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JP7817138B2 - 腫瘍浸潤リンパ球の製造方法及び免疫療法におけるその使用方法 - Google Patents
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JP7817138B2 - 腫瘍浸潤リンパ球の製造方法及び免疫療法におけるその使用方法 - Google Patents

腫瘍浸潤リンパ球の製造方法及び免疫療法におけるその使用方法

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Description

関連出願の相互参照
[0001] 本願は、２０１７年３月２９日に出願された米国仮特許出願第６２／４７８，５０６号、２０１７年７月３１日に出願された米国仮特許出願第６２／５３９，４１０号、２０１７年８月２１日に出願された米国仮特許出願第６２／５４８，３０６号、２０１７年９月５日に出願された米国仮特許出願第６２／５５４，５３８号、２０１７年９月１５日に出願された米国仮特許出願第６２／５５９，３７４号、２０１７年１０月２日に出願された米国仮特許出願第６２／５６７，１２１号、２０１７年１０月２６日に出願した米国仮特許出願第６２／５７７，６５５号、２０１７年１１月７日に出願された米国仮特許出願第６２／５８２，８７４号、及び２０１７年１２月８日に出願された米国仮特許出願第６２／５９６，３７４号に対する優先権を主張するものであり、これらの仮特許出願は本明細書によって全体として参照により援用される。
配列表
[0002] 本願は、ＡＳＣＩＩ形式で電子的に提出された配列表を含み、本明細書によって全体として参照により援用される。前記ＡＳＣＩＩの写しは、２０１８年１月４日に、116983-5017_ST25.txtの名称で、１４キロバイトのサイズで作成された。
発明の背景
[0003] 腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）の養子移入を用いた大型の難治性癌の治療は、予後不良の患者に対する強力な治療手法を表す。Gattinoni, et al., Nat. Rev. Immunol. 2006, 6, 383-393。免疫療法の成功には多量のＴＩＬが必要であり、商業化に向けてロバストで信頼性のある方法が求められている。これは、細胞拡大培養に伴う技術上、物流上、及び規制上の問題に起因して、実現が課題となっている。ＩＬ－２ベースのＴＩＬ拡大培養と、それに続く「迅速拡大培養法」（ＲＥＰ：Rapid Expansion Process）が、その
速さ及び効率から、ＴＩＬ拡大培養に好ましい方法となりつつある。Dudley, et al., Science 2002, 298, 850-54；Dudley, et al., J. Clin. Oncol. 2005, 23, 2346-57；Dudley, et al., J. Clin. Oncol. 2008, 26, 5233-39；Riddell, et al., Science 1992, 257, 238-41；Dudley, et al., J. Immunother. 2003, 26, 332-42。ＲＥＰは１４日の期間でＴＩＬの１，０００倍の拡大をもたらすことができるが、それにはフィーダー細胞として、多くの場合に複数のドナーからの、大過剰の（例えば２００倍の）照射した同種異系末梢血単核球（ＰＢＭＣ、単核細胞（ＭＮＣ）としても知られている）、並びに抗ＣＤ３抗体（ＯＫＴ３）及び高用量のＩＬ－２が必要である。Dudley, et al., J. Immunother.
2003, 26, 332-42。
[0004] 現在のＴＩＬ製造工程は、長さ、経費、無菌性の懸念、及び本明細書中に記載される他の要因によって制限されるため、かかる工程を商業化する可能性は大幅に制限されており、これら及びその他の理由により、現時点では利用できる商業工程は無い。商業規模の製造及び複数の臨床センターのヒト患者に使用する規制当局の承認に適したＴＩＬ製造工程及びかかる工程に基づく治療法を提供する必要性が急務である。
[0005] 本発明は、ＴＩＬを拡大培養し、治療用ＴＩＬ集団を産生するための改善及び／又は短縮方法を提供する。
[0006] 本発明は、腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）を治療用ＴＩＬ集団に拡大培養する方法も提供し、この方法は、
（ａ） 患者から得られた腫瘍試料を複数の腫瘍断片に処理することにより、患者から切除された腫瘍から第１のＴＩＬ集団を得ること；
（ｂ） 腫瘍断片を閉鎖系に加えること；
（ｃ） ＩＬ－２を含む細胞培養培地で第１のＴＩＬ集団を培養し第２のＴＩＬ集団を生じさせることにより第１の拡大培養を実施することであって、第１の拡大培養は、第１のガス透過性表面積を提供する閉鎖型容器内で実施され、第１の拡大培養は、第２のＴＩＬ集団を得るため約３～１４日間行われ、第２のＴＩＬ集団は、第１のＴＩＬ集団よりも少なくとも５０倍数が多く、ステップ（ｂ）からステップ（ｃ）への移行は系を開放せずに発生すること；
（ｄ） 第２のＴＩＬ集団の細胞培養培地に追加のＩＬ－２、ＯＫＴ－３、及び抗原提示細胞（ＡＰＣ）を添加することにより第２の拡大培養を実施して第３のＴＩＬ集団を生じさせることであって、第３のＴＩＬ集団を入手するために第２の拡大培養が約７～１４日間実施され、第３のＴＩＬ集団は、治療用ＴＩＬ集団であり、第２の拡大培養は第２のガス透過性表面積を提供する閉鎖型容器で行われ、及びステップ（ｃ）からステップ（ｄ）への移行は系を開放せずに発生すること；
（ｅ） ステップ（ｄ）から得られた治療用ＴＩＬ集団を回収することであって、ステップ（ｄ）からステップ（ｅ）への移行は、系を開放せずに発生すること；及び
（ｆ） ステップ（ｅ）で回収したＴＩＬ集団を輸注バッグに移すことであって、ステップ（ｅ）から（ｆ）への移行は、系を開放せずに発生すること
を含む。
[0007] 一部の実施形態において、本方法は、凍結保存プロセスを使用して、ステップ（ｆ）で回収したＴＩＬ集団を含む輸注バッグを凍結保存するステップを更に含む。
[0008] 一部の実施形態において、凍結保存プロセスは、回収したＴＩＬ集団と凍結保存培地との比は比率１：１を使用して実施される。
[0009] 一部の実施形態において、抗原提示細胞は末梢血単核球（ＰＢＭＣ）である。一部の実施形態において、ＰＢＭＣは放射線照射された、且つ同種異系のものである。一部の実施形態において、ＰＢＭＣはステップ（ｄ）において９～１４日目のいずれかに細胞培養物に加えられる。一部の実施形態において、抗原提示細胞は人工抗原提示細胞である。
[0010] 一部の実施形態において、ステップ（ｅ）の回収は、膜ベースの細胞処理系を使用して実施される。
[0011] 一部の実施形態において、ステップ（ｅ）の回収は、LOVO細胞処理系を使用して実施される。
[0012] 一部の実施形態において、複数の断片は、約４～約５０個の断片を含み、各断片は約２７ｍｍ３の容積を有する。
[0013] 一部の実施形態において、複数の断片は、約１３００ｍｍ３～約１５００ｍｍ３の総容積を有する約３０～約６０個の断片を含む。
[0014] 一部の実施形態において、複数の断片は、約１３５０ｍｍ３の総容積を有する約５０個の断片を含む。
[0015] 一部の実施形態において、複数の断片は、約１ｇ～約１．５ｇの総質量を有する約５０個の断片を含む。
[0016] 一部の実施形態において、細胞培養培地は、Ｇコンテナ及びXuri細胞培養バッグからなる群から選択される容器内に提供される。
[0017] 一部の実施形態において、ステップ（ｄ）の細胞培養培地は、ＩＬ－１５及び／又はＩＬ－２１を更に含む。
[0018] 一部の実施形態において、ＩＬ－２濃度は、約１０，０００ＩＵ／ｍＬ～約５，０００ＩＵ／ｍＬである。
[0019] 一部の実施形態において、ＩＬ－１５濃度は、約５００ＩＵ／ｍＬ～約１００ＩＵ／ｍＬである。
[0020] 一部の実施形態において、ＩＬ－２１濃度は、約２０ＩＵ／ｍＬ～約０．５ＩＵ／ｍＬである。
[0021] 一部の実施形態において、ステップ（ｆ）の輸注バッグは、HypoThermosol含
有輸注バッグである。
[0022] 一部の実施形態において、凍結保存培地は、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）を含む。一部の実施形態において、凍結保存培地は、７％～１０％のジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）を含む。
[0023] 一部の実施形態において、ステップ（ｃ）の第１の期間及びステップ（ｅ）の第２の期間は、１０日、１１日、又は１２日の期間内にそれぞれ個別に実施される。
[0024] 一部の実施形態において、ステップ（ｃ）の第１の期間及びステップ（ｅ）の第２の期間は、１１日の期間内にそれぞれ個別に実施される。
[0025] 一部の実施形態において、ステップ（ａ）～（ｆ）は約１０日～約２２日の期間内に実施される。
[0026] 一部の実施形態において、ステップ（ａ）～（ｆ）は約２０日～約２２日の期間内に実施される。
[0027] 一部の実施形態において、ステップ（ａ）～（ｆ）は約１５日～約２０日の期間内に実施される。
[0028] 一部の実施形態において、ステップ（ａ）～（ｆ）は約１０日～約２０日の期間内に実施される。
[0029] 一部の実施形態において、ステップ（ａ）～（ｆ）は約１０日～約１５日の期間内に実施される。
[0030] 一部の実施形態において、ステップ（ａ）～（ｆ）は、２２日以内に実施される。
[0031] 一部の実施形態において、ステップ（ａ）～（ｆ）は、２０日以内に実施される。
[0032] 一部の実施形態において、ステップ（ａ）～（ｆ）は、１５日以内に実施される。
[0033] 一部の実施形態において、ステップ（ａ）～（ｆ）は、１０日以内に実施される。
[0034] 一部の実施形態において、ステップ（ａ）～（ｆ）及び凍結保存は２２日以内に実施される。
[0035] 一部の実施形態において、ステップ（ｅ）で回収した治療用ＴＩＬ集団は、治療上有効な投薬量のＴＩＬとなるのに十分なＴＩＬを含む。
[0036] 一部の実施形態において、治療上有効な投薬量となるのに十分なＴＩＬの数は約２．３×１０１０～約１３．７×１０１０個である。
[0037] 一部の実施形態において、ステップ（ｂ）～（ｅ）は、単一の容器で実施され、ステップ（ｂ）～（ｅ）を単一の容器で実施すると、ステップ（ｂ）～（ｅ）を２つ以上の容器で実施した場合に比べ切除された腫瘍毎のＴＩＬ収量が増加する結果となる。
[0038] 一部の実施形態において、抗原提示細胞は、系を開放せずにステップ（ｄ）の第２の期間中にＴＩＬに追加される。
[0039] 一部の実施形態において、ステップ（ｄ）の第３のＴＩＬ集団は、対象に投与されたときに、有効性の増加、インターフェロンガンマ産生の増加、ポリクローナル性の増加、平均ＩＰ－１０の増加、及び／又は平均ＭＣＰ－１の増加を提供する。
[0040] 一部の実施形態において、ステップ（ｄ）の第３のＴＩＬ集団は、対象に投与されたときに、少なくとも５倍以上のインターフェロンガンマ産生を提供する。
[0041] 一部の実施形態において、ステップ（ｄ）の第３のＴＩＬ集団は、第２のＴＩＬ集団に比べて、エフェクターＴ細胞及び／又はセントラルメモリーＴ細胞の亜集団の増加を含む治療用ＴＩＬ集団であり、治療用ＴＩＬ集団中のエフェクターＴ細胞及び／又はセントラルメモリーＴ細胞は、第２の細胞集団から得られるエフェクターＴ細胞及び／又はセントラルメモリーＴ細胞と比べて、ＣＤ２７＋の発現、ＣＤ２８＋の発現、より長いテロメア、ＣＤ５７発現の増加、及びＣＤ５６発現の減少からなる群から選択される１つ以上の特徴を呈する。
[0042] 一部の実施形態において、第３のＴＩＬ集団から得られたエフェクターＴ細胞及び／又はセントラルメモリーＴ細胞は、第２の細胞集団から得られるエフェクターＴ細胞及び／又はセントラルメモリーＴ細胞と比べて、ＣＤ５７発現の増加及びＣＤ５６発現の減少を呈する。
[0043] 一部の実施形態において、微生物汚染のリスクは、開放系と比較して低減される。
[0044] 一部の実施形態において、ステップ（ｇ）からのＴＩＬは、患者に注入される。
[0045] 一部の実施形態において、複数の断片は、約４個の断片を含む。
[0046] 本発明はまた、拡大培養した腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）を投与することを含む癌を有する対象の処置方法も提供し、この方法は、
（ａ） 対象から得られた腫瘍試料を複数の腫瘍断片に処理することにより、患者から切除された腫瘍から第１のＴＩＬ集団を得ること；
（ｂ） 腫瘍断片を閉鎖系に加えること；
（ｃ） ＩＬ－２を含む細胞培養培地で第１のＴＩＬ集団を培養し第２のＴＩＬ集団を生じさせることにより第１の拡大培養を実施することであって、第１の拡大培養は、第１のガス透過性表面積を提供する閉鎖型容器内で実施され、第１の拡大培養は、第２のＴＩＬ集団を得るため約３～１４日間行われ、第２のＴＩＬ集団は、第１のＴＩＬ集団よりも少なくとも５０倍数が多く、ステップ（ｂ）からステップ（ｃ）への移行は系を開放せずに発生すること；
（ｄ） 第２のＴＩＬ集団の細胞培養培地に追加のＩＬ－２、ＯＫＴ－３、及び抗原提示細胞（ＡＰＣ）を添加することにより第２の拡大培養を実施して第３のＴＩＬ集団を生じさせることであって、第３のＴＩＬ集団を入手するために第２の拡大培養が約７～１４日間実施され、第３のＴＩＬ集団は、治療用ＴＩＬ集団であり、第２の拡大培養は第２のガス透過性表面積を提供する閉鎖型容器で行われ、及びステップ（ｃ）からステップ（ｄ）への移行は系を開放せずに発生すること；
（ｅ） ステップ（ｄ）から得られた治療用ＴＩＬ集団を回収することであって、ステップ（ｄ）からステップ（ｅ）への移行は、系を開放せずに発生すること；及び
（ｆ） ステップ（ｅ）で回収したＴＩＬ集団を輸注バッグに移すことであって、ステップ（ｅ）から（ｆ）への移行は、系を開放せずに発生すること；
（ｇ） 凍結保存プロセスを使用して、ステップ（ｆ）で回収したＴＩＬ集団を含む輸注バッグを任意選択で凍結保存すること；及び
（ｈ） ステップ（ｇ）における輸注バッグから治療上有効な投薬量の第３のＴＩＬ集団を患者に投与すること
を含む。
[0047] 一部の実施形態において、ステップ（ｅ）で回収した治療用ＴＩＬ集団は、ステップ（ｈ）の治療上有効な投薬量のＴＩＬを投与するのに十分なＴＩＬを含む。
[0048] 一部の実施形態において、ステップ（ｈ）における治療上有効な投薬量の投与に十分なＴＩＬの数は約２．３×１０１０～約１３．７×１０１０個である。
[0049] 一部の実施形態において、抗原提示細胞（ＡＰＣ）はＰＢＭＣである。
[0050] 一部の実施形態において、ＰＢＭＣはステップ（ｄ）において９～１４日目のいずれかに細胞培養物に加えられる。
[0051] 一部の実施形態において、ステップ（ｈ）で治療上有効な投薬量のＴＩＬ細胞を投与する前に、骨髄非破壊的リンパ球枯渇レジメンが患者に投与されている。
[0052] 一部の実施形態において、骨髄非破壊的リンパ球枯渇レジメンは、６０ｍｇ／ｍ２／日の用量で２日間のシクロホスファミドの投与ステップと、それに続く２５ｍｇ／ｍ２／日の用量で５日間のフルダラビンの投与ステップを含む。
[0053] 一部の実施形態において、本方法は、ステップ（ｈ）で患者にＴＩＬ細胞を投与した翌日に始まる高用量ＩＬ－２レジメンで患者を処置するステップを更に含む。
[0054] 一部の実施形態において、高用量ＩＬ－２レジメンは、忍容量まで８時間毎に１５分ボーラス静脈内注入として投与される６００，０００又は７２０，０００ＩＵ／ｋｇを含む。
[0055] 一部の実施形態において、ステップ（ｄ）の第３のＴＩＬ集団は、第２のＴＩＬ集団に比べて、エフェクターＴ細胞及び／又はセントラルメモリーＴ細胞の亜集団の増加を含む治療用ＴＩＬ集団であり、治療用ＴＩＬ集団中のエフェクターＴ細胞及び／又はセントラルメモリーＴ細胞は、第２の細胞集団から得られるエフェクターＴ細胞及び／又はセントラルメモリーＴ細胞と比べて、ＣＤ２７＋の発現、ＣＤ２８＋の発現、より長いテロメア、ＣＤ５７発現の増加、及びＣＤ５６発現の減少からなる群から選択される１つ以上の特徴を呈する。
[0056] 一部の実施形態において、治療用ＴＩＬ集団のエフェクターＴ細胞及び／又はセントラルメモリーＴ細胞は、第２の細胞集団から得られるエフェクターＴ細胞及び／又はセントラルメモリーＴ細胞と比べて、ＣＤ５７発現の増加、及びＣＤ５６発現の減少を呈する。
[0057] 一部の実施形態において、癌は、黒色腫、卵巣癌、子宮頸癌、非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）、肺癌、膀胱癌、乳癌、ヒトパピローマウイルスによって引き起こされる癌、頭頸部癌（頭頸部扁平上皮癌（ＨＮＳＣＣ）を含む）、腎癌、及び腎細胞癌からなる群から選択される。
[0058] 一部の実施形態において、癌は、黒色腫、ＨＮＳＣＣ、子宮頸癌、及びＮＳＣＬＣからなる群から選択される。
[0059] 一部の実施形態において、癌は黒色腫である。
[0060] 一部の実施形態において、癌はＨＮＳＣＣである。
[0061] 一部の実施形態において、癌は子宮頸癌である。
[0062] 一部の実施形態において、癌はＮＳＣＬＣである。
[0063] 本発明はまた、腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）を治療用ＴＩＬ集団に拡大培養する方法も提供し、この方法は、
（ａ） 第１のＴＩＬ集団を得るために、患者から切除された腫瘍から処理された腫瘍断片を閉鎖系に追加すること；
（ｂ） ＩＬ－２を含む細胞培養培地で第１のＴＩＬ集団を培養し第２のＴＩＬ集団を生じさせることにより第１の拡大培養を実施することであって、第１の拡大培養は、第１のガス透過性表面積を提供する閉鎖型容器内で実施され、第２のＴＩＬ集団を得るため約３～１４日間第１の拡大培養を行い、第２のＴＩＬ集団は第１のＴＩＬ集団よりも少なくとも５０倍数が多く、ステップ（ａ）からステップ（ｂ）への移行は系を開放せずに発生すること；
（ｃ） 第２のＴＩＬ集団の細胞培養培地に追加のＩＬ－２、ＯＫＴ－３、及び抗原提示細胞（ＡＰＣ）を添加することにより第２の拡大培養を実施して第３のＴＩＬ集団を生じさせることであって、第３のＴＩＬ集団を入手するために第２の拡大培養が約７～１４日間実施され、第３のＴＩＬ集団は、治療用ＴＩＬ集団であり、第２の拡大培養は第２のガス透過性表面積を提供する閉鎖型容器で行われ、及びステップ（ｂ）からステップ（ｃ）への移行は系を開放せずに発生すること；
（ｄ） ステップ（ｃ）から得られた治療用ＴＩＬ集団を回収することであって、ステップ（ｃ）からステップ（ｄ）への移行は、系を開放せずに発生すること；及び
（ｅ） ステップ（ｄ）で回収したＴＩＬ集団を輸注バッグに移すことであって、ステップ（ｄ）から（ｅ）への移行は、系を開放せずに発生すること
を含む。
[0064] 一部の実施形態において、ステップ（ｄ）で回収した治療用ＴＩＬ集団は、治療上有効な投薬量のＴＩＬとなるのに十分なＴＩＬを含む。
[0065] 一部の実施形態において、治療上有効な投薬量となるのに十分なＴＩＬの数は約２．３×１０１０～約１３．７×１０１０個である。
[0066] 一部の実施形態において、本方法は、凍結保存プロセスを使用して、回収したＴＩＬ集団を含む輸注バッグを凍結保存するステップを更に含む。
[0067] 一部の実施形態において、凍結保存プロセスは、回収したＴＩＬ集団と凍結保存培地との比は比率１：１を使用して実施される。
[0068] 一部の実施形態において、抗原提示細胞は末梢血単核球（ＰＢＭＣ）である。
[0069] 一部の実施形態において、ＰＢＭＣは放射線照射された、且つ同種異系のものである。
[0070] 前記ＰＢＭＣがステップ（ｃ）において９～１４日目のいずれかに前記細胞培養物に加えられる、請求項６８に記載の方法。
[0071] 一部の実施形態において、抗原提示細胞は人工抗原提示細胞である。
[0072] 一部の実施形態において、ステップ（ｄ）の回収は、LOVO細胞処理系を使用して実施される。
[0073] 一部の実施形態において、複数の断片は、約４～約５０個の断片を含み、各断片は約２７ｍｍ３の容積を有する。
[0074] 一部の実施形態において、複数の断片は、約１３００ｍｍ３～約１５００ｍｍ３の総容積を有する約３０～約６０個の断片を含む。
[0075] 一部の実施形態において、複数の断片は、約１３５０ｍｍ３の総容積を有する約５０個の断片を含む。
[0076] 一部の実施形態において、複数の断片は、約１ｇ～約１．５ｇの総質量を有する約５０個の断片を含む。
[0077] 一部の実施形態において、複数の断片は、約４個の断片を含む。
[0078] 一部の実施形態において、第２の細胞培養培地は、Ｇコンテナ及びXuri細胞培養バッグからなる群から選択される容器内に提供される。
[0079] 一部の実施形態において、ステップ（ｅ）の輸注バッグは、HypoThermosol含
有輸注バッグである。
[0080] 一部の実施形態において、ステップ（ｂ）の第１の期間及びステップ（ｃ）の第２の期間は、１０日、１１日、又は１２日の期間内にそれぞれ個別に実施される。
[0081] 一部の実施形態において、ステップ（ｂ）の第１の期間及びステップ（ｃ）の第２の期間は、１１日の期間内にそれぞれ個別に実施される。
[0082] 一部の実施形態において、ステップ（ａ）～（ｅ）は約１０日～約２２日の期間内に実施される。
[0083] 一部の実施形態において、ステップ（ａ）～（ｅ）は約１０日～約２０日の期間内に実施される。
[0084] 一部の実施形態において、ステップ（ａ）～（ｅ）は約１０日～約１５日の期間内に実施される。
[0085] 一部の実施形態において、ステップ（ａ）～（ｅ）は、２２日以内に実施される。
[0086] 一部の実施形態において、ステップ（ａ）～（ｅ）及び凍結保存は２２日以内に実施される。
[0087] 一部の実施形態において、ステップ（ｂ）～（ｅ）は、単一の容器で実施され、ステップ（ｂ）～（ｅ）を単一の容器で実施すると、ステップ（ｂ）～（ｅ）を２つ以上の容器で実施した場合に比べ切除された腫瘍毎のＴＩＬ収量が増加する結果となる。
[0088] 一部の実施形態において、抗原提示細胞は、系を開放せずにステップ（ｃ）の第２の期間中にＴＩＬに追加される。
[0089] 一部の実施形態において、ステップ（ｄ）の第３のＴＩＬ集団は、第２のＴＩＬ集団に比べて、エフェクターＴ細胞及び／又はセントラルメモリーＴ細胞の亜集団の増加を含む治療用ＴＩＬ集団であり、治療用ＴＩＬ集団中で得られたエフェクターＴ細胞及び／又はセントラルメモリーＴ細胞は、第２の細胞集団から得られるエフェクターＴ細胞及び／又はセントラルメモリーＴ細胞と比べて、ＣＤ２７＋の発現、ＣＤ２８＋の発現、より長いテロメア、ＣＤ５７発現の増加、及びＣＤ５６発現の減少からなる群から選択される１つ以上の特徴を呈する。
[0090] 一部の実施形態において、治療用ＴＩＬ集団で得られたエフェクターＴ細胞及び／又はセントラルメモリーＴ細胞は、第２の細胞集団から得られるエフェクターＴ細胞及び／又はセントラルメモリーＴ細胞と比べて、ＣＤ５７発現の増加、及びＣＤ５６発現の減少を呈する。
[0091] 一部の実施形態において、微生物汚染のリスクは、開放系と比較して低減される。
[0092] 一部の実施形態において、ステップ（ｅ）からのＴＩＬは、患者に注入される。
[0093] 一部の実施形態において、閉鎖型容器は単一のバイオリアクターを含む。
[0094] 一部の実施形態において、閉鎖型容器はG-REX -10を含む。
[0095] 一部の実施形態において、閉鎖型容器はG-REX -100を含む。
[0096] 一部の実施形態において、ステップ（ｄ）で、抗原提示細胞（ＡＰＣ）は、２５：１～１００：１のＡＰＣ：ＴＩＬ比で第２のＴＩＬ集団の細胞培養物に加えられる。
[0097] 一部の実施形態において、細胞培養物は、２．５×１０９ＡＰＣ対１００×１０６ＴＩＬの比を有する。
[0098] 一部の実施形態において、ステップ（ｃ）で、抗原提示細胞（ＡＰＣ）は、２５：１～１００：１のＡＰＣ：ＴＩＬ比で第２のＴＩＬ集団の細胞培養物に加えられる。
[0099] 一部の実施形態において、細胞培養物は、２．５×１０９ＡＰＣ対１００×１０６ＴＩＬの比を有する。
[00100] 本発明はまた、癌を有する対象の処置に使用するための拡大培養ＴＩＬの集
団を提供し、拡大培養ＴＩＬの集団は、
（ａ） 対象から得られた腫瘍試料を複数の腫瘍断片に処理することにより、患者から切除された腫瘍から第１のＴＩＬ集団を得ること；
（ｂ） 腫瘍断片を閉鎖系に加えること；
（ｃ） ＩＬ－２を含む細胞培養培地で第１のＴＩＬ集団を培養し第２のＴＩＬ集団を生じさせることにより第１の拡大培養を実施することであって、第１の拡大培養は、第１のガス透過性表面積を提供する閉鎖型容器内で実施され、第１の拡大培養は、第２のＴＩＬ集団を得るため約３～１４日間行われ、第２のＴＩＬ集団は、第１のＴＩＬ集団よりも少なくとも５０倍数が多く、ステップ（ｂ）からステップ（ｃ）への移行は系を開放せずに発生すること；
（ｄ） 第２のＴＩＬ集団の細胞培養培地に追加のＩＬ－２、ＯＫＴ－３、及び抗原提示細胞（ＡＰＣ）を添加することにより第２の拡大培養を実施して第３のＴＩＬ集団を生じさせることであって、第３のＴＩＬ集団を入手するために第２の拡大培養が約７～１４日間実施され、第３のＴＩＬ集団は、治療用ＴＩＬ集団であり、第２の拡大培養は第２のガス透過性表面積を提供する閉鎖型容器で行われ、及びステップ（ｃ）からステップ（ｄ）への移行は系を開放せずに発生すること；
（ｅ） ステップ（ｄ）から得られた治療用ＴＩＬ集団を回収することであって、ステップ（ｄ）からステップ（ｅ）への移行は、系を開放せずに発生すること；及び
（ｆ） ステップ（ｅ）で回収したＴＩＬ集団を輸注バッグに移すことであって、ステップ（ｅ）から（ｆ）への移行は、系を開放せずに発生すること；及び
（ｇ） 凍結保存プロセスを使用して、ステップ（ｆ）で回収したＴＩＬ集団を含む輸注バッグを任意選択で凍結保存すること
を含む方法によって得ることができる第３のＴＩＬ集団である。
[00101] 一部の実施形態において、ＴＩＬの集団は、上記及び本明細書に記載の方法
に従って癌を有する対象を処置するために使用され、この方法は、上記及び本明細書に列挙される特徴の１つ以上を更に含む。
図面の簡単な説明
[00102]プロセス２Ａ、ＴＩＬ製造の２２日間プロセスの実施形態の略図を示す。 [00103]ＴＩＬ製造のための１Ｃプロセス及び２Ａプロセスの実施形態の比較を示す。 [00104]１Ｃプロセスのタイムラインを示す。 [00105]より高い細胞数のために、投与及び共療法ステップを含む、ＴＩＬ製造のためのプロセス２Ａを使用したＴＩＬ療法の実施形態のプロセスを示す。 [00106]より低い細胞数のために、投与及び共療法ステップを含む、ＴＩＬ製造のためのプロセス２Ａを使用したＴＩＬ療法の実施形態のプロセスを示す。 [00107]２Ａプロセスの実施形態の詳細な概略図を示す。 [00108]新鮮ＴＩＬ及び解凍ＴＩＬ間のインターフェロンガンマ（ＩＦＮ－γ）の発現を比較することにより、２Ａプロセスの実施形態を使用して調製されたＴＩＬの特性を示す。 [00109]新鮮ＴＩＬと解凍ＴＩＬのＣＤ３を調べることにより、２Ａプロセスの実施形態を使用して調製されたＴＩＬの特性を示す。 [00110]新鮮ＴＩＬ及び解凍ＴＩＬ間の回復を調べることにより、２Ａプロセスの実施形態を使用して調製されたＴＩＬの特性を示す。 [00111]新鮮ＴＩＬと解凍ＴＩＬの生存率を調べることにより、２Ａプロセスの実施形態を使用して調製されたＴＩＬの特性を示す。 [00112]凍結保存ステップを含む２Ａプロセスの実施形態の主要なステップを示す。 [00112]凍結保存ステップを含む２Ａプロセスの実施形態の主要なステップを示す。 [00112]凍結保存ステップを含む２Ａプロセスの実施形態の主要なステップを示す。 [00113]１Ｃプロセス及び２Ａプロセスの実施形態から得られた細胞数を示す。 [00114]１Ｃプロセス及び２Ａプロセスの実施形態から得られた細胞生存率を示す。 [00115]１Ｃプロセス及び２Ａプロセスの実施形態で得られたＴＩＬのフローサイトメトリーにより測定されたＣＤ４５及びＣＤ３細胞（即ち、Ｔ細胞）の割合を示す。 [00116]図８０及び９８データの生成に使用されたアッセイとは異なるアッセイにより測定された、１Ｃプロセス及び２Ａプロセスの実施形態で得られたＩＦＮ－γ遊離を示す。 [00117]図８０及び９８データの生成に使用されたアッセイとは異なるアッセイにより測定された、１Ｃプロセス及び２Ａプロセスの実施形態で得られたＩＦＮ－γ遊離を示す。 [00118]１Ｃプロセス及び２Ａプロセスの実施形態から得られたＴＣＲａ／ｂ及びＮＫ細胞の割合を示す。 [00119]１Ｃプロセス及び２Ａプロセスの実施形態により得られたＴＩＬのフローサイトメトリーにより測定されたＣＤ８＋及びＣＤ４＋細胞の割合、並びに各サブセット間の比率を示す。 [00120]１Ｃプロセス及び２Ａプロセスの実施形態から得られたＴＩＬのフローサイトメトリーにより測定されたメモリーサブセットの割合を示す。 [00121]１Ｃプロセス及び２Ａプロセスの実施形態から得られたＴＩＬのフローサイトメトリーによるＰＤ－１、ＬＡＧ－３、及びＴＩＭ－３発現の割合を示す。 [00122]１Ｃプロセス及び２Ａプロセスの実施形態から得られたＴＩＬのフローサイトメトリーによる４ー１ＢＢ、ＣＤ６９、及びＫＬＲＧ１発現の割合を示す。 [00123]１Ｃプロセス及び２Ａプロセスの実施形態から得られたＴＩＬのフローサイトメトリーによるＴＩＧＩＴ発現の割合を示す。 [00124]１Ｃプロセス及び２Ａプロセスの実施形態から得られたＴＩＬのフローサイトメトリーによるＣＤ２７及びＣＤ２８発現の割合を示す。 [00125]フローＦＩＳＨテロメア長分析の結果を示す。 [00126]（外れ値データポイントの削除後の）フローＦＩＳＨテロメア長分析の結果を示す。 [00127]プロセス１Ｃ及びプロセス２Ａの実施形態で処理されたコホートを含む臨床試験デザインを示す。 [00128]ステップＡ～Ｆの概要を提供する例示的な２Ａプロセスチャート。 [00129]プロセス２Ａのプロセスフローチャート。 [00129]プロセス２Ａのプロセスフローチャート。 [00129]プロセス２Ａのプロセスフローチャート。 [00130]プロセス２Ａデータ収集計画のプロセスフローチャート [00131]新鮮ＴＩＬと解凍ＴＩＬの生存率 [00132]ｒｅ－ＲＥＰ培養での新鮮ＴＩＬ及び解凍ＴＩＬの拡大培養 [00133]血液代謝産物の通常の検査値。 [00134]プロセス２ＡのプレＲＥＰ ＴＩＬの代謝物分析。 [00134]プロセス２ＡのプレＲＥＰ ＴＩＬの代謝物分析。 [00135]プロセス２ＡのプレＲＥＰ ＴＩＬ細胞培養におけるＩＬ－２の定量。 [00136]ＴＩＬの抗ＣＤ３、抗ＣＤ２８及び抗４－１ＢＢ刺激による細胞傷害性サイトカインＩＦＮ－γの遊離。 [00137]抗ＣＤ３、抗ＣＤ２８、及びＴＩＬの抗４－１ＢＢ刺激に続くグランザイムＢ遊離。 [00138]ＴＣＲ αβ＋ＴＩＬ。ほとんどのヒトＣＤ３＋Ｔ細胞は、ＭＨＣを抑制した方法で、抗原を認識するα及びβ鎖によって形成される受容体を発現する。Ａ）Ｍ１０６１を除き、新鮮ＴＩＬ産物及び解凍ＴＩＬ産物には、ＴＩＬを発現するＴＣＲ αβ＋が８０％以上含まれていた。新鮮ＴＩＬ及び解凍したＴＩＬの両方で、ＴＣＲ αβの同等の発現が見られた（Ｐ値 －０．９５８２）。Ｒｅ－ＲＥＰ後にＴＩＬを発現するＴＣＲ αβ＋の減少が観察されたにもかかわらず、この減少はＲｅ－ＲＥＰ ＴＩＬ内では有意ではなかった（ｐ＝０．２４）。Ｂ）ＴＣＲ αβを発現する新鮮ＲＥ－ＲＥＰ及び解凍ＲＥ－ＲＥＰ ＴＩＬには、それぞれ新鮮ＴＩＬ及び解凍ＴＩＬと比べて９．２％及び１５．７％の減少があった。 [00139]ＴＣＲ αβーＣＤ５６＋。腫瘍浸潤ナチュラルキラー（ＮＫ）及びＮＫＴ細胞は、ＭＨＣ発現を欠く細胞並びにＣＤ１提示脂質抗原を溶解し、免疫調節性サイトカインを提供する能力も有する。ただし、強力なＮＫ細胞浸潤は進行疾患と関連しており、癌の発生を促進する可能性がある。図Ａは、Ｍ１０６３を除く全ての例で、新鮮ＴＩＬと比較して、解凍ＴＩＬのＮＫ集団の減少は有意ではないものの、わずかにあったことを示している（ｐ＝０．２７）。ｒｅ－ＲＥＰ ＴＩＬ集団間に有意な差は認められなかった（ｐ＝０．８８）。新鮮ＴＩＬ、新鮮ｒｅ－ＲＥＰ ＴＩＬ、及び解凍ｒｅ－ＲＥＰ ＴＩＬは、図Ｂに示すようにＣＤ５６の同様の発現を実証する。解凍ＴＩＬ産物は、おそらく冷凍保存手順の結果として、新鮮ＴＩＬ（３．０±２．２）よりＮＫ発現細胞が少なかった（１．９±１．３）。 [00140]ＣＤ４＋細胞。個々の条件では、ＣＤ４集団に実質的な差は観察されなかった。図Ａは、各条件での平均ＣＤ４集団を表す。図Ｂの表は、ＳＤ値及びＳＥＭ値を示す。新鮮ｒｅ－ＲＥＰ集団のＣＤ４集団にわずかな減少があり、これはＥＰ１１００１Ｔの新鮮ｒｅ－ＲＥＰ集団のＣＤ４の減少が主な原因である。 [00141]ＣＤ８＋細胞。Ａ）ＥＰ１１００１Ｔを除く全てで、新鮮ＴＩＬ及び解凍ＴＩＬの両方が同等のＣＤ８＋集団を示した（Ｐ＝０．１０、有意な差なし）。ほとんどの実験で、新鮮ｒｅ－ＲＥＰ ＴＩＬ産物でＴＩＬを発現するＣＤ８＋がわずかに減少した（Ｍ１０６１Ｔ及びＭ１０６５Ｔは例外）。解凍ｒｅ－ＲＥＰ ＴＩＬのＣＤ８＋個体数は約１０～３０％減少した。新鮮ＴＩＬ及び解凍ＴＩＬの両方からのｒｅ－ＲＥＰ ＴＩＬの比較は、有意な差を示した（ｐ＝０．０３、スチューデントのｔ検定）。図Ｂは、全ての条件でＴＩＬを発現するＣＤ８＋の平均値を示す。新鮮ＴＩＬ及び解凍ＴＩＬの両方が同様の結果を示す。ただし、解凍したｒｅ－ＲＥＰ ＴＩＬ産物では、新鮮ｒｅ－ＲＥＰ ＴＩＬと比較して、ＣＤ８＋集団が１０．８％減少した。 [00142]ＣＤ４＋ＣＤ１５４＋細胞。ＣＤ１５４は、ＣＤ４０Ｌとしても知られ、活性化Ｔ細胞のマーカーである。図Ａ：異なる条件でＣＤ４＋ＣＤ１５４＋集団に実質的な差は観察されなかったが、ＥＰ１１００１Ｔの新鮮ｒｅ－ＲＥＰ ＣＤ４＋ＴＩＬでは３４．１％の減少が観察された。ＣＤ１５４発現は、Ｍ１０６１Ｔ及びＭ１０６２Ｔでは測定されなかった。これらの実験は、拡大表現型パネルが配置される前に実施されたためである。 [00142]ＣＤ４＋ＣＤ１５４＋細胞。ＣＤ１５４は、ＣＤ４０Ｌとしても知られ、活性化Ｔ細胞のマーカーである。図Ｂ：解凍ＴＩＬ状態のわずかな減少は、Ｍ１０６１Ｔ及びＭ１０６２Ｔで測定されなかったＣＤ１５４に起因する可能性がある。全ての条件は、ＣＤ４集団で非常に近いＣＤ１５４発現を示しており、活性化ＣＤ４＋Ｔ細胞を示唆している。 [00143]ＣＤ８＋ＣＤ１５４＋細胞。ＣＤ８＋ＴＩＬに発現した活性化マーカーＣＤ１５４も分析された。Ａ）全体として、新鮮ＴＩＬ産物と解凍ＴＩＬ産物のＣＤ８＋集団のＣＤ１５４発現は低かった。ＣＤ１５４は主に活性化ＣＤ４＋Ｔ細胞で発現するため、これは当然である。新鮮ＴＩＬ産物と解凍ＴＩＬ産物の両方でＣＤ１５４の発現を測定した場合、解凍ＴＩＬ産物でＣＤ１５４の発現に差は認められないか、増加したことが観察された。スチューデントのｔ検定は、２つの条件の間に有意な差がないことを示した。新鮮ｒｅ－ＲＥＰと比較した解凍ｒｅ－ＲＥＰのＣＤ１５４発現の増加が、全ての実験で示された（ｐ＝０．０２）。Ｂ）ＣＤ１５４発現の増加は、対応する産物と比較して、解凍ＴＩＬ及び解凍ｒｅ－ＲＥＰ ＴＩＬ産物の両方で観察された。解凍ｒｅ－ＲＥＰ ＴＩＬは、新鮮ｒｅ－ＲＥＰ ＴＩＬと比較して、ＣＤ１５４発現の２９．１％の増加を示した。 [00144]ＣＤ４＋ＣＤ６９＋細胞。ＣＤ６９は、刺激又は活性化後のＴ細胞の初期活性化マーカーである。Ａ）ＥＰ１１００１Ｔを除く全てのＴＩＬで、おそらくｒｅ－ＲＥＰ長（１１日ではなく７日）により、新鮮ｒｅ－ＲＥＰ及び解凍ｒｅ－ＲＥＰの両方がＣＤ６９発現のわずかな増加を示した。新鮮ＴＩＬ及び解凍ＴＩＬの間に差は観察されなかった（ｐ＝０．８９）。新鮮ｒｅ－ＲＥＰ及び解凍ｒｅ－ＲＥＰにも差は観察されなかった（ｐ＝０．８２）。Ｂ）ＣＤ６９発現のわずかな増加がｒｅ－ＲＥＰ ＴＩＬ産物で観察される。（注記：Ｍ１０６１Ｔ及びＭ１０６２Ｔ解凍ＴＩＬ産物のいずれについてもＣＤ６９染色は実施されなかった。Ｍ１０６１Ｔ新鮮ＴＩＬ産物のＣＤ６９発現は３３．９％であった）。 [00145]ＣＤ８＋ＣＤ６９＋細胞。ＣＤ４＋集団で観察されたように、図ＡはＣＤ８＋ｒｅ－ＲＥＰ ＴＩＬのＣＤ６９発現の増加を示す。ＣＤ６９の発現は、新鮮ＴＩＬ及び解凍ＴＩＬ（ｐ＝０．６８）又は新鮮ｒｅ－ＲＥＰ ＴＩＬ及び解凍ｒｅ－ＲＥＰ ＴＩＬ（ｐ＝０．７６）との間に有意な差を示さなかった。図Ｂは、ｒｅ－ＲＥＰ ＴＩＬ産物のＣＤ６９発現にわずかな増加があるという観察結果を裏付けている。 [00146]ＣＤ４＋ＣＤ１３７＋細胞。ＣＤ１３７（４－１１３１３）は、ＴＣＲの活性化により誘導されるＴ細胞共刺激受容体である。これは、ＣＤ４＋Ｔ細胞及びＣＤ８＋Ｔ細胞で活性化される。Ａ）ＣＤ１３７発現は、７日間の刺激後、ｒｅ－ＲＥＰ ＴＩＬ集団の大幅な増加を示した。ただし、新鮮ＴＩＬ及び解凍ＴＩＬ又は新鮮ｒｅ－ＲＥＰ ＴＩＬ及び解凍ｒｅ－ＲＥＰ ＴＩＬの間に差は観察されなかった（図Ｂの両方のケースでｐ＜０．０５は、この観察結果を裏付けている）。また、解凍ＴＩＬはＣＤ１３７発現のわずかな減少を示した。ｒｅ－ＲＥＰ ＴＩＬのＣＤ１３７発現の増加は、２回目の７日間のｒｅ－ＲＥＰ刺激に起因すると考えられる。 [00147]ＣＤ８＋ＣＤ１３７＋細胞。Ａ）ＣＤ８＋集団はｒｅ－ＲＥＰ産物の全体的な増加を示した。Ｂ）新鮮ｒｅ－ＲＥＰ産物は、新鮮ＴＩＬ産物と比較して、ＣＤ８＋ＣＤ１３７＋発現が３３．４％増加した。解凍ｒｅ－ＲＥＰ産物は、解凍ＴＩＬと比較して、ＣＤ８＋集団におけるＣＤ１３７発現の３３．１５％の増加も示した。新鮮ｒｅ－ＲＥＰ ＴＩＬ及び解凍ｒｅ－ＲＥＰ ＴＩＬの間に有意な差は観察されなかった。新鮮ＴＩＬを解凍ＴＩＬ産物と比較すると、同様の観察結果が見られる。ＣＤ１３７発現のこの増加は、ｒｅ－ＲＥＰの２回目の活性化に起因するものである可能性がある。（ＣＤ１３７発現は３回の実験では測定されなかったため、分析には６個のＴＩＬのみを使用したことに留意されたい。） [00148]ＣＤ４＋ＣＭ細胞。中央記憶（ＣＭ）集団は、ＣＤ４５ＲＡ－（陰性）及びＣＣＲ７＋（陽性）の発現によって定義される。Ａ）ｒｅ－ＲＥＰ条件でＣＭ集団の増加が観察された。Ｍ１０６３Ｔ及びＭ１０６４Ｔは、新鮮ＴＩＬ産物と比較して、解凍ＴＩＬから得られたＣＤ４＋集団でＣＭ発現の減少を示した。新鮮ＴＩＬ産物及び解凍ＴＩＬ産物（ｐ＝０．１６５８）も、新鮮ｒｅ－ＲＥＰ ＴＩＬ及び解凍ｒｅ－ＲＥＰ ＴＩＬ（ｐ＝０．５５３５）もＣＭ集団に有意な差を示さなかった。Ｂ）ＣＭ集団の１４．４％及び１５．４％の増加が、それぞれ新鮮ＴＩＬ及び解凍ＴＩＬと比較して、新鮮ｒｅ－ＲＥＰ ＴＩＬ及び解凍ｒｅ－ＲＥＰ ＴＩＬで観察された。 [00149]ＣＤ８＋ＣＭ細胞。Ａ）ＣＤ８＋集団では、新鮮ＴＩＬ産物でＣＭ発現の劇的な増加が見られた。これはＴＩＬ産物には見られない。この増加は有意性に影響せず（ｐ＝０．３０８６）、新鮮ＴＩＬ及び解凍ＴＩＬの間に差がないことを示唆している。同様の傾向がｒｅ－ＲＥＰ ＴＩＬ産物でも見られた。図４８Ｂ）解凍ＴＩＬと比較して、新鮮ＴＩＬのＣＭ集団の全体的な増加が観察された。数値は、新鮮ＴＩＬ及び新鮮ｒｅ－ＲＥＰ ＴＩＬの差がわずか約２％であることを示している。新鮮ＴＩＬは、Ｍ１０６４Ｔに起因する非常に高い標準偏差を示した。Ｍ１０６４ＴのＣＭ発現を除外すると、新鮮ＴＩＬ産物及び解凍ＴＩＬ産物の間で非常によく似たＣＭ発現が生じた（図示せず）。 [00150]ＣＤ４＋ＥＭ細胞。エフェクターメモリー（ＥＭ）集団は、ＣＣＲ７及びＣＤ４５ＲＡの発現の欠如によって定義される。Ａ）予想どおり、新鮮ＴＩＬ及び解凍ＴＩＬのＣＤ４＋集団は、高いレベルのエフェクターメモリー表現型を有していた。エフェクターメモリー発現の劇的な減少が、Ｍ１０５６Ｔ ｒｅ－ＲＥＰ ＴＩＬ集団で見つかった。また、他の５つの実験では、新鮮ｒｅ－ＲＥＰ ＴＩＬ及び解凍ｒｅ－ＲＥＰ ＴＩＬの両方でエフェクターメモリー表現型の減少が示された。Ｂ）新鮮ＴＩＬ及び解凍ＴＩＬの両方が、同様のエフェクターメモリー表現型の発現を示した。新鮮Ｒｅ－ＲＥＰ ＴＩＬ及び新鮮Ｒｅ－ＲＥＰ ＴＩＬの比較では、後者で１６％の減少が示された。解凍ＴＩＬと比較した場合、解凍Ｒｅ－ＲＥＰ ＴＩＬ（９％）で同様の減少が観察された。 [00151]ＣＤ８＋ＥＭ細胞。Ａ）新鮮ＴＩＬにおけるエフェクターメモリーの増加の同様のパターンが、ＣＤ８＋集団でも見られた。Ｍ１０６４Ｔには例外があり、新鮮ＴＩＬのエフェクターメモリプロファイルはわずか２０％であった。これは、Ａ及びＢに記載されているように、これらのＴＩＬの７３％がＣＭ表現型を有することに起因する。ｒｅ－ＲＥＰ産物からのＣＤ４＋ＴＩＬのエフェクターメモリー集団の減少を示す全ての試料は、ＣＤ８＋ＴＩＬの傾向と同じ傾向を示した。Ｂ）ＣＤ４＋ＴＩＬ集団とは異なり、ＣＤ８＋ＴＩＬは、新鮮ＴＩＬ、解凍ＴＩＬ、及びｒｅ－ＲＥＰ産物で同様のエフェクターメモリー表現型を示した。（新鮮ＴＩＬ及び解凍ＴＩＬの標準偏差が高いことに注意されたい。これは、Ｍ１０６４Ｔの新鮮ＴＩＬのエフェクターメモリー集団が少なく、Ｍ１０６１Ｔの解凍ＴＩＬ試料では発現がないことに起因する。） [00152]ＣＤ４＋ＣＤ２８＋細胞。ＣＤ２８発現は、幼若ＴＩＬが年齢とともに減少することと相関する。Ａ）ＣＭ集団の増加がｒｅ－ＲＥＰ ＴＩＬで観察されたにもかかわらず、ＣＤ２８発現の減少は、ＣＭ状態だけではＴＩＬの動態を決定できないことを示唆する傾向として見られた。Ｍ１０６１Ｔ ＣＤ４＋ ＴＩＬを除き、－ｒｅ－ＲＥＰ産物ではＣＤ２８発現の減少が観察された。ＣＤ２８発現は、幼若ＴＩＬが年齢とともに減少することと相関する。Ｂ）新鮮ＴＩＬ産物及び解凍ＴＩＬ産物と比較して、それぞれ新鮮ＴＩＬで８．８９％、解凍ＴＩＬで５．７１％の減少が見られた。 [00153]ＣＤ８＋ＣＤ２８＋細胞。Ａ）ＣＤ８＋ ＴＩＬ集団におけるＣＤ２８発現は、ｒｅ－ＲＥＰ産物よりも新鮮ＴＩＬ及び解凍ＴＩＬで高かった。ほとんどの場合、解凍ｒｅ－ＲＥＰ ＴＩＬは、解凍ＴＩＬ及び新鮮ｒｅ－ＲＥＰ ＴＩＬと比較した場合、劇的な減少を示した。ただし、スチューデントｔ検定は、新鮮ＴＩＬ及び解凍ＴＩＬ（ｐ＝０．３６６８）間及び新鮮ｒｅ－ＲＥＰ産物及び解凍ｒｅ－ＲＥＰ産物（ｐ－＝０．７９４０）間にも有意な差を示さなかった。Ｂ）ＣＤ４＋ ＴＩＬ集団で見られるように、再刺激されていないものと比較した場合、新鮮ｒｅ－ＲＥＰ（２１．５％）及び解凍ｒｅ－ＲＥＰ（１８．２％）でＣＤ８＋ＣＤ２８＋集団で減少した。 [00154]ＣＤ４＋ＰＤ－１＋細胞。ＴＩＬのＰＤ－１発現は、抗原反応性及び消耗Ｔ細胞に相関する。即ち、１１日間ＲＥＰを受けたＴＩＬで消耗表現型が観察されることは驚くに値しない。Ａ）この消耗表現型は、解凍ＴＩＬ産物（具体的には、ＥＰ１１００１Ｔ及びＭ１０５６Ｔ）で維持又は増加された。新鮮ＴＩＬ産物及び解凍ＴＩＬ産物の間に有意な差は見られなかった（ｐ＝０．９８０９）。解凍ｒｅ－ＲＥＰ ＴＩＬと比較して、同様の傾向が新鮮ｒｅ－ＲＥＰ ＴＩＬに示された（ｐ＝０．０９１２）。Ｂ）新鮮ｒｅ－ＲＥＰは、ＣＤ４＋ ＴＩＬ集団におけるＰＤ－１発現のわずかな減少を示した。他の全ての条件で、同等のＰＤ－１発現パターンを維持した。ＰＤ－１発現の減少又は変化は、他の全ての条件と比較して新鮮ｒｅ－ＲＥＰ産物で観察された。ＰＤ－１発現の増加は、解凍ｒｅ－ＲＥＰ産物のＭ１０６２Ｔ、Ｍ１０６３Ｔ（ＣＤ４＋）及びＥＰ１１００１Ｔ（ＣＤ８＋）で見られた。他の全ての解凍ｒｅ－ＲＥＰ産物は、解凍ｒｅ－ＲＥＰ産物に匹敵する結果を示した。 [00155]ＣＤ８＋ＰＤ－１＋細胞。Ａ）新鮮ＴＩＬ産物からのＣＤ８＋集団は、ＰＤ－１発現の増加に関連するより消耗表現型を示した。ＥＰ１１００１Ｔで例外が観察され、ＣＤ８＋解凍ＴＩＬ産物では、新鮮ＴＩＬ産物と比較してＰＤ－１発現がわずかに増加した。解凍ＴＩＬと比較して、新鮮ＴＩＬのＰＤ－１発現にはわずかな差はあったが、有意な差はなかった（ｐ＝０．３１４４）。Ｂ）新鮮ＴＩＬ産物はわずかな増加を示したが、解凍ＴＩＬと比較して有意ではないＰＤ－１発現（６．７４％、又は解凍ＴＩＬの１．２倍以上の倍率）は、解凍ＴＩＬ産物が表現型パターンに基づいて同等であることを示唆していた。 [00156]ＣＤ４＋ＬＡＧ３＋細胞。消耗Ｔ細胞は、ＰＤ－１とともに高レベルの阻害性受容体ＬＡＧ３を発現する。Ａ）ＣＤ４＋解凍ＴＩＬは、新鮮ＴＩＬと比較してＬＡＧ３発現レベルがわずかに高いが有意なものではないことを示した（ｐ＝０．５２）。Ｍ１０６３Ｔで例外が観察された。ＣＤ４＋新鮮ｒｅ－ＲＥＰ ＴＩＬ及び新鮮ｒｅ－ＲＥＰ ＴＩＬのＬＡＧ３発現が測定された実験では、新鮮ＴＩＬと比較して、新鮮ｒｅ－ＲＥＰ試料でＬＡＧ３＋発現の減少が観察された。Ｂ）全体的に、新鮮ｒｅ－ＲＥＰ ＴＩＬ産物ではＬＡＧ３発現がわずかに減少している。図Ｂの一貫性を維持するため、ＬＡＧ３発現が新鮮産物で測定されなかったため、Ｍ１０６１Ｔ、Ｍ１０６２Ｔ、及びＭ１０６４Ｔは除外されていることに注意されたい。 [00157]ＣＤ８＋ＬＡＧ３＋細胞。Ａ）ＴＩＬ発現するＣＤ８＋ ＬＡＧ３は、新鮮ｒｅ－ＲＥＰ ＴＩＬでＬＡＧ３発現の顕著な減少が見られたＭ１０６３Ｔを除き、本実験でわずかな減少を示した。全体として、ＬＡＧ３発現に関して、解凍ｒｅ－ＲＥＰ ＴＩＬは新鮮ｒｅ－ＲＥＰ ＴＩＬと比較して１．５倍の有意な増加を示した（ｐ＝０．０１５４）。ただし、新鮮ＴＩＬ産物及び解凍ＴＩＬ産物の間に有意な差は認められなかった（ｐ＝０．０８８４）。Ｂ）解凍ＴＩＬ産物と比較して、新鮮ｒｅ－ＲＥＰからのＣＤ８＋ ＴＩＬでのＬＡＧ３発現の約３０％の減少が観察された。新鮮ＴＩＬ及び解凍ＴＩＬは、解凍ＴＩＬに匹敵し、わずかな増加を示した。（本図では、新鮮ＴＩＬ試料又は新鮮ｒｅ－ＲＥＰ ＴＩＬ試料のいずれかでＬＡＧ３発現が測定されなかったため、Ｍ１０６１Ｔ、Ｍ１０６２Ｔ及びＭ１０６４Ｔは除外されている。） [00158]ＣＤ４＋ＴＩＭ－３＋細胞。Ａ）ＰＤ－１及びＬＡＧ３の場合で以前観察されたように、解凍ｒｅ－ＲＥＰ ＴＩＬと比較して、新鮮ｒｅ－ＲＥＰ ＴＩＬでＴＩＭ－３発現の減少が見られた。それにもかかわらず、新鮮ｒｅ－ＲＥＰ ＴＩＬ及び解凍ｒｅ－ＲＥＰ ＴＩＬ（ｐ＝０．２００７）の間に有意な差はなかった。Ｂ）ＴＩＭ－３発現の大きな変化は、解凍ＴＩＬ及び解凍ｒｅＲＥＰ ＴＩＬ産物では見られなかった。解凍ｒｅ－ＲＥＰ産物と比較して、新鮮ｒｅ－ＲＥＰ ＴＩＬでＴＩＭ－３発現の９．２％のわずかな減少が観察された。 [00159]ＣＤ８＋ＴＩＭ－３＋細胞。Ａ）ＣＤ４＋集団で見られたＴＩＭ－３発現の同様の傾向は、ＣＤ８＋ ＴＩＬでも見られた。新鮮ｒｅ－ＲＥＰ ＴＩＬ表現型は最も少なく、ＴＩＭ－３発現が低く、解凍ｒｅ－ＲＥＰ ＴＩＬと比較して有意な差があった（ｐ＝０．０１４７）。ＰＤ－１、ＬＡＧ３及びＴＩＭ－３の比較は、新鮮ｒｅ－ＲＥＰ ＴＩＬ表現型が網羅的ではなく、ＣＭ表現型が増加していることを示唆している。Ｂ）解凍ｒｅ－ＲＥＰ ＴＩＬ産物と比較して、新鮮ｒｅ－ＲＥＰ ＴＩＬはＴＩＭ－３発現の２２％の有意な減少を示した。新鮮ＴＩＬ及び解凍ＴＩＬの両方が同様のＴＩＭ－３発現パターンを示す。 [00160]Ｐ８１５標的細胞株に対するＴＩＬの細胞傷害能。 [00161]新鮮ＴＩＬ、新鮮ｒｅ－ＲＥＰ ＴＩＬ、及び解凍ｒｅ－ＲＥＰ ＴＩＬの代謝呼吸プロファイル。基礎ＯＣＲ（Ａ）、顕在ＳＲＣ（Ｂ）、ＳＲＣ２ＤＧ（Ｃ）、潜在ＳＲＣ（Ｄ）、基礎ＥＣＡＲ（Ｅ）、及び解糖予備能（Ｆ）。 [00162]フローＦＩＳＨテクノロジーを使用して、ポストＲＥＰプロセス２Ａで解凍した９つのＴＩＬ産物のテロメアリピートの平均長を測定した。Ａ）データは、ｑＰＣＲでＴＩＬを１３０１の細胞と比較して測定したテロメア長を表す。Ｂ）データは、ＴＩＬのフローＦＩＳＨアッセイで１３０１の細胞と比較して測定したテロメア長を示す。グラフに使用されるデータは、附属セクション１０の表形式（表２５）で提供されている。全体として、２つのテロメア長アッセイの結果のパターンには大まかな類似性があったが、実験ではＴＩＬの実際のテロメア長をより正確に反映する方法を決定し続ける。この技術を将来の臨床試料に適用し、テロメア長とＴＩＬ療法に対する患者の応答との関係を判断することができる。 [00163]無血清培地提供者の選択（血清代替物）。各断片は、G-Rex２４ウェルプレートの単一ウェルで４回ずつ培養した。１１日目に、ＲＥＰは、４５ ＴＩＬ及び１０６フィーダーを使用して開始され、２Ａプロセスを模した。Ａ）各条件について１１日目（プレＲＥＰ）に記録された平均生細胞数を示す棒グラフ。Ｂ）２２日目（ポストＲＥＰ）に記録された平均生細胞数を示す棒グラフ。Ｐ値は、スチューデントの「ｔ」検定を使用して計算された。それぞれ、＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００１である。 [00164]無血清培地提供者の選択（血小板ライセート血清）。各断片は、G-Rex２４ウェルプレートの単一ウェルで３回ずつ培養した。１１日目に、ＲＥＰは、４ｅ５ ＴＩＬ及び１０ｅ６フィーダーを使用して開始され、２Ａプロセスを模した。Ａ）各条件について１１日目（プレＲＥＰ）に記録された平均生細胞数を示す棒グラフ。Ｂ）２２日目（ポストＲＥＰ）に記録された平均生細胞数を示す棒グラフ。Ｐ値は、スチューデントの「ｔ」検定を使用して計算された。それぞれ、＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００１である。