JP7813038B2 - 効率的な人工多能性幹細胞の作製方法 - Google Patents

Description

本発明は、体細胞の核初期化工程において、転写エンハンサー関連ドメインファミリーメンバー-3（以下、「TEAD3」ともいう）の機能を阻害することによる、人工多能性幹（iPS）細胞の樹立効率の改善方法、並びにTEAD3の機能阻害物質を含んでなるiPS細胞の樹立効率改善剤に関する。本発明はまた、体細胞に核初期化物質及びTEAD3の機能阻害物質を導入することによる、iPS細胞の製造方法に関する。

山中因子（Oct3/4、Sox2、Klf4（及びc-Myc））等の核初期化因子により駆動される体細胞初期化は、細胞を初期化し、それらをiPS細胞にまで脱分化させるために、体細胞としての固有性を守る強力な転写因子群を克服しなければならない。iPS細胞樹立効率を改善するために、初期化バリアの役割を担う鍵因子を同定することに焦点を当てた研究が数多くなされてきた。それにもかかわらず、初期化は依然として効率の低いプロセスである。

体細胞初期化プロセスは、大きく開始、安定化及び成熟化段階に分けることができ、転写ネットワークの大きな変化を含む複数の生物学的プログラムの実行と共役している。p53は初期化の重要な障壁として働くことが広く知られている。実際、マウスやヒトの線維芽細胞で、p53の下方制御によりiPSコロニー数が顕著に増大することが分かっている（例えば、特許文献１、非特許文献１を参照）。しかし、p53はDNA損傷に応答する無制御な細胞増殖に対する防御機構として働くので、p53経路の下方制御はゲノムの不安定性を生じ、安全性に問題があると指摘する向きもある。非組込み型プラスミドを用いた一過的なp53抑制は、iPS細胞樹立効率を改善するより安全な方法を提供する（例えば、非特許文献２を参照）。

本発明者らは以前、体細胞の核初期化工程において、p38の機能を阻害することによりiPS細胞の樹立効率を改善し得ることを報告した（特許文献２）。しかしながら、そのメカニズムは未だよく理解されていない。

国際公開第2009/157593号公報 国際公開第2012/036299号公報

Hong, H. et al. (2009) Nature 460, 1132-1135. Okita, K. et al. (2011) Nat Methods 8,409-412.

本発明の目的は、体細胞の初期化バリアとなる新規な鍵因子を同定し、当該因子を制御することにより初期化バリアを無効化して、iPS細胞の樹立効率を改善することである。

本発明者らは、上記の目的を達成すべく、p38 MAPK阻害薬の役割を体系的に調べ、p38阻害は、ヒトiPS細胞樹立効率を、初期化の開始段階と安定化段階の両方で劇的に改善し得ることを見出した。
本発明者らはまた、初期化過程でp38経路とp53経路の両方を二重阻害した場合、各経路を単独で阻害した場合よりも、iPSコロニーの形成効率がさらに増大することを見出した。そして二重阻害した場合に発現が顕著に下方制御される遺伝子群の中から、当該発現抑制により前記二重阻害した場合と同等のiPS細胞樹立効率改善効果を奏し得る遺伝子としてTEAD3を見出し、本発明を完成させるに至った。

即ち、本発明は以下の通りのものである。
［１］人工多能性幹（iPS）細胞の樹立効率の改善方法であって、体細胞の核初期化工程において転写エンハンサー関連ドメインファミリー メンバー-3（TEAD3）の機能を阻害することを含む、方法。
［２］以下の（ａ）～（ｃ）：
（ａ）TEAD3遺伝子の転写産物に対してRNAi活性を有する核酸もしくはその前駆体；
（ｂ）TEAD3遺伝子の転写産物に対するアンチセンス核酸；及び
（ｃ）TEAD3遺伝子の転写産物に対するリボザイム核酸
のいずれかの核酸を体細胞に導入することによりTEAD3の機能を阻害する、［１］に記載の方法。
［３］TEAD3のドミナントネガティブ変異体又はそれをコードする核酸を体細胞に導入することによりTEAD3の機能を阻害する、［１］に記載の方法。
［４］体細胞においてTEAD3の転写共役因子を阻害することによりTEAD3の機能を阻害する、［１］に記載の方法。
［５］以下の（ａ）又は（ｂ）：
（ａ）TEAD3に対するデコイ核酸；
（ｂ）rrrcwwgyyynnnnnnnnnnnnnrrrcwwgyyy（rはa又はg、wはa又はt、yはc又はtを表し、nはそれぞれ独立して、存在しないか、a、g、t又はcを表す；配列番号３）で表されるヌクレオチド配列を含むオリゴ核酸
を体細胞に導入することによりTEAD3の機能を阻害する、［１］に記載の方法。
［６］TEAD3の機能阻害物質を含有してなる、iPS細胞の樹立効率改善剤。
［７］前記阻害物質が、以下の（ａ）～（ｃ）：
（ａ）TEAD3遺伝子の転写産物に対してRNAi活性を有する核酸もしくはその前駆体；
（ｂ）TEAD3遺伝子の転写産物に対するアンチセンス核酸；及び
（ｃ）TEAD3遺伝子の転写産物に対するリボザイム核酸
のいずれかの核酸である、［６］に記載の剤。
［８］前記阻害物質が、TEAD3のドミナントネガティブ変異体又はそれをコードする核酸である、［６］に記載の剤。
［９］前記阻害物質が、TEAD3の転写共役因子の阻害物質である、［６］に記載の剤。
［１０］前記阻害物質が、下の（ａ）又は（ｂ）：
（ａ）TEAD3に対するデコイ核酸；
（ｂ）rrrcwwgyyynnnnnnnnnnnnnrrrcwwgyyy（rはa又はg、wはa又はt、yはc又はtを表し、nはそれぞれ独立して、存在しないか、a、g、t又はcを表す；配列番号３）で表されるヌクレオチド配列を含むオリゴ核酸
である、［６］に記載の剤。
［１１］体細胞に核初期化物質及びTEAD3の機能阻害物質を接触させることを含む、iPS細胞の製造方法。
［１２］前記阻害物質が、以下の（ａ）～（ｃ）：
（ａ）TEAD3遺伝子の転写産物に対してRNAi活性を有する核酸もしくはその前駆体；
（ｂ）TEAD3遺伝子の転写産物に対するアンチセンス核酸；及び
（ｃ）TEAD3遺伝子の転写産物に対するリボザイム核酸
のいずれかの核酸である、［１１］に記載の方法。
［１３］前記阻害物質が、TEAD3のドミナントネガティブ変異体又はそれをコードする核酸である、［１１］に記載の方法。
［１４］前記阻害物質が、TEAD3の転写共役因子の阻害物質である、［１１］に記載の方法。
［１５］前記阻害物質が、下の（ａ）又は（ｂ）：
（ａ）TEAD3に対するデコイ核酸；
（ｂ）rrrcwwgyyynnnnnnnnnnnnnrrrcwwgyyy（rはa又はg、wはa又はt、yはc又はtを表し、nはそれぞれ独立して、存在しないか、a、g、t又はcを表す；配列番号３）で表されるヌクレオチド配列を含むオリゴ核酸
である、［１１］に記載の方法。
［１６］核初期化物質がOct3/4、Klf4及びSox2、又はそれらをコードする核酸である、［１１］～［１５］のいずれかに記載の方法。
［１７］核初期化物質がOct3/4、Klf4、Sox2、及びc-Myc、L-MycもしくはN-Mycであるか、あるいはそれらをコードする核酸である、［１１］～［１５］のいずれかに記載の方法。

