＤＰＶＤなるアミノ酸配列を有するペプチド、ＧＷＴＬＮＳＡＧＹＬＬＧＫＩＮＬＫＡＬＡＡＬＡＫＫＩＬなるアミノ酸配列を有するペプチド、及びＡＧＹＬＬＧＫＩＮＬＫＡＬＡＡＬＡＫＫＩＬなるアミノ酸配列を有するペプチドからなる群より選択される少なくとも１種の膜透過性ペプチドである、項１に記載の樹状細胞ワクチンの製造方法。
項３．
前記一般式（１）で表される基を側鎖に有する高分子化合物の幹高分子が、ビニル系親水性高分子である、項１又は２に記載の樹状細胞ワクチンの製造方法。
項４．
前記抗原が、がん抗原であり、前記樹状細胞ワクチンが、がんワクチンである、項１～３のいずれかに記載の樹状細胞ワクチンの製造方法。
項５．
樹状細胞、下記一般式（１）で表される基を側鎖に有する高分子化合物、及び抗原を含む、樹状細胞ワクチン。
（式中、Ｘ^１は、膜透過性ペプチドから末端アミノ基および末端カルボキシル基を除いた残基を示し、Ｘ^２は、水酸基、アミノ基、炭素数１～４のアルコキシル基又はベンジルオキシ基を示す。）
項６．
下記一般式（１）で表される基を側鎖に有する高分子化合物を含有する、樹状細胞ワクチン製造補助剤。
（式中、Ｘ^１は、膜透過性ペプチドから末端アミノ基および末端カルボキシル基を除いた残基を示し、Ｘ^２は、水酸基、アミノ基、炭素数１～４のアルコキシル基又はベンジルオキシ基を示す。） The present disclosure encompasses, for example, the subject matter described in the following sections:
Item 1.
A method for producing a dendritic cell vaccine, comprising mixing dendritic cells, a polymer compound having a group represented by the following general formula (1) in its side chain, and an antigen:
(In the formula, ^X1 represents a residue obtained by removing the terminal amino group and the terminal carboxyl group from the membrane-permeable peptide, and ^X2 represents a hydroxyl group, an amino group, an alkoxyl group having 1 to 4 carbon atoms, or a benzyloxy group.)
Item 2.
The membrane-permeable peptide is a peptide having an arginine oligomer in which 7 to 30 arginines are peptide-bonded, a peptide having an amino acid sequence of GRKKRRQRRRPPQ, a peptide having an amino acid sequence of TRQRARNRRRRRWRERQR, a peptide having an amino acid sequence of RRRRNRTRRNRRVR, a peptide having an amino acid sequence of TRRQRTRRARRNR, a peptide having an amino acid sequence of KLTRAQRRAAARKNKRNTR, a peptide having an amino acid sequence of RQIKIWFQNRRMKWKK, a peptide having an amino acid sequence of KMTRAQRRAAARRNRWTAR Item 2. The method for producing a dendritic cell vaccine according to Item 1, wherein the membrane-permeable peptide is at least one selected from the group consisting of a peptide having the amino acid sequence RQIKIWFQNRRMKWKK, a peptide having the amino acid sequence NAKTRRHERRRRKLAIER, a peptide having the amino acid sequence DAATATRGRSAASRPTERPRAPARSASRPDDPVD, a peptide having the amino acid sequence GWTLNSAGYLLGKINLKALAALAKKIL, and a peptide having the amino acid sequence AGYLLGKINLKALAALAKKIL.
Item 3.
Item 3. The method for producing a dendritic cell vaccine according to Item 1 or 2, wherein the trunk polymer of the polymer compound having a group represented by general formula (1) in a side chain is a vinyl hydrophilic polymer.
Item 4.
Item 4. The method for producing a dendritic cell vaccine according to any one of Items 1 to 3, wherein the antigen is a cancer antigen and the dendritic cell vaccine is a cancer vaccine.
Item 5.
A dendritic cell vaccine comprising a dendritic cell, a polymer compound having a group represented by the following general formula (1) in its side chain, and an antigen:
(In the formula, ^X1 represents a residue obtained by removing the terminal amino group and the terminal carboxyl group from the membrane-permeable peptide, and ^X2 represents a hydroxyl group, an amino group, an alkoxyl group having 1 to 4 carbon atoms, or a benzyloxy group.)
Item 6.
An adjuvant for dendritic cell vaccine production, comprising a polymer compound having a group represented by the following general formula (1) in its side chain:
(In the formula, ^X1 represents a residue obtained by removing the terminal amino group and the terminal carboxyl group from the membrane-permeable peptide, and ^X2 represents a hydroxyl group, an amino group, an alkoxyl group having 1 to 4 carbon atoms, or a benzyloxy group.)

抗原の樹状細胞への取り込みが向上する樹状細胞ワクチンの製造方法が提供される。 A method for producing a dendritic cell vaccine that improves antigen uptake into dendritic cells is provided.

樹状細胞による抗原取り込み試験の結果を示す。1 shows the results of a test of antigen uptake by dendritic cells. 樹状細胞ワクチンの投与による腫瘍体積への影響を比較した結果を示す。1 shows the results of comparing the effects of dendritic cell vaccine administration on tumor volume. 樹状細胞ワクチンの投与によるＩＦＮ－γ陽性細胞数への影響を比較した結果を示す。The results of comparing the effects of dendritic cell vaccine administration on the number of IFN-γ positive cells are shown.

以下、本開示に包含される各実施形態について、さらに詳細に説明する。
本開示は、樹状細胞、後述する一般式（１）で表される基を側鎖に有する高分子化合物、及び抗原を混合することを含む、樹状細胞ワクチンの製造方法を包含する。本明細書において、当該樹状細胞ワクチンの製造方法を、「本開示の樹状細胞ワクチンの製造方法」と表記することがある。また、本明細書において、当該樹状細胞ワクチンの製造方法により製造される樹状細胞ワクチンを、「本開示の樹状細胞ワクチン」と表記することがある。 Each embodiment included in the present disclosure will be described in further detail below.
The present disclosure encompasses a method for producing a dendritic cell vaccine, which includes mixing dendritic cells, a polymer compound having a group represented by general formula (1) described below in its side chain, and an antigen. In this specification, the method for producing the dendritic cell vaccine may be referred to as the "method for producing the dendritic cell vaccine of the present disclosure." Furthermore, in this specification, the dendritic cell vaccine produced by the method for producing the dendritic cell vaccine may be referred to as the "dendritic cell vaccine of the present disclosure."

本開示に用いられる樹状細胞は、特に限定されず、投与対象等に応じて適宜選択することができる。例えば、本開示に用いられる樹状細胞としては、哺乳動物由来の樹状細胞であることが好ましい。哺乳動物としては、ヒト；ラット、マウス、ウサギ、ウシ、ブタ、イヌ、ネコ、ヒツジ、サル等の非ヒト哺乳動物などが例示される。また、本開示に用いられる樹状細胞は、例えば、本開示の樹状細胞ワクチンを投与される対象から得た単球由来の樹状細胞であってもよく、商業的に入手可能なものであってもよい。 The dendritic cells used in the present disclosure are not particularly limited and can be selected appropriately depending on the subject of administration, etc. For example, the dendritic cells used in the present disclosure are preferably mammalian-derived dendritic cells. Examples of mammals include humans and non-human mammals such as rats, mice, rabbits, cows, pigs, dogs, cats, sheep, and monkeys. Furthermore, the dendritic cells used in the present disclosure may be, for example, monocyte-derived dendritic cells obtained from a subject to be administered the dendritic cell vaccine of the present disclosure, or may be commercially available dendritic cells.

本開示に用いられる高分子化合物は、下記一般式（１）で表される基を側鎖に有する。 The polymer compound used in this disclosure has a group represented by the following general formula (1) on its side chain.

一般式（１）中、Ｘ^１は、膜透過性ペプチドから末端アミノ基および末端カルボキシル基を除いた残基を示す。 In general formula (1), X ¹ represents a residue obtained by removing the terminal amino group and the terminal carboxyl group from the membrane-permeable peptide.