「＃」腫瘍断片不足。 [00165]小規模２Ａプロセス（G-Rex ５Ｍ）を使用して、CTS Optimizerの有効性と標準条件を比較する。２つの断片／G-Rex ５Ｍを３回培養し、２Ａプロセスを模するために５０６フィーダーで２６ ＴＩＬを使用してＲＥＰを開始した。上記の数値は、１１日目（Ａ）又は２２日目（Ｂ）に得られた平均生細胞数である。 [00165]小規模２Ａプロセス（G-Rex ５Ｍ）を使用して、CTS Optimizerの有効性と標準条件を比較する。２つの断片／G-Rex ５Ｍを３回培養し、２Ａプロセスを模するために５０６フィーダーで２６ ＴＩＬを使用してＲＥＰを開始した。上記の数値は、１１日目（Ａ）又は２２日目（Ｂ）に得られた平均生細胞数である。 [00166]標準条件及びCTS Optimizerを比較して推定されるＴＩＬ拡大培養の前後の概要。Ａ）プレＲＥＰ。Ｂ）ポストＲＥＰ。Ｃ）実際通りに実施するため外挿されたＴＩＬ拡大培養の概要（標準条件とCTS Optimizer＋ＳＲ）。 [00166]標準条件及びCTS Optimizerを比較して推定されるＴＩＬ拡大培養の前後の概要。Ａ）プレＲＥＰ。Ｂ）ポストＲＥＰ。Ｃ）実際通りに実施するため外挿されたＴＩＬ拡大培養の概要（標準条件とCTS Optimizer＋ＳＲ）。 [00166]標準条件及びCTS Optimizerを比較して推定されるＴＩＬ拡大培養の前後の概要。Ａ）プレＲＥＰ。Ｂ）ポストＲＥＰ。Ｃ）実際通りに実施するため外挿されたＴＩＬ拡大培養の概要（標準条件とCTS Optimizer＋ＳＲ）。 [00167]ＣＤ８＋は、生細胞でゲーティングされた。９つの腫瘍のうち７つは、ＣＴＳ＋ＳＲ状態で絶対ＣＤ８＋集団の増加を示す。 [00168]インターフェロンガンマの比較可能性。インターフェロンガンマＥＬＩＳＡ（Quantikine）。ＩＦＮ－ｙの産生は、R＆D SystemsのQuantikine ELISAキットを使用して測定した。ＣＴＳ＋ＳＲは、標準条件と比較した場合、同量のＩＦＮーｙを産生した。 [00169]迅速拡大培養プロトコル（ＲＥＰ：Rapid Expansion Protocol）の例示的な実施形態のスキーム。到着すると、腫瘍は断片化され、１１日間、ＴＩＬ拡大培養（プレＲＥＰ拡大培養）を行うためＩＬ－２を含むG-Rexフラスコに入れられる。トリプルカクテル研究では、プレＲＥＰの開始時にＩＬ－２／ＩＬ－１５／ＩＬ－２１が追加される。迅速拡大培養プロトコル（ＲＥＰ：Rapid Expansion Protocol）の場合、ＴＩＬは更に１１日間のＲＥＰ拡大培養のためにフィーダーとＯＫＴ３で培養される。 [00170]黒色腫由来のＴＩＬ（ｎ＝４）、及び肺（ｎ＝７）は、ポストプレＲＥＰのフローサイトメトリーを使用して、ＣＤ４＋及びＣＤ８＋細胞の表現型を評価した。＊Ｐ値は、スチューデントの非対応ｔ検定を使用したＣＤ８＋細胞におけるＩＬ－２及びＩＬ－１２／ＩＬ－１５／ＩＬ－２１の差を表す。 [00171]黒色腫由来のＴＩＬ（ｎ＝４）、及び肺（ｎ＝７）は、ポストプレＲＥＰのフローサイトメトリーを使用して、ＣＤ４＋及びＣＤ８＋細胞のＣＤ２７＋及びＣＤ２８＋の表現型を評価した。 [00172]ＴＩＬは、ＣＤ８＋細胞のエフェクター／メモリーサブセット（ＣＤ４５ＲＡ及びＣＣＲ７）及び黒色腫（ｎ＝４）（Ａ）及び肺（ｎ＝８）（Ｂ）のＣＤ４＋（データに示さず）の表現型で評価された。ＣＸＣＲ３発現は、黒色腫と肺で評価された。表現型発現は全て、ポストプレＲＥＰのフローサイトメトリーを使用して評価された。ＴＣＭ＝セントラルメモリー、ＴＳＣＭ＝幹細胞様メモリー、ＴＥＭＲＡ（エフェクターＴ細胞）、ＴＥＭ＝エフェクターメモリー。 [00173]（Ａ）黒色腫（ｎ＝４）及び（Ｂ）肺（ｎ＝５）に由来するＴＩＬを、ＣＤ４＋及びＣＤ８＋細胞における４時間のＰＭＡ刺激に応答したＣＤ１０７ａ＋発現について、フローサイトメトリーにより評価した。（Ｃ）プレＲＥＰ ＴＩＬ（ｎ＝５）を可溶性ＯＫＴ３（３０ｎｇ／ｍｌ）で２４時間刺激し、上清をＥＬＩＳＡによりＩＦｎγについて評価した。 [00174]ＴＣＲｖβレパートリー（２４の特異性）は、フローサイトメトリー用のBeckman Coulterキットを使用して、黒色腫（Ａ）及び肺（Ｂ）に由来するＴＩＬで評価された。 [00174]ＴＣＲｖβレパートリー（２４の特異性）は、フローサイトメトリー用のBeckman Coulterキットを使用して、黒色腫（Ａ）及び肺（Ｂ）に由来するＴＩＬで評価された。 [00175]凍結保存ＴＩＬの代表的な製造プロセス（約２２日間）。 [00176]２２日目に、洗浄及び製剤化の前に培養細胞の性能を決定するため、容積が減少した細胞産物をプールしてサンプリングする。試料は、前述のようにNC-200自動セルカウンターで分析される。総生細胞密度は、４つの独立した試料からの重複カウントの総平均によって決定される。ジェネレーション２（Ｇｅｎ２：Generation 2）プロセスでは、ジェネレーション１（Ｇｅｎ１：Generation 1；Ｇｅｎ１の平均＝４．１０×１０１０±２．９２×１０１０、第２世代の平均＝３．１２×１０１０±２．１９×１０１０）と同様の用量のＴＩＬ産物が産生される。Ｂ）拡大倍数は、ＲＥＰ段階について、初期の生ＴＩＬ播種密度に対する最終的な生細胞密度の被除数として計算される。Ｇｅｎ２のＴＩＬ産物は、Ｇｅｎ１に比べて拡大倍数が低くなっている（Ｇｅｎ１の平均＝１．４０×１０３±９．８６×１０２、Ｇｅｎ２の平均＝５．１１×１０２±２．９５×１０２）。 [00177]遊離のためのフローサイトメトリーにより、新鮮な調剤済製剤産物を同一性のためにアッセイした。Ｇｅｎ１及びＧｅｎ２プロセスは、ＣＤ４５、ＣＤ３二重陽性表現型（Ｇｅｎ１＃±ＳＤ、Ｇｅｎ２＃±ＳＤ）で定義される高純度のＴ細胞培養物を産生する。Ｐ値は、Mann-Whitneyの「ｔ」検定を使用して計算された。 [00178]調剤済製剤産物の凍結保存サテライトのバイアルを解凍し、前述のようにフローサイトメトリーにより拡大培養表現型についてアッセイした。Ｇｅｎ１及びＧｅｎ２産物は、ＣＤ８ Ｔ細胞サブタイプとＣＤ４ Ｔ細胞サブタイプの同様の比率を表す。Ｐ値は、Mann-Whitneyの「ｔ」検定を使用して計算された。 [00179]調剤済製剤産物の凍結保存サテライトのバイアルを解凍し、前述のようにフローサイトメトリーにより拡大培養表現型についてアッセイした。Ｇｅｎ１及びＧｅｎ２産物は、Ｔ細胞サブセット上で同レベルの共刺激分子ＣＤ２７及びＣＤ２８を発現する。Ｐ値は、Mann-Whitneyの「ｔ」検定を使用して計算された。ＣＤ２７及びＣＤ２８などの共刺激分子は、Ｔ細胞受容体の関与時にエフェクター細胞の成長に必要な二次及び三次シグナルを供給するために必要である。 [00180]フローＦＩＳＨテクノロジーを使用して、前述のようにテロメアの反復の平均長を測定した。上記のＲＴＬ値は、対照細胞株のＧｅｎ１（１Ｃプロセスの実施形態）の染色体／ゲノムあたりの平均テロメア蛍光が＃％±ＳＤ％であり、Ｇｅｎ２が染色体／ゲノムあたりのテロメア蛍光が＃％±ＳＤ％であることを示す（１３０１白血病細胞株）。データは、Ｇｅｎ２産物が、平均してＧｅｎ１産物と少なくとも同等のテロメア長を有していることを示す。テロメア長は、エキソビボ細胞培養物の長さの代替測定値である。 [00181]Ｇｅｎ２（プロセスの実施形態２Ａ）製剤産物は、Ｇｅｎ１製剤産物と比較したＩＦＮ－γの産生能力の増加を示す。製剤産物が再活性化され、サイトカインを分泌する能力は、ＨＬＡのコンテキストで同種抗原にＴＣＲが結合した際のインビボ機能の代替手段である。 [00182]Ｔ細胞受容体の多様性： Ｇｅｎ１（プロセス１Ｃの実施形態）及びＧｅｎ２（２Ａプロセスの実施形態）製剤産物の１０×１０６ ＴＩＬからのＲＮＡをアッセイして、各製品に存在する固有のＣＤＲ３配列の総数と頻度を決定した。Ａ）各産物に存在する一意のＣＤＲ３配列の総数（Ｇｅｎ１ ｎ＝＃、平均値±ＳＤ、Ｇｅｎ２ ｎ＝＃、平均値±ＳＤ）。Ｂ）固有のＣＤＲ３配列には、産物内のＴ細胞受容体の相対的な多様性を表すスコアを得るため、各産物における頻度に対してインデックスを付した。両方のプロセスのＴＩＬ産物は、異なる抗原特異性と結合活性を持つＴ細胞のポリクローナル集団で構成されている。総Ｔ細胞レパートリーの幅は、腫瘍細胞上の作用可能なエピトープの数の指標である場合がある。 [00183]プロセス２Ａ、ＴＩＬ製造の２２日間プロセスの実施形態の略図を示す。 [00184]プロセス１Ｃ及びプロセス２Ａの例示的な実施形態からのステップＡ～Ｆの比較表。 [00185]プロセス１Ｃの実施形態とプロセス２Ａの実施形態の詳細な比較。 [00186]ＴＩＬ療法プロセスの実施形態の詳細なスキーム。 [00187]１０色フローサイトメトリーアッセイを使用したＴＩＬ産物の表現型の特性評価。（Ａ）Ｔ細胞及び非Ｔ細胞サブセットの割合は、それぞれＣＤ４５＋ＣＤ３＋及びＣＤ４５－（非リンパ球）／ＣＤ４５＋ＣＤ３－（非Ｔ細胞リンパ球）によって定義される。全体として、検定されたＴＩＬ産物の＞９９％がＴ細胞（ＣＤ４５＋ＣＤ３＋）で構成されていた。示されているのは、ＴＩＬ産物の平均である（ｎ＝１０）。 [00187]１０色フローサイトメトリーアッセイを使用したＴＩＬ産物の表現型の特性評価。（Ｂ）ＣＤ４５＋ＣＤ３＋ＣＤ８＋（青い白抜きの丸）及びＣＤ４５＋ＣＤ３＋ＣＤ４＋（ピンクの白抜きの丸）を含む２つのＴ細胞サブセットの割合。スチューデントの非対Ｔ検定を使用しても、両方のサブセットの割合に統計的な差は認められない（Ｐ＝０．６８）。 [00187]１０色フローサイトメトリーアッセイを使用したＴＩＬ産物の表現型の特性評価。（Ｃ）非Ｔ細胞集団は、以下を含む４つの異なるサブセットで特徴付けられた。１）非リンパ球（ＣＤ４５－）、２）ＮＫ細胞（ＣＤ４５＋ＣＤ３－ＣＤ１６＋／５６＋）、３）Ｂ細胞（ＣＤ４５＋ＣＤ１９＋）、及び４）非ＮＫ／Ｂ細胞（ＣＤ４５＋ＣＤ３－ＣＤ１６－ＣＤ５６－ＣＤ１９－）。 [00188]ＣＤ４５＋ＣＤ３＋ＣＤ４＋及びＣＤ４５＋ＣＤ３＋ＣＤ８＋細胞集団のＴ細胞サブセットの特徴付け。ナイーブ、セントラルメモリー（ＴＣＭ）、エフェクターメモリー（ＴＥＦ）、及びエフェクターメモリーＲＡ＋（ＥＭＲＡ）Ｔ細胞サブセットは、ＣＤ４５ＲＡ及びＣＣＲ７を使用して定義された。図は、ＣＤ４＋（Ａ）、及びＣＤ８＋（Ｂ）の両方の細胞集団における１０の最終ＴＩＬ産物からの代表的なＴ細胞サブセットを示す。エフェクターメモリーＴ細胞サブセット（青い白抜き丸）は、最終ＴＩＬ産物のＣＤ４＋及びＣＤ８＋サブセットの両方で主要な集団（＞９３％）である。ＴＩＬ産物の７％未満の細胞がセントラルメモリーサブセットである（ピンクの白抜き丸）。ＥＭＲＡ（灰色の白抜き丸）及びナイーブ（黒の白抜き丸）サブセットは、ＴＩＬ産物ではほとんど検出されない（＜０．０２％）。Ｐ値は、スチューデントの非対応Ｔ検定を使用したＥＭ及びＣＭの差を表す。 [00188]ＣＤ４５＋ＣＤ３＋ＣＤ４＋及びＣＤ４５＋ＣＤ３＋ＣＤ８＋細胞集団のＴ細胞サブセットの特徴付け。ナイーブ、セントラルメモリー（ＴＣＭ）、エフェクターメモリー（ＴＥＦ）、及びエフェクターメモリーＲＡ＋（ＥＭＲＡ）Ｔ細胞サブセットは、ＣＤ４５ＲＡ及びＣＣＲ７を使用して定義された。図は、ＣＤ４＋（Ａ）、及びＣＤ８＋（Ｂ）の両方の細胞集団における１０の最終ＴＩＬ産物からの代表的なＴ細胞サブセットを示す。エフェクターメモリーＴ細胞サブセット（青い白抜き丸）は、最終ＴＩＬ産物のＣＤ４＋及びＣＤ８＋サブセットの両方で主要な集団（＞９３％）である。ＴＩＬ産物の７％未満の細胞がセントラルメモリーサブセットである（ピンクの白抜き丸）。ＥＭＲＡ（灰色の白抜き丸）及びナイーブ（黒の白抜き丸）サブセットは、ＴＩＬ産物ではほとんど検出されない（＜０．０２％）。Ｐ値は、スチューデントの非対応Ｔ検定を使用したＥＭ及びＣＭの差を表す。 [00189]黒色腫腫瘍細胞におけるＭＣＳＰ及びＥｐＣＡＭ発現の検出。黒色腫腫瘍細胞株（ＷＭ３５、５２６、及び８８８）、患者由来の黒色腫細胞株（１０２８、１０３２、及び１０４１）、結腸直腸腺腫がん細胞株（陰性対照としてＨＴ２９）は、ＭＣＳＰ（黒色腫（コンドロイチン硫酸プロテオグリカン）及びＥｐＣＡＭ（上皮細胞接着分子）マーカーによって特徴付けられた。（Ａ）黒色腫腫瘍細胞の平均９０％がＭＣＳＰを発現している。 [00189]黒色腫腫瘍細胞におけるＭＣＳＰ及びＥｐＣＡＭ発現の検出。黒色腫腫瘍細胞株（ＷＭ３５、５２６、及び８８８）、患者由来の黒色腫細胞株（１０２８、１０３２、及び１０４１）、結腸直腸腺腫がん細胞株（陰性対照としてＨＴ２９）は、ＭＣＳＰ（黒色腫（コンドロイチン硫酸プロテオグリカン）及びＥｐＣＡＭ（上皮細胞接着分子）マーカーによって特徴付けられた。（Ｂ）ＥｐＣＡＭ＋腫瘍細胞株である陽性対照ＨＴ２９と比較して、黒色腫腫瘍細胞株ではＥｐＣＡＭ発現は検出されなかった。 [00190]腫瘍検出精度を決定するための混入対照の検出。アッセイは、既知量の腫瘍細胞をＰＢＭＣ懸濁液（ｎ＝１０）に混入させることによって実施された。ＭＣＳＰ＋５２６黒色腫腫瘍細胞を１：１０、１：１００、及び１：１，０００の比率で希釈し、その後ＰＢＭＣと混合し、抗ＭＣＳＰ及び抗ＣＤ４５抗体と生／死染料で染色し、フローサイトメトリーで分析した。（Ａ）約３０００、３００、及び３０の細胞がそれぞれ１：１０、１：１００、及び１：１０００の希釈で検出された。 [00190]腫瘍検出精度を決定するための混入対照の検出。アッセイは、既知量の腫瘍細胞をＰＢＭＣ懸濁液（ｎ＝１０）に混入させることによって実施された。ＭＣＳＰ＋５２６黒色腫腫瘍細胞を１：１０、１：１００、及び１：１，０００の比率で希釈し、その後ＰＢＭＣと混合し、抗ＭＣＳＰ及び抗ＣＤ４５抗体と生／死染料で染色し、フローサイトメトリーで分析した。（Ｂ）各条件で取得された細胞の平均（ＡＶ）及び標準偏差（ＳＤ）を使用して、基準の上限及び下限を定義した。 [00191]混入対照の上限と下限の再現性研究。混入アッセイの再現性を決定するため、３つの独立した実験を３回繰り返し実施した。（Ａ）ＭＣＳＰ＋で検出された腫瘍細胞の数は、一貫して基準の上限から下限の範囲内であった。 [00191]混入対照の上限と下限の再現性研究。混入アッセイの再現性を決定するため、３つの独立した実験を３回繰り返し実施した。（Ｂ）線形回帰図は、ＭＣＳＰ＋細胞及び混入希釈（Ｒ２＝０．９９）の相関関係を示しており、黒実線が最適値を実証する。緑色と灰色の破線は、それぞれ標準曲線と試料（Ｅｘｐ＃１～３）の９５％の予測限界を表す。 [00192]ＴＩＬ産物中の残存黒色腫腫瘍の検出。ＴＩＬ産物を、開発されたアッセイを使用して残った腫瘍汚染について評価した（ｎ＝１５）。（Ａ及びＢ）検出可能なＭＣＳＰ＋事象の中央値及び割合は、それぞれ２及び０．０００２％であった。 [00192]ＴＩＬ産物中の残存黒色腫腫瘍の検出。ＴＩＬ産物を、開発されたアッセイを使用して残った腫瘍汚染について評価した（ｎ＝１５）。（Ａ及びＢ）検出可能なＭＣＳＰ＋事象の中央値及び割合は、それぞれ２及び０．０００２％であった。 [00193]Ｔ細胞活性化後のＴＩＬ産物の効力評価。ＥＬＩＳＡで重複して評価されたＴＩＬ産物中の抗ＣＤ３／ＣＤ２８／ＣＤ１３７による再刺激後のＩＦＮγ分泌（ｎ＝５）。ＴＩＬ産物によるＩＦＮγの分泌は、ウィルコクソンの符号付き順位検定を使用した非刺激対照よりも有意に高く（Ｐ＝０．０２）、一貫して＞１０００ｐｇ／ｍｌであった。＞２００ｐｇ／ｍｌのＩＦＮγ分泌は効力があると考えられている。ｐ値＜０．０５は統計的に有意と見なされる。 [00194]凍結保存ＴＩＬ製造プロセスの実施形態の説明（２２日間）。 [00195]Ｇｅｎ１からＧｅｎ２へのプロセス改善の表。 [00196]総生細胞、成長率、及び生存率。２２日目に、洗浄及び製剤化の前に培養細胞の性能を決定するため、容積が減少した細胞産物をプールしてサンプリングする。（Ａ）試料は、前述のようにNC-200自動セルカウンターで分析される。総生細胞密度は、４つの独立した試料からの重複カウントの総平均によって決定される。Ｇｅｎ２プロセスでは、Ｇｅｎ１と同等用量のＴＩＬ産物が産生される（Ｇｅｎ１平均＝４．１０×１０１０±２．８×１０１０、Ｇｅｎ２平均＝４．１２×１０１０±２．５×１０１０）。 [00196]総生細胞、成長率、及び生存率。２２日目に、洗浄及び製剤化の前に培養細胞の性能を決定するため、容積が減少した細胞産物をプールしてサンプリングする。（Ｂ）ＲＥＰ段階の成長率は、ｇｒ＝ｌｎ（Ｎ（ｔ）／Ｎ（０）／ｔとして計算される。 [00196]総生細胞、成長率、及び生存率。２２日目に、洗浄及び製剤化の前に培養細胞の性能を決定するため、容積が減少した細胞産物をプールしてサンプリングする。（Ｃ）前述のように、Cellometer K2を使用して、９つのプロセス開発ロットから細胞生存率を評価した。製剤化された産物の単一の凍結融解サイクルの後、細胞生存率の有意な減少は観察されなかった。解凍及びサンプリング時の生存率の平均低下は２．１９％である。 [00197]Ｇｅｎ２産物は、Ｇｅｎ１と同等のレベルで共刺激分子を発現する高純度のＴ細胞培養物である。（Ａ）遊離のためのフローサイトメトリーにより、新鮮な調剤済製剤産物を同一性のためにアッセイした。Ｇｅｎ１及びＧｅｎ２プロセスは、ＣＤ４５＋、ＣＤ３＋（二重陽性）表現型で定義される高純度のＴ細胞培養物を産生する。 [00197]Ｇｅｎ２産物は、Ｇｅｎ１と同等のレベルで共刺激分子を発現する高純度のＴ細胞培養物である。（Ｂ及びＣ）調剤済製剤産物の凍結保存サテライトのバイアルを解凍し、前述のようにフローサイトメトリーにより拡大培養表現型についてアッセイした。Ｇｅｎ１及びＧｅｎ２産物は、Ｔ細胞サブセット上で同レベルの共刺激分子ＣＤ２７及びＣＤ２８を発現する。ＣＤ２７及びＣＤ２８などの共刺激分子は、Ｔ細胞受容体の関与時にエフェクター細胞の成長に必要な二次及び三次シグナルを供給するために必要である。Ｐ値は、Mann-Whitneyの「ｔ」検定を使用して計算された。 [00197]Ｇｅｎ２産物は、Ｇｅｎ１と同等のレベルで共刺激分子を発現する高純度のＴ細胞培養物である。（Ｂ及びＣ）調剤済製剤産物の凍結保存サテライトのバイアルを解凍し、前述のようにフローサイトメトリーにより拡大培養表現型についてアッセイした。Ｇｅｎ１及びＧｅｎ２産物は、Ｔ細胞サブセット上で同レベルの共刺激分子ＣＤ２７及びＣＤ２８を発現する。ＣＤ２７及びＣＤ２８などの共刺激分子は、Ｔ細胞受容体の関与時にエフェクター細胞の成長に必要な二次及び三次シグナルを供給するために必要である。Ｐ値は、Mann-Whitneyの「ｔ」検定を使用して計算された。 [00198]Ｇｅｎ２産物は同様のテロメア長を示す。ただし、一部のＴＩＬ集団は、相対テロメアが長くなる傾向があり得る。 [00199]Ｇｅｎ２製剤産物は、ＣＤ３、ＣＤ２８、及びＣＤ１３７の関与に応じてＩＦＮγを分泌する。 [00200]Ｔ細胞受容体の多様性。（Ａ）固有のＣＤＲ３配列には、産物内のＴ細胞受容体の全体的な多様性を表すスコアを得るため、各産物における頻度に対してインデックスを付した。 [00200]Ｔ細胞受容体の多様性。（Ｂ）各注入製品に存在するユニークなＣＤＲ３配列の平均総数。 [00201]本発明のＴＩＬ製造プロセスの実施形態。 [00202]複数の腫瘍組織におけるＩＬ－２／ＩＬ－１５／ＩＬ－２１によるプレＲＥＰ中の拡大培養の亢進。 [00203]ＩＬ－２／ＩＬ－１５／ＩＬ－２１は、肺癌ではＣＤ８＋細胞の割合を増加させたが、黒色腫では増加しなかった。（Ａ）黒色腫（ｎ＝４）及び（Ｂ）肺（ｎ＝７）に由来するＴＩＬは、ポストプレＲＥＰのフローサイトメトリーを使用して、ＣＤ４＋及びＣＤ８＋細胞の表現型を評価した。 [00203]ＩＬ－２／ＩＬ－１５／ＩＬ－２１は、肺癌ではＣＤ８＋細胞の割合を増加させたが、黒色腫では増加しなかった。（Ａ）黒色腫由来のＴＩＬ（ｎ＝４）、及び（Ｂ）肺（ｎ＝７）は、ポストプレＲＥＰのフローサイトメトリーを使用して、ＣＤ４＋及びＣＤ８＋細胞の表現型を評価した。 [00204]ＣＤ２７の発現は、ＩＬ－２／ＩＬ－１５／ＩＬ－２１で処理した培養物のＣＤ８＋細胞でわずかに亢進した。（Ａ）黒色腫由来のＴＩＬ（ｎ＝４）、及び（Ｂ）肺（ｎ＝７）は、ポストプレＲＥＰのフローサイトメトリーを使用して、ＣＤ４＋及びＣＤ８＋細胞のＣＤ２７＋及びＣＤ２８＋の表現型を評価した。 [00204]ＣＤ２７の発現は、ＩＬ－２／ＩＬ－１５／ＩＬ－２１で処理した培養物のＣＤ８＋細胞でわずかに亢進した。（Ａ）黒色腫由来のＴＩＬ（ｎ＝４）、及び（Ｂ）肺（ｎ＝７）は、ポストプレＲＥＰのフローサイトメトリーを使用して、ＣＤ４＋及びＣＤ８＋細胞のＣＤ２７＋及びＣＤ２８＋の表現型を評価した。 [00205]Ｔ細胞サブセットは、ＩＬ－１５／ＩＬ－２１の添加では変化しなかった。ＴＩＬは、（Ａ）黒色腫（ｎ＝４）からのＣＤ８＋及びＣＤ４＋（データに示さず）細胞のエフェクター／メモリーサブセット（ＣＤ４５ＲＡ及びＣＣＲ７）、及びフローサイトメトリーポストプレＲＥＰを介して（Ｂ）肺（ｎ＝８）の表現型で評価された。 [00205]Ｔ細胞サブセットは、ＩＬ－１５／ＩＬ－２１の添加では変化しなかった。ＴＩＬは、（Ａ）黒色腫（ｎ＝４）からのＣＤ８＋及びＣＤ４＋（データに示さず）細胞のエフェクター／メモリーサブセット（ＣＤ４５ＲＡ及びＣＣＲ７）、及びフローサイトメトリーポストプレＲＥＰを介して（Ｂ）肺（ｎ＝８）の表現型で評価された。 [00206]ＴＩＬの機能的能力は、ＩＬ－２／ＩＬ－１５／ＩＬ－２１で差別的に強化された。（Ａ）黒色腫（ｎ＝４）及び（Ｂ）肺（ｎ＝５）に由来するＴＩＬを、ＣＤ４＋及びＣＤ８＋細胞における４時間のＰＭＡ刺激に応答したＣＤ１０７ａ＋発現について、フローサイトメトリーにより評価した。 [00206]ＴＩＬの機能的能力は、ＩＬ－２／ＩＬ－１５／ＩＬ－２１で差別的に強化された。（Ａ）黒色腫（ｎ＝４）及び（Ｂ）肺（ｎ＝５）に由来するＴＩＬを、ＣＤ４＋及びＣＤ８＋細胞における４時間のＰＭＡ刺激に応答したＣＤ１０７ａ＋発現について、フローサイトメトリーにより評価した。 [00206]ＴＩＬの機能的能力は、ＩＬ－２／ＩＬ－１５／ＩＬ－２１で差別的に強化された。（Ｃ）黒色腫及び肺に由来するプレＲＥＰ ＴＩＬを可溶性抗ＣＤ３抗体で２４時間刺激し、上清をＥＬＩＳＡによりＩＦＮγについて評価した。 [00207]ＴＣＲｖβレパートリー（２４の特異性）は、フローサイトメトリー用のBeckman Coulterキットを使用して、（Ａ）黒色腫及び（Ｂ）肺腫瘍に由来するＴＩＬで評価された。 [00207]ＴＣＲｖβレパートリー（２４の特異性）は、フローサイトメトリー用のBeckman Coulterキットを使用して、（Ａ）黒色腫及び（Ｂ）肺腫瘍に由来するＴＩＬで評価された。 [00208]Ｇｅｎ２凍結保存ＬＮ－１４４製造プロセスのスキーム。 [00209]転移性黒色腫患者に投与される新規凍結保存ＴＩＬの多施設第２段階臨床試験の研究計画のスキーム。 [00210]コホート１（ＡＳＣＯ２０１７）とコホート２の患者特性の比較を示す表。 [00211]処置の緊急有害事象を示す表（≧３０％）。 [00212]注入製品及びＴＩＬ療法の有効性。 [00213]ＳＤ又はより良い応答を示す評価可能な患者の応答の臨床状態。 [00214]直径の合計の変化率。 [00215]ＨＭＧＢ１レベルの増加が、ＴＩＬ処置時に観察された。 [00216]バイオマーカーＩＬ－１０の増加がＬＮ－１４４注入後に観察された。 [00217]２番目のデータカットからの転移性黒色腫の第２段階臨床試験のコホート２の更新された患者特性（Ｎ＝１７患者）。 [00218]２番目のデータカットからのコホート２（≧３０％）の処置上の有害事象（Ｎ＝１７患者）。 [00219]２番目のデータカットからのコホート２の評価可能な患者（病状が安定しているか又はそれより良好）の応答時間（Ｎ＝１７患者）。有効性セットの１０人の患者のうち、１人の患者（患者１０）は、図に示さない最初の腫瘍評価の前に黒色腫関連で死亡したため評価できなかった。 [00220]２番目のデータカットからのコホート２の更新された有効性データ（Ｎ＝１７患者）。注入されるＴＩＬの平均数は３４×１０９である。前回の治療の中央値は４．５であった。ＢＲＡＦ変異がある患者は、野生型ＢＲＡＦを有する患者と同様に応答した（＊はＢＲＡＦ変異を有する患者を指す）。１人の患者（患者１０）は、最初の腫瘍評価の前に黒色腫関連で死亡したために評価されなかったが、有効性セットではなおも考慮されていた。略称；ＰＲ、部分応答；ＳＤ、病状が安定している疾患；ＰＤ、進行性疾患。 [00221]２番目のデータカットからのコホート２からの評価可能な患者の更新された有効性データ（Ｎ＝１７患者）。＊は、最初の評価に到達しなかった評価不可能な患者を示す。全ての有効性評価可能な患者は、以前に抗ＰＤ－１及び抗ＣＴＬＡ－４チェックポイント阻害薬治療を受けていた。 [00222]コホート２からのＰＲを持つ患者（００３－０１５）の代表的なコンピュータ断層撮影、２番目のデータカット。 [00223]注入前のＴＩＬ産物によるＩＦＮ－γ誘導と、ＴＩＬ注入後４２日目の腫瘍サイズの臨床的縮小との相関関係。 [00224]Ｇｅｎ２ ＴＩＬ産物の実施形態の注入前後のＩＰ－１０（ＣＸＣＬ１０）レベル（ｐｇ／ｍＬ、ｌｏｇ１０）。ＩＰ－１０は、細胞接着及びホーミングのマーカーである。 [00225]Ｇｅｎ１ ＴＩＬ産物の実施形態の注入前後のＩＰ－１０（ＣＸＣＬ１０）レベル（ｐｇ／ｍＬ、ｌｏｇ１０）。 [00226]Ｇｅｎ２ ＴＩＬ産物の実施形態の注入前後のＭＣＰ－１レベル（ｐｇ／ｍＬ、ｌｏｇ１０）。ＭＣＰ－１は、細胞接着及びホーミングのマーカーである。 [00227]Ｇｅｎ１ ＴＩＬ産物の実施形態の注入前後のＭＣＰ－１レベル（ｐｇ／ｍＬ、ｌｏｇ１０）。 [00228]子宮頸癌及び頭頸部扁平上皮癌（ＨＮＳＣＣ）の第２段階試験のデータ。ＳＤ＝病状が安定した疾患。ＰＲ＝進行性疾患。ＰＲ＝部分応答。
配列表の簡単な説明
[00229] 配列番号１は、ムロモナブの重鎖のアミノ酸配列である。
[00230] 配列番号２は、ムロモナブの軽鎖のアミノ酸配列である。
[00231] 配列番号３は、組換えヒトＩＬ－２タンパク質のアミノ酸配列である。
[00232] 配列番号４は、アルデスロイキンのアミノ酸配列である。
[00233] 配列番号５は、組換えヒトＩＬ－４タンパク質のアミノ酸配列である。
[00234] 配列番号６は、組換えヒトＩＬ－７タンパク質のアミノ酸配列である。
[00235] 配列番号７は、組換えヒトＩＬ－１５タンパク質のアミノ酸配列である。
[00236] 配列番号８は、組換えヒトＩＬ－２１タンパク質のアミノ酸配列である。
発明の詳細な説明
Ｉ．序論
[00237] 迅速拡大培養プロトコル（ＲＥＰ：Rapid Expansion Protocol）によってエ
キソビボで培養したＴＩＬを利用する養子細胞療法は、黒色腫患者において宿主免疫抑制後に養子細胞療法の成功を生み出している。現行の注入適合パラメータは、ＴＩＬの組成（例えば、ＣＤ２８、ＣＤ８、又はＣＤ４陽性）の読み取り並びにＲＥＰ産物の拡大倍数及び生存率の数値に頼っている。
[00238] 現行のＲＥＰプロトコルは、患者に注入されることになるＴＩＬの健康に関
しては見識をほとんど与えない。Ｔ細胞は、ナイーブＴ細胞からエフェクターＴ細胞へのその成熟の過程で顕著な代謝シフトを起こす（Chang, et al., Nat. Immunol. 2016, 17,
364（本明細書によって全体として明示的に援用される）、及び特に嫌気的及び好気的代謝の考察及びマーカーについて参照のこと）。例えば、ナイーブＴ細胞はＡＴＰの産生をミトコンドリア呼吸に頼る一方、ＴＩＬなどの成熟した健康なエフェクターＴ細胞は高度
に解糖性であり、それが増殖、遊走、活性化、及び抗腫瘍有効性に必要とするバイオエナジェティクス基質の供給を好気的解糖に頼る。
[00239] 先行論文の報告によれば、重度に解糖に頼る細胞は養子移入時に栄養枯渇を
被り、その結果、移入細胞の大部分が死滅することになるため、移入前にＴＩＬの解糖を制限し、ミトコンドリア代謝を促進することが望ましい。従って、当該技術分野では、ミトコンドリア代謝を促進すればインビボ寿命が促進される可能性があると教示され、実際、免疫応答の誘導前に解糖の阻害薬を使用することが提案されている。Chang et al.（Chang, et al., Nat. Immunol. 2016, 17(364)）を参照のこと。
[00240] 本発明は更に、一部の実施形態において、この代謝的健康の増加を判定及び
定量化する方法に関する。従って、本発明は、限定はされないが、解糖の速度及び量、酸化的リン酸化、予備呼吸容量（ＳＲＣ）及び解糖予備能を含めた１つ以上の一般的な代謝判定を用いてＴＩＬ集団の相対的健康をアッセイする方法を提供する。
[00241] その上、本発明は更に、一部の実施形態において、この代謝的健康の増加を
判定及び定量化する方法に関する。従って、本発明は、限定はされないが、解糖の速度及び量、酸化的リン酸化、予備呼吸容量（ＳＲＣ）、及び解糖予備能を含めた１つ以上の一般的な代謝判定を用いてＴＩＬ集団の相対的健康をアッセイする方法を提供する。
[00242] 加えて、任意選択の追加の判定としては、限定はされないが、ＡＴＰ産生、
ミトコンドリア質量及びグルコース取込みが挙げられる。
ＩＩ．定義
[00243] 他に定義されない限り、本明細書中で使用される全ての技術的及び科学的用
語は、本発明が属する当該技術分野の当業者によって一般的に理解されるのと同じ意味を有する。本明細書で言及された全ての特許及び刊行物は、全体として参照により本明細書において援用される。
[00244] 用語「インビボ」は、対象の体内で起こる事象を指す。
[00245] 用語「インビトロ」は、対象の体外で起こる事象を指す。インビトロアッセ
イは、生細胞又は死細胞を利用した細胞ベースのアッセイを包含し、また、インタクトな細胞を利用しない無細胞アッセイも包含し得る。
[00246] 用語「エキソビボ」は、対象の体から摘出された細胞、組織及び／又は臓器
の処置又は処置の実施を含む事象を指す。適切には、細胞、組織、及び／又は臓器は、手術又は処置の方法で対象の体に戻される。
[00247] 用語「迅速拡大培養」は、１週間の期間で少なくとも約３倍（又は４倍、５
倍、６倍、７倍、８倍、又は９倍）、より好ましくは１週間の期間で少なくとも約１０倍（又は２０倍、３０倍、４０倍、５０倍、６０倍、７０倍、８０倍、又は９０倍）、又は最も好ましくは１週間の期間で少なくとも約１００倍の抗原特異的ＴＩＬ数の増加を意味する。複数の迅速拡大培養プロトコルが以下に記載される。
[00248] 本明細書において「腫瘍浸潤リンパ球」又は「ＴＩＬ」とは、対象の血流を
離れて腫瘍中に遊走した、当初白血球細胞として得られた細胞の集団を意味する。ＴＩＬとしては、限定はされないが、ＣＤ８＋細胞傷害性Ｔ細胞（リンパ球）、Ｔｈ１及びＴｈ１７ ＣＤ４＋Ｔ細胞、ナチュラルキラー細胞、樹状細胞及びＭ１マクロファージが挙げられる。ＴＩＬには、初代ＴＩＬ及び二次ＴＩＬの両方が含まれる。「初代ＴＩＬ」は、
本明細書に概説されるとおり患者組織試料から得られるものであり（「新鮮に採取した」と称されることもある）、及び「二次ＴＩＬ」は、限定はされないが、バルクＴＩＬ、拡大培養ＴＩＬ（「ＲＥＰ ＴＩＬ」又は「ポストＲＥＰ ＴＩＬ」）を含め、本明細書で考察するとおり拡大培養された又は増殖した任意のＴＩＬ細胞集団である。ＴＩＬ細胞集団は、遺伝子修飾ＴＩＬを含み得る。
[00249] 本明細書において「細胞集団」（ＴＩＬを含む）は、共通の形質を共有する
多数の細胞を意味する。一般に、集団は、概して数が１×１０６～１×１０１０個の範囲であり、異なるＴＩＬ集団は異なる数を含む。例えば、ＩＬ－２の存在下での初代ＴＩＬの初期成長は、およそ１×１０８個の細胞のバルクＴＩＬ集団をもたらす。ＲＥＰ拡大培養は、概して１．５×１０９～１．５×１０１０個の注入用の細胞集団が提供されるように行われる。
[00250] 本明細書において「凍結保存ＴＩＬ」とは、初代、バルク、又は拡大培養（
ＲＥＰ ＴＩＬ）のいずれかのＴＩＬが約－１５０℃～－６０℃の範囲で処理及び保存されることを意味する。一般的な凍結保存方法はまた、実施例を含め、本明細書の他の部分にも記載される。明確にするために言えば、「凍結保存ＴＩＬ」は、初代ＴＩＬの供給源として用いられ得る凍結組織試料と区別可能なものである。
[00251] 本明細書において「解凍した凍結保存ＴＩＬ」とは、かつて凍結保存されて
いたが、次に処理により、限定はされないが細胞培養温度又はＴＩＬを患者に投与し得る温度を含め、室温以上に戻されたＴＩＬ集団を意味する。
[00252] ＴＩＬは、概して、細胞表面マーカーを使用して生化学的に定義することも
、又は腫瘍に浸潤して処置を達成するその能力によって機能的に定義することもできる。ＴＩＬは、一般に、以下のバイオマーカーのうちの１つ以上を発現することによって分類することができる：ＣＤ４、ＣＤ８、ＴＣＲαβ、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ５６、ＣＣＲ７、ＣＤ４５Ｒａ、ＣＤ９５、ＰＤ－１、及びＣＤ２５。加えて、及び或いは、ＴＩＬは、患者への再導入時に固形腫瘍に浸潤するその能力によって機能的に定義することができる。
[00253] 用語「凍結保存培地（cryopreservation media）」又は「凍結保存培地（cryopreservation medium）」は、細胞の凍結保存に使用できる任意の培地を指す。かかる培地には、７％～１０％のＤＭＳＯを含む培地が含まれ得る。例示的媒体には、CryoStor CS10、Hyperthermasol、及びそれらの組み合わせが含まれる。用語「CS10」は、Stemcell Technologies又はBiolife Solutionsから入手した凍結保存培地を指す。CS10倍地は、商
品名「CryoStor（登録商標）CS10」と称される場合がある。CS10培地は、ＤＭＳＯを含む無血清、無動物成分培地である。
[00254] 用語「セントラルメモリーＴ細胞」は、ヒトではＣＤ４５Ｒ０＋であり、且
つＣＣＲ７（ＣＣＲ７ｈｉ）及びＣＤ６２Ｌ（ＣＤ６２ｈｉ）を構成的に発現するＴ細胞のサブセットを指す。セントラルメモリーＴ細胞の表面表現型にはまた、ＴＣＲ、ＣＤ３、ＣＤ１２７（ＩＬ－７Ｒ）、及びＩＬ－１５Ｒも含まれる。セントラルメモリーＴ細胞の転写因子には、ＢＣＬ－６、ＢＣＬ－６Ｂ、ＭＢＤ２、及びＢＭＩ１が含まれる。セントラルメモリーＴ細胞はＴＣＲ惹起後にエフェクター分子としてＩＬ－２及びＣＤ４０Ｌを主に分泌する。セントラルメモリーＴ細胞は血中のＣＤ４コンパートメントにおいて優勢であり、ヒトではリンパ節及び扁桃腺に比例的に高濃度化する。
[00255] 用語「エフェクターメモリーＴ細胞」は、セントラルメモリーＴ細胞と同様
にＣＤ４５Ｒ０＋であるが、ＣＣＲ７の構成的発現が欠損しており（ＣＣＲ７ｌｏ）、且
つＣＤ６２Ｌ発現が不均一であるか又は低い（ＣＤ６２Ｌｌｏ）、ヒト又は哺乳類Ｔ細胞のサブセットを指す。セントラルメモリーＴ細胞の表面表現型にはまた、ＴＣＲ、ＣＤ３、ＣＤ１２７（ＩＬ－７Ｒ）、及びＩＬ－１５Ｒも含まれる。セントラルメモリーＴ細胞の転写因子には、ＢＬＩＭＰ１が含まれる。エフェクターメモリーＴ細胞は抗原刺激後に、インターフェロン－γ、ＩＬ－４、及びＩＬ－５を含め、高レベルの炎症性サイトカインを急速に分泌する。エフェクターメモリーＴ細胞は血中のＣＤ８コンパートメントにおいて優勢であり、ヒトでは肺、肝臓、及び腸に比例的に高濃度化する。ＣＤ８＋ エフェクターメモリーＴ細胞は多量のパーフォリンを有する。
[00256] 用語「閉鎖系」は、外部環境に対して閉鎖されている系を指す。本発明の方
法では、細胞培養方法に適切な任意の閉鎖系を用いることができる。閉鎖系としては、例えば、限定はされないが、閉鎖型Ｇコンテナが挙げられる。閉鎖系に腫瘍セグメントが加えられた後は、ＴＩＬの患者への投与直前までこの系は外部環境に対して開放されない。
[00257] 用語「断片化する」、「断片」、及び「断片化された」は、腫瘍の破壊プロ
セスを記載するために本明細書で使用されるとき、腫瘍組織を押しつぶす、スライスする、分割する、及び細切するなど、機械的断片化方法、並びに腫瘍組織の物理的構造を破壊する任意の他の方法を含む。
[00258] 用語「末梢血単核球」及び「ＰＢＭＣ」は、リンパ球（Ｔ細胞、Ｂ細胞、Ｎ
Ｋ細胞）及び単球を含めた、円形の核を有する末梢血細胞を指す。好ましくは、末梢血単核球は、放射線照射された同種異系末梢血単核球である。ＰＢＭＣは抗原提示細胞の一種である。
[00259] 用語「抗ＣＤ３抗体」は、抗体又はその変異体、例えばモノクローナル抗体
であって、成熟Ｔ細胞のＴ細胞抗原受容体におけるＣＤ３受容体に対するヒト、ヒト化、キメラ又はマウス抗体を含むものを指す。抗ＣＤ３抗体には、ムロモナブとしても知られるＯＫＴ－３が含まれる。抗ＣＤ３抗体には、Ｔ３及びＣＤ３εとしても知られるＵＨＣＴ１クローンも含まれる。他の抗ＣＤ３抗体には、例えば、オテリキシズマブ、テプリズマブ、及びビジリズマブが含まれる。
[00260] 用語「ＯＫＴ－３」（本明細書では「ＯＫＴ３」とも称される）は、成熟Ｔ
細胞のＴ細胞抗原受容体におけるＣＤ３受容体に対する、ヒト、ヒト化、キメラ、若しくはマウス抗体を含めたモノクローナル抗体又はそのバイオシミラー若しくは変異体を指し、ＯＫＴ－３（３０ｎｇ／ｍＬ、MACS GMP CD3 pure、Miltenyi Biotech,Inc.、San Diego, CA, USA）及びムロモナブ又はその変異体、保存的アミノ酸置換、グリコフォーム、若しくはバイオシミラーなど、市販されている形態を含む。ムロモナブの重鎖及び軽鎖のアミノ酸配列を表１に提供する（配列番号１及び配列番号２）。ＯＫＴ－３の産生能を有するハイブリドーマが米国培養細胞系統保存機関（American Type Culture Collection）に寄託されており、ＡＴＣＣ受託番号ＣＲＬ ８００１が付与されている。ＯＫＴ－３の産生能を有するハイブリドーマはまた、欧州認証細胞培養株保存機関（ＥＣＡＣＣ：European Collection of Authenticated Cell Cultures）にも寄託されており、カタログ番号８６０２２７０６が付与されている。
[00261] 用語「ＩＬ－２」（本明細書では「ＩＬ２」とも称される）は、インターロ
イキン－２として知られるＴ細胞成長因子を指し、そのヒト及び哺乳類形態、保存的アミノ酸置換、グリコフォーム、バイオシミラー、及び変異体を含め、あらゆる形態のＩＬ－２が含まれる。ＩＬ－２については、例えば、Nelson, J. Immunol. 2004, 172, 3983-88及びMalek, Annu. Rev. Immunol. 2008, 26, 453-79（これらの開示は参照により本明細
書に援用される）に記載される。本発明での使用に好適な組換えヒトＩＬ－２のアミノ酸配列を表２に提供する（配列番号３）。例えば、用語ＩＬ－２には、ヒトの組換え形態のＩＬ－２、例えばアルデスロイキン（PROLEUKIN、使い捨てバイアル当たり２２００万Ｉ
Ｕで複数の供給業者から市販されている）、並びにCellGenix, Inc.、Portsmouth, NH, USA（CELLGRO GMP）又はProSpec-Tany TechnoGene Ltd.、East Brunswick, NJ, USA（カタログ番号CYT-209-b）によって商業的に供給されている組換えＩＬ－２の形態及び他の販
売業者からの他の市販の均等物が包含される。アルデスロイキン（ｄｅｓ－アラニル－１，セリン－１２５ヒトＩＬ－２）は、分子量が約１５ｋＤａの非グリコシル化ヒト組換え形態のＩＬ－２である。本発明での使用に好適なアルデスロイキンのアミノ酸配列を表２に提供する（配列番号４）。用語ＩＬ－２にはまた、Nektar Therapeutics、South San Francisco, CA, USAから入手可能なペグ化ＩＬ２プロドラッグNKTR-214を含め、本明細書
に記載されるとおりの、ペグ化形態のＩＬ－２も包含される。本発明での使用に好適なNKTR-214及びペグ化ＩＬ－２が米国特許出願公開第２０１４／０３２８７９１ Ａ１号及び国際公開第２０１２／０６５０８６ Ａ１号（これらの開示は参照により本明細書に援用される）に記載されている。本発明での使用に好適な別の形態のコンジュゲート型ＩＬ－２が、米国特許第４，７６６，１０６号、同第５，２０６，３４４号、同第５，０８９，２６１号及び同第４９０２，５０２号（これらの開示は参照により本明細書に援用される）に記載されている。本発明での使用に好適なＩＬ－２の製剤が米国特許第６，７０６，２８９号（この開示は参照により本明細書に援用される）に記載されている。
[00262] 用語「ＩＬ－４」（本明細書では「ＩＬ４」とも称される）は、インターロ
イキン４として知られるサイトカインを指し、これはＴｈ２ Ｔ細胞によって産生され、並びに好酸球、好塩基球、及びマスト細胞によって産生される。ＩＬ－４は、ナイーブヘルパーＴ細胞（Ｔｈ０細胞）のＴｈ２ Ｔ細胞への分化を調節する。Steinke and Borish, Respir. Res. 2001, 2, 66-70。ＩＬ－４によって活性化されると、続いてＴｈ２ Ｔ
細胞はポジティブフィードバックループで更なるＩＬ－４を産生する。ＩＬ－４はまた、Ｂ細胞増殖及びクラスＩＩ ＭＨＣ発現も刺激し、Ｂ細胞からのＩｇＥ及びＩｇＧ１発現へのクラススイッチも誘導する。本発明での使用に好適な組換えヒトＩＬ－４は、ProSpec-Tany TechnoGene Ltd.、East Brunswick, NJ, USA（カタログ番号CYT-211）及びThermoFisher Scientific, Inc.、Waltham, MA, USA（ヒトＩＬ－１５組換えタンパク質、カタ
ログ番号Gibco CTP0043）を含め、複数の供給業者から市販されている。本発明での使用
に好適な組換えヒトＩＬ－４のアミノ酸配列を表２に提供する（配列番号５）。
[00263] 用語「ＩＬ－７」（本明細書では「ＩＬ７」とも称される）は、インターロ
イキン７として知られるグリコシル化組織由来サイトカインを指し、これは間質及び上皮細胞、並びに樹状細胞から入手し得る。Fry and Mackall, Blood 2002, 99, 3892-904。
ＩＬ－７はＴ細胞の発達を刺激することができる。ＩＬ－７は、ＩＬ－７受容体αと共通γ鎖受容体とからなるヘテロ二量体のＩＬ－７受容体に結合し、それが胸腺内でのＴ細胞発達及び末梢内での生存にとって重要な一連のシグナルとなる。本発明での使用に好適な組換えヒトＩＬ－７は、ProSpec-Tany TechnoGene Ltd.、East Brunswick, NJ, USA（カ
タログ番号CYT-254）及びThermoFisher Scientific, Inc.、Waltham, MA, USA（ヒトＩＬ－１５組換えタンパク質、カタログ番号Gibco PHC0071）を含め、複数の供給業者から市
販されている。本発明での使用に好適な組換えヒトＩＬ－７のアミノ酸配列を表２に提供する（配列番号６）。
[00264] 用語「ＩＬ－１５」（本明細書では「ＩＬ１５」とも称される）は、インタ
ーロイキン－１５として知られるＴ細胞成長因子を指し、そのヒト及び哺乳類形態、保存的アミノ酸置換、グリコフォーム、バイオシミラー、及び変異体を含め、あらゆる形態のＩＬ－２が含まれる。ＩＬ－１５については、例えば、Fehniger and Caligiuri, Blood
2001, 97, 14-32（この開示は参照により本明細書に援用される）に記載されている。Ｉ
Ｌ－１５はβ及びγシグナル伝達受容体サブユニットをＩＬ－２と共有している。組換えヒトＩＬ－１５は、分子質量が１２．８ｋＤａの、１１４アミノ酸（及びＮ末端メチオニン）を含む単一の非グリコシル化ポリペプチド鎖である。組換えヒトＩＬ－１５は、ProSpec-Tany TechnoGene Ltd.、East Brunswick, NJ, USA（カタログ番号CYT-230-b）及びThermoFisherScientific, Inc.、Waltham, MA, USA（ヒトＩＬ－１５組換えタンパク質、カタログ番号34-8159-82）を含め、複数の供給業者から市販されている。本発明での使用に好適な組換えヒトＩＬ－１５のアミノ酸配列を表２に提供する（配列番号７）。
[00265] 用語「ＩＬ－２１」（本明細書では「ＩＬ２１」とも称される）は、インタ
ーロイキン－２１として知られるプレイオトロピックサイトカインタンパク質を指し、そのヒト及び哺乳類形態、保存的アミノ酸置換、グリコフォーム、バイオシミラー、及び変異体を含め、あらゆる形態のＩＬ－２１が含まれる。ＩＬ－２１については、例えば、Spolski and Leonard, Nat. Rev. Drug. Disc. 2014, 13, 379-95（この開示は参照により
本明細書に援用される）に記載されている。ＩＬ－２１は、主としてナチュラルキラーＴ細胞及び活性化ヒトＣＤ４＋ Ｔ細胞によって産生される。組換えヒトＩＬ－２１は、分子質量が１５．４ｋＤａの、１３２アミノ酸を含む単一の非グリコシル化ポリペプチド鎖である。組換えヒトＩＬ－２１は、ProSpec-Tany TechnoGene Ltd.、East Brunswick, NJ, USA（カタログ番号CYT-408-b）及びThermoFisherScientific, Inc.、Waltham, MA, USA（ヒトＩＬ－２１組換えタンパク質、カタログ番号14-8219-80）を含め、複数の供給業者から市販されている。本発明での使用に好適な組換えヒトＩＬ－２１のアミノ酸配列を表２に提供する（配列番号８）。
[00266] 「抗腫瘍有効量」、「腫瘍阻害有効量」、又は「治療量」が指示されるとき
、本発明の組成物の正確な投与量は、医師が、年齢、体重、腫瘍サイズ、感染又は転移の程度、及び患者（対象）の状態の個体差を考慮して決定することができる。概して、本明細書に記載される腫瘍浸潤リンパ球（例えば、二次ＴＩＬ又は遺伝子修飾された細胞傷害性リンパ球）を含む医薬組成物は１０４～１０１１細胞／ｋｇ体重（例えば、１０５～１０６、１０５～１０１０、１０５～１０１１、１０６～１０１０、１０６～１０１１、１０７～１０１１、１０７～１０１０、１０８～１０１１、１０８～１０１０、１０９～１０１１、又は１０９～１０１０細胞／ｋｇ体重）（これらの範囲内にある全ての整数値を含む）の投薬量で投与されてもよいと言うことができる。腫瘍浸潤リンパ球（場合によっては遺伝子修飾された細胞傷害性リンパ球を含む）組成物はまた、これらの投薬量で複数回投与されてもよい。腫瘍浸潤リンパ球（ある場合には、遺伝子的なものを含む）は、免疫療法で一般に公知の注入技法を用いることにより投与し得る（例えば、Rosenberg et al., New Eng. J. of Med. 319: 1676, 1988を参照のこと）。特定の患者に最適な投薬量
及び処置レジームは、医学分野の当業者が疾患の徴候に関して患者をモニタし及びそれに応じて処置を調整することにより、容易に決定することができる。
[00267] 用語「血液学的悪性腫瘍」は、限定はされないが、血液、骨髄、リンパ節、
及びリンパ系の組織を含め、哺乳類における造血及びリンパ系組織の癌及び腫瘍を指す。血液学的悪性腫瘍は「液性腫瘍」とも称される。血液学的悪性腫瘍としては、限定はされないが、急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）、慢性リンパ球性リンパ腫（ＣＬＬ）、小リンパ球性リンパ腫（ＳＬＬ）、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、慢性骨髄球性白血病（ＣＭＬ）、急性単球性白血病（ＡＭｏＬ）、ホジキンリンパ腫、及び非ホジキンリンパ腫が挙げられる。用語「Ｂ細胞血液学的悪性腫瘍」は、Ｂ細胞を冒す血液学的悪性腫瘍を指す。
[00268] 用語「固形腫瘍」は、通常嚢胞又は液体範囲を含まない異常な組織塊を指す
。固形腫瘍は良性又は悪性であり得る。用語「固形腫瘍癌」は、悪性、新生物性、又は癌性の固形腫瘍を指す。固形腫瘍癌としては、限定はされないが、肺癌、乳癌、前立腺癌、
結腸癌、直腸癌、及び膀胱癌など、肉腫、癌腫、及びリンパ腫が挙げられる。固形腫瘍の組織構造は、実質（癌細胞）と、癌細胞が分散するところであって支持微小環境をもたらし得る支持間質細胞とを含む相互依存的組織コンパートメントを含む。
[00269] 用語「液性腫瘍」は、事実上流体である異常な細胞塊を指す。液性腫瘍癌と
しては、限定はされないが、白血病、骨髄腫、及びリンパ腫、並びに他の血液学的悪性腫瘍が挙げられる。液性腫瘍から入手されるＴＩＬはまた、本明細書において骨髄浸潤リンパ球（ＭＩＬ）とも称され得る。
[00270] 用語「微小環境」は、本明細書で使用されるとき、固形腫瘍又は血液学的腫
瘍の微小環境全体又は微小環境内の個々の細胞サブセットを指し得る。腫瘍微小環境は、本明細書で使用されるとき、Swartz, et al., Cancer Res., 2012, 72, 2473に記載され
るとおり、「新生物形質転換を促進し、腫瘍成長及び浸潤を支援し、腫瘍を宿主免疫から保護し、治療抵抗性を助長し、及び顕性転移が発育するためのニッチを提供する細胞、可溶性因子、シグナル伝達分子、細胞外マトリックス、及び機械的キュー」の複合混合物を指す。腫瘍は、Ｔ細胞によって認識されるはずの抗原を発現するが、微小環境による免疫抑制のため、免疫系による腫瘍クリアランスはまれである。
[00271] ある実施形態において、本発明は、ＴＩＬ集団で癌を治療する方法を含み、
