JP7808839B2 - Semaphorin 3A expression promoter - Google Patents
Semaphorin 3A expression promoterInfo
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Description
本発明はセマフォリン３Ａ発現促進剤に関する。より詳細には、セマフォリン３Ａ発現促進剤、アトピー性皮膚炎予防及び／又は治療剤、乾皮症予防及び／又は治療剤、アレルギー性鼻炎予防及び／又は治療剤、並びに骨粗鬆症予防及び／又は治療剤に関する。 The present invention relates to a semaphorin 3A expression promoter. More specifically, the present invention relates to a semaphorin 3A expression promoter, a preventive and/or therapeutic agent for atopic dermatitis, a preventive and/or therapeutic agent for xerosis, a preventive and/or therapeutic agent for allergic rhinitis, and a preventive and/or therapeutic agent for osteoporosis.
アトピー性皮膚炎や乾皮症の病変部位では表皮内に神経線維が多数増生し、これがかゆみ過敏の原因になる。
また、セマフォリンは、免疫応答や骨代謝の制御、がんの進展など様々な病態に関与することが知られるたんぱく質群である。正常皮膚（表皮）ではセマフォリン３Ａ（Ｓｅｍａ３Ａ、神経反発因子）がＮＧＦ（神経伸張因子）より優位になっているが、アトピー性皮膚炎や乾皮症の病変部位では、セマフォリン３Ａの発現が低下してＮＧＦの発現が亢進する。その結果、ＮＧＦ優位となり、神経線維の表皮内侵入が惹起されるため、表皮内神経線維の増生は表皮角化細胞が産生するセマフォリン３Ａの発現減少が一因と考えられており、セマフォリン３Ａをアトピー性皮膚炎病変部に塗布又は皮下注射した場合にかゆみや皮膚炎の改善が認められたという報告がある（非特許文献１、２）。
In lesions of atopic dermatitis and xerosis, a large number of nerve fibers proliferate within the epidermis, causing itching and hypersensitivity.
Semaphorins are a group of proteins known to be involved in various pathologies, such as immune response, bone metabolism control, and cancer progression. In normal skin (epidermis), semaphorin 3A (Sema3A, nerve repulsive factor) predominates over NGF (neuronal growth factor). However, in lesions of atopic dermatitis or xerosis, semaphorin 3A expression is reduced and NGF expression is increased. As a result, NGF predominates, inducing the infiltration of nerve fibers into the epidermis. The proliferation of intraepidermal nerve fibers is thought to be partly due to the reduced expression of semaphorin 3A produced by epidermal keratinocytes. It has been reported that application or subcutaneous injection of semaphorin 3A to lesions of atopic dermatitis improved itching and dermatitis (Non-Patent Documents 1 and 2).
また、セマフォリン３Ａの発現減少はアレルギー性鼻炎の鼻粘膜上皮でも見られ、セマフォリン３Ａの鼻腔内投与により鼻炎が軽減されるという報告もある（非特許文献３）。また、セマフォリン３Ａは、破骨細胞の分化抑制と分化促進を同時に行うことで骨量を増加させる作用をもつことが知られている（非特許文献４）。 In addition, decreased expression of semaphorin 3A is also observed in the nasal mucosal epithelium in patients with allergic rhinitis, and it has been reported that intranasal administration of semaphorin 3A alleviates rhinitis (Non-Patent Document 3). Semaphorin 3A is also known to increase bone mass by simultaneously inhibiting and promoting osteoclast differentiation (Non-Patent Document 4).
このようなセマフォリン３Ａの発現を促進するものとして、植物由来スフィンゴ糖脂質や緑茶抽出物がこれまでに報告されている（特許文献１、２）。 Plant-derived glycosphingolipids and green tea extracts have been reported to promote the expression of semaphorin 3A (Patent Documents 1 and 2).
一方、パーベンダゾールやフェンベンダゾール、アルベンダゾールに代表されるベンズイミダゾール誘導体は、駆虫に有効ということが知られているが、セマフォリン３Ａ発現促進効果やアトピー性皮膚炎予防及び／又は治療効果、乾皮症予防及び／又は治療効果、アレルギー性鼻炎予防及び／又は治療効果、骨粗鬆症予防及び／又は治療効果があるか否かを検討したという報告はない。
本発明の課題は、セマフォリン３Ａの発現を促進させる新たな技術を提供することにある。
On the other hand, benzimidazole derivatives such as perbendazole, fenbendazole, and albendazole are known to be effective in anthelmintics, but there have been no reports examining whether they have an effect of promoting semaphorin 3A expression or an effect of preventing and/or treating atopic dermatitis, xerosis, allergic rhinitis, or osteoporosis.
An object of the present invention is to provide a new technique for promoting the expression of semaphorin 3A.
本発明者らは鋭意検討した結果、パーベンダゾールやフェンベンダゾール、アルベンダゾールに代表される特定のベンズイミダゾール誘導体が優れたセマフォリン３Ａ発現促進効果を有することを見出し、本発明を完成した。 After extensive research, the inventors discovered that certain benzimidazole derivatives, such as perbendazole, fenbendazole, and albendazole, have excellent semaphorin 3A expression-promoting effects, leading to the completion of the present invention.
すなわち、本発明は、以下の＜１＞～＜７＞を提供するものである。
＜１＞ 下記式（１）で表される化合物（以下、化合物（１）ともいう）を有効成分とする、セマフォリン３Ａ発現促進剤（以下、本発明のセマフォリン３Ａ発現促進剤ともいう）。
That is, the present invention provides the following items <1> to <7>.
<1> A semaphorin 3A expression promoter (hereinafter also referred to as the semaphorin 3A expression promoter of the present invention) containing a compound represented by the following formula (1) (hereinafter also referred to as compound (1)) as an active ingredient:
〔式（１）中、
Ｒ1は、炭素数６～１４の芳香族炭化水素基又は炭素数１～１２の脂肪族炭化水素基を示し、
Ｒ2は、水素原子又は脂肪族炭化水素基を示し、
Ｘは、単結合、酸素原子又は硫黄原子を示す。〕
[In formula (1),
R 1 represents an aromatic hydrocarbon group having 6 to 14 carbon atoms or an aliphatic hydrocarbon group having 1 to 12 carbon atoms;
R2 represents a hydrogen atom or an aliphatic hydrocarbon group;
X represents a single bond, an oxygen atom, or a sulfur atom.
＜２＞ 化合物（１）を有効成分とする、アトピー性皮膚炎予防及び／又は治療剤（以下、本発明のアトピー性皮膚炎予防及び／又は治療剤ともいう）。
＜３＞ 化合物（１）を有効成分とする、乾皮症予防及び／又は治療剤（以下、本発明の乾皮症予防及び／又は治療剤ともいう）。
＜４＞ 化合物（１）を有効成分とする、アレルギー性鼻炎予防及び／又は治療剤（以下、本発明のアレルギー性鼻炎予防及び／又は治療剤ともいう）。
<2> A preventive and/or therapeutic agent for atopic dermatitis, containing compound (1) as an active ingredient (hereinafter also referred to as the preventive and/or therapeutic agent for atopic dermatitis of the present invention).
<3> A preventive and/or therapeutic agent for xeroderma containing compound (1) as an active ingredient (hereinafter also referred to as the preventive and/or therapeutic agent for xeroderma of the present invention).
<4> A preventive and/or therapeutic agent for allergic rhinitis containing compound (1) as an active ingredient (hereinafter also referred to as the preventive and/or therapeutic agent for allergic rhinitis of the present invention).
＜５＞ 化合物（１）を有効成分とする、骨粗鬆症予防及び／又は治療剤（以下、本発明の骨粗鬆症予防及び／又は治療剤ともいう）。
＜６＞ 化合物（１）を有効成分とする、ＮＧＦ発現抑制剤（以下、本発明のＮＧＦ発現抑制剤ともいう）。
<5> A preventive and/or therapeutic agent for osteoporosis containing compound (1) as an active ingredient (hereinafter also referred to as the preventive and/or therapeutic agent for osteoporosis of the present invention).