本発明によれば、体細胞からのiPS細胞の樹立効率を顕著に改善することができる。

マウスiPS細胞樹立に及ぼす低分子p38阻害薬の効果を示す図である。Ａ．インビトロでMEF初期化効率を変化させると証明された濃度での、７つの化合物（VC-10μg/mL；VA-1.9mM；CH-3μM；PD-0.5μM；IL-0.2ng/mL；AS-5μM；RA-1μM）に対するp38阻害薬（SB202190；10μM）の効果を調べるべく、iPS細胞コロニー形成アッセイを行った。多能性のレポーターである最終的なエフェクターとしてのNanog-GFPカセットとともにベクター中に挿入された4因子（4F；Oct3/4、Sox2、Klf4とc-Myc）を異所的に発現させた初代MEFについて、初期化の誘導を個別にアッセイした。各化合物の単剤処理による初期化効率を評価するために、21日後（Day21）（左のバー）と28日後（Day28）（右のバー）にGFP陽性（GFP⁺）コロニー数を計測し、4F導入陰性コントロ－ル（DM）のGFP陽性コロニー数と比較した。Ｂ．4通り（A～D）のSB202190処理のプロトコールを模式的に示す。時間軸は、MEFに4因子が導入された日をDay0とし、各処理が施された期間を示す（A：Day1～4、B：Day1～8、C：Day8～16、D：Day1～16）。Ｃ．Day21とDay28に各処理による初期化効率を調べ、4Fとp38阻害薬（SB202190）により誘導されたiPS細胞コロニーの数（下のバー）を、ベヒクル（DMSO）で処理し4Fのみにより誘導されたiPS細胞コロニーの数（上のバー）と比較した。Ｄ．期間ＡにSB202190処理した実験群について、Day21とDay 28との間のGFP⁺コロニー数の差を示すフォールプロット。Ｅ．期間ＡにSB202190処理した実験群と、期間ＤにSB202190処理した実験群との間の、Day21及びDay28におけるGFP⁺コロニー数の差を示すフォールプロット。 ヒトiPS細胞樹立に及ぼす低分子p38阻害薬の効果を示す図である。Ａ．4通り（期間Ａ～Ｄ）のp38阻害薬処理のプロトコールを模式的に示す。時間軸は、HDFに4因子が導入された日をDay0とし、各処理が施された期間を示す（Ａ：Days2～4、Ｂ：Days6～20、Ｃ：Days20～32、Ｄ：Days6～32）。Ｂ．iPS細胞コロニー形成アッセイにより、HDFの初期化効率に及ぼすp38阻害薬の効果を調べた。4因子（4F；Oct3/4、Sox2、Klf4及びc-Myc）を異所的に発現させた初代HDFを、10μMのSB202190、SB203580又はSB239063により期間Ａ又は期間Ｄのプロトコールで処理した。Day16、Day24、及びDay32に初期化効率を、ES細胞様（iPS細胞）のコロニー数としてカウントし、p38阻害薬で処理せず4Fのみで初期化されたHDF（DMSO）と比較した。期間Ａに阻害剤処理した結果を左のグラフに、期間Ｄに阻害剤処理した結果を右のグラフにそれぞれ示す。各日数において、上から順にSB239063、SB203580、SB202190、DMSO処理の結果を示す。^＊p<0.05、^＊＊p<0.01Ｃ．4F+SB202190によりHDFから誘導されたヒトES細胞様コロニーの位相差画像を示す。Ｄ．4Fのみ（DMSO）又は4F+SB202190（SB202190）によりHDFから誘導されたiPS細胞におけるアルカリホスファターゼ染色アッセイ。Ｅ．4F+SB202190によりHDFから誘導されたiPS細胞コロニーにおける多能性マーカー（OCT4、SOX2及びTRA-1-60）の代表的な免疫組織化学染色画像（右パネル）。左パネルはDAPIによる核染色を示す。スケールバー：100μmＦ．iPS細胞コロニー形成アッセイにより、3因子（3F；Oct3/4、Sox2及びKlf4）導入によるHDFの初期化効率に及ぼすp38阻害薬（SB202190）の効果を調べた。Day24（下）及びDay32（上）における初期化効率を、ES細胞様の（iPS細胞）コロニー数として計測し、3F+SB202190によりHDFから誘導されたiPS細胞コロニーの数（各Daysにおける上のバー）を、3Fとベヒクル（DMSO）により誘導されたiPS細胞コロニーの数（各Daysにおける下のバー）と比較した。^＊p<0.05Ｇ．iPS細胞コロニー形成アッセイにより、エピソーマルベクター（pCXLE）を介した初期化因子導入によるHDFの初期化効率に及ぼすp38阻害薬（SB202190）の効果を調べた。Day24（下）及びDay32（上）における初期化効率を、ES細胞様の（iPS細胞）コロニー数として計測し、初期化因子+SB202190によりHDFから誘導されたiPS細胞コロニーの数（各Daysにおける上のバー）を、初期化因子とベヒクル（DMSO）により誘導されたiPS細胞コロニーの数（各Dayにおける下のバー）と比較した。^＊p<0.05、^＊＊＊p<0.001 低分子p38阻害薬を用いて樹立したヒトiPS細胞における多能性及びゲノム安定性を示す図である。Ａ．体細胞初期化の指標である多能性遺伝子（OCT4、SOX2、NANOG）発現のqRT-PCR解析。ES細胞での発現レベルを1とした相対値で示す。SB1～SB3：SB202190処理により誘導されたヒトiPS細胞クローン；DM, B7：4Fのみにより誘導されたヒトiPS細胞クローン；ES：ヒトES細胞；HD：HDF。Ｂ．SB202190処理により誘導されたヒトiPSCクローンの核型解析。Ｃ．SB202190処理により誘導されたヒトiPSCクローンのインビトロ分化能アッセイ。左から順に、胚様体（EB）、外胚葉系列（β-III-チューブリン陽性）、中胚葉系列（α-SMA陽性）及び内胚葉系列（AFP陽性）への分化を示す。核はHoechst 33342で染色した。スケールバー：100μmＤ．SB202190処理により誘導されたヒトiPSCクローンのテラトーマ形成アッセイ。左図は三胚葉（外胚葉、中胚葉、及び内胚葉）系列の模式図である。染色写真は左から順に、外胚葉系列、中胚葉系列、及び内胚葉系列への分化を示す。Ｅ．左図：4人の異なるドナー由来のHDF（HDF1616、HDF1079、HDF1078及びTig109）から、4F導入とp38阻害薬（SB202190）処理とにより誘導されたiPS細胞コロニーの数（各HDFについて上のバー）と、4F導入とベヒクル（DMSO）処理により誘導されたiPS細胞コロニーの数（各HDFについて下のバー）とを、iPS細胞コロニー形成アッセイにより比較した。右図：4人のドナーからの結果に基づくiPS細胞コロニー形成効率の統計学的解析（t検定による；^＊p<0.05）。 p38及び／又はp53阻害により樹立したヒトiPS細胞におけるトランスクリプトーム解析の結果を示す図である。Ａ．4Fのみで初期化したHDF（DMSO）と、4Fとともにp53 shRNAを導入して初期化したクロ－ン（shp53）におけるp53 mRNAレベルの比較。前者の発現レベルを1とした相対値で示す。^＊＊＊p<0.001Ｂ．HDFから、4F導入とp53阻害（shp53）及び／又はp38阻害（SB202190）とにより誘導されたiPS細胞コロニーの数と、4F導入とベヒクル処理（DMSO）とにより誘導されたiPS細胞コロニーの数とを、iPS細胞コロニー形成アッセイにより比較した。^＊＊p<0.01、^＊＊＊p<0.001Ｃ．4つの群で発現した58,000を上回る遺伝子についての、iPSCコロニー数増加（△）と相関する主要成分解析（PCA）。Ｄ．上図：サンプルの凝集型階層的クラスタリング。サンプル間の距離はマンハッタン距離を適用してagnes関数を用いて樹形図を作成した。下図：mRNAデータのコンセンサスクラスタリングにより得られた、トランスクリプトームの差を示すサンプル相関マトリクス。Ｅ．k-平均アルゴリズムを用いたクラスタリング結果のスキャタープロット。Ｆ．発現量変動遺伝子（DEG）解析のヒートマップ。クラスターAとCの間の1147 DEG（左）及びクラスターAとBの間の2185 DEG（右）を示す。 p38経路及びp53経路の両方を阻害した場合に特異的に発現量が低下する遺伝子群の探索結果を示す図である。Ａ．4F導入とともに、p53を単独で阻害した場合（shp53）と、p53とp38とを二重阻害した場合（shp53+SB202190）とで、HDFと比べてiPS細胞で発現量が低下した遺伝子（DEG）を抽出・比較した。二重阻害した場合にのみ発現量が低下したDEGが651個見つかった（上）。そのうち発現量が2倍以上低下したDEGは149個であった（下）。Ｂ．4F導入とともに、p38を単独で阻害した場合（SB202190）と、p53とp38とを二重で阻害した場合（shp53+SB202190）とで、HDFと比べてiPS細胞で発現量が低下した遺伝子（DEG）を抽出・比較した。二重阻害した場合にのみ発現量が低下したDEGが1056個見つかった（上）。そのうち発現量が2倍以上低下したDEGは145個であった（下）。Ｃ．p53単独阻害に比べてp53/p38二重阻害でのみ発現量が低下した651遺伝子と、p38単独阻害に比べてp53/p38二重阻害でのみ発現量が低下した1056遺伝子との間の重複を調べた。340遺伝子の重複を認めた。Ｄ．Ｃで抽出された340遺伝子中31遺伝子が、転写因子又はDNA結合活性があるものと分類された。Ｅ．p53/p38二重阻害で共通して発現量が低下したDEGの生物的プロセスに関する顕著なGOタームの解析。 ヒトiPS細胞樹立に及ぼすTEAD3阻害の効果及びKlf4によるTEAD3遺伝子の転写制御を示す図である。Ａ．HDFに4Fを導入した場合（DMSO）、あるいは、4F導入とともに、p38を単独で阻害した場合（p382KO）、p53を単独で阻害した場合（shp53）及びp53とp38とを二重で阻害した場合（shp53+p382KO）における、TEAD3の相対的な発現レベルを示す。X軸の+100はDMSOの発現量を示し、X軸の-100は発現なしを示す。例えばX軸の-75はDMSOの0.125倍の発現量を示す。破線矢印はその方向にiPS細胞コロニー数が増加することを示す。Ｂ．2種のHDF（HDF1616、HDF1079）に、4Fのみ（4F）、4Fと非特異的shRNA（Scr）、4Fと2種のTEAD3 shRNA（4F-shTEAD3#1及び4F-shTEAD3#2）を導入した場合の、TEAD3タンパク質の発現を示す。いずれのHDFでも、2種のTEAD3 shRNAによりTEAD3タンパク質の発現は顕著に抑制された。Ｃ．2種のHDF（HDF1616、HDF1079）に、4Fのみ（4F）、4Fと非特異的shRNA（Scr）、4Fと2種のTEAD3 shRNA（4F-shTEAD3#1及び4F-shTEAD3#2）を導入した場合の、TEAD3 mRNAの発現を示す。いずれのHDFでも、2種のTEAD3 shRNAによりTEAD3 mRNAの発現は顕著に抑制された。^＊＊p<0.01、^＊＊＊p<0.001Ｄ．2種のHDF（HDF1616、HDF1079）に、4Fのみ（4F）、4Fと非特異的shRNA（Scr）、4Fと2種のTEAD3 shRNA（4F-shTEAD3#1及び4F-shTEAD3#2）を導入した場合の、得られたiPS細胞コロニーの数を示す。^＊p<0.05、^＊＊p<0.01Ｅ．HDFに、4Fのみ（4F）、4Fと非特異的shRNA（Scr）、4Fと2種のTEAD3 shRNA（4F-sh#1及び4F-sh#2）を導入した場合の、得られたiPS細胞コロニーのアルカリホスファターゼ染色像（左：ディッシュ全体；右：拡大写真）を示す。Ｆ．MEFの初期化プロセスの間の、初期フェーズ（day 2及びday 4）、中間フェーズ（day 8）、後期フェーズ（day 18）及びiPSCにおけるTEAD3発現の変化を示す。Ｇ．MEFの初期化プロセスの間の、SSEA1陽性及びSSEA1陰性細胞におけるTEAD3発現の変化を示す。Ｈ．KLF4が結合することが予測されるTEAD3遺伝子の転写開始サイト（TSS）配列、並びにその相対的結合スコアを示す。Ｉ．KLF4が結合することが既知の標的遺伝子群の結合シスエレメント配列の解析によるKLF4の結合コンセンサス配列の予測を示す。 Ａ．マウスiPS細胞（20D17；初期細胞密度：1×10⁵細胞/ウェル）の、SB202190処理から96時間後の細胞数を示す（^**：p<0.01；DMSOとの比較）。Ｂ．SB202190処理により得られたマウスiPS細胞は、茶色のコートカラーのキメラマウスを生じることを示す。Ｃ．SB202190処理により得られたマウスiPS細胞由来のマウスにおいてジャームライントランスミッションが起こったことを示す。 p38阻害はHDFや初期化の初期フェーズのHDFの増殖を促進するが、ヒトiPS細胞の増殖には影響しないことを示す。Ａ．HDFを1×10⁵細胞/ウェルの密度で6-ウェルプレートに播種し、3種のp38阻害剤をそれぞれ添加して96時間培養した。処理後2、4、6及び8日目に総細胞数をカウントした。独立した3回の実験の結果を平均値及び標準偏差で示す（^*：p<0.05；DMSOとの比較）。Ｂ．4Fを導入したHDFを、3種のp38阻害剤をそれぞれ添加して96時間培養した。処理後2、4、6及び8日目に総細胞数をカウントした。独立した3回の実験の結果を平均値及び標準偏差で示す（^*：p<0.05；DMSOとの比較）。Ｃ．ヒトiPS細胞（201B7）を2×10⁵細胞/ウェルの密度でSNLフィーダー細胞上に播種し、3種のp38阻害剤をそれぞれ添加して96時間培養した。処理後4日目に総細胞数をカウントした。独立した3回の実験の結果を平均値及び標準偏差で示す。 公共に利用可能なデータセット（MEFのトランスクリプトームデータを含むGSE36664、ヒト肺線維芽細胞（HLF）のトランスクリプトームデータを含むGSE45276、並びにHDFのトランスクリプトームデータを含むデータセット）における、TEAD3発現とp53発現との相関を示す（R：ピアソンの相関係数）。 公共に利用可能なHDFのシングルセルRNA-Seqのデータセットにおける、TEAD3発現とp38δ、ERK4、p44-ERK1、CDK4及びCDK6発現との各相関を示す（R：ピアソンの相関係数）。 HeLa細胞における腫瘍の初期化及び細胞周期カイネティクスにおけるTEAD3の因果的役割の評価を示す図である。まず、レトロウイルス感染を可能にすべくエコトロピック受容体Slc7a1を発現する娘細胞株（plenti/Ubc-Slc7a1）作製し、shTEAD3をレトロウイルスにより導入した。TEAD3発現が下方制御されたクローンは、細胞増殖が促進され、より大きなサイズの腫瘍様塊をより多く産生したことから、TEAD3は、がんを生じる細胞特性を増強させることで子宮頸がんの進展に因果的役割を果たしていることが示唆された（^*：p<0.05, ^**：p<0.01；Scr（非特異的shRNAを導入したHeLa細胞）との比較）。 ヒト子宮頸がんデータセットGSE6791（Cancer Res 2007 May 15;67(10):4605-19.参照）におけるTEAD3発現解析を示す。左：正常（N）及びがん（T）組織サンプルにおける補正後のTEAD3 mRNAレベルを箱ひげ図で示す。右：箱ひげ図に示されたGSE691データ中の患者をTEAD3発現レベルの増加に応じて個別に分類した。 Ａ．HDF1616に4F（scr）又は4F+shTEAD3を導入後12日目の推定iPS細胞コロニー（四角）の代表的な明視野像を示す。Ｂ．HDF1079に4F+shTEAD3を導入後12日目の推定iPS細胞コロニー（四角）の代表的な明視野像を示す。Ｃ．4F（Scr）、4F+shTEAD3、又は4F+shTEAD3+shp53を導入され初期化途上のHDF1616の増殖曲線を示す（^*：p<0.05；Scr（4F+非特異的shRNAを導入したHDF1616）との比較）。Ｄ．HDF1616に4F（Scr）、4F+shTEAD3、又は4F+shTEAD3+shp53を導入して樹立したiPS細胞の増殖曲線を示す）。Ｅ．4F（Scr）、4F+shTEAD3、又は4F+shTEAD3+shp53を導入され初期化途上のHDF1079の増殖曲線を示す（^**：p<0.01；Scr（4F+非特異的shRNAを導入したHDF1079）との比較）。Ｆ．HDF1079に4F（Scr）、4F+shTEAD3、又は4F+shTEAD3+shp53を導入して樹立したiPS細胞の増殖曲線を示す。

本発明は、体細胞の核初期化工程においてTEAD3の機能を阻害することによる、iPS細胞の樹立効率の改善方法（以下、「本発明の改善方法」ともいう）を提供する。TEAD3の機能を阻害する手段は特に制限されないが、好ましくは、体細胞にTEAD3の機能阻害物質を導入する方法が挙げられる。従って、本発明はまた、TEAD3の機能阻害物質を含んでなるiPS細胞の樹立効率改善剤（以下、「本発明の剤」ともいう）を提供する。さらに本発明は、体細胞に核初期化物質及びTEAD3の機能阻害物質を導入することによる、iPS細胞の製造方法（以下、「本発明の製法」ともいう。また、「本発明の改善方法」と「本発明の製法」とを包括して、「本発明の方法」という場合がある）を提供する。

(A) 体細胞ソース
本発明においてiPS細胞作製のための出発材料として用いることのできる体細胞は、哺乳動物（例えば、ヒト、マウス、サル、ウシ、ブタ、ラット、イヌ等）由来の生殖細胞以外のいかなる細胞であってもよく、例えば、角質化する上皮細胞（例、角質化表皮細胞）、粘膜上皮細胞（例、舌表層の上皮細胞）、外分泌腺上皮細胞（例、乳腺細胞）、ホルモン分泌細胞（例、副腎髄質細胞）、代謝・貯蔵用の細胞（例、肝細胞）、境界面を構成する内腔上皮細胞（例、I型肺胞細胞）、内鎖管の内腔上皮細胞（例、血管内皮細胞）、運搬能をもつ繊毛のある細胞（例、気道上皮細胞）、細胞外マトリックス分泌用細胞（例、線維芽細胞）、収縮性細胞（例、平滑筋細胞）、血液と免疫系の細胞（例、末梢血単核球、臍帯血、Tリンパ球）、感覚に関する細胞（例、桿細胞）、自律神経系ニューロン（例、コリン作動性ニューロン）、感覚器と末梢ニューロンの支持細胞（例、随伴細胞）、中枢神経系の神経細胞とグリア細胞（例、星状グリア細胞）、色素細胞（例、網膜色素上皮細胞）、およびそれらの前駆細胞(組織前駆細胞)等が挙げられる。細胞の分化の程度や細胞を採取する動物の齢などに特に制限はなく、未分化な前駆細胞(体性幹細胞も含む)であっても、最終分化した成熟細胞であっても、同様に本発明における体細胞の起源として使用することができる。ここで未分化な前駆細胞としては、たとえば神経幹細胞、造血幹細胞、間葉系幹細胞、歯髄幹細胞等の組織幹細胞（体性幹細胞）が挙げられる。

体細胞を採取するソースとなる哺乳動物個体は特に制限されないが、得られるiPS細胞がヒトの再生医療用途に使用される場合には、拒絶反応が起こらないという観点から、患者本人またはHLAの型が同一もしくは実質的に同一である他人から体細胞を採取することが特に好ましい。ここでHLAの型が「実質的に同一」とは、免疫抑制剤などの使用により、該体細胞由来のiPS細胞から分化誘導することにより得られた細胞を患者に移植した場合に移植細胞が生着可能な程度にHLAの型が一致していることをいう。たとえば主たるHLA(例えばHLA-A、HLA-BおよびHLA-DRの3遺伝子座）が同一である場合などが挙げられる（以下同じ）。また、ヒトに投与（移植）しない場合、例えば、患者の薬剤感受性や副作用の有無を評価するためのスクリーニング用の細胞のソースとしてiPS細胞を使用する場合には、同様に患者本人または薬剤感受性や副作用と相関する遺伝子多型が同一である他人から体細胞を採取することが望ましい。

哺乳動物から分離した体細胞は、核初期化工程に供するに先立って、細胞の種類に応じてその培養に適した自体公知の培地で前培養することができる。そのような培地としては、例えば、約5～20%の胎仔ウシ血清を含む最小必須培地（MEM）、ダルベッコ改変イーグル培地（DMEM）、RPMI1640培地、199培地、F12培地などが挙げられるが、それらに限定されない。核初期化物質及びp38の機能阻害物質（さらに必要に応じて、後述する他のiPS細胞の樹立効率改善物質）との接触に際し、例えば、カチオニックリポソームなど導入試薬を用いる場合には、導入効率の低下を防ぐため、無血清培地に交換しておくことが好ましい場合がある。

(B) TEAD3の機能阻害物質
本発明において標的分子となるTEAD3は、転写エンハンサー関連ドメイン（TEAD）ファミリーのメンバーの1つであり、この転写因子による標的遺伝子の転写活性化は、Hippoシグナル伝達経路によって核内移行が制御されるコアクチベータYAP又はTAZと結合することにより起こる。