ここで患者は本発明に係るＴＩＬの注入前に骨髄非破壊的化学療法で前処置される。一部の実施形態において、ＴＩＬ集団が提供されてもよく、ここで患者は、本発明に係るＴＩＬの注入前に骨髄非破壊的化学療法で前処置される。ある実施形態において、骨髄非破壊的化学療法は、２日間（ＴＩＬ注入前２７日目及び２６日目）のシクロホスファミド６０ｍｇ／ｋｇ／日及び５日間（ＴＩＬ注入前２７～２３日目）のフルダラビン２５ｍｇ／ｍ２／日である。ある実施形態において、骨髄非破壊的化学療法及び本発明に係るＴＩＬ注入（０日目）の後、患者は生理学的忍容量まで８時間毎に静脈内に７２０，０００ＩＵ／ｋｇのＩＬ－２の静脈内注入を受ける。
[00272] 実験的知見から、腫瘍特異的Ｔリンパ球の養子移入前のリンパ球枯渇が、調
節性Ｔ細胞及び免疫系の競合エレメント（「サイトカインシンク」）の除去により、治療有効性の増強において重要な役割を果たすことが指摘される。従って、本発明の一部の実施形態は、本発明のｒＴＩＬを導入する前に患者に対してリンパ球枯渇ステップ（「免疫抑制コンディショニング」とも称される）を利用する。
[00273] 用語「共投与」、「共投与する」、「～と併用して投与される」、「～と併
用して投与する」、「同時の」、及び「並行した」は、本明細書で使用されるとき、両方の医薬品有効成分及び／又はその代謝産物が対象に同じ時点で存在するような対象への２つ以上の医薬品有効成分（本発明の好ましい実施形態において、例えば、複数のＴＩＬとの併用での少なくとも１つのカリウムチャネル作動薬）の投与を包含する。共投与には、別個の組成物での同時投与、別個の組成物での異なる時点における投与、又は２つ以上の医薬品有効成分が存在する組成物での投与が含まれる。別個の組成物での同時投与及び両方の薬剤が存在する組成物での投与が好ましい。
[00274] 用語「有効量」又は「治療有効量」は、限定はされないが疾患治療を含めた
、意図した適用を達成するのに十分な本明細書に記載されるとおりの化合物又は化合物の組み合わせの量を指す。治療有効量は、意図した適用（インビトロ又はインビボ）、又は治療下の対象及び疾患病態（例えば、対象の体重、年齢及び性別）、疾患病態の重症度、又は投与方法に応じて異なり得る。この用語はまた、標的細胞において特定の応答（例えば、血小板粘着及び／又は細胞遊走の低減）を生じさせるであろう用量にも適用される。具体的な用量は、選択した詳細な化合物、従うべき投与レジメン、化合物が他の化合物と
併用して投与されるかどうか、投与タイミング、その投与先の組織、及び化合物を運ぶ物理的デリバリーシステムに応じて異なることになる。
[00275] 用語「治療」、「治療している」、「治療する」などは、所望の薬理学的及
び／又は生理学的効果を達成することを指す。効果は、疾患又はその症状を完全に又は部分的に防ぐという意味で予防的であってもよく、及び／又は疾患及び／又は疾患に起因する有害作用を部分的に又は完全に治癒するという意味で治療的であってもよい。「治療」は、本明細書で使用されるとき、哺乳類、特にヒトにおける疾患の任意の治療を包含し、（ａ）疾患の素因があり得るが、まだそれを有するとは診断されてない対象において疾患の発生を防ぐこと；（ｂ）疾患を阻害すること、即ちその発症又は進行を止めること；及び（ｃ）疾患を軽減すること、即ち疾患の退縮を生じさせること及び／又は１つ以上の疾患症状を軽減することが含まれる。「治療」はまた、疾患又は病態がない場合であっても、薬理学的効果を提供するための薬剤の送達を包含することも意図される。例えば、「治療」は、例えばワクチンの場合に、疾患状態がない中で免疫応答を誘発し又は免疫を付与することのできる組成物の送達を包含する。
[00276] 用語「異種」は、核酸又はタンパク質の一部分に関連して使用されるとき、
その核酸又はタンパク質が、自然中では互いに同じ関係で見出されない２つ以上の部分配列を含むことを示す。例えば、核酸は、典型的には組換え産生されて、新規の機能性核酸を作り出すように編成された無関係の遺伝子からの２つ以上の配列、例えば、ある供給源からのプロモーターと別の供給源からのコード領域、又は異なる供給源からのコード領域を有する。同様に、異種タンパク質とは、タンパク質が、自然中では互いに同じ関係で見出されない２つ以上の部分配列（例えば、融合タンパク質）を含むことを示す。
[00277] ２つ以上の核酸又はポリペプチドの文脈で用語「配列同一性」、「パーセン
ト同一性」、及び「配列パーセント同一性」（又はこれらの同義語、例えば「９９％同一」）は、いかなる保存的アミノ酸置換も配列同一性の一部として考慮せず、対応が最大となるように比較及びアラインメント（必要に応じてギャップを導入する）したときに同じである、又は同じであるヌクレオチド若しくはアミノ酸残基を特定の割合だけ有する２つ以上の配列又は部分配列を指す。パーセント同一性は、配列比較ソフトウェア又はアルゴリズムを用いるか、又は目視検査によって測定することができる。アミノ酸又はヌクレオチド配列のアラインメントを達成するために使用し得る様々なアルゴリズム及びソフトウェアが当該技術分野において公知である。パーセント配列同一性の決定に好適なプログラムとしては、例えば、米国政府の国立バイオテクノロジー情報センター（National Center for Biotechnology Information）BLASTウェブサイトから利用可能なBLASTプログラム
スイートが挙げられる。２つの配列間の比較は、BLASTN又はBLASTPのいずれかのアルゴリズムを使用して行うことができる。BLASTNは核酸配列の比較に使用され、一方、BLASTPはアミノ酸配列の比較に使用される。ALIGN、ALIGN-2（Genentech、South San Francisco, California）又はDNASTARから利用可能なMegAlignが、配列のアラインメントに使用し得
る更なる公的に利用可能なソフトウェアプログラムである。当業者は、特定のアラインメントソフトウェアによるアラインメントを最大化するための適切なパラメータを決定することができる。特定の実施形態では、アラインメントソフトウェアのデフォルトパラメータが使用される。
[00278] 本明細書で使用されるとき、用語「変異体」は、限定はされないが、参照抗
体のアミノ酸配列の範囲内の又はそれに隣接する特定の位置における１つ以上の置換、欠失及び／又は付加の点で参照抗体のアミノ酸配列と異なるアミノ酸配列を含む抗体又は融合タンパク質を包含する。変異体は、参照抗体のアミノ酸配列と比較して、そのアミノ酸配列に１つ以上の保存的置換を含み得る。保存的置換は、例えば、同様の荷電又は非荷電アミノ酸の置換を含み得る。変異体は、参照抗体の抗原に特異的に結合する能力を保持し
ている。変異体という用語はまた、ペグ化抗体又はタンパク質も含む。
[00279] 本明細書において「腫瘍浸潤リンパ球」又は「ＴＩＬ」とは、対象の血流を
離れて腫瘍中に遊走した、当初白血球細胞として得られた細胞の集団を意味する。ＴＩＬとしては、限定はされないが、ＣＤ８＋細胞傷害性Ｔ細胞（リンパ球）、Ｔｈ１及びＴｈ１７ ＣＤ４＋Ｔ細胞、ナチュラルキラー細胞、樹状細胞及びＭ１マクロファージが挙げられる。ＴＩＬには、初代ＴＩＬ及び二次ＴＩＬの両方が含まれる。「初代ＴＩＬ」は、本明細書に概説されるとおり患者組織試料から得られるものであり（「新鮮に採取した」と称されることもある）、及び「二次ＴＩＬ」は、限定はされないが、バルクＴＩＬ、拡大培養ＴＩＬ（「ＲＥＰ ＴＩＬ」）並びに本明細書で考察するとおりの「ｒｅＲＥＰ ＴＩＬ」を含め、本明細書で考察するとおり拡大培養された又は成長した任意のＴＩＬ細胞集団である。ｒｅＲＥＰ ＴＩＬは、例えば、第２の拡大培養ＴＩＬ又は第２追加拡大培養ＴＩＬ（例えば、ｒｅＲＥＰ ＴＩＬと称されるＴＩＬを含む、図２７のステップＤに記載されたものなど）を含み得る。
[00280] ＴＩＬは、概して、細胞表面マーカーを使用して生化学的に定義することも
、又は腫瘍に浸潤して処置を達成するその能力によって機能的に定義することもできる。ＴＩＬは、一般に、以下のバイオマーカーのうちの１つ以上を発現することによって分類することができる：ＣＤ４、ＣＤ８、ＴＣＲαβ、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ５６、ＣＣＲ７、ＣＤ４５Ｒａ、ＣＤ９５、ＰＤ－１、及びＣＤ２５。加えて、及び或いは、ＴＩＬは、患者への再導入時に固形腫瘍に浸潤するその能力によって機能的に定義することができる。ＴＩＬは、更に効力によって特徴付けられてもよく－例えば、ＴＩＬは、例えばインターフェロン（ＩＦＮ）遊離が約５０ｐｇ／ｍＬより高い、約１００ｐｇ／ｍＬより高い、約１５０ｐｇ／ｍＬより高い、又は約２００ｐｇ／ｍＬより高い場合に効力があると見なすことができる。
[00281] 用語「薬学的に許容される担体」又は「薬学的に許容される賦形剤」は、あ
りとあらゆる溶媒、分散剤、コーティング、抗菌剤及び抗真菌剤、等張剤及び吸収遅延剤、並びに不活性成分を含むものとする。活性医薬成分のためのかかる薬学的に許容される担体又は薬学的に許容される賦形剤の使用は当該技術分野において周知である。任意の従来の薬学的に許容される担体又は薬学的に許容される賦形剤が活性医薬成分と適合しない場合を除き、本発明の治療用組成物におけるその使用が企図される。他の薬物などの追加の活性医薬成分もまた、記載の組成物及び方法に援用され得る。
[00282] 用語「約」及び「およそ」は、統計的に意味のある値の範囲内を指す。かか
る範囲は、所定の値又は範囲の一桁以内、好ましくは５０％以内、より好ましくは２０％以内、更により好ましくは１０％以内、更により好ましくは５％以内であり得る。用語「約」又は「およそ」に含まれる許容変動は、研究中の特定の系に依存し、当業者には容易に理解できる。更に、本明細書で使用される場合、用語「約」及び「およそ」は、寸法、サイズ、配合、パラメータ、形状、及びその他の量及び特性が正確ではないことを意味するが、近似及び／又はより大きい又はより小さい場合があり、必要に応じて、公差、変換係数、四捨五入、測定誤差など、及び当業者に公知の他の因子を反映する。一般に、寸法、サイズ、配合、パラメータ、形状、又は他の量若しくは特性は、明示的にそうであると明記されているか否かにかかわらず、「約」又は「およそ」である。大きく異なるサイズ、形状及び寸法の実施形態が、記載された用語を採用する場合があることに留意されたい。
[00283] 添付の特許請求の範囲で使用される場合、「を含む」、「から本質的になる
」、及び「からなる」という移行用語は、記載されていない追加の請求要素又はステップがある場合、それらが特許請求の範囲から除外されることに関して、元の形式及び修正さ
れた形式で、特許請求の範囲を定義する。用語「を含む」は、包括的又は無制限であることを意図しており、追加の、引用されていない要素、方法、ステップ、又は材料を除外するものではない。用語「からなる」は、特許請求の範囲で指定されたもの以外の要素、ステップ、又は材料を除外し、後者の場合、指定された材料に関連する通常の不純物を除外する。用語「から本質的になる」は、特許請求の範囲を特定の要素、ステップ又は材料、及び請求された発明の基本的及び新規の特性に実質的に影響しないものに限定する。本発明を具体化する本明細書に記載の全ての組成物、方法及びキットは、代替実施形態において、「を含む」、「から本質的になる」、及び「からなる」という移行用語のいずれかによってより具体的に定義され得る。
ＩＩＩ．ＴＩＬの製造方法
[00284] これらの特徴のいくつかを含むプロセス２Ａとして知られるＴＩＬプロセス
の例を図１に示し、プロセス１Ｃに対する本発明の本実施形態の利点のいくつかを、図８４と同様に図２に示す。プロセス１Ｃを、図３に比較のために示す。プロセス２Ａに基づくＴＩＬ治療の２つの代替タイムラインを図４（細胞数が多い）と図５（細胞数が少ない）に示す。プロセス２Ａの実施形態を図６並びに図２７に示す。図８３及び図８４は、例示的な１Ｃプロセスと比較した例示的な２Ａプロセスを更に提供する。
[00285] 本明細書において考察されるとおり、本発明は、患者への移植前に凍結保存
ＴＩＬを再刺激することによりその代謝活性、ひいては相対的健康を増加させることに関するステップ、及び前記代謝的健康の試験方法を含み得る。概して本明細書に概説されるとおり、ＴＩＬは概して患者試料から採取し、操作することにより、患者への移植前にその数が拡大される。一部の実施形態において、ＴＩＬは任意選択で以下に考察するとおり遺伝的に操作されてもよい。
[00286] 一部の実施形態において、ＴＩＬは凍結保存され得る。解凍後、ＴＩＬは、
患者への注入前に、その代謝を高めるために再刺激されてもよい。
[00287] 一部の実施形態において、以下並びに実施例及び図で詳細に考察するとおり
、第１の拡大培養（プレＲＥＰと称されるプロセス及び図２７にステップＡとして示されるプロセスを含む）は、３～１４日間に短縮され、第２の拡大培養（ＲＥＰと称されるプロセス及び図２７にステップＢとして示されるプロセスを含む）は、７～１４日間に短縮される。一部の実施形態において、実施例で考察され、図４、５及び２７に示すとおり、第１の拡大培養（例えば、図２７のステップＢとして記載される拡大培養）は１１日間に短縮され、第２の拡大培養（例えば、図２７のステップＤに記載される拡大培養）は１１日間に短縮される。一部の実施形態において、以下並びに実施例及び図で詳細に考察するように、第１の拡大培養及び第２の拡大培養（例えば、図２７のステップＢ及びステップＤとして記載される拡大培養）の組み合わせは２２日間に短縮される。
[00288] 以下の「ステップ」名Ａ、Ｂ、Ｃ等は、図２７を参照し、且つ本明細書に記
載の実施形態を参照する。以下及び図２７におけるステップの順序は例示であり、ステップの任意の組み合わせ又は順序、並びに追加のステップ、ステップの繰り返し、及び／又はステップの省略が、本願及び本明細書に開示される方法によって企図される。
Ａ．ステップＡ：患者腫瘍試料を入手する
[00289] 一般に、ＴＩＬは初めは患者腫瘍試料から入手され（「初代ＴＩＬ」）、次
に本明細書に記載されるとおりの更なる操作のためより大きい集団へと拡大培養され、任意選択で凍結保存され、本明細書に概説されるとおり再刺激され、及び任意選択でＴＩＬの健康の指標として表現型及び代謝パラメータが判定される。
[00290] 患者腫瘍試料は当該技術分野において公知の方法を用いて、概して、外科的
切除、針生検又はその他の、腫瘍とＴＩＬ細胞との混合物を含む試料を入手するための手段によって入手されてもよい。一般に、腫瘍試料は、原発腫瘍、浸潤性腫瘍又は転移性腫瘍を含めた任意の固形腫瘍からであってもよい。腫瘍試料はまた、血液学的悪性腫瘍から入手された腫瘍など、液性腫瘍であってもよい。固形腫瘍は、限定はされないが、乳癌、膵癌、前立腺癌、結腸直腸癌、肺癌、脳癌、腎癌、胃癌、及び皮膚癌（限定はされないが、扁平上皮癌、基底細胞癌、及び黒色腫を含む）を含めた任意の癌型のものであってもよい。一部の実施形態において、有用なＴＩＬは、特に高レベルのＴＩＬを有すると報告されていることに伴い悪性黒色腫腫瘍から入手される。
[00291] 用語「固形腫瘍」は、通常嚢胞又は液体範囲を含まない異常な組織塊を指す
。固形腫瘍は良性又は悪性であり得る。用語「固形腫瘍癌」は、悪性、新生物性、又は癌性の固形腫瘍を指す。固形腫瘍癌としては、限定はされないが、肺癌、乳癌、トリプルネガティブ乳癌、前立腺癌、結腸癌、直腸癌、及び膀胱癌など、肉腫、癌腫、及びリンパ腫が挙げられる。一部の実施形態において、癌は、子宮頸癌、頭頸部癌（頭頸部扁平上皮癌（ＨＮＳＣＣ）を含む）、膠芽腫、卵巣癌、肉腫、膵癌、膀胱癌、乳癌、トリプルネガティブ乳癌、及び非小細胞肺癌から選択される。固形腫瘍の組織構造は、実質（癌細胞）と、癌細胞が分散するところであって支持微小環境をもたらし得る支持間質細胞とを含む相互依存的組織コンパートメントを含む。
[00292] 用語「血液学的悪性腫瘍」は、限定はされないが、血液、骨髄、リンパ節、
及びリンパ系の組織を含め、哺乳類における造血及びリンパ系組織の癌及び腫瘍を指す。血液学的悪性腫瘍は「液性腫瘍」とも称される。血液学的悪性腫瘍としては、限定はされないが、急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）、慢性リンパ球性リンパ腫（ＣＬＬ）、小リンパ球性リンパ腫（ＳＬＬ）、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、慢性骨髄球性白血病（ＣＭＬ）、急性単球性白血病（ＡＭｏＬ）、ホジキンリンパ腫、及び非ホジキンリンパ腫が挙げられる。用語「Ｂ細胞血液学的悪性腫瘍」は、Ｂ細胞を冒す血液学的悪性腫瘍を指す。
[00293] 入手後、腫瘍試料は概して鋭的剥離を用いて１～約８ｍｍ３の小片に断片化
され、約２～３ｍｍ３が特に有用である。ＴＩＬは酵素的腫瘍消化物を使用してこれらの断片から培養される。かかる腫瘍消化物は、酵素培地（例えば、ロズウェルパーク記念研究所（ＲＰＭＩ：Roswell Park Memorial Institute）１６４０緩衝液、２ｍＭグルタミ
ン酸塩、１０ｍｃｇ／ｍＬゲンタマイシン、３０単位／ｍＬのＤＮアーゼ及び１．０ｍｇ／ｍＬのコラゲナーゼ）中でのインキュベーションと、それに続く機械的解離（例えば、組織解離装置を用いる）によって作製されてもよい。腫瘍消化物は、腫瘍を酵素培地中に置き、腫瘍を約１分間機械的に解離した後、続いて５％ＣＯ２下３７℃で３０分間インキュベートし、続いてごく小さい組織片しか存在しなくなるまで前述の条件下で機械的解離及びインキュベーションのサイクルを繰り返すことにより作製されてもよい。この処理の終了時、細胞懸濁液が多数の赤血球又は死細胞を含有する場合、FICOLL分枝状親水性多糖を使用した密度勾配分離を実施して、それらの細胞を除去し得る。米国特許出願公開第２０１２／０２４４１３３ Ａ１号（この開示は参照により本明細書に援用される）に記載されるものなど、当該技術分野において公知の代替的な方法を用いてもよい。前述の方法のいずれも、ＴＩＬの拡大培養方法又は癌の治療方法に関して本明細書に記載される任意の実施形態において用いることができる。
[00294] 一般に、採取された細胞懸濁液は「初代細胞集団」又は「新鮮に採取した」
細胞集団と呼ばれる。
[00295] 一部の実施形態において、断片化は、例えば剥離並びに消化を含めた物理的
断片化を含む。一部の実施形態において、断片化は物理的断片化である。一部の実施形態
において、断片化は剥離である。一部の実施形態において、断片化は消化による。一部の実施形態において、ＴＩＬは初めに、患者から入手された酵素的腫瘍消化物及び腫瘍断片から培養することができる。一実施形態において、ＴＩＬは初めに、患者から入手された酵素的腫瘍消化物及び腫瘍断片から培養することができる。
[00296] 一部の実施形態において、腫瘍が固形腫瘍である場合、例えばステップＡ（
図２７に提供される）における腫瘍試料の入手後に、腫瘍は物理的断片化を受ける。一部の実施形態において、断片化は凍結保存前に行われる。一部の実施形態において、断片化は凍結保存後に行われる。一部の実施形態において、断片化は、腫瘍の入手後に、いかなる凍結保存もなしに行われる。一部の実施形態において、腫瘍は断片化され、第１の拡大培養用の各容器に１０、２０、３０、４０個又はそれを超える数の断片又は小片が置かれる。一部の実施形態において、腫瘍は断片化され、第１の拡大培養用の各容器に３０又は４０個の断片又は小片が置かれる。一部の実施形態において、腫瘍は断片化され、第１の拡大培養用の各容器に４０個の断片又は小片が置かれる。一部の実施形態において、複数の断片は、約４～約５０個の断片を含み、各断片は約２７ｍｍ３の容積を有する。一部の実施形態において、複数の断片は、約１３００ｍｍ３～約１５００ｍｍ３の総容積を有する約３０～約６０個の断片を含む。一部の実施形態において、複数の断片は、約１３５０ｍｍ３の総容積を有する約５０個の断片を含む。一部の実施形態において、複数の断片は、約１ｇ～約１．５ｇの総質量を有する約５０個の断片を含む。一部の実施形態において、複数の断片は、約４個の断片を含む。
[00297] 一部の実施形態において、ＴＩＬは腫瘍断片から入手される。一部の実施形
態において、腫瘍断片は鋭的剥離で入手される。一部の実施形態において、腫瘍断片は約１ｍｍ３～１０ｍｍ３である。一部の実施形態において、腫瘍断片は約１ｍｍ３～８ｍｍ３である。一部の実施形態において、腫瘍断片は約１ｍｍ３である。一部の実施形態において、腫瘍断片は約２ｍｍ３である。一部の実施形態において、腫瘍断片は約３ｍｍ３である。一部の実施形態において、腫瘍断片は約４ｍｍ３である。一部の実施形態において、腫瘍断片は約５ｍｍ３である。一部の実施形態において、腫瘍断片は約６ｍｍ３である。一部の実施形態において、腫瘍断片は約７ｍｍ３である。一部の実施形態において、腫瘍断片は約８ｍｍ３である。一部の実施形態において、腫瘍断片は約９ｍｍ３である。一部の実施形態において、腫瘍断片は約１０ｍｍ３である。
[00298] 一部の実施形態において、ＴＩＬは腫瘍消化物から入手される。一部の実施
形態では、腫瘍消化物は、酵素培地中、例えば限定はされないが、ＲＰＭＩ １６４０、２ｍＭ GlutaMAX、１０ｍｇ／ｍＬゲンタマイシン、３０Ｕ／ｍＬ ＤＮアーゼ、及び１．０ｍｇ／ｍＬコラゲナーゼ中におけるインキュベーションと、それに続く機械的解離（GentleMACS、Miltenyi Biotec、Auburn, CA）によって作成した。腫瘍を酵素培地に置い
た後、腫瘍を約１分間機械的に解離し得る。次に溶液を５％ＣＯ２下３７℃で３０分間インキュベートし、次にそれを再び約１分間機械的に破壊し得る。再び５％ＣＯ２下３７℃で３０分間インキュベートした後、腫瘍を３度目に約１分間機械的に破壊し得る。一部の実施形態において、３度目の機械的破壊後に大型の組織片が存在した場合、５％ＣＯ２下３７℃での更に３０分間のインキュベーションを伴う又は伴わない１回又は２回の更なる機械的解離を試料に適用した。一部の実施形態において、最終回のインキュベーションの終了時に細胞懸濁液が多数の赤血球又は死細胞を含有した場合、Ficollを使用した密度勾配分離を実施して、そうした細胞を除去し得る。
[00299] 一部の実施形態において、第１の拡大培養ステップ前の採取された細胞懸濁
液は、「初代細胞集団」又は「新鮮に採取した」細胞集団と呼ばれる。
[00300] 一部の実施形態において、細胞は、以下に更に詳細に記載する、同様に図２
７に例示するステップＢに記載の拡大培養に進む前に、任意選択で試料採取後に凍結され、凍結貯蔵されてもよい。
Ｂ．ステップＢ：第１の拡大培養
１．幼若ＴＩＬ
[00301] 一部の実施形態において、本方法は、対象／患者への投与時に複製サイクル
を増加させることができる幼若ＴＩＬを得ることを提供し、したがって、成熟ＴＩＬ（即ち、被験者／患者への投与前に更に多くの回数の複製を受けたＴＩＬ）を超える追加の治療上の利点を提供し得る。幼若ＴＩＬの特徴が、文献に記載されている。例えば、Donia,
at al., Scandinavian Journal of Immunology, 75:157-167 (2012)、Dudley et al., Clin Cancer Res, 16:6122-6131 (2010)、Huang et al., J Immunother, 28(3):258-267 (2005)、Besser et al., Clin Cancer Res, 19(17):OF1-OF9 (2013)、Besser et al., J Immunother 32:415-423 (2009)、Robbins, et al., J Immunol 2004; 173:7125-7130、Shen et al., J Immunother, 30:123-129 (2007)、Zhou, et al., J Immunother, 28:53-62 (2005)、及びTran, et al., J Immunother, 31:742-751 (2008)であり、これらは全て、
全体として参照により本明細書に援用される。
[00302] Ｔ及びＢリンパ球の多様な抗原受容体は、限られているが多数の遺伝子セグ
メントの体細胞組換えによって産生される。これらの遺伝子セグメントＶ（可変）、Ｄ（多様性）、Ｊ（結合）、及びＣ（定数）は、免疫グロブリン及びＴ細胞受容体（ＴＣＲ）の結合特異性及び下流側での適用を決定する。本発明は、Ｔ細胞レパートリーの多様性を示し、増加させるＴＩＬを生成する方法を提供する。一部の実施形態において、本方法により得られたＴＩＬは、Ｔ細胞レパートリー多様性の増加を示す。一部の実施形態において、本方法によって得られたＴＩＬは、新鮮に採取したＴＩＬ及び／又は例えば、図２７に具体化された方法以外の方法を含む、本明細書で提供する以外の方法を使用して調製されたＴＩＬと比較して、Ｔ細胞レパートリー多様性の増加を示す。一部の実施形態において、図８３に例示されているように、本方法によって得られたＴＩＬは、新鮮に回収したＴＩＬ及び／又は、プロセス１Ｃと称される方法を使用して調製されたＴＩＬと比較して、Ｔ細胞レパートリー多様性の増加を示す。一部の実施形態において、第１の拡大培養で得られたＴＩＬは、Ｔ細胞レパートリー多様性の増加を示す。一部の実施形態において、多様性の増加は、免疫グロブリンの多様性及び／又はＴ細胞受容体の多様性の増加である。一部の実施形態において、免疫グロブリンの多様性は、免疫グロブリン重鎖にある。一部の実施形態において、免疫グロブリンの多様性は、免疫グロブリン軽鎖にある。一部の実施形態において、多様性はＴ細胞受容体にある。一部の実施形態において、多様性は、アルファ、ベータ、ガンマ、及びデルタ受容体からなる群から選択されるＴ細胞受容体の１つにある。一部の実施形態において、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）アルファ及び／又はベータの発現が増加する。一部の実施形態において、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）アルファの発現が増加する。一部の実施形態において、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）ベータの発現が増加する。一部の実施形態において、ＴＣＲａｂ（即ち、ＴＣＲα／β）の発現が増加する。
[00303] 腫瘍断片の剥離又消化後、例えば、図２７のステップＡに記載れたように、
得られた細胞は、腫瘍及び他の細胞よりもＴＩＬの成長に有利な条件下で血清含有ＩＬ－２において培養される。一部の実施形態において、腫瘍消化物は、２ｍＬウェルにおいて、不活性化ヒトＡＢ血清を６０００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２と共に含む培地中でインキュベートされる。この初代細胞集団は、数日、概して３～１４日の期間にわたって培養され、それによりバルクＴＩＬ集団、概して約１×１０８個のバルクＴＩＬ細胞が得られる。一部の実施形態において、この初代細胞集団は、７～１４日の期間にわたって培養され、それによりバルクＴＩＬ集団、概して約１×１０８個のバルクＴＩＬ細胞が得られる。一部の実施形態において、この初代細胞集団は、１０～１４日の期間にわたって培養され、それによりバルクＴＩＬ集団、概して約１×１０８個のバルクＴＩＬ細胞が得られる。一部
の実施形態において、この初代細胞集団は、約１１日の期間にわたって培養され、それによりバルクＴＩＬ集団、概して約１×１０８個のバルクＴＩＬ細胞が得られる。
[00304] 好ましい実施形態において、以下及び本明細書で説明するように、初期バル
クＴＩＬ拡大培養ステップ（例えば、プレＲＥＰと称されるプロセスを含み得る図２７のステップＢで説明したものなど）、その後の、以下ステップＤの下及び本明細書に記載されているように、第２の拡大培養（ステップＤ、高速拡大培養プロトコル（ＲＥＰ）ステップと称されるプロセスを含む）、その後の、任意選択の凍結保存、及びその後の第２のステップＤ（再刺激ＲＥＰステップと称されるプロセスを含む）を使用してＴＩＬの拡大培養を実施することができる。このプロセスによって得られたＴＩＬは、任意選択で、本明細書に記載されるとおり表現型特徴及び代謝パラメータが特徴付けられてもよい。
[00305] 実施形態において、ＴＩＬ培養が２４ウェルプレートで、例えばCostar２４
ウェル細胞培養クラスター、平底（Corning Incorporated、Corning, NYを使用して開始
される場合、各ウェルには、ＩＬ－２（６０００ＩＵ／ｍＬ；Chiron Corp.、Emeryville, CA）を含む２ｍＬの完全培地（ＣＭ）中、１×１０６個の腫瘍消化物細胞又は１個の腫瘍断片を播種することができる。一部の実施形態において、腫瘍断片は約１ｍｍ３～１０ｍｍ３である。
[00306] 一部の実施形態において、第１の拡大培養培地は、培養培地の略称である「
ＣＭ」と称される。一部の実施形態において、ステップＢのＣＭは、１０％ヒトＡＢ血清、２５ｍＭヘペス、及び１０ｍｇ／ｍＬゲンタマイシンを添加したGlutaMAX含有ＲＰＭＩ
１６４０からなる。培養が、４０ｍＬ容量及び１０ｃｍ２ガス透過性シリコン底のガス透過性フラスコ（例えば、G-Rex10; Wilson Wolf Manufacturing, New Brighton, MN）内で開始される実施形態では（図１）、各フラスコに、１０～４０ｍＬのＩＬ－２含有ＣＭ中の１０～４０×１０６個の腫瘍消化物生細胞又は５～３０個の腫瘍断片をロードした。G-Rex10及び２４ウェルプレートのいずれも、加湿インキュベーターにおいて５％ＣＯ２
下３７℃でインキュベートし、培養開始から５日後に培地の半分を取り出して、新鮮なＣＭ及びＩＬ－２を補充し、５日目以降は２～３日毎に培地の半分を交換した。
[00307] 腫瘍断片の調製後、得られた細胞（即ち断片）は、腫瘍及び他の細胞よりも
ＴＩＬの成長に有利な条件下で血清含有ＩＬ－２において培養される。一部の実施形態において、腫瘍消化物は、２ｍＬウェルにおいて、不活性化ヒトＡＢ血清を６０００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２と共に含む培地中で（又は、ある場合には、本明細書に概説されるとおり、ａＡＰＣ細胞集団の存在下で）インキュベートされる。この初代細胞集団は、数日、概して１０～１４日の期間にわたって培養され、それによりバルクＴＩＬ集団、概して約１×１０８個のバルクＴＩＬ細胞が得られる。一部の実施形態において、第１の拡大培養の間の成長培地はＩＬ－２又はその変異体を含む。一部の実施形態において、ＩＬは組換えヒトＩＬ－２（ｒｈＩＬ－２）である。一部の実施形態においてＩＬ－２ストック溶液は、１ｍｇバイアルにつき２０～３０×１０６ＩＵ／ｍｇの比活性を有する。一部の実施形態において、ＩＬ－２ストック溶液は１ｍｇバイアルにつき２０～×１０６ＩＵ／ｍｇの比活性を有する。一部の実施形態においてＩＬ－２ストック溶液は１ｍｇバイアルにつき２５×１０６ＩＵ／ｍｇの比活性を有する。一部の実施形態においてＩＬ－２ストック溶液は１ｍｇバイアルにつき３０×１０６ＩＵ／ｍｇの比活性を有する。一部の実施形態において、ＩＬ－２ストック溶液は４～８×１０６ＩＵ／ｍｇのＩＬ－２の最終濃度を有する。一部の実施形態において、ＩＬ－２ストック溶液は５～７×１０６ＩＵ／ｍｇのＩＬ－２の最終濃度を有する。一部の実施形態において、ＩＬ－２ストック溶液は６×１０６ＩＵ／ｍｇのＩＬ－２の最終濃度を有する。一部の実施形態において、ＩＬ－２ストック溶液は実施例４に記載されるとおり調製される。一部の実施形態において、第１の拡大培養培地は約１０，０００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２、約９，０００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２、約
８，０００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２、約７，０００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２、約６０００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２又は約５，０００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２を含む。一部の実施形態において、第１の拡大培養培地は、約９，０００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２、乃至約５，０００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２を含む。一部の実施形態において、第１の拡大培養培地は、約８，０００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２、乃至約６，０００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２を含む。一部の実施形態において、第１の拡大培養培地は、約７，０００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２、乃至約６，０００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２を含む。一部の実施形態において、第１の拡大培養培地は約６，０００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２を含む。ある実施形態において、細胞培養培地はＩＬ－２を更に含む。一部の実施形態において、細胞培養培地は約３０００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２を含む。ある実施形態において、細胞培養培地はＩＬ－２を更に含む。一部の実施形態において、細胞培養培地は約３０００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２を含む。ある実施形態において、細胞培養培地は、約１０００ＩＵ／ｍＬ、約１５００ＩＵ／ｍＬ、約２０００ＩＵ／ｍＬ、約２５００ＩＵ／ｍＬ、約３０００ＩＵ／ｍＬ、約３５００ＩＵ／ｍＬ、約４０００ＩＵ／ｍＬ、約４５００ＩＵ／ｍＬ、約５０００ＩＵ／ｍＬ、約５５００ＩＵ／ｍＬ、約６０００ＩＵ／ｍＬ、約６５００ＩＵ／ｍＬ、約７０００ＩＵ／ｍＬ、約７５００ＩＵ／ｍＬ、又は約８０００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２を含む。ある実施形態において、細胞培養培地は、１０００～２０００ＩＵ／ｍＬ、２０００～３０００ＩＵ／ｍＬ、３０００～４０００ＩＵ／ｍＬ、４０００～５０００ＩＵ／ｍＬ、５０００～６０００ＩＵ／ｍＬ、６０００～７０００ＩＵ／ｍＬ、７０００～８０００ＩＵ／ｍＬの間、又は約８０００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２を含む。
[00308] 一部の実施形態において、第１の拡大培養培地は約５００ＩＵ／ｍＬのＩＬ
－１５、約４００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－１５、約３００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－１５、約２００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－１５、約１８０ＩＵ／ｍＬのＩＬ－１５、約１６０ＩＵ／ｍＬのＩＬ－１５、約１４０ＩＵ／ｍＬのＩＬ－１５、約１２０ＩＵ／ｍＬのＩＬ－１５、又は約１００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－１５を含む。一部の実施形態において、第１の拡大培養培地は約５００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－１５～約１００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－１５を含む。一部の実施形態において、第１の拡大培養培地は約４００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－１５～約１００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－１５を含む。一部の実施形態において、第１の拡大培養培地は約３００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－１５～約１００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－１５を含む。一部の実施形態において、第１の拡大培養培地は約２００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－１５を含む。一部の実施形態において、細胞培養培地は約１８０ＩＵ／ｍＬのＩＬ－１５を含む。ある実施形態において、細胞培養培地はＩＬ－１５を更に含む。好ましい一実施形態において、細胞培養培地は約１８０ＩＵ／ｍＬのＩＬ－１５を含む。
[00309] 一部の実施形態において、第１の拡大培養培地は約２０ＩＵ／ｍＬのＩＬ－
２１、約１５ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２１、約１２ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２１、約１０ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２１、約５ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２１、約４ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２１、約３ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２１、約２ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２１、約１ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２１、又は約０．５ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２１を含む。一部の実施形態において、第１の拡大培養培地は約２０ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２１～約０．５ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２１を含む。一部の実施形態において、第１の拡大培養培地は約１５ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２１～約０．５ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２１を含む。一部の実施形態において、第１の拡大培養培地は約１２ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２１～約０．５ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２１を含む。一部の実施形態において、第１の拡大培養培地は約１０ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２１～約０．５ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２１を含む。一部の実施形態において、第１の拡大培養培地は約５ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２１～約１ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２１を含む。一部の実施形態において、第１の拡大培養培地は約２ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２１を含む。一部の実施形態において、細胞培養培地は約１ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２１を含む。一部の実施形態において、細胞培養培地は約０．５ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２１を含む。ある実施形態において、細胞培養培地はＩＬ－２１を更に含む。好ま
しい一実施形態において、細胞培養培地は約１ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２１を含む。
[00310] 一部の実施形態において、第１の拡大培養培地は、培養培地（culture media）の略称である「ＣＭ」と称される。一部の実施形態において、これはＣＭ１（培養培地１）と称される。一部の実施形態において、ＣＭは、１０％ヒトＡＢ血清、２５ｍＭヘペス、及び１０ｍｇ／ｍＬゲンタマイシンを添加したGlutaMAX含有ＲＰＭＩ １６４０からなる。培養が、４０ｍＬ容量及び１０ｃｍ２ガス透過性シリコン底のガス透過性フラスコ（例えば、G-Rex10；Wilson Wolf Manufacturing、New Brighton, MN）内で開始される実施形態では（図１）、各フラスコに、１０～４０ｍＬのＩＬ－２含有ＣＭ中の１０～４０×１０６個の腫瘍消化物生細胞又は５～３０個の腫瘍断片をロードした。G-Rex10及び２
４ウェルプレートのいずれも、加湿インキュベーターにおいて５％ＣＯ２下３７℃でインキュベートし、培養開始から５日後に培地の半分を取り出して、新鮮なＣＭ及びＩＬ－２を補充し、５日目以降は２～３日毎に培地の半分を交換した。一部の実施形態において、ＣＭは、実施例に記載されるＣＭ１であり、実施例５を参照のこと。一部の実施形態において、第１の拡大培養は初期細胞培養培地又は第１の細胞培養培地中で行われる。一部の実施形態において、初期細胞培養培地又は第１の細胞培養培地はＩＬ－２を含む。
[00311] 一部の実施形態において、実施例及び図で考察されているように、第１の拡
大培養（例えば、プレＲＥＰと称されることもあるものを含み得る、図２７のステップＢに記載されるプロセスなどを含む）プロセスは３～１４日間に短縮される。一部の実施形態において、実施例で考察し、図４及び５並びに、例えば、図２７のステップＢに記載されている拡大培養を含む、第１の拡大培養（例えば、プレＲＥＰと称されることもあるものを含み得る、図２７のステップＢに記載されるプロセスなどを含む）は７～１４日間に短縮される。一部の実施形態において、実施例で考察し、図４及び５に示すように、ステップＢの第１の拡大培養は１０～１４日間に短縮される。一部の実施形態において、実施例で考察し、図４及び５並びに、例えば、図２７のステップＢに記載されている拡大培養を含む、第１の拡大培養は１１日間に短縮される。
[00312] 一部の実施形態において、第１のＴＩＬ拡大培養は１日、２日、３日、４日
、５日、６日、７日、８日、９日、１０日、１１日、１２日、１３日、又は１４日間続行され得る。一部の実施形態において、第１のＴＩＬ拡大培養は１日～１４日間続行され得る。一部の実施形態において、第１のＴＩＬ拡大培養は２日～１４日間続行され得る。一部の実施形態において、第１のＴＩＬ拡大培養は３日～１４日間続行され得る。一部の実施形態において、第１のＴＩＬ拡大培養は４日～１４日間続行され得る。一部の実施形態において、第１のＴＩＬ拡大培養は５日～１４日間続行され得る。一部の実施形態において、第１のＴＩＬ拡大培養は６日～１４日間続行され得る。一部の実施形態において、第１のＴＩＬ拡大培養は７日～１４日間続行され得る。一部の実施形態において、第１のＴＩＬ拡大培養は８日～１４日間続行され得る。一部の実施形態において、第１のＴＩＬ拡大培養は９日～１４日間続行され得る。一部の実施形態において、第１のＴＩＬ拡大培養は１０日～１４日間続行され得る。一部の実施形態において、第１のＴＩＬ拡大培養は１１日～１４日間続行され得る。一部の実施形態において、第１のＴＩＬ拡大培養は１２日～１４日間続行され得る。一部の実施形態において、第１のＴＩＬ拡大培養は１３日～１４日間続行され得る。一部の実施形態において、第１のＴＩＬ拡大培養は１４日間続行され得る。一部の実施形態において、第１のＴＩＬ拡大培養は１日～１１日間続行され得る。一部の実施形態において、第１のＴＩＬ拡大培養は２日～１１日間続行され得る。一部の実施形態において、第１のＴＩＬ拡大培養は３日～１１日間続行され得る。一部の実施形態において、第１のＴＩＬ拡大培養は４日～１１日間続行され得る。一部の実施形態において、第１のＴＩＬ拡大培養は５日～１１日間続行され得る。一部の実施形態において、第１のＴＩＬ拡大培養は６日～１１日間続行され得る。一部の実施形態において、第１のＴＩＬ拡大培養は７日～１１日間続行され得る。一部の実施形態において、第１のＴＩ
Ｌ拡大培養は８日～１１日間続行され得る。一部の実施形態において、第１のＴＩＬ拡大培養は９日～１１日間続行され得る。一部の実施形態において、第１のＴＩＬ拡大培養は１０日～１１日間続行され得る。一部の実施形態において、第１のＴＩＬ拡大培養は１１日間続行され得る。
[00313] 一部の実施形態において、ＩＬ－２、ＩＬ－７、ＩＬ－１５、及び／又はＩ
Ｌ－２１の組み合わせが、第１の拡大培養中の組み合わせとして用いられる。一部の実施形態において、ＩＬ－２、ＩＬ－７、ＩＬ－１５、及び／又はＩＬ－２１、並びにそれらの任意選択の組み合わせは、例えば、図２７による、並びに本明細書に記載されているとおり、ステップＢプロセス中を含む、第１の拡大培養中に含められ得る。一部の実施形態において、ＩＬ－２、ＩＬ－１５、及びＩＬ－２１の組み合わせが、第１の拡大培養中の組み合わせとして用いられる。一部の実施形態において、ＩＬ－２、ＩＬ－１５、及びＩＬ－２１、並びにそれらの任意選択の組み合わせは、例えば、図２７による、及び本明細書に記載されているとおりステップＢプロセス中に含められ得る。
[00314] 一部の実施形態において、実施例及び図で考察されているように、第１の拡
大培養（例えば、プレＲＥＰと称される、図２７のステップＢに記載されるプロセスなどを含む）プロセスは３～１４日間に短縮される。一部の実施形態において、実施例で考察し、図４及び５に示すように、ステップＢの第１の拡大培養は７～１４日間に短縮される。一部の実施形態において、実施例で考察し、図４、５、及び２７に示すように、ステップＢの第１の拡大培養は１０～１４日間に短縮される。一部の実施形態において、実施例で考察し、図４、５、及び２７に示すように、第１の拡大培養は１１日間に短縮される。
[00315] 一部の実施形態において、第１の拡大培養、例えば、図２７によるステップ
Ｂは、閉鎖系バイオリアクターで実施される。一部の実施形態において、本明細書で記載されるとおり、ＴＩＬ拡大培養のために閉鎖系が用いられる。一部の実施形態において、単一のバイオリアクターが用いられる。一部の実施形態において、用いられる単一のバイオリアクターは、例えば、G-REX-10又はG-REX-100である。一部の実施形態において、閉
鎖系バイオリアクターは単一のバイオリアクターである。
Ｃ．ステップＣ：第１の拡大培養から第２の拡大培養への移行
[00316] ある場合には、例えば、図２７に示されるように、例えばステップＢから得
られるＴＩＬ集団を含む、第１の拡大培養から得られるバルクＴＩＬ集団は、以下本明細書で考察されるプロトコルを使用して、直ちに凍結保存してもよい。或いは、第２のＴＩＬ集団と称される第１の拡大培養から得られたＴＩＬ集団は、第２の拡大培養（ＲＥＰと呼ばれることがある拡大培養を含み得る）に供し、その後、以下で考察するように凍結保存してもよい。同様に、遺伝子修飾ＴＩＬが治療に使用される場合、第１のＴＩＬ集団（バルクＴＩＬ集団と称されることもある）又は、第２のＴＩＬ集団（一部の実施形態において、ＲＥＰ ＴＩＬ集団と称される集団を含み得る）は、拡大培養の前又は、第１の拡大培養の後で第２の拡大培養の前に、適切な処置のために遺伝子修飾に供してもよい。
[00317] 一部の実施形態において、第１の拡大培養から（例えば、図２７に示される
とおりのステップＢから）入手されたＴＩＬは、選択のためのフェノタイピングまで貯蔵される。一部の実施形態において、第１の拡大培養から（例えば、図２７に示されるとおりのステップＢから）入手されたＴＩＬは、貯蔵されず第２の拡大培養に直接進む。一部の実施形態において、第１の拡大培養から入手されたＴＩＬは、第１の拡大培養後、第２の拡大培養前に凍結保存されない。一部の実施形態において、第１の拡大培養から第２の拡大培養への移行は、断片化が行われたときから約３日、４日、５日、６日、７日、８日、９日、１０日、１１日、１２日、１３日、又は１４日の時点で行われる。一部の実施形態において、第１の拡大培養から第２の拡大培養への移行は、断片化が行われたときから
約３日～１４日の時点で行われる。一部の実施形態において、第１の拡大培養から第２の拡大培養への移行は、断片化が行われたときから約４日～１４日の時点で行われる。一部の実施形態において、第１の拡大培養から第２の拡大培養への移行は、断片化が行われたときから約４日～１０日の時点で行われる。一部の実施形態において、第１の拡大培養から第２の拡大培養への移行は、断片化が行われたときから約７日～１４日の時点で行われる。一部の実施形態において、第１の拡大培養から第２の拡大培養への移行は、断片化が行われたときから約１４日の時点で行われる。
[00318] 一部の実施形態において、第１の拡大培養から第２の拡大培養への移行は、
