JP7810466B2

JP7810466B2 - 線維芽細胞または線維芽細胞様細胞を従来型２型樹状細胞にリプログラミングするための方法

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Publication number: JP7810466B2
Application number: JP2024508173A
Authority: JP
Inventors: 雄太郎熊谷
Original assignee: National Institute of Advanced Industrial Science and Technology AIST
Current assignee: National Institute of Advanced Industrial Science and Technology AIST
Priority date: 2022-03-18
Filing date: 2023-03-14
Publication date: 2026-02-03
Anticipated expiration: 2043-03-14
Also published as: EP4477749A4; WO2023176806A1; US20250195569A1; EP4477749A1; CN118871574A; JPWO2023176806A1

Description

本発明は、線維芽細胞または線維芽細胞様細胞から従来型２型樹状細胞をダイレクトリプログラミングにより調製するための方法および組成物に関する。

膵がんは５年相対生存率が１０％未満であり、他のがんに比べて極めて予後が不良な難治がんとして知られる。膵がんなどの難治がんの特徴の一つは、非常に多くの間質ががん細胞を取り巻いていることである。間質は、血管新生やがん細胞の増殖・浸潤を促進する細胞を多く含んでおり、その中でも量的に主体となる細胞が、がん関連線維芽細胞（ＣＡＦ）である。ＣＡＦは、増殖因子を産生してがん細胞の増殖を促進するだけでなく、コラーゲンなどの細胞外基質を過剰に産生することによりがん組織を硬くする。その結果、難治がんは、従来一般的な化学療法や放射線療法に対して強い抵抗性を示す。

難治がんに対する治療方法として、抗腫瘍免疫応答を活性化する免疫療法が試みられている。中でも、自家性の樹状細胞をインビトロでがん抗原により感作して患者の体内に戻すことにより抗腫瘍免疫応答を活性化する、いわゆるＤＣワクチン療法は、安全性も高いことから注目されている。しかし、樹状細胞およびその前駆細胞である単球は末梢血中に極めて少量しか存在せず、培養により増殖させることもできないため、治療に有効な量のＤＣワクチンを調製することには困難が存在する。この問題を解決するために、現在、リプログラミングにより樹状細胞を調製する手法の開発が進められている。体細胞から誘導多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）を調製し、樹状細胞へと誘導する技術がすでに臨床でも試験されつつある。しかし、ｉＰＳＣの調製には時間と費用がかかり、技術的難易度も高いことから、ｉＰＳＣ由来ＤＣの臨床応用は実現されていない。

そこで、分化細胞をｉＰＳＣを経由せずに別の種類の分化細胞へと直接誘導するダイレクトリプログラミング技術に期待が高まっている。特に、線維芽細胞から樹状細胞を直接誘導できれば、容易かつ短時間・低コストでＤＣワクチンを調製できる。現在、マウス胎児線維芽細胞（ＭＥＦ）から樹状細胞へとダイレクトリプログラミングできることが実証されている（特許文献１および２、非特許文献１）。しかし、ヒト成体の線維芽細胞を高効率で樹状細胞へと直接誘導できるには至っていない。

国際公開第２０１８／１８５７０９号国際公開第２０２１／１０５２３４号

Rosa FF et al., Sci. Immunol., 2018 Dec 7;3(30):eaau4292

本発明は、難治がんに対する新たな治療戦略、および、容易かつ効率的なＤＣワクチンの調製方法を提供することを目的としてなされたものである。

本発明者らは、鋭意研究の結果、特定の４つの転写因子を組み合わせて導入することにより、種々の線維芽細胞または線維芽細胞様細胞を従来型２型樹状細胞（ｃＤＣ２）様細胞へと分化転換することに成功した。

すなわち、本発明は、一実施形態によれば、線維芽細胞または線維芽細胞様細胞から従来型２型樹状細胞（ｃＤＣ２）様細胞を生成するための方法であって、ＰＵ．１をコードする核酸、ＫＬＦ４をコードする核酸、ＩＲＦ４をコードする核酸およびＣ／ＥＢＰをコードする核酸を前記線維芽細胞または線維芽細胞様細胞に導入するステップを含む方法を提供するものである。

前記Ｃ／ＥＢＰは、Ｃ／ＥＢＰアルファまたはＣ／ＥＢＰベータであることが好ましい。

前記線維芽細胞または線維芽細胞様細胞は、がん関連線維芽細胞であることが好ましい。

前記線維芽細胞または線維芽細胞様細胞は、間葉系幹細胞であることが好ましい。

また、本発明は、一実施形態によれば、上記方法により調製された従来型２型樹状細胞（ｃＤＣ２）様細胞を含んでなる、対象におけるがんを予防または治療するための医薬組成物を提供するものである。

前記ｃＤＣ２様細胞は、がん抗原を負荷されていることが好ましい。

前記ｃＤＣ２様細胞は、前記対象に対して自家性であることが好ましい。

前記ｃＤＣ２様細胞は、不死化されたものであってよい。

また、本発明は、一実施形態によれば、ＰＵ．１をコードする核酸、ＫＬＦ４をコードする核酸、ＩＲＦ４をコードする核酸およびＣ／ＥＢＰをコードする核酸を含んでなる、線維芽細胞または線維芽細胞様細胞を従来型２型樹状細胞様細胞へと分化転換するための組成物を提供するものである。

本発明に係る方法によれば、線維芽細胞または線維芽細胞様細胞をｃＤＣ２様細胞へと直接分化転換することができる。そのため、本発明に係る方法によれば、ＤＣワクチンを容易かつ効率的に調製することができる。