<6> An NGF expression inhibitor containing compound (1) as an active ingredient (hereinafter also referred to as the NGF expression inhibitor of the present invention).
＜７＞ 式（１）で表される化合物が、パーベンダゾール、フェンベンダゾール及びアルベンダゾールから選ばれる１種又は２種以上である、＜１＞～＜６＞のいずれかに記載の剤。 <7> The agent according to any one of <1> to <6>, wherein the compound represented by formula (1) is one or more selected from perbendazole, fenbendazole, and albendazole.
本発明のセマフォリン３Ａ発現促進剤は、優れたセマフォリン３Ａ発現促進効果を有する。また、本発明のＮＧＦ発現抑制剤は、優れたＮＧＦ発現抑制効果を有する。
本発明のアトピー性皮膚炎予防及び／又は治療剤は、アトピー性皮膚炎予防及び／又は治療効果に優れる。
本発明の乾皮症予防及び／又は治療剤は、乾皮症予防及び／又は治療効果に優れる。
本発明のアレルギー性鼻炎予防及び／又は治療剤は、アレルギー性鼻炎予防及び／又は治療効果に優れる。
本発明の骨粗鬆症予防及び／又は治療剤は、骨粗鬆症予防及び／又は治療効果に優れる。
The semaphorin 3A expression promoter of the present invention has an excellent effect of promoting semaphorin 3A expression, and the NGF expression inhibitor of the present invention has an excellent effect of inhibiting NGF expression.
The agent for preventing and/or treating atopic dermatitis of the present invention has excellent preventive and/or therapeutic effects for atopic dermatitis.
The agent for preventing and/or treating xeroderma of the present invention has excellent effects for preventing and/or treating xeroderma.
The agent for preventing and/or treating allergic rhinitis of the present invention has excellent effects for preventing and/or treating allergic rhinitis.
The agent for preventing and/or treating osteoporosis of the present invention has excellent effects for preventing and/or treating osteoporosis.
本発明のセマフォリン３Ａ発現促進剤、ＮＧＦ発現抑制剤、アトピー性皮膚炎予防及び／又は治療剤、乾皮症予防及び／又は治療剤、アレルギー性鼻炎予防及び／又は治療剤、並びに骨粗鬆症予防及び／又は治療剤は、下記式（１）で表される化合物を有効成分とする。
まず、化合物（１）について詳細に説明する。
The semaphorin 3A expression promoter, NGF expression inhibitor, preventive and/or therapeutic agent for atopic dermatitis, preventive and/or therapeutic agent for xerosis, preventive and/or therapeutic agent for allergic rhinitis, and preventive and/or therapeutic agent for osteoporosis of the present invention contain, as an active ingredient, a compound represented by the following formula (1):
First, the compound (1) will be described in detail.
〔式（１）中、
Ｒ1は、炭素数６～１４の芳香族炭化水素基又は炭素数１～１２の脂肪族炭化水素基を示し、
Ｒ2は、水素原子又は脂肪族炭化水素基を示し、
Ｘは、単結合、酸素原子又は硫黄原子を示す。〕
[In formula (1),
R 1 represents an aromatic hydrocarbon group having 6 to 14 carbon atoms or an aliphatic hydrocarbon group having 1 to 12 carbon atoms;
R2 represents a hydrogen atom or an aliphatic hydrocarbon group;
X represents a single bond, an oxygen atom, or a sulfur atom.
化合物（１）としては、下記式（１Ｂ）で表される化合物が好ましい。 The compound (1) is preferably a compound represented by the following formula (1B):
〔式（１Ｂ）中、Ｒ1、Ｒ2及びＸは、前記と同義である。〕 [In formula (1B), R 1 , R 2 and X are as defined above.]
式（１）及び（１Ｂ）中、Ｘは、単結合、酸素原子又は硫黄原子を示すが、セマフォリン３Ａ発現促進効果、ＮＧＦ発現抑制効果、アトピー性皮膚炎予防及び／又は治療効果、乾皮症予防及び／又は治療効果、アレルギー性鼻炎予防及び／又は治療効果、骨粗鬆症予防及び／又は治療効果並びに低毒性の観点から、単結合又は硫黄原子が好ましく、単結合が特に好ましい。 In formulas (1) and (1B), X represents a single bond, an oxygen atom, or a sulfur atom. From the viewpoints of the semaphorin 3A expression-promoting effect, NGF expression-suppressing effect, atopic dermatitis preventive and/or therapeutic effect, xeroderma preventive and/or therapeutic effect, allergic rhinitis preventive and/or therapeutic effect, and osteoporosis preventive and/or therapeutic effect, as well as low toxicity, a single bond or a sulfur atom is preferred, and a single bond is particularly preferred.
Ｒ1で示される芳香族炭化水素基の炭素数は６～１４であるが、好ましくは６～１２であり、より好ましくは６～８である。また、芳香族炭化水素基としては、具体的には、フェニル基、トリル基、キシリル基、ナフチル基等のアリール基が挙げられる。これらの中では、セマフォリン３Ａ発現促進効果、ＮＧＦ発現抑制効果、アトピー性皮膚炎予防及び／又は治療効果、乾皮症予防及び／又は治療効果、アレルギー性鼻炎予防及び／又は治療効果、骨粗鬆症予防及び／又は治療効果並びに低毒性の観点から、フェニル基が好ましい。 The aromatic hydrocarbon group represented by R1 has 6 to 14 carbon atoms, preferably 6 to 12 carbon atoms, and more preferably 6 to 8 carbon atoms. Specific examples of the aromatic hydrocarbon group include aryl groups such as phenyl, tolyl, xylyl, and naphthyl groups. Of these, a phenyl group is preferred from the viewpoints of the semaphorin 3A expression-promoting effect, NGF expression-suppressing effect, atopic dermatitis preventive and/or therapeutic effect, xeroderma preventive and/or therapeutic effect, allergic rhinitis preventive and/or therapeutic effect, and osteoporosis preventive and/or therapeutic effect, as well as low toxicity.
Ｒ1で示される脂肪族炭化水素基の炭素数は１～１２であるが、セマフォリン３Ａ発現促進効果、ＮＧＦ発現抑制効果、アトピー性皮膚炎予防及び／又は治療効果、乾皮症予防及び／又は治療効果、アレルギー性鼻炎予防及び／又は治療効果、骨粗鬆症予防及び／又は治療効果並びに低毒性の観点から、好ましくは１～１０であり、より好ましくは２～６であり、特に好ましくは３～４である。
また、Ｒ2は、水素原子又は脂肪族炭化水素基を示すが、好ましくは脂肪族炭化水素基である。Ｒ2で示される脂肪族炭化水素基の炭素数は、セマフォリン３Ａ発現促進効果、ＮＧＦ発現抑制効果、アトピー性皮膚炎予防及び／又は治療効果、乾皮症予防及び／又は治療効果、アレルギー性鼻炎予防及び／又は治療効果、骨粗鬆症予防及び／又は治療効果並びに低毒性の観点から、好ましくは１～１０であり、より好ましくは１～６であり、更に好ましくは１～４であり、特に好ましくは１～２である。
Ｒ1、Ｒ2で示される脂肪族炭化水素基は直鎖状でも分岐状でもよい。また、脂肪族炭化水素基としては、アルキル基が好ましい。アルキル基としては、メチル基、エチル基、ｎ－プロピル基、イソプロピル基、ｎ－ブチル基、イソブチル基、ｓｅｃ－ブチル基、ｔｅｒｔ－ブチル基、ペンチル基、ヘキシル基、ヘプチル基、オクチル基、ノニル基、デシル基、ドデシル基等が挙げられる。
Ｒ1で示されるアルキル基の中では、セマフォリン３Ａ発現促進効果、ＮＧＦ発現抑制効果、アトピー性皮膚炎予防及び／又は治療効果、乾皮症予防及び／又は治療効果、アレルギー性鼻炎予防及び／又は治療効果、骨粗鬆症予防及び／又は治療効果並びに低毒性の観点から、ｎ－プロピル基、イソプロピル基、ｎ－ブチル基、イソブチル基、ｓｅｃ－ブチル基、ｔｅｒｔ－ブチル基が好ましい。また、Ｒ2で示されるアルキル基の中では、セマフォリン３Ａ発現促進効果、ＮＧＦ発現抑制効果、アトピー性皮膚炎予防及び／又は治療効果、乾皮症予防及び／又は治療効果、アレルギー性鼻炎予防及び／又は治療効果、骨粗鬆症予防及び／又は治療効果並びに低毒性の観点から、メチル基、エチル基が好ましい。
The aliphatic hydrocarbon group represented by R1 has 1 to 12 carbon atoms. From the viewpoints of the semaphorin 3A expression-promoting effect, NGF expression-suppressing effect, atopic dermatitis preventive and/or therapeutic effect, xeroderma preventive and/or therapeutic effect, allergic rhinitis preventive and/or therapeutic effect, and osteoporosis preventive and/or therapeutic effect, as well as low toxicity, the carbon number of the aliphatic hydrocarbon group represented by R1 is preferably 1 to 10, more preferably 2 to 6, and particularly preferably 3 to 4.