断片化が行われたときから１日、２日、３日、４日、５日、６日、７日、８日、９日、１０日、１１日、１２日、１３日、又は１４日の時点で行われる。一部の実施形態において、第１の拡大培養から第２の拡大培養への移行は、断片化が行われたときから１日～１４日で行われる。一部の実施形態において、第１のＴＩＬ拡大培養は２日～１４日間続行され得る。一部の実施形態において、第１の拡大培養から第２の拡大培養への移行は、断片化が行われたときから３日～１４日で行われる。一部の実施形態において、第１の拡大培養から第２の拡大培養への移行は、断片化が行われたときから４日～１４日で行われる。一部の実施形態において、第１の拡大培養から第２の拡大培養への移行は、断片化が行われたときから５日～１４日で行われる。一部の実施形態において、第１の拡大培養から第２の拡大培養への移行は、断片化が行われたときから６日～１４日で行われる。一部の実施形態において、第１の拡大培養から第２の拡大培養への移行は、断片化が行われたときから７日～１４日で行われる。一部の実施形態において、第１の拡大培養から第２の拡大培養への移行は、断片化が行われたときから８日～１４日で行われる。一部の実施形態において、第１の拡大培養から第２の拡大培養への移行は、断片化が行われたときから９日～１４日で行われる。一部の実施形態において、第１の拡大培養から第２の拡大培養への移行は、断片化が行われたときから１０日～１４日で行われる。一部の実施形態において、第１の拡大培養から第２の拡大培養への移行は、断片化が行われたときから１１日～１４日で行われる。一部の実施形態において、第１の拡大培養から第２の拡大培養への移行は、断片化が行われたときから１２日～１４日で行われる。一部の実施形態において、第１の拡大培養から第２の拡大培養への移行は、断片化が行われたときから１３日～１４日で行われる。一部の実施形態において、第１の拡大培養から第２の拡大培養への移行は、断片化が行われたときから１４日で行われる。一部の実施形態において、第１の拡大培養から第２の拡大培養への移行は、断片化が行われたときから１日～１１日で行われる。一部の実施形態において、第１の拡大培養から第２の拡大培養への移行は、断片化が行われたときから２日～１１日で行われる。一部の実施形態において、第１の拡大培養から第２の拡大培養への移行は、断片化が行われたときから３日～１１日で行われる。一部の実施形態において、第１の拡大培養から第２の拡大培養への移行は、断片化が行われたときから４日～１１日で行われる。一部の実施形態において、第１の拡大培養から第２の拡大培養への移行は、断片化が行われたときから５日～１１日で行われる。一部の実施形態において、第１の拡大培養から第２の拡大培養への移行は、断片化が行われたときから６日～１１日で行われる。一部の実施形態において、第１の拡大培養から第２の拡大培養への移行は、断片化が行われたときから７日～１１日で行われる。一部の実施形態において、第１の拡大培養から第２の拡大培養への移行は、断片化が行われたときから８日～１１日で行われる。一部の実施形態において、第１の拡大培養から第２の拡大培養への移行は、断片化が行われたときから９日～１１日で行われる。一部の実施形態において、第１の拡大培養から第２の拡大培養への移行は、断片化が行われたときから１０日～１１日で行われる。一部の実施形態において、第１の拡大培養から第２の拡大培養への移行は、断片化が行われたときから１１日で行われる。
[00319] 一部の実施形態において、ＴＩＬは第１の拡大培養の後、第２の拡大培養の
前に貯蔵されず、ＴＩＬは第２の拡大培養に直接進む（例えば、一部の実施形態において
、図２７に示すように、ステップＢからステップＤへの移行中に貯蔵は行われない）。一部の実施形態において、本明細書に記載されるとおり、移行は閉鎖系で行われる。一部の実施形態において、第１の拡大培養からのＴＩＬは、第２のＴＩＬ集団からのＴＩＬであり、移行期間を伴わず第２の拡大培養に直接進む。
[00320] 一部の実施形態において、第１の拡大培養から第２の拡大培養への移行は、
例えば、図２７によるステップＣは、閉鎖系バイオリアクターで実施される。一部の実施形態において、本明細書に記載されるとおり、ＴＩＬ拡大培養のために閉鎖系が用いられる。一部の実施形態において、単一のバイオリアクターが用いられる。一部の実施形態において、用いられる単一のバイオリアクターは、例えば、G-REX-10又はG-REX-100である
。一部の実施形態において、閉鎖系バイオリアクターは単一のバイオリアクターである。
Ｄ．ステップＤ： 第２の拡大培養
[00321] 一部の実施形態において、ＴＩＬ細胞集団は、例えば、図２７に記載のとお
り、ステップＡ及びステップＢ、並びにステップＣと称される移行後、回収及び初期バルク処理の後、数が増加する）。この更なる増加は、本明細書では第２の拡大培養と称され、これは、当該技術分野で一般に迅速拡大培養プロセスと称される拡大培養プロセス（ＲＥＰ、並びに図２７のステップＤに示されるプロセス）を含み得る。第２の拡大培養は、概して、フィーダー細胞、サイトカイン源、及び抗ＣＤ３抗体を含め、幾つもの成分を含むガス透過性容器内の培養培地を使用して達成することができる。
[00322] 一部の実施形態において、ＴＩＬの第２の拡大培養又は第２のＴＩＬ拡大培
養（これはＲＥＰと称されることもある拡大培養；並びに図２７のステップＤに示されるプロセスを含み得る）は、当業者に公知の任意のＴＩＬフラスコ又は容器を使用して実施することができる。一部の実施形態において、第２のＴＩＬ拡大培養は７日、８日、９日、１０日、１１日、１２日、１３日、又は１４日間続行し得る。一部の実施形態において、第２のＴＩＬ拡大培養は約７日～約１４日間続行し得る。一部の実施形態において、第２のＴＩＬ拡大培養は約８日～約１４日間続行し得る。一部の実施形態において、第２のＴＩＬ拡大培養は約９日～約１４日間続行し得る。一部の実施形態において、第２のＴＩＬ拡大培養は約１０日～約１４日間続行し得る。一部の実施形態において、第２のＴＩＬ拡大培養は約１１日～約１４日間続行し得る。一部の実施形態において、第２のＴＩＬ拡大培養は約１２日～約１４日間続行し得る。一部の実施形態において、第２のＴＩＬ拡大培養は約１３日～約１４日間続行し得る。一部の実施形態において、第２のＴＩＬ拡大培養は約１４日間続行し得る。
[00323] ある実施形態において、第２の拡大培養は、本開示の方法（例えば、ＲＥＰ
と呼ばれる拡大培養、並びに図２７のステップＤに示されるプロセスを含む）を使用して、ガス透過性容器内で実施することができる。例えば、ＴＩＬは、インターロイキン－２（ＩＬ－２）又はインターロイキン－１５（ＩＬ－１５）の存在下で非特異的Ｔ細胞受容体刺激を用いて迅速に拡大培養することができる。非特異的Ｔ細胞受容体刺激としては、例えば、約３０ｎｇ／ｍｌのＯＫＴ３などの抗ＣＤ３抗体、マウスモノクローナル抗ＣＤ３抗体（Ortho-McNeil, Raritan, NJ又はMiltenyi Biotech, Auburn, CAから市販されて
いる）又は、ＵＨＣＴ－１（BioLegend, San Diego, CA, USAから市販されている）を挙
げることができる。ＴＩＬは、任意選択で３００ＩＵ／ｍＬ ＩＬ－２又はＩＬ－１５など、Ｔ細胞成長因子の存在下で、ヒト白血球抗原Ａ２（ＨＬＡ－Ａ２）結合ペプチド、例えば、０．３μΜ ＭＡＲＴ－１：２６－３５（２７Ｌ）又はｇｐｌ ００：２０９－２１７（２１０Ｍ）など、任意選択でベクターから発現させることのできる、１つ又は複数のエピトープなど、その抗原性部分を含めた癌の１つ以上の抗原を、第２の拡大培養の間に含めることにより、インビトロでのＴＩＬの更なる刺激を誘発するように拡大培養することができる。他の好適な抗原としては、例えば、ＮＹ－ＥＳＯ－１、ＴＲＰ－１、ＴＲ
Ｐ－２、チロシナーゼ癌抗原、ＭＡＧＥ－Ａ３、ＳＳＸ－２、及びＶＥＧＦＲ２、又はその抗原性部分を挙げることができる。ＴＩＬはまた、ＨＬＡ－Ａ２発現抗原提示細胞にパルスした癌の同じ１つ又は複数の抗原による再刺激によっても迅速に拡大培養し得る。或いは、ＴＩＬは、例えば照射自己リンパ球によるか、又は照射ＨＬＡ－Ａ２＋同種異系リンパ球及びＩＬ－２によって更に再刺激することができる。一部の実施形態において、再刺激は、第２の拡大培養の一部として生じる。一部の実施形態において、放射線照射された自己リンパ球の存在下で、又は放射線照射されたＨＬＡ－Ａ２＋同種リンパ球及びＩＬ－２とともに第２の拡大培養が発生する。
[00324] ある実施形態において、細胞培養培地はＩＬ－２を更に含む。一部の実施形
態において、細胞培養培地は約３０００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２を含む。ある実施形態において、細胞培養培地はＩＬ－２を更に含む。一部の実施形態において、細胞培養培地は約３０００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２を含む。ある実施形態において、細胞培養培地は、約１０００ＩＵ／ｍＬ、約１５００ＩＵ／ｍＬ、約２０００ＩＵ／ｍＬ、約２５００ＩＵ／ｍＬ、約３０００ＩＵ／ｍＬ、約３５００ＩＵ／ｍＬ、約４０００ＩＵ／ｍＬ、約４５００ＩＵ／ｍＬ、約５０００ＩＵ／ｍＬ、約５５００ＩＵ／ｍＬ、約６０００ＩＵ／ｍＬ、約６５００ＩＵ／ｍＬ、約７０００ＩＵ／ｍＬ、約７５００ＩＵ／ｍＬ、又は約８０００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２を含む。ある実施形態において、細胞培養培地は、１０００～２０００ＩＵ／ｍＬ、２０００～３０００ＩＵ／ｍＬ、３０００～４０００ＩＵ／ｍＬ、４０００～５０００ＩＵ／ｍＬ、５０００～６０００ＩＵ／ｍＬ、６０００～７０００ＩＵ／ｍＬ、７０００～８０００ＩＵ／ｍＬ、又は８０００ＩＵ／ｍＬの間のＩＬ－２を含む。
[00325] ある実施形態において、細胞培養培地はＯＫＴ３抗体を含む。一部の実施形
態において、細胞培養培地は約３０ｎｇ／ｍＬのＯＫＴ３抗体を含む。ある実施形態において、細胞培養培地は、約０．１ｎｇ／ｍＬ、約０．５ｎｇ／ｍＬ、約１ｎｇ／ｍＬ、約２．５ｎｇ／ｍＬ、約５ｎｇ／ｍＬ、約７．５ｎｇ／ｍＬ、約１０ｎｇ／ｍＬ、約１５ｎｇ／ｍＬ、約２０ｎｇ／ｍＬ、約２５ｎｇ／ｍＬ、約３０ｎｇ／ｍＬ、約３５ｎｇ／ｍＬ、約４０ｎｇ／ｍＬ、約５０ｎｇ／ｍＬ、約６０ｎｇ／ｍＬ、約７０ｎｇ／ｍＬ、約８０ｎｇ／ｍＬ、約９０ｎｇ／ｍＬ、約１００ｎｇ／ｍＬ、約２００ｎｇ／ｍＬ、約５００ｎｇ／ｍＬ、及び約１μｇ／ｍＬのＯＫＴ３抗体を含む。ある実施形態において、細胞培養培地は、０．１ｎｇ／ｍＬ～１ｎｇ／ｍＬ、１ｎｇ／ｍＬ～５ｎｇ／ｍＬ、５ｎｇ／ｍＬ～１０ｎｇ／ｍＬ、１０ｎｇ／ｍＬ～２０ｎｇ／ｍＬ、２０ｎｇ／ｍＬ～３０ｎｇ／ｍＬ、３０ｎｇ／ｍＬ～４０ｎｇ／ｍＬ、４０ｎｇ／ｍＬ～５０ｎｇ／ｍＬ、及び５０ｎｇ／ｍＬ～１００ｎｇ／ｍＬのＯＫＴ３抗体を含む。
[00326] 一部の実施形態において、ＩＬ－２、ＩＬ－７、ＩＬ－１５、及び／又はＩ
Ｌ－２１の組み合わせが、第２の拡大培養中の組み合わせとして用いられる。一部の実施形態において、ＩＬ－２、ＩＬ－７、ＩＬ－１５、及び／又はＩＬ－２１、並びにそれらの任意選択の組み合わせは、例えば、図２７による、並びに本明細書に記載されているとおり、ステップＤプロセス中を含む、第２の拡大培養中に含められ得る。一部の実施形態において、ＩＬ－２、ＩＬ－１５、及びＩＬ－２１の組み合わせが、第２の拡大培養中の組み合わせとして用いられる。一部の実施形態において、ＩＬ－２、ＩＬ－１５、及びＩＬ－２１、並びにそれらの任意の組み合わせは、例えば、図２７による、及び本明細書に記載されているとおり、ステップＤプロセス中に含められ得る。
[00327] 一部の実施形態において、第２の拡大培養は、ＩＬ－２、ＯＫＴ－３、及び
抗原提示フィーダー細胞を含む添加細胞培養培地で実施されてもよい。一部の実施形態において、第２の拡大培養は添加細胞培養培地で行われる。一部の実施形態において、添加細胞培養培地は、ＩＬ－２、ＯＫＴ－３、及び抗原提示フィーダー細胞を含む。一部の実施形態において、第２の細胞培養培地は、ＩＬ－２、ＯＫＴ－３、及び抗原提示細胞（Ａ
ＰＣ；抗原提示フィーダー細胞とも称される）を含む。一部の実施形態において、第２の拡大培養は、ＩＬ－２、ＯＫＴ－３、及び抗原提示フィーダー細胞を含む細胞培養培地で生じる（即ち、抗原提示細胞）。
[00328] 一部の実施形態において、第２の拡大培養培地は約５００ＩＵ／ｍＬのＩＬ
－１５、約４００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－１５、約３００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－１５、約２００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－１５、約１８０ＩＵ／ｍＬのＩＬ－１５、約１６０ＩＵ／ｍＬのＩＬ－１５、約１４０ＩＵ／ｍＬのＩＬ－１５、約１２０ＩＵ／ｍＬのＩＬ－１５、又は約１００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－１５を含む。一部の実施形態において、第２の拡大培養培地は約５００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－１５～約１００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－１５を含む。一部の実施形態において、第２の拡大培養培地は約４００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－１５～約１００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－１５を含む。一部の実施形態において、第２の拡大培養培地は約３００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－１５～約１００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－１５を含む。一部の実施形態において、第２の拡大培養培地は約２００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－１５を含む。一部の実施形態において、細胞培養培地は約１８０ＩＵ／ｍＬのＩＬ－１５を含む。ある実施形態において、細胞培養培地はＩＬ－１５を更に含む。好ましい一実施形態において、細胞培養培地は約１８０ＩＵ／ｍＬのＩＬ－１５を含む。
[00329] 一部の実施形態において、第２の拡大培養培地は約２０ＩＵ／ｍＬのＩＬ－
２１、約１５ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２１、約１２ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２１、約１０ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２１、約５ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２１、約４ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２１、約３ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２１、約２ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２１、約１ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２１、又は約０．５ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２１を含む。一部の実施形態において、第２の拡大培養培地は約２０ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２１～約０．５ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２１を含む。一部の実施形態において、第２の拡大培養培地は約１５ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２１～約０．５ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２１を含む。一部の実施形態において、第２の拡大培養培地は約１２ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２１～約０．５ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２１を含む。一部の実施形態において、第２の拡大培養培地は約１０ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２１～約０．５ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２１を含む。一部の実施形態において、第２の拡大培養培地は約５ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２１～約１ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２１を含む。一部の実施形態において、第２の拡大培養培地は約２ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２１を含む。一部の実施形態において、細胞培養培地は約１ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２１を含む。一部の実施形態において、細胞培養培地は約０．５ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２１を含む。ある実施形態において、細胞培養培地はＩＬ－２１を更に含む。好ましい一実施形態において、細胞培養培地は約１ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２１を含む。
[00330] 一部の実施形態において、抗原提示フィーダー細胞（ＡＰＣ）はＰＢＭＣで
ある。ある実施形態において、迅速拡大培養及び／又は第２の拡大培養におけるＴＩＬとＰＢＭＣ及び／又は抗原提示細胞との比は、約１対２５、約１対５０、約１対１００、約１対１２５、約１対１５０、約１対１７５、約１対２００、約１対２２５、約１対２５０、約１対２７５、約１対３００、約１対３２５、約１対３５０、約１対３７５、約１対４００、又は約１対５００である。ある実施形態において、迅速拡大培養及び／又は第２の拡大培養におけるＴＩＬとＰＢＭＣとの比は１対５０～１対３００である。ある実施形態において、迅速拡大培養及び／又は第２の拡大培養におけるＴＩＬとＰＢＭＣとの比は１対１００～１対２００である。
[00331] 一実施形態において、ＲＥＰ及び／又は第２の拡大培養は、バルクＴＩＬを
１５０ｍｌ培地中の１００倍又は２００倍過剰の不活性化フィーダー細胞、３０ｍｇ／ｍＬ ＯＫＴ３抗ＣＤ３抗体及び３０００ＩＵ／ｍＬ ＩＬ－２と混合してフラスコ内で実施される。細胞を別の成長チャンバに移すまで培地補充が行われる（概して新鮮培地による呼吸を介した３分の２の培地補充）。別の成長チャンバには、以下に更に十分に考察す
るとおりのG-REXフラスコ及びガス透過性容器が含まれる。
[00332] 一部の実施形態において、第２の拡大培養（ＲＥＰプロセスと称されるプロ
セスを含み得る）は、実施例及び図で考察されるように、７～１４日間に短縮される。一部の実施形態において、第２の拡大培養は１１日間に短縮される。
[00333] ある実施形態において、ＲＥＰ及び／又は第２の拡大培養は、前述のように
（Tran, et al., J. Immunother.2008, 31, 742-51; Dudley, et al., J. Immunother.2003, 26, 332-42）Ｔ－１７５フラスコ及びガス透過性バッグ又はガス透過性培養器具（G-Rexフラスコ）を使用して実施してもよい。一部の実施形態において、第２の拡大培養（
迅速拡大培養と称される拡大培養を含む）は、Ｔ－１７５フラスコで実施され、１５０ｍＬの培地に懸濁した約１×１０６個のＴＩＬを各Ｔ－１７５フラスコに加えてもよい。ＴＩＬは、ＩＬ－２の３０００ＩＵ／ｍＬ及び抗ＣＤ３の３０ｎｇ／ｍＬを添加したＣＭ及びAIM-V培地の１対１の混合物で培養してもよい。Ｔ－１７５フラスコは５％ＣＯ２下３
７℃でインキュベートしてもよい。培地の半分は、５日目に、３０００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２を含む５０／５０培地を使用して交換されてもよい。一部の実施形態において、７日目に、２つのＴ－１７５フラスコからの細胞を３Ｌバッグに合わせることができ、その３００ｍＬのＴＩＬ懸濁液に、５％ヒトＡＢ血清及び３０００ＩＵ／ｍｌのＩＬ－２を含む３００ｍＬのAIM Vを加えた。毎日又は２日毎に各バッグの細胞数をカウントし、新鮮培
地を加えて細胞数を０．５～２．０×１０６細胞／ｍＬに保った。
[00334] 一実施形態において、第２の拡大培養（これはＲＥＰと称される拡大培養；
並びに図２７のステップＤに称されるものを含み得る）は、１００ｃｍガス透過性シリコン底の５００ｍＬ容量ガス透過性フラスコ（G-Rex 100、Wilson Wolf Manufacturing Corporation, New Brighton, MN, USAから市販されている）において実施され得、５％ヒト
ＡＢ血清、３０００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２及び３０ｎｇ／ｍｌの抗ＣＤ３（ＯＫＴ３）を添加した４００ｍＬの５０／５０培地中で５×１０６又は１０×１０６個のＴＩＬをＰＢＭＣと培養し得る。G-Rex 100フラスコは５％ＣＯ２下３７℃でインキュベートし得る。
５日目、２５０ｍＬの上清を取り出して遠心ボトルに入れ、１５００ｒｐｍ（４９１×ｇ）で１０分間遠心し得る。５％ヒトＡＢ血清、３０００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２を含む１５０ｍＬの新鮮培地にＴＩＬペレットを再懸濁し、元のG-Rex 100フラスコに戻し加え得る
。G-Rex 100フラスコ内でＴＩＬを連続的に拡大培養するときは、７日目に各G-Rex 100のＴＩＬを各フラスコ内に存在する３００ｍＬの培地に懸濁してもよく、及び細胞懸濁液を３つの１００ｍＬアリコートに分割してもよく、それらを３つのG-Rex 100フラスコの播
種に使用し得る。次に、５％ヒトＡＢ血清及び３０００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２を含む１５０ｍＬのAIM-Vを各フラスコに加え得る。G-Rex 100フラスコは５％ＣＯ２下３７℃でインキュベートしてもよく、４日後、各G-Rex100フラスコに３０００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２を含む１５０ｍＬのAIM-Vを加え得る。細胞は培養１４日目に回収し得る。
[00335] 一実施形態において、第２の拡大培養（ＲＥＰと称される拡大培養を含む）
は、バルクＴＩＬを１５０ｍｌ培地中の１００倍又は２００倍過剰の不活性化フィーダー細胞、３０ｍｇ／ｍＬ ＯＫＴ３抗ＣＤ３抗体及び３０００ＩＵ／ｍＬ ＩＬ－２と混合してフラスコ内で実施される。一部の実施形態において、細胞が別の成長チャンバに移されるまで培地交換が行われる。一部の実施形態において、培地の２／３が新鮮培地による呼吸に置き換えられる。一部の実施形態において、別の成長チャンバには、以下に更に十分に考察するとおりのG-REXフラスコ及びガス透過性容器が含まれる。
[00336] 一実施形態において、第２の拡大培養（ＲＥＰと称される拡大培養を含む）
が実施され、これは優れた腫瘍応答性に関してＴＩＬを選択するステップを更に含む。当該技術分野において公知の任意の選択方法を用いることができる。例えば、米国特許出願
公開第２０１６／００１００５８ Ａ１号（この開示は参照により本明細書に援用される）に記載される方法が、優れた腫瘍応答性に関するＴＩＬの選択に用いられてもよい。
[00337] 任意選択で、第２の拡大培養（ＲＥＰ拡大培養と称される拡大培養を含む）
の後に、当該技術分野において公知の標準アッセイを用いて細胞生存率アッセイを実施することができる。例えば、バルクＴＩＬの試料に対してトリパンブルー色素排除アッセイを行うことができ、これは死細胞を選択的に標識して生存率の評価を可能にするものである。一部の実施形態では、Cellometer K2自動セルカウンター（Nexcelom Bioscience, Lawrence, MA）を使用してＴＩＬ試料をカウントし、生存率を決定することができる。一部の実施形態では、生存率は、例えば実施例１５に記載されるCellometer K2 Image Cytometer自動セルカウンタープロトコルに従い決定される。
[00338] 一部の実施形態において、ＴＩＬの第２の拡大培養（ＲＥＰと称される拡大
培養を含む）は、先述のとおりＴ－１７５フラスコ及びガス透過性バッグ（Tran KQ, Zhou J, Durflinger KH, et al., 2008, J Immunother., 31:742-751及びDudley ME, Wunderlich JR, Shelton TE, et al. 2003, J Immunother., 26:332-342）又はガス透過性G-Rexフラスコを使用して実施することができる。一部の実施形態において、第２の拡大培養はフラスコを使用して実施される。一部の実施形態において、第２の拡大培養はガス透過性G-Rexフラスコを使用して実施される。一部の実施形態において、Ｔ－１７５フラスコで
実施される第２の拡大培養、及び約１×１０６個のＴＩＬを約１５０ｍＬの培地中に懸濁し、これを各Ｔ－１７５フラスコに加える。ＴＩＬは、「フィーダー」細胞としての照射（５０Ｇｙ）された同種異系ＰＢＭＣと１対１００の比で培養し、及び細胞は、３０００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２及び３０ｎｇ／ｍＬの抗ＣＤ３を添加したＣＭとAIM-V培地との１
対１混合物（５０／５０培地）で培養した。Ｔ－１７５フラスコは５％ＣＯ２下３７℃でインキュベートする。一部の実施形態において、培地の半分は、５日目に３０００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２を含む５０／５０培地を使用して交換される。一部の実施形態において、７日目、２つのＴ－１７５フラスコからの細胞を３Ｌバッグに合わせ、その３００ｍＬのＴＩＬ懸濁液に、５％ヒトＡＢ血清及び３０００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２を含む３００ｍＬのAIM-Vを加える。毎日又は２日毎に各バッグの細胞数をカウントしてもよく、新鮮培地
を加えて細胞数を約０．５～約２．０×１０６細胞／ｍＬに保ち得る。
[00339] 一部の実施形態において、第２の拡大培養（ＲＥＰと称される拡大培養を含
む）は、１００ｃｍ２ガス透過性シリコン底の５００ｍＬ容量フラスコ（G-Rex 100, Wilson Wolf）において実施され（図１）、３０００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２及び３０ｎｇ／ｍＬの抗ＣＤ３を添加した４００ｍＬの５０／５０培地中で約５×１０６又は１０×１０６個のＴＩＬを照射同種異系ＰＢＭＣと１対１００の比で培養する。G-Rex100フラスコは５％ＣＯ２下３７℃でインキュベートされる。一部の実施形態において、５日目に、２５０ｍＬの上清を取り出して遠心ボトルに入れ、１５００ｒｐｍ（４９１ｇ）で１０分間遠心する。次に３０００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２を含む１５０ｍＬの新鮮５０／５０培地にＴＩＬペレットを再懸濁し、元のG-Rex100フラスコに加え戻し得る。ＴＩＬがG-Rex100フラスコ内で連続的に拡大培養される実施形態では、７日目に各G-Rex100内のＴＩＬを各フラスコ内に存在する３００ｍＬの培地に懸濁し、及び細胞懸濁液を３つの１００ｍＬアリコートに分割しており、それらを３つのG-Rex100フラスコの播種に使用される。次に、５％ヒトＡＢ血清及び３０００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２を含む１５０ｍＬのAIM-Vを各フラスコに
加える。G-Rex100フラスコは５％ＣＯ２下３７℃でインキュベートされ、４日後、各G-Rex100フラスコに３０００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２を含む１５０ｍＬのAIM-Vを加える。細胞
は培養１４日目に回収される。
[00340] Ｔ及びＢリンパ球の多様な抗原受容体は、限られているが多数の遺伝子セグ
メントの体細胞組換えによって産生される。これらの遺伝子セグメントＶ（可変）、Ｄ（
多様性）、Ｊ（結合）、及びＣ（定数）は、免疫グロブリン及びＴ細胞受容体（ＴＣＲ）の結合特異性及び下流側での適用を決定する。本発明は、Ｔ細胞レパートリーの多様性を示し、増加させるＴＩＬを生成する方法を提供する。一部の実施形態において、本方法により得られたＴＩＬは、Ｔ細胞レパートリー多様性の増加を示す。一部の実施形態において、第２の拡大培養で得られたＴＩＬは、Ｔ細胞レパートリー多様性の増加を示す。一部の実施形態において、多様性の増加は、免疫グロブリンの多様性及び／又はＴ細胞受容体の多様性の増加である。一部の実施形態において、免疫グロブリンの多様性は、免疫グロブリン重鎖にある。一部の実施形態において、免疫グロブリンの多様性は、免疫グロブリン軽鎖にある。一部の実施形態において、多様性はＴ細胞受容体にある。一部の実施形態において、多様性は、アルファ、ベータ、ガンマ、及びデルタ受容体からなる群から選択されるＴ細胞受容体の１つにある。一部の実施形態において、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）アルファ及び／又はベータの発現が増加する。一部の実施形態において、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）アルファの発現が増加する。一部の実施形態において、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）ベータの発現が増加する。一部の実施形態において、ＴＣＲａｂ（即ち、ＴＣＲα／β）の発現が増加する。
[00341] 一部の実施形態において、第２の拡大培養培地（例えば、ＣＭ２又は第２の
細胞培養培地と称されることもある）は、以下で更に詳細に考察するとおり、ＩＬ－２、ＯＫＴ－３、並びに抗原提示フィーダー細胞（ＡＰＣ）を含む。
[00342] 一部の実施形態において、第２の拡大培養、例えば、図２７によるステップ
Ｄは、閉鎖系バイオリアクターで実施される。一部の実施形態において、本明細書に記載されるとおり、ＴＩＬ拡大培養のために閉鎖系が用いられる。一部の実施形態において、単一のバイオリアクターが用いられる。一部の実施形態において、用いられる単一のバイオリアクターは、例えば、G-REX -10又はG-REX -100である。一部の実施形態において、
閉鎖系バイオリアクターは単一のバイオリアクターである。
１．フィーダー細胞及び抗原提示細胞
[00343] 一実施形態では、本明細書に記載の第２の拡大培養手順（例えば、図２７の
ステップＤに記載された拡大培養、並びにＲＥＰと称される拡大培養を含む）は、ＲＥＰ
ＴＩＬ拡大培養中及び／又は第２の拡大培養中に過剰量のフィーダー細胞が必要である。多くの実施形態において、フィーダー細胞は、健常供血者からの標準的な全血ユニットから入手される末梢血単核球（ＰＢＭＣ）である。ＰＢＭＣは、Ficoll-Paque勾配分離などの標準方法を用いて入手される。
[00344] 一般に、同種異系ＰＢＭＣは、照射又は熱処理のいずれかにより不活性化さ
れ、実施例、特に放射線照射された同種異系ＰＢＭＣの複製不能性を評価するための例示的なプロトコルを提供する実施例１４に記載されるように、ＲＥＰ手順で使用される。
[00345] 一部の実施形態において、１４日目の生細胞の総数がＲＥＰの０日目及び／
又は第２の拡大培養の０日目に培養（即ち、第２の拡大培養の開始日）に移行した初期の生細胞数より少ない場合、ＰＢＭＣは複製不能とみなされ、本明細書に記載のＴＩＬ拡大培養手順での使用が認められる。例えば、実施例１４を参照のこと。
[00346] 一部の実施形態において、ＯＫＴ３及びＩＬ－２の存在下で培養された生細
胞の総数が、７日目及び１４日目に、ＲＥＰの０日目及び／又は第２の拡大培養の０日目（即ち、第２の拡大培養の開始日）に培養に移行した初期の生細胞数から増加していない場合、ＰＢＭＣは複製不能とみなされ、本明細書に記載のＴＩＬ拡大培養手順での使用が認められる。一部の実施形態において、ＰＢＭＣは、３０ｎｇ／ｍｌのＯＫＴ３抗体及び３０００ＩＵ／ｍｌのＩＬ－２の存在下で培養される。例えば、実施例１３を参照のこと
。
[00347] 一部の実施形態において、ＯＫＴ３及びＩＬ－２の存在下で培養された生細
胞の総数が、７日目及び１４日目に、ＲＥＰの０日目及び／又は第２の拡大培養の０日目（即ち、第２の拡大培養の開始日）に培養に移行した初期の生細胞数から増加していない場合、ＰＢＭＣは複製不能とみなされ、本明細書に記載のＴＩＬ拡大培養手順での使用が認められる。一部の実施形態において、ＰＢＭＣは、５～６０ｎｇ／ｍｌのＯＫＴ３抗体及び１０００～６０００ＩＵ／ｍｌのＩＬ－２の存在下で培養される。一部の実施形態において、ＰＢＭＣは、１０～５０ｎｇ／ｍｌのＯＫＴ３抗体及び２０００～５０００ＩＵ／ｍｌのＩＬ－２の存在下で培養される。一部の実施形態において、ＰＢＭＣは、２０～４０ｎｇ／ｍｌのＯＫＴ３抗体及び２０００～４０００ＩＵ／ｍｌのＩＬ－２の存在下で培養される。一部の実施形態において、ＰＢＭＣは、２５～３５ｎｇ／ｍｌのＯＫＴ３抗体及び２５００～３５００ＩＵ／ｍｌのＩＬ－２の存在下で培養される。
[00348] 一部の実施形態において、抗原提示フィーダー細胞はＰＢＭＣである。一部
の実施形態において、抗原提示フィーダー細胞は人工抗原提示フィーダー細胞である。ある実施形態において、第２の拡大培養におけるＴＩＬと抗原提示フィーダー細胞との比は、約１対２５、約１対５０、約１対１００、約１対１２５、約１対１５０、約１対１７５、約１対２００、約１対２２５、約１対２５０、約１対２７５、約１対３００、約１対３２５、約１対３５０、約１対３７５、約１対４００、又は約１対５００である。ある実施形態において、第２の拡大培養におけるＴＩＬと抗原提示フィーダー細胞との比は１対５０～１対３００である。ある実施形態において、第２の拡大培養におけるＴＩＬと抗原提示フィーダー細胞との比は１対１００～１対２００である。
[00349] ある実施形態において、本明細書に記載の第２の拡大培養手順は、約２．５
×１０９個のフィーダー細胞と約１００×１０６個のＴＩＬとの比を必要とする。別の実施形態において、本明細書に記載の第２の拡大培養手順は、約２．５×１０９個のフィーダー細胞と約５０×１０６個のＴＩＬとの比を必要とする。更に別の実施形態において、本明細書に記載の第２の拡大培養手順は、約２．５×１０９個のフィーダー細胞と約２５×１０６個のＴＩＬを必要とする。
[00350] ある実施形態において、本明細書に記載の第２の拡大培養手順は、第２の拡
大培養中に過剰量のフィーダー細胞を必要とする。多くの実施形態において、フィーダー細胞は、健常供血者からの標準的な全血ユニットから入手される末梢血単核球（ＰＢＭＣ）である。ＰＢＭＣは、Ficoll-Paque勾配分離などの標準方法を用いて入手される。ある実施形態では、ＰＢＭＣの代わりに人工抗原提示（ａＡＰＣ）細胞が使用される。
[00351] 一般に、同種異系ＰＢＭＣは、照射又は熱処理のいずれかによって不活性化
され、図４、５、及び２７に記載された例示的な手順を含む、本明細書に記載されたＴＩＬ拡大培養手順で使用される。
[00352] ある実施形態において、人工抗原提示細胞は、ＰＢＭＣの代替として、又は
それと組み合わせて、第２の拡大培養で使用される。
２．サイトカイン
[00353] 本明細書に記載の拡大培養方法は、一般に、当該技術分野において公知のと
おり、高用量のサイトカイン、特にＩＬ－２を含む培養培地を使用する。
[00354] 或いは、ＴＩＬの迅速拡大培養又は第２の拡大培養にサイトカインの組み合
わせを使用することが更に可能であり、ＩＬ－２、ＩＬ－１５及びＩＬ－２１のうちの２
つ以上の組み合わせについては、概して国際公開第２０１５／１８９３５６号及び国際公開第２０１５／１８９３５７号（本明細書によって全体として参照により明示的に援用される）に概説されるとおりである。従って、可能な組み合わせとしては、ＩＬ－２とＩＬ－１５、ＩＬ－２とＩＬ－２１、ＩＬ－１５とＩＬ－２１とＩＬ－２、ＩＬ－１５とＩＬ－２１が挙げられ、後者には多くの実施形態において特定の使用が見出される。これらの明細書に記載されるとおり、サイトカインの組み合わせを使用することは、特にリンパ球、詳細にはＴ細胞の生成に有利である。
３．抗ＣＤ３抗体
[00355] 一部の実施形態において、本明細書に記載の拡大培養方法で使用される培養
培地（ＲＥＰと称されるものを含み、例えば、図２７を参照のこと）は、抗ＣＤ３抗体も含む。抗ＣＤ３抗体をＩＬ－２と併用すると、ＴＩＬ集団においてＴ細胞活性化及び細胞分裂が誘導される。この効果は完全長抗体並びにＦａｂ及びＦ（ａｂ’）２断片で見ることができ、前者が概して好ましい；例えば、Tsoukas et al., J.Immunol.1985, 135, 1719（本明細書によって全体として参照により援用される）を参照のこと。
[00356] 当業者は理解するであろうとおり、本発明において使用が見出される好適な
抗ヒトＣＤ３抗体は、限定はされないが、ネズミ科動物、ヒト、霊長類、ラット、及びイヌ科動物抗体を含めた、様々な哺乳類からの抗ヒトＣＤ３ポリクローナル及びモノクローナル抗体を含め、幾つも存在する。詳細な実施形態では、ＯＫＴ３抗ＣＤ３抗体が使用される（Ortho-McNeil, Raritan, NJ又はMiltenyi Biotech, Auburn, CAから市販されてい
る）。
Ｅ．ステップＥ：ＴＩＬを回収する
[00357] 第２の拡大培養ステップの後、細胞は回収することができる。一部の実施形
態において、ＴＩＬは、例えば、図２７に提供されるとおり、１、２、３、４回又はそれ以上の拡大培養ステップの後に回収される。一部の実施形態において、ＴＩＬは、例えば、図２７に提供されるとおり、２回の拡大培養ステップの後に回収される。
[00358] ＴＩＬは、例えば遠心によることを含め、任意の適切な且つ無菌の方法で回
収することができる。ＴＩＬ回収方法は当該技術分野において周知であり、本プロセスと共に任意のかかる公知の方法を用いることができる。一部の実施形態において、ＴＩＬは自動化系を使用して回収される。
[00359] セルハーベスター及び／又は細胞処理系は、例えば、Fresenius Kabi、Tomtec Life Science、Perkin Elmer、及びInotech Biosystems International, Inc.を含む様々な供給源から市販されている。任意の細胞ベースのハーベスターを本方法で使用することができる。一部の実施形態において、セルハーベスター及び／又は細胞処理系は、膜ベースの細胞ハーベスターである。一部の実施形態において、細胞回収は、LOVO系（Fresenius Kabi製）などの細胞処理系を介して行われる。用語「LOVO細胞処理系」は、滅菌及び／又は閉鎖系環境で、回転膜又は回転フィルターなどの膜又はフィルターを通して細胞を含む溶液を送り出すことができ、ペレット化せず上清又は細胞培養液を除去する連続フロー及び細胞処理を可能にする、あらゆる販売業者によって製造された機器又は装置も指す。一部の実施形態において、セルハーベスター及び／又は細胞処理系は、閉鎖、無菌系で細胞分離、洗浄、流体交換、濃縮、及び／又は他の細胞処理ステップを実施することができる。
[00360] 一部の実施形態において、回収、例えば、図２７によるステップＥは、閉鎖
系バイオリアクターから実施される。一部の実施形態において、本明細書に記載されるとおり、ＴＩＬ拡大培養のために閉鎖系が用いられる。一部の実施形態において、単一のバ
イオリアクターが用いられる。一部の実施形態において、用いられる単一のバイオリアクターは、例えば、G-REX-10又はG-REX-100である。一部の実施形態において、閉鎖系バイ
オリアクターは単一のバイオリアクターである。
Ｆ．ステップＦ：最終的な製剤化及び／又は輸注バッグに移す
[00361] 図２７に例示的順序で提供されるとおりの、且つ上記及び本明細書に詳細に
概説されるとおりのステップＡ～Ｅが完了した後、細胞は患者への投与における使用のため容器に移される。一部の実施形態において、上記に記載される拡大培養方法を用いて治療上十分な数のＴＩＬが入手されると、ＴＩＬは患者への投与における使用のため容器に移される。
[00362] ある実施形態において、本開示のＡＰＣを使用して拡大培養したＴＩＬは、
医薬組成物として患者に投与される。ある実施形態において、医薬組成物は滅菌緩衝液中のＴＩＬの懸濁液である。本開示のＰＢＭＣを使用して拡大培養したＴＩＬは、当該技術分野において公知のとおりの任意の好適な経路によって投与されてよい。一部の実施形態において、Ｔ細胞は単回動脈内又は静脈内注入として投与され、これは好ましくは約３０～６０分間継続される。他の好適な投与経路としては、腹腔内、髄腔内、及びリンパ内が挙げられる。
１．医薬組成物、投薬量、及び投与レジメン
[00363] ある実施形態において、本開示の方法を使用して拡大培養したＴＩＬは、医
薬組成物として患者に投与される。ある実施形態において、医薬組成物は滅菌緩衝液中のＴＩＬの懸濁液である。本開示のＰＢＭＣを使用して拡大培養したＴＩＬは、当該技術分野において公知のとおりの任意の好適な経路によって投与されてよい。一部の実施形態において、Ｔ細胞は単回動脈内又は静脈内注入として投与され、これは好ましくは約３０～６０分間継続される。他の好適な投与経路としては、腹腔内、髄腔内、及びリンパ内投与が挙げられる。
[00364] 任意の好適な用量のＴＩＬを投与することができる。一部の実施形態におい
て、約２．３×１０１０～約１３．７×１０１０個のＴＩＬが投与され、特に癌が黒色腫である場合、平均約７．８×１０１０個のＴＩＬである。ある実施形態において、約１．２×１０１０～約４．３×１０１０個のＴＩＬが投与される。一部の実施形態において、約３×１０１０～約１２×１０１０個のＴＩＬが投与される。一部の実施形態において、約４×１０１０～約１０×１０１０個のＴＩＬが投与される。一部の実施形態において、約５×１０１０～約８×１０１０個のＴＩＬが投与される。一部の実施形態において、約６×１０１０～約８×１０１０個のＴＩＬが投与される。一部の実施形態において、約７×１０１０～約８×１０１０個のＴＩＬが投与される。一部の実施形態において、治療上有効な投薬量は約２．３×１０１０～約１３．７×１０１０個である。一部の実施形態において、治療上有効な投薬量は、特に癌が黒色腫である場合、約７．８×１０１０個のＴＩＬである。一部の実施形態において、治療上有効な投薬量は約１．２×１０１０～約４．３×１０１０個のＴＩＬである。一部の実施形態において、治療上有効な投薬量は約３×１０１０～約１２×１０１０個のＴＩＬである。一部の実施形態において、治療上有効な投薬量は約４×１０１０～約１０×１０１０個のＴＩＬである。一部の実施形態において、治療上有効な投薬量は約５×１０１０～約８×１０１０個のＴＩＬである。一部の実施形態において、治療上有効な投薬量は約６×１０１０～約８×１０１０個のＴＩＬである。一部の実施形態において、治療上有効な投薬量は約７×１０１０～約８×１０１０個のＴＩＬである。
[00365] 一部の実施形態において、本発明の医薬組成物中に提供されるＴＩＬの数は
、約１×１０６、２×１０６、３×１０６、４×１０６、５×１０６、６×１０６、７×
１０６、８×１０６、９×１０６、１×１０７、２×１０７、３×１０７、４×１０７、５×１０７、６×１０７、７×１０７、８×１０７、９×１０７、１×１０８、２×１０８、３×１０８、４×１０８、５×１０８、６×１０８、７×１０８、８×１０８、９×１０８、１×１０９、２×１０９、３×１０９、４×１０９、５×１０９、６×１０９、７×１０９、８×１０９、９×１０９、１×１０１０、２×１０１０、３×１０１０、４×１０１０、５×１０１０、６×１０１０、７×１０１０、８×１０１０、９×１０１０、１×１０１１、２×１０１１、３×１０１１、４×１０１１、５×１０１１、６×１０１１、７×１０１１、８×１０１１、９×１０１１、１×１０１２、２×１０１２、３×１０１２、４×１０１２、５×１０１２、６×１０１２、７×１０１２、８×１０１２、９×１０１２、１×１０１３、２×１０１３、３×１０１３、４×１０１３、５×１０１３、６×１０１３、７×１０１３、８×１０１３、及び９×１０１３個である。ある実施形態において、本発明の医薬組成物中に提供されるＴＩＬの数は、１×１０６～５×１０６、５×１０６～１×１０７、１×１０７～５×１０７、５×１０７～１×１０８、１×１０８～５×１０８、５×１０８～１×１０９、１×１０９～５×１０９、５×１０９～１×１０１０、１×１０１０～５×１０１０、５×１０１０～１×１０１１、５×１０１１～１×１０１２、１×１０１２～５×１０１２、及び５×１０１２～１×１０１３個の範囲である。
[00366] 一部の実施形態において、本発明の医薬組成物中に提供されるＴＩＬの濃度
は、例えば、医薬組成物の１００％、９０％、８０％、７０％、６０％、５０％、４０％、３０％、２０％、１９％、１８％、１７％、１６％、１５％、１４％、１３％、１２％、１１％、１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％、１％、０．５％、０．４％、０．３％、０．２％、０．１％、０．０９％、０．０８％、０．０７％、０．０６％、０．０５％、０．０４％、０．０３％、０．０２％、０．０１％、０．００９％、０．００８％、０．００７％、０．００６％、０．００５％、０．００４％、０．００３％、０．００２％、０．００１％、０．０００９％、０．０００８％、０．０００７％、０．０００６％、０．０００５％、０．０００４％、０．０００３％、０．０００２％又は０．０００１％ｗ／ｗ、ｗ／ｖ又はｖ／ｖ未満である。
[00367] 一部の実施形態において、本発明の医薬組成物中に提供されるＴＩＬの濃度
は、医薬組成物の９０％、８０％、７０％、６０％、５０％、４０％、３０％、２０％、１９．７５％、１９．５０％、１９．２５％ １９％、１８．７５％、１８．５０％、１８．２５％ １８％、１７．７５％、１７．５０％、１７．２５％ １７％、１６．７５％、１６．５０％、１６．２５％ １６％、１５．７５％、１５．５０％、１５．２５％
１５％、１４．７５％、１４．５０％、１４．２５％ １４％、１３．７５％、１３．５０％、１３．２５％ １３％、１２．７５％、１２．５０％、１２．２５％ １２％、１１．７５％、１１．５０％、１１．２５％ １１％、１０．７５％、１０．５０％、１０．２５％ １０％、９．７５％、９．５０％、９．２５％ ９％、８．７５％、８．５０％、８．２５％ ８％、７．７５％、７．５０％、７．２５％ ７％、６．７５％、６．５０％、６．２５％ ６％、５．７５％、５．５０％、５．２５％ ５％、４．７５％、４．５０％、４．２５％、４％、３．７５％、３．５０％、３．２５％、３％、２．７５％、２．５０％、２．２５％、２％、１．７５％、１．５０％、１２５％、１％、０．５％、０．４％、０．３％、０．２％、０．１％、０．０９％、０．０８％、０．０７％、０．０６％、０．０５％、０．０４％、０．０３％、０．０２％、０．０１％、０．００９％、０．００８％、０．００７％、０．００６％、０．００５％、０．００４％、０．００３％、０．００２％、０．００１％、０．０００９％、０．０００８％、０．０００７％、０．０００６％、０．０００５％、０．０００４％、０．０００３％、０．０００２％又は０．０００１％ｗ／ｗ、ｗ／ｖ、又はｖ／ｖ超である。
[00368] 一部の実施形態において、本発明の医薬組成物中に提供されるＴＩＬの濃度
は、医薬組成物の約０．０００１％～約５０％、約０．００１％～約４０％、約０．０１％～約３０％、約０．０２％～約２９％、約０．０３％～約２８％、約０．０４％～約２７％、約０．０５％～約２６％、約０．０６％～約２５％、約０．０７％～約２４％、約０．０８％～約２３％、約０．０９％～約２２％、約０．１％～約２１％、約０．２％～約２０％、約０．３％～約１９％、約０．４％～約１８％、約０．５％～約１７％、約０．６％～約１６％、約０．７％～約１５％、約０．８％～約１４％、約０．９％～約１２％又は約１％～約１０％ｗ／ｗ、ｗ／ｖ又はｖ／ｖの範囲である。
[00369] 一部の実施形態において、本発明の医薬組成物中に提供されるＴＩＬの濃度