図１は、ＣＤ４５、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ１１ｃおよびＭＨＣクラスＩＩの発現に基づいて、マウス４転写因子を導入したＭＥＦをフローサイトメトリーによりゲーティングした結果を示す図である。図２は、ＣＤ４５＋ＣＤ１１ｂ＋ＭＨＣ－ＩＩ＋ＣＤ１１ｃ＋細胞におけるｃＤＣ２特異的マーカー（ＣＬＥＣ１０Ａ、ＳＩＲＰαおよびＣＣＲ７）の発現を示す図である。図３は、ＣＤ４５＋ＣＤ１１ｂ＋ＭＨＣ－ＩＩ＋ＣＤ１１ｃ＋細胞におけるＣ型レクチン（ＳＩＧＮＲ１およびＤＣ－ＳＩＧＮ）の発現を示す図である。図４は、ＣＤ４５＋ＣＤ１１ｂ＋ＭＨＣ－ＩＩ＋ＣＤ１１ｃ＋細胞におけるマクロファージ特異的マーカー（ＣＤ１１５およびＦ４／８０）および単球特異的マーカー（Ｌｙ６Ｃ）の発現を示す図である。図５は、ｉｃＤＣ２におけるｃＤＣ特異的転写因子Ｚｂｔｂ４６の発現をＲＴ－ｑＰＣＲにより定量した結果を示すグラフである。図６は、ｉｃＤＣ２におけるマクロファージ特異的チロシンキナーゼＭｅｒＴＫの発現をＲＴ－ｑＰＣＲにより定量した結果を示すグラフである。図７は、マウス４転写因子を導入した不死化ＭＥＦのｃＤＣ２様細胞への分化転換の経時変化を示すグラフである。図８は、不死化ＭＥＦから誘導されたｃＤＣ２様細胞の増殖を示すグラフである。図９は、マウスＰＵ．１と、マウスＫＬＦ４、ＩＲＦ４およびＣ／ＥＢＰアルファから選択される１以上の転写因子とを組み合わせて導入したＭＥＦからｉｃＤＣ２への分化転換効率を示すグラフである。図１０は、ＴＲＥプロモーター制御下にマウス４転写因子を発現するポリシストロニックベクターの構成を示す概略図である。図１１は、ＣＤ４５、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ１１ｃおよびＭＨＣクラスＩＩの発現に基づいて、それぞれ個別のベクターによりマウス４転写因子を導入したＭＥＦをフローサイトメトリーによりゲーティングした結果を示す図である。図１２は、ＣＤ４５、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ１１ｃおよびＭＨＣクラスＩＩの発現に基づいて、単一のポリシストロニックベクターにより４転写因子を導入したＭＥＦをフローサイトメトリーによりゲーティングした結果を示す図である。図１３は、ＣＤ４５およびＣＤ１１ｂの発現に基づいて、ヒト４転写因子を導入したＭＲＣ－５をフローサイトメトリーによりゲーティングした結果を示す図である。図１４は、ＣＤ４５＋ＣＤ１１ｂ＋細胞におけるＨＬＡ－ＤＲの発現の亢進を示す図である。図１５は、ＣＤ４５＋ＣＤ１１ｂ＋細胞におけるＣＤ１１ｃの発現の亢進を示す図である。図１６は、マウス４転写因子を導入したＭＥＦ、ＭＳＣ、３Ｔ３およびＣＤ４陽性Ｔ細胞を混合した細胞集団におけるＣＤ３イプシロン陽性細胞数の増加を示すプロットである。図１７は、マウス４転写因子を導入したＭＥＦと混合されたＣＤ４陽性Ｔ細胞におけるＣＤ６９の発現の亢進を示す図である。図１８は、マウス４転写因子を導入したＭＥＦを投与されたまたは投与されていないモデルマウスにおける腫瘍サイズを比較したグラフである。

以下、本発明を詳細に説明するが、本発明は本明細書中に説明した実施形態に限定されるものではない。

本発明は、第一の実施形態によれば、線維芽細胞または線維芽細胞様細胞から従来型２型樹状細胞（ｃＤＣ２）様細胞を生成するための方法であって、ＰＵ．１をコードする核酸、ＫＬＦ４をコードする核酸、ＩＲＦ４をコードする核酸およびＣ／ＥＢＰをコードする核酸を前記線維芽細胞または線維芽細胞様細胞に導入するステップを含む方法である。

「線維芽細胞」とは、間質に存在する紡錘形の細胞であって、細胞外基質構成タンパク質およびその分解酵素を産生する細胞をいう。一方、「線維芽細胞様細胞」とは、線維芽細胞と類似した紡錘形のみにより定義され、分化能などの機能は特定されていない細胞をいう。形態学的には、線維芽細胞と線維芽細胞様細胞とは区別することができない。本実施形態の方法は、線維芽細胞または線維芽細胞様細胞のいずれも使用することができる。

本実施形態における線維芽細胞または線維芽細胞様細胞は、任意の脊椎動物由来のものであってよいが、好ましくは、マウス、ラット、モルモット、ウサギ、イヌ、ヒツジ、ブタ、ウシ、ウマ、ヤギ、サル、ヒトなどの哺乳動物由来であり、特に好ましくはヒト由来である。また、本実施形態における線維芽細胞または線維芽細胞様細胞は、胎児または成体の任意の組織に由来するものであってよく、組織は正常組織またはがん組織のいずれであってもよい。

したがって、本実施形態における線維芽細胞または線維芽細胞様細胞には、例えば、マウス胎児線維芽細胞（ＭＥＦ）、不死化したマウス胎児線維芽細胞（３Ｔ３）、成体マウス尾端線維芽細胞（ＴＴＦ）、ヒト胎児繊維芽細胞（ＨＥＦ）、がん関連線維芽細胞（ＣＡＦ）、脂肪由来間葉系幹細胞（ＡＤ－ＭＳＣ）、骨髄間葉系幹細胞（ＢＭ－ＭＳＣ）などが挙げられるが、これらに限定されない。

線維芽細胞または線維芽細胞様細胞の調製方法は十分に確立されており、当分野において公知の方法にしたがって調製することができる。あるいは、すでに樹立された線維芽細胞株または線維芽細胞様細胞株を、例えば、理研バイオリソースセンター（ＲＩＫＥＮＢＲＣ）、ＡＴＣＣ（ＡｍｅｒｉｃａｎＴｙｐｅＣｕｌｔｕｒｅＣｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）などから入手してもよい。

本実施形態の方法では、ＰＵ．１、ＫＬＦ４、ＩＲＦ４およびＣ／ＥＢＰをコードする核酸を線維芽細胞または線維芽細胞様細胞に導入する。

「ＰＵ．１」、「ＫＬＦ４」、「ＩＲＦ４」および「Ｃ／ＥＢＰ」は、いずれも転写因子である。Ｃ／ＥＢＰファミリーは、Ｃ／ＥＢＰアルファ、Ｃ／ＥＢＰベータ、Ｃ／ＥＢＰガンマ、Ｃ／ＥＢＰデルタ、Ｃ／ＥＢＰイプシロンおよびＣＨＯＰ（Ｃ／ＥＢＰゼータ）からなり、本実施形態におけるＣ／ＥＢＰは、そのいずれであってもよいが、好ましくはＣ／ＥＢＰアルファまたはＣ／ＥＢＰベータである。本実施形態におけるＰＵ．１、ＫＬＦ４、ＩＲＦ４およびＣ／ＥＢＰは、任意の脊椎動物由来のものであってよいが、好ましくは、マウス、ラット、モルモット、ウサギ、イヌ、ヒツジ、ブタ、ウシ、ウマ、ヤギ、サル、ヒトなどの哺乳動物由来であり、特に好ましくはヒト由来である。