R2 represents a hydrogen atom or an aliphatic hydrocarbon group, preferably an aliphatic hydrocarbon group. The number of carbon atoms in the aliphatic hydrocarbon group represented by R2 is preferably 1 to 10, more preferably 1 to 6, even more preferably 1 to 4, and particularly preferably 1 to 2, from the viewpoints of the semaphorin 3A expression-promoting effect, NGF expression-suppressing effect, atopic dermatitis preventive and/or therapeutic effect, xeroderma preventive and/or therapeutic effect, allergic rhinitis preventive and/or therapeutic effect, and osteoporosis preventive and/or therapeutic effect, as well as low toxicity.
The aliphatic hydrocarbon groups represented by R1 and R2 may be linear or branched. Furthermore, alkyl groups are preferred as the aliphatic hydrocarbon groups. Examples of alkyl groups include methyl, ethyl, n-propyl, isopropyl, n-butyl, isobutyl, sec-butyl, tert-butyl, pentyl, hexyl, heptyl, octyl, nonyl, decyl, and dodecyl groups.
Among the alkyl groups represented by R 1 , n-propyl, isopropyl, n-butyl, isobutyl, sec-butyl, and tert-butyl are preferred from the viewpoints of the semaphorin 3A expression-promoting effect, NGF expression-suppressing effect, atopic dermatitis preventive and/or therapeutic effect, xeroderma preventive and/or therapeutic effect, allergic rhinitis preventive and/or therapeutic effect, and osteoporosis preventive and/or therapeutic effect, as well as low toxicity. Furthermore, among the alkyl groups represented by R 2 , methyl and ethyl are preferred from the viewpoints of the semaphorin 3A expression-promoting effect, NGF expression-suppressing effect, atopic dermatitis preventive and/or therapeutic effect, xeroderma preventive and/or therapeutic effect, allergic rhinitis preventive and/or therapeutic effect, and osteoporosis preventive and/or therapeutic effect, as well as low toxicity.
Ｒ1で示される芳香族炭化水素基は、置換芳香族炭化水素基でも非置換芳香族炭化水素基でもよく、Ｒ1、Ｒ2で示される脂肪族炭化水素基は、置換脂肪族炭化水素基でも非置換脂肪族炭化水素基でもよい。
Ｒ1、Ｒ2における置換基としては、例えば、フッ素原子、塩素原子、臭素原子、ヨウ素原子等のハロゲン原子が挙げられる。
The aromatic hydrocarbon group represented by R1 may be a substituted or unsubstituted aromatic hydrocarbon group, and the aliphatic hydrocarbon groups represented by R1 and R2 may be a substituted or unsubstituted aliphatic hydrocarbon group.
Examples of the substituent in R 1 and R 2 include halogen atoms such as a fluorine atom, a chlorine atom, a bromine atom, and an iodine atom.
化合物（１）としては、セマフォリン３Ａ発現促進効果、ＮＧＦ発現抑制効果、アトピー性皮膚炎予防及び／又は治療効果、乾皮症予防及び／又は治療効果、アレルギー性鼻炎予防及び／又は治療効果、骨粗鬆症予防及び／又は治療効果並びに低毒性の観点から、パーベンダゾール、フェンベンダゾール及びアルベンダゾールから選ばれる１種又は２種以上が好ましく、パーベンダゾールが特に好ましい。
化合物（１）は市販品を用いても常法に従って合成して得たものを用いてもよい。
As compound (1), from the viewpoints of the semaphorin 3A expression-promoting effect, the NGF expression-suppressing effect, the preventive and/or therapeutic effect on atopic dermatitis, the preventive and/or therapeutic effect on xeroderma, the preventive and/or therapeutic effect on allergic rhinitis, and the preventive and/or therapeutic effect on osteoporosis, as well as low toxicity, one or more compounds selected from perbendazole, fenbendazole, and albendazole are preferred, and perbendazole is particularly preferred.
Compound (1) may be a commercially available product or may be synthesized according to a conventional method.
そして、後記実施例に示すように、化合物（１）は、セマフォリン３Ａ発現促進効果、ＮＧＦ発現抑制効果、アトピー性皮膚炎予防及び／又は治療効果、乾皮症予防及び／又は治療効果、アレルギー性鼻炎予防及び／又は治療効果、骨粗鬆症予防及び／又は治療効果に優れる。また、細胞毒性が低い。
したがって、化合物（１）は、細胞のセマフォリン３Ａの発現を促進することができ、また、細胞のＮＧＦの発現を抑制することができるところ、セマフォリン３Ａ発現促進剤、ＮＧＦ発現抑制剤、アトピー性皮膚炎予防及び／又は治療剤、乾皮症予防及び／又は治療剤、アレルギー性鼻炎予防及び／又は治療剤、骨粗鬆症予防及び／又は治療剤として有用である。
ここで、本明細書において「セマフォリン３Ａ発現促進」とは、細胞のセマフォリン３Ａの発現を促進することをいい、また、本明細書において「ＮＧＦ発現抑制」とは、細胞のＮＧＦの発現を抑制することをいう。上記細胞としては、好ましくは皮膚細胞であり、表皮角化細胞、線維芽細胞、及びメラノサイトから選ばれる１種又は２種以上が挙げられる。
また、本明細書において「アトピー性皮膚炎予防及び／又は治療」とは、アトピー性皮膚炎を予防及び／又は治療することをいい、具体的には、アトピー性皮膚炎の炎症やかゆみを抑制することをいう。
また、本明細書において「乾皮症予防及び／又は治療」とは、乾皮症を予防及び／又は治療することをいい、具体的には、乾皮症の炎症やかゆみを抑制することをいう。
また、本明細書において「アレルギー性鼻炎予防及び／又は治療」とは、アレルギー性鼻炎を予防及び／又は治療することをいい、具体的には、鼻みず、鼻づまり、くしゃみ等の鼻のアレルギー症状を緩和することをいう。
また、本明細書において「骨粗鬆症予防及び／又は治療」とは、骨粗鬆症を予防及び／又は治療することをいう。
As will be shown in the Examples below, compound (1) has excellent effects of promoting semaphorin 3A expression, suppressing NGF expression, and preventing and/or treating atopic dermatitis, xeroderma, allergic rhinitis, and osteoporosis, and also has low cytotoxicity.
Therefore, compound (1) can promote the expression of semaphorin 3A in cells and suppress the expression of NGF in cells, and is useful as a semaphorin 3A expression promoter, an NGF expression suppressor, a preventive and/or therapeutic agent for atopic dermatitis, a preventive and/or therapeutic agent for xerosis, a preventive and/or therapeutic agent for allergic rhinitis, and a preventive and/or therapeutic agent for osteoporosis.
