JP7809338B2

JP7809338B2 - アミロイドオリゴマーの画像診断薬

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Publication number: JP7809338B2
Application number: JP2022503749A
Authority: JP
Inventors: 育夫遠山; 弘康田口; 大治郎柳沢; 智子加藤
Original assignee: Shiga University of Medical Science NUC
Current assignee: Shiga University of Medical Science NUC
Priority date: 2020-02-28
Filing date: 2021-02-26
Publication date: 2026-02-02
Anticipated expiration: 2041-02-26
Also published as: JPWO2021172515A1; WO2021172515A1; WO2021172515A9

Description

本発明は、アミロイドβオリゴマーを検出するために用いられる画像診断薬、及びクルクミン誘導体又はその塩に関する。

日本における認知症患者数は500万人を超え、2025年には700万人に達すると推計されており、その解決は緊急且つ重要な問題である。認知症の中でも最も多いのがアルツハイマー病(AD)であり、アルツハイマー病の臨床症状は、記憶障害、高次脳機能障害(失語、失行、失認、構成失行)等である。その症状は他の認知症疾患でも共通して見られることが多く、臨床症状だけでアルツハイマー病と確定診断することは極めて困難である。

また、ADにおいては、根本治療薬の開発がことごとく失敗に終わっている。アルツハイマー病の脳病理は発症の20～30年前から進行しており、発症前の段階で診断して治療する先制医療の重要性が指摘されている。

アルツハイマー病の特徴的な病理組織所見としては、老人斑と神経原線維変化とがある。前者の主構成成分はβシート構造をとったアミロイドβ蛋白であり、後者のそれは過剰リン酸化されたタウ蛋白である。アルツハイマー病においては臨床症状が発症するかなり前から、脳内では凝集したアミロイドβ蛋白の蓄積等の上記病理的組織変化が始まっていることが知られている。したがって、凝集したアミロイドβ蛋白をマーカーとして検出することが、アミロイドが蓄積する疾患、特にアルツハイマー病の早期診断方法の１つとなる。

ADの発症前の初期段階において、重要な役割を果たしているのがアミロイドβペプチド(Aβ)のオリゴマーである。Aβの凝集体は、Aβオリゴマーを経てAβ線維(Aβフィブリル)となる。AD発症後の治療は困難であることから、毒性オリゴマーが蓄積し始める40～50代での正確な診断法の確立と治療法の開発が重要である。

このような観点から、近年、脳内アミロイドβ蛋白に選択的に結合するポジトロン断層撮影法(PET)及びシングルフォトン断層撮影法(SPECT)用の放射性造影剤の研究が進められている。アミロイドに親和性の高い古典的な化合物としては、アルツハイマー病の病理的確定診断に使用されているコンゴーレッド、チオフラビンS及びチオフラビンTがある。その多くは、血液－脳関門を通過しがたく静脈内投与しても殆ど脳内へは移行しない。

また、放射性核種を用いない診断方法の一つとして核磁気共鳴イメージング法(MRI)がある。これまで、本発明者らは、クルクミン誘導体を用いてフッ素核磁気共鳴画像法(フッ素MR画像法)により老人斑の画像化に成功したことを報告している(特許文献１及び２)。その他、特許文献３には、Aβ線維と相互作用し、Aβ線維を検出するために使用することができるクルクミン誘導体が報告されている。

しかしながら、今までAβオリゴマーに特異的に結合する低分子化合物についての報告はなされていない。

国際公開第2010/098502号国際公開第2014/109296号日本国特開2018-138528号公報

本発明の目的は、アミロイドβオリゴマーを検出するために用いられる画像診断薬、及びアミロイドβオリゴマーに特異的に結合する物質を提供することにある。

本発明者らは、これまでクルクミン及びクルクミン誘導体が、Aβ線維のみならず、Aβオリゴマーにも結合することを明らかにしている。

本発明者らは、上記目的を達成すべく鋭意研究を重ねた結果、特許文献１及び２に記載されているようなクルクミン誘導体の化学的なメカニズムを解析し、クルクミンの持つケト・エノール互変異性が重要な役割を果たしていると考え、ケト型構造しか取らないクルクミン誘導体を合成した。その結果、そのようなケト型構造のみを取るクルクミン誘導体が、Aβオリゴマーに特異的に結合することを見出した。

本発明は、これら知見に基づき、更に検討を重ねて完成されたものであり、次のアミロイドβオリゴマーを検出するために用いられる画像診断薬、クルクミン誘導体又はその塩等を提供するものである。

項１．ケト型構造のみが存在するクルクミン誘導体又はその塩を有効成分とする、アミロイドβオリゴマーを検出するために用いられる画像診断薬。
項２．前記クルクミン誘導体が式（Ｉ）：