は、医薬組成物の約０．００１％～約１０％、約０．０１％～約５％、約０．０２％～約４．５％、約０．０３％～約４％、約０．０４％～約３．５％、約０．０５％～約３％、約０．０６％～約２．５％、約０．０７％～約２％、約０．０８％～約１．５％、約０．０９％～約１％、約０．１％～約０．９％ｗ／ｗ、ｗ／ｖ又はｖ／ｖの範囲である。
[00370] 一部の実施形態において、本発明の医薬組成物中に提供されるＴＩＬの量は
、１０ｇ、９．５ｇ、９．０ｇ、８．５ｇ、８．０ｇ、７．５ｇ、７．０ｇ、６．５ｇ、６．０ｇ、５．５ｇ、５．０ｇ、４．５ｇ、４．０ｇ、３．５ｇ、３．０ｇ、２．５ｇ、２．０ｇ、１．５ｇ、１．０ｇ、０．９５ｇ、０．９ｇ、０．８５ｇ、０．８ｇ、０．７５ｇ、０．７ｇ、０．６５ｇ、０．６ｇ、０．５５ｇ、０．５ｇ、０．４５ｇ、０．４ｇ、０．３５ｇ、０．３ｇ、０．２５ｇ、０．２ｇ、０．１５ｇ、０．１ｇ、０．０９ｇ、０．０８ｇ、０．０７ｇ、０．０６ｇ、０．０５ｇ、０．０４ｇ、０．０３ｇ、０．０２ｇ、０．０１ｇ、０．００９ｇ、０．００８ｇ、０．００７ｇ、０．００６ｇ、０．００５ｇ、０．００４ｇ、０．００３ｇ、０．００２ｇ、０．００１ｇ、０．０００９ｇ、０．０００８ｇ、０．０００７ｇ、０．０００６ｇ、０．０００５ｇ、０．０００４ｇ、０．０００３ｇ、０．０００２ｇ、又は０．０００１ｇ以下である。
[00371] 一部の実施形態において、本発明の医薬組成物中に提供されるＴＩＬの量は
、０．０００１ｇ、０．０００２ｇ、０．０００３ｇ、０．０００４ｇ、０．０００５ｇ、０．０００６ｇ、０．０００７ｇ、０．０００８ｇ、０．０００９ｇ、０．００１ｇ、０．００１５ｇ、０．００２ｇ、０．００２５ｇ、０．００３ｇ、０．００３５ｇ、０．００４ｇ、０．００４５ｇ、０．００５ｇ、０．００５５ｇ、０．００６ｇ、０．００６５ｇ、０．００７ｇ、０．００７５ｇ、０．００８ｇ、０．００８５ｇ、０．００９ｇ、０．００９５ｇ、０．０１ｇ、０．０１５ｇ、０．０２ｇ、０．０２５ｇ、０．０３ｇ、０．０３５ｇ、０．０４ｇ、０．０４５ｇ、０．０５ｇ、０．０５５ｇ、０．０６ｇ、０．０６５ｇ、０．０７ｇ、０．０７５ｇ、０．０８ｇ、０．０８５ｇ、０．０９ｇ、０．０９５ｇ、０．１ｇ、０．１５ｇ、０．２ｇ、０．２５ｇ、０．３ｇ、０．３５ｇ、０．４ｇ、０．４５ｇ、０．５ｇ、０．５５ｇ、０．６ｇ、０．６５ｇ、０．７ｇ、０．７５ｇ、０．８ｇ、０．８５ｇ、０．９ｇ、０．９５ｇ、１ｇ、１．５ｇ、２ｇ、２．５、３ｇ、３．５、４ｇ、４．５ｇ、５ｇ、５．５ｇ、６ｇ、６．５ｇ、７ｇ、７．５ｇ、８ｇ、８．５ｇ、９ｇ、９．５ｇ、又は１０ｇ超である。
[00372] 本発明の医薬組成物中に提供されるＴＩＬは、広い投薬量範囲にわたって有
効である。正確な投薬量は、投与経路、化合物の投与形態、治療対象の性別及び年齢、治療対象の体重、並びに主治医の優先的選択及び経験に依存することになる。臨床的に確立されたＴＩＬの投薬量もまた、適宜用いられ得る。ＴＩＬの投薬量など、本明細書の方法を用いて投与される医薬組成物の量は、治療下のヒト又は哺乳類、障害又は病態の重症度、投与速度、医薬品有効成分の性質及び処方医師の裁量に依存することになる。
[00373] 一部の実施形態において、ＴＩＬは単回用量で投与されてもよい。かかる投
与は、注射、例えば静脈内注射によってもよい。一部の実施形態において、ＴＩＬは複数
回用量で投与されてもよい。投与は、年１回、２回、３回、４回、５回、６回、又は６回超であってもよい。投与は、月１回、２週間に１回、週１回、又は隔日１回であってもよい。ＴＩＬの投与は必要な限り継続されてもよい。
[00374] 一部の実施形態において、ＴＩＬの有効投薬量は、約１×１０６、２×１０
６、３×１０６、４×１０６、５×１０６、６×１０６、７×１０６、８×１０６、９×１０６、１×１０７、２×１０７、３×１０７、４×１０７、５×１０７、６×１０７、７×１０７、８×１０７、９×１０７、１×１０８、２×１０８、３×１０８、４×１０８、５×１０８、６×１０８、７×１０８、８×１０８、９×１０８、１×１０９、２×１０９、３×１０９、４×１０９、５×１０９、６×１０９、７×１０９、８×１０９、９×１０９、１×１０１０、２×１０１０、３×１０１０、４×１０１０、５×１０１０、６×１０１０、７×１０１０、８×１０１０、９×１０１０、１×１０１１、２×１０１１、３×１０１１、４×１０１１、５×１０１１、６×１０１１、７×１０１１、８×１０１１、９×１０１１、１×１０１２、２×１０１２、３×１０１２、４×１０１２、５×１０１２、６×１０１２、７×１０１２、８×１０１２、９×１０１２、１×１０１３、２×１０１３、３×１０１３、４×１０１３、５×１０１３、６×１０１３、７×１０１３、８×１０１３、及び９×１０１３個である。一部の実施形態において、ＴＩＬの有効投薬量は、１×１０６～５×１０６、５×１０６～１×１０７、１×１０７～５×１０７、５×１０７～１×１０８、１×１０８～５×１０８、５×１０８～１×１０９、１×１０９～５×１０９、５×１０９～１×１０１０、１×１０１０～５×１０１０、５×１０１０～１×１０１１、５×１０１１～１×１０１２、１×１０１２～５×１０１２、及び５×１０１２～１×１０１３個の範囲である。
[00375] 一部の実施形態において、ＴＩＬの有効投薬量は、約０．０１ｍｇ／ｋｇ～
約４．３ｍｇ／ｋｇ、約０．１５ｍｇ／ｋｇ～約３．６ｍｇ／ｋｇ、約０．３ｍｇ／ｋｇ～約３．２ｍｇ／ｋｇ、約０．３５ｍｇ／ｋｇ～約２．８５ｍｇ／ｋｇ、約０．１５ｍｇ／ｋｇ～約２．８５ｍｇ／ｋｇ、約０．３ｍｇ～約２．１５ｍｇ／ｋｇ、約０．４５ｍｇ／ｋｇ～約１．７ｍｇ／ｋｇ、約０．１５ｍｇ／ｋｇ～約１．３ｍｇ／ｋｇ、約０．３ｍｇ／ｋｇ～約１．１５ｍｇ／ｋｇ、約０．４５ｍｇ／ｋｇ～約１ｍｇ／ｋｇ、約０．５５ｍｇ／ｋｇ～約０．８５ｍｇ／ｋｇ、約０．６５ｍｇ／ｋｇ～約０．８ｍｇ／ｋｇ、約０．７ｍｇ／ｋｇ～約０．７５ｍｇ／ｋｇ、約０．７ｍｇ／ｋｇ～約２．１５ｍｇ／ｋｇ、約０．８５ｍｇ／ｋｇ～約２ｍｇ／ｋｇ、約１ｍｇ／ｋｇ～約１．８５ｍｇ／ｋｇ、約１．１５ｍｇ／ｋｇ～約１．７ｍｇ／ｋｇ、約１．３ｍｇ／ｋｇｍｇ～約１．６ｍｇ／ｋｇ、約１．３５ｍｇ／ｋｇ～約１．５ｍｇ／ｋｇ、約２．１５ｍｇ／ｋｇ～約３．６ｍｇ／ｋｇ、約２．３ｍｇ／ｋｇ～約３．４ｍｇ／ｋｇ、約２．４ｍｇ／ｋｇ～約３．３ｍｇ／ｋｇ、約２．６ｍｇ／ｋｇ～約３．１５ｍｇ／ｋｇ、約２．７ｍｇ／ｋｇ～約３ｍｇ／ｋｇ、約２．８ｍｇ／ｋｇ～約３ｍｇ／ｋｇ、又は約２．８５ｍｇ／ｋｇ～約２．９５ｍｇ／ｋｇの範囲である。
[00376] 一部の実施形態において、ＴＩＬの有効投薬量は、約１ｍｇ～約５００ｍｇ
、約１０ｍｇ～約３００ｍｇ、約２０ｍｇ～約２５０ｍｇ、約２５ｍｇ～約２００ｍｇ、約１ｍｇ～約５０ｍｇ、約５ｍｇ～約４５ｍｇ、約１０ｍｇ～約４０ｍｇ、約１５ｍｇ～約３５ｍｇ、約２０ｍｇ～約３０ｍｇ、約２３ｍｇ～約２８ｍｇ、約５０ｍｇ～約１５０ｍｇ、約６０ｍｇ～約１４０ｍｇ、約７０ｍｇ～約１３０ｍｇ、約８０ｍｇ～約１２０ｍｇ、約９０ｍｇ～約１１０ｍｇ、又は約９５ｍｇ～約１０５ｍｇ、約９８ｍｇ～約１０２ｍｇ、約１５０ｍｇ～約２５０ｍｇ、約１６０ｍｇ～約２４０ｍｇ、約１７０ｍｇ～約２３０ｍｇ、約１８０ｍｇ～約２２０ｍｇ、約１９０ｍｇ～約２１０ｍｇ、約１９５ｍｇ～約２０５ｍｇ、又は約１９８～約２０７ｍｇの範囲である。
[00377] 有効量のＴＩＬは、鼻腔内及び経皮経路、動脈内注射によること、静脈内、
腹腔内、非経口的、筋肉内、皮下、局所、移植によること、又は吸入によることを含め、同様の有用性を有する薬剤について一般に認められている任意の投与方式により、単回用量又は複数回用量のいずれで投与されてもよい。
Ｇ．任意選択の細胞生存率分析
[00378] 任意選択で、ステップＢの第１の拡大培養の後に、当該技術分野において公
知の標準アッセイを用いて細胞生存率アッセイを実施することができる。例えば、バルクＴＩＬの試料に対してトリパンブルー色素排除アッセイを行うことができ、これは死細胞を選択的に標識して生存率の評価を可能にするものである。生存率の試験に用いられる他のアッセイとしては、限定はされないが、アラマーブルーアッセイ；及びＭＴＴアッセイを挙げることができる。
１．細胞数、生存率、フローサイトメトリー
[00379] 一部の実施形態において、細胞数及び／又は生存率が測定される。限定はさ
れないが、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、及びＣＤ５６などのマーカー、並びに本明細書に開示又は記載される任意の他のものの発現を抗体によるフローサイトメトリー、例えば限定はされないが、FACSCanto（商標）フローサイトメーター（BD Biosciences）を使用してBD Bio-sciences（BD Biosciences、San Jose, CA）から市販されているものによって測定することができる。細胞は、ディスポーザブルc-chip血球計算盤（VWR、Batavia, IL）を使用して手動でカウントすることができ、及び生存率は、限定はされないがトリパンブルー染色を含め、当該技術分野において公知の任意の方法を用いて評価することができる。
[00380] ある場合には、バルクＴＩＬ集団は、以下で考察するプロトコルを用いて直
ちに凍結保存することができる。或いは、バルクＴＩＬ集団は、以下で考察するとおり、ＲＥＰに供し、次に凍結保存してもよい。同様に、療法において遺伝子修飾ＴＩＬが使用されることになる場合、バルク又はＲＥＰ ＴＩＬ集団を好適な治療のための遺伝子修飾に供してもよい。
２．細胞培養
[00381] ある実施形態において、ＴＩＬの拡大培養方法は、約５，０００ｍＬ～約２
５，０００ｍＬの細胞培地、約５，０００ｍＬ～約１０，０００ｍＬの細胞培地、又は約５，８００ｍＬ～約８，７００ｍＬの細胞培地を使用することを含み得る。ある実施形態において、ＴＩＬ数の拡大には１種類以下の細胞培養培地が使用される。任意の好適な細胞培養培地、例えば、AIM-V細胞培地（Ｌ－グルタミン、５０μＭ硫酸ストレプトマイシ
ン、及び１０μＭ硫酸ゲンタマイシン）細胞培養培地（Invitrogen、Carlsbad CA）を使
用し得る。この点に関して、本発明の方法では有利には、ＴＩＬ数の拡大に必要な培地の量及び培地の種類の数が減少する。ある実施形態において、ＴＩＬ数の拡大は、２日又は３日おき以下の頻度で細胞に新鮮細胞培養培地を加える（細胞をフィードするとも称される）ことを含み得る。ガス透過性容器内で細胞の数を拡大すると、細胞の拡大培養に必要なフィーディング頻度が減少することにより細胞の数の拡大に必要な手順が簡便になる。
[00382] ある実施形態において、第１及び／又は第２のガス透過性容器内の細胞培地
はろ過されていない。ろ過されていない細胞培地を使用すると、細胞の数の拡大に必要な手順が簡便になり得る。ある実施形態において、第１及び／又は第２のガス透過性容器内の細胞培地はβ－メルカプトエタノール（ＢＭＥ）を含まない。
[00383] ある実施形態において、哺乳類から腫瘍組織試料を入手すること；細胞培地
が中に入った第１のガス透過性容器内で腫瘍組織試料を培養すること；腫瘍組織試料からＴＩＬを入手すること；ａＡＰＣを使用して細胞培地が中に入った第２のガス透過性容器内でＴＩＬ数を約１４～約４２日間、例えば約２８日間拡大することを含む本方法の所要
期間。
[00384] ある実施形態において、ＴＩＬはガス透過性容器内で拡大培養される。ガス
透過性容器は、米国特許出願公開第２００５／０１０６７１７ Ａ１号（この開示は参照により本明細書に援用される）に記載されるものを含め、当該技術分野において公知の方法、組成物、及び装置を用いたＰＢＭＣを使用したＴＩＬの拡大培養に用いられている。ある実施形態において、ＴＩＬはガス透過性バッグ内で拡大培養される。ある実施形態において、ＴＩＬは、Xuri Cell Expansion System W25（GE Healthcare）など、ガス透過
性バッグ内でＴＩＬを拡大培養する細胞拡大培養システムを使用して拡大培養される。ある実施形態において、ＴＩＬは、Xuri Cell Expansion System W5（GE Healthcare）としても知られるWAVE Bioreactor Systemなど、ガス透過性バッグ内でＴＩＬを拡大培養する細胞拡大培養システムを使用して拡大培養される。ある実施形態において、細胞拡大培養システムは、約１００ｍＬ、約２００ｍＬ、約３００ｍＬ、約４００ｍＬ、約５００ｍＬ、約６００ｍＬ、約７００ｍＬ、約８００ｍＬ、約９００ｍＬ、約１Ｌ、約２Ｌ、約３Ｌ、約４Ｌ、約５Ｌ、約６Ｌ、約７Ｌ、約８Ｌ、約９Ｌ、及び約１０Ｌからなる群から選択される容積を有するガス透過性細胞バッグを含む。ある実施形態において、ＴＩＬはG-Rexフラスコ（Wilson Wolf Manufacturingから市販されている）において拡大培養することができる。かかる実施形態は、細胞集団を約５×１０５細胞／ｃｍ２から１０×１０６～３０×１０６細胞／ｃｍ２へと拡大培養することを可能にする。ある実施形態において、この拡大培養は、細胞に新鮮な細胞培養培地を加える（細胞をフィードするとも称される）ことなく行われる。ある実施形態において、これは、GRexフラスコ内に約１０ｃｍの高さの培地がある限りフィーディングなしである。ある実施形態において、これにフィーディングはないが、１つ以上のサイトカインが加えられる。ある実施形態において、サイトカインは、サイトカインを培地と混合する必要は一切なしにボーラスとして加えることができる。かかる容器、装置、及び方法は当該技術分野において公知で、ＴＩＬの拡大培養に用いられており、米国特許出願公開第２０１４／０３７７７３９Ａ１号、国際公開第２０１４／２１００３６ Ａ１号、米国特許出願公開第２０１３／０１１５６１７ Ａ１号、国際公開第２０１３／１８８４２７ Ａ１号、米国特許出願公開第２０１１／０１３６２２８ Ａ１号、米国特許第８，８０９，０５０ Ｂ２号、国際公開第２０１１／０７２０８８ Ａ２号、米国特許出願公開第２０１６／０２０８２１６ Ａ１号、米国特許出願公開第２０１２／０２４４１３３ Ａ１号、国際公開第２０１２／１２９２０１ Ａ１号、米国特許出願公開第２０１３／０１０２０７５ Ａ１号、米国特許第８，９５６，８６０ Ｂ２号、国際公開第２０１３／１７３８３５ Ａ１号、米国特許出願公開第２０１５／０１７５９６６ Ａ１号（これらの開示は参照により本明細書に援用される）に記載されるものが含まれる。かかるプロセスはまた、Jin et al., J. Immunotherapy, 2012, 35:283-292にも記載されている。任意選択のＴＩＬ遺伝子改変
[00385] 一部の実施形態において、ＴＩＬは任意選択で、限定はされないが、高親和
性Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）、例えば、ＭＡＧＥ－１、ＨＥＲ２、若しくはＮＹ－ＥＳＯ－１などの腫瘍関連抗原を標的とするＴＣＲ、又は腫瘍関連細胞表面分子（例えばメソテリン）若しくは系統限定的細胞表面分子（例えばＣＤ１９）に結合するキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を含め、追加の機能性を含むように遺伝子改変される。
Ｈ．任意選択のＴＩＬ凍結保存
[00386] 上記で考察したとおり、且つ図２７に提供したとおりステップＡ～Ｅにおい
て例示したとおり、ＴＩＬ拡大培養プロセス全体を通じて数々の時点で凍結保存を行うことができる。一部の実施形態において、（例えば、図２７のステップＤに係るとおり）第２の拡大培養後の拡大培養ＴＩＬ集団が凍結保存されてもよい。凍結保存は、概して、凍結溶液、例えば８５％補体不活性化ＡＢ血清及び１５％ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）の中にＴＩＬ集団を置くことにより達成し得る。この溶液中の細胞を極低温バイアルに
入れ、－８０℃で２４時間貯蔵し、任意選択で凍結保存のため気体窒素フリーザーに移す。Sadeghi, et al., Acta Oncologica 2013, 52, 978-986を参照のこと。一部の実施形態において、ＴＩＬは５％ＤＭＳＯに凍結保存される。一部の実施形態において、ＴＩＬは細胞培養培地＋５％ＤＭＳＯに凍結保存される。一部の実施形態において、ＴＩＬは、実施例８及び９に提供される方法に従い凍結保存される。
[00387] 適切な場合、細胞をフリーザーから取り出し、３７℃の水浴中で溶液の約５
分の４が解凍されるまで解凍する。細胞は概して完全培地中に再懸濁され、任意選択で１回以上洗浄される。一部の実施形態では、当該技術分野において公知のとおり解凍ＴＩＬをカウントし、生存率に関して評価することができる。
Ｉ．拡大培養したＴＩＬの表現型特徴
[00388] 一部の実施形態において、ＴＩＬは拡大培養後に、本明細書及び実施例に記
載されるものを含め、多数の表現型マーカーの発現に関して分析される。ある実施形態では、１つ以上の表現型マーカーの発現が調べられる。一部の実施形態において、ＴＩＬの表現型特徴は、ステップＢの第１の拡大培養後に分析される。一部の実施形態において、ＴＩＬの表現型特徴は、ステップＣの移行中に分析される。一部の実施形態において、ＴＩＬの表現型特徴は、ステップＣに係る移行中且つ凍結保存後に分析される。一部の実施形態において、ＴＩＬの表現型特徴は、ステップＤに係る第２の拡大培養後に分析される。一部の実施形態において、ＴＩＬの表現型特徴は、ステップＤに係る２回以上の拡大培養後に分析される。一部の実施形態において、マーカーは、ＴＣＲａｂ（すなわち、ＴＣＲα／β）、ＣＤ５７、ＣＤ２８、ＣＤ４、ＣＤ２７、ＣＤ５６、ＣＤ８ａ、ＣＤ４５ＲＡ、ＣＤ８ａ、ＣＣＲ７、ＣＤ４、ＣＤ３、ＣＤ３８、及びＨＬＡ－ＤＲからなる群から選択される。一部の実施形態において、マーカーは、ＴＣＲａｂ（すなわち、ＴＣＲα／β）、ＣＤ５７、ＣＤ２８、ＣＤ４、ＣＤ２７、ＣＤ５６、及びＣＤ８ａからなる群から選択される。ある実施形態において、マーカーは、ＣＤ４５ＲＡ、ＣＤ８ａ、ＣＣＲ７、ＣＤ４、ＣＤ３、ＣＤ３８、及びＨＬＡ－ＤＲからなる群から選択される。一部の実施形態では、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、又は１４個のマーカーの発現が調べられる。一部の実施形態では、各群から１つ以上のマーカーからの発現が調べられる。一部の実施形態では、解凍ＴＩＬと比較したとき新鮮ＴＩＬにおいてＨＬＡ－ＤＲ、ＣＤ３８、及びＣＤ６９発現のうちの１つ以上が維持される（即ち、統計的に有意な差を呈しない）。一部の実施形態では、解凍ＴＩＬにおいてＴＩＬの活性化状態が維持される。
[00389] ある実施形態において、１つ以上の調節マーカーの発現が測定される。一部
の実施形態において、調節マーカーは、ＣＤ１３７、ＣＤ８ａ、Ｌａｇ３、ＣＤ４、ＣＤ３、ＰＤ－１、ＴＩＭ－３、ＣＤ６９、ＣＤ８ａ、ＴＩＧＩＴ、ＣＤ４、ＣＤ３、ＫＬＲＧ１、及びＣＤ１５４からなる群から選択される。一部の実施形態において、調節マーカーは、ＣＤ１３７、ＣＤ８ａ、Ｌａｇ３、ＣＤ４、ＣＤ３、ＰＤ－１、及びＴＩＭ－３からなる群から選択される。一部の実施形態において、調節マーカーは、ＣＤ６９、ＣＤ８ａ、ＴＩＧＩＴ、ＣＤ４、ＣＤ３、ＫＬＲＧ１、及びＣＤ１５４からなる群から選択される。一部の実施形態において、調節分子発現は新鮮ＴＩＬと比較したとき解凍ＴＩＬにおいて低下する。一部の実施形態において、調節分子ＬＡＧ－３及びＴＩＭ－３の発現は新鮮ＴＩＬと比較したとき解凍ＴＩＬにおいて低下する。一部の実施形態において、ＣＤ４、ＣＤ８、ＮＫ、ＴＣＲαβ発現に有意な差はない。一部の実施形態において、解凍ＴＩＬと比較したとき新鮮ＴＩＬにおいてＣＤ４、ＣＤ８、ＮＫ、ＴＣＲαβ発現、及び／又はメモリーマーカーに有意な差はない。一部の実施形態において、例えば図２７に例示されているように、本明細書で提供される方法によって作製されるＴＩＬ、及び／又は例えば、図２７で具体化されているもの以外の方法を含む本明細書で提供する以外の他の方法を使用して調製されたＴＩＬ間のＣＤ４、ＣＤ８、ＮＫ、ＴＣＲαβ発現には有意な差は
無い。
[00390] 一部の実施形態において、第１のＴＩＬ集団、第２のＴＩＬ集団、第３のＴ
ＩＬ集団、回収したＴＩＬ集団、及び／又はＣＤ４、ＣＤ８、及び／又はＮＫ、ＴＣＲαβ発現に基づく治療用ＴＩＬ集団の選択は、上記で考察した、又は図２７の例を含むあらゆるステップ中には実施されない。一部の実施形態において、ＣＤ４、ＣＤ８、及び／又はＮＫ、ＴＣＲαβに基づく第１のＴＩＬ集団の選択は実施されない。一部の実施形態において、ＣＤ４、ＣＤ８、及び／又はＮＫ、ＴＣＲαβ発現に基づく第２のＴＩＬ集団の選択は実施されない。一部の実施形態において、ＣＤ４、ＣＤ８、及び／又はＮＫ、ＴＣＲαβ発現に基づく第３のＴＩＬ集団の選択は実施されない。一部の実施形態において、ＣＤ４、ＣＤ８、及び／又はＮＫ、ＴＣＲαβ発現に基づく回収したＴＩＬ集団の選択は実施されない。一部の実施形態において、ＣＤ４、ＣＤ８、及び／又はＮＫ、ＴＣＲαβ発現に基づく治療用ＴＩＬ集団の選択は実施されない。
[00391] ある実施形態において、第１のＴＩＬ集団、第２のＴＩＬ集団、第３のＴＩ
Ｌ集団、又はＣＤ４、ＣＤ８、及び／又はＮＫ、ＴＣＲαβ発現に基づく回収ＴＩＬの選択は、腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）を治療用ＴＩＬ集団に拡大培養する方法のステップ（ａ）～（ｆ）のいずれの間も実施されず、このステップは
（ａ） 患者から得られた腫瘍試料を複数の腫瘍断片に処理することにより、患者から切除された腫瘍から第１のＴＩＬ集団を得ること；
（ｂ） 腫瘍断片を閉鎖系に加えること；
（ｃ） ＩＬ－２を含む細胞培養培地で第１のＴＩＬ集団を培養し第２のＴＩＬ集団を生じさせることにより第１の拡大培養を実施することであって、第１の拡大培養は、第１のガス透過性表面積を提供する閉鎖型容器内で実施され、第１の拡大培養は、第２のＴＩＬ集団を得るため約３～１４日間行われ、第２のＴＩＬ集団は、第１のＴＩＬ集団よりも少なくとも５０倍数が多く、ステップ（ｂ）からステップ（ｃ）への移行は系を開放せずに発生すること；
（ｄ） 第２のＴＩＬ集団の細胞培養培地に追加のＩＬ－２、ＯＫＴ－３、及び抗原提示細胞（ＡＰＣ）を添加することにより第２の拡大培養を実施して第３のＴＩＬ集団を生じさせることであって、第３のＴＩＬ集団を入手するために第２の拡大培養が約７～１４日間実施され、第３のＴＩＬ集団は、第２のＴＩＬ集団と比べてエフェクターＴ細胞及び／又はセントラルメモリーＴ細胞の増加サブ集団を含む治療用ＴＩＬ集団であり、第２の拡大培養は第２のガス透過性表面積を提供する閉鎖型容器で行われ、及びステップ（ｃ）からステップ（ｄ）への移行は系を開放せずに発生すること；
（ｅ） ステップ（ｄ）から得られた治療用ＴＩＬ集団を回収することであって、ステップ（ｄ）からステップ（ｅ）への移行は、系を開放せずに発生すること；及び
（ｆ） ステップ（ｅ）で回収したＴＩＬ集団を輸注バッグに移すことであって、ステップ（ｅ）から（ｆ）への移行は、系を開放せずに発生すること
を含む。
[00392] ある実施形態において、第１のＴＩＬ集団、第２のＴＩＬ集団、第３のＴＩ
Ｌ集団、又はＣＤ４、ＣＤ８、及び／又はＮＫ、ＴＣＲαβ発現に基づく回収ＴＩＬの選択は、癌を有する対象の処置を行う方法のステップ（ａ）～（ｈ）のいずれの間も実施されず、この拡大培養した腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）を投与することを含む方法は、
（ａ） 対象から得られた腫瘍試料を複数の腫瘍断片に処理することにより、患者から切除された腫瘍から第１のＴＩＬ集団を得ること；
（ｂ） 腫瘍断片を閉鎖系に加えること；
（ｃ） ＩＬ－２を含む細胞培養培地で第１のＴＩＬ集団を培養し第２のＴＩＬ集団を生じさせることにより第１の拡大培養を実施することであって、第１の拡大培養は、第１のガス透過性表面積を提供する閉鎖型容器内で実施され、第１の拡大培養は、第２のＴＩＬ
集団を得るため約３～１４日間行われ、第２のＴＩＬ集団は、第１のＴＩＬ集団よりも少なくとも５０倍数が多く、ステップ（ｂ）からステップ（ｃ）への移行は系を開放せずに発生すること；
（ｄ） 第２のＴＩＬ集団の細胞培養培地に追加のＩＬ－２、ＯＫＴ－３、及び抗原提示細胞（ＡＰＣ）を添加することにより第２の拡大培養を実施して第３のＴＩＬ集団を生じさせることであって、第３のＴＩＬ集団を入手するために第２の拡大培養が約７～１４日間実施され、第３のＴＩＬ集団は、第２のＴＩＬ集団と比べてエフェクターＴ細胞及び／又はセントラルメモリーＴ細胞の増加サブ集団を含む治療用ＴＩＬ集団であり、第２の拡大培養は第２のガス透過性表面積を提供する閉鎖型容器で行われ、及びステップ（ｃ）からステップ（ｄ）への移行は系を開放せずに発生すること；
（ｅ） ステップ（ｄ）から得られた治療用ＴＩＬ集団を回収することであって、ステップ（ｄ）からステップ（ｅ）への移行は、系を開放せずに発生すること；及び
（ｆ） ステップ（ｅ）で回収したＴＩＬ集団を輸注バッグに移すことであって、ステップ（ｅ）から（ｆ）への移行は、系を開放せずに発生すること；
（ｇ） 凍結保存プロセスを使用して、ステップ（ｆ）で回収したＴＩＬ集団を含む輸注バッグを任意選択で凍結保存すること；及び
（ｈ） ステップ（ｇ）における輸注バッグから治療上有効な投薬量の第３のＴＩＬ集団を患者に投与すること
を含む。
[00393] 一部の実施形態において、メモリーマーカーは、ＣＣＲ７及びＣＤ６２Ｌか
らなる群から選択される。
[00394] 一部の実施形態において、解凍ＴＩＬと比較したときの新鮮ＴＩＬの生存率
は、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、又は少なくとも９８％である。一部の実施形態において、新鮮ＴＩＬ及び解凍ＴＩＬの両方の生存率が、７０％超、７５％超、８０％超、８５％超、９０％超、９５％超、又は９８％超である。一部の実施形態において、新鮮産物及び解凍産物の両方の生存率が、８０％超、８１％超、８２％超、８３％超、８４％超、８５％超、８６％超、８７％超、８８％超、８９％超、又は９０％超である。一部の実施形態において、新鮮産物及び解凍産物の両方の生存率が８６％超である。
[00395] ある実施形態において、再刺激ＴＩＬはまた、サイトカイン遊離アッセイを
用いてサイトカイン遊離に関しても判定することができる。一部の実施形態において、ＴＩＬは、ＯＫＴ３か又は自己腫瘍消化物との共培養かのいずれかによる刺激に応答したインターフェロン－７（ＩＦＮ－７）分泌に関して判定することができる。例えば、ＯＫＴ３刺激を用いる実施形態では、ＴＩＬを広範に洗浄し、リン酸緩衝生理食塩水で希釈した０．１又は１．０μｇ／ｍＬのＯＫＴ３をプレコートした９６ウェル平底プレートに０．２ｍＬ ＣＭ中１×１０５細胞でデュプリケートウェルを調製する。一晩インキュベートした後、上清を回収し、上清中のＩＦＮ－７をＥＬＩＳＡ（Pierce/Endogen、Woburn, MA）によって測定する。共培養アッセイについては、１×１０５個のＴＩＬ細胞を９６ウェルプレートに自己腫瘍細胞と共に（１：１比）置く。２４時間のインキュベーション後、上清を回収し、ＩＦＮ－７遊離を例えばＥＬＩＳＡによって定量化することができる。
[00396] 細胞表面バイオマーカーのフローサイトメトリー分析：細胞表面マーカーの
フローサイトメトリー分析のため、ＴＩＬ試料をアリコートに分けた。例えば実施例７、８、及び９を参照のこと。
[00397] 一部の実施形態において、ＴＩＬは様々な調節マーカーに関して判定される
ものである。一部の実施形態において、調節マーカーは、ＴＣＲα／β、ＣＤ５６、ＣＤ
２７、ＣＤ２８、ＣＤ５７、ＣＤ４５ＲＡ、ＣＤ４５ＲＯ、ＣＤ２５、ＣＤ１２７、ＣＤ９５、ＩＬ－２Ｒ－、ＣＣＲ７、ＣＤ６２Ｌ、ＫＬＲＧ１、及びＣＤ１２２からなる群から選択される。一部の実施形態において、調節マーカーはＴＣＲα／βである。一部の実施形態において、調節マーカーはＣＤ５６である。一部の実施形態において、調節マーカーはＣＤ２７である。一部の実施形態において、調節マーカーはＣＤ２８である。一部の実施形態において、調節マーカーはＣＤ５７である。一部の実施形態において、調節マーカーはＣＤ４５ＲＡである。一部の実施形態において、調節マーカーはＣＤ４５ＲＯである。一部の実施形態において、調節マーカーはＣＤ２５である。一部の実施形態において、調節マーカーはＣＤ１２７である。一部の実施形態において、調節マーカーはＣＤ９５である。一部の実施形態において、調節マーカーはＩＬ－２Ｒ－である。一部の実施形態において、調節マーカーはＣＣＲ７である。一部の実施形態において、調節マーカーはＣＤ６２Ｌである。一部の実施形態において、調節マーカーはＫＬＲＧ１である。一部の実施形態において、調節マーカーはＣＤ１２２である。
[00398] 一実施形態において、拡大培養されたＴＩＬは、本明細書及び実施例に記載
されるものを含め、多数の表現型マーカーの発現に関して分析される。ある実施形態では、１つ以上の表現型マーカーの発現が調べられる。一部の実施形態において、マーカーは、ＴＣＲａｂ（即ち、ＴＣＲα／β）、ＣＤ５７、ＣＤ２８、ＣＤ４、ＣＤ２７、ＣＤ５６、ＣＤ８ａ、ＣＤ４５ＲＡ、ＣＤ８ａ、ＣＣＲ７、ＣＤ４、ＣＤ３、ＣＤ３８、及びＨＬＡ－ＤＲからなる群から選択される。一部の実施形態において、マーカーは、ＴＣＲａｂ（即ち、ＴＣＲα／β）、ＣＤ５７、ＣＤ２８、ＣＤ４、ＣＤ２７、ＣＤ５６、及びＣＤ８ａからなる群から選択される。ある実施形態において、マーカーは、ＣＤ４５ＲＡ、ＣＤ８ａ、ＣＣＲ７、ＣＤ４、ＣＤ３、ＣＤ３８、及びＨＬＡ－ＤＲからなる群から選択される。一部の実施形態では、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、又は１４個のマーカーの発現が調べられる。一部の実施形態では、各群から１つ以上のマーカーからの発現が調べられる。一部の実施形態では、解凍ＴＩＬと比較したとき新鮮ＴＩＬにおいてＨＬＡ－ＤＲ、ＣＤ３８、及びＣＤ６９発現のうちの１つ以上が維持される（即ち、統計的に有意な差を呈しない）。一部の実施形態では、解凍ＴＩＬにおいてＴＩＬの活性化状態が維持される。
[00399] ある実施形態において、１つ以上の調節マーカーの発現が測定される。一部
の実施形態において、調節マーカーは、ＣＤ１３７、ＣＤ８ａ、Ｌａｇ３、ＣＤ４、ＣＤ３、ＰＤ１、ＴＩＭ－３、ＣＤ６９、ＣＤ８ａ、ＴＩＧＩＴ、ＣＤ４、ＣＤ３、ＫＬＲＧ１、及びＣＤ１５４からなる群から選択される。一部の実施形態において、調節マーカーは、ＣＤ１３７、ＣＤ８ａ、Ｌａｇ３、ＣＤ４、ＣＤ３、ＰＤ１、及びＴＩＭ－３からなる群から選択される。一部の実施形態において、調節マーカーは、ＣＤ６９、ＣＤ８ａ、ＴＩＧＩＴ、ＣＤ４、ＣＤ３、ＫＬＲＧ１、及びＣＤ１５４からなる群から選択される。一部の実施形態において、調節分子発現は新鮮ＴＩＬと比較したとき解凍ＴＩＬにおいて低下する。一部の実施形態において、調節分子ＬＡＧ－３及びＴＩＭ－３の発現は新鮮ＴＩＬと比較したとき解凍ＴＩＬにおいて低下する。一部の実施形態において、ＣＤ４、ＣＤ８、ＮＫ、ＴＣＲαβ発現に有意な差はない。一部の実施形態において、解凍ＴＩＬと比較したとき新鮮ＴＩＬにおいてＣＤ４、ＣＤ８、ＮＫ、ＴＣＲαβ発現、及び／又はメモリーマーカーに有意な差はない。
[00400] 一部の実施形態において、メモリーマーカーは、ＣＣＲ７及びＣＤ６２Ｌか
らなる群から選択される。
[00401] 一部の実施形態において、解凍ＴＩＬと比較したときの新鮮ＴＩＬの生存率
は、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、又は少なくとも９８％である。一部の実施形態におい
て、新鮮ＴＩＬ及び解凍ＴＩＬの両方の生存率が、７０％超、７５％超、８０％超、８５％超、９０％超、９５％超、又は９８％超である。一部の実施形態において、新鮮産物及び解凍産物の両方の生存率が、８０％超、８１％超、８２％超、８３％超、８４％超、８５％超、８６％超、８７％超、８８％超、８９％超、又は９０％超である。一部の実施形態において、新鮮産物及び解凍産物の両方の生存率が８６％超である。
[00402] ある実施形態において、再刺激ＴＩＬはまた、サイトカイン遊離アッセイを
用いてサイトカイン遊離に関しても判定することができる。一部の実施形態において、ＴＩＬは、ＯＫＴ３か又は自己腫瘍消化物との共培養かのいずれかによる刺激に応答したインターフェロン－７（ＩＦＮ－７）分泌に関して判定することができる。例えば、ＯＫＴ３刺激を用いる実施形態では、ＴＩＬを広範に洗浄し、リン酸緩衝生理食塩水で希釈した０．１又は１．０μｇ／ｍＬのＯＫＴ３をプレコートした９６ウェル平底プレートに０．２ｍＬ ＣＭ中１×１０５細胞でデュプリケートウェルを調製する。一晩インキュベートした後、上清を回収し、上清中のＩＦＮ－７をＥＬＩＳＡ（Pierce/Endogen、Woburn, MA）によって測定する。共培養アッセイについては、１×１０５個のＴＩＬ細胞を９６ウェルプレートに自己腫瘍細胞と共に置く（１：１の比率）。２４時間のインキュベーション後、上清を回収し、ＩＦＮ－７遊離を例えばＥＬＩＳＡによって定量化することができる。
[00403] 一部の実施形態において、表現型の特徴付けは、凍結保存後に調べられる。
Ｊ．拡大培養したＴＩＬの代謝的健康
[00404] 再刺激したＴＩＬは、新鮮に採取したＴＩＬ及び／又は解凍後のＴＩＬのい
ずれと比較したときも、基礎解糖の有意な亢進によって特徴付けられる。ある実施形態において、第１のＴＩＬ集団、第２のＴＩＬ集団、第３のＴＩＬ集団、回収ＴＩＬ集団、及び／又はＣＤ８発現に基づく治療用ＴＩＬ集団の選択は、上記で考察した、又は図２７の例を含むあらゆるステップ中には実施されない。一部の実施形態において、ＣＤ８発現に基づく第１のＴＩＬ集団の選択は実施されない。一部の実施形態において、ＣＤ８発現に基づく第２のＴＩＬ集団の選択は実施されない。一部の実施形態において、ＣＤ８発現に基づく第３のＴＩＬ集団の選択は実施されない。一部の実施形態において、ＣＤ８発現に基づく回収ＴＩＬ集団の選択は実施されない。一部の実施形態において、ＣＤ８発現に基づく治療用ＴＩＬ集団の選択は実施されない。
[00405] ある実施形態において、第１のＴＩＬ集団、第２のＴＩＬ集団、第３のＴＩ
Ｌ集団、又はＣＤ８発現に基づく回収ＴＩＬの選択は、腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）を治療用ＴＩＬ集団に拡大培養する方法のステップ（ａ）～（ｆ）のいずれの間も実施されず、このステップは、
（ａ） 患者から得られた腫瘍試料を複数の腫瘍断片に処理することにより、患者から切除された腫瘍から第１のＴＩＬ集団を得ること；
（ｂ） 腫瘍断片を閉鎖系に加えること；
（ｃ） ＩＬ－２を含む細胞培養培地で第１のＴＩＬ集団を培養し第２のＴＩＬ集団を生じさせることにより第１の拡大培養を実施することであって、第１の拡大培養は、第１ガス透過性表面積を提供する閉鎖型容器内で実施され、第１の拡大培養は、第２のＴＩＬ集団を得るため約３～１４日間行われ、第２のＴＩＬ集団は、第１のＴＩＬ集団よりも少なくとも５０倍数が多く、ステップ（ｂ）からステップ（ｃ）への移行は系を開放せずに発生すること；
（ｄ） 第２のＴＩＬ集団の細胞培養培地に追加のＩＬ－２、ＯＫＴ－３、及び抗原提示細胞（ＡＰＣ）を添加することにより第２の拡大培養を実施して第３のＴＩＬ集団を生じさせることであって、第３のＴＩＬ集団を入手するために第２の拡大培養が約７～１４日間実施され、第３のＴＩＬ集団は、第２のＴＩＬ集団と比べてエフェクターＴ細胞及び／
又はセントラルメモリーＴ細胞の増加サブ集団を含む治療用ＴＩＬ集団であり、第２の拡大培養は第２のガス透過性表面積を提供する閉鎖型容器で行われ、及びステップ（ｃ）からステップ（ｄ）への移行は系を開放せずに発生すること；
（ｅ） ステップ（ｄ）から得られた治療用ＴＩＬ集団を回収することであって、ステップ（ｄ）からステップ（ｅ）への移行は、系を開放せずに発生すること；及び
（ｆ） ステップ（ｅ）で回収したＴＩＬ集団を輸注バッグに移すことであって、ステップ（ｅ）から（ｆ）への移行は、系を開放せずに発生すること
を含む。
[00406] ある実施形態において、第１のＴＩＬ集団、第２のＴＩＬ集団、第３のＴＩ
Ｌ集団、又はＣＤ８発現に基づく回収ＴＩＬの選択は、癌を有する対象の処置を行う方法のステップ（ａ）～（ｈ）のいずれの間も実施されず、この拡大培養した腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）を投与することを含む方法は、
（ａ） 対象から得られた腫瘍試料を複数の腫瘍断片に処理することにより、患者から切除された腫瘍から第１のＴＩＬ集団を得ること；
（ｂ） 腫瘍断片を閉鎖系に加えること；
（ｃ） ＩＬ－２を含む細胞培養培地で第１のＴＩＬ集団を培養し第２のＴＩＬ集団を生じさせることにより第１の拡大培養を実施することであって、第１の拡大培養は、第１のガス透過性表面積を提供する閉鎖型容器内で実施され、第１の拡大培養は、第２のＴＩＬ集団を得るため約３～１４日間行われ、第２のＴＩＬ集団は、第１のＴＩＬ集団よりも少なくとも５０倍数が多く、ステップ（ｂ）からステップ（ｃ）への移行は系を開放せずに発生すること；
（ｄ） 第２のＴＩＬ集団の細胞培養培地に追加のＩＬ－２、ＯＫＴ－３、及び抗原提示細胞（ＡＰＣ）を添加することにより第２の拡大培養を実施して第３のＴＩＬ集団を生じさせることであって、第３のＴＩＬ集団を入手するために第２の拡大培養が約７～１４日間実施され、第３のＴＩＬ集団は、第２のＴＩＬ集団と比べてエフェクターＴ細胞及び／又はセントラルメモリーＴ細胞の増加サブ集団を含むＴ細胞治療用ＴＩＬ集団であり、第２の拡大培養は第２のガス透過性表面積を提供する閉鎖型容器で行われ、及びステップ（ｃ）からステップ（ｄ）への移行は系を開放せずに発生すること；
（ｅ） ステップ（ｄ）から得られた治療用ＴＩＬ集団を回収することであって、ステップ（ｄ）からステップ（ｅ）への移行は、系を開放せずに発生すること；及び
（ｆ） ステップ（ｅ）で回収したＴＩＬ集団を輸注バッグに移すことであって、ステップ（ｅ）から（ｆ）への移行は、系を開放せずに発生すること；
（ｇ） 凍結保存プロセスを使用して、ステップ（ｆ）で回収したＴＩＬ集団を含む輸注バッグを任意選択で凍結保存すること；及び
（ｈ） ステップ（ｇ）における輸注バッグから治療上有効な投薬量の第３のＴＩＬ集団を患者に投与すること
を含む。
[00407] 本明細書に記載された方法によって調製されたＴＩＬは、例えば、新鮮に採
取したＴＩＬ及び／又は、例えば、図２７に具体化された方法以外の方法を含む、本明細書で提供する以外の方法を使用して調製されたＴＩＬと比較して、基礎解糖の有意な差に特徴付けられる。ある実施形態において、第１のＴＩＬ集団、第２のＴＩＬ集団、第３のＴＩＬ集団、回収ＴＩＬ集団、及び／又はＣＤ８発現に基づく治療用ＴＩＬ集団の選択は、上記で考察した、又は図２７の例を含むあらゆるステップ中には実施されない。一部の実施形態において、ＣＤ８発現に基づく第１のＴＩＬ集団の選択は実施されない。一部の実施形態において、ＣＤ８発現に基づく第２のＴＩＬ集団の選択は実施されない。一部の実施形態において、ＣＤ８発現に基づく第３のＴＩＬ集団の選択は実施されない。一部の実施形態において、ＣＤ８発現に基づく回収ＴＩＬ集団の選択は実施されない。一部の実施形態において、ＣＤ８発現に基づく治療用ＴＩＬ集団の選択は実施されない。ある実施
形態において、第１のＴＩＬ集団、第２のＴＩＬ集団、第３のＴＩＬ集団、又はＣＤ８発現に基づく回収ＴＩＬの選択は、ステップ（ａ）～（ｈ）のいずれの間も実施されない。
[00408] 本開示の異なる方法で拡大培養したＴＩＬについて、予備呼吸容量（ＳＲＣ
）及び解糖予備能を判定することができる。Seahorse XF細胞ミトストレステストは、ミ
トコンドリアにおける電子伝達鎖の成分を標的にする呼吸調節因子を用いて細胞の酸素消費速度（ＯＣＲ）を直接測定することによりミトコンドリア機能を測定する。試験化合物（オリゴマイシン、ＦＣＣＰ、及びロテノンとアンチマイシンＡとの混合物、以下に記載する）を連続的に注入して、それぞれ、ＡＴＰ産生、最大呼吸、及び非ミトコンドリア呼吸を測定する。次にこれらのパラメータ及び基礎呼吸を使用してプロトンリーク及び予備呼吸容量を計算する。各調節因子が電子伝達鎖の特異的成分を標的にする。オリゴマイシンはＡＴＰシンターゼ（複合体Ｖ）を阻害し、オリゴマイシン注射後のＯＣＲの低下は、細胞性ＡＴＰ産生に関連するミトコンドリア呼吸と相関する。カルボニルシアニド－４（トリフルオロメトキシ）フェニルヒドラゾン（ＦＣＣＰ）は、プロトン勾配を破綻させてミトコンドリア膜電位を破壊する脱共役剤である。結果として、電子伝達鎖を通じた電子流が抑制されず、複合体ＩＶによって酸素が最大限に消費される。ひいてはＦＣＣＰの刺激を受けたＯＣＲを使用して、最大呼吸と基礎呼吸との差として定義される予備呼吸容量を計算することができる。予備呼吸容量（ＳＲＣ）は、細胞がエネルギー要求の増加に応答する能力の尺度である。第３の注射は、複合体Ｉ阻害薬であるロテノンと、複合体ＩＩＩ阻害薬であるアンチマイシンＡとの混合物である。この組み合わせはミトコンドリア呼吸を遮断し、ミトコンドリア外部の過程によってドライブされる非ミトコンドリア呼吸の計算を可能にする。一部の実施形態において、比較は、例えば、新鮮に採取したＴＩＬ及び／又は例えば、図２７に具体化された方法以外の方法を含む、本明細書で提供する以外の方法を使用して調製されたＴＩＬに対するものである。
[00409] 一部の実施形態において、代謝アッセイは基礎呼吸である。一般に、第２の
拡大培養ＴＩＬは、新鮮に採取したＴＩＬ及び／又は例えば、図２７に具体化された方法以外の方法を含む、本明細書で提供する以外の方法を使用して調製されたＴＩＬの基礎呼吸速度の少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、又は少なくとも９９％の基礎呼吸速度を有する。一部の実施形態において、基礎呼吸速度は、新鮮に採取したＴＩＬ及び／又は例えば、図２７に具体化された方法以外の方法を含む、本明細書で提供する以外の方法を使用して調製されたＴＩＬの基礎呼吸速度の約５０％～約９９％である。一部の実施形態において、基礎呼吸速度は、新鮮に採取したＴＩＬ及び／又は例えば、図２７に具体化された方法以外の方法を含む、本明細書で提供する以外の方法を使用して調製されたＴＩＬの基礎呼吸速度の約６０％～約９９％である。一部の実施形態において、基礎呼吸速度は、新鮮に採取したＴＩＬ及び／又は例えば、図２７に具体化された方法以外の方法を含む、本明細書で提供する以外の方法を使用して調製されたＴＩＬの基礎呼吸速度の約７０％～約９９％である。一部の実施形態において、基礎呼吸速度は、新鮮に採取したＴＩＬ及び／又は例えば、図２７に具体化された方法以外の方法を含む、本明細書で提供する以外の方法を使用して調製されたＴＩＬの基礎呼吸速度の約８０％～約９９％である。一部の実施形態において、基礎呼吸速度は、新鮮に採取したＴＩＬ及び／又は例えば、図２７に具体化された方法以外の方法を含む、本明細書で提供する以外の方法を使用して調製されたＴＩＬの基礎呼吸速度の約９０％～約９９％である。一部の実施形態において、基礎呼吸速度は、新鮮に採取したＴＩＬ及び／又は例えば、図２７に具体化された方法以外の方法を含む、本明細書で提供する以外の方法を使用して調製されたＴＩＬの基礎呼吸速度の約９５％～約９９％である。一部の実施形態において、第２の拡大培養ＴＩＬ又は第２の追加の拡大培養ＴＩＬ（例えば、ｒｅＲＥＰ ＴＩＬと称されるＴＩＬを含め、図２７のステップＤに記載されるものなど）は、新鮮に採取したＴＩＬ及び／
又は例えば、図２７に具体化された方法以外の方法を含む、本明細書で提供する以外の方法を使用して調製されたＴＩＬの基礎呼吸速度と統計的に有意な差のない基礎呼吸速度を有する。一部の実施形態において、比較は、例えば新鮮に採取したＴＩＬ及び／又は例えば、図２７に具体化された方法以外の方法を含む、本明細書で提供する以外の方法を使用して調製されたＴＩＬに対するものである。
[00410] 一部の実施形態において、代謝アッセイは予備呼吸容量である。一般に、第
２の拡大培養ＴＩＬ又は第２の追加の拡大培養ＴＩＬ（例えば、ｒｅＲＥＰ ＴＩＬと称されるＴＩＬを含め、図２７のステップＤに記載されるものなど）は、新鮮に採取したＴＩＬの基礎呼吸速度及び／又は、例えば、図２７に具体化されるもの以外の方法を含む、本明細書で提供するもの以外の他の方法を使用して調整したＴＩＬの少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、又は少なくとも９９％の予備呼吸容量を有する。一部の実施形態において、予備呼吸容量は、新鮮に採取したＴＩＬの基礎呼吸速度の約５０％～約９９％である。一部の実施形態において、予備呼吸容量は、新鮮に採取したＴＩＬ及び／又は例えば、図２７に具体化された方法以外の方法を含む、本明細書で提供する以外の方法を使用して調製されたＴＩＬの約５０％～約９９％の基礎呼吸速度である。一部の実施形態において、予備呼吸容量は、新鮮に採取したＴＩＬ及び／又は例えば、図２７に具体化された方法以外の方法を含む、本明細書で提供する以外の方法を使用して調製されたＴＩＬの約６０％～約９９％の基礎呼吸速度である。一部の実施形態において、予備呼吸容量は、新鮮に採取したＴＩＬ及び／又は例えば、図２７に具体化された方法以外の方法を含む、本明細書で提供する以外の方法を使用して調製されたＴＩＬの約７０％～約９９％の基礎呼吸速度である。一部の実施形態において、予備呼吸容量は、新鮮に採取したＴＩＬの基礎呼吸速度の約８０％～約９９％である。一部の実施形態において、予備呼吸容量は、新鮮に採取したＴＩＬ及び／又は例えば、図２７に具体化された方法以外の方法を含む、本明細書で提供する以外の方法を使用して調製されたＴＩＬの約９０％～約９９％の基礎呼吸速度である。一部の実施形態において、予備呼吸容量は、新鮮に採取したＴＩＬ及び／又は例えば、図２７に具体化された方法以外の方法を含む、本明細書で提供する以外の方法を使用して調製されたＴＩＬの約９５％～約９９％の基礎呼吸速度である。一部の実施形態において、第２の拡大培養ＴＩＬ又は第２の追加の拡大培養ＴＩＬ（例えば、ｒｅＲＥＰ ＴＩＬと称されるＴＩＬを含め、図２７のステップＤに記載されるものなど）は、新鮮に採取したＴＩＬ及び／又は、例えば、図２７に具体化されるもの以外の方法を含む、本明細書で提供するもの以外の他の方法を使用して調整したＴＩＬの基礎呼吸速度とは統計的に有意な差を呈しない予備呼吸容量を有する。
[00411] 一般に、第２の拡大培養ＴＩＬ又は第２の追加の拡大培養ＴＩＬ（例えば、
ｒｅＲＥＰ ＴＩＬと称されるＴＩＬを含め、図２７のステップＤに記載されるものなど）は、新鮮に採取したＴＩＬ及び／又は例えば、図２７に具体化された方法以外の方法を含む、本明細書で提供する以外の方法を使用して調製されたＴＩＬの基礎呼吸速度の少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、又は少なくとも９９％の予備呼吸容量を有する。一部の実施形態において、測定される代謝アッセイは解糖予備能である。一部の実施形態において、代謝アッセイは予備呼吸容量である。細胞（呼吸）代謝を測定するため、細胞をミトコンドリア呼吸及び解糖の阻害薬で処理して、以下の尺度からなるＴＩＬの代謝プロファイルを決定した：ベースライン酸化的リン酸化（ＯＣＲによる測定時）、予備呼吸容量、ベースライン解糖活性（ＥＣＡＲによる測定時）、及び解糖予備能。代謝プロファイルは、ミトコンドリアＡＴＰ産生の遮断時に細胞が解糖を遂行する能力を決定することが可能な、Seahorseコンビネーションミトコンドリア／解糖ストレステ
ストアッセイ（Agilent（登録商標）から市販されているキットを含む）を用いて実施し
た。一部の実施形態において、細胞がグルコース飢餓状態にあり、次にグルコースを注入し、続いてストレス作用剤を注入する。一部の実施形態において、ストレス作用剤は、オリゴマイシン、ＦＣＣＰ、ロテノン、アンチマイシンＡ及び／又は２－デオキシグルコース（２－ＤＧ）、並びにこれらの組み合わせからなる群から選択される。一部の実施形態において、オリゴマイシンは１０ｍＭで加えられる。一部の実施形態において、ＦＣＣＰは１０ｍＭで加えられる。一部の実施形態において、ロテノンは２．５ｍＭで加えられる。一部の実施形態において、アンチマイシンＡは２．５ｍＭで加えられる。一部の実施形態において、２－デオキシグルコース（２－ＤＧ）は５００ｍＭで加えられる。一部の実施形態において、解糖能、解糖予備能、及び／又は非解糖酸性化が測定される。一般に、ＴＩＬは、新鮮に採取したＴＩＬ及び／又は例えば、図２７に具体化された方法以外の方法を含む、本明細書で提供する以外の方法を使用して調製されたＴＩＬの基礎呼吸速度の少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、又は少なくとも９９％の解糖予備能を有する。一部の実施形態において、解糖予備能は、新鮮に採取したＴＩＬ及び／又は例えば、図２７に具体化された方法以外の方法を含む、本明細書で提供する以外の方法を使用して調製されたＴＩＬの基礎呼吸速度の約５０％～約９９％である。一部の実施形態において、解糖予備能は、新鮮に採取したＴＩＬ及び／又は例えば、図２７に具体化された方法以外の方法を含む、本明細書で提供する以外の方法を使用して調製されたＴＩＬの約６０％～約９９％の基礎呼吸速度である。一部の実施形態において、解糖予備能は、新鮮に採取したＴＩＬ及び／又は例えば、図２７に具体化された方法以外の方法を含む、本明細書で提供する以外の方法を使用して調製されたＴＩＬの約７０％～約９９％の基礎呼吸速度である。一部の実施形態において、解糖予備能は、新鮮に採取したＴＩＬ及び／又は例えば、図２７に具体化された方法以外の方法を含む、本明細書で提供する以外の方法を使用して調製されたＴＩＬの約８０％～約９９％の基礎呼吸速度である。一部の実施形態において、解糖予備能は、新鮮に採取したＴＩＬ及び／又は例えば、図２７に具体化された方法以外の方法を含む、本明細書で提供する以外の方法を使用して調製されたＴＩＬの約９０％～約９９％の基礎呼吸速度である。一部の実施形態において、解糖予備能は、新鮮に採取したＴＩＬ及び／又は例えば、図２７に具体化された方法以外の方法を含む、本明細書で提供する以外の方法を使用して調製されたＴＩＬの約９５％～約９９％の基礎呼吸速度である。