Here, as used herein, "promoting semaphorin 3A expression" refers to promoting the expression of semaphorin 3A in cells, and "suppressing NGF expression" refers to suppressing the expression of NGF in cells. The cells are preferably skin cells, and examples include one or more types selected from epidermal keratinocytes, fibroblasts, and melanocytes.
Furthermore, in this specification, "prevention and/or treatment of atopic dermatitis" refers to preventing and/or treating atopic dermatitis, and specifically refers to suppressing inflammation and itching caused by atopic dermatitis.
In addition, in this specification, "prevention and/or treatment of xeroderma" refers to preventing and/or treating xeroderma, and specifically refers to suppressing inflammation and itching caused by xeroderma.
In addition, in this specification, "prevention and/or treatment of allergic rhinitis" means preventing and/or treating allergic rhinitis, and specifically means alleviating nasal allergic symptoms such as runny nose, nasal congestion, and sneezing.
In addition, in this specification, the term "prevention and/or treatment of osteoporosis" refers to the prevention and/or treatment of osteoporosis.
また、化合物（１）は、セマフォリン３Ａ発現促進剤、ＮＧＦ発現抑制剤、アトピー性皮膚炎予防及び／又は治療剤、乾皮症予防及び／又は治療剤、アレルギー性鼻炎予防及び／又は治療剤、骨粗鬆症予防及び／又は治療剤となり得、セマフォリン３Ａ発現促進、ＮＧＦ発現抑制、アトピー性皮膚炎予防及び／又は治療、乾皮症予防及び／又は治療、アレルギー性鼻炎予防及び／又は治療、骨粗鬆症予防及び／又は治療のために使用することができ、また、セマフォリン３Ａ発現促進剤、ＮＧＦ発現抑制剤、アトピー性皮膚炎予防及び／又は治療剤、乾皮症予防及び／又は治療剤、アレルギー性鼻炎予防及び／又は治療剤、骨粗鬆症予防及び／又は治療剤を製造するために使用できる。
ここで、上記「使用」は、ヒト若しくは非ヒト動物への投与又は摂取であり得、また治療的使用であっても非治療的使用であってもよい。なお、「非治療的」とは、医療行為を含まない概念、すなわち人間を手術、治療又は診断する方法を含まない概念、より具体的には、医師又は医師の指示を受けた者が人間に対して手術、治療又は診断を実施する方法を含まない概念である。
Furthermore, compound (1) can serve as a semaphorin 3A expression promoter, an NGF expression inhibitor, a preventive and/or therapeutic agent for atopic dermatitis, a preventive and/or therapeutic agent for xeroderma, a preventive and/or therapeutic agent for allergic rhinitis, or a preventive and/or therapeutic agent for osteoporosis, and can be used for promoting semaphorin 3A expression, suppressing NGF expression, preventing and/or treating atopic dermatitis, a preventive and/or therapeutic agent for xeroderma, a preventive and/or therapeutic agent for allergic rhinitis, or a preventive and/or therapeutic agent for osteoporosis. Furthermore, compound (1) can be used for producing a semaphorin 3A expression promoter, an NGF expression inhibitor, a preventive and/or therapeutic agent for atopic dermatitis, a preventive and/or therapeutic agent for xeroderma, a preventive and/or therapeutic agent for allergic rhinitis, or a preventive and/or therapeutic agent for osteoporosis.
Here, the above-mentioned "use" may be administration or ingestion to a human or a non-human animal, and may be therapeutic or non-therapeutic use. Note that "non-therapeutic" is a concept that does not include medical procedures, i.e., a concept that does not include methods of surgery, therapy, or diagnosis on humans, more specifically, a concept that does not include methods of surgery, therapy, or diagnosis on humans by a physician or a person under the direction of a physician.
本発明のセマフォリン３Ａ発現促進剤、ＮＧＦ発現抑制剤、アトピー性皮膚炎予防及び／又は治療剤、乾皮症予防及び／又は治療剤、アレルギー性鼻炎予防及び／又は治療剤、骨粗鬆症予防及び／又は治療剤は、セマフォリン３Ａ発現促進やＮＧＦ発現抑制、アトピー性皮膚炎予防及び／又は治療、乾皮症予防及び／又は治療、アレルギー性鼻炎予防及び／又は治療、骨粗鬆症予防及び／又は治療に有効な医薬品、医薬部外品、化粧品若しくは食品として、又は医薬品、医薬部外品、化粧品若しくは食品に配合する素材として使用可能である。
なお、食品は、セマフォリン３Ａ発現促進やＮＧＦ発現抑制、アトピー性皮膚炎予防及び／又は治療、乾皮症予防及び／又は治療、アレルギー性鼻炎予防及び／又は治療、骨粗鬆症予防及び／又は治療をコンセプトとし、必要に応じてその旨を表示した保健機能食品（例えば機能性表示食品、特定保健用食品、栄養機能食品等）とすることが可能である。
The semaphorin 3A expression promoter, NGF expression inhibitor, agent for preventing and/or treating atopic dermatitis, agent for preventing and/or treating xeroderma, agent for preventing and/or treating allergic rhinitis, and agent for preventing and/or treating osteoporosis of the present invention can be used as a pharmaceutical, quasi-drug, cosmetic, or food that is effective for promoting semaphorin 3A expression, suppressing NGF expression, preventing and/or treating atopic dermatitis, preventing and/or treating xeroderma, preventing and/or treating allergic rhinitis, and preventing and/or treating osteoporosis, or as an ingredient to be incorporated into a pharmaceutical, quasi-drug, cosmetic, or food.
The food may be a health food (e.g., a functional food, a food for specified health uses, a food with nutritional functions, etc.) that is based on the concept of promoting semaphorin 3A expression, suppressing NGF expression, preventing and/or treating atopic dermatitis, preventing and/or treating xerosis, preventing and/or treating allergic rhinitis, and/or treating osteoporosis, and is labeled as such if necessary.
本発明のセマフォリン３Ａ発現促進剤、ＮＧＦ発現抑制剤、アトピー性皮膚炎予防及び／又は治療剤、乾皮症予防及び／又は治療剤、アレルギー性鼻炎予防及び／又は治療剤、骨粗鬆症予防及び／又は治療剤の適用手段は、経口、注射、皮膚外用等のいずれでもよいが、皮膚外用又は注射が好ましく、皮膚外用がより好ましい。なお、このような皮膚を適用部位とする形態としては、例えば、皮膚外用剤、入浴剤、注射用製剤が挙げられる。なお、「皮膚」は、顔や身体、手足の皮膚、及び頭皮を包含する概念である。 The semaphorin 3A expression promoter, NGF expression inhibitor, atopic dermatitis preventive and/or therapeutic agent, xeroderma preventive and/or therapeutic agent, allergic rhinitis preventive and/or therapeutic agent, and osteoporosis preventive and/or therapeutic agent of the present invention may be administered orally, by injection, or topically on the skin, with topical application or injection being preferred, and topical application being more preferred. Examples of forms in which the skin is used as the application site include topical skin preparations, bath additives, and injectable preparations. The term "skin" encompasses the skin of the face, body, hands, feet, and scalp.