本明細書において、「TEAD3」とは、配列番号２で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含むタンパク質である。本明細書において、タンパク質及びペプチドは、ペプチド表記の慣例に従って左端がＮ末端（アミノ末端）、右端がＣ末端（カルボキシル末端）で記載される。
「配列番号２で表されるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列」とは、
（ａ）配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるヒトTEAD3の、他の温血動物（例えば、モルモット、ラット、マウス、ニワトリ、ウサギ、イヌ、ブタ、ヒツジ、ウシ、サルなど）におけるオルソログのアミノ酸配列；又は
（ｂ）配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるヒトTEAD3もしくは上記（ａ）のオルソログの天然のアレル変異体もしくは遺伝子多型におけるアミノ酸配列
を意味する。
好ましくは、TEAD3は配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるヒトTEAD3もしくはその天然のアレル変異体もしくは遺伝子多型である。該遺伝子多型としては、例えば、dbSNPにrs35080860として登録されている、254位のThr（ACG）がMet（ATG）に置換するSNPが挙げられるが、それに限定されない。

本明細書において「TEAD3の機能阻害物質」とは、(1)TEAD3タンパク質の機能もしくは(2)TEAD3遺伝子の発現を阻害し得る限り、いかなる物質であってもよい。すなわち、TEAD3タンパク質に直接作用してその機能を阻害する物質や、TEAD3遺伝子に直接作用してその発現を阻害する物質のみならず、TEAD3による転写活性化に関与する因子に作用することにより、結果的にTEAD3タンパク質の機能やTEAD3遺伝子の発現を阻害する物質も、本明細書における「TEAD3の機能阻害物質」に含まれる。

本発明において「TEAD3遺伝子の発現を阻害する物質」とは、TEAD3遺伝子の転写レベル、転写後調節のレベル、タンパク質への翻訳レベル、翻訳後修飾のレベル等のいかなる段階で作用するものであってもよい。従って、TEAD3の発現を阻害する物質としては、例えば、TEAD3遺伝子の転写を阻害する物質（例、アンチジーン）、初期転写産物からmRNAへのプロセッシングを阻害する物質、mRNAの細胞質への輸送を阻害する物質、mRNAからタンパク質への翻訳を阻害するか（例、アンチセンス核酸、miRNA）あるいはmRNAを分解する（例、siRNA、ギャップマー型アンチセンス核酸、リボザイム、miRNA）物質、初期翻訳産物の翻訳後修飾を阻害する物質などが含まれる。いずれの段階で作用するものであっても用いることができるが、mRNAに相補的に結合してタンパク質への翻訳を阻害するかあるいはmRNAを分解する物質が好ましい。

TEAD3遺伝子のmRNAからタンパク質への翻訳を特異的に阻害する（あるいはmRNAを分解する）物質として、好ましくは、該mRNAのヌクレオチド配列と相補的なヌクレオチド配列またはその一部を含む核酸が挙げられる。
TEAD3遺伝子のmRNAのヌクレオチド配列と相補的なヌクレオチド配列とは、生理的条件下において、該mRNAの標的配列に結合してその翻訳を阻害し得る（あるいは該標的配列を切断する）程度の相補性を有するヌクレオチド配列を意味し、具体的には、例えば、該mRNAのヌクレオチド配列と完全相補的なヌクレオチド配列（すなわち、mRNAの相補鎖のヌクレオチド配列）と、オーバーラップする領域に関して、90％以上、好ましくは95％以上、より好ましくは97％以上、特に好ましくは98％以上の相同性を有するヌクレオチド配列である。本発明における「ヌクレオチド配列の相同性」は、相同性計算アルゴリズムNCBI BLAST（National Center for Biotechnology Information Basic Local Alignment Search Tool）を用い、以下の条件（期待値=10；ギャップを許す；フィルタリング=ON；マッチスコア=1；ミスマッチスコア=-3）にて計算することができる。

より具体的には、TEAD3遺伝子のmRNAのヌクレオチド配列と相補的なヌクレオチド配列とは、配列番号１で表されるヌクレオチド配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズするヌクレオチド配列である。ここで「ストリンジェントな条件」とは、例えば、Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons,6.3.1-6.3.6, 1999に記載される条件、例えば、6×SSC（sodium chloride/sodium citrate）／45℃でのハイブリダイゼーション、次いで0.2×SSC／0.1％ SDS／50～65℃での一回以上の洗浄等が挙げられるが、当業者であれば、これと同等のストリンジェンシーを与えるハイブリダイゼーションの条件を適宜選択することができる。

TEAD3遺伝子のmRNAの好ましい例としては、配列番号１で表されるヌクレオチド配列を含むヒトTEAD3（RefSeq Accession No. NM_003214.4）、あるいは他の温血動物におけるそのオルソログ、さらにはそれらの天然のアレル変異体もしくは遺伝子多型などのmRNAがあげられる。

「TEAD3遺伝子のmRNAのヌクレオチド配列と相補的なヌクレオチド配列の一部」とは、TEAD3遺伝子のmRNAに特異的に結合することができ、且つ該mRNAからのタンパク質の翻訳を阻害（あるいは該mRNAを分解）し得るものであれば、その長さや位置に特に制限はないが、配列特異性の面から、標的配列に相補的な部分を少なくとも10塩基以上、好ましくは15塩基以上、より好ましくは19塩基以上含むものである。

具体的には、TEAD3遺伝子のmRNAのヌクレオチド配列と相補的なヌクレオチド配列の一部を含む核酸として、以下の(a)～(c)のいずれかのものが好ましく例示される。
(a) TEAD3遺伝子のmRNAに対してRNAi活性を有する核酸もしくはその前駆体
(b) TEAD3遺伝子のmRNAに対するアンチセンス核酸
(c) TEAD3遺伝子のmRNAに対するリボザイム核酸

(a) TEAD3遺伝子のmRNAに対してRNAi活性を有する核酸もしくはその前駆体
本明細書においては、TEAD3遺伝子のmRNAに相補的なオリゴRNAとその相補鎖とからなる二本鎖RNA、いわゆるsiRNAは、TEAD3遺伝子のmRNAのヌクレオチド配列と相補的なヌクレオチド配列またはその一部を含む核酸に包含されるものとして定義される。

siRNAは、標的遺伝子のcDNA配列情報に基づいて、例えば、Elbashirら（Genes Dev., 15, 188-200 (2001)）の提唱する規則に従って設計することができる。siRNAの標的配列としては、例えばAA+(N)₁₉、AA+(N)₂₁もしくはNA+(N)₂₁（Nは任意の塩基）等が挙げられるが、それらに限定されない。標的配列の位置も特に制限されるわけではない。選択された標的配列の候補群について、標的以外のmRNAにおいて16-17塩基の連続した配列に相同性がないかどうかを、BLAST（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/）等のホモロジー検索ソフトを用いて調べ、選択した標的配列の特異性を確認する。例えば、AA+(N)₁₉、AA+(N)₂₁もしくはNA+(N)₂₁（Nは任意の塩基）を標的配列とする場合、特異性の確認された標的配列について、AA（もしくはNA）以降の19-21塩基にTTもしくはUUの3’末端オーバーハングを有するセンス鎖と、該19-21塩基に相補的な配列及びTTもしくはUUの3’末端オーバーハングを有するアンチセンス鎖とからなる2本鎖RNAをsiRNAとして設計してもよい。また、siRNAの前駆体であるショートヘアピンRNA（shRNA）は、ループ構造を形成しうる任意のリンカー配列（例えば、5-25塩基程度）を適宜選択し、上記センス鎖とアンチセンス鎖とを該リンカー配列を介して連結することにより設計することができる。

siRNA及び／又はshRNAの配列は、種々のwebサイト上に無料で提供される検索ソフトを用いて検索が可能である。このようなサイトとしては、例えば、Horizon Discovery Ltd.が提供するsiDESIGN Center（https://horizondiscovery.com/en/products/tools/siDESIGN-Center）、GenScriptが提供するsiRNA Target Finder（https://www.genscript.com/tools/sirna-target-finder）等が挙げられるが、これらに限定されない。

好ましい一実施態様において、本発明のsiRNA及びshRNAは、配列番号１で表されるヌクレオチド配列中、ヌクレオチド番号２１９～２４７（AGCAACCAGCACAATAGCGTCCAACAGCT：配列番号４）、あるいは１２０７～１２３５（AGCATGACCATCAGCGTCTCCACCAAGGT：配列番号５）で示される領域内の、連続する少なくとも15個のヌクレオチドからなる配列と相補的なヌクレオチド配列を含む。

本明細書においては、TEAD3遺伝子のmRNAを標的とするマイクロRNA（miRNA）もまた、TEAD3遺伝子のmRNAのヌクレオチド配列と相補的なヌクレオチド配列またはその一部を含む核酸に包含されるものとして定義される。miRNAは、標的となるmRNAに相補的に結合してmRNAの翻訳を抑制するか、あるいはmRNAを分解することにより、遺伝子発現の転写後制御に関与している。

miRNAはまず、それをコードする遺伝子から一次転写産物であるprimary-microRNA (pri-miRNA)が転写され、次いで、Droshaにより特徴的なヘアピン構造を有する約70塩基長のprecursor-microRNA (pre-miRNA)にプロセッシングされた後、核から細胞質に輸送され、さらに、Dicer介在によるプロセシングにより成熟型miRNAとなり、RISCに取り込まれて標的mRNAに作用する。従って、miRNAの前駆体として、pre-miRNAやpri-miRNA、好ましくはpre-miRNAを用いることもできる。

miRNAは、種々のwebサイト上に無料で提供される標的予測ソフトを用いて検索が可能である。このようなサイトとしては、例えば、米国ホワイトヘッド研究所が公開しているTargetScan（http://www.targetscan.org/vert_72/）、ギリシアのアレクサンダー・フレミング生体医科学研究センターが公開しているDIANA-micro-T-CDS（http://diana.imis.athena-innovation.gr/DianaTools/index.php?r=microT_CDS/index）等が挙げられるが、これらに限定されない。あるいは、チェザレー大学・パスツール研究所等が公開している、標的mRNAに作用することが実験的に証明されているmiRNAに関するデータベースであるTarBase（http://carolina.imis.athena-innovation.gr/diana_tools/web/index.php?r=tarbasev8/index）を用いて、TEAD3 mRNAを標的とするmiRNAを検索することもできる。例えば、該データベース上でヒットしたTEAD3 mRNAに対するmiRNAのうち上記標的予測ソフトで高スコアのものとして、例えば、hsa-miR-106b-5p、hsa-miR-20a-5p等が挙げられる。これらのmiRNA及び/又はpre-miRNAの配列情報は、例えば、英国マンチェスター大学が公開しているmiRBase（http://www.mirbase.org/search.shtml）を用いて取得することができる。

siRNA及び／又はshRNA、あるいはmiRNA及び/又はpre-miRNAを構成するヌクレオチド分子は、天然型のRNAもしくはDNAでもよいが、安定性（化学的および／または対酵素）や比活性（RNAとの親和性）を向上させるために、種々の化学修飾を含むことができる。例えば、ヌクレアーゼなどの加水分解酵素による分解を防ぐために、アンチセンス核酸を構成する各ヌクレオチドのリン酸残基（ホスフェート）を、例えば、ホスホロチオエート（PS)、メチルホスホネート、ホスホロジチオネートなどの化学修飾リン酸残基に置換することができる。また、各ヌクレオチドの糖（リボース）の2’位の水酸基を、-OR（R=CH₃（2’-O-Me）、CH₂CH₂OCH₃（2’-O-MOE）、CH₂CH₂NHC(NH)NH₂、CH₂CONHCH₃、CH₂CH₂CN等）に置換してもよい。さらに、塩基部分（ピリミジン、プリン）に化学修飾を施してもよく、例えば、ピリミジン塩基の5位へのメチル基やカチオン性官能基の導入、あるいは2位のカルボニル基のチオカルボニルへの置換などが挙げられる。

RNAの糖部のコンフォーメーションはC2’-endo（S型）とC3’-endo（N型）の２つが支配的であり、一本鎖RNAではこの両者の平衡として存在するが、二本鎖を形成するとN型に固定される。したがって、標的RNAに対して強い結合能を付与するために、2’酸素と4’炭素を架橋することにより、糖部のコンフォーメーションをN型に固定したRNA誘導体であるBNA(LNA)（Imanishi, T. et al., Chem. Commun., 1653-9, 2002; Jepsen, J.S. et al., Oligonucleotides, 14, 130-46, 2004）やENA（Morita, K. et al., Nucleosides Nucleotides Nucleic Acids, 22, 1619-21, 2003）もまた、好ましく用いられ得る。

siRNAは、mRNA上の標的配列のセンス鎖及びアンチセンス鎖をDNA/RNA自動合成機でそれぞれ合成し、適当なアニーリング緩衝液中、約90～約95℃で約1分程度変性させた後、約30～約70℃で約1～約8時間アニーリングさせることにより調製することができる。また、siRNAの前駆体となるshRNAを合成し、これをダイサー（dicer）を用いて切断することにより調製することもできる。miRNA及びpre-miRNAは、それらの配列情報に基づいて、DNA/RNA自動合成機で合成することができる。

本明細書においては、生体内でTEAD3遺伝子のmRNAに対するsiRNA又はmiRNAを生成し得るようにデザインされた核酸もまた、TEAD3遺伝子のmRNAのヌクレオチド配列と相補的なヌクレオチド配列またはその一部を含む核酸に包含されるものとして定義される。そのような核酸としては、上記したshRNAもしくはsiRNA又はmiRNAもしくはpre-miRNAを発現するように構築された発現ベクターなどが挙げられる。後述の実施例に示されるように、TEAD3の発現は、初期化過程の開始段階（例えば、核初期化物質の導入後3日以内）と安定化段階（例えば、核初期化物質の導入後2～3週間）の両方で上昇することから、TEAD3の機能阻害は核初期化工程を通じて長期間持続することが望ましいと考えられる。発現ベクターの使用は、TEAD3の発現を阻害する核酸を長期間持続的に体細胞に供給できる点で好ましい。

shRNAは、mRNA上の標的配列のセンス鎖およびアンチセンス鎖を適当なループ構造を形成しうる長さ（例えば5～25塩基程度）のスペーサー配列を間に挿入して連結したヌクレオチド配列を含むオリゴRNAをデザインし、これをDNA/RNA自動合成機で合成することにより調製することができる。shRNAを発現するベクターには、タンデムタイプとステムループ（ヘアピン）タイプとがある。前者はsiRNAのセンス鎖の発現カセットとアンチセンス鎖の発現カセットをタンデムに連結したもので、細胞内で各鎖が発現してアニーリングすることにより2本鎖のsiRNA（dsRNA）を形成するというものである。一方、後者はshRNAの発現カセットをベクターに挿入したもので、細胞内でshRNAが発現しdicerによるプロセシングを受けてdsRNAを形成するというものである。プロモーターとしては、polII系プロモーター（例えば、CMV前初期プロモーター）を使用することもできるが、短いRNAの転写を正確に行わせるために、polIII系プロモーターを使用するのが一般的である。polIII系プロモーターとしては、マウスおよびヒトのU6-snRNAプロモーター、ヒトH1-RNase P RNAプロモーター、ヒトバリン-tRNAプロモーターなどが挙げられる。また、転写終結シグナルとして4個以上Tが連続した配列が用いられる。miRNAやpre-miRNAの発現カセットも、shRNAと同様にして作製することができる。