膜透過性ペプチド残基を構成するアミノ酸の少なくとも１つは塩基性アミノ酸であることが好ましい。また、塩基性アミノ酸は、Ｌ体又はＤ体のいずれであってもよい。 It is preferable that at least one of the amino acids constituting the membrane-permeable peptide residue is a basic amino acid. Furthermore, the basic amino acid may be in either the L- or D-form.

塩基性アミノ酸としては、例えば、アルギニン、オルニチン、リジン、ヒドロキシリジン、ヒスチジン等が挙げられ、中でも、グアニジノ基含有アミノ酸が好ましく、アルギニンが更に好ましい。膜透過性ペプチド残基を構成する全アミノ酸に対する塩基性アミノ酸の割合は、モル基準で、５０％以上であることが好ましく、７０％以上であることが更に好ましい。膜透過性ペプチド残基を構成するアミノ酸のうち、塩基性アミノ酸以外のアミノ酸は、中性アミノ酸であることが好ましい。なお、本明細書中、アミノ酸と記載する場合、特に断らない限り、α－アミノ酸を意味する。 Examples of basic amino acids include arginine, ornithine, lysine, hydroxylysine, and histidine. Among these, guanidino group-containing amino acids are preferred, with arginine being even more preferred. The ratio of basic amino acids to all amino acids constituting the membrane-permeable peptide residue is preferably 50% or more, and even more preferably 70% or more, on a molar basis. Of the amino acids constituting the membrane-permeable peptide residue, amino acids other than basic amino acids are preferably neutral amino acids. Note that, throughout this specification, "amino acids" refers to α-amino acids unless otherwise specified.

膜透過性ペプチド残基を構成するアミノ酸の数は、例えば、５～４０個程度とすることができる。当該範囲の上限若しくは下限は、例えば６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、又は３９個であってもよい。より具体的には、例えば、６～３９個であってもよい。 The number of amino acids constituting the membrane-permeable peptide residues can be, for example, approximately 5 to 40. The upper or lower limit of this range can be, for example, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, or 39. More specifically, it can be, for example, 6 to 39.

膜透過性ペプチドとしては、例えば、７～３０個のアルギニンがペプチド結合したアルギニンオリゴマーを有するペプチド、ＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲＰＰＱなるアミノ酸配列を有するペプチド（例えば、ＨＩＶ－１Ｔａｔ：配列番号１）、ＴＲＱＡＲＲＮＲＲＲＲＷＲＥＲＱＲなるアミノ酸配列を有するペプチド（例えば、ＨＩＶ－１Ｒｅｖ：配列番号２）、ＲＲＲＲＮＲＴＲＲＮＲＲＲＶＲなるアミノ酸配列を有するペプチド（例えば、ＦＨＶＣｏａｔ：配列番号３）、ＴＲＲＱＲＴＲＲＡＲＲＮＲなるアミノ酸配列を有するペプチド（例えば、ＨＴＬＶ－ＩＩＲｅｘ：配列番号４）、ＫＬＴＲＡＱＲＲＡＡＡＲＫＮＫＲＮＴＲなるアミノ酸配列を有するペプチド（例えば、ＣＣＭＶＧａｇ：配列番号５）等の親水性の塩基性ペプチド；ＲＱＩＫＩＷＦＱＮＲＲＭＫＷＫＫなるアミノ酸配列を有するペプチド（例えば、アンテナペディア：配列番号６）、ＫＭＴＲＡＱＲＲＡＡＡＲＲＮＲＷＴＡＲなるアミノ酸配列を有するペプチド（例えば、ＢＭＷＧａｇ：配列番号７）、ＲＱＩＫＩＷＦＱＮＲＲＭＫＷＫＫなるアミノ酸配列を有するペプチド（例えば、ペネトラチン：配列番号８）、ＮＡＫＴＲＲＨＥＲＲＲＫＬＡＩＥＲなるアミノ酸配列を有するペプチド（例えば、Ｐ２２Ｎ：配列番号９）、ＤＡＡＴＡＴＲＧＲＳＡＡＳＲＰＴＥＲＰＲＡＰＡＲＳＡＳＲＰＤＤＰＶＤなるアミノ酸配列を有するペプチド（例えば、ＶＰ２２：配列番号１０）等の両親媒性の塩基性ペプチド；ＧＷＴＬＮＳＡＧＹＬＬＧＫＩＮＬＫＡＬＡＡＬＡＫＫＩＬなるアミノ酸配列を有するペプチド（例えば、トランスポータン：配列番号１１）、ＡＧＹＬＬＧＫＩＮＬＫＡＬＡＡＬＡＫＫＩＬなるアミノ酸配列を有するペプチド（例えば、ＴＰ－１０：配列番号１２）等の疎水性の塩基性ペプチド等が挙げられる。膜透過性ペプチドは、上述したアルギニンオリゴマー又は配列番号１～１２に示すアミノ酸配列からなるペプチドであってもよい。
中でも、膜透過性ペプチドとしては、親水性の塩基性ペプチドが好ましく、アルギニンオリゴマーを有するペプチドがより好ましく、アルギニンオリゴマーからなるペプチドがさらにより好ましい。アルギニンオリゴマーにおけるアルギニンの繰り返し数は、７～２０が好ましく、７～１５がより好ましく、７～１０がさらに好ましい。 Examples of membrane-permeable peptides include peptides having an arginine oligomer in which 7 to 30 arginines are peptide-bound, peptides having an amino acid sequence of GRKKRRQRRRPPQ (e.g., HIV-1 Tat: SEQ ID NO: 1), peptides having an amino acid sequence of TRQARRNRRRRWRERQR (e.g., HIV-1 Rev: SEQ ID NO: 2), peptides having an amino acid sequence of RRRRNRTRRNRRRVR (e.g., FHV Coat: SEQ ID NO: 3), peptides having an amino acid sequence of TRRQRTRRARRNR (e.g., HTLV-II Rex: SEQ ID NO: 4), and peptides having an amino acid sequence of KLTRAQRRAAARKNKRNTR (e.g., CCMV hydrophilic basic peptides such as Gag (SEQ ID NO: 5); peptides having the amino acid sequence RQIKIWFQNRRMKWKK (e.g., Antennapedia: SEQ ID NO: 6), peptides having the amino acid sequence KMTRAQRRAAARRNRWTAR (e.g., BMW Examples of the membrane-permeable peptide include amphipathic basic peptides such as peptides having the amino acid sequence RQIKIWFQNRRMKWKK (e.g., penetratin: SEQ ID NO: 8), peptides having the amino acid sequence NAKTRRHERRRRKLAIER (e.g., P22N: SEQ ID NO: 9), and peptides having the amino acid sequence DAATATRGRSAASRPTERPRAPARSASRPDDPVD (e.g., VP22: SEQ ID NO: 10); and hydrophobic basic peptides such as peptides having the amino acid sequence GWTLNSAGYLLGKINLKALAALAKKIL (e.g., transportan: SEQ ID NO: 11), and peptides having the amino acid sequence AGYLLGKINLKALAALAKKIL (e.g., TP-10: SEQ ID NO: 12). The membrane-permeable peptide may be the above-mentioned arginine oligomer or a peptide consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NOs: 1 to 12.
Among them, the membrane-permeable peptide is preferably a hydrophilic basic peptide, more preferably a peptide having an arginine oligomer, and even more preferably a peptide consisting of an arginine oligomer. The number of arginine repeats in the arginine oligomer is preferably 7 to 20, more preferably 7 to 15, and even more preferably 7 to 10.

一般式（１）中、Ｘ^２は、水酸基、アミノ基、炭素数１～４のアルコキシル基又はベンジルオキシ基を示す。
炭素数１～４のアルコキシル基としては、例えば、メトキシ基、エトキシ基、プロポキシ基、イソプロポキシ基、ブトキシ基、イソブトキシ基、１－メチルプロポキシ基、ｔ－ブトキシ基等が挙げられる。Ｘ^２としては、水酸基、アミノ基、ｔ－ブトキシ基、ベンジルオキシ基が好ましく、水酸基、アミノ基が更に好ましく、アミノ基が最も好ましい。
一般式（１）で表される基を側鎖に有する高分子化合物中、一般式（１）で表される基が複数存在する場合、それぞれの一般式（１）で表される基の、Ｘ^１及びＸ^２は同一であってもよく、異なっていてもよい。 In the general formula (1), ^X2 represents a hydroxyl group, an amino group, an alkoxyl group having 1 to 4 carbon atoms, or a benzyloxy group.
Examples of the alkoxyl group having 1 to 4 carbon atoms include a methoxy group, an ethoxy group, a propoxy group, an isopropoxy group, a butoxy group, an isobutoxy group, a 1-methylpropoxy group, a t-butoxy group, etc. ^X2 is preferably a hydroxyl group, an amino group, a t-butoxy group, or a benzyloxy group, more preferably a hydroxyl group or an amino group, and most preferably an amino group.
In a polymer compound having a group represented by general formula (1) in a side chain, when a plurality of groups represented by general formula (1) are present, ^X1 and ^X2 in each group represented by general formula (1) may be the same as or different from each other.