ＰＵ．１、ＫＬＦ４、ＩＲＦ４およびＣ／ＥＢＰをコードする遺伝子はすでにクローニングされており、それらの核酸配列情報は、所定のデータベースから入手することができる。例えば、ヒトＰＵ．１であればＮＭ＿００３１２０、マウスＰＵ．１であればＮＭ＿０１１３５５、ヒトＫＬＦ４であればＮＭ＿００４２３５、マウスＫＬＦ４であればＮＭ＿０１０６３７、ヒトＩＲＦ４であればＮＭ＿００２４６０、マウスＩＲＦ４であればＮＭ＿０１３６７４、ヒトＣ／ＥＢＰアルファであればＮＭ＿００４３６４、マウスＣ／ＥＢＰアルファであればＮＭ＿００７６７８、ヒトＣ／ＥＢＰベータであればＮＭ＿００５１９４、マウスＣ／ＥＢＰベータであればＮＭ＿００９８８３（いずれもＮＣＢＩＮｕｃｌｅｏｔｉｄｅデータベース）が利用可能である。

本実施形態におけるＰＵ．１、ＫＬＦ４、ＩＲＦ４およびＣ／ＥＢＰには、同等の転写調節活性を有するそれらのバリアントやホモログなども含まれてよい。言い換えれば、本実施形態におけるＰＵ．１、ＫＬＦ４、ＩＲＦ４およびＣ／ＥＢＰには、その転写調節活性が維持されていることを限度として、データベースに登録されているアミノ酸配列と８０％以上、好ましくは９０％以上、より好ましくは約９５％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなるタンパク質が包含され得る。アミノ酸配列の同一性は、配列解析ソフトウェアを用いて、または、当分野で慣用のプログラム（ＦＡＳＴＡ、ＢＬＡＳＴなど）を用いて算出することができる。また、本実施形態におけるＰＵ．１、ＫＬＦ４、ＩＲＦ４およびＣ／ＥＢＰには、その転写調節活性が維持されていることを限度として、データベースに登録されているアミノ酸配列において、１～数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入および／または付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質が包含され得る。ここで、「１～数個」とは、例えば「１～３０個」、好ましくは「１～１０個」、特に好ましくは「１～５個」である。

ＰＵ．１、ＫＬＦ４、ＩＲＦ４およびＣ／ＥＢＰをコードする核酸は、当分野において周知の方法により線維芽細胞または線維芽細胞様細胞に導入することができ、例えば、それらの核酸を発現ベクターにクローニングして、細胞に導入すればよい。発現ベクターの種類は、対象とする線維芽細胞または線維芽細胞様細胞に応じて適切な発現ベクターを選択して用いることができる。例えば、以下に限定されないが、レトロウイルス、レンチウイルス、アデノウイルス、センダイウイルスなどのウイルスベクターや、ｐＣＭＶなどのプラスミドベクターなどを用いることができる。また、ＰＵ．１、ＫＬＦ４、ＩＲＦ４およびＣ／ＥＢＰをコードする核酸は、それぞれ個別のベクターから発現されてもよいし、単一のポリシストロニックベクターから発現されてもよい。

本実施形態の方法において、発現ベクターは、その種類に応じて当分野において周知の方法により細胞に導入され得る。非ウイルスベクターであれば、例えば、リポフェクション、エレクトロポレーション、マイクロインジェクションなどにより導入することができる。ウイルスベクターであれば、適切な力価または多重感染度（ＭＯＩ）において細胞に感染させることにより導入することができる。

ＰＵ．１、ＫＬＦ４、ＩＲＦ４およびＣ／ＥＢＰが発現されると、線維芽細胞または線維芽細胞様細胞は従来型２型樹状細胞（ｃＤＣ２）様細胞へと分化転換される。ここで、「分化転換（またはダイレクトリプログラミング）」とは、ある成熟（分化）細胞型が、多能性細胞状態を経ることなく、別の成熟（分化）細胞型へと直接的に変換されることをいう。

本実施形態において「従来型２型樹状細胞（ｃＤＣ２）様細胞」とは、ｃＤＣ２特異的マーカーを発現し、抗原提示能を有する細胞をいう。樹状細胞（ＤＣ）は、従来型１型樹状細胞（ｃＤＣ１）、従来型２型樹状細胞（ｃＤＣ２）および形質細胞様樹状細胞（ｐＤＣ）の３つの主要なサブセットに分類され、各サブセットを特徴づけるマーカーが周知である。本実施形態におけるｃＤＣ２様細胞は、周知の血球マーカー、ミエロイド系細胞マーカーおよびｃＤＣ２特異的マーカーの任意の組み合わせによって定義されてよいが、例えば、ＣＤ４５＋、ＣＤ１１ｂ＋、ＣＤ１１ｃ＋、かつＭＨＣクラスＩＩ（ＨＬＡ－ＤＲ）＋として定義されることが好ましい。ＭＨＣクラスＩＩ（ＨＬＡ－ＤＲ）の顕著な発現により、本実施形態のｃＤＣ２様細胞が抗原提示能を有することが示され得る。本実施形態におけるｃＤＣ２様細胞は、上記マーカーに加え、ＣＬＥＣ１０Ａ、ＳＩＲＰα、および／またはＣＣＲ７をさらに発現していることが好ましく、ＳＩＧＮＲ１やＤＣ－ＳＩＧＮなどのＣ型レクチンをさらに発現していることがより好ましい。本実施形態におけるｃＤＣ２様細胞は、ｃＤＣ２特異的マーカーのみならず、ＣＤ１１５などのマクロファージ特異的マーカーやＬｙ６Ｃなどの単球特異的マーカーをさらに発現していてもよい。マーカーの発現は、ＲＴ－ＰＣＲ、ウェスタンブロット、フローサイトメトリーなどの公知の手法により解析することができる。