（式中、R¹はそれぞれ独立に水素原子、フッ素原子、CH₃-、CH₂F-、CHF₂-、CF₃-、CH₃O-、CH₂FO-、CHF₂O-又はCF₃O-であり、R²はそれぞれ独立に水素原子又はフッ素原子であり、Aはアルキル、シアノ、カルボキシ、アルコキシカルボニル又はR³-(CH₂)_m-であり、R³はヒドロキシ、カルボキシ、シアノ、アルキルカルボニルオキシ、アルコキシカルボニル、アルコキシアルコキシ、ヒドロキシアルコキシ又はCONR⁴R⁵であり、R⁴及びR⁵はそれぞれ独立に水素原子又はアルキルであり、mは1～5の整数である）で表されるクルクミン誘導体である、項１に記載の画像診断薬。
項３．前記R¹はそれぞれ独立にフッ素原子、CH₂F-、CHF₂-、CF₃-、CH₂FO-、CHF₂O-又はCF₃O-である、項２に記載の画像診断薬。
項４．アミロイドβ蛋白が蓄積する疾患の診断用である、項１～３のいずれか一項に記載の画像診断薬。
項５．アミロイドβ蛋白が蓄積する疾患がアルツハイマー病である、項４に記載の画像診断薬。
項６．画像診断がMRIである、項１～５のいずれか一項に記載の画像診断薬。
項７．項１～３のいずれか一項に記載の画像診断薬を用いる、アミロイドβオリゴマーの検出方法。
項８．項１～３のいずれか一項に記載の画像診断薬を用いる、アミロイドβ蛋白が蓄積する疾患の診断方法。
項９．式（ＩＡ）：

（式中、R¹はそれぞれ独立に水素原子、フッ素原子、CH₃-、CH₂F-、CHF₂-、CF₃-、CH₃O-、CH₂FO-、CHF₂O-又はCF₃O-であり、R²はそれぞれ独立に水素原子又はフッ素原子であり、Aはアルキル、シアノ、カルボキシ、アルコキシカルボニル又はR³-(CH₂)_m-であり、R³はヒドロキシ、カルボキシ、シアノ、アルキルカルボニルオキシ、アルコキシカルボニル、アルコキシアルコキシ、ヒドロキシアルコキシ又はCONR⁴R⁵であり、R⁴及びR⁵はそれぞれ独立に水素原子又はアルキルであり、mは1～5の整数である（ただし、R¹が共にCH₃O-又はCF₃O-であり、R²が共に水素原子である場合、AはCH₃-であってはならない））で表されるクルクミン誘導体又はその塩。
項１０．前記R¹はそれぞれ独立にフッ素原子、CH₂F-、CHF₂-、CF₃-、CH₂FO-、CHF₂O-又はCF₃O-である、項９に記載のクルクミン誘導体又はその塩。

本発明の画像診断薬は、Aβオリゴマーに対する高い結合特異性を有している化合物を有効成分とするものであり、Aβオリゴマーを検出するために使用することができる。また、本発明のクルクミン誘導体又はその塩は、Aβオリゴマーに対する高い結合特異性を有しており、Aβオリゴマーを検出するために用いられる画像診断薬の有効成分として有用である。

本発明によれば、AβオリゴマーはADの発症前の初期段階において重要な役割を果たしているため、アミロイドβ蛋白が蓄積する疾患について発症前の段階での早期の診断が可能となる。

試験例１で実施した水晶発振子マイクロバランス(QCM)測定装置を用いたAβオリゴマー及びAβ線維との結合性の解析結果を示すグラフである。上段はAβ線維に対する周波数変化を、下段はAβオリゴマーに対する周波数変化を示す。*p<0.05 vs vehicle (20分後、Mann Whitney test)、Aβオリゴマー及びAβ線維 n=5、vehicle n=3 試験例１で実施したQCM装置を用いたAβオリゴマー及びAβ線維との結合性の解析結果を示すグラフである。上段はAβ線維又は溶媒と結合した化合物の総量を、下段はAβオリゴマー又は溶媒と結合した化合物の総量(pmol/ 1 nmol Aβ)を示す。*p<0.05 vs vehicle (Mann Whitney test)、Aβオリゴマー及びAβ線維 n=5、vehicle n=3 試験例２において化合物１をAPP/PS1マウス及び野生型マウスに尾静脈から投与し測定したMRIによる¹⁹F-NMR信号のピーク面積の経時変化を示すグラフである。実線は16か月齢のAPP/PS1マウスを、破線は12か月齢の野生型マウスを用いた結果である。n=3 試験例２において化合物１をAPP/PS1マウス及び野生型マウスに尾静脈から投与し測定したMRIの脳画像である。左は16か月齢のAPP/PS1マウスを、右は12か月齢の野生型マウスを用いた結果である。

以下、本発明の実施の形態について詳細に説明する。

本発明のアミロイドβオリゴマーを検出するために用いられる画像診断薬は、ケト型構造のみが存在するクルクミン誘導体又はその塩を有効成分とすることを特徴とする。

本発明において、アミロイドβ蛋白とは38～43個のアミノ酸からなるタンパク質で、アミロイド前駆体タンパク質からプロテアーゼの作用により産生されるタンパク質を意味し、AβオリゴマーはAβが2～数十個(特に2～30個)集合したものである。