本明細書において、一般式（１）で表される基を側鎖に有する高分子化合物の主鎖部分を幹高分子という。 In this specification, the main chain portion of a polymer compound having a group represented by general formula (1) on its side chain is referred to as the backbone polymer.

幹高分子は、特に限定されないが、親水性高分子であることが好ましい。ここで、親水性高分子とは、水溶性高分子、または水中で膨潤する高分子を意味する。本明細書において、水溶性高分子とは、常圧下で２５℃の水に０．１質量％以上の量で均一に溶解する高分子をいう。 The backbone polymer is not particularly limited, but is preferably a hydrophilic polymer. Here, a hydrophilic polymer refers to a water-soluble polymer or a polymer that swells in water. In this specification, a water-soluble polymer refers to a polymer that dissolves uniformly in water at 25°C under normal pressure in an amount of 0.1% by mass or more.

親水性高分子としては、例えば、グアーガム、アガロース、マンナン、グルコマンナン、ポリデキストロース、リグニン、キチン、キトサン、カラギーナン、プルラン、コンドロイチン硫酸、セルロース、ヘミセルロース、メチルセルロース、エチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、デンプン、カチオンデンプン、デキストリンの多糖類又は多糖類の変性物；アルブミン、カゼイン、ゼラチン、ポリグルタミン酸、ポリリジン等の水溶性タンパク質又は水溶性ポリペプチド；ポリ（メタ）アクリル酸、ポリ（アクリル酸ヒドロキシエチル）、ポリ（メタ）アクリルアミド、ポリＮ－ビニルアセトアミド、ポリビニルピロリドン、ポリビニルアルコール、ポリ（２－アミノエチル（メタ）アクリレート）、（メタ）アクリル酸／アクリルアミド共重合物、（メタ）アクリル酸／Ｎ－イソプロピルアクリルアミド共重合物、（メタ）アクリル酸／Ｎ－ビニルアセトアミド共重合物、（メタ）アクリル酸／マレイン酸共重合物、（メタ）アクリル酸／フマル酸共重合物、エチレン／マレイン酸共重合物、イソブチレン／マレイン酸共重合物、スチレン／マレイン酸共重合物、アルキルビニルエーテル／マレイン酸共重合物、アルキルビニルエーテル／フマル酸共重合物等のビニル系親水性高分子；水溶性ポリウレタン等が挙げられる。なお、本明細書において（メタ）アクリル酸とはアクリル酸および／またはメタクリル酸を意味する。 Hydrophilic polymers include, for example, guar gum, agarose, mannan, glucomannan, polydextrose, lignin, chitin, chitosan, carrageenan, pullulan, chondroitin sulfate, cellulose, hemicellulose, methylcellulose, ethylcellulose, hydroxyethylcellulose, hydroxypropylcellulose, starch, cationic starch, and dextrin polysaccharides or modified polysaccharides; water-soluble proteins or water-soluble polypeptides such as albumin, casein, gelatin, polyglutamic acid, and polylysine; poly(meth)acrylic acid, poly(hydroxyethyl acrylate), poly(meth)acrylamide, and poly(N-vinyl acetate). Examples of suitable vinyl hydrophilic polymers include vinyl-based hydrophilic polymers such as acrylate, polyvinylpyrrolidone, polyvinyl alcohol, poly(2-aminoethyl (meth)acrylate), (meth)acrylic acid/acrylamide copolymer, (meth)acrylic acid/N-isopropylacrylamide copolymer, (meth)acrylic acid/N-vinylacetamide copolymer, (meth)acrylic acid/maleic acid copolymer, (meth)acrylic acid/fumaric acid copolymer, ethylene/maleic acid copolymer, isobutylene/maleic acid copolymer, styrene/maleic acid copolymer, alkyl vinyl ether/maleic acid copolymer, and alkyl vinyl ether/fumaric acid copolymer; and water-soluble polyurethanes. In this specification, (meth)acrylic acid refers to acrylic acid and/or methacrylic acid.

幹高分子への膜透過性ペプチド基のグラフト化が容易になることから、幹高分子としては、カルボキシル基を有する高分子が好ましく、カルボキシル基を有する親水性高分子がより好ましく、カルボキシル基を有するモノマーとカルボキシル基を有しないモノマーとの共重合物が更に好ましく、（メタ）アクリル酸／Ｎ－ビニルアセトアミド共重合物が最も好ましい。 Because this facilitates grafting of membrane-permeable peptide groups onto the backbone polymer, polymers having carboxyl groups are preferred, hydrophilic polymers having carboxyl groups are more preferred, copolymers of monomers having carboxyl groups and monomers not having carboxyl groups are even more preferred, and (meth)acrylic acid/N-vinylacetamide copolymers are most preferred.

幹高分子を構成するモノマー単位の数に対するカルボキシル基を有するモノマー単位の数の割合は、例えば、５～８０％程度が好ましく、１０～６０％程度がより好ましい。例えば、２０～４０％程度であってもよい。 The ratio of the number of monomer units having a carboxyl group to the number of monomer units constituting the backbone polymer is, for example, preferably about 5 to 80%, more preferably about 10 to 60%. It may be, for example, about 20 to 40%.

一般式（１）で表される基を側鎖に有する高分子化合物における膜透過性ペプチド残基の数は、幹高分子を構成するモノマー単位（多糖類又は多糖類の変性物の場合は単糖単位、水溶性タンパク質又は水溶性ポリペプチドの場合はアミノ酸単位）の数に対して、０．００１～０．９程度であることが好ましく、０．００５～０．８程度であることが更に好ましく、０．０１～０．７程度であることが最も好ましい。例えば、０．０５～０．５程度であってもよい。 The number of membrane-permeable peptide residues in a polymer compound having a group represented by general formula (1) in its side chain is preferably approximately 0.001 to 0.9, more preferably approximately 0.005 to 0.8, and most preferably approximately 0.01 to 0.7, relative to the number of monomer units (monosaccharide units in the case of polysaccharides or modified polysaccharides, and amino acid units in the case of water-soluble proteins or water-soluble polypeptides) that make up the backbone polymer. For example, it may be approximately 0.05 to 0.5.

幹高分子の重量平均分子量は、例えば、１０ｋＤａ～１００００ｋＤａが好ましく、３０ｋＤａ～５０００ｋＤａが更に好ましく、１００ｋＤａ～３０００ｋＤａが最も好ましい。なお、本明細書において重量平均分子量とは、水系溶媒を用いてＧＰＣ分析を行った場合の重量平均分子量であって、幹高分子が多糖類若しくは多糖類の変性物、又は水溶性タンパク質の場合には、プルラン換算の重量平均分子量、幹高分子がビニル系親水性高分子の場合には、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）若しくはポリエチレンオキシド（ＰＥＯ）換算の重量平均分子量をいう。 The weight-average molecular weight of the backbone polymer is, for example, preferably 10 kDa to 10,000 kDa, more preferably 30 kDa to 5,000 kDa, and most preferably 100 kDa to 3,000 kDa. In this specification, the term "weight-average molecular weight" refers to the weight-average molecular weight measured by GPC analysis using an aqueous solvent. When the backbone polymer is a polysaccharide, a modified polysaccharide, or a water-soluble protein, it refers to the weight-average molecular weight calculated in terms of pullulan. When the backbone polymer is a vinyl-based hydrophilic polymer, it refers to the weight-average molecular weight calculated in terms of polyethylene glycol (PEG) or polyethylene oxide (PEO).