本実施形態の方法によれば、線維芽細胞または線維芽細胞様細胞から、多能性細胞状態を経ることなく、直接的にｃＤＣ２様細胞を生成することができる。線維芽細胞は容易に取得でき増殖させることができることから、本実施形態の方法は、ＤＣワクチンの調製に有用である。

本発明は、第二の実施形態によれば、上記方法により調製されたｃＤＣ２様細胞を含んでなる、対象におけるがんを予防または治療するための医薬組成物である。

本実施形態において、「予防する」とは、がんを発症するおそれのある対象において、その発症を未然に防ぐことのみならず、その発症リスクを低減することや、発症する前の対象に処置することにより、対象ががんを発症した場合の症状の進行を遅延または重症度を軽減することをも含む。「治療する」とは、がんを完全に治癒することのみならず、がんの症状を寛解または緩和すること、がんの進行を遅延または停止させること、および、がんの予後を改善することをも含む。

本実施形態における「対象」は、任意の脊椎動物であってよいが、好ましくは、マウス、ラット、ウサギ、ヒツジ、ブタ、ウシ、ヤギ、サル、ヒトなどの哺乳動物であり、特に好ましくはヒトである。対象は、乳幼児、若年、青年、成人および老人対象を含めた任意の年齢であり得る。

本実施形態におけるｃＤＣ２様細胞は、第一の実施形態において定義したものと同様であり、任意の脊椎動物の任意の組織由来の線維芽細胞または線維芽細胞様細胞から調製されたものであってよい。本実施形態におけるｃＤＣ２様細胞は、対象に対して好ましくは同種または自家、より好ましくは自家の線維芽細胞または線維芽細胞様細胞から調製され得る。

本実施形態におけるｃＤＣ２様細胞は、任意で、不死化されていてもよい。ここで、細胞が「不死化されている」とは、細胞が、一定回数の分裂を繰り返した後もなお増殖可能な状態を維持する、すなわち、細胞が無限増殖能を有することを意味する。細胞を不死化する方法はすでに確立されており、公知の手法を採用することができる。例えば、ＳＶ４０Ｔ抗原遺伝子やテロメラーゼ逆転写酵素（ＴＥＲＴ）遺伝子などの不死化遺伝子をレトロウイルスベクターにより細胞に導入することにより、細胞を不死化することができる。

本実施形態におけるｃＤＣ２様細胞は、がん抗原を負荷されていることが好ましい。樹状細胞にがん抗原を負荷する方法は十分に確立されており、当分野において公知の方法にしたがって本実施形態におけるｃＤＣ２様細胞にがん抗原を負荷することができる。例えば、がん抗原ペプチドの全長もしくは部分断片または腫瘍ライセートを含有する培地中でｃＤＣ２様細胞を１２時間～数日間培養すればよい。または、がん抗原ペプチドの全長または部分断片をコードする核酸を、ウイルスベクターまたは非ウイルスベクターを用いて細胞に導入してもよい。

本実施形態において使用できるがん抗原は、特に限定されないが、例えば、ＨＥＲ２／ＮＥＵ、ＴＥＲＴ、ＷＴ１、ＭＡＧＥ－Ａ３、ＮＹ－ＥＳＯ－１、ＰＡＰ、ＰＳＡなどであってよい。

本実施形態の医薬組成物は、上記ｃＤＣ２様細胞を有効成分として含有する。本実施形態の医薬組成物は、有効成分のみから構成されていてもよいが、さらに任意の成分として、薬学的に許容される公知の担体、緩衝剤、その他の成分（例えばＣｐＧＤＮＡのようなＴｏｌｌ様受容体リガンド、合成サイクリックヌクレオチドのようなＳＴＩＮＧアゴニスト、ＧＭ－ＣＳＦ、ＣＣＬ１９、ＦＬＴ３Ｌのようなサイトカイン／ケモカイン）などを含んでもよい。例えば、本実施形態の医薬組成物は、有効成分である細胞の生存を維持できるリン酸緩衝生理食塩水などの担体を用いて、注射剤型として調製することができる。この場合、ｃＤＣ２様細胞は、例えば１×１０⁶～１×１０⁸細胞／ｍＬの濃度で上記担体に懸濁されてよい。

本実施形態の医薬組成物は、例えば、注射、注入、移植などの適切な方法により投与することができる。好ましくは、本実施形態の医薬組成物は、静脈内、皮下、皮内、リンパ節内に注入されてよい。本実施形態の医薬組成物の投与量は、対象の年齢、体重、がんの重症度などに応じて異なってよいが、例えば１×１０⁵～１×１０¹⁰細胞／ｋｇ（体重）であってよい。前記投与量は、１回で投与されてもよいし、複数回にわたって投与されてもよい。

本実施形態の医薬組成物は、安全かつ効果的に抗腫瘍免疫応答を活性化することができる。そのため、従来の化学療法や放射線療法によっては治療が困難であった難治がんの治療に有用である。

本発明は、第三の実施形態によれば、ＰＵ．１をコードする核酸、ＫＬＦ４をコードする核酸、ＩＲＦ４をコードする核酸およびＣ／ＥＢＰをコードする核酸を含んでなる、線維芽細胞または線維芽細胞様細胞を従来型２型樹状細胞様細胞へと分化転換するための組成物である。本実施形態におけるｃＤＣ２様細胞、線維芽細胞、線維芽細胞様細胞、ＰＵ．１、ＫＬＦ４、ＩＲＦ４およびＣ／ＥＢＰをコードする核酸は、第一の実施形態で定義したものと同様であり、第一の実施形態に記載されたように調製かつ使用され得る。