このようにして構築したsiRNAもしくはshRNA又はmiRNAもしくはpre-miRNA発現カセットを、次いでプラスミドベクターやウイルスベクターに挿入する。このようなベクターとしては、レトロウイルス、レンチウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、ヘルペスウイルス、センダイウイルスなどのウイルスベクターや、動物細胞発現プラスミドなどが用いられる。TEAD3は、恒常性維持にも関わるHippoシグナル伝達経路を介した遺伝子発現制御に深く関与していることから、初期化バリアが解除され、体細胞がiPS細胞にまで脱分化した後は、速やかに機能を回復させることが好ましいと考えられる。従って、発現ベクターとしては、非組込み型の一過的発現ベクター、例えばアデノウイルスベクターやプラスミドがより好ましい。中でも、核初期化工程を通じてTEAD3の発現を阻害する核酸を持続的発現させることができ、iPS細胞樹立後に速やかに細胞から消失し得る点で、染色体外で自律複製可能なエピゾーマルベクターの使用が好ましい。エピゾーマルベクターを用いる具体的手段は、Yu et al., Science, 324, 797-801 (2009)に開示されている。

エピゾーマルベクターとしては、例えば、EBV、SV40等に由来する自律複製に必要な配列をベクター要素として含むベクターが挙げられる。自律複製に必要なベクター要素としては、具体的には、複製開始点と、複製開始点に結合して複製を制御するタンパク質をコードする遺伝子であり、例えば、EBVにあっては複製開始点oriPとEBNA-1遺伝子、SV40にあっては複製開始点oriとSV40 large T antigen遺伝子が挙げられる。

(b) TEAD3遺伝子のmRNAに対するアンチセンス核酸
本発明における「TEAD3遺伝子のmRNAに対するアンチセンス核酸」とは、該mRNAのヌクレオチド配列と相補的なヌクレオチド配列またはその一部を含む核酸であって、標的mRNAと特異的かつ安定した二重鎖を形成して結合することにより、タンパク質合成を抑制する機能を有するものである。
アンチセンス核酸は、2-デオキシ-D-リボースを含有しているポリデオキシリボヌクレオチド、D-リボースを含有しているポリリボヌクレオチド、プリンまたはピリミジン塩基のN-グリコシドであるその他のタイプのポリヌクレオチド、非ヌクレオチド骨格を有するその他のポリマー（例えば、市販のタンパク質核酸および合成配列特異的な核酸ポリマー）または特殊な結合を含有するその他のポリマー（但し、該ポリマーはDNAやRNA中に見出されるような塩基のペアリングや塩基の付着を許容する配置をもつヌクレオチドを含有する）などが挙げられる。それらは、二本鎖DNA、一本鎖DNA、二本鎖RNA、一本鎖RNA、DNA:RNAハイブリッドであってもよく、さらに非修飾ポリヌクレオチド（または非修飾オリゴヌクレオチド）、公知の修飾の付加されたもの、例えば当該分野で知られた標識のあるもの、キャップの付いたもの、メチル化されたもの、１個以上の天然のヌクレオチドを類縁物で置換したもの、分子内ヌクレオチド修飾のされたもの、例えば非荷電結合（例えば、メチルホスホネート、ホスホトリエステル、ホスホルアミデート、カルバメートなど）を持つもの、電荷を有する結合または硫黄含有結合（例、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエートなど）を持つもの、例えばタンパク質（例、ヌクレアーゼ、ヌクレアーゼ・インヒビター、トキシン、抗体、シグナルペプチド、ポリ-L-リジンなど）や糖（例、モノサッカライドなど）などの側鎖基を有しているもの、インターカレント化合物（例、アクリジン、ソラレンなど）を持つもの、キレート化合物（例えば、金属、放射活性をもつ金属、ホウ素、酸化性の金属など）を含有するもの、アルキル化剤を含有するもの、修飾された結合を持つもの（例えば、αアノマー型の核酸など）であってもよい。ここで「ヌクレオシド」、「ヌクレオチド」および「核酸」とは、プリンおよびピリミジン塩基を含有するのみでなく、修飾されたその他の複素環型塩基をもつようなものを含んでいて良い。このような修飾物は、メチル化されたプリンおよびピリミジン、アシル化されたプリンおよびピリミジン、あるいはその他の複素環を含むものであってよい。修飾されたヌクレオシドおよび修飾されたヌクレオチドはまた糖部分が修飾されていてよく、例えば、１個以上の水酸基がハロゲンとか、脂肪族基などで置換されていたり、またはエーテル、アミンなどの官能基に変換されていたりしてもよい。

上記の通り、アンチセンス核酸はDNAであってもRNAであってもよく、あるいはDNA/RNAキメラであってもよい。アンチセンス核酸がDNAの場合、標的RNAとアンチセンスDNAとによって形成されるRNA:DNAハイブリッドは、内在性RNase Hに認識されて標的RNAの選択的な分解を引き起こすことができる。したがって、RNase Hによる分解を指向するアンチセンスDNAの場合、標的配列は、mRNA中の配列だけでなく、TEAD3遺伝子の初期翻訳産物におけるイントロン領域の配列であってもよい。イントロン配列は、ゲノム配列と、TEAD3遺伝子のcDNAヌクレオチド配列とをBLAST、FASTA等のホモロジー検索プログラムを用いて比較することにより、決定することができる。

本発明のアンチセンス核酸の標的領域は、該アンチセンス核酸がハイブリダイズすることにより、結果としてタンパク質への翻訳が阻害されるものであればその長さに特に制限はなく、タンパク質をコードするmRNAの全配列であっても部分配列であってもよく、短いもので約10塩基程度、長いものでmRNAもしくは初期転写産物の全配列が挙げられる。合成の容易さや抗原性、細胞内移行性の問題等を考慮すれば、約10～約40塩基、特に約15～約30塩基からなるオリゴヌクレオチドが好ましいが、それに限定されない。具体的には、TEAD3遺伝子の5’端ヘアピンループ、5’端６－ベースペア・リピート、5’端非翻訳領域、翻訳開始コドン、タンパク質コード領域、ORF翻訳終止コドン、3’端非翻訳領域、3’端パリンドローム領域または3’端ヘアピンループなどが、アンチセンス核酸の好ましい標的領域として選択しうるが、それらに限定されない。

一実施態様において、本発明のアンチセンス核酸の標的領域として、上記siRNAと同様に、配列番号１で表されるヌクレオチド配列中、ヌクレオチド番号２１９～２４７、あるいは１２０７～１２３５で示される領域内の、連続する少なくとも15個のヌクレオチドからなる配列を挙げることができる。ギャップマー型のアンチセンス核酸を用いると、該標的領域内でRNase Hの作用によりTEAD3 mRNAを分解することができるので、siRNAと同等の効果を得ることができる。

TEAD3のパラログであるTEAD4には、N末端側のDNA結合ドメインを欠くスプライシングバリアントが知られており、エキソン3のスキッピングにより開始コドンの位置が変化するためと考えられている（Nat Commun 7:11840 | DOI: 10.1038/ncomms11840）。TEADファミリーのDNA結合領域は高度に保存されており、TEAD3にも、同様にDNA結合ドメインを欠くスプライシングバリアントの存在が推定されている。従って、エキソン3の内部もしくは隣接するイントロン内に存在するスプライシング促進配列を標的としたアンチセンス核酸を用いることにより、エキソン3を欠くスプライシングバリアントの転写を促進し、配列番号２で表されるアミノ酸配列中、アミノ酸番号１１２で示されるMetから始まるTEAD3アイソフォームを生成し得る。該アイソフォームは、コアクチベータのYAP/TAZに結合するが、標的遺伝子のプロモーターに結合できないので、TEAD3のドミナントネガティブ変異体として機能する。

さらに、本発明のアンチセンス核酸は、TEAD3遺伝子のmRNAや初期転写産物とハイブリダイズしてタンパク質への翻訳を阻害するだけでなく、二本鎖DNAであるこれらの遺伝子と結合して三重鎖（トリプレックス）を形成し、RNAへの転写を阻害し得るもの（アンチジーン）であってもよい。

アンチセンス核酸を構成するヌクレオチド分子もまた、安定性、比活性などを向上させるために、上記のsiRNA等の場合と同様の修飾を受けていてもよい。

本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドは、TEAD3遺伝子のcDNA配列もしくはゲノミックDNA配列に基づいてmRNAもしくは初期転写産物の標的配列を決定し、市販のDNA/RNA自動合成機（アプライド・バイオシステムズ社、ベックマン社等）を用いて、これに相補的な配列を合成することにより調製することができる。また、上記した各種修飾を含むアンチセンス核酸も、いずれも自体公知の手法により、化学的に合成することができる。

あるいは、アンチセンス核酸は、上記のsiRNA等の場合と同様に発現ベクターに組み込んで体細胞に導入することもできる。

(c) TEAD3遺伝子のmRNAに対するリボザイム核酸
TEAD3遺伝子のmRNAのヌクレオチド配列と相補的なヌクレオチド配列またはその一部を含む核酸の他の例としては、該mRNAをコード領域の内部で特異的に切断し得るリボザイム核酸が挙げられる。「リボザイム」とは、狭義には、核酸を切断する酵素活性を有するRNAをいうが、本明細書では配列特異的な核酸切断活性を有する限りDNAをも包含する概念として用いるものとする。リボザイム核酸として最も汎用性の高いものとしては、ウイロイドやウイルソイド等の感染性RNAに見られるセルフスプライシングRNAがあり、ハンマーヘッド型やヘアピン型等が知られている。ハンマーヘッド型は約40塩基程度で酵素活性を発揮し、ハンマーヘッド構造をとる部分に隣接する両端の数塩基ずつ（合わせて約10塩基程度）をmRNAの所望の切断部位と相補的な配列にすることにより、標的mRNAのみを特異的に切断することが可能である。このタイプのリボザイム核酸は、RNAのみを基質とするので、ゲノムDNAを攻撃することがないというさらなる利点を有する。TEAD3遺伝子のmRNAが自身で二本鎖構造をとる場合には、RNAヘリカーゼと特異的に結合し得るウイルス核酸由来のRNAモチーフを連結したハイブリッドリボザイムを用いることにより、標的配列を一本鎖にすることができる［Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 98(10): 5572-5577 (2001)］。さらに、リボザイムを、それをコードするDNAを含む発現ベクターの形態で使用する場合には、転写産物の細胞質への移行を促進するために、tRNAを改変した配列をさらに連結したハイブリッドリボザイムとすることもできる［Nucleic Acids Res., 29(13): 2780-2788 (2001)］。

TEAD3遺伝子のmRNAのヌクレオチド配列と相補的なヌクレオチド配列またはその一部を含む核酸は、リポソーム、ミクロスフェアのような特殊な形態で提供したり、他の要素が付加された形態で提供したりすることができうる。付加形態で用いられるものとしては、リン酸基骨格の電荷を中和するように働くポリリジンのようなポリカチオン体、細胞膜との相互作用を高めたり、核酸の取込みを増大せしめるような脂質（例、ホスホリピド、コレステロールなど）などの疎水性のものが挙げられる。付加するに好ましい脂質としては、コレステロールやその誘導体（例、コレステリルクロロホルメート、コール酸など）が挙げられる。こうしたものは、核酸の3’端または5’端に付着させることができ、塩基、糖、分子内ヌクレオシド結合を介して付着させることができうる。その他の基としては、核酸の3’端または5’端に特異的に配置されたキャップ用の基で、エキソヌクレアーゼ、RNaseなどのヌクレアーゼによる分解を阻止するためのものが挙げられる。こうしたキャップ用の基としては、ポリエチレングリコール、テトラエチレングリコールなどのグリコールをはじめとした当該分野で知られた水酸基の保護基が挙げられるが、それに限定されるものではない。

TEAD3遺伝子のmRNAのヌクレオチド配列と相補的なヌクレオチド配列の一部を含む核酸がRNAの形態の場合、例えばリポフェクション、マイクロインジェクションなどの手法によって体細胞内に導入することができる。
一方、該RNAをコードするDNAを含む発現ベクターの形態の場合、ベクターの種類に応じて、自体公知の手法により細胞に導入することができる。例えば、ウイルスベクターの場合、該DNAを含むプラスミドを適当なパッケージング細胞（例、Plat-E細胞）や相補細胞株（例、293細胞）に導入して、培養上清中に産生されるウイルスベクターを回収し、各ウイルスベクターに応じた適切な方法により、該ベクターを細胞に感染させる。例えば、ベクターとしてレトロウイルスベクターを用いる具体的手段が WO2007/69666、Cell, 126, 663-676 (2006) 及び Cell, 131, 861-872 (2007) に開示されており、ベクターとしてレンチウイルスベクターを用いる場合については、Science, 318, 1917-1920 (2007) に開示がある。また、アデノウイルスベクターを用いる場合については、Science, 322, 945-949 (2008) に記載されている。
一方、非ウイルスベクターであるプラスミドベクターの場合には、リポフェクション法、リポソーム法、エレクトロポレーション法、リン酸カルシウム共沈殿法、DEAEデキストラン法、マイクロインジェクション法、遺伝子銃法などを用いて該ベクターを細胞に導入することができる。

(d) p53のコンセンサス結合配列を含むオリゴ核酸
TEAD3遺伝子の発現を阻害する物質の別の好ましい実施態様として、TEAD3遺伝子の転写活性化因子がTEAD3遺伝子のプロモーター領域に結合するのを阻害する物質が挙げられる。例えば、そのような物質として、p53のコンセンサス結合配列であるrrrcwwgyyynnnnnnnnnnnnnrrrcwwgyyy（rはa又はg、wはa又はt、yはc又はtを表し、nはそれぞれ独立して、存在しないか、a、g、t又はcを表す；配列番号３）を含むオリゴ核酸を挙げることができる。好ましくは、該オリゴ核酸は二本鎖DNAである。p53はTEAD3プロモーター領域に存在するシスエレメント配列に結合して、TEAD3遺伝子の転写を正に制御していると考えられるので、p53のコンセンサス結合配列を含むオリゴ核酸は、p53のTEAD3プロモーター領域への結合を阻害してその転写を抑制することができる。該オリゴ核酸の長さは、例えば、20～50ヌクレオチド、好ましくは25～40ヌクレオチドである。

前記オリゴ核酸は、配列番号３の配列情報に基づいて、市販のDNA/RNA自動合成機（アプライド・バイオシステムズ社、ベックマン社等）を用いて、センス鎖及びアンチセンス鎖を合成し、それらをアニーリングさせることにより製造することができる。