一般式（１）で表される基を側鎖に有する高分子化合物の製造方法は特に限定されず、当業者に広く知られている各種の方法を適用できる。例えば、一般式（１）で表される基を有する重合性モノマーを重合して製造してもよく、幹高分子に一般式（１）で表される基を導入して製造してもよい。例えば、幹高分子のカルボキシル基に、膜透過性ペプチドのアミノ基をペプチド反応させることにより得ることができる。カルボキシル基とアミノ基との反応は、公知の方法を用いればよく、例えば、カルボキル基をＮ－ヒドロキシコハク酸イミドによりスクシイミドエステル化した後、アミノ基を反応させる方法等が挙げられる。 The method for producing a polymeric compound having a group represented by general formula (1) in its side chain is not particularly limited, and various methods widely known to those skilled in the art can be applied. For example, the polymeric compound may be produced by polymerizing a polymerizable monomer having a group represented by general formula (1), or by introducing a group represented by general formula (1) into a backbone polymer. For example, the polymeric compound can be obtained by subjecting the amino group of a membrane-permeable peptide to a peptide reaction with the carboxyl group of the backbone polymer. The reaction between the carboxyl group and the amino group can be carried out using known methods, such as succinimide esterification of the carboxyl group with N-hydroxysuccinimide, followed by reaction with the amino group.

本開示に用いられる抗原は、例えば、がん抗原であることが好ましい。がん抗原としては、がん細胞特異的である限り特に限定されず、例えば、タンパク質、ペプチド、ＤＮＡ、ＲＮＡ等が挙げられる。また、本開示に用いられる抗原としては、例えば、がん細胞又は組織の溶解液等を用いることもできる。これらは、１種単独で又は２種以上を組み合わせて用いることができる。
がん抗原は、例えば、本開示の樹状細胞ワクチンを投与される対象由来であってもよく、人工的に合成されたものであってもよい。 The antigen used in the present disclosure is preferably, for example, a cancer antigen. The cancer antigen is not particularly limited as long as it is cancer cell-specific, and examples thereof include proteins, peptides, DNA, and RNA. Furthermore, the antigen used in the present disclosure can also be, for example, a lysate of cancer cells or tissues. These can be used alone or in combination of two or more.
The cancer antigen may be, for example, derived from the subject to which the dendritic cell vaccine of the present disclosure is administered, or may be artificially synthesized.

樹状細胞、一般式（１）で表される基を側鎖に有する高分子化合物、及び抗原を混合する方法は、樹状細胞に抗原が取り込まれる限り特に限定されず、例えば、水性媒体中で、樹状細胞、一般式（１）で表される基を側鎖に有する高分子化合物、及び抗原を混合する方法などが挙げられる。 The method for mixing dendritic cells, a polymer compound having a group represented by general formula (1) in its side chain, and an antigen is not particularly limited, as long as the antigen is taken up by dendritic cells. For example, a method may be used in which dendritic cells, a polymer compound having a group represented by general formula (1) in its side chain, and an antigen are mixed in an aqueous medium.

水性媒体としては、例えば、細胞培養に一般的に用いられる培地；樹状細胞培養液；蒸留水；生理食塩水、ブドウ糖水溶液等の等張液等が挙げられる。 Aqueous media include, for example, media commonly used in cell culture; dendritic cell culture medium; distilled water; and isotonic solutions such as physiological saline and glucose aqueous solutions.

樹状細胞、一般式（１）で表される基を側鎖に有する高分子化合物、及び抗原を混合する工程において、混合液における樹状細胞の濃度は、特に限定されず、適宜設定することができる。例えば、１．０×１０^４～２．０×１０^７ｃｅｌｌｓ／ｍｌ程度とすることができる。１．０×１０^５～５×１０^６ｃｅｌｌｓ／ｍｌ程度であってもよい。 In the step of mixing dendritic cells, a polymer compound having a group represented by general formula (1) in its side chain, and an antigen, the concentration of dendritic cells in the mixture is not particularly limited and can be set appropriately. For example, it can be about 1.0 × 10 ⁴ to 2.0 × 10 ⁷ cells/ml. It may also be about 1.0 × 10 ⁵ to 5 × 10 ⁶ cells/ml.

樹状細胞、一般式（１）で表される基を側鎖に有する高分子化合物、及び抗原を混合する工程において、混合液における一般式（１）で表される基を側鎖に有する高分子化合物の濃度は、例えば、０．１μｇ／ｍｌ～１ｍｇ／ｍｌ程度とすることができる。５μｇ／ｍ１～７５μｇ／ｍｌ程度であってもよい。 In the step of mixing dendritic cells, a polymer compound having a group represented by general formula (1) in its side chain, and an antigen, the concentration of the polymer compound having a group represented by general formula (1) in its side chain in the mixture can be, for example, approximately 0.1 μg/ml to 1 mg/ml. It may also be approximately 5 μg/ml to 75 μg/ml.

樹状細胞、一般式（１）で表される基を側鎖に有する高分子化合物、及び抗原を混合する工程において、混合液における抗原の濃度は、抗原の種類に応じて適宜設定することができる。例えば、０．５μｇ／ｍｌ～１０ｍｇ／ｍｌ程度とすることができる。５μｇ／ｍ～１００μｇ／ｍｌ程度であってもよい。
例えば、細胞の溶解液を抗原として用いる場合には、樹状細胞と細胞溶解液の調製に用いる細胞との細胞数の比率は、例えば、１：０．５～１：５程度とすることができる。 In the step of mixing dendritic cells, a polymer compound having a group represented by general formula (1) in its side chain, and an antigen, the concentration of the antigen in the mixture can be appropriately set depending on the type of antigen. For example, it can be about 0.5 μg/ml to 10 mg/ml. It may also be about 5 μg/ml to 100 μg/ml.
For example, when a cell lysate is used as an antigen, the ratio of the number of dendritic cells to the number of cells used to prepare the cell lysate can be, for example, about 1:0.5 to 1:5.

樹状細胞、一般式（１）で表される基を側鎖に有する高分子化合物、及び抗原を混合する温度は、樹状細胞が生存し得る限り、特に限定されず、例えば、３０～４０℃程度とすることができる。例えば、３４～３８℃程度であってもよい。 The temperature at which dendritic cells, a polymer compound having a group represented by general formula (1) in its side chain, and an antigen are mixed is not particularly limited, as long as the dendritic cells can survive, and can be, for example, approximately 30 to 40°C. It may also be, for example, approximately 34 to 38°C.

樹状細胞、一般式（１）で表される基を側鎖に有する高分子化合物、及び抗原を混合する時間は、樹状細胞に抗原が取り込まれる限り特に限定されず、例えば、１５分～２４時間程度とすることができる。例えば、３０分～３時間程度であってもよい。 The time for mixing dendritic cells, a polymer compound having a group represented by general formula (1) in its side chain, and an antigen is not particularly limited as long as the antigen is taken up by the dendritic cells, and can be, for example, about 15 minutes to 24 hours. It may also be, for example, about 30 minutes to 3 hours.

樹状細胞、一般式（１）で表される基を側鎖に有する高分子化合物、及び抗原を混合する工程は、例えば、振盪、攪拌等を行ってもよい。振盪、攪拌方法は、当該技術分野において公知の方法を用いることができ、任意の条件を採用することができる。 The step of mixing dendritic cells, a polymer compound having a group represented by general formula (1) in its side chain, and an antigen may involve, for example, shaking or stirring. Methods known in the art can be used for shaking and stirring, and any conditions can be used.

本開示の樹状細胞ワクチンの製造方法は、さらに樹状細胞を洗浄する工程を含んでいてもよい。洗浄方法は、当該技術分野において公知の方法を用いることができ、任意の条件を採用することができる。 The method for producing a dendritic cell vaccine disclosed herein may further include a step of washing the dendritic cells. The washing method may be any method known in the art, and any conditions may be employed.

本開示の樹状細胞ワクチンの製造方法は、さらに樹状細胞を濃縮する工程を含んでいてもよい。濃縮方法は、当該技術分野において公知の方法を用いることができ、任意の条件を採用することができる。 The method for producing a dendritic cell vaccine disclosed herein may further include a step of concentrating dendritic cells. The concentration method may be any method known in the art, and any conditions may be used.