以下に実施例を挙げ、本発明についてさらに説明する。なお、これらは本発明を何ら限定するものではない。

＜１．４転写因子によるＭＥＦの樹状細胞への分化転換＞
マウスＰＵ．１遺伝子のコード配列（ＲｅｆＳｅｑＩＤ：ＮＭ＿０１１３５５、配列番号１）、ＫＬＦ４遺伝子のコード配列（ＲｅｆＳｅｑＩＤ：ＮＭ＿０１０６３７、配列番号２）、ＩＲＦ４遺伝子のコード配列（ＲｅｆＳｅｑＩＤ：ＮＭ＿０１３６７４、配列番号３）およびＣ／ＥＢＰアルファ遺伝子のコード配列（ＲｅｆＳｅｑＩＤ：ＮＭ＿００７６７８、配列番号４）をＰＣＲにより増幅し、ｐＭＸｓベクター（Ｋｉｔａｍｕｒａｅｔａｌ．，Ｅｘｐ．Ｈｅｍａｔｏｌ．，２００３）にサブクローニングした。これらのベクターをＶＳＶ－Ｇプラスミドおよびｇａｇ／ｐｏｌプラスミド（Ａｄｄｇｅｎｅ）とともにＨＥＫ２９３細胞にトランスフェクションし、レトロウイルス粒子を産生させた。培養上清を回収し、４℃、６，０００×ｇで２０分間超遠心分離を行った。不溶性画分を除去した上清に、１／４量の４０％（ｗ／ｖ）ＰＥＧ－８０００、１．２ＭＮａＣｌ／ＰＢＳ溶液を混和し、４℃で一晩インキュベートした。その後、４℃、１，６００×ｇで６０分間超遠心分離を行い、上清を除去した。元の培養上清１ｍＬにつき５０μＬのＤＭＥＭを加えてペレットを懸濁し、－８０℃で保存した。

マウス胚性線維芽細胞（ＭＥＦ）は、常法に従い、１３．５日胚から取得した。ＭＥＦを２４ウェルプレートに播種し（１ウェルあたり４×１０⁴細胞）、翌日に１ウェルあたり１００μＬのウイルス懸濁液を加えた。翌日（１日目とする）、１ウェル中の細胞を３ウェルに継代培養し、測定まで維持した。培養には１０％ＦＣＳ含有ＤＭＥＭを用いた。１３日後、細胞を回収し、マーカータンパク質の免疫染色を行った。マーカータンパク質を染色するためには、トリプシン処理して回収した細胞を抗体溶液に懸濁し、３７℃で２０分間インキュベートした後、４℃で１５分間インキュベートした。染色後の細胞を、ＦＡＣＳＶｅｒｓｅ（ＢＤＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）により観測した。

表１．マーカーの染色に用いた抗体

血球マーカーＣＤ４５、ミエロイド系細胞マーカーＣＤ１１ｂ、樹状細胞マーカーＣＤ１１ｃおよび抗原提示細胞マーカーＭＨＣクラスＩＩ（ＭＨＣ－ＩＩ）の発現に基づく、フローサイトメトリーによる細胞のゲーティングの結果を図１に示す。図中、「４ＴＦ」は、ＰＵ．１、ＫＬＦ４、ＩＲＦ４およびＣ／ＥＢＰアルファの４転写因子を導入した細胞を、「ｍｏｃｋ」は導入処理を行っていない細胞を示す。４転写因子を導入した細胞から、血球マーカーＣＤ４５、ミエロイド系細胞マーカーＣＤ１１ｂ、樹状細胞マーカーＣＤ１１ｃおよび抗原提示細胞マーカーＭＨＣクラスＩＩを発現する樹状細胞様細胞が得られたことが確認された。

ｃＤＣ２特異的マーカーおよびその他の単球系細胞マーカーの発現について、ＣＤ４５＋ＣＤ１１ｂ＋ＭＨＣ－ＩＩ＋ＣＤ１１ｃ＋細胞とＣＤ４５－細胞とを比較した結果を図２～４に示す。ＣＤ４５＋ＣＤ１１ｂ＋ＭＨＣ－ＩＩ＋ＣＤ１１ｃ＋細胞は、ｃＤＣ２特異的マーカーであるＣＬＥＣ１０Ａ、ＳＩＲＰαおよびＣＣＲ７を発現していることが判明した（図２）。また、ＣＤ４５＋ＣＤ１１ｂ＋ＭＨＣ－ＩＩ＋ＣＤ１１ｃ＋細胞は、樹状細胞に発現するＣ型レクチンであるＳＩＧＮＲ１およびＤＣ－ＳＩＧＮを発現していた（図３）。その一方で、ＣＤ４５＋ＣＤ１１ｂ＋ＭＨＣ－ＩＩ＋ＣＤ１１ｃ＋細胞は、マクロファージ特異的マーカー（ＣＤ１１５およびＦ４／８０）や単球特異的マーカーＬｙ６Ｃを発現している点で、ｃＤＣ２とは異なっていた。これらの結果から、ＰＵ．１、ＫＬＦ４、ＩＲＦ４およびＣ／ＥＢＰアルファの４転写因子を導入して得られた細胞はｃＤＣ２様細胞であると結論し、「ｉｎｄｕｃｅｄｃＤＣ２（ｉｃＤＣ２）」と名付けた。

続いて、ｉｃＤＣ２におけるｃＤＣ特異的転写因子Ｚｂｔｂ４６とマクロファージ特異的チロシンキナーゼＭｅｒＴＫの発現をＲＴ－ｑＰＣＲにより評価した。以下の手順によりＧＭ－ＣＳＦ誘導骨髄由来樹状細胞（ＧＭ－ＤＣ）を調製し、陽性対照として用いた。マウス大腿骨から骨髄細胞を採取し、１匹分の骨髄細胞を２４ｍＬのＧＭ－ＣＳＦ培地（１０ｎｇ／ｍＬＧＭ－ＣＳＦ（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ）、３．５μＬ２－メルカプトエタノール（ナカライテスク）、１０％ＦＣＳを含むＲＰＭＩ１６４０培地）に懸濁し、１ウェルあたり１ｍＬで２４ウェルプレートに播種した。培養上清を２日ごとに新しい培地により半量交換した。培養開始から６日後に浮遊細胞を回収し、ＧＭ－ＤＣとして用いた。

ＴＲＩｒｅａｇｅｎｔ（ＭｏｌｅｃｕｌａｒＲｅｓｅａｒｃｈＣｅｎｔｅｒ）を用いて説明書にしたがって細胞からＲＮＡを抽出し、ＲｅｖｅｒＴｒａＡｃｅｑＰＣＲＲＴＭａｓｔｅｒＭｉｘｗｉｔｈｇＤＮＡＲｅｍｏｖｅｒ（Ｔｏｙｏｂｏ）を用いて説明書にしたがってｃＤＮＡを合成した。このｃＤＮＡを鋳型として、ＴＨＵＮＤＥＲＢＩＲＤＳＹＢＲｑＰＣＲＭｉｘ（Ｔｏｙｏｂｏ）およびＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ９６（Ｒｏｃｈｅ）を用いてｑＰＣＲを行った。使用したプライマーを以下に示す。モック細胞における発現量を１として発現誘導の倍率変化を算出した。