[00412] 一部の実施形態において、代謝アッセイは基礎解糖である。一部の実施形態
において、第２の拡大培養ＴＩＬ又は第２の追加の拡大培養ＴＩＬ（例えば、ｒｅＲＥＰ
ＴＩＬと称されるＴＩＬを含め、図２７のステップＤに記載されるものなど）は、新鮮に採取したＴＩＬの基礎呼吸速度及び／又は、例えば、図２７に具体化されるもの以外の方法を含む、本明細書で提供するもの以外の他の方法を使用して調整したＴＩＬに比べて少なくとも２倍、少なくとも３倍、少なくとも４倍、少なくとも５倍、少なくとも６倍、少なくとも７倍、少なくとも８倍、少なくとも９倍、又は少なくとも１０倍の基礎解糖の増加を有する。一部の実施形態において、第２の拡大培養ＴＩＬ又は第２の追加の拡大培養ＴＩＬ（例えば、ｒｅＲＥＰ ＴＩＬと称されるＴＩＬを含め、図２７のステップＤに記載されるものなど）は、新鮮に採取したＴＩＬ及び／又は、例えば、図２７に具体化されるもの以外の方法を含む、本明細書で提供するもの以外の他の方法を使用して調整したＴＩＬと比べて約２倍～約１０倍の基礎解糖の増加を有する。一部の実施形態において、第２の拡大培養ＴＩＬ又は第２の追加の拡大培養ＴＩＬ（例えば、ｒｅＲＥＰ ＴＩＬと称されるＴＩＬを含め、図２７のステップＤに記載されるものなど）は、新鮮に採取したＴＩＬ及び／又は、例えば、図２７に具体化されるもの以外の方法を含む、本明細書で提供するもの以外の他の方法を使用して調整したＴＩＬと比べて約２倍～約８倍の基礎解糖の増加を有する。一部の実施形態において、第２の拡大培養ＴＩＬ又は第２の追加の拡大
培養ＴＩＬ（例えば、ｒｅＲＥＰ ＴＩＬと称されるＴＩＬを含め、図２７のステップＤに記載されるものなど）は、新鮮に採取したＴＩＬ及び／又は、例えば、図２７に具体化されるもの以外の方法を含む、本明細書で提供するもの以外の他の方法を使用して調整したＴＩＬと比べて約３倍～約７倍の基礎解糖の増加を有する。一部の実施形態において、第２の拡大培養ＴＩＬ又は第２の追加の拡大培養ＴＩＬ（例えば、ｒｅＲＥＰ ＴＩＬと称されるＴＩＬを含め、図２７のステップＤに記載されるものなど）は、新鮮に採取したＴＩＬ及び／又は、例えば、図２７に具体化されるもの以外の方法を含む、本明細書で提供するもの以外の他の方法を使用して調整したＴＩＬと比べて約２倍～約４倍の基礎解糖の増加を有する。一部の実施形態において、第２の拡大培養ＴＩＬ又は第２の追加の拡大培養ＴＩＬ（例えば、ｒｅＲＥＰ ＴＩＬと称されるＴＩＬを含め、図２７のステップＤに記載されるものなど）は、新鮮に採取したＴＩＬ及び／又は、例えば、図２７に具体化されるもの以外の方法を含む、本明細書で提供するもの以外の他の方法を使用して調整したＴＩＬと比べて約２倍～約３倍の基礎解糖の増加を有する。
[00413] 一般に、第２の拡大培養ＴＩＬ又は第２の追加の拡大培養ＴＩＬ（例えば、
ｒｅＲＥＰ ＴＩＬと称されるＴＩＬを含め、図２７のステップＤに記載されるものなど）は、新鮮に採取したＴＩＬの基礎呼吸速度及び／又は、例えば、図２７に具体化されるもの以外の方法を含む、本明細書で提供するもの以外の他の方法を使用して調整したＴＩＬの少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、又は少なくとも９９％の解糖予備能を有する。一部の実施形態において、解糖予備能は、新鮮に採取したＴＩＬの基礎呼吸速度の約５０％～約９９％である。一部の実施形態において、解糖予備能は、新鮮に採取したＴＩＬ及び／又は例えば、図２７に具体化された方法以外の方法を含む、本明細書で提供する以外の方法を使用して調製されたＴＩＬの約６０％～約９９％の基礎呼吸速度である。一部の実施形態において、解糖予備能は、新鮮に採取したＴＩＬ及び／又は例えば、図２７に具体化された方法以外の方法を含む、本明細書で提供する以外の方法を使用して調製されたＴＩＬの約７０％～約９９％の基礎呼吸速度である。一部の実施形態において、解糖予備能は、新鮮に採取したＴＩＬ及び／又は例えば、図２７に具体化された方法以外の方法を含む、本明細書で提供する以外の方法を使用して調製されたＴＩＬの約８０％～約９９％の基礎呼吸速度である。一部の実施形態において、解糖予備能は、新鮮に採取したＴＩＬ及び／又は例えば、図２７に具体化された方法以外の方法を含む、本明細書で提供する以外の方法を使用して調製されたＴＩＬの約９０％～約９９％の基礎呼吸速度である。一部の実施形態において、解糖予備能は、新鮮に採取したＴＩＬの基礎呼吸速度の約９５％～約９９％である。
[00414] グランザイムＢ産生：グランザイムＢは、ＴＩＬが標的細胞を死滅させる能
力の別の尺度である。ＣＤ３、ＣＤ２８、及びＣＤ１３７／４－１ＢＢに対する抗体を使用して上記に記載したとおり再刺激した培地上清について、そのグランザイムＢレベルもまた、Human Granzyme B DuoSet ELISA Kit（R & D Systems、Minneapolis, MN）を製造
者の指示に従い使用して評価した。一部の実施形態において、第２の拡大培養ＴＩＬ又は第２の追加の拡大培養ＴＩＬ（例えば、ｒｅＲＥＰ ＴＩＬと称されるＴＩＬを含め、図２７のステップＤに記載されるものなど）はグランザイムＢ産生が増加する。一部の実施形態において、第２の拡大培養ＴＩＬ又は第２の追加の拡大培養ＴＩＬ（例えば、ｒｅＲＥＰ ＴＩＬと称されるＴＩＬを含め、図２７のステップＤに記載されるものなど）は細胞傷害活性が増加する。
[00415] 一部の実施形態において、テロメア長は、細胞生存率及び／又は細胞機能の
尺度として使用することができる。一部の実施形態において、テロメアは、図２７に具体化された方法以外の方法を含む、本明細書で提供する以外の方法を使用して調製されたＴ
ＩＬと比較して、驚くべきことに、本発明によって作製されたＴＩＬと同一の長さであった。テロメア長の測定：ゲノムＤＮＡ及び細胞学的調製物中のテロメア長を測定するために、様々な方法が使用されてきた。テロメア制限フラグメント（ＴＲＦ）分析は、テロメア長を測定するための究極の判断基準である（de Lange et al., 1990）。ただし、ＴＲ
Ｆの主な制限は、大量のＤＮＡ（１．５＾ｇ）を必要とすることである。テロメア長の測定に広く使用されている２つの技術、即ち、蛍光ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ； Agilent Technologies、Santa Clara、CA）及び定量的ＰＣＲを本発明で用いてもよい。一部の実施形態において、ステップＡで初めに回収したＴＩＬと、例えば図２７に提供されたステップＤから拡大培養したＴＩＬとの間でテロメア長に変化はない。
[00416] 一部の実施形態において、ＴＩＬの健康はＩＦＮ－ガンマ（ＩＦＮ－γ）分
泌によって測定される。一部の実施形態において、ＩＦＮ－γ分泌は活性ＴＩＬの指標である。一部の実施形態において、ＩＦＮ－γ産生の効力アッセイが用いられる。ＩＦＮ－γ産生は、細胞傷害能のもう１つの尺度である。ＩＦＮ－γ産生は、ＣＤ３、ＣＤ２８、及びＣＤ１３７／４－１ＢＢに対する抗体で刺激されたＴＩＬの培地中のサイトカインＩＦＮ－γのレベルを決定することで測定できる。これらの刺激したＴＩＬからの培地中のＩＦＮ－γレベルは、ＩＦＮ－γ遊離を測定することにより決定できる。一部の実施形態において、例えば図２７に示されるステップＡにおける初めに収穫されたＴＩＬに比べて例えば図２７に示されるＴＩＬはステップＤのＩＦＮ－γ産生の増加は、ステップＤのＴＩＬの細胞傷害能の増加の指標である。一部の実施形態において、ＩＦＮ－γ分泌は１倍、２倍、３倍、４倍、又は５倍以上増加する。一部の実施形態において、ＩＦＮ－γ分泌は１倍増加する。一部の実施形態において、ＩＦＮ－γ分泌は２倍増加する。一部の実施形態において、ＩＦＮ－γ分泌は３倍増加する。一部の実施形態において、ＩＦＮ－γ分泌は４倍増加する。一部の実施形態において、ＩＦＮ－γ分泌は５倍増加する。一部の実施形態において、ＩＦＮ－γはQuantikine ELISA kitを使用して測定される。一部の実施形態において、ＩＦＮ－γはＴＩＬエキソビボで測定される。一部の実施形態において、ＩＦＮ－γは、例えば図２７の方法を含む本発明の方法によって作製されるＴＩＬ、並びに、例えば、図８３（実施例プロセス１ＣのＴＩＬなど）に実施例が提供されているものなど新鮮に採取したＴＩＬ又はその他の方法によって作製されるＴＩＬを含む、ＴＩＬエキソビボで測定される。
[00417] 一部の実施形態において、標的細胞を溶解するＴＩＬの細胞傷害能は、高感
度の用量依存的方法でＴＩＬの細胞傷害能を測定するＴＩＬアッセイのための生物発光リダイレクト溶解アッセイ（効力アッセイ）に従って、生物発光細胞株Ｐ８１５（クローンＧ６）とのＴＩＬの共培養アッセイを使用して評価された。
[00418] 一部の実施形態において、本方法は、上記に記載したとおりの方法を用いた
、ＴＩＬ生存率を評価するためのアッセイを含む。一部の実施形態において、ＴＩＬは、例えば図２７に提供されるとおりのものを含め、上記で考察したとおり拡大培養される。一部の実施形態において、ＴＩＬは、生存率の評価前に凍結保存される。一部の実施形態において、生存率評価は、第１の拡大培養、第２の拡大培養、及び追加の第２の拡大培養の実施前にＴＩＬを解凍することを含む。一部の実施形態において、本方法は、ＴＩＬ集団の細胞増殖、細胞毒性、細胞死、及び／又はその他の生存率に関連する事項を評価するためのアッセイを提供する。生存率は、上記に記載されるＴＩＬ代謝アッセイのいずれか並びに当該技術分野において公知の細胞生存率の評価について公知の任意の方法によって測定することができる。一部の実施形態において、本方法は、図２７に例示されるものを含め、本明細書に記載される方法を用いて拡大培養されたＴＩＬの細胞増殖、細胞毒性、細胞死、及び／又はその他の生存率に関連する事項を評価するためのアッセイを提供する。
[00419] 本発明はまた、ＴＩＬ生存率を決定するためのアッセイ方法も提供する。一
部の実施形態において、ＴＩＬは、新鮮に採取したＴＩＬ及び／又は例えば、図２７に具体化された方法以外の方法を含む、本明細書で提供する以外の方法を使用して調製されたＴＩＬと比較して同等の生存率を有する。一部の実施形態において、ＴＩＬは、新鮮に採取したＴＩＬ及び／又は例えば、図２７に具体化された方法以外の方法を含む、本明細書で提供する以外の方法を使用して調製されたＴＩＬと比較して生存率が増加した。本開示は、腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）をより大きいＴＩＬ集団に拡大培養することによりＴＩＬの生存率をアッセイする方法も提供し、この方法は、
（ｉ）予め拡大培養された第１のＴＩＬ集団を入手すること；
（ｉｉ）ＩＬ－２を含む細胞培養培地中で前記第１のＴＩＬ集団を培養することにより第１の拡大培養を実施して第２のＴＩＬ集団を生じさせること；及び
（ｉｉｉ）第２のＴＩＬ集団の細胞培養培地に追加のＩＬ－２、ＯＫＴ－３、及び抗原提示細胞（ＡＰＣ）を添加することにより第２の拡大培養を実施して第３のＴＩＬ集団を生じさせることであって、第３のＴＩＬ集団が第２のＴＩＬ集団より少なくとも１００倍数が多く、及び第３のＴＩＬ集団を入手するために第２の拡大培養が少なくとも１４日間実施され、第３のＴＩＬ集団が第２のＴＩＬ集団と比べて増加したエフェクターＴ細胞及び／又はセントラルメモリーＴ細胞サブ集団を含み、及び第３の集団が生存率に関して更にアッセイされること
を含む。
[00420] 一部の実施形態において、本方法は、
（ｉｖ）第３のＴＩＬ集団の細胞培養培地に追加のＩＬ－２、追加のＯＫＴ－３、及び追加のＡＰＣを添加することにより追加の第２の拡大培養を実施することを更に含み、ここで追加の第２の拡大培養は、ステップ（ｉｉｉ）で入手されたよりも大きいＴＩＬ集団を入手するため少なくとも１４日間実施され、より大きいＴＩＬ集団は第３のＴＩＬ集団と比べて増加したエフェクターＴ細胞及び／又はセントラルメモリーＴ細胞サブ集団を含み、及び第３の集団は生存率に関して更にアッセイされる。
[00421] 一部の実施形態において、ステップ（ｉ）の前に、細胞は凍結保存される。
[00422] 一部の実施形態において、細胞はステップ（ｉ）の実施前に解凍される。
[00423] 一部の実施形態において、分析に十分なＴＩＬを入手するため、ステップ（
ｉｖ）が１～４回繰り返される。
[00424] 一部の実施形態において、ステップ（ｉ）～（ｉｉｉ）又は（ｉｖ）は約４
０日～約５０日の期間内に実施される。
[00425] 一部の実施形態において、ステップ（ｉ）～（ｉｉｉ）又は（ｉｖ）は約４
２日～約４８日の期間内に実施される。
[00426] 一部の実施形態において、ステップ（ｉ）～（ｉｉｉ）又は（ｉｖ）は約４
２日～約４５日の期間内に実施される。
[00427] 一部の実施形態において、ステップ（ｉ）～（ｉｉｉ）又は（ｉｖ）は約４
４日以内に実施される。
[00428] 一部の実施形態において、ステップ（ｉｉｉ）又は（ｉｖ）からの細胞は、
ＣＤ４、ＣＤ８、及びＴＣＲαβを新鮮採取細胞と同程度に発現する。
[00429] 一部の実施形態において、抗原提示細胞は末梢血単核球（ＰＢＭＣ）である
。
[00430] 一部の実施形態において、ＰＢＭＣはステップ（ｉｉｉ）において９～１７
日目のいずれかに細胞培養物に加えられる。
[00431] 一部の実施形態において、ステップ（ｉｖ）のより大きいＴＩＬ集団中のエ
フェクターＴ細胞及び／又はセントラルメモリーＴ細胞は、第３の細胞集団中のエフェクターＴ細胞、及び／又はセントラルメモリーＴ細胞と比べて、ＣＤ２７の発現、ＣＤ２８の発現、より長いテロメア、ＣＤ５７発現の増加、及びＣＤ５６発現の減少からなる群から選択される１つ以上の特徴を呈する。
[00432] 一部の実施形態において、エフェクターＴ細胞及び／又はセントラルメモリ
ーＴ細胞はＣＤ５７発現の増加及びＣＤ５６発現の減少を呈する。
[00433] 一部の実施形態において、ＡＰＣは人工ＡＰＣ（ａＡＰＣ）である。
[00434] 一部の実施形態において、本方法は、高親和性Ｔ細胞受容体をコードする核
酸を含む発現ベクターで第１のＴＩＬ集団を形質導入するステップを更に含む。
[00435] 一部の実施形態において、形質導入ステップはステップ（ｉ）の前に行われ
る。
[00436] 一部の実施形態において、本方法は、Ｔ細胞シグナル伝達分子の少なくとも
１つのエンドドメインに融合した単鎖可変断片抗体を含むキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）をコードする核酸を含む発現ベクターで第１のＴＩＬ集団を形質導入するステップを更に含む。
[00437] 一部の実施形態において、形質導入ステップはステップ（ｉ）の前に行われ
る。
[00438] 一部の実施形態において、ＴＩＬは生存率に関してアッセイされる。
[00439] 一部の実施形態において、ＴＩＬは凍結保存後に生存率に関してアッセイさ
れる。
[00440] 一部の実施形態において、ＴＩＬは凍結保存後及びステップ（ｉｖ）の後に
生存率に関してアッセイされる。
[00441] Ｔ及びＢリンパ球の多様な抗原受容体は、限られているが多数の遺伝子セグ
メントの体細胞組換えによって産生される。これらの遺伝子セグメントＶ（可変）、Ｄ（多様性）、Ｊ（結合）、及びＣ（定数）は、免疫グロブリン及びＴ細胞受容体（ＴＣＲ）の結合特異性及び下流側での適用を決定する。本発明は、Ｔ細胞レパートリーの多様性を示し、増加させるＴＩＬを生成する方法を提供する（ポリクローナル性と称されることがある）。一部の実施形態において、Ｔ細胞レパートリーの多様性の増加は、新鮮に採取したＴＩＬ及び／又は例えば、図２７に具体化された方法以外の方法を含む、本明細書で提供する以外の方法を使用して調製されたＴＩＬと比較して生存率が増加した。一部の実施形態において、本方法により得られたＴＩＬは、Ｔ細胞レパートリー多様性の増加を示す。一部の実施形態において、第１の拡大培養で得られたＴＩＬは、Ｔ細胞レパートリー多様性の増加を示す。一部の実施形態において、多様性の増加は、免疫グロブリンの多様性
及び／又はＴ細胞受容体の多様性の増加である。一部の実施形態において、免疫グロブリンの多様性は、免疫グロブリン重鎖にある。一部の実施形態において、免疫グロブリンの多様性は、免疫グロブリン軽鎖にある。一部の実施形態において、多様性はＴ細胞受容体にある。一部の実施形態において、多様性は、アルファ、ベータ、ガンマ、及びデルタ受容体からなる群から選択されるＴ細胞受容体の１つにある。一部の実施形態において、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）アルファ及び／又はベータの発現が増加する。一部の実施形態において、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）アルファの発現が増加する。一部の実施形態において、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）ベータの発現が増加する。一部の実施形態において、ＴＣＲａｂ（即ち、ＴＣＲα／β）の発現が増加する。
[00442] 本開示によれば、ＴＩＬの生存率をアッセイする方法及び／又は対象への投
与における更なる使用。一部の実施形態において、腫瘍浸潤リンパ球（tumor infiltratitng lymphocyte）（ＴＩＬ）をアッセイする方法は、
（ｉ）第１のＴＩＬ集団を入手すること；
（ｉｉ）ＩＬ－２を含む細胞培養培地中で第１のＴＩＬ集団を培養することにより第１の拡大培養を実施して第２のＴＩＬ集団を生じさせること；及び
（ｉｉｉ）第２のＴＩＬ集団の細胞培養培地に追加のＩＬ－２、ＯＫＴ－３、及び抗原提示細胞（ＡＰＣ）を添加することにより第２の拡大培養を実施して第３のＴＩＬ集団を生じさせることであって、第３のＴＩＬ集団が第２のＴＩＬ集団より少なくとも５０倍数が多いこと；
（ｉｖ）第３のＴＩＬ集団を回収し、洗浄し、及び凍結保存すること；
（ｖ）凍結保存ＴＩＬを極低温で貯蔵すること；
（ｖｉ）第３のＴＩＬ集団を解凍して解凍された第３のＴＩＬ集団を提供すること；及び
（ｖｉｉ）第３の集団の細胞培養培地にＩＬ－２、ＯＫＴ－３、及びＡＰＣを添加することにより、解凍された第３のＴＩＬ集団の一部の追加の第２の拡大培養を少なくとも３日の追加の拡大培養期間（ｒｅＲＥＰ期間と称されることがある）にわたって実施することであって、この第３の拡大培養を実施して第４のＴＩＬ集団を入手し、第４のＴＩＬ集団中のＴＩＬ数を第３のＴＩＬ集団中のＴＩＬ数と比較して比を求めること；
（ｖｉｉｉ）ステップ（ｖｉｉ）の比に基づき、解凍されたＴＩＬ集団が患者への投与に好適かどうかを決定すること；
（ｉｘ）ステップ（ｖｉｉｉ）において第４のＴＩＬ集団中のＴＩＬ数と第３のＴＩＬ集団中のＴＩＬ数との比が５：１より大きいと決定されるとき、治療上有効な投薬量の解凍された第３のＴＩＬ集団を患者に投与すること
を含む。
[00443] 一部の実施形態において、追加の拡大培養期間（ｒｅＲＥＰ期間と称される
ことがある）は、第４のＴＩＬ集団中のＴＩＬ数と第３のＴＩＬ集団中のＴＩＬ数との比が５０：１より大きくなるまで実施される。
[00444] 一部の実施形態において、治療上有効な投薬量となるのに十分なＴＩＬの数
は約２．３×１０１０～約１３．７×１０１０個である。
[00445] 一部の実施形態において、ステップ（ｉ）～（ｖｉｉ）は約４０日～約５０
日の期間内に実施される。一部の実施形態において、ステップ（ｉ）～（ｖｉｉ）は約４２日～約４８日の期間内に実施される。一部の実施形態において、ステップ（ｉ）～（ｖｉｉ）は約４２日～約４５日の期間内に実施される。一部の実施形態において、ステップ（ｉ）～（ｖｉｉ）は約４４日以内に実施される。
[00446] 一部の実施形態において、ステップ（ｉｉｉ）又は（ｖｉｉ）からの細胞は
、ＣＤ４、ＣＤ８、及びＴＣＲαβを新鮮採取細胞と同程度に発現する。一部の実施形態において細胞はＴＩＬである。
[00447] 一部の実施形態において、抗原提示細胞は末梢血単核球（ＰＢＭＣ）である
。一部の実施形態において、ＰＢＭＣはステップ（ｉｉｉ）において９～１７日目のいずれかに細胞培養物に加えられる。
[00448] 一部の実施形態において、ステップ（ｉｉｉ）又は（ｖｉｉ）のより大きい
ＴＩＬ集団中のエフェクターＴ細胞及び／又はセントラルメモリーＴ細胞は、第３の細胞集団中のエフェクターＴ細胞、及び／又はセントラルメモリーＴ細胞と比べて、ＣＤ２７の発現、ＣＤ２８の発現、より長いテロメア、ＣＤ５７発現の増加、及びＣＤ５６発現の減少からなる群から選択される１つ以上の特徴を呈する。
[00449] 一部の実施形態において、エフェクターＴ細胞及び／又はセントラルメモリ
ーＴ細胞はＣＤ５７発現の増加及びＣＤ５６発現の減少を呈する。
[00450] 一部の実施形態において、ＡＰＣは人工ＡＰＣ（ａＡＰＣ）である。
[00451] 一部の実施形態において、高親和性Ｔ細胞受容体をコードする核酸を含む発
現ベクターで第１のＴＩＬ集団を形質導入するステップ。
[00452] 一部の実施形態において、形質導入ステップはステップ（ｉ）の前に行われ
る。
[00453] 一部の実施形態において、Ｔ細胞シグナル伝達分子の少なくとも１つのエン
ドドメインに融合した単鎖可変断片抗体を含むキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）をコードする核酸を含む発現ベクターで第１のＴＩＬ集団を形質導入するステップ。
[00454] 一部の実施形態において、形質導入ステップはステップ（ｉ）の前に行われ
る。
[00455] 一部の実施形態において、ＴＩＬはステップ（ｖｉｉ）の後に生存率に関し
てアッセイされる。
[00456] 本開示はまた、更なるＴＩＬのアッセイ方法も提供する。一部の実施形態に
おいて、本開示は、ＴＩＬのアッセイ方法を提供し、この方法は、
（ｉ）第１の凍結保存ＴＩＬ集団の一部を入手すること；
（ｉｉ）第１の凍結保存ＴＩＬ集団の一部を解凍すること；
（ｉｉｉ）ＩＬ－２、ＯＫＴ－３、及び抗原提示細胞（ＡＰＣ）を含む細胞培養培地中で第１のＴＩＬ集団の一部を少なくとも３日の追加の拡大培養期間（（ｒｅＲＥＰ期間と称されることがある）にわたって培養することにより第１の拡大培養を実施して第２のＴＩＬ集団を生じさせることであって、第１のＴＩＬ集団からの一部を第２のＴＩＬ集団と比較してＴＩＬ数の比を求め、第２のＴＩＬ集団中のＴＩＬ数と第１のＴＩＬ集団の一部のＴＩＬ数との比が５：１より大きいこと；
（ｉｖ）ステップ（ｉｉｉ）の比に基づき、第１のＴＩＬ集団が患者への治療的投与における使用に好適かどうかを決定すること；
（ｖ）ステップ（ｉｖ）において第２のＴＩＬ集団中のＴＩＬ数と第１のＴＩＬ集団中のＴＩＬ数との比が５：１より大きいと決定されるとき、第１のＴＩＬ集団が治療的投与における使用に好適であると決定すること
を含む。
[00457] 一部の実施形態において、第２のＴＩＬ集団中のＴＩＬ数と第１のＴＩＬ集
団の一部のＴＩＬ数との比は５０：１より大きい。
[00458] 一部の実施形態において、本方法は、本明細書に提供される任意の実施形態
に記載されるとおりの方法によりステップ（ｉ）からの第１の凍結保存ＴＩＬ集団全体の拡大培養を実施することを更に含む。
[00459] 一部の実施形態において、本方法は、ステップ（ｉ）からの第１の凍結保存
ＴＩＬ集団全体を患者に投与することを更に含む。
Ｋ．ＴＩＬ製造用閉鎖系
[00460] 本発明は、ＴＩＬ培養プロセス中の閉鎖系の使用を提供する。かかる閉鎖系
は、微生物汚染の防止及び／又は削減を可能にし、使用するフラスコの数が少なくなり、コスト削減が可能となる。一部の実施形態において、閉鎖系は２つの容器を使用する。
[00461] かかる閉鎖系は、当該技術分野で公知であり、例えば、http://www.fda.gov/cber/guidelines.htm及びhttps://www.fda.gov/BiologicsBloodVaccines/GuidanceComplianceRegulatoryInformation/Guidances/Blood/ucm076779.htm.に記載されている。
[00462] ＦＤＡのウェブサイトで提供されているように、滅菌方法を備えた閉鎖系は
公知であり、詳細に記載されている。https://www.fda.gov/BiologicsBloodVaccines/GuidanceComplianceRegulatoryInformation/Guidances/Blood/ucm076779.htmを参照のこと。上記で参照され、以下の関連箇所にて提供されている。
序論
[00463] 滅菌接続装置（ＳＴＣＤ：Sterile Connecting Device）は、互換性のある２つの配管の間に滅菌溶接を産生する。この手順により、様々な直径の容器及びチューブを滅菌接続できる。このガイダンスでは、これらの装置の使用に関する推奨管理基準と手順について記載する。このガイダンスは、滅菌接続装置の製造業者がマーケティングの承認又は認可を得るためにＦＤＡに提出しなければならないデータ又は情報は取り扱っていない。また、表示方法において許可されていない目的で承認又は認可された滅菌接続装置を使用すると、米連邦食品医薬品化粧品法下で、装置が粗悪品及び不正表示品と見なされる可能性があることに注意することも重要である。
１．ＦＤＡ推奨事項
[00464] ＦＤＡ認可のＳＴＣＤを日常的に使用することを提案する血液製剤の製造業
者は、各血液製剤の標準操作手順（ＳＯＰ：Standard Operating Procedure）マニュアルに、かかる使用に関する情報を組み込む必要がある。これらの記載には、記録管理、製品追跡、チューブ溶接品質管理、ソフトウェア及び使い捨て用品のロット番号（追加する要素の販売業者を含む）が含まれていなければならない。品質管理手順には、各溶接の完全性試験を含めなくてはならない。
２．ＳＴＣＤの適用
[00465] ユーザは、装置の使用により、安全性と有効性が実証されていない規制製品
の新製品を作成したり、構成を大幅に変更したりする可能性があることに注意する必要がある。ライセンスの対象となる「新製品」については、ＳＯＰの提出に加え、申請書又は申請書の補足資料をＦＤＡに提出する必要がある。一般に、細胞組成を含むプーリング又は混合は、ライセンス適用又は適用の追加の提出及び承認を必要とする製品の変更を表す。かかる適用及び適用の追加には、「新製品」が提案された日付の期間全体にわたって意
図された使用に対して安全且つ効果的であることを実証するデータ及び製造手順の説明を含める必要がある。
[00466] 以下の論評は、ＦＤＡが認可又は承認したＳＴＣＤのより一般的な使用に関
するガイダンスとして提供されている。
Ｌ．血液採血セットへの新しい針又は小さい針の追加
[00467] 手順の開始前にＳＴＣＤを使用して針を追加すること（全血液採取、血小板
フェレーシス、又は元血漿採取）は、機能的に閉鎖系を開放するものとは見なされない。手順中に針を追加する場合は、液体充填チューブの溶接が承認されているＳＴＣＤのみを使用する必要がある。溶接の完全性試験を満たす場合、ＳＴＣＤの使用は機能的に閉鎖系を開放するものとは見なされない。
[00468] 血小板、開放系で調製されたフェレーシスには２４時間の期限が表示され、
機能的閉鎖系で調製された血小板、フェレーシス製品には５日間の期限が表示される必要がある（Revised Guideline for Collection of Platelets, Pheresis, October 7, 1988を参照のこと）。
[00469] 追加されたチューブと針の販売業者と仕様は、血液センターのＳＯＰと記録
に記載する必要がある。針を追加するためのＳＴＣＤの使用は、認可された施設が事前承認を必要とする製造の大きな変化を表すものではない。
Ｍ．成分の調製のためのＳＴＣＤの使用
[00470] ＳＴＣＤを使用して追加する成分調製バッグを取り付ける場合、移送パック
の販売業者を特定し、血液ユニット番号とＡＢＯ／Ｒｈの適切な検証を識別する記録を適切に維持する必要がある。全ての血液及び血液成分に適切な表示をする必要がある（21 CFR 606.121）。
例：
・新鮮凍結血漿からクリオプレシピテート抗血友病因子を産生するため、４枚目のバッグを全血採取トリプルパックに追加する。
・赤血球ユニットへの添加剤溶液の接続。
・成分の製造での使用のためにＦＤＡで認可されたインラインフィルターの追加。
・血小板フェレーシスハーネスへの第３の保管容器の追加。
・上記の用途では、手順を作成して記録を保持する必要があるが、手順を決めるために使用権者がＦＤＡの承認を得る必要はない。
１．血液製剤をプールするためのＳＴＣＤの使用
[00471] 全血採取から調製された血小板をプールするためにＳＴＣＤを適切に使用す
ることにより、一般的に使用されるスパイク及びポートの入り口からの潜在的な汚染を取り除くことができる。輸血の直前実施されるプーリングは、かかる適切な使用の例である。プールされた血小板は、プール後４時間以内に投与しなくてはならない（21 CFR 606.122(l)(2)を参照）。
[00472] ただし、プーリング及びその後の保管は、無作為のドナーユニットの管理と
比較してリスクを高める可能性があり、ある汚染されたユニットが投与前に他のユニットと共にプールされ、貯蔵される場合、投与される総細菌接種量は、追加量における複製の結果として増加する可能性がある。したがって、血小板を４時間を超えるプール及び貯蔵するためのＳＴＣＤの推奨使用は、かかるプーリングがリスク増加と関連しているか否かを十分に解決するデータによって裏付けられるべきである。
[00473] かかる血小板のプーリングは、新製品の製造を構成する。
[00474] 血小板を含むプーリング又は混合は、保管期間が４時間を超える場合、新製
品の製造と見なされ、ライセンス申請又は申請補足資料の提出と承認が必要となる。
２．小児用の使用及び分割ユニット用のアリコートを調製するためのＳＴＣＤの使用
[00475] ＳＴＣＤを使用して調製された全血、赤血球、新鮮凍結血漿の小児用ユニッ
ト及び分割ユニットは、以下の条件を満たす場合、生物製剤承認申請（ＢＬＡ：Biologics License Application）の補足資料が必要な新製品とは見なさない。
製造業者は、使用する各抗凝固剤の承認を含む、元の（即ち、分割されていない）製品について、承認された生物製剤承認又は追加ライセンスを有している必要がある。
表示は、配布前に確認及び承認のために提出する必要がある。表記は、FDA Form 2567、Transmittal of Labels and Circularsの所見欄に基づいて行う必要がある。
準備中の成分の保管が承認された最終産物容器を使用する必要がある。
[00476] 認可を受けて製造された血小板には、少なくとも５．５×（１０）１０個の
血小板が含まれていなくてはならない（21 CFR 640.24(c)）。免許で製造された血小板、フェレーシスには、少なくとも３．０×（１０）１１の血小板が含まれていなくてはならない（Revised Guideline for the Collection of Platelets, Pheresis, October 7, 1988を参照）。
[00477] ＳＴＣＤを使用して全血採取及び自動化されたヘマフェレーシス手順によっ
て調製された血漿及び血小板から分割された製品を調製する場合に従うべき手順には、以下の説明を含める必要がある。
・ＦＤＡが認可したＳＴＣＤでアフェレーシスハーネス又は収集容器を改良する方法。
・スプリット血漿又は全血製剤の最小量。
・スプリット血小板フェレーシス製剤の容積及び血小板濃度。
・製剤の保管時間。製剤は承認された容器に入れ、かかる容器の表示に記載されている保管時間に合わせる必要がある。
・血液センターの記録において分割された製品に表示を付けて追跡するために使用する方法。
[00478] 注記：アリコートの表示手順は、必要に応じて、全ての成分の追跡及び不良
品回収を許可するのに十分な手順記帳に明確に記載する必要がある。
３．自動化された血漿交換手順中追加の生理食塩水ライン又は抗凝固剤ラインの接続ためのＳＴＣＤの使用
[00479] 手順を作成して機器製造業者の使用指示に従って記録を保持する必要がある
が、手順を決めるために使用権者がＦＤＡの承認を得る必要はない。
４．処理液の取り付けのためのＳＴＣＤの使用
[00480] ＳＴＣＤを使用して、洗浄液又は凍結赤血球製剤に処理液の入った容器を取
り付ける場合、得られた産物の定められた期日期間は２４時間であるが、より長い期間をサポートするＣＢＥＲへの承認申請書又は申請補足資料の書式で提供される場合に限る（21 CFR 610.53(c)）。免除又は変更は、ＣＢＥＲセンター長から書面で承認されなければならない（21 CFR 610.53(d)）。
５．ＦＤＡ認可済み白血球除去フィルターを追加するためのＳＴＣＤの使用
[00481] 一部の白血球除去フィルターは、全血採取系に一体的に取り付けられていな
い。保管前ろ過にＳＴＣＤを使用する手順は、フィルター製造業者の使用指示に従わなく
てはならない。
[00482] 交付前に白血球が減少した場合、製造上の重要な変化と見なされる。したが
って、ＳＴＣＤを使用して調製された新しい白血球削減製品の場合、製造業者は生物製剤承認申請（21 CFR 601.2）又は事前承認申請補足資料をＦＤＡ（21 CFR 601.12）に提出
する必要がある。
[00483] 血液製剤容器から試験用試料を取り出すためのＳＴＣＤの使用（例えば、血
小板又は血小板の容器から血小板の試料を取り出すためのＳＴＣＤの使用、交差適合用のフェレーシスなど）。
[00484] 試料回収後の産物の容積及び／又は細胞数が元の表示又は情報の回状に記載
されているものと異なる場合、製剤の表示は新しい容積及び／又は細胞数を反映すべく修正しなくてはならない。例えば、血小板１単位中の血小板数を５．５×（１０）１０未満に減少させる試料は取り出してはならない（21 CFR 640.24 (c)）。
６．ＦＤＡガイダンスからの追加情報
[00485] ＳＴＣＤガイダンスでは、一般的なガイダンスに加え、ＳＴＣＤ使用を申し
入れるＦＤＡへの申請書及び申請補足資料の提出のための仕様に関する具体的な情報及び例を示す。ＳＴＣＤの適切な使用に関してさらなる疑問が生じた場合は、ＦＤＡ生物製剤評価センター血液研究・審査課まで質問すること。
[00486] 一部の実施形態において、閉鎖系は、腫瘍断片が得られた時点からＴＩＬが
患者への投与又は凍結保存の準備が整うまで１つの容器を使用する。一部の実施形態において、２つの容器が使用される場合、第１の容器は閉鎖型Ｇコンテナであり、ＴＩＬ集団は遠心され、第１の閉鎖型Ｇコンテナを開かずに輸注バッグに移される。一部の実施形態において、２つの容器が使用される場合、輸注バッグは、HypoThermosol含有輸注バッグ
である。閉鎖系又は閉鎖ＴＩＬ細胞培養系は、腫瘍試料及び／又は腫瘍断片が追加されると、系が外側からしっかりと密閉され、細菌、真菌、及び／又はその他の微生物汚染がない閉鎖環境を形成する。
[00487] 一部の実施形態において、微生物汚染の減少は約５％～約１００％である。
一部の実施形態において、微生物汚染の減少は約５％～約９５％である。一部の実施形態において、微生物汚染の減少は約５％～約９０％である。一部の実施形態において、微生物汚染の減少は約１０％～約９０％である。一部の実施形態において、微生物汚染の減少は約１５％～約８５％である。一部の実施形態において、微生物汚染の減少は、約５％、約１０％、約１５％、約２０％、約２５％、約３０％、約３５％、約４０％、約４５％、約５０％、約５５％、約６０％、約６５％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、約９７％、約９８％、約９９％、又は約１００％である。
[00488] 閉鎖系は、微生物汚染の不在下及び／又は大幅に減少させＴＩＬを成長させ
る。
[00489] 更に、ＴＩＬ細胞培養環境のｐＨ、二酸化炭素分圧及び酸素分圧は、細胞が
培養されるにつれてそれぞれ変化する。したがって、たとえ細胞培養に適した培地が流通していても、ＴＩＬ成長に最適な環境として閉鎖環境を常に維持する必要がある。このため、閉鎖環境の培養液内のｐＨ、二酸化炭素分圧及び酸素分圧の物理的要因は、センサーによって監視され、そのセンサーの信号は、培養環境の入口に設置されたガス交換器の制御に使用され、閉鎖環境のガス分圧は、細胞培養環境を最適化するため、培養液の変化に従ってリアルタイムで調整されることが望ましい。一部の実施形態において、本発明は、
閉鎖環境への入口に、閉鎖環境のｐＨ、二酸化炭素分圧及び酸素分圧を測定し、監視装置からの信号に基づいてガス濃度を自動的に調整することにより、細胞培養環境を最適化する監視装置を備えたガス交換器を一体化した閉鎖細胞培養系を提供する。
[00490] 一部の実施形態において、閉鎖環境内の圧力は連続的又は断続的に制御され
る。つまり、閉鎖環境内の圧力は、例えば、圧力維持装置によって変化させることができ、即ち、空間が、陽圧状態のＴＩＬの成長に適していることを保証するか、又は陰圧状態の流体の滲出を促進し、ひいては、細胞成長を促進することを確実にする。更に、断続的に負圧を加えることにより、閉鎖環境の容積の一時的な収縮によって閉鎖環境内の循環液を均一且つ効率的に交換することが可能である。
[00491] 一部の実施形態において、ＴＩＬの成長に最適な培養成分を置換又は追加す
ることができ、ＩＬ－２及び／又はＯＫＴ３などの要因、並びに組み合わせを追加してもよい。
Ｃ．細胞培養
[00492] ある実施形態において、ＴＩＬの拡大培養方法は、上記で考察され図２７で
例示されているものを含み、約５，０００ｍＬ～約２５，０００ｍＬの細胞培地、約５，０００ｍＬ～約１０，０００ｍＬの細胞培地、又は約５，８００ｍＬ～約８，７００ｍＬの細胞培地を使用することを含み得る。一部の実施形態において、培地は、例えば、実施例２１に記載されるように、無血清培地である。一部の実施形態において、第１の拡大培養の培地は無血清である。一部の実施形態において、第２の拡大培養の培地は無血清である。一部の実施形態において、第１及び第２の拡大培養の培地は双方とも無血清である。ある実施形態において、ＴＩＬ数の拡大には１種類以下の細胞培養培地が使用される。任意の好適な細胞培養培地、例えば、AIM-V細胞培地（Ｌ－グルタミン、５０μＭ硫酸スト
レプトマイシン、及び１０μＭ硫酸ゲンタマイシン）細胞培養培地（Invitrogen、Carlsbad CA）を使用し得る。この点に関して、本発明の方法では有利には、ＴＩＬ数の拡大に
必要な培地の量及び培地の種類の数が減少する。ある実施形態において、ＴＩＬ数の拡大は、３日又は４日に１回以下の頻度で細胞をフィードすることを含み得る。ガス透過性容器内で細胞の数を拡大すると、細胞の拡大培養に必要なフィーディング頻度が減少することにより細胞の数の拡大に必要な手順が簡便になる。
[00493] ある実施形態において、第１及び／又は第２のガス透過性容器内の細胞培地
はろ過されていない。ろ過されていない細胞培地を使用すると、細胞の数の拡大に必要な手順が簡便になり得る。ある実施形態において、第１及び／又は第２のガス透過性容器内の細胞培地はβ－メルカプトエタノール（ＢＭＥ）を含まない。
[00494] ある実施形態において、哺乳類から腫瘍組織試料を入手すること；細胞培地
が中に入った第１のガス透過性容器内で腫瘍組織試料を培養すること；腫瘍組織試料からＴＩＬを入手すること；細胞培地を含有する第２のガス透過性容器内でＴＩＬ数を約７～１４日間、例えば約１１日間拡大することを含む本方法の所要期間。一部の実施形態において、プレＲＥＰは約７～１４日間、例えば、約１１日間である。一部の実施形態において、ＲＥＰは約７～１４日間、例えば、約１１日間である。
[00495] ある実施形態において、ＴＩＬはガス透過性容器内で拡大培養される。ガス
透過性容器は、米国特許出願公開第２００５／０１０６７１７ Ａ１号（この開示は参照により本明細書に援用される）に記載されるものを含め、当該技術分野において公知の方法、組成物、及び装置を用いたＰＢＭＣを使用したＴＩＬの拡大培養に用いられている。ある実施形態において、ＴＩＬはガス透過性バッグ内で拡大培養される。ある実施形態において、ＴＩＬは、Xuri Cell Expansion System W25（GE Healthcare）など、ガス透過
性バッグ内でＴＩＬを拡大培養する細胞拡大培養システムを使用して拡大培養される。ある実施形態において、ＴＩＬは、Xuri Cell Expansion System W5（GE Healthcare）としても知られるWAVE Bioreactor Systemなど、ガス透過性バッグ内でＴＩＬを拡大培養する細胞拡大培養システムを使用して拡大培養される。ある実施形態において、細胞拡大培養システムは、約１００ｍＬ、約２００ｍＬ、約３００ｍＬ、約４００ｍＬ、約５００ｍＬ、約６００ｍＬ、約７００ｍＬ、約８００ｍＬ、約９００ｍＬ、約１Ｌ、約２Ｌ、約３Ｌ、約４Ｌ、約５Ｌ、約６Ｌ、約７Ｌ、約８Ｌ、約９Ｌ、及び約１０Ｌからなる群から選択される容積を有するガス透過性細胞バッグを含む。
[00496] ある実施形態において、ＴＩＬはG-Rexフラスコ（Wilson Wolf Manufacturingから市販されている）において拡大培養することができる。かかる実施形態は、細胞集
団を約５×１０５細胞／ｃｍ２から１０×１０６～３０×１０６細胞／ｃｍ２へと拡大培養することを可能にする。一実施形態では、これはフィーディングを伴わない。ある実施形態において、これは、G-Rexフラスコ内に約１０ｃｍの高さの培地がある限りフィーデ
ィングなしである。ある実施形態において、これにフィーディングはないが、１つ以上のサイトカインが加えられる。ある実施形態において、サイトカインは、サイトカインを培地と混合する必要は一切なしにボーラスとして加えることができる。かかる容器、装置、及び方法は当該技術分野において公知で、ＴＩＬの拡大培養に用いられており、米国特許出願公開第２０１４／０３７７７３９Ａ１号、国際公開第２０１４／２１００３６ Ａ１号、米国特許出願公開第２０１３／０１１５６１７ Ａ１号、国際公開第２０１３／１８８４２７ Ａ１号、米国特許出願公開第２０１１／０１３６２２８ Ａ１号、米国特許第８，８０９，０５０ Ｂ２号、国際公開第２０１１／０７２０８８ Ａ２号、米国特許出願公開第２０１６／０２０８２１６ Ａ１号、米国特許出願公開第２０１２／０２４４１３３ Ａ１号、国際公開第２０１２／１２９２０１ Ａ１号、米国特許出願公開第２０１３／０１０２０７５ Ａ１号、米国特許第８，９５６，８６０ Ｂ２号、国際公開第２０１３／１７３８３５ Ａ１号、米国特許出願公開第２０１５／０１７５９６６ Ａ１号（これらの開示は参照により本明細書に援用される）に記載されるものが含まれる。かかるプロセスはまた、Jin et al., J.Immunotherapy, 2012, 35:283-292にも記載されている
。
Ｄ．任意選択のＴＩＬ遺伝子改変
[00497] 一部の実施形態において、ＴＩＬは任意選択で、限定はされないが、高親和
性Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）、例えば、ＭＡＧＥ－１、ＨＥＲ２、若しくはＮＹ－ＥＳＯ－１などの腫瘍関連抗原を標的とするＴＣＲ、又は腫瘍関連細胞表面分子（例えばメソテリン）若しくは系統限定的細胞表面分子（例えばＣＤ１９）に結合するキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を含め、追加の機能性を含むように遺伝子改変される。
Ｅ．任意選択のＴＩＬ凍結保存
[00498] バルクＴＩＬ集団又はＴＩＬの拡大培養集団のいずれかを、必要に応じて凍
結保存できる。一部の実施形態において、治療用ＴＩＬ集団で凍結保存が行われる。一部の実施形態において、凍結保存は、第２の拡大培養後に回収したＴＩＬで生じる。一部の実施形態において、図２７の例示的ステップＦのＴＩＬで凍結保存が行われる。一部の実施形態において、ＴＩＬは輸注バッグ中に凍結保存される。一部の実施形態において、ＴＩＬは、輸注バッグでの置換前に凍結保存される。一部の実施形態において、ＴＩＬは、凍結保存されるが輸注バッグ中には置かれない。一部の実施形態において、凍結保存は凍結保存培地を使用して実施される。一部の実施形態において、凍結保存培地は、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）を含有する。これは、概して、凍結溶液、例えば８５％補体不活性化ＡＢ血清及び１５％ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）の中にＴＩＬ集団を入れることにより達成される。この溶液中の細胞を極低温バイアルに入れ、－８０℃で２４時間貯蔵し、任意選択で凍結保存のため気体窒素フリーザーに移す。Sadeghi, et al., Acta
Oncologica 2013, 52, 978-986を参照のこと。
[00499] 適切な場合、細胞をフリーザーから取り出し、３７℃の水浴中で溶液の約５
分の４が解凍されるまで解凍する。細胞は概して完全培地中に再懸濁され、任意選択で１回以上洗浄される。一部の実施形態では、当該技術分野において公知のとおり解凍ＴＩＬをカウントし、生存率に関して評価することができる。
[00500] 好ましい実施態様において、ＴＩＬの集団はCS10凍結保存培地（CryoStor 10、BioLife Solutions）を用いて凍結保存される。好ましい実施態様において、ＴＩＬの
集団は凍結保存培地（ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）を含有する）を用いて凍結保存される。好ましい実施形態において、ＴＩＬの集団は、１：１（容積：容積）の比のCS10及び細胞培養培地を用いて凍結保存される。好ましい実施形態において、ＴＩＬの集団は、約１：１（容積：容積）の比のCS10及び細胞培養培地を使用し、更に追加のＩＬ－２を含んで凍結保存される。
[00501] 上記でステップＡ～Ｅにおいて考察したとおり、ＴＩＬ拡大培養プロセス全
体を通じて数々の時点で凍結保存を行うことができる。一部の実施形態において、ステップＢに係る第１の拡大培養後のバルクＴＩＬ集団又はステップＤに係る１回以上の第２の拡大培養後の拡大培養ＴＩＬ集団が凍結保存されてもよい。凍結保存は、概して、凍結溶液、例えば８５％補体不活性化ＡＢ血清及び１５％ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）の中にＴＩＬ集団を置くことにより達成し得る。この溶液中の細胞を極低温バイアルに入れ、－８０℃で２４時間貯蔵し、任意選択で凍結保存のため気体窒素フリーザーに移す。Sadeghi, et al., Acta Oncologica 2013, 52, 978-986を参照のこと。
[00502] 適切な場合、細胞をフリーザーから取り出し、３７℃の水浴中で溶液の約５
分の４が解凍されるまで解凍する。細胞は概して完全培地中に再懸濁され、任意選択で１回以上洗浄される。一部の実施形態では、当該技術分野において公知のとおり解凍ＴＩＬをカウントし、生存率に関して評価することができる。
[00503] ある場合には、ステップＢのＴＩＬ集団は、以下で考察するプロトコルを用
いて直ちに凍結保存することができる。或いは、バルクＴＩＬ集団にステップＣ及びステップＤを施し、ステップＤ後に凍結保存することができる。同様に、遺伝子修飾ＴＩＬを治療に使用する場合、ステップＢ又はステップＤのＴＩＬ集団は、適切な処置のため遺伝子修飾の対象となり得る。
Ｆ．任意選択の細胞生存率分析
[00504] 任意選択で、第１の拡大培養（初めのバルク拡大培養と称されることがある
）の後に、当該技術分野において公知の標準アッセイを用いて細胞生存率アッセイを実施することができる。例えば、バルクＴＩＬの試料に対してトリパンブルー色素排除アッセイを行うことができ、これは死細胞を選択的に標識して生存率の評価を可能にするものである。生存率の試験に用いられる他のアッセイとしては、限定はされないが、アラマーブルーアッセイ；及びＭＴＴアッセイを挙げることができる。
１．細胞数、生存率、フローサイトメトリー
[00505] 一部の実施形態において、細胞数及び／又は生存率が測定される。限定はさ
れないが、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、及びＣＤ５６などのマーカー、並びに本明細書に開示又は記載される任意の他のものの発現を抗体によるフローサイトメトリー、例えば限定はされないが、FACSCanto（商標）フローサイトメーター（BD Biosciences）を使用してBD Bio-sciences（BD Biosciences、San Jose, CA）から市販されているものによって測定することができる。細胞は、ディスポーザブルc-chip血球計算盤（VWR、Batavia, IL）を