本発明で使用するクルクミン誘導体は、ケト型構造のみをとる化合物であり、ケト型とは以下に示すクルクミン誘導体の中心部分において両方ケトンとなっているものを示し、エノール型とはどちらか一方がエノール化しているものを示す。

本発明のクルクミン誘導体又はその塩は、ADの発症前の初期段階において重要な役割を果たしているAβオリゴマーに対する結合特異性が高いという性質を有する。

本発明のクルクミン誘導体又はその塩としては、クルクミンの構造を有し且つケト型構造のみを取る化合物である限り特に制限されない。本発明のクルクミン誘導体又はその塩が不斉炭素を含む場合は、常法に従い分離した光学異性体、及びラセミ体の両方が本発明の化合物に含まれる。

本発明のクルクミン誘導体は塩であってもよく、そのような塩としては、医薬上許容される塩であればよく、例えば、カリウム塩、ナトリウム塩のようなアルカリ金属塩；カルシウム塩のようなアルカリ土類金属塩；トリエタノールアミン塩、トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン塩のような有機アミン塩などが挙げられる。また、これらの塩の中で結晶水を持つものもある。

本発明の好ましいクルクミン誘導体としては、以下の式（Ｉ）で表されるクルクミン誘導体又はその塩を挙げることができる。
式（Ｉ）：

（式中、R¹はそれぞれ独立に水素原子、フッ素原子、CH₃-、CH₂F-、CHF₂-、CF₃-、CH₃O-、CH₂FO-、CHF₂O-又はCF₃O-であり、R²はそれぞれ独立に水素原子又はフッ素原子であり、Aはアルキル、シアノ、カルボキシ、アルコキシカルボニル又はR³-(CH₂)_m-であり、R³はヒドロキシ、カルボキシ、シアノ、アルキルカルボニルオキシ、アルコキシカルボニル、アルコキシアルコキシ、ヒドロキシアルコキシ又はCONR⁴R⁵であり、R⁴及びR⁵はそれぞれ独立に水素原子又はアルキルであり、mは1～5の整数である。）

また、以下の式（ＩＡ）で表されるクルクミン誘導体又はその塩は、式（Ｉ）で表されるクルクミン誘導体又はその塩に含まれる文献未記載の新規化合物である。
式（ＩＡ）：

（式中、R¹はそれぞれ独立に水素原子、フッ素原子、CH₃-、CH₂F-、CHF₂-、CF₃-、CH₃O-、CH₂FO-、CHF₂O-又はCF₃O-であり、R²はそれぞれ独立に水素原子又はフッ素原子であり、Aはアルキル、シアノ、カルボキシ、アルコキシカルボニル又はR³-(CH₂)_m-であり、R³はヒドロキシ、カルボキシ、シアノ、アルキルカルボニルオキシ、アルコキシカルボニル、アルコキシアルコキシ、ヒドロキシアルコキシ又はCONR⁴R⁵であり、R⁴及びR⁵はそれぞれ独立に水素原子又はアルキルであり、mは1～5、好ましくは1～3の整数である（ただし、R¹が共にCH₃O-又はCF₃O-であり、R²が共に水素原子である場合、AはCH₃-であってはならない））

R¹は、好ましくは、それぞれ独立にフッ素原子、CH₂F-、CHF₂-、CF₃-、CH₂FO-、CHF₂O-又はCF₃O-である。

A、R⁴及びR⁵のアルキルは、直鎖又は分枝鎖状のC_1-6アルキルであればよく、直鎖又は分枝鎖状のC_1-3アルキルが好ましい。当該アルキルの規定は、式（Ｉ）の化合物におけるアルキルカルボニルオキシ、アルコキシカルボニル、アルコキシアルコキシ及びヒドロキシアルコキシのアルキルにも適用される。

C_1-6アルキルの具体例としてはメチル、エチル、ｎ－プロピル、イソプロピル、ｎ－ブチル、イソブチル、tert-ブチル、ｎ－ペンチル、イソペンチル、及びヘキシルが挙げられる。

C_1-3アルキルの具体例としてはメチル、エチル、ｎ－プロピル、及びイソプロピルが挙げられる。

式（Ｉ）又は式（ＩＡ）のクルクミン誘導体又はその塩は、以下に記載の方法により製造することができる。

式（Ｉ）の化合物は、式（ＩＩ）の化合物を加水分解することにより製造することができる。

（式中、R¹, R²及びAは前述の通りである。）

本反応の溶媒としては、メタノール、エタノール、n-プロパノール、iso-プロパノール、ブタノールなどのアルコール類；含水テトラヒドロフラン、含水ジオキサンなどのエーテル類；含水ジメチルホルムアミド、含水ジメチルアセトアミドなどの酸アミド類；含水ジメチルスルホキシドなどのスルホキシド類及びこれらの混合溶媒を挙げることができる。

本反応を促進するために鉱酸を添加することが望ましく、その鉱酸としては塩酸、硫酸、硝酸、過塩素酸などを挙げることができる。鉱酸は、式（ＩＩ）の化合物に対して3～10倍モル、望ましくは4～6倍モル使用することができる。