表２．ｑＰＣＲに用いたプライマー

結果を図５および６に示す。ｉｃＤＣ２においてＺｂｔｂ４６遺伝子およびＭｅｒｔｋ遺伝子の発現が亢進していた。以上の結果から、ｉｃＤＣ２は、ｃＤＣ２の特徴を有しつつｃＤＣ２とは異なる特徴も有する新規なｃＤＣ２様細胞であることが示された。

＜２．４転写因子によるＭＥＦのｃＤＣ２様細胞への分化転換時系列＞
ＳＶ４０Ｔ抗原を発現するプラスミドｐＢＳＳＶＤ２００５（Ａｄｄｇｅｎｅ、ｐｌａｓｍｉｄ＃２１８２６）をトランスフェクションして不死化したＭＥＦに、上記１と同様の手順により４転写因子を導入し、マーカーの発現を観測した。ＣＤ４５＋ＣＤ１１ｂ＋ＭＨＣ－ＩＩ＋ＣＤ１１ｃ＋細胞画分の割合に基づいて分化転換の経時変化を分析した。

結果を図７に示す。４転写因子の導入から３日後頃から分化転換が開始され、７日後にピークを迎え、その後は減少することが確認された。

＜３．不死化ＭＥＦ由来ｉｃＤＣ２の増殖能＞
引き続き、上記２の細胞を７日ごとに継代培養し、ＣＤ４５＋ＣＤ１１ｂ＋ＭＨＣ－ＩＩ＋ＣＤ１１ｃ＋細胞数を計測した。結果を図８に示す。培養日数を重ねるにしたがってＣＤ４５＋ＣＤ１１ｂ＋ＭＨＣ－ＩＩ＋ＣＤ１１ｃ＋細胞数が増加しており、この細胞自体が増殖していることが判明した。この結果は、不死化された細胞由来のｉｃＤＣ２は増殖維持することができることを示しており、創薬への応用の可能性を示すものである。

＜４．ＭＥＦのｃＤＣ２様細胞への分化転換に必要な転写因子の組み合わせ＞
ＭＥＦのｃＤＣ２様細胞への分化転換に、ＰＵ．１、ＫＬＦ４、ＩＲＦ４およびＣ／ＥＢＰアルファのいずれが必要であるかを検討した。ＰＵ．１を欠く場合には、他のどの転写因子の組み合わせによってもＣＤ４５陽性細胞が誘導されなかったため（データは省略）、ＰＵ．１と、ＫＬＦ４、ＩＲＦ４およびＣ／ＥＢＰアルファから選択される１以上の転写因子とを組み合わせてＭＥＦに導入し、上記１と同様の手順によりｉｃＤＣ２への分化転換効率を評価した。

結果を図９に示す。図中、「Ｐ」はＰＵ．１のみ、「ＰＣ」はＰＵ．１およびＣ／ＥＢＰアルファ、「ＰＫ」はＰＵ．１およびＫＬＦ４、「ＰＩ」はＰＵ．１およびＩＲＦ４、「ＰＣＫ」はＰＵ．１、Ｃ／ＥＢＰアルファおよびＫＬＦ４、「ＰＣＩ」はＰＵ．１、Ｃ／ＥＢＰアルファおよびＩＲＦ４、「ＰＩＫ」はＰＵ．１、ＩＲＦ４およびＫＬＦ４、「ＰＩＣＫ」はＰＵ．１、ＩＲＦ４、Ｃ／ＥＢＰアルファおよびＫＬＦ４の組み合わせの導入を示す。ＩＲＦ４を欠く場合には、ｉｃＤＣ２への分化転換がほとんど誘導されなかった。ＫＬＦ４またはＣ／ＥＢＰアルファを欠く場合には、ｉｃＤＣ２への分化転換は誘導されたものの、４転写因子すべてを導入した場合と比較して、その効率は著しく低下した。この結果から、ＭＥＦのｃＤＣ２様細胞への分化転換には、ＰＵ．１、ＫＬＦ４、ＩＲＦ４およびＣ／ＥＢＰアルファの４転写因子すべてを組み合わせて導入することが必要であることが示された。

次いで、Ｃ／ＥＢＰの他のファミリー：Ｃ／ＥＢＰベータ（ＲｅｆＳｅｑＩＤ：ＮＭ＿００９８８３、配列番号１３）、Ｃ／ＥＢＰデルタ（ＲｅｆＳｅｑＩＤ：ＮＭ＿００７６７９、配列番号１４）およびＣ／ＥＢＰイプシロン（ＲｅｆＳｅｑＩＤ：ＮＭ＿２０７１３１、配列番号１５）による分化転換効率を比較した。上記１と同様の手順により、各Ｃ／ＥＢＰファミリーを発現するレトロウイルスベクターを調製し、ＰＵ．１、ＫＬＦ４およびＩＲＦ４と組み合わせてＭＥＦに導入し、分化転換効率を評価した。その結果、Ｃ／ＥＢＰベータはＣ／ＥＢＰアルファと同等の分化転換効率を示したが、Ｃ／ＥＢＰデルタまたはＣ／ＥＢＰイプシロンでは分化転換効率が低下した（データは省略）。これらの結果から、ＭＥＦのｃＤＣ２様細胞への分化転換には、ＰＵ．１、ＫＬＦ４、ＩＲＦ４およびＣ／ＥＢＰアルファまたはＣ／ＥＢＰベータの組み合わせが最適であることが結論づけられた。