本開示の樹状細胞ワクチンは、がんワクチンとして好適に用いることができる。このため、本開示の樹状細胞ワクチンは、がんの治療に好適に用いることができる。 The dendritic cell vaccine of the present disclosure can be suitably used as a cancer vaccine. Therefore, the dendritic cell vaccine of the present disclosure can be suitably used in the treatment of cancer.

本開示の樹状細胞ワクチンにおける樹状細胞の含有量は、特に限定されず、適宜設定することができる。 The amount of dendritic cells contained in the dendritic cell vaccine of the present disclosure is not particularly limited and can be set as appropriate.

本開示の樹状細胞ワクチンにおいて、一般式（１）で表される基を側鎖に有する高分子化合物は、含まれていてもよく、含まれていなくてもよい。 The dendritic cell vaccine of the present disclosure may or may not contain a polymer compound having a group represented by general formula (1) in its side chain.

本開示の樹状細胞ワクチンにおいて、抗原は、樹状細胞に取り込まれていることが好ましい。なお本開示の樹状細胞ワクチンにおいて、抗原は、樹状細胞外に存在していてもよい。 In the dendritic cell vaccine of the present disclosure, the antigen is preferably incorporated into the dendritic cell. However, in the dendritic cell vaccine of the present disclosure, the antigen may be present outside the dendritic cell.

本開示の樹状細胞ワクチンは、さらに他の成分を含むことができる。当該他の成分としては、薬学的に許容される各種担体（例えば、溶剤、分散剤、等張化剤、キレート剤、安定化剤、ｐＨ調節剤、防腐剤、保存剤、抗酸化剤、溶解補助剤、粘稠化剤等）等が例示される。また、本開示の樹状細胞ワクチンは、アジュバントを含んでいてもよい。これらは、１種単独で又は２種以上を組み合わせて用いることができる。 The dendritic cell vaccine of the present disclosure may further contain other components. Examples of such other components include various pharmaceutically acceptable carriers (e.g., solvents, dispersants, isotonicity agents, chelating agents, stabilizers, pH adjusters, antiseptics, preservatives, antioxidants, solubilizers, thickeners, etc.). The dendritic cell vaccine of the present disclosure may also contain an adjuvant. These may be used alone or in combination of two or more types.

本開示の樹状細胞ワクチンの製剤形態は、特に限定されず、例えば、錠剤、丸剤、カプセル剤、散剤、顆粒剤、液剤、シロップ剤、ゼリー剤等の経口投与剤；注射剤、点滴剤、軟膏剤、パップ剤、貼付剤、点鼻剤、吸入剤、坐剤等の非経口投与剤等を挙げられる。中でも、注射剤が好ましい。 The formulation form of the dendritic cell vaccine of the present disclosure is not particularly limited, and examples include oral administration forms such as tablets, pills, capsules, powders, granules, liquids, syrups, and jellies; and parenteral administration forms such as injections, drips, ointments, poultices, patches, nasal drops, inhalants, and suppositories. Of these, injections are preferred.

本開示の樹状細胞ワクチンの投与方法としては、例えば、経口投与、及び非経口（例えば静脈、動脈、筋肉、皮下、腹腔、直腸、経皮、局所など）投与により、投与することができる。中でも、皮下投与が好ましい。 The dendritic cell vaccine of the present disclosure can be administered, for example, orally or parenterally (e.g., intravenously, intraarterially, intramuscularly, subcutaneously, intraperitoneally, rectally, transdermally, topically, etc.). Of these, subcutaneous administration is preferred.

本開示の樹状細胞ワクチンの投与対象としては、例えば、哺乳動物が挙げられる。哺乳動物としては、ヒト；ラット、マウス、ウサギ、ウシ、ブタ、イヌ、ネコ、ヒツジ、サル等の非ヒト哺乳動物などが例示される。 The dendritic cell vaccine of the present disclosure can be administered to, for example, mammals. Examples of mammals include humans and non-human mammals such as rats, mice, rabbits, cows, pigs, dogs, cats, sheep, and monkeys.

本開示の樹状細胞ワクチンの投与（摂取）量は、特に限定されず、投与する対象の年齢、性別、症状の程度、投与方法等により決定される。 The dosage (intake) of the dendritic cell vaccine disclosed herein is not particularly limited and is determined based on the age, sex, severity of symptoms, administration method, etc. of the recipient.

本開示は、下記一般式（１）で表される基を側鎖に有する高分子化合物を含有する、樹状細胞ワクチン製造補助剤をも包含する。本明細書において、当該樹状細胞ワクチン製造補助剤を、「本開示の樹状細胞ワクチン製造補助剤」と表記することがある。
The present disclosure also encompasses a dendritic cell vaccine production adjuvant containing a polymer compound having a group represented by the following general formula (1) in its side chain. In this specification, the dendritic cell vaccine production adjuvant may be referred to as the "dendritic cell vaccine production adjuvant of the present disclosure."

一般式（１）で表される基を側鎖に有する高分子化合物については、上記記載を援用することができる。 The above description can be applied to polymer compounds having a group represented by general formula (1) on their side chains.

本開示の樹状細胞ワクチン製造補助剤における、一般式（１）で表される基を側鎖に有する高分子化合物の含有量は、特に限定されず、適宜設定することができる。 The content of the polymer compound having a group represented by general formula (1) in its side chain in the dendritic cell vaccine production adjuvant of the present disclosure is not particularly limited and can be set as appropriate.

本開示の樹状細胞ワクチン製造補助剤は、一般式（１）で表される基を側鎖に有する高分子化合物に加えて、さらに他の成分を含むことができる。当該他の成分としては、薬学的に許容される各種担体（例えば、溶剤、分散剤、等張化剤、キレート剤、安定化剤、ｐＨ調節剤、防腐剤、保存剤、抗酸化剤、溶解補助剤、粘稠化剤等）等が例示される。これらは、１種単独で又は２種以上を組み合わせて用いることができる。 The dendritic cell vaccine production adjuvant of the present disclosure may further contain other components in addition to the polymer compound having a group represented by general formula (1) in its side chain. Examples of such other components include various pharmaceutically acceptable carriers (e.g., solvents, dispersants, isotonicity agents, chelating agents, stabilizers, pH adjusters, antiseptics, preservatives, antioxidants, solubilizers, thickeners, etc.). These may be used alone or in combination of two or more.

本開示の樹状細胞ワクチン製造補助剤の形態は、特に限定されず、例えば、液体状（例えば、溶液状、懸濁液状等）、ペースト状、又は固体状（例えば、粉末状、等）等であってもよい。 The form of the dendritic cell vaccine production adjuvant disclosed herein is not particularly limited, and may be, for example, a liquid (e.g., a solution, a suspension, etc.), a paste, or a solid (e.g., a powder, etc.).

本開示の樹状細胞ワクチン製造補助剤によれば、樹状細胞による抗原の取り込みを促進することができる。 The dendritic cell vaccine production adjuvant disclosed herein can promote antigen uptake by dendritic cells.

なお、本明細書において「含む」とは、「本質的にからなる」と、「からなる」をも包含する（The term "comprising" includes "consisting essentially of ” and "consisting of."）。また、本開示は、本明細書に説明した構成要件を任意の組み合わせを全て包含する。 In this specification, the term "comprising" includes "consisting essentially of" and "consisting of." Furthermore, the present disclosure encompasses all arbitrary combinations of the constituent elements described in this specification.

また、上述した本開示の各実施形態について説明した各種特性（性質、構造、機能等）は、本開示に包含される主題を特定するにあたり、どのように組み合わせられてもよい。すなわち、本開示には、本明細書に記載される組み合わせ可能な各特性のあらゆる組み合わせからなる主題が全て包含される。 Furthermore, the various characteristics (properties, structures, functions, etc.) described for each embodiment of the present disclosure above may be combined in any way to identify the subject matter encompassed by the present disclosure. In other words, the present disclosure encompasses all subject matter consisting of any combination of the combinable characteristics described in this specification.

本開示の内容を以下の実験例等を用いて具体的に説明する。しかし、本開示はこれらに何ら限定されるものではない。下記において、特に言及する場合を除いて、実験は大気圧及び常温条件下で行っている。また特に言及する場合を除いて、「％」は「質量％」を意味する。 The contents of this disclosure will be explained in detail using the following experimental examples. However, this disclosure is in no way limited to these. Unless otherwise specified, experiments below were conducted under atmospheric pressure and room temperature conditions. Furthermore, unless otherwise specified, "%" means "% by mass."