本反応は、通常0～150℃、望ましくは30～100℃で行うことができ、その反応時間は通常、1～150時間程度である。

（ＩＩ）の化合物は、式（ＩＩＩ）の化合物にヨウ化メチルを反応させることにより製造することができる。

（式中、R¹, R²及びAは前述の通りである。）

本反応の溶媒としては、ベンゼン、トルエン、キシレンなどの芳香族炭化水素類；ペンタン、ヘキサン、石油エーテル、リグロインなどの脂肪族炭化水素類；ジエチルエーテル、ジプロピルエーテル、ジブチルエーテル、テトラヒドロフラン、ジオキサンなどのエーテル類；アセトン、2-ブタノンなどのケトン類；アセトニトリル、プロピオニトリルなどのニトリル類；ジメチルホルムアミド、ジメチルアセトアミドなどの酸アミド類；ジメチルスルホキシドなどのスルホキシド類及びこれらの混合溶媒を挙げることができる。

本反応を促進するためには塩基を添加することが望ましく、その塩基としては、トリエチルアミン、ピリジン、N-メチルモルホリン、1,8-ジアザビシクロ[5,4,0]-7-ウンデセン、N,N-ジメチルアニリンなどの有機塩基；炭酸ナトリウム、炭酸カリウムなどのアルカリ金属の炭酸塩；炭酸水素ナトリウム、炭酸水素カリウムなどのアルカリ金属の炭酸水素塩；水酸化ナトリウム、水酸化カリウムなどのアルカリ金属の水酸化物；水酸化バリウム、水酸化カルシウムなどのアルカリ土類金属の水酸化物などを挙げることができる。塩基は、式（ＩＩＩ）の化合物に対して3～20倍モル、望ましくは5～10倍モル使用することができる。

本反応は通常0～70℃で行うことができ、反応時間は1～48時間程度である。

また、ヨウ化メチルは、式（ＩＩＩ）の化合物に対して2～20倍モル使用するのが望ましい。

式（ＩＩＩ）の化合物は、式（ＩＶ）の化合物と式（Ｖ）の化合物を縮合させることにより製造することができる。ただし、式（ＩＶ）の化合物は式（Ｖ）の化合物に対して2倍モル反応させる必要がある。なお、式（Ｖ）の化合物は、公知の方法により製造できる。

（式中、R¹, R²及びAは前述の通りである。）

反応を効率的に進めるために、溶媒中でホウ素化合物と塩基の存在下で反応を行うのが望ましい。本反応に使用することができるホウ素化合物としては、ホウ酸、三酸化二ホウ素、ホウ酸トリメチル、ホウ酸トリエチル、ホウ酸トリプロピル、ホウ酸トリ-n-ブチル、ホウ酸トリ-tert-ブチル、あるいは三酸化二ホウ素と各種ホウ酸エステルの混合物などを挙げることができる。ホウ酸化合物は、式（ＩＶ）の化合物に対して0.5～6倍モル使用するのが望ましい。

塩基としては、n-ブチルアミン、sec-ブチルアミン、tert-ブチルアミン、n-プロピルアミン、n-ヘキシルアミン、シクロへキシルアミンなどの一級アミン類；モルホリン、ピぺリジン、1,2,3,4-テトラヒドロキノリンなどの二級アミン類などを挙げることができる。塩基は、式（Ｖ）の化合物に対して1倍モル使用するのが望ましい。

また、溶媒としては、ベンゼン、トルエン、キシレンなどの芳香族炭化水素類；ペンタン、ヘキサン、ヘプタン、石油エーテル、リグロインなどの脂肪族炭化水素類；ジエチルエーテル、ジプロピルエーテル、ジブチルエーテル、テトラヒドロフラン、ジオキサンなどのエーテル類；酢酸メチル、酢酸エチル、プロピオン酸メチルなどのエステル類；ジメチルホルムアミド、ジメチルアセトアミドなどの酸アミド類；ジメチルスルホキシドなどのスルホキシド類；ヘキサメチルホスホルトリアミドなどのリン酸アミド類及びこれらの混合溶媒を挙げることができる。

反応温度は、通常0～150℃、望ましくは0～100℃で行うことができ、反応時間は通常0.5～24時間程度である。

また、上記反応では、反応後、生成した式（ＩＩＩ）の化合物のホウ素錯体を分解するために酸で反応液を処理する必要がある。その際使用する酸としては、塩酸、硫酸などの鉱酸あるいは酢酸、プロピオン酸などの有機酸を挙げることができる。

式（ＩＶ）の化合物は、式（ＶＩ）の化合物にクロロジメチルエーテルを反応させることにより製造することができる。なお、式（ＶＩ）の化合物は、公知の方法により製造できる。