前記オリゴ核酸は、例えばリポフェクション、マイクロインジェクションなどの手法によって体細胞内に導入することができる。

本発明において「TEAD3の機能を抑制する物質」とは、いったん機能的に産生されたTEAD3の機能（例えば、体細胞としての固有性を維持する遺伝子群の転写活性化機能）を抑制する限りいかなるものでもよく、例えば、TEAD3に結合して前記機能を抑制する物質、TEAD3と標的遺伝子の結合活性や、TEAD3と転写共役因子との相互作用を阻害する物質等が挙げられる。

(e) TEAD3のドミナントネガティブ変異体
TEAD3は、ヒトの場合、配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質であるが、N末端側から約30～約100アミノ酸の領域が、TEADファミリーで高度に保存されたDNA結合ドメインであり、約200位以降がYAP/TAZ結合ドメイン及び転写活性化ドメインである。従って、DNA結合ドメインを欠くTEAD3フラグメントは、内因性の全長TEAD3と競合的に転写コアクチベータであるYAP/TAZと結合し、TEAD3とYAP/TAZとの相互作用による標的遺伝子群の転写活性化を抑制することができる。一方、YAP/TAZ結合ドメイン、転写活性化ドメインを欠くTEAD3フラグメントは、内因性の全長TEAD3と競合的に標的遺伝子のプロモーター領域に結合し、TEAD3とYAP/TAZとの相互作用による標的遺伝子群の転写活性化を抑制することができる。

TEAD3のドミナントネガティブ変異体は、例えば、ヒト等の温血動物のTEAD3を発現する細胞・組織由来のmRNA、cDNAもしくはcDNAライブラリーから、適当なプライマーセットを設計して(RT-)PCR法により、目的とするDNA結合ドメイン又はYAP/TAZ結合ドメイン（転写活性化ドメイン）を欠くTEAD3フラグメントをコードする核酸をクローニングし、適当な発現ベクターに挿入し、該ベクターを宿主細胞に導入し、該細胞を培養して得られる培養物から組換えタンパク質を回収することにより取得することができる。

体細胞へのドミナントネガティブ変異体の接触は、自体公知の細胞へのタンパク質導入方法を用いて実施することができる。そのような方法としては、例えば、タンパク質導入試薬を用いる方法、タンパク質導入ドメイン（PTD）融合タンパク質を用いる方法、マイクロインジェクション法などが挙げられる。タンパク質導入試薬としては、カチオン性脂質をベースとしたBioPOTER Protein Delivery Reagent（Gene Therapy Systmes）、Pro-Ject^TM Protein Transfection Reagent（PIERCE）及びProVectin（IMGENEX）、脂質をベースとしたProfect-1（Targeting Systems）、膜透過性ペプチドをベースとしたPenetrain Peptide（Q biogene）及びChariot Kit（Active Motif）等が市販されている。導入はこれらの試薬に添付のプロトコルに従って行うことができるが、一般的な手順は以下の通りである。p38のドミナントネガティブ変異体を適当な溶媒（例えば、PBS、HEPES等の緩衝液）に希釈し、導入試薬を加えて室温で5-15分程度インキュベートして複合体を形成させ、これを無血清培地に交換した細胞に添加して37℃で１ないし数時間インキュベートする。その後培地を除去して血清含有培地に交換する。

PTDとしては、ショウジョウバエ由来のAntP、HIV由来のTAT、HSV由来のVP22等のタンパク質の細胞通過ドメインを用いたものが開発されている。p38のドミナントネガティブ変異体のcDNAとPTD配列とを組み込んだ融合タンパク質発現ベクターを作製して組換え発現させ、融合タンパク質を回収して導入に用いる。導入は、タンパク質導入試薬を添加しない以外は上記と同様にして行うことができる。p38DDなどの比較的分子量の小さい欠失変異体の導入に好適である。

マイクロインジェクションは、先端径1μm程度のガラス針にタンパク質溶液を入れ、細胞に穿刺導入する方法であり、確実に細胞内にタンパク質を導入することができる。

(f) TEAD3のドミナントネガティブ変異体をコードする核酸
しかしながら、体細胞への導入の容易さを考慮すると、TEAD3のドミナントネガティブ変異体は、タンパク質自体としてよりも、それをコードする核酸の形態で用いることがむしろ好ましい。したがって、本発明の別の好ましい実施態様において、TEAD3機能阻害物質は、TEAD3のドミナントネガティブ変異体をコードする核酸である。該核酸はDNAであってもRNAであってもよく、あるいはDNA/RNAキメラであってもよいが、好ましくはDNAである。また、該核酸は二本鎖であっても、一本鎖であってもよい。TEAD3のドミナントネガティブ変異体をコードするcDNAは、該変異体タンパク質の作製について上記した手法によりクローニングすることができる。

単離されたcDNAは、上記したTEAD3遺伝子のmRNAのヌクレオチド配列と相補的なヌクレオチド配列の一部を含む核酸と同様に、適切なウイルス性又は非ウイルス性の発現ベクターに挿入して、同様の遺伝子導入法により体細胞に導入することができる。

(g) TEAD3の転写共役因子の阻害物質
上述のとおり、TEAD3はコアクチベータであるYAP/TAZと共役して標的遺伝子群の転写を活性化する。YAP/TAZはリン酸化（例えば、127位のSer残基におけるリン酸化）された状態では、14-3-3と結合して細胞質に局在し、不活性化されているが、脱リン酸化により14-3-3と解離して核内に移行し、TEAD3と共役して標的遺伝子群の転写を促進する。従って、TEAD3の転写共役因子であるYAP/TAZを阻害することにより、結果的にTEAD3の機能を阻害することができる。

YAP/TAZを阻害する方法としては、YAPやTAZに対するsiRNAやmiRNA、あるいはその前駆体、YAPやTAZに対するアンチセンス核酸、リボザイム核酸等を体細胞に導入して、それらの発現を抑制したり、YAP/TAZのリン酸化や14-3-3との複合体形成を促進して、その活性化及び核内移行を抑制したりする方法が挙げられる。

YAP又はTAZに対するsiRNAやshRNAは、YAPのmRNA（例えば、ヒトYAP1-2γアイソフォームの場合、NM_001130145）又はTAZのmRNA（例えば、ヒトTAZアイソフォーム-1の場合、NM_000116）の配列情報に基づいて、TEAD3に対するsiRNA等について記載したのと同じ方法により適宜設計することができる。

YAP又はTAZに対するmiRNAは、TEAD3に対するmiRNAについて記載したのと同じデータベースを用いて検索することができる。例えば、TarBase（上述）によれば、YAP1に対するmiRNAとしてhsa-miR-204-5p、hsa-miR-506-3p等が挙げられるが、それらに限定されない。また、TAZに対するmiRNAとしてhsa-miR-382-3p、hsa-miR-26b-5p等が挙げられるが、それらに限定されない。これらのmiRNA及び/又はpre-miRNAの配列情報は、例えば、miRBase（上述）を用いて取得することができる。

YAPやTAZに対するアンチセンス核酸やリボザイム核酸も、上記TEAD3に対するアンチセンス核酸やリボザイム核酸と同様にして設計し、用いることができる。

別の実施態様においては、YAP又はTAZの阻害物質として、14-3-3タンパク質を用いることができる。細胞内の14-3-3タンパク質を富化することにより、YAP/TAZとの複合体形成を促進し、YAP/TAZの核内移行を抑制することができる。
また、別の実施態様においては、YAP又はTAZの阻害物質として、Hippoシグナル伝達経路の活性化物質を用いることもできる。Hippoシグナル伝達経路が活性化すると、YAP/TAZのリン酸化が促進され、核内移行が抑制され得る。Hippoシグナル伝達経路の活性化物質としては、例えば、Lats1/2（及びその共役因子であるMob1A/1B）、さらにその上流のMST1/2（及びその共役因子であるWW45）を挙げることができる。
さらに別の実施態様においては、YAP又はTAZのドミナントネガティブ変異体を用いることができる。YAP及びTAZのTEAD結合ドメインは、それぞれN末端から50～100アミノ酸及び13～57アミノ酸であり、転写活性化ドメインは、それぞれ276～472位及び208～381位であるので、TEAD結合ドメインを含むが転写活性化ドメインを欠くYAP又はTAZフラグメントは、核内に移行すると、内因性のYAP/TAZと競合的にTEAD3に結合し、TEAD3とYAP/TAZとの相互作用による標的遺伝子の転写活性化を抑制することができる。転写活性化ドメインの欠失により核局在化が棄損される場合には、自体公知の核局在化シグナル配列を付加してもよい。
これらのYAP/TAZ阻害物質のアミノ酸配列及びmRNA配列の情報はいずれも既知であり、種々のデータベースから配列情報を入手することができ、上記したTEAD3のドミナントネガティブ変異体及びそれをコードする核酸と同様にして、所望のタンパク質又はそれをコードする核酸を取得することができる。得られたタンパク質又は核酸は、TEAD3のドミナントネガティブ変異体又はそれをコードする核酸と同様の方法により、体細胞に導入することができる。

(h) TEAD3に対するデコイ核酸
YAP/TAZは、TEAD3だけでなく他の転写因子とも共役している。そのため、TEAD3選択的に標的遺伝子の転写活性化を抑制するには、TEAD3の標的遺伝子プロモーター領域への結合を阻害する物質を用いることがより好ましい。そのような物質としては、上記したYAP/TAZ結合ドメイン（転写活性化ドメイン）を欠くTEAD3のドミナントネガティブ変異体だけでなく、TED3のコンセンサス結合配列を含むデコイ核酸を挙げることができる。TEAD3のコンセンサス結合配列としては、ACATTCCAが挙げられる。好ましくは、該デコイ核酸は二本鎖DNAである。該デコイ核酸の長さは、例えば、8～30ヌクレオチド、好ましくは8～20ヌクレオチドである。

TEAD3に対するデコイ核酸は、上記p53のコンセンサス結合配列を含むオリゴ核酸と同様にして調製し、体細胞に導入することができる。

上記TEAD3の機能阻害物質は、体細胞の核初期化工程においてTEAD3の機能を阻害するのに十分な様式で体細胞に導入する必要がある。ここで体細胞の核初期化は、核初期化物質を体細胞に導入することにより実施することができる。

(C) 核初期化物質
本発明において「核初期化物質」とは、体細胞に導入することにより該体細胞からiPS細胞を誘導することができる物質（群）であれば、タンパク性因子またはそれをコードする核酸（ベクターに組み込まれた形態を含む）、あるいは低分子化合物等のいかなる物質から構成されてもよい。核初期化物質がタンパク性因子またはそれをコードする核酸の場合、好ましくは以下の組み合わせが例示される（以下においては、タンパク性因子の名称のみを記載する）。
(1) Oct3/4, Klf4, c-Myc
(2) Oct3/4, Klf4, c-Myc, Sox2（ここで、Sox2はSox1, Sox3, Sox15, Sox17またはSox18、好ましくはSox1, Sox3, Sox15または Sox17、より好ましくはSox1またはSox3で置換可能である。また、Klf4はKlf1, Klf2またはKlf5、好ましくはKlf2で置換可能である。さらに、c-MycはT58A（活性型変異体）, N-Myc, L-Mycで置換可能である。）
(3) Oct3/4, Klf4, c-Myc, Sox2, Fbx15, Nanog, Eras, ECAT15-2, TclI, β-catenin (活性型変異体S33Y)
(4) Oct3/4, Klf4, c-Myc, Sox2, TERT, SV40 Large T antigen（以下、SV40LT）
(5) Oct3/4, Klf4, c-Myc, Sox2, TERT, HPV16 E6
(6) Oct3/4, Klf4, c-Myc, Sox2, TERT, HPV16 E7
(7) Oct3/4, Klf4, c-Myc, Sox2, TERT, HPV6 E6, HPV16 E7
(8) Oct3/4, Klf4, c-Myc, Sox2, TERT, Bmil
（以上、WO 2007/069666を参照（但し、上記(2)の組み合わせにおいて、Sox2からSox18への置換、Klf4からKlf1もしくはKlf5への置換については、Nature Biotechnology, 26, 101-106 (2008)を参照）。「Oct3/4, Klf4, c-Myc, Sox2」の組み合わせについては、Cell, 126, 663-676 (2006)、Cell, 131, 861-872 (2007) 等も参照。「Oct3/4, Klf2（またはKlf5）, c-Myc, Sox2」の組み合わせについては、Nat. Cell Biol., 11, 197-203 (2009)も参照。「Oct3/4, Klf4, c-Myc, Sox2, hTERT, SV40LT」の組み合わせについては、Nature, 451, 141-146 (2008)も参照。）
(9) Oct3/4, Klf4, Sox2（Nature Biotechnology, 26, 101-106 (2008)を参照）（ここで、Sox2はSox1, Sox3, Sox15, Sox17またはSox18で置換可能である。また、Klf4はKlf1, Klf2またはKlf5で置換可能である。）
(10) Oct3/4, Sox2, Nanog, Lin28（Science, 318, 1917-1920 (2007)を参照）
(11) Oct3/4, Sox2, Nanog, Lin28, hTERT, SV40LT（Stem Cells, 26, 1998-2005 (2008)を参照）
(12) Oct3/4, Klf4, c-Myc, Sox2, Nanog, Lin28（Cell Research (2008) 600-603を参照）
(13) Oct3/4, Klf4, c-Myc, Sox2, SV40LT（Stem Cells, 26, 1998-2005 (2008)も参照）
(14) Oct3/4, Klf4（Nature 454:646-650 (2008)、Cell Stem Cell, 2:525-528(2008)を参照）
(15) Oct3/4, c-Myc（Nature 454:646-650 (2008)を参照）
(16) Oct3/4, Sox2 (Nature, 451, 141-146 (2008), WO2008/118820を参照)
(17) Oct3/4, Sox2, Nanog (WO2008/118820を参照)
(18) Oct3/4, Sox2, Lin28 (WO2008/118820を参照)
(19) Oct3/4, Sox2, c-Myc, Esrrb (ここで、EsrrbはEsrrgで置換可能である。Nat. Cell Biol., 11, 197-203 (2009) を参照)
(20) Oct3/4, Sox2, Esrrb (Nat. Cell Biol., 11, 197-203 (2009) を参照)
(21) Oct3/4, Klf4, L-Myc
(22) Oct3/4, Nanog
(23) Oct3/4 (Cell 136: 411-419 (2009)、Nature, 08436, doi:10.1038 published online(2009))
(24) Oct3/4, Klf4, c-Myc, Sox2, Nanog, Lin28, SV40LT（Science, 324: 797-801 (2009)を参照）
(25) Oct3/4, Sox2, Klf4, L-Myc, Lin28
(26) Oct3/4, Sox2, Klf4, L-Myc, Lin28, Glis1