本発明のセマフォリン３Ａ発現促進剤、ＮＧＦ発現抑制剤、アトピー性皮膚炎予防及び／又は治療剤、乾皮症予防及び／又は治療剤、アレルギー性鼻炎予防及び／又は治療剤、骨粗鬆症予防及び／又は治療剤を経口投与する場合、その剤形としては、錠剤、顆粒剤、細粒剤、散剤、丸剤、カプセル剤、ドライシロップ剤等の固形製剤；半固形製剤；懸濁剤、シロップ剤等の液状製剤等が挙げられる。医薬品、医薬部外品、食品のいずれの場合においても、これらの剤形にしてよい。また、経口投与用組成物とする場合には、上記の有効成分に加えて、賦形剤、崩壊剤、結合剤、滑沢剤等の添加剤を含有せしめることができる。
また、上記食品の具体的な形態としては、錠剤等の上記剤形の保健機能食品やサプリメントの他、ウエハース、ビスケット、ガム等の各種食品が挙げられる。
When the semaphorin 3A expression promoter, NGF expression inhibitor, atopic dermatitis preventive and/or therapeutic agent, xeroderma preventive and/or therapeutic agent, allergic rhinitis preventive and/or therapeutic agent, and osteoporosis preventive and/or therapeutic agent of the present invention are orally administered, their dosage forms include solid preparations such as tablets, granules, fine granules, powders, pills, capsules, and dry syrups; semi-solid preparations; and liquid preparations such as suspensions and syrups. These dosage forms may be used in any of the cases of pharmaceuticals, quasi-drugs, and foods. Furthermore, when preparing a composition for oral administration, additives such as excipients, disintegrants, binders, and lubricants may be contained in addition to the active ingredients.
Specific examples of the food include health functional foods and supplements in the dosage form of tablets, etc., as well as various foods such as wafers, biscuits, and gum.
本発明のセマフォリン３Ａ発現促進剤、ＮＧＦ発現抑制剤、アトピー性皮膚炎予防及び／又は治療剤、乾皮症予防及び／又は治療剤、アレルギー性鼻炎予防及び／又は治療剤、骨粗鬆症予防及び／又は治療剤を経皮用（皮膚外用剤）とする場合、その剤形としては、軟膏剤、クリーム剤、乳液、ゲル剤、ペースト剤、ローション、スプレー剤、貼付剤等が挙げられる。また、皮膚外用剤は、例えば、化粧水、美容液、パック、乳液、クリーム、サンスクリーン、サンオイル等の形態にしてもよい。
皮膚を適用部位とする形態とする場合には、上記の有効成分に加えて、通常の外用剤や入浴剤において基材や添加剤として用いられる各種成分を含有せしめることができる。
When the semaphorin 3A expression promoter, NGF expression inhibitor, atopic dermatitis preventive and/or therapeutic agent, xeroderma preventive and/or therapeutic agent, allergic rhinitis preventive and/or therapeutic agent, or osteoporosis preventive and/or therapeutic agent of the present invention is used transdermally (as an external skin preparation), its dosage form may be an ointment, cream, emulsion, gel, paste, lotion, spray, patch, etc. Furthermore, the external skin preparation may be in the form of, for example, a lotion, serum, pack, emulsion, cream, sunscreen, sun oil, etc.
When the application site is the skin, various ingredients used as base materials or additives in ordinary external preparations or bath additives can be contained in addition to the above-mentioned active ingredients.
化合物（１）の含有量としては、本発明のセマフォリン３Ａ発現促進剤、ＮＧＦ発現抑制剤、アトピー性皮膚炎予防及び／又は治療剤、乾皮症予防及び／又は治療剤、アレルギー性鼻炎予防及び／又は治療剤、骨粗鬆症予防及び／又は治療剤中、０．００１質量％以上８０質量％以下が好ましく、本発明のセマフォリン３Ａ発現促進剤、ＮＧＦ発現抑制剤、アトピー性皮膚炎予防及び／又は治療剤、乾皮症予防及び／又は治療剤、アレルギー性鼻炎予防及び／又は治療剤、骨粗鬆症予防及び／又は治療剤が医薬品である場合は、０．０１質量％以上４０質量％以下がより好ましい。一方、本発明のセマフォリン３Ａ発現促進剤、ＮＧＦ発現抑制剤、アトピー性皮膚炎予防及び／又は治療剤、乾皮症予防及び／又は治療剤、アレルギー性鼻炎予防及び／又は治療剤、骨粗鬆症予防及び／又は治療剤が、医薬部外品、化粧品又は食品である場合、化合物（１）の含有量としては、医薬部外品、化粧品又は食品中に０．００１質量％以上１０質量％以下がより好ましい。 The content of compound (1) in the semaphorin 3A expression promoter, NGF expression inhibitor, atopic dermatitis preventive and/or therapeutic agent, xeroderma preventive and/or therapeutic agent, allergic rhinitis preventive and/or therapeutic agent, and osteoporosis preventive and/or therapeutic agent of the present invention is preferably 0.001% by mass or more and 80% by mass or less, and when the semaphorin 3A expression promoter, NGF expression inhibitor, atopic dermatitis preventive and/or therapeutic agent, xeroderma preventive and/or therapeutic agent, allergic rhinitis preventive and/or therapeutic agent, and osteoporosis preventive and/or therapeutic agent of the present invention is a pharmaceutical product, the content is more preferably 0.01% by mass or more and 40% by mass or less. On the other hand, when the semaphorin 3A expression promoter, NGF expression inhibitor, atopic dermatitis preventive and/or therapeutic agent, xeroderma preventive and/or therapeutic agent, allergic rhinitis preventive and/or therapeutic agent, or osteoporosis preventive and/or therapeutic agent of the present invention is a quasi-drug, cosmetic, or food product, the content of compound (1) in the quasi-drug, cosmetic, or food product is more preferably 0.001% by mass or more and 10% by mass or less.
本発明のセマフォリン３Ａ発現促進剤、ＮＧＦ発現抑制剤、アトピー性皮膚炎予防及び／又は治療剤、乾皮症予防及び／又は治療剤、アレルギー性鼻炎予防及び／又は治療剤、骨粗鬆症予防及び／又は治療剤は、化合物（１）として、成人一日あたり、０．００１～５ｍｇを摂取又は塗布することが好ましい。 The semaphorin 3A expression promoter, NGF expression inhibitor, atopic dermatitis preventive and/or therapeutic agent, xeroderma preventive and/or therapeutic agent, allergic rhinitis preventive and/or therapeutic agent, and osteoporosis preventive and/or therapeutic agent of the present invention are preferably administered by ingestion or application of 0.001 to 5 mg of compound (1) per day to an adult.
以下、実施例を挙げて本発明を詳細に説明するが、本発明はこれら実施例に限定されるものではない。 The present invention will be described in detail below using examples, but the present invention is not limited to these examples.
〔試験例〕
（１） 材料と試薬
Ｔ－５２２４はＡｄｏｏＱ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社の製品を使用した。ｃ－Ｊｕｎ、ｃ－Ｆｏｓ、Ｃｏｎｔｒｏｌ ｓｉＲＮＡは、Ｈｏｒｉｚｏｎ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ社から購入したものを用いた。ベンズイミダゾール系駆虫薬のパーベンダゾール、フェンベンダゾール、アルベンダゾールは、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ社の製品を購入し、いずれもジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）に溶解後、実験に用いた。
[Test example]
(1) Materials and Reagents T-5224 was a product of AdooQ Bioscience. c-Jun, c-Fos, and Control siRNA were purchased from Horizon Discovery. The benzimidazole anthelmintics perbendazole, fenbendazole, and albendazole were purchased from Sigma-Aldrich and were dissolved in dimethyl sulfoxide (DMSO) before use.
（２） ＮＨＥＫｓの培養
正常ヒト表皮角化細胞（ＮＨＥＫ）は、Ｌｏｎｚａ社のプロトコールに従い培養した。ＮＨＥＫｓを６ウェル組織培養用プレート内で培養し、細胞密度が５０～８０％の増殖期の細胞にパーベンダゾール（０．０１μＭ、０．１μＭ、１μＭ、１０μＭ）、フェンベンダゾール（１μＭ、１０μＭ）またはアルベンダゾール（１μＭ、１０μＭ）を添加した。駆虫薬添加から４８時間後に細胞の培養上清を回収し、ＥＬＩＳＡによりＳｅｍａ３Ａタンパク質発現量の解析を行った。また、全ＲＮＡを抽出し、定量リアルタイムＰＣＲによりｍＲＮＡの発現解析を行った。
(2) Culture of NHEKs Normal human epidermal keratinocytes (NHEKs) were cultured according to Lonza's protocol. NHEKs were cultured in 6-well tissue culture plates, and perbendazole (0.01 μM, 0.1 μM, 1 μM, 10 μM), fenbendazole (1 μM, 10 μM), or albendazole (1 μM, 10 μM) was added to the proliferating cells at a cell density of 50-80%. Forty-eight hours after addition of the anthelmintic, the cell culture supernatant was collected and analyzed for Sema3A protein expression levels by ELISA. Total RNA was also extracted, and mRNA expression was analyzed by quantitative real-time PCR.