（式中、R¹及びR²は前述の通りである。）

溶媒としては、ベンゼン、トルエン、キシレンなどの芳香族炭化水素類；ペンタン、ヘキサン、ヘプタン、石油エーテル、リグロインなどの脂肪族炭化水素類；ジエチルエーテル、ジプロピルエーテル、ジブチルエーテル、テトラヒドロフラン、ジオキサンなどのエーテル類；アセトン、2-ブタノンなどのケトン類；アセトニトリル、プロピオニトリルなどのニトリル類；ジメチルホルムアミド、ジメチルアセトアミドなどの酸アミド類；ジメチルスルホキシドなどのスルホキシド類；ジクロロメタン、四塩化炭素、1,2-ジクロロエタンなどのハロゲン化炭化水素類及びこれらの混合溶媒を挙げることができる。

本反応を促進するためには塩基を添加することが望ましく、その塩基としては、トリエチルアミン、ピリジン、N-メチルモルホリン、N-メチルピぺリジン、1,8-ジアザビシクロ[5,4,0]-7-ウンデセン、N,N-ジメチルアニリンなどの有機塩基；炭酸ナトリウム、炭酸カリウムなどのアルカリ金属の炭酸塩；炭酸水素ナトリウム、炭酸水素カリウムなどのアルカリ金属の炭酸水素塩；水酸化ナトリウム、水酸化カリウムなどのアルカリ金属の水酸化物などを挙げることができる。塩基は、式（ＶＩ）の化合物に対して1～3倍モル、望ましくは1.4～1.8倍モル使用することができる。

本反応は、通常0～50℃で行うことができ、反応時間は通常1～48時間程度である。

上記した製法及びそれに付随した方法で得られる前記式（Ｉ）の化合物は、公知の手段、例えば、濃縮、減圧濃縮、蒸留、分留、転溶、溶媒抽出、結晶化、再結晶、クロマトグラフィーなどにより単離、精製することができる。

前記式（Ｉ）の化合物がフリー体で得られる場合、通常の方法で塩を形成させることができる。

式（Ｉ）の化合物の具体例を以下の表１に示す。

式（Ｉ）のクルクミン誘導体の多くは疎水性の化合物であり、水に対する溶解度は低い。生体に投与する化合物としては水溶解度が高いことが望ましく、式（Ｉ）の化合物の内、塩を持つ化合物がより望ましい。

ケト型構造のみが存在するクルクミン誘導体又はその塩は、Aβオリゴマーを検出するために用いられる画像診断薬として使用することができる。画像診断としては、MRIであることが望ましい。

ケト型構造のみが存在するクルクミン誘導体又はその塩を画像診断薬として使用する場合、当該化合物により脳内のAβオリゴマーを特異的に検出することができる。特に、¹⁹F-MRIを用いて非侵襲的にAβオリゴマーを検出する場合、その検出感度は、フッ素原子の数に依存しているので、式（Ｉ）の化合物の内、フッ素原子をより多く含む化合物がより望ましい。

ケト型構造のみが存在するクルクミン誘導体又はその塩は、ADの発症前の初期段階において重要な役割を果たしているAβオリゴマーに特異的に結合するので、Aβオリゴマーの存在部位を検出することが可能となる。そのため、ケト型構造のみが存在するクルクミン誘導体又はその塩は、アミロイドβ蛋白が蓄積する疾患の画像診断薬として使用することができ、アミロイドβが蓄積する疾患について発症前の段階での早期の診断が可能となる。

ケト型構造のみが存在するクルクミン誘導体又はその塩を画像診断薬として使用する場合、その投与は、局所的であってもよく、全身的であってもよい。投与方法には特に制限はなく、経口的又は非経口的に投与される。非経口的投与経路としては、皮下、腹腔内、静脈、動脈又は脊髄液への注射、点滴等が挙げられる。

ケト型構造のみが存在するクルクミン誘導体又はその塩を含む画像診断薬は、ヒトへの投与に適した医薬上許容される形態であって、生理学的に許容し得る添加剤を含む。かかる組成物は、適宜、医薬として許容し得る希釈剤、緩衝剤、可溶化剤(例えば、シクロデキストリン、ポリエチレングリコール、プルロニック(商標)、Tween (商標)、クレモフォール(商標)又はリン脂質のような界面活性剤)、無痛化剤等を添加してもよく、更に必要に応じて、医薬として許容し得る溶剤、安定化剤又は酸化防止剤(例えばアスコルビン酸等)のような成分を含んでもよい。ケト型構造のみが存在するクルクミン誘導体又はその塩の投与量は、用法、患者の年齢、性別その他の条件、疾患の程度により適宜選択される。

アミロイドβ蛋白が蓄積する疾患としては、アルツハイマー病の他、ダウン症候群が挙げられる。

次に本発明に係わる合成例及び試験例を記載するが、本発明はこれらに限定されるわけではない。

［合成例１］1,7-ビス(4'-ヒドロキシ-3'-トリフルオロメトキシ)フェニル-4-エチル-4-メチル-1,6-ヘプタジエン-3,5-ジオン(化合物１)の合成
（１）4-ヒドロキシ-3-(トリフルオロメトキシ)ベンズアルデヒド(2.06 g;10 mmol)のアセトン(18 mL)溶液に炭酸カリウム(2.21 g;16 mmol)を加えた混合物を氷冷し、ここに攪拌しながらクロロメチルメチルエーテル(1.07 mL;14 mmol)を少量ずつ加えた。反応液を室温で10時間攪拌した後、溶媒を減圧下に溜去して得られる残渣を酢酸エチルで抽出した。抽出液を水洗、続いて飽和炭酸水素ナトリウム水溶液、飽和食塩水で洗浄した後、硫酸マグネシウムで乾燥した。減圧下に溶媒を溜去して得られる残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー(溶離液：酢酸エチル:n-ヘキサン＝1:3)により精製すると、4-メトキシメトキシ-3-(トリフルオロメトキシ)ベンズアルデヒド2.48 g (99%)が無色の油状物として得られた。