上記(1)-(26)において、Oct3/4に代えて他のOctファミリーのメンバー、例えばOct1A、Oct6などを用いることもできる。また、Sox2（またはSox1、Sox3、Sox15、Sox17、Sox18）に代えて他のSoxファミリーのメンバー、例えばSox7などを用いることもできる。また、上記(1)-(26)には該当しないが、それらのいずれかにおける構成要素をすべて含み、且つ任意の他の物質をさらに含む組み合わせも、本発明における「核初期化物質」の範疇に含まれ得る。また、核初期化の対象となる体細胞が上記(1)-(26)のいずれかにおける構成要素の一部を、核初期化のために十分なレベルで内在的に発現している条件下にあっては、当該構成要素を除いた残りの構成要素のみの組み合わせもまた、本発明における「核初期化物質」の範疇に含まれ得る。

これらの組み合わせの中で、Oct3/4、Sox2、Klf4、c-MycもしくはL-Myc、Nanog、Lin28およびSV40LTから選択される少なくとも1つ、好ましくは2つ以上、より好ましくは3つ以上が、好ましい核初期化物質の例として挙げられる。

とりわけ、得られるiPS細胞を治療用途に用いることを念頭においた場合、Oct3/4, Sox2およびKlf4の3因子の組み合わせ（即ち、上記(9)）が好ましい。一方、iPS細胞を治療用途に用いることを念頭に置かない場合（例えば、創薬スクリーニング等の研究ツールとして用いる場合など)は、Oct3/4、Sox2およびKlf4の3因子のほか、それにc-Mycを加えた4因子を例示することができる。あるいは、iPS細胞の使用態様にかかわらず、Oct3/4、Sox2およびKlf4の3因子にL-MycとLin28を加えた5因子（即ち、上記(25)）、さらにGlis1（即ち、上記(26)）やSV40 Large Tを加えた6因子などを例示することができる。

さらに、上記におけるc-MycをL-Mycに変更した組み合わせも、好ましい核初期化物質の例として挙げられる。

上記の各核初期化物質のマウスおよびヒトcDNAのヌクレオチド配列並びに当該cDNAにコードされるタンパク質のアミノ酸配列情報は、WO 2007/069666に記載のNCBI accession numbersを参照すること、またL-Myc、Lin28、Lin28b、Esrrb、EsrrgおよびGlis1のマウスおよびヒトのcDNA配列およびアミノ酸配列情報については、それぞれ下記NCBI accession numbersを参照することにより取得できる。当業者は、当該cDNA配列またはアミノ酸配列情報に基づいて、常法により所望の核初期化物質を調製することができる。
遺伝子名 マウス ヒト
L-Myc NM_008506 NM_001033081
Lin28 NM_145833 NM_024674
Lin28b NM_001031772 NM_001004317
Esrrb NM_011934 NM_004452
Esrrg NM_011935 NM_001438
Glis1 NM_147221 NM_147193

核初期化物質としてタンパク性因子自体を用いる場合には、得られたcDNAを適当な発現ベクターに挿入して宿主細胞に導入し、該細胞を培養して得られる培養物から組換えタンパク性因子を回収することにより調製することができる。一方、核初期化物質としてタンパク性因子をコードする核酸を用いる場合、得られたcDNAを、上記TEAD3のドミナントネガティブ変異体をコードする核酸の場合と同様にして、ウイルスベクター、エピソーマルベクターもしくはプラスミドベクターに挿入して発現ベクターを構築し、核初期化工程に供される。必要に応じて、上記Cre-loxPシステムやpiggyBacトランスポゾンシステムを利用することもできる。尚、核初期化物質として2以上のタンパク性因子をコードする核酸を細胞に導入する場合、各核酸を別個のベクターに担持させてもよいし、複数の核酸をタンデムに繋いでポリシストロニックベクターとすることもできる。後者の場合、効率的なポリシストロニック発現を可能にするために、例えば、口蹄疫ウイルスの2A配列（PLoS ONE 3, e2532, 2008、Stem Cells 25, 1707, 2007）、IRES配列（U.S. Patent No. 4,937,190）など、好ましくは2A配列を用いることができる。

核初期化物質の体細胞への接触は、(a) 該物質がタンパク性因子である場合、上記TEAD3のドミナントネガティブ変異体と同様にして、(b) 該物質が(a)のタンパク性因子をコードする核酸である場合、上記TEAD3のドミナントネガティブ変異体をコードする核酸と同様にして、実施することができる。

(D) iPS細胞の樹立効率改善物質
上記TEAD3の機能阻害物質に加え、公知の他の樹立効率改善物質を体細胞に接触させることにより、iPS細胞の樹立効率をより高めることが期待できる。

iPS細胞の樹立効率改善物質としては、例えば、ヒストンデアセチラーゼ（HDAC）阻害剤［例えば、バルプロ酸 (VPA)(Nat. Biotechnol., 26(7): 795-797 (2008))、トリコスタチンA、酪酸ナトリウム、MC 1293、M344等の低分子阻害剤、HDACに対するsiRNAおよびshRNA（例、HDAC1 siRNA Smartpool（商標）(Millipore)、HuSH 29mer shRNA Constructs against HDAC1 (OriGene)等）等の核酸性発現阻害剤など］、DNAメチルトランスフェラーゼ阻害剤（例えば5’-azacytidine）（Nat. Biotechnol., 26(7): 795-797 (2008))、G9aヒストンメチルトランスフェラーゼ阻害剤［例えば、BIX-01294 (Cell Stem Cell, 2: 525-528 (2008))等の低分子阻害剤、G9aに対するsiRNAおよびshRNA（例、G9a siRNA(human)(Santa Cruz Biotechnology)等）等の核酸性発現阻害剤など］、L-channel calcium agonist (例えばBayk8644) (Cell Stem Cell, 3, 568-574 (2008))、UTF1(Cell Stem Cell, 3, 475-479 (2008))、Wnt Signaling活性化剤（例えばsoluble Wnt3a）（Cell Stem Cell, 3, 132-135 (2008)）、2i/LIF (2iはmitogen-activated protein kinase signallingおよびglycogen synthase kinase-3の阻害剤、PloS Biology, 6(10), 2237-2247 (2008))、ES細胞特異的miRNA（例えば、miR-302-367クラスター (Mol. Cell. Biol. doi:10.1128/MCB.00398-08)、miR-302 (RNA (2008) 14: 1-10)、miR-291-3p, miR-294およびmiR-295(以上、Nat. Biotechnol. 27: 459-461 (2009))）、3’-phosphoinositide-dependent kinase-1 (PDK1) acitvator（例、PS48 (Cell Stem Cell, 7: 651-655 (2010)) など）、神経ペプチドY（WO 2010/147395）、プロスタグランジン類（例えば、プロスタグランジンE2およびプロスタグランジンJ2）（WO 2010/068955）等が挙げられるが、それらに限定されない。
前記で核酸性の発現阻害剤はsiRNAもしくはshRNAをコードするDNAを含む発現ベクターの形態であってもよい。

尚、前記核初期化物質の構成要素のうち、例えばSV40 large T等は、体細胞の核初期化のために必須ではなく補助的な因子であるという点において、iPS細胞の樹立効率改善物質の範疇にも含まれ得る。核初期化の機序が明らかでない現状においては、核初期化に必須の因子以外の補助的な因子について、それらを核初期化物質として位置づけるか、あるいはiPS細胞の樹立効率改善物質として位置づけるかは便宜的であってもよい。即ち、体細胞の核初期化プロセスは、体細胞への核初期化物質およびiPS細胞の樹立効率改善物質の接触によって生じる全体的事象として捉えられるので、当業者にとって両者を必ずしも明確に区別する必要性はないであろう。

これら他のiPS細胞の樹立効率改善物質の体細胞への接触は、該物質が(a) タンパク性因子である場合、(b) 該タンパク性因子をコードする核酸である場合に応じて、TEAD3の機能阻害物質についてそれぞれ上記したと同様の方法により、実施することができる。該物質が低分子化合物である場合は、該物質を体細胞の培地に適切な濃度となるように添加すればよい。

(E) 培養条件による樹立効率の改善
体細胞の核初期化工程において低酸素条件下で細胞を培養することにより、iPS細胞の樹立効率をさらに改善することができる。本明細書において「低酸素条件」とは、細胞を培養する際の雰囲気中の酸素濃度が、大気中のそれよりも有意に低いことを意味する。具体的には、通常の細胞培養で一般的に使用される5-10% CO₂/95-90%大気の雰囲気中の酸素濃度よりも低い酸素濃度の条件が挙げられ、例えば雰囲気中の酸素濃度が18%以下の条件が該当する。好ましくは、雰囲気中の酸素濃度は15%以下（例、14%以下、13%以下、12%以下、11%以下など）、10%以下（例、9%以下、8%以下、7%以下、6%以下など）、または5%以下（例、4%以下、3%以下、2%以下など）である。また、雰囲気中の酸素濃度は、好ましくは0.1%以上（例、0.2%以上、0.3%以上、0.4%以上など）、0.5%以上（例、0.6%以上、0.7%以上、0.8%以上、0.95以上など）、または1%以上（例、1.1%以上、1.2%以上、1.3%以上、1.4%以上など）である。
低酸素培養に関するより詳細な培養条件については、例えば、国際公開第2010/013845号公報を参照することができる。

核初期化物質およびTEAD3の機能阻害物質を接触させた後、細胞を、例えばES細胞の培養に適した条件下で培養することができる。マウス細胞の場合、通常の培地に分化抑制因子としてLeukemia Inhibitory Factor（LIF）を添加して培養を行う。一方、ヒト細胞の場合には、LIFの代わりに塩基性線維芽細胞増殖因子（bFGF）および／または幹細胞因子（SCF）を添加することが望ましい。また通常、細胞は、フィーダー細胞として、放射線や抗生物質で処理して細胞分裂を停止させたマウス胎仔由来の線維芽細胞（MEF）の共存下で培養される。MEFとしては、通常STO細胞等がよく使われるが、iPS細胞の誘導には、SNL細胞（McMahon, A. P. & Bradley, A. Cell 62, 1073-1085 (1990)）等がよく使われている。フィーダー細胞との共培養は、核初期化物質およびTEAD3の機能阻害物質の接触より前から開始してもよいし、該接触時から、あるいは該接触より後（例えば1-10日後）から開始してもよい。

iPS細胞の候補コロニーの選択は、薬剤耐性とレポーター活性を指標とする方法と目視による形態観察による方法とが挙げられる。前者としては、例えば、分化多能性細胞において特異的に高発現する遺伝子（例えば、Fbx15、Nanog、Oct3/4など、好ましくはNanogまたはOct3/4）の遺伝子座に、薬剤耐性遺伝子および／またはレポーター遺伝子をターゲッティングした組換え体細胞を用い、薬剤耐性および／またはレポーター活性陽性のコロニーを選択するというものである。そのような組換え体細胞としては、例えばFbx15遺伝子座にβgeo（β-ガラクトシダーゼとネオマイシンホスホトランスフェラーゼとの融合タンパク質をコードする）遺伝子をノックインしたマウス由来のMEF（Takahashi & Yamanaka, Cell, 126, 663-676 (2006)）、あるいはNanog遺伝子座に緑色蛍光タンパク質（GFP）遺伝子とピューロマイシン耐性遺伝子を組み込んだトランスジェニックマウス由来のMEF（Okita et al., Nature, 448, 313-317 (2007)）等が挙げられる。一方、目視による形態観察で候補コロニーを選択する方法としては、例えばTakahashi et al., Cell, 131, 861-872 (2007)に記載の方法が挙げられる。レポーター細胞を用いる方法は簡便で効率的ではあるが、iPS細胞がヒトの治療用途を目的として作製される場合、安全性の観点から目視によるコロニー選択が望ましい。

選択されたコロニーの細胞がiPS細胞であることの確認は、上記したNanog（もしくはOct3/4）レポーター陽性（ピューロマイシン耐性、GFP陽性など）および目視によるES細胞様コロニーの形成によっても行い得るが、より正確を期すために、アルカリフォスファターゼ染色や、各種ES細胞特異的遺伝子の発現を解析したり、選択された細胞をマウスに移植してテラトーマ形成を確認する等の試験を実施することもできる。

このようにして樹立されたiPS細胞は、種々の目的で使用することができる。例えば、ES細胞で報告されている分化誘導法を利用して、iPS細胞から種々の細胞（例えば、心筋細胞、血液細胞、神経細胞、血管内皮細胞、インスリン分泌細胞等）への分化を誘導することができる。したがって、患者本人やHLAの型が同一もしくは実質的に同一である他人から採取した体細胞を用いてiPS細胞を誘導すれば、そこから所望の細胞（即ち、該患者が罹病している臓器の細胞や疾患に対する治療効果を発揮する細胞など）に分化させて該患者に移植するという、自家移植による幹細胞療法が可能となる。さらに、iPS細胞から分化させた機能細胞（例えば、肝細胞）は、対応する既存の細胞株よりも実際の生体内での該機能細胞の状態をより反映していると考えられるので、医薬候補化合物の薬効や毒性のin vitroスクリーニング等にも好適に用いることができる。

以下に、実施例によって本発明を更に説明するが、本発明は以下の実施例になんら限定されるものではない。

材料及び方法
［方法１］細胞培養
マウス胚線維芽細胞（MEFs）の初代培養は、以前に記載された確立した方法（Okitaら、2007）に従って行った。MEFsは、10%ウシ胎仔血清（FBS、Invitorogen）を添加したダルベッコ変法イーグル培地（DMEM、ナカライテスク）中で37℃、5% CO₂条件下で培養した。DMEMは0.5%ペニシリン及びストレプトマイシン（Invitorogen）とともに供給された。ヒト皮膚線維芽細胞（HDF）は同等の条件下で培養した。MEF及びHDF由来iPS細胞は、白血病抑制因子（LIF）を添加した、15% FBS、2mM L-グルタミン（Invitorogen）、0.1 mM 非必須アミノ酸（Invitorogen）、0.1 mM 2-メルカプトエタノール（Invitorogen）及び0.5%ペニシリン及びストレプトマイシンを含むDMEM中で培養した。

［方法２］マウスｉＰＳ細胞の作製
iPS細胞は、以前の記載（Okitaら、2007; Takahashi及びYamanaka、2006）に多少の改変を加えた方法により樹立した。ウェルあたり細胞1×10^５個のMEFsを播種し、一晩培養した。24時間後、4種類の因子（Oct3/4、Sox2、Klf4及びc-Myc; 本明細書では“4F”と略記する場合がある）がNanog-GFPカセットに挿入されたレトロウイルスを感染させることにより、4Fを前記MEFsに導入した。24時間後、前記細胞を1回継代し、マイトマイシンCで処理されたSNL細胞のフィーダー層の上に、ディッシュあたり2.5×10³個となるように播種した。翌日、培地をマウスiPS細胞培地に置換し、その後30日間培養した。