実験例１：DC2.4による抗原取り込み試験
細胞株と用いた培地
C57BL/6マウス由来樹状細胞株Dendritic Cell 2.4(DC2.4)はUniversity of Assachusetts Medical schoolのKenneth l.Rockより提供された。DC2.4はFetal Bovine Serum (FBS)(SIGMA Life Science)10%、Non-Essential Amino Asids solution（ナカライテスク）1%、Sodium Pyruvate Solution（ナカライテスク）1%、Penicilin Streptomycin（ナカライテスク）1%、2-MercaptoEthanol（FUJIFILM）0.004%を含むRoswell Park Memorial Institute(RPMI)培地で培養した。ただし、DC2.4への抗原導入時にはFBSのみ含まず他の試薬を加えたRPMI培地を使用した(これをFBS(-)RPMI培地とする)。 Experimental Example 1: Antigen uptake test by DC2.4
Cell lines and media used
The C57BL/6 mouse-derived dendritic cell line, Dendritic Cell 2.4 (DC2.4), was kindly provided by Kenneth L. Rock of the University of Assachusetts Medical School. DC2.4 were cultured in Roswell Park Memorial Institute (RPMI) medium containing 10% fetal bovine serum (FBS) (Sigma Life Science), 1% non-essential amino acid solution (Nacalai Tesque), 1% sodium pyruvate solution (Nacalai Tesque), 1% penicilin streptomycin (Nacalai Tesque), and 0.004% 2-mercaptoethanol (FUJIFILM). However, for antigen transfection of DC2.4, RPMI medium containing only FBS but other reagents was used (FBS(-) RPMI medium).

実験手順
1.0×10⁵ cellのDC2.4を24ウェルプレートに播種し、RPMI培地で1日培養した。培養液の上清を除去し、FBS（-）RPMI培地を加えた。抗原としてOvalbumin-Fluorescein conjugate(OVA)(Merck)を用いた。OVA 10μg/ml（図１中、OVAと示す。）、OVA 10μg/mlとKeyhole Limpet Hemocyanin(KLH)(Wako) 50μg/mlの混合物（図１中、OVA＋KLHと示す。）、OVA 10μg/mlと膜透過ペプチド固定化高分子HA-G4R8 50μg/mlの混合物（図１中、OVA＋HAと示す。）、OVA 10μg/mlと膜透過ペプチド固定化高分子VP-R8 50μg/mlの混合物（図１中、OVA＋VPと示す。）を、DC2.4を培養しているウェルプレートにtriplicate（各群n=3）で添加した。なお、HA-G4R8とVP-R8は摂南大学の佐久間信至先生より提供された。構造式をそれぞれ以下に示す。なお、膜透過ペプチド固定化高分子HA-G4R8の主鎖のヒアルロン酸の重量平均分子量は27 kDaであり、膜透過ペプチド部分の分子量とその固定化率から算出した、膜透過ペプチド固定化高分子HA-G4R8の重量平均分子量は114 kDaであった。また、膜透過ペプチド固定化高分子VP-R8の幹高分子（PNVA-co-AA：アクリル酸／N-ビニルアセトアミド共重合体）の重量平均分子量は、350 kDaであり、膜透過ペプチドとして用いたD-オクタアルギニンの分子量とその固定化率から算出した、膜透過ペプチド固定化高分子VP-R8の重量平均分子量は1100 kDa（計算値）であった。 Experimental procedure
1.0 × ¹⁰⁵ cells of DC2.4 were seeded onto a 24-well plate and cultured in RPMI medium for 1 day. The culture supernatant was removed, and FBS(-) RPMI medium was added. Ovalbumin-fluorescein conjugate (OVA) (Merck) was used as an antigen. OVA at 10 μg/ml (indicated as OVA in Fig. 1), a mixture of OVA at 10 μg/ml and Keyhole Limpet Hemocyanin (KLH) (Wako) at 50 μg/ml (indicated as OVA + KLH in Fig. 1), a mixture of OVA at 10 μg/ml and the membrane-permeable peptide-immobilized polymer HA-G4R8 at 50 μg/ml (indicated as OVA + HA in Fig. 1), and a mixture of OVA at 10 μg/ml and the membrane-permeable peptide-immobilized polymer VP-R8 at 50 μg/ml (indicated as OVA + VP in Fig. 1) were added in triplicate (n = 3 per group) to well plates containing DC2.4 cells. HA-G4R8 and VP-R8 were kindly provided by Professor Nobuyuki Sakuma of Setsunan University. Their structural formulas are shown below. The weight-average molecular weight of the hyaluronic acid in the main chain of the membrane-permeable peptide-immobilized polymer HA-G4R8 was 27 kDa. The weight-average molecular weight of the membrane-permeable peptide-immobilized polymer HA-G4R8 calculated from the molecular weight of the membrane-permeable peptide moiety and its immobilization rate was 114 kDa. The weight-average molecular weight of the backbone polymer (PNVA-co-AA: acrylic acid/N-vinylacetamide copolymer) in the membrane-permeable peptide-immobilized polymer VP-R8 was 350 kDa. The weight-average molecular weight of the membrane-permeable peptide-immobilized polymer VP-R8 calculated from the molecular weight of the membrane-permeable peptide, D-octaarginine, and its immobilization rate was 1100 kDa (calculated value).

ウェルプレートを37℃、1時間インキュベートした。上清を除去し、Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline（D-PBS）で2回洗浄した。Accutase（商標）（ナカライテスク）を添加し、37℃、5分間インキュベートした。ピペッティングし細胞塊をほぐして単一にし、15 mlチューブにうつして、4℃、2000 rpm、5分で遠心した。D-PBSで2回洗浄した後300μlのD-PBSに懸濁し、Guava（登録商標）easyCyte（商標）Flow Cytometers(Luminex Corporation)によりMean Fluorescence Intensity（MFI）を測定した。結果を図１に示す。 The well plate was incubated at 37°C for 1 hour. The supernatant was removed and the plate was washed twice with Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (D-PBS). Accutase™ (Nacalai Tesque) was added and the plate was incubated at 37°C for 5 minutes. The cell clumps were loosened by pipetting, transferred to a 15 ml tube, and centrifuged at 2000 rpm at 4°C for 5 minutes. After washing twice with D-PBS, the cells were suspended in 300 μl of D-PBS and the mean fluorescence intensity (MFI) was measured using Guava® easyCyte™ Flow Cytometers (Luminex Corporation). The results are shown in Figure 1.

図１に示すとおり、OVAと膜輸送性高分子ポリマーVP-R8の混合物を添加した場合に、DC2.4による抗原（OVA）取り込みが有意に増加していることが確認された。 As shown in Figure 1, it was confirmed that antigen (OVA) uptake by DC2.4 was significantly increased when a mixture of OVA and the membrane-transporting polymer VP-R8 was added.

実験例２：DC2.4ワクチンin vivo実験
用いた動物と細胞株
実験に用いたメスのC57BL/6マウスはチャールズリバーより購入した。また、DC2.4は実験例１と同様の方法により培養を行った。
C57BL/6Nマウス由来の悪性リンパ腫細胞株であるEL4細胞を使用し、FBS 10%を含むRPMI培地を用いて培養した。 Experimental Example 2: DC2.4 vaccine in vivo experiment
Animals and cell lines used: Female C57BL/6 mice used in the experiments were purchased from Charles River. DC2.4 were cultured in the same manner as in Experimental Example 1.
EL4 cells, a malignant lymphoma cell line derived from C57BL/6N mice, were used and cultured in RPMI medium containing 10% FBS.