（２）3-エチル-2,4-ペンタンジオン(256 mg;2.0 mmol)の酢酸エチル(4.0 mL)溶液に三酸化二ホウ素(140 mg;2.0 mmol)を加え70℃で30分間加熱し、次いでホウ酸トリブチル(1.08 mL;4.0 mmol)と前記工程（１）で得られた4-メトキシメトキシ-3-(トリフルオロメトキシ)ベンズアルデヒド(1.00 g;4.0 mmol)とを加えて、同温度で30分間加熱した。さらにブチルアミン(0.20 mL;2.0 mmol)を加えて、同温度で5時間加熱した。室温まで冷却した反応液に2M-塩酸(10 mL)を加え、室温で30分間激しく攪拌した後、酢酸エチルで抽出した。抽出液を水洗し、次いで飽和食塩水で洗った後、硫酸マグネシウムで乾燥した。減圧下に溶媒を溜去して得られた残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー(溶離液：酢酸エチル:n-ヘキサン＝1:3)により精製すると、1,7-ビス(4'-メトキシメトキシ-3'-トリフルオロメトキシ)フェニル-4-エチル-1,6-ヘプタジエン-3,5-ジオン(282 mg;24%)が得られた。M.p.124-125℃
¹⁹FNMR (CDCl₃)：δ -59.50 (s), ¹HNMR (CDCl₃)：δ1.20 (3H, t, J=7.2Hz), δ2.58 (2H, q, J=7.2Hz), δ3.50 (6H, s), δ5.26 (4H, s), δ6.96 (2H, d, J=15.6Hz), δ7.2-7.3 (2H), δ7.4-7.5 (4H), δ7.67 (2H, d, J=15.6Hz), δ17.38 (1H, s)

（３）前記工程（２）で得られた1,7-ビス(4'-メトキシメトキシ-3'-トリフルオロメトキシ)フェニル-4-エチル-1,6-ヘプタジエン-3,5-ジオン(237 mg;0.40 mmol)とヨウ化メチル(0.25 mL;4.0 mmol)のアセトン(10 mL)溶液に粉末の炭酸カリウム(550 mg;4.0 mmol)を加えて55℃で3時間加熱した。減圧下に溶媒を溜去して得られる残渣を酢酸エチルで抽出した。抽出液を水洗し、次いで飽和食塩水で洗った後、硫酸マグネシウムで乾燥した。溶媒を減圧下に溜去して得られる残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー(溶離液：酢酸エチル:n-ヘキサン＝1:3)により精製すると、1,7-ビス(4'-メトキシメトキシ-3'-トリフルオロメトキシ)フェニル-4-エチル-4-メチル-1,6-ヘプタジエン-3,5-ジオン 230 mg (95.0%)が淡黄色油状物として得られた。
¹⁹FNMR (CDCl₃)：δ -59.59 (s), ¹HNMR (CDCl₃)：δ0.82 (3H, t, J=7.2Hz), δ1.42 (3H, s), δ2.05 (2H, q, J=7.2Hz), δ3.46 (6H, s), δ5.23 (4H, s), δ6.65 (2H, d, J=15.6Hz), δ7.17 (2H, d, J=8.4Hz), δ7.38 (2H, br.s), δ7.40 (2H, dd, J=2Hz, 8.4Hz), δ7.62 (2H, d, J=15.6Hz)

（４）前記工程（３）で得られた1,7-ビス(4'-メトキシメトキシ-3'-トリフルオロメトキシ)フェニル-4-エチル-4-メチル-1,6-ヘプタジエン-3,5-ジオン(182 mg;0.30 mmol)のエタノール(6.0 mL)溶液に1M-塩酸(1.80 mL;1.80 mmol)を加え、60-65℃に4時間加熱した。溶媒を減圧下に溜去して得られる残渣を酢酸エチルで抽出した。抽出液を水洗した後、飽和食塩水で洗浄し、硫酸マグネシウムで乾燥した。溶媒を減圧下に溜去して得られた残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー(溶出液：酢酸エチル:n-ヘキサン=1:3)により精製すると無色結晶の1,7-ビス(4'-ヒドロキシ-3'-トリフルオロメトキシ)フェニル-4-エチル-4-メチル-1,6-ヘプタジエン-3,5-ジオン101 mg (65%)が得られた。M.p.89-91℃¹⁹FNMR (CDCl₃)：δ -59.22 (s), ¹HNMR (CDCl₃)：δ0.82 (3H, t, J=7.2Hz), δ1.42 (3H,s), δ2.05 (2H, q, J=7.2Hz), δ5.69 (2H, s), δ6.64 (2H, d, J=15.6Hz), δ7.01 (2H, d, J=8.4Hz), δ7.35 (2H, br.s), δ7.39 (2H, dd, J=2Hz, 8.4Hz), δ7.61 (2H, d, J=15.6Hz)