［方法３］レトロウイルスベクターを用いたヒトiPS細胞の作製
iPS細胞は、以前の記載（Takahashiら、2007）に多少の改変を加えた方法により樹立した。HDFsをウェルあたり細胞1×10⁵個となるように播種し、一晩培養した。24時間後、レトロウイルス感染により、4種類の因子（4F: OCT3/4、SOX2、KLF4及びc-MYC）又は3種類の因子（前記4Fからc-MYCを除いたもの、本書では“3F”と呼ぶ場合がある）を前記HDFsに導入した。96時間後、前記細胞を継代し、2.5×10^５個（4種類の因子）又は5×10⁵個（3種類の因子）となるように、マイトマイシンCで処理されたSNL細胞のフィーダー層の上に播種した。翌日、培地を4 ng/mLのヒト塩基性繊維芽細胞成長因子（bFGF）を添加した霊長類ES培地（ReproCELL、日本）に置換し、その後30日間培養した。

［方法４］エピソーマルベクターを用いたヒトiPS細胞の作製
iPS細胞は、以前の記載（Okitaら、2011）に多少の改変を加えた方法により樹立した。HDFsは、10% FBSを添加したDMEM中で培養した。Neonトランスフェクションシステム（Invitorogen）の指示書に従い、3 μgの発現プラスミド混合物（pCXLE-hOCT3/4-shp53、pCXLE-hSOX2-hKLF4及びpCXLE-hLIN28-hL-MYC）を、100 μLのキット溶液とともに、6×10⁵個のHDFsにエレクトロポレーション法により導入した。エレクトロポレーションは、1650 V、10 msで、3回（3パルス）行った。トランスダクションの4日後に前記細胞をトリプシン処理し、マイトマイシンC処理されたSNL細胞のフィーダー層で覆われた100 mmディッシュ上に、2×10⁵個の細胞密度で再播種した。翌日、培地を、bFGFを添加した霊長類ES細胞培地に置換し、その後30日間培養した。

［方法５］アルカリ性ホスファターゼ染色及び免疫細胞化学
アルカリ性ホスファターゼ（AP）染色は、アルカリ性ホスファターゼ検出キット（Sigma）のプロトコールに従って行った。免疫細胞化学的な解析を行うために、前記細胞を、4%パラホルムアルデヒド含有PBS中室温で20分間処理して固定した。PBSでの洗浄後、前記細胞をブロッキング溶液（5%正常ヤギ血清（Millipore）、1%ウシ血清アルブミン（BSA、ナカライテスク）及び0.2% Triton X-100を含むPBS）で室温にて45分間処理した。一次抗体及び希釈率は以下のとおり。
抗OCT4抗体（1:50、Santa Cruz、sc-5279）、抗SOX2抗体（1:100、Abcam、ab75485）及び抗TRA1-60抗体（1:50、Millipore、MAB4360）。二次抗体には、Alexa Fluor 488標識抗マウスIgG（1:500、Invitrogen、A-11001）を使用した。核染色には、Hoechst 33342（1 μg/mL、Invitrogen）を使用した。

［方法６］分化誘導
iPS細胞は、0.25%トリプシン（Invitrogen）、0.1 mg/mL コラゲナーゼIV（Invitrogen）、20% KSR及び0.1 mM CaCl₂含有CTK溶液を用いて回収した。得られた細胞塊を、bFGFを含まず10 μMのY-27632（Wako）を含む霊長類ES培地中に懸濁し、胚様体を形成するために超低結合性プレート（Corning）に播種して、胚様体を形成させた。前記胚様体を8日間浮遊培養した後、ゼラチンでコーティングしたプレート上に播種し、さらに8日間培養した。その後、前記細胞に対し、免疫細胞化学的解析を行った。使用した一次抗体は以下のとおり。
抗Tuj1抗体（1:100、Chemicon: MAB1637）、抗α-平滑筋アクチン抗体（α-SMA、1:500、DAKO: M085101）及び抗α-フェトプロテイン抗体（1:100、R&D: MAB1368）。二次抗体には、Alexa488標識抗マウスIgG（1:500、Invitrogen: A-11001）を使用した。

［方法７］マイクロアレイの前処理及び差次遺伝子発現解析
単色AgilentDNAマイクロアレイスキャナーを用いてマイクロアレイスライドをスキャンし、初期設定のパラメーターを用いて解析した。生データはRStudio（Rビジュアル・スクリプト）にローディングし、読み取り、探索及び前処理用の遺伝子発現データはBioconductorパッケージLimmaを用いて解析した。差次的遺伝子発現解析（DEG）には、Limmaのワークフローを使用した。階層的クラスター系統樹（Hierachical derived）は、statパッケージのhclust及びclusterパッケージのagnesを用いて作成した。DistanceはManhattan city-block distance法を用いて計算し、k-平均はkmeans機能を用いて計算した。距離及び相関マトリックスは、factoroextraパッケージに含まれるget_dist、fviz_distを用いて視覚化した。クラスター散布図は、fviz_cluster機能を用いて計算した。DEGsについての発現データをRスクリプトを用いてクラスター化し、Heatmapsを作成した。遺伝子オントロジーと遺伝子クラスターの統計的解析は、DOSE及びclusterProfilerパッケージを用いて解析した。なお、本願で取得したマイクロアレイデータは、Gene Expression Omnibusでアクセッション番号GSE56167として利用可能である。

［方法８］遺伝子サイレンシング
p53遺伝子の継続的なノックダウンは、以前の記載（Hongら、2009; Masutomiら、2003）に多少改変を加えて、短鎖ヘアピンRNA（shRNA）を用いて行った。4Fとともに、p53遺伝子に対するshRNA（pMKO.1-puro p53 shRNA-2; Addgene plasmid 10672）又は模擬ベクター（pMXs）を、レトロウイルス感染によりMEFまたはHDFに導入した。
TEAD3遺伝子の継続的なノックダウンは、TEAD3のmRNAに対する2種のｓhRNA sh#1及びsh#2 (標的mRNA配列：sh#1 5’-AGCATGACCATCAGCGTCTCCACCAAGGT-3’ (配列番号５)； sh#2 5’- AGCAACCAGCACAATAGCGTCCAACAGCT-3’ (配列番号４)) を用いて行った。HDFsを6穴プレートに1×10^５細胞/ウェルとなるように播種し、一晩培養した。翌日、4Fとともに、shRNA又は模擬ベクター（pSINsi-hH1）をレトロウイルス感染により前記HDFsに導入した。4日後、前記細胞をトリプシン処理によって回収し、マイトマイシンC処理したSNL細胞フィーダー層上に2×10⁵細胞/100 mmディッシュとなるように播種した。

［方法９］テラトーマ形成
iPS細胞をCTK溶液を用いて回収し、60 mmディッシュに播種した。コンフルエントになるまで培養した後、細胞を回収し、非肥満糖尿病/重度複合免疫不全（NOD-SCID）マウス（CREA、日本）の精巣に注入した。注入から3か月後、得られた腫瘍を切開し、PBS中4%パラホルムアルデヒドで固定した。パラフィン包埋組織から薄切された切片をヘマトキシリン及びエオジンで染色した。

動物福祉
本研究は京都大学の動物実験規則の勧告を厳密に順守して実施した。

結果
１）マウス胚線維芽細胞（MEF）の初期化に対する、p38阻害の促進効果
［方法２］に従って、MEFからiPSCを作製した。その際、レトロウイルスによる4F導入から24時間後に、DMSO（vehicle、陰性コントロール）、p38選択的阻害剤（SB202190、Calbiochem、10 μM）、またはMEFの初期化効率を促進することが既知の7化合物のいずれかを培地に添加し、98時間後にそれらを含まない培地に置換した。前記7化合物とその処理濃度は以下の通りである；ビタミンC（Sigma、10 μg/mL）、バルプロ酸（Sigma、1.9 mM）、CHIR99021（Calbiochem、3 μM）、PD0325901（Calbiochem、0.5 μM）、インターロイキン-6（R&D、0.2 ng/mL）、AS601245（Calbiochem、5 μM）、ラパマイシン（Sigma、1 μM）。4F導入の陰性コントロールとして、4Fをコードしないレトロウイルス（空ベクター）を感染させた細胞に対し、同様の薬剤処理を行った。また、ウイルス感染効率を評価するために、4FとDsRed遺伝子が挿入されたレトロウイルス（4F+DsRed）を感染させて、同様の操作を行った。

4F導入から21日後（Day21）と28日後（Day28）にGFP陽性コロニー数を計測し、4F導入陰性コントロールのGFP陽性コロニー数と比較して、初期化効率をそれぞれ計算した。その際、前記4FとDsRed遺伝子が挿入されたレトロウイルス（4F+DsRed）を感染させて得られたGFP陽性コロニー数による補正（ウイルス感染効率による補正）を行った。結果を図１Ａに示す。なお、以降の初期化効率の解析でも同様の補正を行ったが、説明を割愛する。
図１Ａに示されるように、p38選択的阻害剤（SB202190）で処理したMEFからは、Day21とDay28のいずれにおいても、DMSO処理したMEFと比べて2倍近いGFP陽性コロニーが得られた。そして、当該GFP陽性コロニー数は、前記既知7化合物の中で最も効果の高かった抗酸化剤（VC、ビタミンC）及びGSK3β阻害剤（CH、CHIR99021）処理で得られたGFP陽性コロニー数とほぼ同等であった。

続いて、薬剤処理する期間を変えて解析を行った。図１Ｂに記載した4通りの期間（A：Days 1～4、B：Days 1～8、C：Days 8～16、D：Days 1～16）にDMSOまたはSB202190を培地に添加し、Day21とDay28にGFP陽性コロニー数を計測した。結果を図１Ｃに示す。
図１Ｃに示されるように、初期フェーズ（期間A）にSB202190処理した実験群では、コントロール（同期間にDMSO処理）と比べて、Day21、Day28におけるGFP陽性コロニー数がいずれも大幅に増加した。そして、図１Ｄに示されるように、期間AにSB202190処理した実験群では、Day21よりもDay28の方が、GFP陽性コロニー数が増加する傾向が認められた。さらに、図１Ｅに示されるように、期間AにSB202190処理した実験群では、Day21、Day28のいずれの時点においても、期間DにSB202190処理した実験群よりもGFP陽性コロニー数が有意に多かった。興味深いことに、SB202190で長期間処理すると、iPS細胞の増殖が抑制されたことから（図７Ａ）、後期フェーズにおけるp38阻害は初期化を損なう可能性が示唆される。初期フェーズ（期間A）にSB202190処理して得たマウスiPS細胞からキメラ胚を作製し、仮親に移植したところ、複数の組織へと首尾よく分化し（図７Ｂ）、ジャームライントランスミッションも確認された（図７Ｃ）。

これらの結果から、マウス細胞に初期化因子を発現させて初期化する際にp38を阻害すると、初期化効率が顕著に増加することが明らかになった。さらに、マウス細胞では、初期化の初期フェーズにおいてp38を阻害すると、非常に顕著な初期化促進効果が得られることが明らかになった。

２）ヒト皮膚線維芽細胞（HDF）の初期化に対する、p38阻害の促進効果
p38の阻害がヒト細胞に対しても同様の効果を奏するかどうか、複数のP38選択的阻害剤を用いて検討した。HDFからiPSCを作製する工程（［方法３］）において、図２Ａに記載された4通りの期間（A～D）に、DMSO（陰性コントロール）またはp38選択的阻害剤（SB202190、SB203580、SB239063（すべてCalbiochem社製、終濃度10 μM）のいずれかを培地に添加し、4F導入から16日後（Day16）、24日後（Day24）、32日後（Day32）にGFP陽性コロニー数を計測した。初期化効率の計算方法は、前記１）のMEFの初期化効率の計算方法に従った。期間AまたはDに阻害剤処理した実験群の結果を図２Ｂに示す。期間Aに阻害剤処理した実験群では、前記３種類の阻害剤いずれを用いた場合にも、Day24およびDay32のGFP陽性コロニー数はコントロール（DMSO処理）の実験群よりも顕著且つ有意に多かった（図２Ｂ、左棒グラフ）。さらに、期間Dに阻害剤処理した実験群でも、前記阻害剤の種類に関わらず、コントロールに比べてGFP陽性コロニー数が顕著に多くなる傾向が認められた（図２Ｂ、右棒グラフ）。特に、SB202190またはSB203580を全フェーズ（期間D）にわたって添加した場合には、初期フェーズでのみ添加した場合と比べて、Day32におけるGFP陽性コロニー数が2倍以上に有意に増加することが示された。

よって、マウス細胞のみならずヒト細胞でも、初期化工程においてp38を阻害すると、初期化効率が顕著に増加することが示された。さらに、ヒト細胞の初期化では、初期フェーズだけでなく、全フェーズにわたってp38を阻害した場合にも、非常に高い初期化促進効果（初期化フェーズでのみp38阻害した場合の2倍以上）が得られることが明らかになった。
さらに、上記結果から、マウス細胞とヒト細胞では初期化工程におけるp38の役割に差異があり、ヒト細胞の方がp38によって初期化が強く阻害されている可能性が示唆された。

SB202190で処理して得られたヒトiPSCは、Day32から30回継代培養しても、ESC様の形態を維持し（図２Ｃ）、ESC特異的マーカーであるアルカリホスファターゼを発現していた（図２Ｄ、［方法５］）。さらに、OCT4、SOX2、及びTRA-1-60の発現が認められ(図２Ｅ、［方法５］)、ヒトESC様のマーカープロファイルを示すことが確認された。

さらに、4Fでなく3F（Oct3/4、Sox2及びKlf4）をレトロウイルスベクターで、または4Fをエピソーマルベクターで導入・発現させて初期化する場合についても、同様の解析を行った。期間AにSB202190処理し、Day24およびDay32にGFP陽性コロニー数を計測した結果を図２Ｆ、Ｇに示す。

3Fで初期化した場合（図２Ｆ）、エピソーマルベクターで4Fを発現させた場合（図２Ｇ）のいずれにおいても、コントロール（DMSO）群と比べて、最終的に得られるGFP陽性コロニー数は顕著且つ有意に増加した。

よって、初期化因子の種類および初期化因子の導入方法に関わらず、ヒト細胞を初期化する際にp38を阻害すると、初期化効率が顕著に増加することが示された。なお、HDF又は4F導入したHDFを96時間p38阻害剤で処理すると細胞増殖が促進されたが（図８Ａ及びＢ）、HDF由来のiPSCを同様に処理しても、ヒトiPSCの増殖速度は変化しなかった（図８Ｃ）。即ち、p38阻害はヒトiPSCの増殖促進を介してiPSC数を増加させるわけではないことが示された。