＜５．４転写因子のレンチウイルスベクターからのポリシストロニック発現によるＭＥＦのｃＤＣ２様細胞への分化転換＞
ＰＵ．１、ＫＬＦ４、ＩＲＦ４およびＣ／ＥＢＰアルファの４転写因子を２Ａペプチドにより接続した融合遺伝子をＦＵＷ－ｔｅｔＯ－ＭＣＳベクター（Ｈｏｃｋｅｍｅｙｅｒｅｔａｌ．，ＣｅｌｌＳｔｅｍＣｅｌｌ，２００８）にサブクローニングし、テトラサイクリン応答因子（ＴＲＥ）プロモーター制御下に４転写因子をポリシストロニックに発現するベクター構築物を作製した（図１０）。作製したベクターを、ｐＭＤ２．Ｇ（Ａｄｄｇｅｎｅ、ｐｌａｓｍｉｄ＃１２２５９）およびｐｓＰＡＸ２（Ａｄｄｇｅｎｅ、ｐｌａｓｍｉｄ＃１２２６０）とともにＨＥＫ２９３細胞に導入し、レンチウイルス粒子を作製した。上記１と同様の手順によりウイルス濃縮液を調製し、－８０℃で保存した。また、上記融合遺伝子に代えて、ＰＵ．１、ＫＬＦ４、ＩＲＦ４またはＣ／ＥＢＰアルファの各遺伝子を用いて、同様の手順により、各転写因子についてのレンチウイルス粒子を作製した。ＭＥＦを２４ウェルプレートに播種し（１ウェルあたり４×１０⁴細胞）、翌日に１ウェルあたり１００μＬのウイルス懸濁液を加えた。翌日、１μｇ／ｍＬのドキシサイクリン（シグマアルドリッチ）を加え、１日おきに培地を交換した。１３日後、上記１と同様の手順により、マーカーの発現を観測した。

４転写因子を個別のベクターにより導入した結果を図１１に、ポリシストロニックベクターにより導入した結果を図１２に示す。いずれの場合にも、ドキシサイクリンの添加（Ｄｏｘ＋）によりｉｃＤＣ２が得られたことが確認された。

＜６．４転写因子によりｃＤＣ２様細胞へと分化転換される出発細胞の検討＞
４転写因子の導入によりｃＤＣ２様細胞へと分化転換され得る出発細胞の種類を調べるために、ＭＥＦに代えて、マウスメラノーマ細胞株Ｂ１６Ｆ１（理研）、マウス肺がん細胞株３ＬＬ（医薬基盤研）、マウス乳がん細胞株ｅ０７７１（ＣＨ３ＢｉｏＳｙｓｔｅｍｓ）、マウスリンパ腫細胞株ＥＬ４（理研）、成体マウス尾端線維芽細胞（ＴＴＦ）およびマウス脂肪由来間葉系幹細胞（ＡＤ－ＭＳＣ）を用いて、上記１と同様に解析した。ＴＴＦは、常法（Ｔａｋａｈａｓｈｉｅｔａｌ．，Ｎａｔ．Ｐｒｏｔｏｃｏｌ，２００７）により、Ｃ５７ＢＬ／６マウスから調製した。ＡＤ－ＭＳＣは、Ｃ５７ＢＬ／６マウスから単離された白色脂肪組織をコラゲナーゼ溶液（１００Ｕ／ｍＬコラゲナーゼ（Ｗａｋｏ）および５％ＦＣＳを含むＲＰＭＩ１６４０培地）により消化し、その中から接着細胞を取得することにより調製した。いずれの細胞も、１０％ＦＣＳ含有ＤＭＥＭ中で培養した。

その結果、ＴＴＦおよびＡＤ－ＭＳＣは、ｃＤＣ２様細胞へと分化転換された一方、Ｂ１６Ｆ１、３ＬＬ、ｅ０７７１およびＥＬ４は、ｃＤＣ２様細胞へと分化転換されなかった（データは省略）。この結果から、４転写因子の導入によるｃＤＣ２様細胞の生成には線維芽細胞および線維芽細胞様細胞を使用し得ることが示された。

＜７．ヒト転写因子によるヒト線維芽細胞のｃＤＣ２様細胞への分化転換＞
マウスＰＵ．１遺伝子のコード配列（配列番号１）、ＫＬＦ４遺伝子のコード配列（配列番号２）、ＩＲＦ４遺伝子のコード配列（配列番号３）およびＣ／ＥＢＰアルファ遺伝子のコード配列（配列番号４）に代えて、ヒトＰＵ．１遺伝子のコード配列（ＲｅｆＳｅｑＩＤ：ＮＭ＿００３１２０、配列番号５）、ＫＬＦ４遺伝子のコード配列（ＲｅｆＳｅｑＩＤ：ＮＭ＿００４２３５、配列番号６）、ＩＲＦ４遺伝子のコード配列（ＲｅｆＳｅｑＩＤ：ＮＭ＿００２４６０、配列番号７）およびＣ／ＥＢＰアルファ遺伝子のコード配列（ＲｅｆＳｅｑＩＤ：ＮＭ＿００４３６４、配列番号８）を用いて、上記１と同様の手順によりレトロウイルスを調製した。ＭＥＦに代えてヒト線維芽細胞株ＭＲＣ－５（ＡＴＣＣ）を用いて、感染から１３日後に、上記１と同様の手順によりマーカーの発現を観測した。

結果を図１３～１５に示す。４転写因子の導入により、ＣＤ４５＋ＣＤ１１ｂ＋細胞が得られた（図１３、ＭＲＣ－５＋４ＴＦ）。また、ＣＤ４５＋ＣＤ１１ｂ＋細胞では、ＣＤ４５－ＣＤ１１ｂ－細胞と比べて、ＨＬＡ－ＤＲおよびＣＤ１１ｃの発現が亢進していた（図１４、１５）。同様に、ＭＲＣ－５に代えてヒト不死化ＡＤ－ＭＳＣ株ＳＣＲＣ－４０００（ＡＴＣＣ）を用いた場合にも、ＣＤ４５＋ＣＤ１１ｂ＋ＨＬＡ－ＤＲ＋ＣＤ１１ｃ＋細胞が観測された（データは省略）。これらの結果から、ヒトＰＵ．１、ＫＬＦ４、ＩＲＦ４およびＣ／ＥＢＰアルファの４転写因子により、ヒト線維芽細胞または線維芽細胞様細胞からｉｃＤＣ２を生成できることが示された。

一方、ＭＲＣ－５に代えて、ヒト肺上皮細胞株Ａ５４９（理研）、ヒト膵がん細胞株Ｃａｐａｎ－１（ＡＴＣＣ）、ヒト子宮頸部がん細胞株ＨｅＬａ（ＡＴＣＣ）を用いて同様の解析を行ったところ、ＣＤ４５＋ＣＤ１１ｂ＋ＨＬＡ－ＤＲ＋ＣＤ１１ｃ＋細胞は観測されなかった（データは省略）。