腫瘍細胞溶解液（ライセ―ト）の準備
シャーレに培養したEL4細胞をDulbecco’s Phosphate Buffered Saline（D-PBS）で2回洗浄した。0.25w/v％トリプシン-1mmol/l EDTA・4Na溶液（Wako）を添加し、37℃、5分インキュベートした。シャーレからはがした細胞をD-PBSで2回洗浄後、2×10⁷ cells/mLでD-PBSに懸濁した。液体窒素に細胞液を3分間浸したのちに42℃で解凍した。これを5回繰り返した。4℃、10000 rpm、10分遠心した後、上清を回収した。回収した上清を0.22μmのMillex-GV Filter Unit(Merck)で濾過し、その液をライセ―トとして回収した。 Preparation of tumor cell lysate: EL4 cells cultured in a petri dish were washed twice with Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (D-PBS). 0.25 w/v% trypsin-1 mmol/L EDTA tetraNa solution (Wako) was added and incubated at 37°C for 5 minutes. Cells detached from the petri dish were washed twice with D-PBS and then suspended in D-PBS at 2 × ¹⁰⁷ cells/mL. The cell suspension was immersed in liquid nitrogen for 3 minutes and then thawed at 42°C. This process was repeated five times. After centrifugation at 10,000 rpm for 10 minutes at 4°C, the supernatant was collected. The collected supernatant was filtered through a 0.22 μm Millex-GV Filter Unit (Merck), and the resulting solution was used as the lysate.

マウスへの腫瘍投与
培養したEL4細胞の上清を除去し、D-PBSで1回洗浄後、トリプシンを添加後インキュベートした。細胞数をカウントし、細胞液が1.4×10⁵ cells/70μlになるよう調整した。70μlずつ1.5 mlチューブに分注し、同量のCorning（登録商標）Matrigel（登録商標）(Corning)を加えた。マウスにセボフルラン（Wako）を用いて麻酔をかけ、細胞液をピペットでやさしく十分に混和した後、右側背中部に1.4×10⁵ cells/100μlで皮下投与した。 Tumor administration to mice: The supernatant of cultured EL4 cells was removed, washed once with D-PBS, and then trypsin was added and incubated. The cells were counted and the cell solution was adjusted to 1.4 x 10 ⁵ cells/70 μl. 70 μl of the solution was dispensed into 1.5 ml tubes, and an equal volume of Corning® Matrigel® (Corning) was added. Mice were anesthetized with sevoflurane (Wako), and the cell solution was gently mixed thoroughly with a pipette before being subcutaneously administered at 1.4 x 10 ⁵ cells/100 μl to the right back.

DC2.4ワクチンの調製と投与
培養したDC2.4細胞の上清を除去し、FBS(-)RPMI培地を3 ml加えた。DC2.4細胞にライセ－ト（図２中、DC2.4+EL4Lysateと示す。）、ライセ―トとKeyhole Limpet Hemocyanin(KLH)(Wako)50μg/mlの混合物（図２中、DC2.4+EL4Lysate+KLHと示す。）、ライセ－トとVP-R8 12.5μg/mlの混合物（図２中、DC2.4+EL4Lysate+VPと示す。）を添加した。ライセ－トはDC2.4(1.0×10⁶ cells/mouse)の3倍の細胞数から抽出した。添加後、振盪させながら1h、37℃インキュベートした。上清を除去し、Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline（D-PBS）で2回洗浄した。Accutase（商標）（ナカライテスク）を添加し、37℃、5分間インキュベートした。ピペッティングし細胞塊をほぐして単一にし、15 mlチューブにうつして、4℃、2000 rpm、5分で遠心し、D-PBSで2回洗浄した。マウス1匹あたり1.0×10⁶ cells in 100μl D-PBS投与できるようD-PBSに懸濁しDC2.4ワクチンを調製した。 Preparation and Administration of DC2.4 Vaccine: The supernatant of cultured DC2.4 cells was removed, and 3 ml of FBS(-) RPMI medium was added. DC2.4 cells were supplemented with lysate (shown as DC2.4+EL4Lysate in Figure 2), a mixture of lysate and Keyhole Limpet Hemocyanin (KLH) (Wako) 50 μg/ml (shown as DC2.4+EL4Lysate+KLH in Figure 2), or a mixture of lysate and VP-R8 12.5 μg/ml (shown as DC2.4+EL4Lysate+VP in Figure 2). Lysate was extracted from a cell number three times the number of DC2.4 (1.0 × ¹⁰ cells/mouse). After addition, the cells were incubated at 37°C with shaking for 1 hour. The supernatant was removed, and the cells were washed twice with Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (D-PBS). Accutase™ (Nacalai Tesque) was added, and the cells were incubated at 37°C for 5 minutes. The cells were pipetted to loosen the cell clumps, transferred to a 15 ml tube, centrifuged at 4°C, 2000 rpm for 5 minutes, and washed twice with D-PBS. The DC2.4 vaccine was prepared by suspending the cells in D-PBS so that 1.0 × ¹⁰ cells could be administered in 100 μl of D-PBS per mouse.

腫瘍を投与した日をday0として、day7、10、13に、マウスの鼠径リンパ節周辺に調製した各DC2.4ワクチンの皮下投与を行った。なお、DC2.4+EL4Lysate、DC2.4+EL4Lysate+VP、DC2.4+EL4Lysate+KLHに加えて、PBSのみ（図２中、PBSと示す。）、およびライセート、KLHまたはVPのいずれも添加せずに培養調整したDC2.4細胞（図２中、DC2.4と示す。）についても同様にマウスの鼠径リンパ節周辺に皮下投与を行った。 The day of tumor administration was designated day 0, and on days 7, 10, and 13, each DC2.4 vaccine was administered subcutaneously around the inguinal lymph nodes of mice. In addition to DC2.4+EL4Lysate, DC2.4+EL4Lysate+VP, and DC2.4+EL4Lysate+KLH, PBS alone (shown as PBS in Figure 2) and DC2.4 cells cultured without the addition of lysate, KLH, or VP (shown as DC2.4 in Figure 2) were also administered subcutaneously around the inguinal lymph nodes of mice.

腫瘍径測定を行い、平均腫瘍体積の算定を行った。腫瘍の体積は（腫瘍体積）＝（腫瘍の長径）×（腫瘍の短径）²/2で算定を行った。結果を図２に示す。 The tumor diameter was measured, and the average tumor volume was calculated using the formula: (tumor volume) = (longest diameter of tumor) × (shortest diameter of tumor) ² /2. The results are shown in Figure 2.

図２に示す通り、DC2.4細胞にライセ―トとVP-R8の混合物を添加して調製した懸濁液（DC2.4ワクチン）をマウスに投与すると、腫瘍体積の増加が抑制することが確認された。 As shown in Figure 2, when a suspension (DC2.4 vaccine) prepared by adding a mixture of DC2.4 cell lysate and VP-R8 to mice was administered, it was confirmed that the increase in tumor volume was suppressed.

実験例３：治療したマウスから摘出した脾臓細胞を用いたICCS実験
用いた動物と細胞株
実験例２と同様の動物、及び細胞株を同様に用いた。 Experimental Example 3: ICCS experiment using spleen cells extracted from treated mice
Animals and cell lines used The same animals and cell lines as in Experimental Example 2 were used.

腫瘍細胞溶解液（ライセ―ト）の準備
実験例２と同様の方法により、ライセートを調製した。 Preparation of tumor cell lysate Lysate was prepared in the same manner as in Experimental Example 2.

DC2.4ワクチンの調製と投与
実験例２と同様の方法により、D-PBSに懸濁したDC2.4ワクチン（DC2.4+EL4Lysate、DC2.4+EL4Lysate+VP、DC2.4+EL4Lysate+KLH）を調製し、マウスの鼠径リンパ節周辺に計3回皮下投与を行った（最初に投与を行った日をday0とし、day0、3、6に投与を行った）。なお、DC2.4+EL4Lysate、DC2.4+EL4Lysate+VP、DC2.4+EL4Lysate+KLHに加えて、PBSのみ（図３中、PBSと示す。）、およびライセート、KLHまたはVPのいずれも添加せずに培養調整したDC2.4細胞（図３中、DC2.4と示す。）についても同様にマウスの鼠径リンパ節周辺に皮下投与を行った。 DC2.4 vaccines (DC2.4+EL4Lysate, DC2.4+EL4Lysate+VP, and DC2.4+EL4Lysate+KLH) suspended in D-PBS were prepared using the same method as in Experimental Example 2, and administered subcutaneously three times around the inguinal lymph nodes of mice (the first administration was designated day 0, and administrations were performed on days 0, 3, and 6). In addition to DC2.4+EL4Lysate, DC2.4+EL4Lysate+VP, and DC2.4+EL4Lysate+KLH, PBS alone (shown as PBS in Figure 3) and DC2.4 cells cultured without the addition of lysate, KLH, or VP (shown as DC2.4 in Figure 3) were also administered subcutaneously around the inguinal lymph nodes of mice.