３）p38を阻害して得られたヒトiPSCの分化能力
初期化工程でp38を阻害して得られたヒトiPSCの分化能力について解析した。SB202190処理して得られたHDF由来iPSCから３クローン（SB1～SB3）を樹立し、当該クローンについて、多能性の指標となるSOX2、OCT4、及びNANOGの発現量を解析した（図３Ａ）。図３Ａに示されるように、SB1～SB3では、HDF（HD）と比べて、p38を阻害せずに初期化して得られたヒトiPSC（DM、B7）やES細胞（ES）と同程度またはそれ以上に、SOX2、OCT4、及びNANOGのmRNA量が増加していた。また、核型解析では核型正常であることが確認され（図３Ｂ）、これにより、初期化工程でp38を阻害しても染色体の安定性は損なわれないことが示された。さらに、これらのクローンを胚様体経由で三胚葉に分化誘導（［方法６］）すると、平滑筋アクチン（A-SMA）を発現する中胚葉、β-IIIチューブリン（B-3-TUBULIN）を発現する外胚葉、α－フェトタンパク質（AFP）を発現する内胚葉にそれぞれ分化した（図３Ｃ）。また、［方法９］に従いインビボでの奇形腫（teratoma）形成能を解析した結果、解析した全クローンから奇形種が形成され、神経上皮、軟骨、及び種々の腺構造を含む三胚葉に分化したことが確認された（図３Ｄ）。よって、初期化工程でp38を阻害して得られたヒトiPSCは、インビトロ、インビボの両方において、三胚葉への分化能力を備えていることが示された。

さらに、新たなドナー４人に由来するHDF（HDF1616、HDF1079、HDF1078及びTig109）の初期化効率に対するp38阻害の効果を解析した。前記２）と同様に、初期化工程の期間ＤにSB202190で処理し、Day32にGFP陽性コロニー数を計測した結果を図３Ｅに示す。いずれのドナー由来HDFを用いた場合にも、コントロールに比べてSB202190処理した実験群ではGFP陽性コロニー数が大幅に増加すること、すなわち、p38阻害剤処理によって初期化効率が大幅に促進されることが確認された。

以上の結果より、初期化工程でp38を阻害して得られるヒトiPSCは、p38阻害せずに得られるヒトiPS細胞やES細胞と比べても遜色なく、核型正常で、三胚葉への分化能力を備えていることが確認された。

４）p38とp53のいずれによっても発現量が減少する遺伝子の解析
p53は、ヒト及びマウス細胞の初期化において、強力な初期化バリアとして機能する遺伝子である。図４Ｂに示されるように、４Fによる初期化の際に、p53 mRNAに対するshRNA（図４Ａ）を用いてp53を継続的にノックダウンすると（［方法８］）、iPS細胞コロニー数は顕著且つ有意に増加する（shp53のバー）。驚くべきことに、p53の継続的ノックダウンに加えてさらに期間ＡにSB202190処理した実験群（shp53＋SB202190のバー）では、各単独処理によって得られるiPS細胞コロニー数（shp53、SB202190の各バー）のコントロール（DMSOのバー）に対する増加分の和よりも遥かに多くのiPS細胞コロニー数が得られた（図４Ｂ）。よって、p53のノックダウンとp38阻害は、初期化に対し相乗的な効果（促進効果）を奏することが示された。そして、この結果より、p53とp38によって、直接または間接的に、共通に制御される転写因子の存在が示唆された。

P53のノックダウンとp38阻害によって生じる変化の関連性と、それらの初期化効率増加（△iPS細胞コロニー数）との関連性を調べるために、全mRNAのトランスクリプトームに基づく主成分分析（PCA）を行った。その結果、３つの主成分(PC1 54.37%, PC2 19.64%, PC3 18.57%)を同定し、これらの主成分の発現量をもとにそれぞれのサンプルをプロットし、発現プロファイルの変化を確認した（図４Ｃ）。さらに、これらの多能性トランスクリプトームは階層的クラスター分析の結果３つのクラスターに分類され（図４Ｄ上パネル）、SB202190処理とshp53・SB202190二重処理は同じクラスター（クラスターC）に分類されたことから、ある成分の類似性が示唆された。しかしながら、Sample correlation matrix解析からは、多数の遺伝子が前記４つの処理によって別々に制御されていることが示され、特にDMSO処理と二重処理の差が最も大きいことが示された（図４Ｄ下パネル）。同様に、クラスタースキャタープロットにおけるk-平均アルゴリズムでは、クラスターA（DMSO処理群）が他のクラスターから最も遠位にマップされ、shp53又はp38阻害の何れかによって制御される多能性トランスクリプトームは第１次元の方向に沿って最も分離することが示された（図４Ｅ）。この結果は上記PCA解析と整合するものである。

初期化効率増加のカギとなる因子を同定するために、各クラスター間で発現量変動遺伝子（DEG）解析を行った。その結果、SB202190で誘導されたDEGとして1147遺伝子、shp53で誘導されたDEGとして2185遺伝子が見いだされ（図4F）、各クラスター間で非常に大きな遺伝子発現変化が生じていることが明らかになった。

５）初期化バリアとして機能する遺伝子の同定
初期化の強力なバリアとして機能する遺伝子を同定するために、まず、shp53処理群とshp53・SB202190二重処理群とで発現量が低下する遺伝子を解析し、このうち、二重処理群特異的に発現量が低下する遺伝子として651遺伝子を同定した（図５Ａ上のDOWN1）。同様に、SB202190処理群とshp53・SB202190二重処理群とで発現量が低下する遺伝子を解析し、このうち、二重処理群特異的に発現量が低下する遺伝子として1056遺伝子を同定した（図５Ｂ上のDOWN2）。さらに、shp53処理群と二重処理群、SB202190処理群と二重処理群のそれぞれ解析でfold changeが２以下のものを除外し2-fold cutoffを行い、DOWN1とDOWN2に共通するものとして340遺伝子を同定した（図５Ｃ）。

前記340遺伝子のうち、31遺伝子が、転写因子またはDNA結合活性のあるものとして分類された（図５Ｄ）。前記340遺伝子のGOエンリッチメント解析では、主なGOタームとして、チロシンキナーゼ活性/膜受容体型キナーゼ活性/膜受容体型チロシンキナーゼ活性、コラーゲン結合/コラーゲン受容体活性、オリゴ糖転移酵素活性等がヒットした（図５Ｅ）。

本発明者らは、前記31遺伝子に対してさまざまな検討を行った結果、最終的に、前記31遺伝子の中から、体細胞初期化の強力なバリアをして機能する遺伝子として、TEAD3を見出した。まず、4FによるHDFの初期化におけるp53及び／又はp38阻害の効果と内因性TEAD3の発現との関係を調べた。その結果、4F導入のみ（ベヒクル（DMSO）処理）の場合と比較して、p53又はp38をそれぞれ単独で阻害するとTEAD3の発現は顕著に低下したが、p53及びp38を二重阻害すると、TEAD3の発現はさらに大きく低下した（図６Ａ）。

６）TEAD3の発現阻害による初期化効率の増加
次に、TEAD3に対する特異的なshRNA（4F-shTEAD3#1、#2の2種類、図６Ｂ）を用いて、初期化に対するTEAD3の役割を解析した。４FによるHDFの初期化（［方法２］）の際にこれらのshRNAを発現させると、TEAD3の発現量が大幅に減少し（図６Ｃ）、GFP陽性コロニー数が顕著且つ有意に増加することが示された（図６Ｄ）。また、TEAD3 shRNAを発現させて得られたコロニーは、アルカリホスファターゼ陽性であることも確認された（図６Ｅ）。よって、HDFを初期化する際にTEAD3の発現を減少させると、初期化効率が顕著に増加することが示された。

MEFのトランスクリプトームデータを含むGSE36664データセット（J Biol Chem 2012 Oct 19;287(43):35825-37.参照）、ヒト肺線維芽細胞トランスクリプトームデータを含むGSE45276データセット（Mol Cell 2011 Apr 8;42(1):36-49.参照）、並びにHDFのトランスクリプトームデータセットを用い、TEAD3とp53の発現の相関を調べたところ、いずれの細胞でも正の相関が認められ（図９）、p53が初期化バリアであるTEAD3の発現を正に制御していることを示唆している。HDFのシングルセルRNA-Seqデータセットの解析から、TEAD3とMAPK13（p38δ）、ERK4（MAPK4）及びp44-ERK1（MAPK3）との正の相関、並びに、TEAD3とCDK4やCDK6等の細胞周期の進行を制御するサイクリン依存性キナーゼとの負の相関が明らかとなった（図１０）。

TEAD3阻害による細胞周期カイネティクスへの寄与を通じたiPSCコロニー形成能の増大が腫瘍形成と関連するか否かを調べるために、TEAD3発現レベルの異なるHeLa細胞の腫瘍様塊の形成能を試験した。shRNA導入によりTEAD3発現が低下した細胞由来の腫瘍様塊の数及びサイズは、コントロール細胞由来の腫瘍様塊と比べて有意に増大していた（図１１）。また、ヒト子宮頸がんの腫瘍組織では、正常組織に比べてTEAD3の発現が低下しており、がんの進展におけるTEAD3の役割が確認された（図１２）。

4F及びTEAD3に対するshRNAを導入したHDFは4Fのみ（4F+非特異的shRNA）を導入したHDFよりも初期化速度が速かった（図１３Ａ及びＢ）。これは、初期化の初期フェーズにおけるより速い細胞増殖によって部分的に説明できるであろう（図１３Ｃ及びＥ）。しかし、いったん多能性を獲得すると、4Fのみを導入して得たヒトiPSCと、TEAD3に対するshRNAをさらに導入して得たヒトiPSCとは、よく似た速度で増殖し（図１３Ｄ及びＦ）、細胞周期チェックポイントの復元によるTEAD3阻害で誘導されたiPSCクローンの安全性が示唆された。

GSE116309データセット（Stem Cell Reports 2019 Feb 12;12(2):319-332.参照）を用いて、MEFからiPS細胞への初期化過程におけるTEAD3の発現の変動を調べたところ、多能性獲得の直前にTEAD3の発現が急激に低下していた（図６Ｆ）。SSEA1はMEFにおける初期の初期化マーカーであり、首尾よく初期化にコミットしたことを示す。そこで、GSE106835データセット（Cell Stem Cell 2018 Aug 2;23(2):289-305.e5.参照）を用い、MEFからiPS細胞への初期化過程におけるTEAD3の発現の変動をSSEA1陽性細胞とSSEA1陰性細胞についてそれぞれ調べた。その結果、SSEA1陽性のMEF初期化中間体でのみ、多能性獲得のためにTEAD3発現が下方制御されていた（図６Ｇ）。このことは、首尾よく初期化にコミットした細胞のみが初期化を阻もうとする細胞のメカニズムを克服するのにTEAD3の発現低下を必要とすることを示している。

さらに、本発明者らはTEAD3発現の制御メカニズムの探索を行った。まずTEAD3 mRNA配列に基づいて、ゲノムDNA情報からその5’上流のプロモーター領域の配列を取得し、既知の転写開始サイト（TSS）配列をクエリーとして、該プロモーター配列に対してBlastを行ったところ、TSSコンセンサス配列の1つであるAGGGCGGAGC（配列番号６）と100%マッチする配列が存在することを見出した。そこで、このTSS配列に結合し得る転写因子を検索したところ、KLF4が該TSS配列と結合し得ることが推定された（図６Ｈ）。さらに、KLF4が結合することが既知の標的遺伝子群の結合シスエレメント配列の解析の結果、KLF4の結合コンセンサス配列としてGGGCGGGGC（配列番号７）が同定され、TEAD3のTSS配列と高いホモロジーを有することが確認された（図６Ｉ）。KLF4は部分的にp38によって制御されることが示唆されていることから、p38を阻害するとKLF4がTEAD3の転写を抑制することで多能性獲得を促進しているのかもしれない。
また、TEAD3のプロモーター領域の探索の結果、p53が結合し得るコンセンサス配列の存在が確認された。

これらの結果より、TEAD3は、ヒト細胞の初期化を阻む強力なバリアとして機能しており、当該発現または活性を阻害することで前記細胞の初期化効率が促進されることが明らかになった。

本発明によれば、核初期化工程においてTEAD3の機能を阻害することにより、p38経路とp53経路とを二重阻害するのと同等に、顕著にiPS細胞樹立効率を改善することができる。本発明に係る方法は、さまざまな方法での初期化に有効であるため、ヒトiPS細胞の再生医療への応用に関して、安全性とコストの両面できわめて有用である。

本出願は、日本国に2020年6月11日付で出願された特願2020-101932を基礎としており、ここで言及することによりその内容はすべて本明細書中に包含されるものである。

Claims (5)

1. 人工多能性幹（iPS）細胞の樹立効率の改善方法であって、体細胞の核初期化工程において転写エンハンサー関連ドメインファミリー メンバー-3（TEAD3）の体細胞としての固有性を維持する遺伝子群の転写活性化機能を阻害することを含み、
   以下の（ａ）～（ｅ）：
   （ａ）TEAD3遺伝子の転写産物に対してRNAi活性を有する核酸もしくはその前駆体；
   （ｂ）TEAD3遺伝子の転写産物に対するアンチセンス核酸；
   （ｃ）TEAD3遺伝子の転写産物に対するリボザイム核酸；
   （ｄ）TEAD3のドミナントネガティブ変異体又はそれをコードする核酸；又は
   （ｅ）TEAD3に対するデコイ核酸
   を体細胞に導入することによりTEAD3の体細胞としての固有性を維持する遺伝子群の転写活性化機能を阻害する、方法。
2. TEAD3の体細胞としての固有性を維持する遺伝子群の転写活性化機能の阻害物質を含有してなる、iPS細胞の樹立効率改善剤であって、
   前記阻害物質が、以下の（ａ）～（ｅ）：
   （ａ）TEAD3遺伝子の転写産物に対してRNAi活性を有する核酸もしくはその前駆体；
   （ｂ）TEAD3遺伝子の転写産物に対するアンチセンス核酸；
   （ｃ）TEAD3遺伝子の転写産物に対するリボザイム核酸；
   （ｄ）TEAD3のドミナントネガティブ変異体又はそれをコードする核酸；又は
   （ｅ）TEAD3に対するデコイ核酸
   である、剤。
3. 体細胞に核初期化物質及びTEAD3の体細胞としての固有性を維持する遺伝子群の転写活性化機能の阻害物質を接触させることを含む、iPS細胞の製造方法であって、
   前記阻害物質が、以下の（ａ）～（ｅ）：
   （ａ）TEAD3遺伝子の転写産物に対してRNAi活性を有する核酸もしくはその前駆体；
   （ｂ）TEAD3遺伝子の転写産物に対するアンチセンス核酸；
   （ｃ）TEAD3遺伝子の転写産物に対するリボザイム核酸；
   （ｄ）TEAD3のドミナントネガティブ変異体又はそれをコードする核酸；又は
   （ｅ）TEAD3に対するデコイ核酸
   である、方法。
4. 核初期化物質がOct3/4、Klf4及びSox2、又はそれらをコードする核酸である、請求項３に記載の方法。
5. 核初期化物質がOct3/4、Klf4、Sox2、及びc-Myc、L-MycもしくはN-Mycであるか、あるいはそれらをコードする核酸である、請求項３に記載の方法。