（３） ｓｉＲＮＡによるノックダウン解析
転写因子ＡＰ－１の構成成分であるｃ－Ｊｕｎとｃ－ＦｏｓがパーベンダゾールによるＳｅｍａ３Ａの発現促進作用に関与していることを証明するために、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）を使用して、ｃ－Ｊｕｎとｃ－Ｆｏｓの発現を抑制後、細胞をパーベンダゾールで刺激し、Ｓｅｍａ３ＡのｍＲＮＡ発現量を解析した。
ＮＨＥＫｓにｃ－Ｊｕｎ及びｃ－Ｆｏｓに対するｓｉＲＮＡまたはＣｏｎｔｒｏｌ ｓｉＲＮＡ（終濃度４０ｎＭ）をそれぞれＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ＲＮＡｉ ＭＡＸ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて、トランスフェクションした。細胞は抗菌剤を含まない培地で培養し、４８時間後に１μＭパーベンダゾールを添加した培地に交換し、細胞を刺激した。更に２４時間後に細胞から全ＲＮＡを抽出し、定量リアルタイムＰＣＲにより、各転写因子及びＳｅｍａ３ＡのｍＲＮＡの発現解析を行った。使用したｓｉＲＮＡの配列（４種類の異なる配列のｓｉＲＮＡの混合物（配列番号１～１２））を表１に示す。
(3) siRNA knockdown analysis To demonstrate that c-Jun and c-Fos, components of the transcription factor AP-1, are involved in the perbendazole-induced promotion of Sema3A expression, we used small interfering RNA (siRNA) to suppress the expression of c-Jun and c-Fos, then stimulated the cells with perbendazole and analyzed the expression level of Sema3A mRNA.
NHEKs were transfected with siRNA against c-Jun and c-Fos or control siRNA (final concentration 40 nM) using Lipofectamine RNAi MAX (Invitrogen). Cells were cultured in antibiotic-free medium, and after 48 hours, the medium was changed to one containing 1 μM perbendazole to stimulate the cells. After an additional 24 hours, total RNA was extracted from the cells, and the expression of each transcription factor and Sema3A mRNA was analyzed by quantitative real-time PCR. The sequences of the siRNAs used (a mixture of four siRNAs with different sequences (SEQ ID NOS: 1 to 12)) are shown in Table 1.
（４） 阻害剤による解析
転写因子ＡＰ－１がパーベンダゾールによるＳｅｍａ３Ａの発現促進作用に関与していることを証明するために、ＮＨＥＫｓにＡＰ－１阻害剤Ｔ－５２２４（終濃度１０μＭ）を添加して、ＡＰ－１のＤＮＡへの結合を阻害後、細胞を１μＭパーベンダゾールで刺激し、Ｓｅｍａ３Ａの発現量を解析した。
(4) Analysis using inhibitors To demonstrate that the transcription factor AP-1 is involved in the perbendazole-induced promotion of Sema3A expression, the AP-1 inhibitor T-5224 (final concentration 10 μM) was added to NHEKs to inhibit the binding of AP-1 to DNA, and the cells were then stimulated with 1 μM perbendazole, and the expression level of Sema3A was analyzed.
（５） 各遺伝子のｍＲＮＡ発現の解析
各遺伝子の転写レベルを定量リアルタイムＰＣＲにより解析した。ＲＮｅａｓｙ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて、取扱説明書に従って培養細胞から全ＲＮＡを抽出し、ＰｒｉｍｅＳｃｒｉｐｔ ＲＴ ｒｅａｇｅｎｔ ｋｉｔ（Ｔａｋａｒａ）を用いてｃＤＮＡに逆転写した。定量リアルタイムＰＣＲは取扱説明書に従い、ＴＢ Ｇｒｅｅｎ Ｐｒｅｍｉｘ Ｅｘ Ｔａｑ（Ｔａｋａｒａ）を使用して、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ ７９００ＨＴ Ｆａｓｔ Ｒｅａｌ－ｔｉｍｅ ＰＣＲ ｓｙｓｔｅｍ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）により実施した。使用したプライマーに関する情報を表２に示す（配列番号１３～２２）。リボソームタンパク質Ｓ１８（ＲＰＳ１８）を標準遺伝子として使用した。各ｍＲＮＡの量はＲＰＳ１８の量に対して標準化し、最終的に対照（溶媒添加）群のｍＲＮＡに対する比として示した。
(5) Analysis of mRNA Expression of Each Gene The transcription level of each gene was analyzed by quantitative real-time PCR. Total RNA was extracted from cultured cells using the RNeasy Mini Kit (Qiagen) according to the manufacturer's instructions, and reverse-transcribed to cDNA using the PrimeScript RT reagent kit (Takara). Quantitative real-time PCR was performed on an Applied Biosystems 7900HT Fast Real-time PCR system (Applied Biosystems) using TB Green Premix Ex Taq (Takara) according to the manufacturer's instructions. The primers used are listed in Table 2 (SEQ ID NOs: 13-22). Ribosomal protein S18 (RPS18) was used as the standard gene. The amount of each mRNA was normalized to the amount of RPS18, and finally expressed as a ratio to the mRNA of the control (solvent-added) group.
（６） Ｓｅｍａ３Ａタンパク質発現解析
Ｓｅｍａ３Ａタンパク質の発現レベルは、ＥＬＩＳＡにより解析した。培養上清中のＳｅｍａ３Ａ量を取扱説明書に従って、ＥＬＩＳＡ ｋｉｔ ｆｏｒ ｈｕｍａｎ Ｓｅｍａ３Ａ（Ｕｓｃｎ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ）を使用して測定した。
(6) Sema3A Protein Expression Analysis The expression level of Sema3A protein was analyzed by ELISA. The amount of Sema3A in the culture supernatant was measured using an ELISA kit for human Sema3A (Uscn Life Science) according to the manufacturer's instructions.
（７） パーベンダゾール添加後のＮＨＥＫｓの細胞生存率の解析
ＮＨＥＫｓの細胞生存率はＣｅｌｌ－ｃｏｕｎｔｉｎｇ ｋｉｔ－８（同仁化学）により解析した。９６ウェル培養プレート内で細胞を培養し、細胞密度が５０～８０％の増殖期の細胞にパーベンダゾールを添加した。薬剤添加の４８時間後、取扱説明書に従いＣＣＫ－８溶液を各ウェルに添加後、プレートをＣＯ2インキュベーターに３時間静置し、呈色反応を行った。その後、ＡＲＶＯＸ４マルチラベルプレートリーダー（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）で４５０ｎｍの吸光度測定を行った。
(7) Analysis of cell viability of NHEKs after perbendazole addition. The cell viability of NHEKs was analyzed using Cell-counting kit-8 (Dojindo Laboratories). Cells were cultured in a 96-well culture plate, and perbendazole was added to cells in the proliferation phase at a cell density of 50-80%. 48 hours after drug addition, CCK-8 solution was added to each well according to the manufacturer's instructions, and the plate was then placed in a CO2 incubator for 3 hours to allow for a color reaction. Absorbance at 450 nm was then measured using an ARVOX4 multilabel plate reader (Perkin Elmer).