使用して手動でカウントすることができ、及び生存率は、限定はされないがトリパンブルー染色を含め、当該技術分野において公知の任意の方法を用いて評価することができる。
[00506] ある場合には、バルクＴＩＬ集団は、以下で考察するプロトコルを用いて直
ちに凍結保存することができる。或いは、バルクＴＩＬ集団は、以下で考察するとおり、ＲＥＰに供し、次に凍結保存してもよい。同様に、療法において遺伝子修飾ＴＩＬが使用されることになる場合、バルク又はＲＥＰ ＴＩＬ集団を好適な処置のための遺伝子修飾に供してもよい。
２．細胞培養
[00507] ある実施形態において、ＴＩＬの拡大培養方法は、約５，０００ｍＬ～約２
５，０００ｍＬの細胞培地、約５，０００ｍＬ～約１０，０００ｍＬの細胞培地、又は約５，８００ｍＬ～約８，７００ｍＬの細胞培地を使用することを含み得る。ある実施形態において、ＴＩＬ数の拡大には１種類以下の細胞培養培地が使用される。任意の好適な細胞培養培地、例えば、AIM-V細胞培地（Ｌ－グルタミン、５０μＭ硫酸ストレプトマイシ
ン、及び１０μＭ硫酸ゲンタマイシン）細胞培養培地（Invitrogen、Carlsbad CA）を使
用し得る。この点に関して、本発明の方法では有利には、ＴＩＬ数の拡大に必要な培地の量及び培地の種類の数が減少する。ある実施形態において、ＴＩＬ数の拡大は、３日又は４日に１回以下の頻度で細胞をフィードすることを含み得る。ガス透過性容器内で細胞の数を拡大すると、細胞の拡大培養に必要なフィーディング頻度が減少することにより細胞の数の拡大に必要な手順が簡便になる。
[00508] ある実施形態において、第１及び／又は第２のガス透過性容器内の細胞培地
はろ過されていない。ろ過されていない細胞培地を使用すると、細胞の数の拡大に必要な手順が簡便になり得る。ある実施形態において、第１及び／又は第２のガス透過性容器内の細胞培地はβ－メルカプトエタノール（ＢＭＥ）を含まない。
[00509] ある実施形態において、哺乳類から腫瘍組織試料を入手すること；細胞培地
が中に入った第１のガス透過性容器内で腫瘍組織試料を培養すること；腫瘍組織試料からＴＩＬを入手すること；ａＡＰＣを使用して細胞培地が中に入った第２のガス透過性容器内でＴＩＬ数を約１４～約４２日間、例えば約２８日間拡大することを含む本方法の所要期間。
[00510] ある実施形態において、ＴＩＬはガス透過性容器内で拡大培養される。ガス
透過性容器は、米国特許出願公開第２００５／０１０６７１７ Ａ１号（この開示は参照により本明細書に援用される）に記載されるものを含め、当該技術分野において公知の方法、組成物、及び装置を用いたＰＢＭＣを使用したＴＩＬの拡大培養に用いられている。ある実施形態において、ＴＩＬはガス透過性バッグ内で拡大培養される。ある実施形態において、ＴＩＬは、Xuri Cell Expansion System W25（GE Healthcare）など、ガス透過
性バッグ内でＴＩＬを拡大培養する細胞拡大培養システムを使用して拡大培養される。ある実施形態において、ＴＩＬは、Xuri Cell Expansion System W5（GE Healthcare）としても知られるWAVE Bioreactor Systemなど、ガス透過性バッグ内でＴＩＬを拡大培養する細胞拡大培養システムを使用して拡大培養される。ある実施形態において、細胞拡大培養システムは、約１００ｍＬ、約２００ｍＬ、約３００ｍＬ、約４００ｍＬ、約５００ｍＬ、約６００ｍＬ、約７００ｍＬ、約８００ｍＬ、約９００ｍＬ、約１Ｌ、約２Ｌ、約３Ｌ、約４Ｌ、約５Ｌ、約６Ｌ、約７Ｌ、約８Ｌ、約９Ｌ、及び約１０Ｌからなる群から選択される容積を有するガス透過性細胞バッグを含む。
[00511] ある実施形態において、ＴＩＬはG-Rexフラスコ（Wilson Wolf Manufacturingから市販されている）において拡大培養することができる。かかる実施形態は、細胞集
団を約５×１０５細胞／ｃｍ２から１０×１０６～３０×１０６細胞／ｃｍ２へと拡大培養することを可能にする。一実施形態では、これはフィーディングを伴わない。ある実施形態において、これは、G-Rexフラスコ内に約１０ｃｍの高さの培地がある限りフィーデ
ィングなしである。ある実施形態において、これにフィーディングはないが、１つ以上のサイトカインが加えられる。ある実施形態において、サイトカインは、サイトカインを培地と混合する必要は一切なしにボーラスとして加えることができる。かかる容器、装置、及び方法は当該技術分野において公知で、ＴＩＬの拡大培養に用いられており、米国特許出願公開第２０１４／０３７７７３９Ａ１号、国際公開第２０１４／２１００３６ Ａ１号、米国特許出願公開第２０１３／０１１５６１７ Ａ１号、国際公開第２０１３／１８８４２７ Ａ１号、米国特許出願公開第２０１１／０１３６２２８ Ａ１号、米国特許第８，８０９，０５０ Ｂ２号、国際公開第２０１１／０７２０８８ Ａ２号、米国特許出願公開第２０１６／０２０８２１６ Ａ１号、米国特許出願公開第２０１２／０２４４１３３ Ａ１号、国際公開第２０１２／１２９２０１ Ａ１号、米国特許出願公開第２０１３／０１０２０７５ Ａ１号、米国特許第８，９５６，８６０ Ｂ２号、国際公開第２０１３／１７３８３５ Ａ１号、米国特許出願公開第２０１５／０１７５９６６ Ａ１号（これらの開示は参照により本明細書に援用される）に記載されるものが含まれる。かかるプロセスはまた、Jin et al., J.Immunotherapy, 2012, 35:283-292にも記載されている
。任意選択のＴＩＬ遺伝子改変
[00512] 一部の実施形態において、ＴＩＬは任意選択で、限定はされないが、高親和
性Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）、例えば、ＭＡＧＥ－１、ＨＥＲ２、若しくはＮＹ－ＥＳＯ－１などの腫瘍関連抗原を標的とするＴＣＲ、又は腫瘍関連細胞表面分子（例えばメソテリン）若しくは系統限定的細胞表面分子（例えばＣＤ１９）に結合するキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を含め、追加の機能性を含むように遺伝子改変される。
ＩＶ．患者の処置方法
[00513] 処置方法は、最初のＴＩＬ収集及びＴＩＬの培養から始まる。かかる方法に
ついては、両方ともに当該技術分野において、例えばJin et al., J.Immunotherapy, 2012, 35(3):283-292（全体として参照により本明細書に援用される）により記載されている。処置方法の実施形態は、実施例を含む以下のセクション全体で説明される。
[00514] 本明細書に記載の方法、例えば上記のステップＡ～Ｆに記載の方法を含む、
又は上記のステップＡ～Ｆに記載の方法（又、図２７に示すものなど）に従って作製された拡大培養ＴＩＬは、癌患者の処置における特定の使用（例えば、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、Goff, et al., J. Clinical Oncology, 2016, 34(20):2389-239、並びに補足内容）が見出される。一部の実施形態では、ＴＩＬは、先述のとおり転移
性黒色腫の寄託切除物から成長させた（Dudley, et al., J Immunother., 2003, 26:332-342を参照のこと；全体として参照により本明細書に援用される）。新鮮腫瘍は無菌条件
下で剥離し得る。正式な病理解析のため、代表試料を収集し得る。２ｍｍ３～３ｍｍ３の単一の断片が使用され得る。一部の実施形態において、患者１人当たり５、１０、１５、２０、２５又は３０の試料を入手する。一部の実施形態において、患者１人当たり２０、２５、又は３０の試料を入手する。一部の実施形態において、患者１人当たり２０、２２、２４、２６、又は２８の試料を入手する。一部の実施形態において、患者１人当たり２４の試料を入手する。試料を２４ウェルプレートの個々のウェルに置き、高用量ＩＬ－２（６，０００ＩＵ／ｍＬ）を含む成長培地中に維持し、腫瘍の破壊及び／又はＴＩＬの増殖に関してモニタし得る。処理後に生細胞が残っている任意の腫瘍を酵素消化して単一細胞懸濁液にし、本明細書に記載されるとおり凍結保存し得る。
[00515] 一部の実施形態において、表現型分析（ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、及びＣＤ
５６）のため拡大培養ＴＩＬをサンプリングし、利用可能な場合には自己腫瘍に対して試
験し得る。ＴＩＬは、一晩の共培養によりインターフェロンガンマ（ＩＦＮ－γ）レベル＞２００ｐｇ／ｍＬ及びバックグラウンドの２倍となった場合に応答性であると見なすことができる。（Goff, et al., J Immunother., 2010, 33:840-847；全体として参照によ
り本明細書に援用される）。一部の実施形態において、自己応答性又は十分な成長パターンのエビデンスを有する培養物が、迅速拡大培養（ＲＥＰ）と称されることもある第２の拡大培養を含め、第２の拡大培養（例えば、図２７のステップＤにおいて提供されるとおりの第２の拡大培養）に選択され得る。一部の実施形態において、高い自己応答性（例えば、第２の拡大培養中の高い増殖）を有する拡大培養ＴＩＬが、追加の第２の拡大培養に選択される。一部の実施形態において、自己応答性（例えば、図２７のステップＤに提供されるとおりの第２の拡大培養中の高い増殖）を有するＴＩＬが、図２７のステップＤに係る追加の第２の拡大培養に選択される。
[00516] 一部の実施形態において、患者はＡＣＴ（養子細胞移入）に直接移されず、
例えば、一部の実施形態において、腫瘍採取後及び／又は第１の拡大培養後、細胞はすぐには利用されない。一部の実施形態において、ＴＩＬは凍結保存し、患者への投与の２日前に解凍することができる。一部の実施形態において、ＴＩＬは凍結保存し、患者への投与の１日前に解凍することができる。一部の実施形態において、ＴＩＬは凍結保存し、患者への投与の直前に解凍することができる。
[00517] 輸注バッグＴＩＬの凍結保存試料の細胞表現型は、表面マーカーＣＤ３、Ｃ
Ｄ４、ＣＤ８、ＣＣＲ７、及びＣＤ４５ＲＡ（BD BioSciences）に関するフローサイトメトリー（例えば、FlowJo）、並びに本明細書に記載される方法のいずれかによって分析することができる。血清サイトカインは標準的な酵素結合免疫吸着アッセイ法を用いることにより測定した。血清ＩＦＮ－ｇの上昇は、＞１００ｐｇ／ｍＬ及び４ ３ベースラインレベル超（greater than 4 3 baseline levels）と定義した。
[00518] 一部の実施形態において、本明細書で提供される方法、例えば図２７に例示
される方法により作製されるＴＩＬは、ＴＩＬの臨床有効性の驚くべき改善を提供する。一部の実施形態において、本明細書で提供される方法、例えば図２７に例示される方法により作製されるＴＩＬは、例えば図２７に例示される方法以外の方法を含む、本明細書に記載されるもの以外の方法により作製されるＴＩＬに比べて臨床有効性が増加する。一部の実施形態において、本明細書に記載されているもの以外の方法は、プロセス１Ｃ及び／又はジェネレーション１（Ｇｅｎ１）と称される方法を含む。一部の実施形態において、有効性の増加は、ＤＣＲ、ＯＲＲ、及び／又は他の臨床応答によって測定される。一部の実施形態において、本明細書で提供される方法、例えば図２７に例示される方法により作製されるＴＩＬは、例えば図２７に例示される方法以外の、例えばＧｅｎ１プロセスを含む、本明細書に記載されるもの以外の方法により作製されるＴＩＬと同様の応答時間及び安全プロファイルを示す。
[00519] 一部の実施形態において、ＩＦＮ－ガンマ（ＩＦＮ－γ）は、処置有効性及
び／又は臨床有効性の増加の指標である。一部の実施形態において、ＴＩＬで処置された被験者の血液中のＩＦＮ－γは、活性ＴＩＬの指標である。一部の実施形態において、ＩＦＮ－γ産生の効力アッセイが用いられる。ＩＦＮ－γ産生は、細胞傷害能のもう１つの尺度である。ＩＦＮ－γ産生は、本発明の方法、例えば、図２７に例示されるものを含む方法により調製されたＴＩＬで処置された対象の血液、血清、又はＴＩＬエキソビボ中のサイトカインＩＦＮ－γのレベルを決定することにより測定できる。一部の実施形態において、ＩＦＮ－γの増加は、本発明の方法により作製されたＴＩＬで処置された患者における処置有効性の指標である。一部の実施形態において、ＩＦＮ－γは、未処置患者と比較して、及び／又は、例えば、図２７で具体化された方法以外の方法を含む、本明細書で提供する以外の方法を使用して調製されたＴＩＬで処置された患者と比較して、１倍、２
倍、３倍、４倍、又は５倍以上増加する。一部の実施形態において、ＩＦＮ－γ分泌は、未処置患者と比較して、及び／又は、例えば、図２７で具体化された方法以外の方法を含む、本明細書で提供する以外の方法を使用して調製されたＴＩＬで処置された患者と比較して、１倍増加する。一部の実施形態において、ＩＦＮ－γ分泌は、未処置患者と比較して、及び／又は、例えば、図２７で具体化された方法以外の方法を含む、本明細書で提供する以外の方法を使用して調製されたＴＩＬで処置された患者と比較して２倍増加する。一部の実施形態において、ＩＦＮ－γ分泌は、未処置患者と比較して、及び／又は、例えば、図２７で具体化された方法以外の方法を含む、本明細書で提供する以外の方法を使用して調製されたＴＩＬで処置された患者と比較して３倍増加する。一部の実施形態において、ＩＦＮ－γ分泌は、未処置患者と比較して、及び／又は、例えば、図２７で具体化された方法以外の方法を含む、本明細書で提供する以外の方法を使用して調製されたＴＩＬで処置された患者と比較して４倍増加する。一部の実施形態において、ＩＦＮ－γ分泌は、未処置患者と比較して、及び／又は、例えば、図２７で具体化された方法以外の方法を含む、本明細書で提供する以外の方法を使用して調製されたＴＩＬで処置された患者と比較して５倍増加する。一部の実施形態において、ＩＦＮ－γはQuantikine ELISA kitを使用して測定される。一部の実施形態において、ＩＦＮ－γは、例えば図２７に記載されるものを含む、本発明の方法により調製されたＴＩＬで処置された対象のＴＩＬエキソビボで測定される。一部の実施形態において、ＩＦＮ－γは、例えば図２７に記載されるものを含む、本発明の方法により調製されたＴＩＬで処置された対象の血液で測定される。一部の実施形態において、ＩＦＮ－γは、例えば図２７に記載されるものを含む、本発明の方法により調製されたＴＩＬで処置された対象のＴＩＬ血清で測定される。
[00520] 一部の実施形態において、より高い平均ＩＰ－１０は、処置有効性及び／又
は臨床有効性の増加の指標である。一部の実施形態において、ＴＩＬで処置された被験者の血液中のより高い平均ＩＰ－１０は、活性ＴＩＬの指標である。ＩＰ－１０産生は、本発明の方法、例えば、図２７に例示されるものを含む方法により調製されたＴＩＬで処置された対象の血液のＩＰ－１０のレベルを決定することにより測定できる。一部の実施形態において、より高い平均ＩＰ－１０は、本発明の方法により作製されたＴＩＬで処置された患者における処置有効性の指標である。一部の実施形態において、より高い平均ＩＰ－１０は、未処置患者と比較して、及び／又は、例えば、図２７で具体化された方法以外の方法を含む、本明細書で提供する以外の方法を使用して調製されたＴＩＬで処置された患者と比較して、１倍、２倍、３倍、４倍、又は５倍以上の増加と相関する。一部の実施形態において、より高い平均ＩＰ－１０は、未処置患者と比較して、及び／又は、例えば、図２７で具体化された方法以外の方法を含む、本明細書で提供する以外の方法を使用して調製されたＴＩＬで処置された患者と比較して、１倍の増加と相関する。一部の実施形態において、より高い平均ＩＰ－１０は、未処置患者と比較して、及び／又は、例えば、図２７で具体化された方法以外の方法を含む、本明細書で提供する以外の方法を使用して調製されたＴＩＬで処置された患者と比較して、２倍の増加と相関する。一部の実施形態において、より高い平均ＩＰ－１０は、未処置患者と比較して、及び／又は、例えば、図２７で具体化された方法以外の方法を含む、本明細書で提供する以外の方法を使用して調製されたＴＩＬで処置された患者と比較して、３倍の増加と相関する。一部の実施形態において、より高い平均ＩＰ－１０は、未処置患者と比較して、及び／又は、例えば、図２７で具体化された方法以外の方法を含む、本明細書で提供する以外の方法を使用して調製されたＴＩＬで処置された患者と比較して、４倍の増加と相関する。一部の実施形態において、より高い平均ＩＰ－１０は、未処置患者と比較して、及び／又は、例えば、図２７で具体化された方法以外の方法を含む、本明細書で提供する以外の方法を使用して調製されたＴＩＬで処置された患者と比較して、５倍の増加と相関する。一部の実施形態において、ＩＰ－１０は、例えば図２７に記載されるものを含む、本発明の方法により調製されたＴＩＬで処置された対象の血液で測定される。一部の実施形態において、ＩＰ－１０は、例えば図２７に記載されるものを含む、本発明の方法により調製されたＴＩＬで処置さ
れた対象のＴＩＬ血清で測定される。
[00521] 一部の実施形態において、より高い平均ＭＣＰ－１は、処置有効性及び／又
は臨床有効性の増加の指標である。一部の実施形態において、ＴＩＬで処置された被験者の血液中のより高い平均ＭＣＰ－１は、活性ＴＩＬの指標である。ＭＣＰ－１産生は、本発明の方法、例えば、図２７に例示されるものを含む方法により調製されたＴＩＬで処置された対象の血液のＭＣＰ－１のレベルを決定することにより測定できる。一部の実施形態において、より高い平均ＭＣＰ－１は、本発明の方法により作製されたＴＩＬで処置された患者における処置有効性の指標である。一部の実施形態において、より高い平均ＭＣＰ－１は、未処置患者と比較して、及び／又は、例えば、図２７で具体化された方法以外の方法を含む、本明細書で提供する以外の方法を使用して調製されたＴＩＬで処置された患者と比較して、１倍、２倍、３倍、４倍、又は５倍以上の増加と相関する。一部の実施形態において、より高い平均ＭＣＰ－１は、未処置患者と比較して、及び／又は、例えば、図２７で具体化された方法以外の方法を含む、本明細書で提供する以外の方法を使用して調製されたＴＩＬで処置された患者と比較して、１倍の増加と相関する。一部の実施形態において、より高い平均ＭＣＰ－１は、未処置患者と比較して、及び／又は、例えば、図２７で具体化された方法以外の方法を含む、本明細書で提供する以外の方法を使用して調製されたＴＩＬで処置された患者と比較して、２倍の増加と相関する。一部の実施形態において、より高い平均ＭＣＰ－１は、未処置患者と比較して、及び／又は、例えば、図２７で具体化された方法以外の方法を含む、本明細書で提供する以外の方法を使用して調製されたＴＩＬで処置された患者と比較して、３倍の増加と相関する。一部の実施形態において、より高い平均ＭＣＰ－１は、未処置患者と比較して、及び／又は、例えば、図２７で具体化された方法以外の方法を含む、本明細書で提供する以外の方法を使用して調製されたＴＩＬで処置された患者と比較して、４倍の増加と相関する。一部の実施形態において、より高い平均ＭＣＰ－１は、未処置患者と比較して、及び／又は、例えば、図２７で具体化された方法以外の方法を含む、本明細書で提供する以外の方法を使用して調製されたＴＩＬで処置された患者と比較して、５倍の増加と相関する。一部の実施形態において、ＭＣＰ－１は、例えば図２７に記載されるものを含む、本発明の方法により調製されたＴＩＬで処置された対象の血液で測定される。一部の実施形態において、ＭＣＰ－１は、例えば図２７に記載されるものを含む、本発明の方法により調製されたＴＩＬで処置された対象のＴＩＬ血清で測定される。
[00522] 一部の実施形態において、例えば図２７に記載されるものを含む本発明の方
法により調製されたＴＩＬは、例えば図２７に例示されない、例えばプロセス１Ｃメソッドと称されるものを含む他の方法により作製されるＴＩＬと比較してポリクローナル性の増加を示す。一部の実施形態において、有意に改善されたポリクローナル性及び／又は増加したポリクローナル性は、処置有効性及び／又は臨床有効性の増加の指標である。一部の実施形態において、ポリクローナル性とは、Ｔ細胞レパートリーの多様性を指す。一部の実施形態において、ポリクローナル性の増加は、本発明の方法に作製されたＴＩＬを投与された患者に関する処置有効性の指標である。一部の実施形態において、ポリクローナル性は、例えば、図２７に具体化された方法以外の方法を含む、本明細書で提供する以外の方法を使用して調製されたＴＩＬと比較して１倍、２倍、１０倍、１００倍、５００倍、又は１０００倍が増加する。一部の実施形態において、ポリクローナル性は、未処置患者と比較して、及び／又は、例えば、図２７で具体化された方法以外の方法を含む、本明細書で提供する以外の方法を使用して調製されたＴＩＬで処置された患者と比較して、１倍増加する。一部の実施形態において、ポリクローナル性は、未処置患者と比較して、及び／又は、例えば、図２７で具体化された方法以外の方法を含む、本明細書で提供する以外の方法を使用して調製されたＴＩＬで処置された患者と比較して、２倍増加する。一部の実施形態において、ポリクローナル性は、未処置患者と比較して、及び／又は、例えば、図２７で具体化された方法以外の方法を含む、本明細書で提供する以外の方法を使用し
て調製されたＴＩＬで処置された患者と比較して、１０倍増加する。一部の実施形態において、ポリクローナル性は、未処置患者と比較して、及び／又は、例えば、図２７で具体化された方法以外の方法を含む、本明細書で提供する以外の方法を使用して調製されたＴＩＬで処置された患者と比較して、１００倍増加する。一部の実施形態において、ポリクローナル性は、未処置患者と比較して、及び／又は、例えば、図２７で具体化された方法以外の方法を含む、本明細書で提供する以外の方法を使用して調製されたＴＩＬで処置された患者と比較して、５００倍増加する。一部の実施形態において、ポリクローナル性は、未処置患者と比較して、及び／又は、例えば、図２７で具体化された方法以外の方法を含む、本明細書で提供する以外の方法を使用して調製されたＴＩＬで処置された患者と比較して、１０００倍増加する。
[00523] 有効性の尺度には、当該技術分野において公知であり、実施例２８を含む本
明細書に提供される実施例に記載されるように、疾患制御率（ＤＣＲ：Disease Control Rate）測定値並びに全奏効率（ＯＲＲ：Overall Response Rate）が含まれ得る。
１．癌及びその他の疾患の処置方法
[00524] 本明細書に記載の組成物及び方法は、疾患の処置方法で使用することができ
る。一実施形態において、それらは過剰成長性障害の処置に使用するためのものである。それらはまた、本明細書及び以下の段落に記載されているとおりその他の障害の処置に使用されてもよい。
[00525] 一部の実施形態において、過剰成長性障害は癌である。一部の実施形態にお
いて、過剰成長性障害は固形腫瘍癌である。一部の実施形態において、固形腫瘍癌は、黒色腫、卵巣癌、子宮頸癌、非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）、肺癌、膀胱癌、乳癌、ヒトパピローマウイルスによって引き起こされる癌、頭頸部癌（頭頸部扁平上皮癌（ＨＮＳＣＣ）を含む）、腎癌、及び腎細胞癌からなる群から選択される。一部の実施形態において、過剰成長性障害は血液学的悪性腫瘍である。一部の実施形態において、固形腫瘍癌は、慢性リンパ球性白血病、急性リンパ芽球性白血病、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、非ホジキンリンパ腫、ホジキンリンパ腫、濾胞性リンパ腫、及びマントル細胞リンパ腫からなる群から選択される。
[00526] ある実施形態において、本発明は、ＴＩＬ集団で癌を処置する方法を含み、
ここで患者は本開示に係るＴＩＬの注入前に骨髄非破壊的化学療法で前処置される。ある実施形態において、骨髄非破壊的化学療法は、２日間（ＴＩＬ注入前２７日目及び２６日目）のシクロホスファミド６０ｍｇ／ｋｇ／日及び５日間（ＴＩＬ注入前２７～２３日目）のフルダラビン２５ｍｇ／ｍ２／日である。ある実施形態において、骨髄非破壊的化学療法及び本開示に係るＴＩＬ注入（０日目）の後、患者は生理学的忍容量まで８時間毎に静脈内に７２０，０００ＩＵ／ｋｇのＩＬ－２の静脈内注入を受ける。
[00527] 示された疾患又は障害の処置、予防及び／又は管理における本明細書に記載
の化合物及び化合物の組み合わせの有効性は、ヒト疾患の処置のためのガイダンスを提供する当該技術分野でにおいて公知の様々なモデルを使用して試験することができる。例えば、卵巣癌の処置の有効性を決定するためのモデルは、例えば、Mullany, et al., Endocrinology 2012, 153, 1585-92;及びFong, et al., J. Ovarian Res.2009, 2, 12に記載がある。膵臓癌の処置の有効性を決定するためのモデルは、Herreros-Villanueva, et al.,
World J. Gastroenterol.2012, 18, 1286-1294に記載がある。乳癌の処置の有効性を決
定するためのモデルは、例えば、Fantozzi, Breast Cancer Res.2006, 8, 212に記載がある。黒色腫の処置の有効性を決定するためのモデルは、例えば、Damsky, et al., Pigment Cell & Melanoma Res.2010, 23, 853-859に記載がある。肺癌の処置の有効性を決定す
るためのモデルは、例えば、Meuwissen, et al., Genes & Development, 2005, 19, 643-
664に記載がある。肺癌処置の有効性を決定するためのモデルは、例えば、Kim, Clin.Exp.Otorhinolaryngol.2009, 2, 55-60;及びSano, Head Neck Oncol.2009, 1, 32に記載がある。
[00528] 一部の実施形態において、ＩＦＮ－ガンマ（ＩＦＮ－γ）は、過剰成長性傷
害の処置有効性の指標である。一部の実施形態において、ＴＩＬで処置された被験者の血液中のＩＦＮ－γは、活性ＴＩＬの指標である。一部の実施形態において、ＩＦＮ－γ産生の効力アッセイが用いられる。ＩＦＮ－γ産生は、細胞傷害能のもう１つの尺度である。ＩＦＮ－γ産生は、本発明の方法、例えば、図２７に例示されるものを含む方法により調製されたＴＩＬで処置された対象の血液中のサイトカインＩＦＮ－γのレベルを決定することにより測定できる。一部の実施形態において、本方法で得られたＴＩＬは、図８３に例示されるように、プロセス１Ｃと称される方法を使用して調製されたＴＩＬで処置された被験者と比較して、本方法のＴＩＬで処置された対象の血液中のＩＦＮ－γの増加をもたらす。一部の実施形態において、ＩＦＮ－γの増加は、本発明の方法により作製されたＴＩＬで処置された患者における処置有効性の指標である。一部の実施形態において、ＩＦＮ－γは、未処置患者と比較して、及び／又は、例えば、図２７で具体化された方法以外の方法を含む、本明細書で提供する以外の方法を使用して調製されたＴＩＬで処置された患者と比較して、１倍、２倍、３倍、４倍、又は５倍以上増加する。一部の実施形態において、ＩＦＮ－γ分泌は、未処置患者と比較して、及び／又は、例えば、図２７で具体化された方法以外の方法を含む、本明細書で提供する以外の方法を使用して調製されたＴＩＬで処置された患者と比較して、１倍増加する。一部の実施形態において、ＩＦＮ－γ分泌は、未処置患者と比較して、及び／又は、例えば、図２７で具体化された方法以外の方法を含む、本明細書で提供する以外の方法を使用して調製されたＴＩＬで処置された患者と比較して２倍増加する。一部の実施形態において、ＩＦＮ－γ分泌は、未処置患者と比較して、及び／又は、例えば、図２７で具体化された方法以外の方法を含む、本明細書で提供する以外の方法を使用して調製されたＴＩＬで処置された患者と比較して３倍増加する。一部の実施形態において、ＩＦＮ－γ分泌は、未処置患者と比較して、及び／又は、例えば、図２７で具体化された方法以外の方法を含む、本明細書で提供する以外の方法を使用して調製されたＴＩＬで処置された患者と比較して４倍増加する。一部の実施形態において、ＩＦＮ－γ分泌は、未処置患者と比較して、及び／又は、例えば、図２７で具体化された方法以外の方法を含む、本明細書で提供する以外の方法を使用して調製されたＴＩＬで処置された患者と比較して５倍増加する。一部の実施形態において、ＩＦＮ－γはQuantikine ELISA kitを使用して測定される。一部の実施形態において、ＩＦＮ－γはQuantikine ELISA kitを使用して測定される。一部の実施形態において、ＩＦＮ－γは、本発明の方法により作製されたＴＩＬで処置された患者からのＴＩＬエキソビボにおいて測定される。一部の実施形態において、ＩＦＮ－γは、本発明の方法により作製されたＴＩＬで処置された患者の血液において測定される。一部の実施形態において、ＩＦＮ－γは、本発明の方法により作製されたＴＩＬで処置された患者の血清において測定される。
[00529] 一部の実施形態において、より高い平均ＩＰ－１０は、過剰成長性傷害処置
の処置有効性及び／又は臨床有効性の増加の指標である。一部の実施形態において、ＴＩＬで処置された被験者の血液中のより高い平均ＩＰ－１０は、活性ＴＩＬの指標である。一部の実施形態において、本方法で得られたＴＩＬは、図８３に例示されるように、プロセス１Ｃと称される方法を使用して調製されたＴＩＬで処置された被験者と比較して、本方法のＴＩＬで処置された対象の血液中のより高い平均ＩＰ－１０をもたらす。ＩＰ－１０産生は、本発明の方法、例えば、図２７に例示されるものを含む方法により調製されたＴＩＬで処置された対象の血液のＩＰ－１０のレベルを決定することにより測定できる。一部の実施形態において、より高い平均ＩＰ－１０は、本発明の方法により作製されたＴＩＬで処置された患者における処置有効性の指標である。一部の実施形態において、より
高い平均ＩＰ－１０は、未処置患者と比較して、及び／又は、例えば、図２７で具体化された方法以外の方法を含む、本明細書で提供する以外の方法を使用して調製されたＴＩＬで処置された患者と比較して、１倍、２倍、３倍、４倍、又は５倍以上の増加と相関する。一部の実施形態において、より高い平均ＩＰ－１０は、未処置患者と比較して、及び／又は、例えば、図２７で具体化された方法以外の方法を含む、本明細書で提供する以外の方法を使用して調製されたＴＩＬで処置された患者と比較して、１倍の増加と相関する。一部の実施形態において、より高い平均ＩＰ－１０は、未処置患者と比較して、及び／又は、例えば、図２７で具体化された方法以外の方法を含む、本明細書で提供する以外の方法を使用して調製されたＴＩＬで処置された患者と比較して、２倍の増加と相関する。一部の実施形態において、より高い平均ＩＰ－１０は、未処置患者と比較して、及び／又は、例えば、図２７で具体化された方法以外の方法を含む、本明細書で提供する以外の方法を使用して調製されたＴＩＬで処置された患者と比較して、３倍の増加と相関する。一部の実施形態において、より高い平均ＩＰ－１０は、未処置患者と比較して、及び／又は、例えば、図２７で具体化された方法以外の方法を含む、本明細書で提供する以外の方法を使用して調製されたＴＩＬで処置された患者と比較して、４倍の増加と相関する。一部の実施形態において、より高い平均ＩＰ－１０は、未処置患者と比較して、及び／又は、例えば、図２７で具体化された方法以外の方法を含む、本明細書で提供する以外の方法を使用して調製されたＴＩＬで処置された患者と比較して、５倍の増加と相関する。
[00530] 一部の実施形態において、より高い平均ＭＣＰ－１は、過剰成長性傷害処置
の処置有効性及び／又は臨床有効性の増加の指標である。一部の実施形態において、ＴＩＬで処置された被験者の血液中のより高い平均ＭＣＰ－１は、活性ＴＩＬの指標である。一部の実施形態において、本方法で得られたＴＩＬは、図８３に例示されるように、プロセス１Ｃと称される方法を使用して調製されたＴＩＬで処置された被験者と比較して、本方法のＴＩＬで処置された対象の血液中のより高い平均ＭＣＰ－１をもたらす。ＭＣＰ－１産生は、本発明の方法、例えば、図２７に例示されるものを含む方法により調製されたＴＩＬで処置された対象の血液のＭＣＰ－１のレベルを決定することにより測定できる。一部の実施形態において、より高い平均ＭＣＰ－１は、本発明の方法により作製されたＴＩＬで処置された患者における処置有効性の指標である。一部の実施形態において、より高い平均ＭＣＰ－１は、未処置患者と比較して、及び／又は、例えば、図２７で具体化された方法以外の方法を含む、本明細書で提供する以外の方法を使用して調製されたＴＩＬで処置された患者と比較して、１倍、２倍、３倍、４倍、又は５倍以上の増加と相関する。一部の実施形態において、より高い平均ＭＣＰ－１は、未処置患者と比較して、及び／又は、例えば、図２７で具体化された方法以外の方法を含む、本明細書で提供する以外の方法を使用して調製されたＴＩＬで処置された患者と比較して、１倍の増加と相関する。一部の実施形態において、より高い平均ＭＣＰ－１は、未処置患者と比較して、及び／又は、例えば、図２７で具体化された方法以外の方法を含む、本明細書で提供する以外の方法を使用して調製されたＴＩＬで処置された患者と比較して、２倍の増加と相関する。一部の実施形態において、より高い平均ＭＣＰ－１は、未処置患者と比較して、及び／又は、例えば、図２７で具体化された方法以外の方法を含む、本明細書で提供する以外の方法を使用して調製されたＴＩＬで処置された患者と比較して、３倍の増加と相関する。一部の実施形態において、より高い平均ＭＣＰ－１は、未処置患者と比較して、及び／又は、例えば、図２７で具体化された方法以外の方法を含む、本明細書で提供する以外の方法を使用して調製されたＴＩＬで処置された患者と比較して、４倍の増加と相関する。一部の実施形態において、より高い平均ＭＣＰ－１は、未処置患者と比較して、及び／又は、例えば、図２７で具体化された方法以外の方法を含む、本明細書で提供する以外の方法を使用して調製されたＴＩＬで処置された患者と比較して、５倍の増加と相関する。
[00531] 一部の実施形態において、例えば図２７に記載されるものを含む本発明の方
法により調製されたＴＩＬは、例えば図２７に例示されない、例えばプロセス１Ｃメソッ
ドと称されるものを含む他の方法により作製されるＴＩＬと比較してポリクローナル性の増加を示す。一部の実施形態において、有意に改善されたポリクローナル性及び／又は増加したポリクローナル性は、癌処置の処置有効性及び／又は臨床有効性の増加の指標である。一部の実施形態において、ポリクローナル性とは、Ｔ細胞レパートリーの多様性を指す。一部の実施形態において、ポリクローナル性の増加は、本発明の方法に作製されたＴＩＬを投与された患者に関する処置有効性の指標である。一部の実施形態において、ポリクローナル性は、例えば、図２７に具体化された方法以外の方法を含む、本明細書で提供する以外の方法を使用して調製されたＴＩＬと比較して１倍、２倍、１０倍、１００倍、５００倍、又は１０００倍が増加する。一部の実施形態において、ポリクローナル性は、未処置患者と比較して、及び／又は、例えば、図２７で具体化された方法以外の方法を含む、本明細書で提供する以外の方法を使用して調製されたＴＩＬで処置された患者と比較して、１倍増加する。一部の実施形態において、ポリクローナル性は、未処置患者と比較して、及び／又は、例えば、図２７で具体化された方法以外の方法を含む、本明細書で提供する以外の方法を使用して調製されたＴＩＬで処置された患者と比較して、２倍増加する。一部の実施形態において、ポリクローナル性は、未処置患者と比較して、及び／又は、例えば、図２７で具体化された方法以外の方法を含む、本明細書で提供する以外の方法を使用して調製されたＴＩＬで処置された患者と比較して、１０倍増加する。一部の実施形態において、ポリクローナル性は、未処置患者と比較して、及び／又は、例えば、図２７で具体化された方法以外の方法を含む、本明細書で提供する以外の方法を使用して調製されたＴＩＬで処置された患者と比較して、１００倍増加する。一部の実施形態において、ポリクローナル性は、未処置患者と比較して、及び／又は、例えば、図２７で具体化された方法以外の方法を含む、本明細書で提供する以外の方法を使用して調製されたＴＩＬで処置された患者と比較して、５００倍増加する。一部の実施形態において、ポリクローナル性は、未処置患者と比較して、及び／又は、例えば、図２７で具体化された方法以外の方法を含む、本明細書で提供する以外の方法を使用して調製されたＴＩＬで処置された患者と比較して、１０００倍増加する。
２．共投与方法
[00532] 一部の実施形態において、例えば、図２７のステップＡ～Ｆに記載される方
法に由来するＴＩＬを含む、本明細書に記載されるとおり作製されるＴＩＬは、以下に記載する抗体など、１つ以上の免疫チェックポイント調節因子と併用して投与することができる。例えば、ＰＤ－１を標的とする、且つ本発明のＴＩＬと共投与し得る抗体としては、例えば、限定はされないが、ニボルマブ（ＢＭＳ－９３６５５８、Bristol-Myers Squibb；Opdivo（登録商標））、ペンブロリズマブ（ランブロリズマブ、ＭＫ０３４７５又はＭＫ－３４７５、Merck；Keytruda（登録商標））、ヒト化抗ＰＤ－１抗体ＪＳ００１（ShangHai JunShi）、モノクローナル抗ＰＤ－１抗体ＴＳＲ－０４２（Tesaro, Inc.）、ピジリズマブ（抗ＰＤ－１ ｍＡｂ ＣＴ－０１１、Medivation）、抗ＰＤ－１モノクローナル抗体ＢＧＢ－Ａ３１７（BeiGene）、及び／又は抗ＰＤ－１抗体ＳＨＲ－１２１０（ShangHai HengRui）、ヒトモノクローナル抗体ＲＥＧＮ２８１０（Regeneron）、ヒトモノクローナル抗体ＭＤＸ－１１０６（Bristol-Myers Squibb）、及び／又はヒト化抗ＰＤ１
ＩｇＧ４抗体ＰＤＲ００１（Novartis）が挙げられる。一部の実施形態において、ＰＤ－１抗体は、クローン：ＲＭＰ１－１４（ラットＩｇＧ）－BioXcellカタログ番号BP0146からのものである。本明細書に記載されるとおりのステップＡ～Ｆにより作製されるＴＩＬとの共投与方法における使用に好適な他の好適な抗体は、米国特許第８，００８，４４９号（本明細書において参照により援用される）に開示される抗ＰＤ－１抗体である。一部の実施形態において、抗体又はその抗原結合部分はＰＤ－Ｌ１に特異的に結合し、ＰＤ－１とのその相互作用を阻害し、それにより免疫活性を増加させる。ＰＤ－Ｌ１に結合してＰＤ－１とＰＤ－Ｌ１との間の相互作用を破壊し、且つ抗腫瘍免疫応答を刺激する当該技術分野において公知の任意の抗体が、本明細書に記載されるとおりのステップＡ～Ｆにより作製されるＴＩＬとの共投与方法における使用に好適である。例えば、ＰＤ－Ｌ１を
標的とする臨床試験中の抗体としては、ＢＭＳ－９３６５５９（Bristol-Myers Squibb）及びＭＰＤＬ３２８０Ａ（Genentech）が挙げられる。ＰＤ－Ｌ１を標的とする他の好適
な抗体は、米国特許第７，９４３，７４３号（本明細書において参照により援用される）に開示される。当業者は、ＰＤ－１又はＰＤ－Ｌ１に結合し、ＰＤ－１／ＰＤ－Ｌ１相互作用を破壊し、且つ抗腫瘍免疫応答を刺激する任意の抗体が、本明細書に記載されるとおりのステップＡ～Ｆにより作製されるＴＩＬとの共投与方法における使用に好適であることを理解するであろう。一部の実施形態において、ステップＡ～Ｆにより作製されるＴＩＬの組み合わせを投与される対象は、患者が抗ＰＤ－１抗体単独の投与に不応性の癌型を有するとき抗ＰＤ－１抗体と共投与される。一部の実施形態において、患者が難治性（refactory）黒色腫を有するとき、患者はＴＩＬを抗ＰＤ－１と併用して投与される。一部
の実施形態において、患者が非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）を有するとき、患者はＴＩＬを抗ＰＤ－１と併用して投与される。
３．任意選択での患者のリンパ球枯渇プレコンディショニング
[00533] ある実施形態において、本発明は、ＴＩＬ集団で癌を処置する方法を含み、
ここで患者は本開示に係るＴＩＬの注入前に骨髄非破壊的化学療法で前処置される。ある実施形態において、本発明は、骨髄非破壊的化学療法で前処置された患者の癌処置に使用するためのＴＩＬの集団を含む。ある実施形態において、ＴＩＬの集団は注入による投与用である。ある実施形態において、骨髄非破壊的化学療法は、２日間（ＴＩＬ注入前２７日目及び２６日目）のシクロホスファミド６０ｍｇ／ｋｇ／日及び５日間（ＴＩＬ注入前２７～２３日目）のフルダラビン２５ｍｇ／ｍ２／日である。ある実施形態において、骨髄非破壊的化学療法及び本開示に係るＴＩＬ注入（０日目）の後、患者は生理学的忍容量まで８時間毎に静脈内に７２０，０００ＩＵ／ｋｇのＩＬ－２（アルデスロイキン、PROLEUKINとして市販）の静脈内注入を受ける。特定の実施形態では、ＴＩＬの集団は、ＩＬ
－２と組み合わせて癌を処置するのに使用され、ＩＬ－２はＴＩＬの集団の後に投与される。
[00534] 実験的知見から、腫瘍特異的Ｔリンパ球の養子移入前のリンパ球枯渇が、調
節性Ｔ細胞及び免疫系の競合エレメント（「サイトカインシンク」）の除去により、処置有効性の増強において重要な役割を果たすことが指摘される。従って、本発明の一部の実施形態は、本発明のＴＩＬを導入する前に患者に対してリンパ球枯渇ステップ（「免疫抑制コンディショニング」とも称される）を利用する。
[00535] 一般に、リンパ球枯渇はフルダラビン又はシクロホスファミド（その活性型
はマホスファミドと称される）及びこれらの組み合わせの投与を使用して行われる。かかる方法については、Gassner, et al., Cancer Immunol.Immunother.2011, 60, 75-85, Muranski, et al., Nat.Clin.Pract.Oncol., 2006, 3, 668-681, Dudley, et al., J. Clin.Oncol.2008, 26, 5233-5239、及びDudley, et al., J. Clin.Oncol.2005, 23, 2346-2357（これらは全て、本明細書において全体として参照により援用される）に記載されてい
る。
[00536] 一部の実施形態において、フルダラビンは０．５μｇ／ｍｌ～１０μｇ／ｍ
Ｌフルダラビンの濃度で投与される。一部の実施形態において、フルダラビンは１μｇ／ｍＬフルダラビンの濃度で投与される。一部の実施形態において、フルダラビン処置は１日、２日、３日、４日、５日、６日、又は７日間又はそれ以上にわたり投与される。一部の実施形態において、フルダラビンは、１０ｍｇ／ｋｇ／日、１５ｍｇ／ｋｇ／日、２０ｍｇ／ｋｇ／日、２５ｍｇ／ｋｇ／日、３０ｍｇ／ｋｇ／日、３５ｍｇ／ｋｇ／日、４０ｍｇ／ｋｇ／日、又は４５ｍｇ／ｋｇ／日の投薬量で投与される。一部の実施形態において、フルダラビン処置は３５ｍｇ／ｋｇ／日で２～７日間にわたり投与される。一部の実施形態において、フルダラビン処置は３５ｍｇ／ｋｇ／日で４～５日間にわたり投与され
る。一部の実施形態において、フルダラビン処置は２５ｍｇ／ｋｇ／日で４～５日間にわたり投与される。
[00537] 一部の実施形態において、活性型のシクロホスファミドであるマホスファミ
ドは、シクロホスファミドの投与による０．５μｇ／ｍＬ～１０μｇ／ｍＬの濃度で得られる。一部の実施形態において、活性型のシクロホスファミドであるマホスファミドは、シクロホスファミドの投与による１μｇ／ｍＬの濃度で得られる。一部の実施形態において、シクロホスファミド処置は１日、２日、３日、４日、５日、６日、又は７日間又はそれ以上にわたり投与される。一部の実施形態において、シクロホスファミドは、１００ｍｇ／ｍ２／日、１５０ｍｇ／ｍ２／日、１７５ｍｇ／ｍ２／日、２００ｍｇ／ｍ２／日、２２５ｍｇ／ｍ２／日、２５０ｍｇ／ｍ２／日、２７５ｍｇ／ｍ２／日、又は３００ｍｇ／ｍ２／日の投薬量で投与される。一部の実施形態において、シクロホスファミドは静脈内に（即ち、ｉ．ｖ．）投与される。一部の実施形態において、シクロホスファミド処置は３５ｍｇ／ｋｇ／日で２～７日間にわたり投与される。一部の実施形態において、シクロホスファミド処置は２５０ｍｇ／ｍ２／日、ｉ．ｖ．で４～５日間にわたり投与される。一部の実施形態において、シクロホスファミド処置は２５０ｍｇ／ｍ２／日、ｉ．ｖ．で４日間にわたり投与される。
[00538] 一部の実施形態において、リンパ球枯渇は、フルダラビン及びシクロホスフ
ァミドの患者に併せて投与することで実施される。一部の実施形態において、４日間にわたってフルダラビンは２５ｍｇ／ｍ２／日、ｉ．ｖ．で投与され、シクロホスファミドは２５０ｍｇ／ｍ２／日、ｉ．ｖ．で投与される。
[00539] ある実施形態において、リンパ球枯渇は、６０ｍｇ／ｍ２／日の用量で２日
間のシクロホスファミドの投与ステップと、それに続く２５ｍｇ／ｍ２／日の用量で５日間のフルダラビンの投与により実施される。
４．ＩＬ－２レジメン
[00540] ある実施形態において、ＩＬ－２レジメンは、高用量ＩＬ－２レジメンを含
み、治療用ＴＩＬ集団の治療有効部分を投与した１日後から静脈内投与され始めた、高用量ＩＬ－２レジメンはアルデスロイキン又はそのバイオシミラー若しくはそれらの変異体を含み、アルデロイキン又はそのバイオシミラー若しくは変異体が忍容量まで８時間毎に１５分ボーラス静脈内注入を使用して、最大１４用量で、０．０３７ｍｇ／ｋｇ又は０．０４４ｍｇ／ｋｇ ＩＵ／ｋｇ（患者の体重）の用量で投与される。９日間の休息の後、このスケジュールを更に１４回、合計で最大２８回まで繰り返してもよい。
[00541] ある実施形態において、ＩＬ－２レジメンは、漸減性ＩＬ－２レジメンを含
む。漸減性ＩＬ－２レジメンは、O’Day, et al., J. Clin.Oncol.1999, 17, 2752-61及
びEton, et al., Cancer 2000, 88, 1703-9に記載されており、これらの開示は参照によ
り本明細書に援用される。ある実施形態において、漸減性ＩＬ－２レジメンは、１８×１０６ ＩＵ／ｍ２の６時間にわたる静脈内投与、それに続く１８×１０６ ＩＵ／ｍ２の１２時間にわたる静脈内投与、その後１８×１０６ ＩＵ／ｍ２の２４時間にわたる静脈内投与、その後４．５×１０６ ＩＵ／ｍ２の７２時間にわたる静脈内投与を含む。この処置サイクルは、最大４サイクル、２８日毎に繰り返してもよい。ある実施形態において、漸減性ＩＬ－２レジメンは、１日目の１８，０００，０００ＩＵ／ｍ２、２日目の９，０００，０００ＩＵ／ｍ２、３日目及び４日目の４，５００，０００ＩＵ／ｍ２を含む。
[00542] ある実施形態において、ＩＬ－２レジメンは、０．１０ｍｇ／日～５０ｍｇ
／日の用量で、１、２、４、６、７、１４又は２１日毎にペグ化ＩＬ－２を投与することを含む。
５．養子細胞移入
[00543] 養子細胞移入（ＡＣＴ）は極めて有効な形態の免疫療法であり、抗腫瘍活性
を有する免疫細胞を癌患者に移入することを含む。ＡＣＴは、抗腫瘍活性を有するリンパ球のインビトロ同定、それらの細胞の数を増やすインビトロ拡大培養、及び癌担持宿主へのその注入を伴う治療手法である。養子移入に使用されるリンパ球は、切除された腫瘍の間質に由来してもよい（腫瘍浸潤リンパ球又はＴＩＬ）。ＡＣＴ用のＴＩＬは、本明細書に記載されるとおり調製することができる。一部の実施形態において、ＴＩＬは、例えば図２７に記載されるとおりの方法により調製される。ＴＩＬはまた、抗腫瘍Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）又はキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を発現するように遺伝子改変されている場合には血液から誘導されてもよく、混合リンパ球腫瘍細胞培養物（ＭＬＴＣ）でエンリッチされてもよく、又は自己抗原提示細胞及び腫瘍由来ペプチドを使用してクローニングされてもよい。注入しようとする癌担持宿主にリンパ球が由来するＡＣＴは、自家ＡＣＴと称される。米国特許出願公開第２０１１／００５２５３０号は、主に転移性黒色腫に罹患している患者の治療に向けた、癌退縮を促進するため養子細胞療法を実施する方法に関する（これらの方法に関して全体として参照により援用される）。一部の実施形態において、ＴＩＬは、本明細書に記載されるとおり投与することができる。一部の実施形態において、ＴＩＬは単回用量で投与することができる。かかる投与は、注射、例えば静脈内注射によってもよい。一部の実施形態において、ＴＩＬ及び／又は細胞傷害性リンパ球は複数回用量で投与されてもよい。投与は、年１回、２回、３回、４回、５回、６回、又は６回超であってもよい。投与は、月１回、２週間に１回、週１回、又は隔日１回であってもよい。ＴＩＬ及び／又は細胞傷害性リンパ球の投与は必要な限り継続されてもよい。
６．例示的処置の実施形態
[00544] 一部の実施形態において、本開示は、腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）集団によ