脾臓回収
最後に投与を行ってから2週間後（day20）にマウスを安楽死させ、脾臓を回収し、セルスクレイパー(日本ジェネティクス)と滅菌ピンセット（アズワン）を使って、脾臓をすりつぶした。セルストレイナー（コーニング）で脾臓細胞を濾過した。4℃、2000 rpm、5分で遠心後、上清を除去した。Red Blood Cell Lysis Buffer (Sigma Aldrich) を1 ml入れて室温で2分インキュベートした。RPMI培地を5 ml加え混和し、4℃、2000 rpm、5分で遠心した。上清を吸い、D-PBSで2回洗浄し、RPMI培地1 mlで懸濁した。96ウェルプレートに細胞液100μlを加え、培養しておいたEL4 2.0×10⁵ cells/サンプルをMitomycin C 50μg/mlで処理したものを100μl添加し、抗原刺激を行った。 Spleen Collection: Two weeks after the last injection (day 20), mice were euthanized and the spleens were collected. They were mashed using a cell scraper (Nihon Genetics) and sterile tweezers (As One). Spleen cells were filtered through a cell strainer (Corning). After centrifugation at 2000 rpm at 4°C for 5 minutes, the supernatant was removed. One ml of Red Blood Cell Lysis Buffer (Sigma-Aldrich) was added and incubated at room temperature for 2 minutes. Five ml of RPMI medium was added, mixed, and centrifuged at 2000 rpm at 4°C for 5 minutes. The supernatant was aspirated, washed twice with D-PBS, and resuspended in 1 ml of RPMI medium. One hundred μl of the cell suspension was added to a 96-well plate, and 100 μl of cultured EL4 cells (2.0 × 10 ⁵ cells/sample) treated with 50 μg/ml mitomycin C was added for antigen stimulation.

ICCS実験
抗原刺激を行った脾臓細胞にBD Golgi Stop（商標）(BDs Biosciences)を添加後12時間培養し、ウェルプレートを遠心（4℃、2500 rpm、5 min）し、上清除去した。100μlのstaining buffer（1%FBS、0.09%アジ化ナトリウムin PBS）で1回洗浄（4℃、2500 rpm、5 min）し、上清除去した。1μg CD16/32抗体（Bio Legend）in 100μl staining bufferを添加し氷上で15分間静置した。100μlのstaining bufferで1回洗浄（4℃、2500 rpm、5 min）し、上清除去した。NC（ネガティブコントロール）用の脾臓細胞として抗体反応を行わないサンプルを用意した。FITC-anti-mouse CD4 (BD Biosciences) 抗体、APC-anti-mouse CD8 (BD Biosciences) 抗体、PerCP-anti-mouse CD3 (BD Biosciences) 抗体in Staining Bufferを100μl添加し遮光下、氷上30分静置した。100μlのstaining bufferで1回洗浄（4℃、2500 rpm、5 min）し、上清除去した。細胞を100μl Fixation/Permeabilization solution (BD Biosciences) で遮光下、氷上20分静置した。1×BD Perm/Wash Buffer (BD Biosciences) で2回洗浄した（4℃、3500 rpm、5 min）。細胞をPE-anti mouse IFN-γ抗体（BD Biosciences）[0.5μg in 100μl Perm/Wash Buffer(終濃度5μg/ml)]で遮光下、氷上30分静置した。1×BD Perm/Wash Bufferで2回洗浄（4℃、3500 rpm、5 min）した。細胞を300μl staining bufferに懸濁し、Guava（登録商標）easyCyte（商標）Flow Cytometers(Luminex Corporation)によりMean Fluorescence Intensity（MFI）を測定した。結果を図３に示す。 For ICCS experiments, BD Golgi Stop™ (BD Biosciences) was added to antigen-stimulated splenocytes and cultured for 12 hours. The well plate was centrifuged (4°C, 2500 rpm, 5 min) and the supernatant was removed. The plate was washed once with 100 μl of staining buffer (1% FBS, 0.09% sodium azide in PBS) (4°C, 2500 rpm, 5 min) and the supernatant was removed. 1 μg of CD16/32 antibody (Bio Legend) was added in 100 μl of staining buffer and the plate was left on ice for 15 minutes. The plate was washed once with 100 μl of staining buffer (4°C, 2500 rpm, 5 min) and the supernatant was removed. A sample of splenocytes not subjected to antibody reaction was prepared as a negative control (NC). 100 μl of FITC-anti-mouse CD4 (BD Biosciences), APC-anti-mouse CD8 (BD Biosciences), and PerCP-anti-mouse CD3 (BD Biosciences) antibodies in staining buffer was added and incubated on ice for 30 minutes in the dark. The cells were washed once with 100 μl of staining buffer (4°C, 2500 rpm, 5 minutes), and the supernatant was removed. The cells were incubated on ice for 20 minutes in the dark with 100 μl of Fixation/Permeabilization solution (BD Biosciences). Then, the cells were washed twice with 1x BD Perm/Wash Buffer (BD Biosciences) (4°C, 3500 rpm, 5 minutes). The cells were incubated with PE-anti-mouse IFN-γ antibody (BD Biosciences) [0.5 μg in 100 μL Perm/Wash Buffer (final concentration 5 μg/ml)] on ice for 30 minutes in the dark. Then, they were washed twice with 1x BD Perm/Wash Buffer (4°C, 3500 rpm, 5 min). The cells were suspended in 300 μL staining buffer, and the mean fluorescence intensity (MFI) was measured using Guava® easyCyte™ Flow Cytometers (Luminex Corporation). The results are shown in Figure 3.

図３に示すとおり、DC2.4細胞にライセ―トとVP-R8の混合物を添加して培養調製したDC2.4ワクチンをマウスに投与すると、抗原タンパク（EL4細胞）の刺激に反応してIFN-γ陽性のCD4およびCD8細胞数が増加する傾向が確認された。これは当該ワクチンが抗原特異的な細胞性免疫を誘導することができることを示唆する。 As shown in Figure 3, when mice were administered the DC2.4 vaccine, which was prepared by adding a mixture of DC2.4 cells lysate and VP-R8 to the cells and culturing them, a tendency for the number of IFN-γ-positive CD4 and CD8 cells to increase in response to stimulation with the antigen protein (EL4 cells) was confirmed. This suggests that the vaccine is capable of inducing antigen-specific cellular immunity.

Claims

A method for producing a dendritic cell vaccine, comprising mixing dendritic cells, a polymer compound having a group represented by the following general formula (1) in a side chain, and an antigen, wherein the trunk polymer of the polymer compound is a (meth)acrylic acid/N-vinylacetamide copolymer :
(wherein ^X1 represents residues obtained by removing the terminal amino group and the terminal carboxyl group from a membrane-permeable peptide, and the membrane-permeable peptide is a peptide composed of an arginine oligomer having 7 to 10 arginine repeats; and ^X2 represents an amino group .)

The method for producing a dendritic cell vaccine according to claim 1 , wherein the antigen is a cancer antigen and the dendritic cell vaccine is a cancer vaccine.

A dendritic cell vaccine comprising: a dendritic cell; a polymer compound having a group represented by the following general formula (1) at its side chain; and an antigen, wherein the trunk polymer of the polymer compound is a (meth)acrylic acid/N-vinylacetamide copolymer :
(wherein ^X1 represents residues obtained by removing the terminal amino group and the terminal carboxyl group from a membrane-permeable peptide, and the membrane-permeable peptide is a peptide composed of an arginine oligomer having 7 to 10 arginine repeats; and ^X2 represents an amino group .)

A dendritic cell vaccine production adjuvant comprising a polymer compound having a group represented by the following general formula (1) in a side chain, wherein the trunk polymer of the polymer compound is a (meth)acrylic acid/N-vinylacetamide copolymer :
(wherein ^X1 represents residues obtained by removing the terminal amino group and the terminal carboxyl group from a membrane-permeable peptide, and the membrane-permeable peptide is a peptide composed of an arginine oligomer having 7 to 10 arginine repeats; and ^X2 represents an amino group .)