なお、以下の試験例で使用している化合物３は、日本国特開2014-105196号公報の合成例１の記載に従い合成を行った。化合物３は以下の構造を有している。化合物３は、ケト・エノール互変異性を有する化合物である。

［試験例１］水晶発振子マイクロバランス(QCM)装置を用いたAβオリゴマー及びAβ線維との結合性の解析
本試験で使用する水晶発振子マイクロバランス(QCM)測定装置は、AffinitxQ (Initium社、東京)を用いた。本装置は、27-MHz QCMアナライザーであり、水晶発振子センサーに固定した化合物と被検物質とが結合すると振動周波数が減少することを利用し、微量物質の結合を高感度に検出できる。本試験では、QCM装置のセンサー部にβシート構造を持つAβ線維、あるいはAβオリゴマーなどのAβ凝集体を固定して、それぞれの試薬と反応させた。Aβ線維(fibril)とAβオリゴマー(oligomer、Globulomer-type)とは以下のように作製した。

Aβ凝集体の作製には、Aβ_1-42ペプチド(株式会社ペプチド研究所)を1,1,1,3,3,3-ヘキサフルオロ-2-プロパノール(HFIP)(富士フイルム和光純薬株式会社)で1 mMの濃度に溶解し、37℃で1時間おいて冷やした後にHFIPを吸引除去し、-30℃に保存したものを用いた。使用する前にジメチルスルホキシド(DMSO、脱水)にて、5 mMの濃度に溶解して使用した。Aβ線維は、5 mM Aβ_1-42DMSO溶液をダルベッコリン酸緩衝生理食塩水(D-PBS、Ca、Mg不含、ナカライテスク株式会社)で希釈し100μM溶液を作製し、37℃で48時間インキュベートし作製した。Aβオリゴマーは、5 mM Aβ_1-42DMSO溶液を0.2%ドデシル硫酸ナトリウム(SDS)入りD-PBS溶液で400μMに希釈し37℃で6時間おいた後、純水を加えて最終濃度100μM溶液とし、さらに37℃で18時間インキュベートした。この溶液を14,000g、10分間の遠心分離後、上清を使用した。

次に、QCM装置を用いた結合試験では、センサー部にAβオリゴマー、Aβ線維又は溶媒2μLを乾燥固定した(Aβオリゴマーは、4℃に湿潤状態で一晩おき、さらに4℃で24時間乾燥した)。センサーをガラスセル容器に入れたPBSに浸漬し安定化させた後、化合物１、３を終濃度10μM、チオフラビンT (Anaspec社)を終濃度30μMになるように加え、その直後から周波数の変化を記録した。

得られた結果を図１、２、表２に示す。図１の上段はAβ線維に対する周波数変化、下段はAβオリゴマーに対する周波数変化を示す。化合物３を加えるとAβ線維を固定したセンサー(fibril)とAβオリゴマーを固定したセンサー(oligomer)の両方で、溶媒のみを固定したコントロール実験のセンサー(vehicle)に比べて、周波数の著しい減少が認められた(fibril n=5、oligomer n=5、vehicle n=3)。一方、化合物１を加えたときは、Aβオリゴマーを固定したセンサーでは周波数の減少が認められたが、Aβ線維を固定したセンサーでは、コントロールとほとんど差がなかった。Aβ線維に特異的に結合することが知られているチオフラビンTは、Aβ線維を固定したセンサーでは周波数の減少が認められたが、Aβオリゴマーを固定したセンサーでは、Aβを固定していないコントロールと差が認められなかった。

また、図２の上段は化合物添加後20分間にAβ線維と結合した化合物の総量、下段はAβオリゴマーと結合した化合物の総量を示す。化合物３はAβ線維及びAβオリゴマーの両方で、化合物１はAβオリゴマーのみで、チオフラビンTはAβ線維のみでそれぞれ有意に高い結合量が得られていた。

さらに、表２は、Aβ線維に対するAβオリゴマーの結合量のモル比の値を示す。この値は、Aβ線維よりAβオリゴマーに結合しやすいと大きくなる。表２からも、化合物１は、Aβオリゴマーに対する結合の選択性が化合物３及びチオフラビンTよりも高いことが分かる。

以上の結果から、化合物３はAβオリゴマーとAβ線維の両方と結合する特性を持つが、化合物１はAβオリゴマーとは結合するがAβ線維とは結合性が低いことが示された。

［試験例２］化合物１の¹⁹F-MR画像化試験
化合物１を10 mg量り取り、80%のCremophor-ELを0.125 ml加え、温めながら溶解した。次いで生理食塩水を0.875 ml加えて投与溶液(10 mg/ml)を調製した。本投与液をペントバルビタールナトリウムで麻酔をかけた野生型マウス(12か月齢、オス1匹、メス2匹)又はAPP/PS1マウス(16か月齢、オス2匹、メス1匹)に、尾静脈から0.5 ml/kg/minで総量200 mg/kg投与した。