＜８．４転写因子により分化転換されたｃＤＣ２様細胞による獲得免疫応答の誘導＞
上記１の手順によりＭＥＦに４転写因子を導入し、得られたｃＤＣ２様細胞の抗原提示能を調べた。ＯＴ－ＩＩマウス（ニワトリオバルブミン３２３－３３９エピトープ特異的Ｔ細胞受容体トランスジェニックマウス）から脾臓を回収し、コラゲナーゼバッファー中で消化後、スライドグラスですりつぶして脾細胞を回収した。ＣＤ４＋ＴＣｅｌｌＩｓｏｌａｔｉｏｎＫｉｔ，ｍｏｕｓｅ（ＭｉｌｔｅｎｙｉＢｉｏｔｅｃＩｎｃ．）を用い、キットの説明書にしたがって脾細胞集団からＣＤ４陽性Ｔ細胞を単離した。４転写因子を導入したＭＥＦ、ＡＤ－ＭＳＣ、もしくは３Ｔ３法（ＴｏｄａｒｏａｎｄＧｒｅｅｎ，Ｊ．ＣｅｌｌＢｉｏｌ，１９６２）により調製した不死化マウス胎児線維芽細胞（以下、「３Ｔ３」と記載する）；ＭＥＦ（陰性対照）；またはＧＭ－ＤＣ（陽性対照）（それぞれ２×１０⁴個）と、２×１０⁴個のＣＤ４陽性Ｔ細胞とを混合し、または何も混合せず（ｍｏｃｋ、陰性対照）、丸底９６ウェルプレートに播種した。ＣＤ４陽性Ｔ細胞に対しては１０μｇ／ｍＬのニワトリオバルブミン３２３－３３９ペプチドを添加し、または添加せずに、７日間培養した。ＦＡＣＳＶｅｒｓｅ（ＢＤＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）により、全細胞数、ＣＤ３イプシロン陽性細胞数、およびＣＤ６９の発現を観測した。

結果を図１６および１７に示す。４転写因子を導入したＭＥＦ（ＭＥＦ＋４ＴＦ）とＴ細胞とを混合した細胞集団、４転写因子を導入したＭＳＣ（ＭＳＣ＋４ＴＦ）とＴ細胞とを混合した細胞集団、および、４転写因子を導入した３Ｔ３（３Ｔ３＋４ＴＦ）とＴ細胞とを混合した細胞集団では、ＣＤ３イプシロン陽性細胞数が増加しており、Ｔ細胞が増加していることが確認された（図１６）。また、４転写因子を導入したＭＥＦ（ＭＥＦ＋４ＴＦ）とＴ細胞とを混合した細胞集団において、活性化Ｔ細胞マーカーＣＤ６９の発現が増加したことも確認された（図１７）。この結果から、４転写因子によりＭＥＦから分化転換されたｃＤＣ２様細胞が抗原提示能を有するものであることが示された。

＜９．４転写因子により分化転換されたｃＤＣ２様細胞によるがんマウスモデルにおける抗腫瘍免疫応答の誘導＞
４転写因子により分化転換されたｃＤＣ２様細胞をがん抗原によりパルスし、ＤＣワクチンとして使用することができるかどうかを、がんマウスモデルを用いて評価するための手順を以下に示す。

（９－１）担がんモデルマウスの作製
Ｂ１６Ｆ１メラノーマ細胞（１×１０⁶個）をＣ５７ＢＬ／６マウスの皮下に移植した。１週間後に腫瘍サイズを計測し、当該マウスを担がんモデルとして使用した。

（９－２）パルスｃＤＣ２様細胞の調製および投与
上記１と同様の手順にしたがって４転写因子を導入することにより、Ｃ５７ＢＬ／６ＣＤ４５．１マウス由来の線維芽細胞からｃＤＣ２様細胞を誘導した。ｃＤＣ２様細胞に対してＢ１６Ｆ１メラノーマ細胞ライセートを負荷し、１６時間培養した。その後、ｃＤＣ２様細胞を、上記担がんモデルマウスに静脈内投与し、１週間ごとに腫瘍サイズを計測した。

結果を図１８に示す。図中、「ｄａｙｓ」は、Ｂ１６Ｆ１メラノーマ細胞の皮下移植からの日数を示す。４転写因子を導入したＭＥＦ（ＭＥＦ＋４ＴＦ）を投与した群および何も投与していない群（ｍｏｃｋ、陰性対照）における腫瘍サイズを計測し比較したところ、皮下移植後２１日（すなわち、ＭＥＦ＋４ＴＦ投与後１４日）の時点で有意差が見られた（ｐ＜０．０５、Ｓｔｕｄｅｎｔのｔ検定）。この結果から、４転写因子によりＭＥＦから分化転換されたｃＤＣ２様細胞が、がん縮小作用を有するものであることが示された。

Claims

線維芽細胞または線維芽細胞様細胞から従来型２型樹状細胞（ｃＤＣ２）様細胞を生成するための方法であって、ＰＵ．１をコードする核酸、ＫＬＦ４をコードする核酸、ＩＲＦ４をコードする核酸およびＣ／ＥＢＰをコードする核酸を前記線維芽細胞または線維芽細胞様細胞に導入するステップを含み、前記ｃＤＣ２様細胞が、ＣＤ４５＋、ＣＤ１１ｂ＋、ＣＤ１１ｃ＋、ＭＨＣクラスＩＩ＋であり、かつ、ＣＤ１１５、Ｌｙ６ＣおよびＭｅｒＴＫをさらに発現する、方法。
前記Ｃ／ＥＢＰが、Ｃ／ＥＢＰアルファまたはＣ／ＥＢＰベータである、請求項１に記載の方法。
前記線維芽細胞または線維芽細胞様細胞が、がん関連線維芽細胞である、請求項１または２に記載の方法。
前記線維芽細胞または線維芽細胞様細胞が、間葉系幹細胞である、請求項１または２に記載の方法。
ＰＵ．１をコードする核酸、ＫＬＦ４をコードする核酸、ＩＲＦ４をコードする核酸およびＣ／ＥＢＰをコードする核酸を含んでなる、線維芽細胞または線維芽細胞様細胞を従来型２型樹状細胞様細胞へと分化転換するための組成物であって、前記ｃＤＣ２様細胞が、ＣＤ４５＋、ＣＤ１１ｂ＋、ＣＤ１１ｃ＋、ＭＨＣクラスＩＩ＋であり、かつ、ＣＤ１１５、Ｌｙ６ＣおよびＭｅｒＴＫをさらに発現する、組成物。
前記Ｃ／ＥＢＰが、Ｃ／ＥＢＰアルファまたはＣ／ＥＢＰベータである、請求項５に記載の組成物。