（８） 三次元培養ヒト表皮モデルの培養
三次元培養ヒト表皮モデルＬａｂＣｙｔｅ ＥＰＩ－ＭＯＤＥＬ（Ｊ－ＴＥＣ）は、Ｊ－ＴＥＣ社の取扱説明書に従い、キット付属のアッセイ培地で培養した。
試験の前日、２４ウェル組織培養用プレート内で一晩、前培養した。その翌日、アッセイ培地で希釈したパーベンダゾール（１μＭ，１０μＭ）を表皮モデル角層表面に５０μＬ滴下して細胞を刺激、またはパーベンダゾール（１μＭ，１０μＭ）を含む培地で表皮モデルを培養し基底層側から細胞を刺激した。２４時間培養後、表皮を回収し、バイオマッシャーで細胞を破砕後、ＲＮｅａｓｙ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて全ＲＮＡを抽出し、定量リアルタイムＰＣＲによりｍＲＮＡの発現解析を行った。また、培養カップの外側にＭＴＴ（３－（４，５－ｄｉ－ｍｅｔｈｙｌｔｈｉａｚｏｌ－２－ｙｌ）－２，５－ｄｉｐｈｅｎｙｌｔｅｔｒａｚｏｌｉｕｍ ｂｒｏｍｉｄｅ）試薬（同仁化学）をアッセイ培地で希釈した溶液（終濃度０．５ｍｇ／ｍＬ）を加えて、ＣＯ2インキュベーターで３時間反応後、表皮を回収し、イソプロパノール３００μＬに浸漬して色素を抽出した。室温暗所で一晩静置後、抽出液はＡＲＶＯＸ４マルチラベルプレートリーダー（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）で４５０ｎｍの吸光度測定を行った。
(8) Cultivation of Three-Dimensional Cultured Human Epidermal Model The three-dimensional cultured human epidermal model LabCyte EPI-MODEL (J-TEC) was cultured in the assay medium provided with the kit according to the instruction manual of J-TEC.
The day before the test, the cells were pre-cultured overnight in a 24-well tissue culture plate. The next day, 50 μL of perbendazole (1 μM, 10 μM) diluted in assay medium was dropped onto the surface of the stratum corneum of the epidermal model to stimulate the cells, or the epidermal model was cultured in medium containing perbendazole (1 μM, 10 μM) to stimulate the cells from the basal layer side. After 24 hours of culture, the epidermis was collected and the cells were disrupted with a biomasher. Total RNA was extracted using an RNeasy Mini Kit (Qiagen), and mRNA expression was analyzed by quantitative real-time PCR. Additionally, a solution (final concentration 0.5 mg/mL) of MTT (3-(4,5-di-methylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide) reagent (Dojindo Chemical Industries) diluted with assay medium was added to the outside of the culture cup, and after 3 hours of reaction in a CO2 incubator, the epidermis was collected and immersed in 300 μL of isopropanol to extract the pigment. After standing overnight in a dark place at room temperature, the extract was subjected to absorbance measurement at 450 nm using an ARVOX4 multilabel plate reader (Perkin Elmer).
（９） 統計処理
統計処理ソフトＧｒａｐｈ Ｐａｄ Ｐｒｉｓｍ ９（Ｇｒａｐｈ Ｐａｄ Ｓｏｆｔｗａｒｅ）を用いて、Ｄｕｎｎｅｔｔ検定、Ｔｕｋｅｙ検定またはＳｔｕｄｅｎｔのｔ検定により有意差を求めた。*Ｐ ＜ ０．０５を統計学的に有意差ありとした。
(9) Statistical Processing Using the statistical processing software Graph Pad Prism 9 (Graph Pad Software), significant differences were determined by Dunnett's test, Tukey's test, or Student's t-test. * P < 0.05 was considered to indicate a statistically significant difference.
（試験結果）
図１に、パーベンダゾールを添加したＮＨＥＫｓの培養上清中に分泌されたＳｅｍａ３Ａタンパク質をＥＬＩＳＡで定量した結果を示す（パーベンダゾール無添加（０μＭ）群に対して、***Ｐ ＜ ０．００１、****Ｐ ＜ ０．０００１で有意差あり）。
図１に示すとおり、パーベンダゾールをＮＨＥＫｓに添加することによって、培養上清中へのＳｅｍａ３Ａタンパク質の分泌量が増加した。
(Test results)
Figure 1 shows the results of ELISA quantification of Sema3A protein secreted into the culture supernatant of NHEKs treated with perbendazole (significant difference compared to the group without perbendazole (0 μM) at *** P < 0.001 and **** P < 0.0001).
As shown in Figure 1, the addition of perbendazole to NHEKs increased the amount of Sema3A protein secreted into the culture supernatant.
図２に、パーベンダゾールを添加したＮＨＥＫｓにおけるＳｅｍａ３ＡのｍＲＮＡ発現を定量リアルタイムＰＣＲで解析した結果を示す（パーベンダゾール無添加（０μＭ）群に対して、***Ｐ ＜ ０．００１、****Ｐ ＜ ０．０００１で有意差あり）。
図２に示すとおり、パーベンダゾールをＮＨＥＫｓに添加することによって、Ｓｅｍａ３Ａ ｍＲＮＡ発現量が増加した。
Figure 2 shows the results of quantitative real-time PCR analysis of Sema3A mRNA expression in perbendazole-treated NHEKs (significant differences compared to the perbendazole-free (0 μM) group: *** P < 0.001, **** P < 0.0001).
As shown in Figure 2, the addition of perbendazole to NHEKs increased the expression level of Sema3A mRNA.
図３に、パーベンダゾールを添加したＮＨＥＫｓにおけるＮＧＦのｍＲＮＡ発現を定量リアルタイムＰＣＲで解析した結果を示す（パーベンダゾール無添加（０μＭ）群に対して、****Ｐ ＜ ０．０００１で有意差あり）。
図３に示すとおり、ＮＧＦ ｍＲＮＡの発現はパーベンダゾール添加により減少した。
FIG. 3 shows the results of quantitative real-time PCR analysis of NGF mRNA expression in perbendazole-treated NHEKs (significant difference compared to the perbendazole-free (0 μM) group, **** P<0.0001).
As shown in Figure 3, the expression of NGF mRNA was reduced by the addition of perbendazole.
図４に、パーベンダゾールを添加したＮＨＥＫｓの細胞生存率を、Ｃｅｌｌ－ｃｏｕｎｔｉｎｇ ｋｉｔ－８を用いて解析した結果を示す。
図４に示すとおり、パーベンダゾールは細胞毒性が低いものであった。
FIG. 4 shows the results of analyzing the cell viability of NHEKs to which perbendazole had been added using Cell-counting kit-8.
As shown in Figure 4, perbendazole had low cytotoxicity.
図５－１に、フェンベンダゾールを添加したＮＨＥＫｓにおけるＳｅｍａ３ＡのｍＲＮＡ発現を定量リアルタイムＰＣＲで解析した結果を示す（フェンベンダゾール無添加（０μＭ）群に対して、****Ｐ ＜ ０．０００１で有意差あり）。
図５－１に示すとおり、フェンベンダゾールも、ＮＨＥＫｓに添加された場合にＳｅｍａ３Ａ ｍＲＮＡ発現を促進した。
図５－２に、アルベンダゾールを添加したＮＨＥＫｓにおけるＳｅｍａ３ＡのｍＲＮＡ発現を定量リアルタイムＰＣＲで解析した結果を示す（アルベンダゾール無添加（０μＭ）群に対して、****Ｐ ＜ ０．０００１で有意差あり）。
図５－２に示すとおり、アルベンダゾールも、ＮＨＥＫｓに添加された場合にＳｅｍａ３Ａ ｍＲＮＡ発現を促進した。
FIG. 5-1 shows the results of quantitative real-time PCR analysis of Sema3A mRNA expression in fenbendazole-treated NHEKs (significant difference compared to the fenbendazole-free (0 μM) group, **** P<0.0001).
As shown in FIG. 5-1, fenbendazole also promoted Sema3A mRNA expression when added to NHEKs.