そして、MR装置を用いてマウス頭部の¹⁹F-MR信号を測定した。測定はまずNMRスペクトルを取得するためのシングルパルス測定を10分間実施し、次いでChemical Shift Imaging法(CSI法)による画像化のための50分間の測定を繰り返し、測定終了後にデータを加算して画像を作成した。

得られた結果を図３、４に示す。図３は化合物1を投与した野生型マウス(破線)及びAPP/PS1マウス(実線)における¹⁹F-NMR信号のピーク面積の経時的変化を示している。APP/PS１マウスのピーク面積はすべての時点で野生型マウスよりも大きく、化合物1がAPP/PS１マウス脳内に集積していることが示された。

図４中、左はAPP/PS1マウスの¹⁹F-MR画像、右は野生型マウスの¹⁹F-MR画像である。¹⁹F-MR画像において、Aβオリゴマーと推測される信号(矢印)が脳から検出された。

［試験例３］化合物１の脳移行性の解析
化合物１を10 mg量り取り、80%のCremophor-ELを0.125 ml加え、温めながら溶解した。ついで生理食塩水を0.875 ml加えて投与溶液(10 mg/ml)を調製した。本投与液(200 mg/kgの投与量)と溶媒(vehicle)のみの投与液とを野生型マウス(6.5か月齢、メス各１匹)に、それぞれ尾静脈から投与した。投与30分後にペントバルビタールナトリウムを過剰投与してマウスを安楽死させた後、脳を摘出し、4倍量のCD₃ODでホモジナイズして、抽出物のメタノール溶液を調製した。

次に、液体クロマトグラフ質量分析計(LC/MS)を用いて解析を行った。LC装置はAgilent 1290 binary pumpを使用した。分析条件は、分析カラム ZORBAX Eclipse Plus C18 1.8μm 2.1×50 mm、A: 4 mM HCOONH₄(pH 6.4) B: CAN、0 min A90%, 1 min A90%, 6 min A20%, 7 min A20%であった。MS装置はQTRAP5500 negative ion modeを使用した。

以下の表３に、LS/MSで観察したイオン強度から求めたマウス脳サンプル溶液中の化合物１の濃度を示す。

Claims

ケト型構造のみが存在するクルクミン誘導体又はその塩を有効成分とする、アミロイドβオリゴマーを検出するために用いられる画像診断薬であって、前記クルクミン誘導体が式（Ｉ）：
（式中、R¹はそれぞれ独立に水素原子、フッ素原子、CH₃-、CH₂F-、CHF₂-、CF₃-、CH₃O-、CH₂FO-、CHF₂O-又はCF₃O-であり、R²はそれぞれ独立に水素原子又はフッ素原子であり、Aはアルキル、シアノ、カルボキシ、アルコキシカルボニル又はR³-(CH₂)_m-であり、R³はヒドロキシ、カルボキシ、シアノ、アルキルカルボニルオキシ、アルコキシカルボニル、アルコキシアルコキシ、ヒドロキシアルコキシ又はCONR⁴R⁵であり、R⁴及びR⁵はそれぞれ独立に水素原子又はアルキルであり、mは1～5の整数である）で表されるクルクミン誘導体である、画像診断薬。
前記R¹はそれぞれ独立にフッ素原子、CH₂F-、CHF₂-、CF₃-、CH₂FO-、CHF₂O-又はCF₃O-である、請求項１に記載の画像診断薬。
アミロイドβ蛋白が蓄積する疾患の診断用である、請求項１又は２に記載の画像診断薬。
アミロイドβ蛋白が蓄積する疾患がアルツハイマー病である、請求項３に記載の画像診断薬。
画像診断がMRIである、請求項１～４のいずれか一項に記載の画像診断薬。
式（ＩＡ）：
（式中、R¹はそれぞれ独立に水素原子、フッ素原子、CH₃-、CH₂F-、CHF₂-、CF₃-、CH₃O-、CH₂FO-、CHF₂O-又はCF₃O-であり、R²はそれぞれ独立に水素原子又はフッ素原子であり、Aはメチル又はエチルである（ただし、R¹が共に水素原子、CH₃O-又はCF₃O-であるか又は水素原子及びCH ₃ O-であり、R²が共に水素原子である場合、AはCH₃-であってはならない））で表されるクルクミン誘導体又はその塩。
式（ＩＡ）：
（式中、R¹はそれぞれ独立にフッ素原子、CH₂F-、CHF₂-、CF₃-、CH₂FO-、CHF₂O-又はCF₃O-であり、R ² はそれぞれ独立に水素原子又はフッ素原子であり、Aはメチル又はエチルである（ただし、R ¹ が共にCF ₃ O-であり、R ² が共に水素原子である場合、AはCH ₃ -であってはならない））で表されるクルクミン誘導体又はその塩。