Figure 5-2 shows the results of quantitative real-time PCR analysis of Sema3A mRNA expression in albendazole-treated NHEKs (significant difference compared to the albendazole-free (0 μM) group, **** P<0.0001).
As shown in FIG. 5-2, albendazole also promoted Sema3A mRNA expression when added to NHEKs.
図６－１に、フェンベンダゾールを添加したＮＨＥＫｓにおけるＮＧＦのｍＲＮＡ発現を定量リアルタイムＰＣＲで解析した結果を示す（フェンベンダゾール無添加（０μＭ）群に対して、****Ｐ ＜ ０．０００１で有意差あり）。
図６－１に示すとおり、フェンベンダゾールを添加したＮＨＥＫｓでも、ＮＧＦ ｍＲＮＡの発現が抑制された。
図６－２に、アルベンダゾールを添加したＮＨＥＫｓにおけるＮＧＦのｍＲＮＡ発現を定量リアルタイムＰＣＲで解析した結果を示す（アルベンダゾール無添加（０μＭ）群に対して、****Ｐ ＜ ０．０００１で有意差あり）。
図６－２に示すとおり、アルベンダゾールを添加したＮＨＥＫｓでも、ＮＧＦ ｍＲＮＡの発現が抑制された。
FIG. 6-1 shows the results of quantitative real-time PCR analysis of NGF mRNA expression in fenbendazole-treated NHEKs (significant difference compared to the fenbendazole-free (0 μM) group, **** P<0.0001).
As shown in FIG. 6-1, NGF mRNA expression was also suppressed in NHEKs treated with fenbendazole.
FIG. 6-2 shows the results of quantitative real-time PCR analysis of NGF mRNA expression in albendazole-treated NHEKs (significant difference compared to the albendazole-free (0 μM) group, **** P<0.0001).
As shown in FIG. 6-2, NGF mRNA expression was also suppressed in NHEKs treated with albendazole.
図７－１に、三次元培養ヒト表皮モデルの角層表面にパーベンダゾールを添加し、角層側から細胞を刺激したときのＳｅｍａ３Ａ ｍＲＮＡ発現をリアルタイムＰＣＲで解析した結果を示す（パーベンダゾール無添加（０μＭ）群に対して、**Ｐ ＜ ０．０１、****Ｐ ＜ ０．０００１で有意差あり）。
図７－１に示すとおり、三次元培養ヒト表皮モデルの角層表面にパーベンダゾール溶液を塗布したところ、Ｓｅｍａ３Ａ ｍＲＮＡ発現が増加した。
図７－２に、三次元培養ヒト表皮モデルの培地にパーベンダゾールを添加し、基底層側から細胞を刺激したときのＳｅｍａ３Ａ ｍＲＮＡ発現をリアルタイムＰＣＲで解析した結果を示す（パーベンダゾール無添加（０μＭ）群に対して、*Ｐ ＜ ０．０５、**Ｐ ＜ ０．０１で有意差あり）。
図７－２に示すとおり、培地で希釈したパーベンダゾール溶液を用いて、基底層側から細胞を刺激したときにも、Ｓｅｍａ３Ａ ｍＲＮＡの発現が増加した。
Figure 7-1 shows the results of real-time PCR analysis of Sema3A mRNA expression when perbendazole was added to the stratum corneum surface of a three-dimensional culture human epidermal model and cells were stimulated from the stratum corneum side (significant difference compared to the group without perbendazole (0 μM) at ** P<0.01 and **** P<0.0001).
As shown in FIG. 7-1, when perbendazole solution was applied to the stratum corneum surface of the three-dimensional cultured human epidermis model, Sema3A mRNA expression increased.
Figure 7-2 shows the results of real-time PCR analysis of Sema3A mRNA expression when perbendazole was added to the culture medium of a three-dimensional cultured human epidermal model and cells were stimulated from the basal layer side (significant difference compared to the group without perbendazole (0 μM) at * P < 0.05 and ** P < 0.01).
As shown in FIG. 7-2, the expression of Sema3A mRNA also increased when the cells were stimulated from the basal layer side with a perbendazole solution diluted in the medium.
図８－１に、三次元培養ヒト表皮モデルの角層表面にパーベンダゾールを添加したときの細胞生存率の解析結果を、図８－２に、三次元培養ヒト表皮モデルの培地にパーベンダゾールを添加し、基底層側から刺激したときの細胞生存率をＭＴＴアッセイで解析した結果を、それぞれ示す。
図８－１、図８－２に示すとおり、三次元培養ヒト表皮モデルの角層側（図８－１）、基底層側（図８－２）からパーベンダゾールで細胞を刺激したとき、細胞生存率の有意な低下は見られなかった。
Figure 8-1 shows the results of an analysis of cell viability when perbendazole was added to the stratum corneum surface of a three-dimensional cultured human epidermal model, and Figure 8-2 shows the results of an MTT assay analysis of cell viability when perbendazole was added to the culture medium of a three-dimensional cultured human epidermal model and stimulation was performed from the basal layer side.
As shown in Figures 8-1 and 8-2, when cells of the three-dimensional cultured human epidermal model were stimulated with perbendazole from the stratum corneum side (Figure 8-1) or the basal layer side (Figure 8-2), no significant decrease in cell viability was observed.
図９に、ＮＨＥＫｓにおける転写因子ｃ－Ｊｕｎとｃ－Ｆｏｓをノックダウン後、パーベンダゾールを添加したときのＳｅｍａ３Ａ ｍＲＮＡ発現をリアルタイムＰＣＲで解析した結果を示す（ｓｉＣｏｎｔｒｏｌのパーベンダゾール無添加（０μＭ）群に対して、****Ｐ ＜ ０．０００１で有意差あり。ｓｉＣｏｎｔｒｏｌの１μＭパーベンダゾール添加群に対して、††††Ｐ ＜ ０．０００１で有意差あり）。
図９に示すとおり、パーベンダゾールによるＳｅｍａ３Ａの発現促進作用は、転写因子ＡＰ－１の構成成分であるｃ－Ｊｕｎとｃ－Ｆｏｓのノックダウンにより、有意に抑制された。
Figure 9 shows the results of real-time PCR analysis of Sema3A mRNA expression in NHEKs when perbendazole was added after knockdown of the transcription factors c-Jun and c-Fos (significant difference compared to the siControl group without perbendazole (0 μM), **** P <0.0001; significant difference compared to the siControl group with 1 μM perbendazole, ††††P < 0.0001).
As shown in FIG. 9, the promoting effect of perbendazole on Sema3A expression was significantly suppressed by knockdown of c-Jun and c-Fos, which are components of the transcription factor AP-1.
図１０に、転写因子ＡＰ－１の阻害剤存在下でＮＨＥＫｓをパーベンダゾールで刺激したときの、Ｓｅｍａ３Ａ ｍＲＮＡ発現をリアルタイムＰＣＲで解析した結果を示す（パーベンダゾール無添加（０μＭ）群に対して、****Ｐ ＜ ０．０００１で有意差あり。１μＭパーベンダゾールを添加したＴ－５２２４無添加（０ μＭ）群に対して、††††Ｐ ＜ ０．０００１で有意差あり）。
図１０に示すとおり、ＡＰ－１阻害剤Ｔ－５２２４で細胞を処理したときも、パーベンダゾール添加によるＳｅｍａ３Ａの発現増加は抑制された。
Figure 10 shows the results of real-time PCR analysis of Sema3A mRNA expression when NHEKs were stimulated with perbendazole in the presence of an inhibitor of the transcription factor AP-1 (significant difference, **** P<0.0001, compared to the group without perbendazole (0 μM) and significant difference, ††††P<0.0001, compared to the group without T-5224 (0 μM) but with 1 μM perbendazole).
As shown in FIG. 10, the increase in Sema3A expression caused by the addition of perbendazole was also suppressed when the cells were treated with the AP-1 inhibitor T-5224.
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