って癌を処置する方法を提供し、この方法は、（ａ）患者から切除された腫瘍から第１のＴＩＬ集団を入手するステップ；（ｂ）第１の細胞培養培地中で第１のＴＩＬ集団の初期拡大培養を実施することにより第２のＴＩＬ集団を入手するステップであって、第２のＴＩＬ集団が第１のＴＩＬ集団より少なくとも５倍数が多く、及び第１の細胞培養培地がＩＬ－２を含むステップ；（ｃ）第２の細胞培養培地中で骨髄系人工抗原提示細胞（骨髄系ａＡＰＣ）集団を使用して第２のＴＩＬ集団の迅速拡大培養を実施することにより第３のＴＩＬ集団を入手するステップであって、迅速拡大培養の開始から７日後に第３のＴＩＬ集団が第２のＴＩＬ集団より少なくとも５０倍数が多く；及び第２の細胞培養培地がＩＬ－２及びＯＫＴ－３を含むステップ；（ｄ）癌を有する患者に治療上有効な分量の第３のＴＩＬ集団を投与するステップを含む。一部の実施形態において、本開示は、癌の処置における使用のための腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）集団であり、ＴＩＬ集団は、（ｂ）第１の細胞培養培地中で患者から切除された腫瘍から入手した第１のＴＩＬ集団の初期拡大培養を実施することにより第２のＴＩＬ集団を入手するステップであって、第２のＴＩＬ集団が第１のＴＩＬ集団より少なくとも５倍数が多く、及び第１の細胞培養培地がＩＬ－２を含むステップ；（ｃ）第２の細胞培養培地中で骨髄系人工抗原提示細胞（骨髄系ａＡＰＣ）集団を使用して第２のＴＩＬ集団の迅速拡大培養を実施することにより第３のＴＩＬ集団を入手するステップであって、迅速拡大培養の開始から７日後に第３のＴＩＬ集団が第２のＴＩＬ集団より少なくとも５０倍数が多く；及び第２の細胞培養培地がＩＬ－２及びＯＫＴ－３を含むステップ；（ｄ）癌を有する患者に治療上有効な分量の第３のＴＩＬ集団を投与するステップを含む方法によって入手可能である。一部の実施形態において、本方法は、患者から切除された腫瘍からＴＩＬの第１の集団を得る第１のステップ（ａ）を含む。一部の実施形態において、第２の細胞培養培地中にＩＬ－２は約３０００ＩＵ／ｍＬの初期濃度で存在し、及びＯＫＴ－３抗体は約３０ｎｇ／ｍＬの初期濃度で存在する。一部の実施形態において、第１の拡大培養は１４日以下の期間にわたって実施される。一部の実施形態において、第１の拡大培養はガス透過性容器を使用して実施される。一部
の実施形態において、第２の拡大培養はガス透過性容器を使用して実施される。一部の実施形態において、迅速拡大培養における第２のＴＩＬ集団とａＡＰＣ集団との比は１対８０～１対４００である。一部の実施形態において、迅速拡大培養における第２のＴＩＬ集団とａＡＰＣ集団との比は約１対３００である。一部の実施形態において、処置される癌は、黒色腫、卵巣癌、子宮頸癌、非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）、肺癌、膀胱癌、乳癌、ヒトパピローマウイルスによって引き起こされる癌、頭頸部癌（頭頸部扁平上皮癌（ＨＮＳＣＣ）を含む）、腎癌、及び腎細胞癌からなる群から選択される。一部の実施形態において、処置される癌は、黒色腫、卵巣癌、及び子宮頸癌からなる群から選択される。一部の実施形態において、処置される癌は黒色腫である。一部の実施形態において、処置される癌は卵巣癌である。一部の実施形態において、処置される癌は子宮頸癌である。一部の実施形態において、癌の処置方法は、患者に第３のＴＩＬ集団を投与する前に骨髄非破壊的リンパ球枯渇レジメンによって患者を処置するステップを更に含む。一部の実施形態において、骨髄非破壊的リンパ球枯渇レジメンは、６０ｍｇ／ｍ２／日の用量で２日間のシクロホスファミドの投与ステップと、それに続く２５ｍｇ／ｍ２／日の用量で５日間のフルダラビンの投与ステップを含む。一部の実施形態において、高用量ＩＬ－２レジメンは、忍容量まで８時間毎に１５分ボーラス静脈内注入として投与される６００，０００又は７２０，０００ＩＵ／ｋｇのアルデスロイキン、又はそのバイオシミラー若しくは変異体を含む。
Ｖ．例示的実施形態
[00545] 一部の実施形態において、本発明は、拡大培養した腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩ
Ｌ）を投与することを含む癌を有する対象の処置方法も提供し、この方法は、
（ａ） 対象から得られた腫瘍試料を複数の腫瘍断片に処理することにより、患者から切除された腫瘍から第１のＴＩＬ集団を得ること；
（ｂ） 腫瘍断片を閉鎖系に加えること；
（ｃ） ＩＬ－２を含む細胞培養培地で第１のＴＩＬ集団を培養し第２のＴＩＬ集団を産生することにより第１の拡大培養を実施することであって、第１の拡大培養は、第１のガス透過性表面積を提供する閉鎖型容器内で実施され、及び第２のＴＩＬ集団を得るため約１１日間拡大培養を行い、第２のＴＩＬ集団は第１のＴＩＬ集団よりも少なくとも５０倍数が多く、ステップ（ｂ）からステップ（ｃ）への移行は系を開放せずに発生すること；（ｄ） 第２のＴＩＬ集団の細胞培養培地に追加のＩＬ－２、ＯＫＴ－３、及び抗原提示細胞（ＡＰＣ）を添加することにより第２の拡大培養を実施して第３のＴＩＬ集団を生じさせることであって、第３のＴＩＬ集団を入手するために第２の拡大培養が約１１日間実施され、第３のＴＩＬ集団は、治療用ＴＩＬ集団であり、第２の拡大培養は第２のガス透過性表面積を提供する閉鎖型容器で行われ、及びステップ（ｃ）からステップ（ｄ）への移行は系を開放せずに発生すること；
（ｅ） ステップ（ｄ）から得られた治療用ＴＩＬ集団を採取することであって、ステップ（ｄ）からステップ（ｅ）への移行は、系を開放せずに発生すること；及び
（ｆ） ステップ（ｅ）で回収したＴＩＬ集団を輸注バッグに移すことであって、ステップ（ｅ）から（ｆ）への移行は、系を開放せずに発生すること；
（ｇ） 凍結保存プロセスを使用して、ステップ（ｆ）で回収したＴＩＬ集団を含む輸注バッグを凍結保存すること；及び
（ｈ） ステップ（ｇ）における輸注バッグから治療上有効な投薬量の第３のＴＩＬ集団を患者に投与すること
を含む。
[00546] 一部の実施形態において、凍結保存プロセスは、ＤＭＳＯを含む培地での凍
結保存を含む。一部の実施形態において、凍結保存培地は、７％～１０％のＤＭＳＯを含む。一部の実施形態において、凍結保存培地は、CS10に存在する。
[00547] 一部の実施形態において、ステップ（ｅ）で回収した治療用ＴＩＬ集団は、
ステップ（ｈ）の治療上有効な投薬量のＴＩＬを投与するのに十分なＴＩＬを含む。
[00548] 一部の実施形態において、ステップ（ｈ）における治療上有効な投薬量の投
与に十分なＴＩＬの数は約２．３×１０１０～約１３．７×１０１０個である。
[00549] 一部の実施形態において、抗原提示細胞（ＡＰＣ）はＰＢＭＣである。
[00550] 一部の実施形態において、ＰＢＭＣはステップ（ｄ）において９～１１日目
のいずれかに細胞培養物に加えられる。
[00551] 一部の実施形態において、ステップ（ｈ）で治療上有効な投薬量のＴＩＬ細
胞を投与する前に、骨髄非破壊的リンパ球枯渇レジメンが患者に投与されている。
[00552] 一部の実施形態において、骨髄非破壊的リンパ球枯渇レジメンは、６０ｍｇ
／ｍ２／日の用量で２日間のシクロホスファミドの投与ステップと、それに続く２５ｍｇ／ｍ２／日の用量で５日間のフルダラビンの投与ステップを含む。
[00553] 一部の実施形態において、本方法は、ステップ（ｈ）で患者にＴＩＬ細胞を
投与した翌日に始まる高用量ＩＬ－２レジメンで患者を処置するステップを更に含む。
[00554] 一部の実施形態において、高用量ＩＬ－２レジメンは、忍容量まで８時間毎
に１５分ボーラス静脈内注入として投与される６００，０００又は７２０，０００ＩＵ／ｋｇを含む。
[00555] 一部の実施形態において、ステップ（ｄ）の第３のＴＩＬ集団は、対象に投
与されたときに、有効性の増加、インターフェロンガンマ（ＩＦＮ－γ）産生の増加、ポリクローナル性の増加、平均ＩＰ－１０の増加、及び／又は平均ＭＣＰ－１の増加を提供する。一部の実施形態において、ＩＦＮ－γの増加、平均ＩＰ－１０の増加、及び／又は平均ＭＣＰ－１の増加は、ＴＩＬで処置された対象の血液で測定される。
[00556] 一部の実施形態において、癌は、黒色腫、卵巣癌、子宮頸癌、非小細胞肺癌
（ＮＳＣＬＣ）、肺癌、膀胱癌、乳癌、ヒトパピローマウイルスによって引き起こされる癌、頭頸部癌（頭頸部扁平上皮癌（ＨＮＳＣＣ）を含む）、腎癌、及び腎細胞癌からなる群から選択される。一部の実施形態において、癌は、黒色腫、ＨＮＳＣＣ、子宮頸癌、及びＮＳＣＬＣからなる群から選択される。一部の実施形態において、癌は黒色腫である。一部の実施形態において、癌はＨＮＳＣＣである。一部の実施形態において、癌は子宮頸癌である。一部の実施形態において、癌はＮＳＣＬＣである。
[00557] ある実施形態において、本発明は、腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）を拡大培養
する方法を提供する。
[00558] 本発明は、腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）を拡大培養する方法を提供し、その
方法は、（ａ）患者から腫瘍試料を得ることであって、前記腫瘍試料はＴＩＬの第１の集団を含むステップ；（ｂ）前記腫瘍試料を複数の腫瘍断片に処理するステップ；（ｃ）前記腫瘍断片を閉鎖型容器に加えるステップ；（ｄ）第２のＴＩＬ集団を得るために第１の細胞培養培地で前記第１のＴＩＬ集団の初めの拡大培養を実施することであって、前記第１の細胞培養培地はＩＬ－２を含み、前記初めの拡大培養は、ガス透過性表面積が少なくとも１００ｃｍ２の前記閉鎖型容器で実施され、前記初めの拡大培養は、約７～１４日間の第１の期間内に初めの拡大培養を実施して第２のＴＩＬ集団を得、前記第２のＴＩＬ集
団は数が前記第１のＴＩＬ集団より少なくとも５０倍数が多く、ステップ（ｃ）からステップ（ｄ）への移行は、系を開放せずに発生するステップ；（ｅ）前記第２のＴＩＬ集団を第２の細胞培養培地で拡大培養することであって、前記第２の細胞培養培地は、ＩＬ－２、ＯＫＴ－３、及び末梢血単核球（ＰＢＭＣ、単核球（ＭＮＣ）としても知られる）を含み、前記拡大培養は、約７～１４日間の第２の期間内に実施されて第３のＴＩＬ集団を得、前記第３のＴＩＬ集団は、第２のＴＩＬ集団と比べてエフェクターＴ細胞及び／又はセントラルメモリーＴ細胞のサブ集団の増加を示し、前記拡大培養は、少なくとも５００ｃｍ２のガス透過性表面積を提供する閉鎖型容器内で行われ、ステップ（ｄ）からステップ（ｅ）への移行は、系を開かずに行われるステップ；（ｆ）ステップ（ｅ）から得られた前記第３のＴＩＬ集団を回収することであって、ステップ（ｅ）からステップ（ｆ）への移行は、系を開かずに行われるステップ；及び（ｇ）前記回収したＴＩＬ集団をステップ（ｆ）から輸注バッグに移すことであって、ステップ（ｆ）から（ｇ）への前記移行は、系を開かずに行われるステップを含む。一部の実施形態において、この方法は、インビトロ又はエクスビボ方法である。
[00559] 一部の実施形態において、この方法は、更に、ステップ（ｆ）でのFresenius
Kabi製のLOVO系などの細胞処理系を介する回収を含む。用語「LOVO細胞処理系」は、滅
菌及び／又は閉鎖系環境で、回転膜又は回転フィルターなどの膜又はフィルターを通して細胞を含む溶液を送り出すことができ、ペレット化せず上清又は細胞培養液を除去する連続フロー及び細胞処理を可能にする、あらゆる販売業者によって製造された機器又は装置も指す。ある場合には、細胞処理系は、閉鎖、無菌系で細胞分離、洗浄、流体交換、濃縮、及び／又は他の細胞処理ステップを実施することができる。
[00560] 一部の実施形態において、閉鎖型容器は、Ｇコンテナ及びXuri細胞培養バッ
グからなる群から選択される。
[00561] 一部の実施形態において、ステップ（ｇ）の輸注バッグは、HypoThermosol含有輸注バッグである。
[00562] 一部の実施形態において、ステップ（ｄ）の第１の期間及び前記ステップ（
ｅ）の第２の期間は、１０日、１１日、又は１２日の期間内にそれぞれ個別に実施される。
[00563] 一部の実施形態において、ステップ（ｄ）の第１の期間及び前記ステップ（
ｅ）の第２の期間は、１１日の期間内にそれぞれ個別に実施される。
[00564] 一部の実施形態において、ステップ（ａ）～（ｇ）は約２５日～約３０日の
期間内に実施される。
[00565] 一部の実施形態において、ステップ（ａ）～（ｇ）は約２０日～約２５日の
期間内に実施される。
[00566] 一部の実施形態において、ステップ（ａ）～（ｇ）は約２０日～約２２日の
期間内に実施される。
[00567] 一部の実施形態において、ステップ（ａ）～（ｇ）は、２２日以内の間に実
施される。
[00568] 一部の実施形態において、ステップ（ｃ）～（ｆ）は、単一の容器で実施さ
れ、ステップ（ｃ）～（ｆ）を単一の容器で実施すると、ステップ（ｃ）～（ｆ）を２つ
以上の容器で実施した場合に比べ切除された腫瘍毎のＴＩＬ収量が増加する結果となる。
[00569] 一部の実施形態において、ＰＢＭＣは、系を開放せずにステップ（ｅ）の第
２の期間中にＴＩＬに加えられる。
[00570] 一部の実施形態において、前記第３のＴＩＬ集団から得られたエフェクター
Ｔ細胞及び／又はセントラルメモリーＴ細胞は、前記第２の細胞集団から得られるエフェクターＴ細胞及び／又はセントラルメモリーＴ細胞と比べて、ＣＤ２７＋の発現、ＣＤ２８＋の発現、より長いテロメア、ＣＤ５７発現の増加、及びＣＤ５６発現の減少からなる群から選択される１つ以上の特徴を呈する。
[00571] 一部の実施形態において、前記第３のＴＩＬ集団から得られたエフェクター
Ｔ細胞及び／又はセントラルメモリーＴ細胞は、前記第２の細胞集団から得られるエフェクターＴ細胞及び／又はセントラルメモリーＴ細胞と比べて、ＣＤ５７発現の増加及びＣＤ５６発現の減少を呈する。
[00572] 一部の実施形態において、微生物汚染のリスクは、開放系と比較して低減さ
れる。
[00573] 一部の実施形態において、ステップ（ｇ）からのＴＩＬは、患者に注入され
る。
[00574] 本発明は、また、腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）の集団で患者にある癌を処置
する方法を提供し、その方法は、（ａ）患者から腫瘍試料を得ることであって、前記腫瘍試料はＴＩＬの第１の集団を含むステップ；（ｂ）前記腫瘍試料を複数の腫瘍断片に処理するステップ；（ｃ）前記腫瘍断片を閉鎖型容器に加えるステップ；（ｄ）第２のＴＩＬ集団を得るために第１の細胞培養培地で前記第１のＴＩＬ集団の初めの拡大培養を実施することであって、前記第１の細胞培養培地はＩＬ－２を含み、前記初めの拡大培養は、ガス透過性表面積が少なくとも１００ｃｍ２の前記閉鎖型容器で実施され、前記初めの拡大培養は、約７～１４日間の第１の期間内に初めの拡大培養を実施して第２のＴＩＬ集団を得、前記第２のＴＩＬ集団は数が前記第１のＴＩＬ集団より少なくとも５０倍数が多く、ステップ（ｃ）からステップ（ｄ）への移行は、系を開放せずに発生するステップ；（ｅ）第２のＴＩＬ集団を第２の細胞培養培地で拡大培養することであって、前記第２の細胞培養培地は、ＩＬ－２、ＯＫＴ－３、及び末梢血単核球（ＰＢＭＣ）を含み、前記拡大培養は、約７～１４日間の第２の期間内に実施されて第３のＴＩＬ集団を得、前記第３のＴＩＬ集団は、第２のＴＩＬ集団と比べてエフェクターＴ細胞及び／又はセントラルメモリーＴ細胞のサブ集団の増加を示し、前記拡大培養は、少なくとも５００ｃｍ２のガス透過性表面積を提供する閉鎖型容器内で行われ、ステップ（ｄ）からステップ（ｅ）への移行は、系を開かずに行われるステップ；（ｆ）ステップ（ｅ）から得られた前記第３のＴＩＬ集団を回収することであって、ステップ（ｅ）からステップ（ｆ）への移行は、系を開かずに行われるステップ；（ｇ）回収したＴＩＬ集団をステップ（ｆ）から輸注バッグに移すことであって、ステップ（ｆ）から（ｇ）への前記移行は、系を開かずに行われるステップ；及び（ｈ）ステップ（ｇ）の前記輸注バッグからＴＩＬ細胞の有効量を前記患者へ静脈内投与するステップを含む。
[00575] 一部の実施形態において、本発明は、また、癌処置における使用のための腫
瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）の集団を含み、そのＴＩＬの集団は、（ｂ）患者から得た腫瘍試料を処理することであって、前記腫瘍試料は複数の腫瘍断片に切除されるＴＩＬの第１の集団を含むステップ；（ｃ）前記腫瘍断片を閉鎖型容器に加えるステップ；（ｄ）第２のＴＩＬ集団を得るために第１の細胞培養培地で前記第１のＴＩＬ集団の初めの拡大培養
を実施することであって、前記第１の細胞培養培地はＩＬ－２を含み、前記初めの拡大培養は、ガス透過性表面積が少なくとも１００ｃｍ２の前記閉鎖型容器で実施され、前記初めの拡大培養は、約７～１４日間の第１の期間内に初めの拡大培養を実施して第２のＴＩＬ集団を得、前記第２のＴＩＬ集団は数が前記第１のＴＩＬ集団より少なくとも５０倍数が多く、ステップ（ｃ）からステップ（ｄ）への移行は、系を開放せずに発生するステップ；（ｅ）前記第２のＴＩＬ集団を第２の細胞培養培地で拡大培養することであって、前記第２の細胞培養培地は、ＩＬ－２、ＯＫＴ－３、及び末梢血単核球（ＰＢＭＣ）を含み、前記拡大培養は、約７～１４日間の第２の期間内に実施されて第３のＴＩＬ集団を得、前記第３のＴＩＬ集団は、第２のＴＩＬ集団と比べてエフェクターＴ細胞及び／又はセントラルメモリーＴ細胞のサブ集団の増加を示し、前記拡大培養は、少なくとも５００ｃｍ２のガス透過性表面積を提供する閉鎖型容器内で行われ、ステップ（ｄ）からステップ（ｅ）への移行は、系を開かずに行われるステップ；（ｆ）ステップ（ｅ）から得られた前記第３のＴＩＬ集団を回収することであって、ステップ（ｅ）からステップ（ｆ）への移行は、系を開かずに行われるステップ；（ｇ）前記回収したＴＩＬ集団をステップ（ｆ）から輸注バッグに移すことであって、ステップ（ｆ）から（ｇ）への前記移行は、系を開かずに行われるステップを含む方法から得られる。一部の実施形態において、本方法は、患者から腫瘍試料を得ることであって、前記腫瘍試料は第１のＴＩＬ集団を含む第１のステップ（ａ）を含む。一部の実施形態において、ＴＩＬの集団は、ステップ（ｇ）の前記輸注バッグから治療有効量で投与するためのものである。
[00576] 一部の実施形態において、ステップ（ｈ）で治療上有効な投薬量のＴＩＬ細
胞を投与する前に、骨髄非破壊的リンパ球枯渇レジメンが前記患者に投与されている。一部の実施形態において、ＴＩＬの集団は、骨髄非破壊的リンパ球枯渇レジメンを受けた患者への投与用である。
[00577] 一部の実施形態において、骨髄非破壊的リンパ球枯渇レジメンは、６０ｍｇ
／ｍ２／日の用量で２日間のシクロホスファミドの投与ステップと、それに続く２５ｍｇ／ｍ２／日の用量で５日間のフルダラビンの投与ステップを含む。
[00578] 一部の実施形態において、本方法は、ステップ（ｈ）で前記患者に前記ＴＩ
Ｌ細胞を投与した翌日に始まる高用量ＩＬ－２レジメンで前記患者を処置するステップを更に含む。一部の実施形態において、ＴＩＬの集団は、高用量ＩＬ－２レジメン前の投与用である。一部の実施形態において、ＴＩＬの集団は、高用量ＩＬ－２レジメンの開始１日前の投与用である。
[00579] 一部の実施形態において、高用量ＩＬ－２レジメンは、忍容量まで８時間毎
に１５分ボーラス静脈内注入として投与される６００，０００又は７２０，０００ＩＵ／ｋｇを含む。
[00580] 一部の実施形態において、前記第３のＴＩＬ集団から得られたエフェクター
Ｔ細胞及び／又はセントラルメモリーＴ細胞は、前記第２の細胞集団から得られるエフェクターＴ細胞及び／又はセントラルメモリーＴ細胞と比べて、ＣＤ２７＋の発現、ＣＤ２８＋の発現、より長いテロメア、ＣＤ５７発現の増加、及びＣＤ５６発現の減少からなる群から選択される１つ以上の特徴を呈する。
[00581] 一部の実施形態において、前記第３のＴＩＬ集団から得られたエフェクター
Ｔ細胞及び／又はセントラルメモリーＴ細胞は、前記第２の細胞集団から得られるエフェクターＴ細胞及び／又はセントラルメモリーＴ細胞と比べて、ＣＤ５７発現の増加及びＣＤ５６発現の減少を呈する。
[00582] 本発明は、また、腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）を拡大培養する方法を提供し
、その方法は、（ａ）処理した腫瘍断片を閉鎖系に加えるステップ；（ｂ）第２のＴＩＬ集団を得るために第１の細胞培養培地での前記第１のＴＩＬ集団の第１の拡大培養で実施することであって、前記第１の細胞培養培地はＩＬ－２を含み、前記第１の拡大培養は、第１のガス透過性表面積を提供する閉鎖型容器で実施され、前記第１の拡大培養は、約３～１４日間の第１の期間内に初めの拡大培養を実施して第２のＴＩＬ集団を得、前記第２のＴＩＬ集団は数が前記第１のＴＩＬ集団より少なくとも５０倍数が多く、ステップ（ａ）からステップ（ｂ）への移行は、系を開放せずに発生するステップ；（ｃ）前記第２のＴＩＬ集団を第２の細胞培養培地で拡大培養することであって、前記第２の細胞培養培地は、ＩＬ－２、ＯＫＴ－３、及び抗原提示細胞を含み、前記拡大培養は、約７～１４日間の第２の期間内に実施されて第３のＴＩＬ集団を得、前記第３のＴＩＬ集団は、第２のＴＩＬ集団と比べてエフェクターＴ細胞及び／又はセントラルメモリーＴ細胞のサブ集団の増加を示し、前記拡大培養は、第２のガス透過性表面積を提供する閉鎖型容器内で行われ、ステップ（ｂ）からステップ（ｃ）への移行は、系を開かずに行われるステップ；（ｄ）ステップ（ｃ）から得られた前記第３のＴＩＬ集団を回収することであって、ステップ（ｃ）からステップ（ｄ）への移行は、系を開かずに行われるステップ；及び（ｅ）回収したＴＩＬ集団をステップ（ｄ）から前記輸注バッグに移すことであって、ステップ（ｄ）から（ｅ）への前記移行は、系を開かずに行われるステップを含む。
[00583] 一部の実施形態において、本方法は、凍結保存プロセスを使用して、回収し
たＴＩＬ集団を含む輸注バッグを凍結保存するステップを更に含む。一部の実施形態において、凍結保存プロセスは、回収したＴＩＬ集団とCS10培地との比は比率１：１を使用して実施される。
[00584] 一部の実施形態において、抗原提示細胞は末梢血単核球（ＰＢＭＣ）である
。一部の実施形態において、抗原提示細胞は人工抗原提示細胞である。
[00585] 一部の実施形態において、ステップ（ｄ）の採取は、LOVO細胞処理系を使用
して実施される。
[00586] 一部の実施形態において、複数の断片は、約５０個の断片を含み、各断片は
約２７ｍｍ３の容積を有する。一部の実施形態において、複数の断片は、約１３００ｍｍ３～約１５００ｍｍ３の総容積を有する約３０～約６０個の断片を含む。一部の実施形態において、複数の断片は、約１３５０ｍｍ３の総容積を有する約５０個の断片を含む。一部の実施形態において、複数の断片は、約１ｇ～約１．５ｇの総質量を有する約５０個の断片を含む。
[00587] 一部の実施形態において、第２の細胞培養培地は、Ｇコンテナ及びXuri細胞
培養バッグからなる群から選択される容器内に提供される。
[00588] 一部の実施形態において、ステップ（ｅ）の輸注バッグは、HypoThermosol含有輸注バッグである。
[00589] 一部の実施形態において、ステップ（ｂ）の第１の期間及び前記ステップ（
ｃ）の第２の期間は、１０日、１１日、又は１２日の期間内にそれぞれ個別に実施される。一部の実施形態において、ステップ（ｂ）の第１の期間及び前記ステップ（ｃ）の第２の期間は、１１日の期間内にそれぞれ個別に実施される。
[00590] 一部の実施形態において、ステップ（ａ）～（ｅ）は約２５日～約３０日の
期間内に実施される。一部の実施形態において、ステップ（ａ）～（ｅ）は約２０日～約
２５日の期間内に実施される。一部の実施形態において、ステップ（ａ）～（ｅ）は約２０日～約２２日の期間内に実施される。一部の実施形態において、ステップ（ａ）～（ｅ）は、２２日以内の間実施される。一部の実施形態において、ステップ（ａ）～（ｅ）及び凍結保存は２２日以内の間実施される。
[00591] 一部の実施形態において、ステップ（ｂ）～（ｅ）は、単一の閉鎖系で実施
され、ステップ（ｂ）～（ｅ）を単一の容器で実施すると、ステップ（ｂ）～（ｅ）を２つ以上の容器で実施した場合に比べ切除された腫瘍毎のＴＩＬ収量が増加する結果となる。
[00592] 一部の実施形態において、抗原提示細胞は、系を開放せずにステップ（ｃ）
の第２の期間中にＴＩＬに追加される。
[00593] 一部の実施形態において、前記第３のＴＩＬ集団から得られたエフェクター
Ｔ細胞及び／又はセントラルメモリーＴ細胞は、前記第２の細胞集団から得られるエフェクターＴ細胞及び／又はセントラルメモリーＴ細胞と比べて、ＣＤ２７＋の発現、ＣＤ２８＋の発現、より長いテロメア、ＣＤ５７発現の増加、及びＣＤ５６発現の減少からなる群から選択される１つ以上の特徴を呈する。
[00594] 一部の実施形態において、前記第３のＴＩＬ集団から得られたエフェクター
Ｔ細胞及び／又はセントラルメモリーＴ細胞は、前記第２の細胞集団から得られるエフェクターＴ細胞及び／又はセントラルメモリーＴ細胞と比べて、ＣＤ５７発現の増加及びＣＤ５６発現の減少を呈する。
[00595] 一部の実施形態において、微生物汚染のリスクは、開放系と比較して低減さ
れる。
[00596] 一部の実施形態において、ステップ（ｅ）からのＴＩＬは、患者に注入され
る。
[00597] 一部の実施形態において、閉鎖型容器は単一のバイオリアクターを含む。一
部の実施形態において、閉鎖型容器はG-REX-10を含む。一部の実施形態において、閉鎖型容器はG-REX-100を含む。一部の実施形態において、閉鎖型容器はG-Rex 500を含む。一部の実施形態において、閉鎖型容器はXuri又はWave bioreactorガス透過性バッグを含む。
[00598] 一部の実施形態において、本開示は、腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）を治療用
ＴＩＬ集団に拡大培養する方法も提供し、この方法は、
（ｂ） 腫瘍断片が第１のＴＩＬ集団を含む閉鎖系に腫瘍断片を加えること；
（ｃ） ＩＬ－２を含む細胞培養培地で第１のＴＩＬ集団を培養し第２のＴＩＬ集団を生じさせることにより第１の拡大培養を実施することであって、第１の拡大培養は、第１のガス透過性表面積を提供する閉鎖型容器内で実施され、第１の拡大培養は、第２のＴＩＬ集団を得るため約３～１４日間行われ、第２のＴＩＬ集団は、第１のＴＩＬ集団よりも少なくとも５０倍数が多く、ステップ（ｂ）からステップ（ｃ）への移行は系を開放せずに発生すること；
（ｄ） 第２のＴＩＬ集団の細胞培養培地に追加のＩＬ－２、ＯＫＴ－３、及び抗原提示細胞（ＡＰＣ）を添加することにより第２の拡大培養を実施して第３のＴＩＬ集団を生じさせることであって、第３のＴＩＬ集団を入手するために第２の拡大培養が約７～１４日間実施され、第３のＴＩＬ集団は、第２のＴＩＬ集団と比べてエフェクターＴ細胞及び／又はセントラルメモリーＴ細胞の増加サブ集団を含む治療用ＴＩＬ集団であり、第２の拡大培養は第２のガス透過性表面積を提供する閉鎖型容器で行われ、及びステップ（ｃ）か
らステップ（ｄ）への移行は系を開放せずに発生すること；
（ｅ） ステップ（ｄ）から得られた治療用ＴＩＬ集団を回収することであって、ステップ（ｄ）からステップ（ｅ）への移行は、系を開放せずに発生すること；及び
（ｆ） ステップ（ｅ）で回収したＴＩＬ集団を輸注バッグに移すことであって、ステップ（ｅ）から（ｆ）への移行は、系を開放せずに発生すること
を含む。
[00599] 一部の実施形態において、本方法はまた、第１のステップとして
（ａ） 患者から得られた腫瘍試料を複数の腫瘍断片に処理することにより、患者から切除された腫瘍から第１のＴＩＬ集団を得ること；
を含む。
[00600] ある実施形態において、本方法は、インビトロ又はエクスビボ方法である。
[00601] 一部の実施形態において、本開示は、腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）を治療用
ＴＩＬ集団に拡大培養する方法を提供し、この方法は、
（ａ） 患者から得られた腫瘍試料を複数の腫瘍断片に処理することにより、患者から切除された腫瘍から第１のＴＩＬ集団を得ること；
（ｂ） 腫瘍断片を閉鎖系に加えること；
（ｃ） ＩＬ－２を含む細胞培養培地で第１のＴＩＬ集団を培養し第２のＴＩＬ集団を生じさせることにより第１の拡大培養を実施することであって、第１の拡大培養は、第１のガス透過性表面積を提供する閉鎖型容器内で実施され、第１の拡大培養は、第２のＴＩＬ集団を得るため約３～１４日間行われ、第２のＴＩＬ集団は、第１のＴＩＬ集団よりも少なくとも５０倍数が多く、ステップ（ｂ）からステップ（ｃ）への移行は系を開放せずに発生すること；
（ｄ） 第２のＴＩＬ集団の細胞培養培地に追加のＩＬ－２、ＯＫＴ－３、及び抗原提示細胞（ＡＰＣ）を添加することにより第２の拡大培養を実施して第３のＴＩＬ集団を生じさせることであって、第３のＴＩＬ集団を入手するために第２の拡大培養が約７～１４日間実施され、第３のＴＩＬ集団は、第２のＴＩＬ集団と比べてエフェクターＴ細胞及び／又はセントラルメモリーＴ細胞の増加サブ集団を含むＴ細胞治療用ＴＩＬ集団であり、第２の拡大培養は第２のガス透過性表面積を提供する閉鎖型容器で行われ、及びステップ（ｃ）からステップ（ｄ）への移行は系を開放せずに発生すること；
（ｅ） ステップ（ｄ）から得られた治療用ＴＩＬ集団を回収することであって、ステップ（ｄ）からステップ（ｅ）への移行は、系を開放せずに発生すること；及び
（ｆ） ステップ（ｅ）で回収したＴＩＬ集団を輸注バッグに移すことであって、ステップ（ｅ）から（ｆ）への移行は、系を開放せずに発生すること
を含む。
[00602] ある実施形態において、本方法は、インビトロ又はエクスビボ方法である。
[00603] 一部の実施形態において、本方法は、凍結保存プロセスを使用して、ステッ
プ（ｆ）で回収したＴＩＬ集団を含む輸注バッグを凍結保存するステップを更に含む。
[00604] 一部の実施形態において、凍結保存プロセスは、回収したＴＩＬ集団と凍結
保存培地との比は比率１：１を使用して実施される。一部の実施形態において、凍結保存培地は、ジメチルスルホキシドを含む。一部の実施形態において、凍結保存培地は、Cryostor CS10、HypoThermasol、又はそれらの組み合わせからなる群から選択される。
[00605] 一部の実施形態において、抗原提示細胞は末梢血単核球（ＰＢＭＣ）である
。
[00606] 一部の実施形態において、ＰＢＭＣは放射線照射された、且つ同種異系のも
のである。
[00607] 一部の実施形態において、ＰＢＭＣはステップ（ｄ）において９～１４日目
のいずれかに細胞培養物に加えられる。
[00608] 一部の実施形態において、抗原提示細胞は人工抗原提示細胞である。
[00609] 一部の実施形態において、ステップ（ｅ）の回収は、LOVO細胞処理系を使用
して実施される。
[00610] 一部の実施形態において、腫瘍断片は複数の断片であり、約４～約５０個の
断片を含み、各断片は約２７ｍｍ３の容積を有する。一部の実施形態において、複数の断片は、約１３００ｍｍ３～約１５００ｍｍ３の総容積を有する約３０～約６０個の断片を含む。一部の実施形態において、複数の断片は、約１３５０ｍｍ３の総容積を有する約５０個の断片を含む。一部の実施形態において、複数の断片は、約１ｇ～約１．５ｇの総質量を有する約５０個の断片を含む。
[00611] 一部の実施形態において、細胞培養培地は、Ｇコンテナ及びXuri細胞培養バ
ッグからなる群から選択される容器内に提供される。
[00612] 一部の実施形態において、ステップ（ｆ）の輸注バッグは、HypoThermosol含有輸注バッグである。
[00613] 一部の実施形態において、ステップ（ｃ）の第１の期間及びステップ（ｅ）
の第２の期間は、１０日、１１日、又は１２日の期間内にそれぞれ個別に実施される。一部の実施形態において、ステップ（ｃ）の第１の期間及びステップ（ｅ）の第２の期間は、１１日の期間内にそれぞれ個別に実施される。一部の実施形態において、ステップ（ａ）～（ｆ）は約２５日～約３０日の期間内に実施される。一部の実施形態において、ステップ（ａ）～（ｆ）は約２０日～約２５日の期間内に実施される。一部の実施形態において、ステップ（ａ）～（ｆ）は約２０日～約２２日の期間内に実施される。一部の実施形態において、ステップ（ａ）～（ｆ）は、２２日以内に実施される。一部の実施形態において、ステップ（ａ）～（ｆ）及び凍結保存は２２日以内に実施される。
[00614] 一部の実施形態において、ステップ（ｅ）で回収した治療用ＴＩＬ集団は、
治療上有効な投薬量のＴＩＬとなるのに十分なＴＩＬを含む。一部の実施形態において、治療上有効な投薬量となるのに十分なＴＩＬの数は約２．３×１０１０～約１３．７×１０１０個である。
[00615] 一部の実施形態において、ステップ（ｂ）～（ｅ）は、単一の容器で実施さ
れ、ステップ（ｂ）～（ｅ）を単一の容器で実施すると、ステップ（ｂ）～（ｅ）を２つ以上の容器で実施した場合に比べ切除された腫瘍毎のＴＩＬ収量が増加する結果となる。
[00616] 一部の実施形態において、抗原提示細胞は、系を開放せずにステップ（ｄ）
の第２の期間中にＴＩＬに追加される。
[00617] 一部の実施形態において、治療用ＴＩＬ集団中のエフェクターＴ細胞及び／
又はセントラルメモリーＴ細胞は、第２の細胞集団から得られるエフェクターＴ細胞及び／又はセントラルメモリーＴ細胞と比べて、ＣＤ２７＋の発現、ＣＤ２８＋の発現、より
長いテロメア、ＣＤ５７発現の増加、及びＣＤ５６発現の減少からなる群から選択される１つ以上の特徴を呈する。
[00618] 一部の実施形態において、第３のＴＩＬ集団から得られたエフェクターＴ細
胞及び／又はセントラルメモリーＴ細胞は、第２の細胞集団から得られるエフェクターＴ細胞及び／又はセントラルメモリーＴ細胞と比べて、ＣＤ５７発現の増加及びＣＤ５６発現の減少を呈する。
[00619] 一部の実施形態において、微生物汚染のリスクは、開放系と比較して低減さ
れる。
[00620] 一部の実施形態において、ステップ（ｆ）からのＴＩＬは、患者に注入され
る。
[00621] 一部の実施形態において、複数の断片は、約４個の断片を含む。一部の実施
形態において、４つの断片は、G-REX -100に入れられる。一部の実施形態において、４つの断片は、直径約０．５ｃｍである。一部の実施形態において、４つの断片は、G-REX -100に入れられる。一部の実施形態において、４つの断片は、直径が約０．１ｃｍ、０．２ｃｍ、０．３ｃｍ、０．４ｃｍ、０．５ｃｍ、０．６ｃｍ、０．７ｃｍ、０．８ｃｍ、０．９ｃｍ、又は１ｃｍである。一部の実施形態において、４つの断片は、直径が約０．１ｃｍ、０．２ｃｍ、０．３ｃｍ、０．４ｃｍ、０．５ｃｍ、０．６ｃｍ、０．７ｃｍ、０．８ｃｍ、０．９ｃｍ、又は１ｃｍであり、G-REX -100に置かれる。一部の実施形態において、４つの断片は、直径が約０．１ｃｍ、０．２ｃｍ、０．３ｃｍ、０．４ｃｍ、０．５ｃｍ、０．６ｃｍ、０．７ｃｍ、０．８ｃｍ、０．９ｃｍ、又は１ｃｍであり、G-REX -100と同等の容積の容器に置かれる。一部の実施形態において、４つの断片は、直径約０．５ｃｍであり、G-REX -100に置かれる。一部の実施形態において、４つの断片は、直径が約０．５ｃｍであり、G-REX -100と同等の容積の容器に置かれる。
[00622] ステップ（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）、（ｅ）及び（ｆ）のさらなる詳
細は、本明細書以下に提供され、例えば限定はされないが、「ステップＡ：患者腫瘍試料を入手する」、「ステップＢ：第１の拡大培養」、「ステップＣ：第１の拡大培養から第２の拡大培養への移行」、「ステップＤ：第２の拡大培養」、「ステップＥ：ＴＩＬを回収する」及び「ステップＦ：最終的な製剤／輸注バッグに移す」の見出しで記載される実施例を含む。
[00623] 一部の実施形態において、本開示は、拡大培養した腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩ
Ｌ）を投与することを含む癌を有する対象の処置方法を提供し、この方法は、
（ａ） 対象から得られた腫瘍試料を複数の腫瘍断片に処理することにより、患者から切除された腫瘍から第１のＴＩＬ集団を得ること；
（ｂ） 腫瘍断片を閉鎖系に加えること；
（ｃ） ＩＬ－２を含む細胞培養培地で第１のＴＩＬ集団を培養し第２のＴＩＬ集団を生じさせることにより第１の拡大培養を実施することであって、第１の拡大培養は、第１のガス透過性表面積を提供する閉鎖型容器内で実施され、第１の拡大培養は、第２のＴＩＬ集団を得るため約３～１４日間行われ、第２のＴＩＬ集団は、第１のＴＩＬ集団よりも少なくとも５０倍数が多く、ステップ（ｂ）からステップ（ｃ）への移行は系を開放せずに発生すること；
（ｄ） 第２のＴＩＬ集団の細胞培養培地に追加のＩＬ－２、ＯＫＴ－３、及び抗原提示細胞（ＡＰＣ）を添加することにより第２の拡大培養を実施して第３のＴＩＬ集団を生じさせることであって、第３のＴＩＬ集団を入手するために第２の拡大培養が約７～１４日間実施され、第３のＴＩＬ集団は、第２のＴＩＬ集団と比べてエフェクターＴ細胞及び／
又はセントラルメモリーＴ細胞の増加サブ集団を含むＴ細胞治療用ＴＩＬ集団であり、第２の拡大培養は第２のガス透過性表面積を提供する閉鎖型容器で行われ、及びステップ（ｃ）からステップ（ｄ）への移行は系を開放せずに発生すること；
（ｅ） ステップ（ｄ）から得られた治療用ＴＩＬ集団を回収することであって、ステップ（ｄ）からステップ（ｅ）への移行は、系を開放せずに発生すること；及び
（ｆ） ステップ（ｅ）で回収したＴＩＬ集団を輸注バッグに移すことであって、ステップ（ｅ）から（ｆ）への移行は、系を開放せずに発生すること；
（ｇ） 凍結保存プロセスを使用して、ステップ（ｆ）で回収したＴＩＬ集団を含む輸注バッグを任意選択で凍結保存すること；及び
（ｈ） ステップ（ｇ）における輸注バッグから治療上有効な投薬量の第３のＴＩＬ集団を患者に投与すること
を含む。
[00624] 一部の実施形態において、本発明は、癌の処置に使用するための腫瘍浸潤リ
ンパ球（ＴＩＬ）の治療集団を提供し、その集団は、
（ｂ） 腫瘍断片が第１のＴＩＬ集団を含む閉鎖系に腫瘍断片を加えること；
（ｃ） ＩＬ－２を含む細胞培養培地で第１のＴＩＬ集団を培養し第２のＴＩＬ集団を生じさせることにより第１の拡大培養を実施することであって、第１の拡大培養は、第１のガス透過性表面積を提供する閉鎖型容器内で実施され、第１の拡大培養は、第２のＴＩＬ集団を得るため約３～１４日間実施され、第２のＴＩＬ集団は、第１のＴＩＬ集団よりも少なくとも５０倍数が多く、ステップ（ｂ）からステップ（ｃ）への移行は系を開放せずに発生すること；
（ｄ） 第２のＴＩＬ集団の細胞培養培地に追加のＩＬ－２、ＯＫＴ－３、及び抗原提示細胞（ＡＰＣ）を添加することにより第２の拡大培養を実施して第３のＴＩＬ集団を生じさせることであって、第３のＴＩＬ集団を入手するために第２の拡大培養が約７～１４日間実施され、第３のＴＩＬ集団は、第２のＴＩＬ集団と比べてエフェクターＴ細胞及び／又はセントラルメモリーＴ細胞の増加サブ集団を含むＴ細胞治療用ＴＩＬ集団であり、第２の拡大培養は第２のガス透過性表面積を提供する閉鎖型容器で行われ、及びステップ（ｃ）からステップ（ｄ）への移行は系を開放せずに発生すること；
（ｅ） ステップ（ｄ）から得られた治療用ＴＩＬ集団を回収することであって、ステップ（ｄ）からステップ（ｅ）への移行は、系を開放せずに発生すること；及び
（ｆ） ステップ（ｅ）で回収したＴＩＬ集団を輸注バッグに移すことであって、ステップ（ｅ）から（ｆ）への移行は、系を開放せずに発生すること；及び
（ｇ） 凍結保存プロセスを使用して、ステップ（ｆ）で回収したＴＩＬ集団を含む輸注バッグを任意選択で凍結保存すること
のステップを含む方法から入手可能である。
[00625] 一部の実施形態において、その集団は、第１のステップとして
（ａ） 患者から得られた腫瘍試料を複数の腫瘍断片に処理することにより、患者から切除された腫瘍から第１のＴＩＬ集団を得ること；
を含む方法によって得ることもできる。
[00626] ある実施形態において、本方法は、インビトロ又はエクスビボ方法である。
[00627] 一部の実施形態において、ステップ（ａ）～（ｆ）のいずれかは、本明細書
で開示される１つ以上の特徴、例えば、「ステップＡ：患者腫瘍試料を入手する」、「ステップＢ：第１の拡大培養」、「ステップＣ：第１の拡大培養から第２の拡大培養への移行」、「ステップＤ：第２の拡大培養」、「ステップＥ：ＴＩＬを回収する」及び「ステップＦ：最終的な製剤／輸注バッグに移す」という見出しで開示される１つ以上特徴を含む。
[00628] 一部の実施形態において、ステップ（ｇ）は、本明細書に開示される１つ以
上の特徴、例えば、「ステップＨ：任意選択のＴＩＬ凍結保存」という見出しで開示される１つ以上の特徴を含む。一部の実施形態において、ステップ（ｈ）は、本明細書に開示される１つ以上の特徴、例えば、「ステップＦ：医薬組成物、投薬量、及び投与レジメン」という見出しで開示される１つ以上の特徴を含む。
[00629] 一部の実施形態において、ステップ（ｅ）で回収した治療用ＴＩＬ集団は、
ステップ（ｈ）の治療上有効な投薬量のＴＩＬを投与するのに十分なＴＩＬを含む。
[00630] 一部の実施形態において、ステップ（ｈ）における治療上有効な投薬量の投
与に十分なＴＩＬの数は約２．３×１０１０～約１３．７×１０１０個である。
[00631] 一部の実施形態において、抗原提示細胞（ＡＰＣ）はＰＢＭＣである。
[00632] 一部の実施形態において、ＰＢＭＣはステップ（ｄ）において９～１４日目
のいずれかに細胞培養物に加えられる。
[00633] 一部の実施形態において、ステップ（ｈ）で治療上有効な投薬量のＴＩＬ細
胞を投与する前に、骨髄非破壊的リンパ球枯渇レジメンが患者に投与されている。
[00634] 一部の実施形態において、癌を処置する際、及び骨髄非破壊的リンパ枯渇レ
ジメンと組み合わせて使用するための、腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）の治療集団が提供される。一部の実施形態において、腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）の治療集団を投与する前に、骨髄非破壊的リンパ球枯渇レジメンが投与される。
[00635] 一部の実施形態において、骨髄非破壊的リンパ球枯渇レジメンは、６０ｍｇ
／ｍ２／日の用量で２日間のシクロホスファミドの投与ステップと、それに続く２５ｍｇ／ｍ２／日の用量で５日間のフルダラビンの投与ステップを含む。
[00636] 一部の実施形態における、ステップ（ｈ）で患者にＴＩＬ細胞を投与した翌
日に始まる高用量ＩＬ－２レジメンで患者を処置するステップ。
[00637] 一部の実施形態において、癌処置及び高用量ＩＬ－２レジメンと組み合わせ
て使用するための、腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）の治療集団が提供される。一部の実施形態において、高用量ＩＬ－２レジメンは、ＴＩＬ細胞の治療集団の投与の翌日に始まる。
[00638] 一部の実施形態において、高用量ＩＬ－２レジメンは、忍容量まで８時間毎
に１５分ボーラス静脈内注入として投与される６００，０００又は７２０，０００ＩＵ／ｋｇを含む。
[00639] 一部の実施形態において、治療用ＴＩＬ集団中のエフェクターＴ細胞及び／
又はセントラルメモリーＴ細胞は、第２の細胞集団から得られるエフェクターＴ細胞及び／又はセントラルメモリーＴ細胞と比べて、ＣＤ２７＋の発現、ＣＤ２８＋の発現、より長いテロメア、ＣＤ５７発現の増加、及びＣＤ５６発現の減少からなる群から選択される１つ以上の特徴を呈する。
[00640] 一部の実施形態において、治療用ＴＩＬ集団のエフェクターＴ細胞及び／又
はセントラルメモリーＴ細胞は、第２の細胞集団から得られるエフェクターＴ細胞及び／又はセントラルメモリーＴ細胞と比べて、ＣＤ５７発現の増加、及びＣＤ５６発現の減少
を呈する。
[00641] 本開示はまた、腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）を治療用ＴＩＬ集団に拡大培養
する方法も提供し、この方法は、
（ａ） 第１のＴＩＬ集団を得るために、患者から切除された腫瘍から処理された腫瘍断片を閉鎖系に追加すること；
（ｂ） ＩＬ－２を含む細胞培養培地で第１のＴＩＬ集団を培養し第２のＴＩＬ集団を産生することにより第１の拡大培養を実施することであって、第１の拡大培養は、第１のガス透過性表面積を提供する閉鎖型容器内で実施され、及び第２のＴＩＬ集団を得るため約３～１４日間拡大培養を行い、第２のＴＩＬ集団は第１のＴＩＬ集団よりも少なくとも５０倍数が多く、ステップ（ａ）からステップ（ｂ）への移行は系を開放せずに発生すること；
（ｃ） 第２のＴＩＬ集団の細胞培養培地に追加のＩＬ－２、ＯＫＴ－３、及び抗原提示細胞（ＡＰＣ）を添加することにより第２の拡大培養を実施して第３のＴＩＬ集団を生じさせることであって、第３のＴＩＬ集団を入手するために第２の拡大培養が約７～１４日間実施され、第３のＴＩＬ集団は、第２のＴＩＬ集団と比べてエフェクターＴ細胞及び／又はセントラルメモリーＴ細胞の増加サブ集団を含むＴ細胞治療用ＴＩＬ集団であり、第２の拡大培養は第２のガス透過性表面積を提供する閉鎖型容器で行われ、及びステップ（ｂ）からステップ（ｃ）への移行は系を開放せずに発生すること；
（ｄ） ステップ（ｃ）から得られた治療用ＴＩＬ集団を回収することであって、ステップ（ｃ）からステップ（ｄ）への移行は、系を開放せずに発生すること；及び
（ｅ） ステップ（ｄ）で回収したＴＩＬ集団を輸注バッグに移すことであって、ステップ（ｄ）から（ｅ）への移行は、系を開放せずに発生すること
を含む。
[00642] 一部の実施形態において、ステップ（ｄ）で回収した治療用ＴＩＬ集団は、
治療上有効な投薬量のＴＩＬとなるのに十分なＴＩＬを含む。
[00643] 一部の実施形態において、治療上有効な投薬量となるのに十分なＴＩＬの数
は約２．３×１０１０～約１３．７×１０１０個である。
[00644] 一部の実施形態において、本方法は、凍結保存プロセスを使用して、回収し
たＴＩＬ集団を含む輸注バッグを凍結保存するステップを更に含む。
[00645] 一部の実施形態において、凍結保存プロセスは、回収したＴＩＬ集団とCS10
培地との比は比率１：１を使用して実施される。
[00646] 一部の実施形態において、本開示は、拡大培養した腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩ
Ｌ）を投与することを含む癌を有する対象の処置方法も提供し、この方法は、
（ａ） 対象から得られた腫瘍試料を複数の腫瘍断片に処理することにより、患者から切除された腫瘍から第１のＴＩＬ集団を得ること；
（ｂ） 腫瘍断片を閉鎖系に加えること；
（ｃ） ＩＬ－２を含む細胞培養培地で第１のＴＩＬ集団を培養し第２のＴＩＬ集団を生じさせることにより第１の拡大培養を実施することであって、第１の拡大培養は、第１のガス透過性表面積を提供する閉鎖型容器内で実施され、第１の拡大培養は、第２のＴＩＬ集団を得るため約３～１４日間行われ、第２のＴＩＬ集団は、第１のＴＩＬ集団よりも少なくとも５０倍数が多く、ステップ（ｂ）からステップ（ｃ）への移行は系を開放せずに発生すること；
（ｄ） 第２のＴＩＬ集団の細胞培養培地に追加のＩＬ－２、ＯＫＴ－３、及び抗原提示細胞（ＡＰＣ）を添加することにより第２の拡大培養を実施して第３のＴＩＬ集団を生じ
させることであって、第３のＴＩＬ集団を入手するために第２の拡大培養が約７～１４日間実施され、第３のＴＩＬ集団は、第２のＴＩＬ集団と比べてエフェクターＴ細胞及び／又はセントラルメモリーＴ細胞の増加サブ集団を含むＴ細胞治療用ＴＩＬ集団であり、第２の拡大培養は第２のガス透過性表面積を提供する閉鎖型容器で行われ、及びステップ（ｃ）からステップ（ｄ）への移行は系を開放せずに発生すること；
（ｅ） ステップ（ｄ）から得られた治療用ＴＩＬ集団を回収することであって、ステップ（ｄ）からステップ（ｅ）への移行は、系を開放せずに発生すること；及び
（ｆ） ステップ（ｅ）で回収したＴＩＬ集団を輸注バッグに移すことであって、ステップ（ｅ）から（ｆ）への移行は、系を開放せずに発生すること；
（ｇ） 凍結保存プロセスを使用して、ステップ（ｆ）で回収したＴＩＬ集団を含む輸注バッグを任意選択で凍結保存すること；及び
（ｈ） ステップ（ｇ）における輸注バッグから治療上有効な投薬量の第３のＴＩＬ集団を患者に投与すること
を含み、ＴＩＬ集団の選択は、ステップ（ａ）から（ｈ）のいずれの間も実施されない。ある実施形態において、表現型に基づく第２のＴＩＬ集団（プレＲＥＰ集団）の選択は、ステップ（ｄ）の第２の拡大培養を実施する前には実施されない。ある実施形態において、第１のＴＩＬ集団、第２のＴＩＬ集団、第３のＴＩＬ集団、又はＣＤ８発現に基づく回収ＴＩＬの選択は、ステップ（ａ）～（ｈ）のいずれの間も実施されない。
[00647] 一部の実施形態において、本開示は、拡大培養した腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩ
Ｌ）を投与することを含む癌を有する対象の処置方法も提供し、この方法は、
（ａ） 対象から得られた腫瘍試料を複数の腫瘍断片に処理することにより、患者から切除された腫瘍から第１のＴＩＬ集団を得ること；
（ｂ） 腫瘍断片を閉鎖系に加えること；
（ｃ） ＩＬ－２を含む細胞培養培地で第１のＴＩＬ集団を培養し第２のＴＩＬ集団を生じさせることにより第１の拡大培養を実施することであって、第１の拡大培養は、第１のガス透過性表面積を提供する閉鎖型容器内で実施され、第１の拡大培養は、第２のＴＩＬ集団を得るため約３～１４日間行われ、第２のＴＩＬ集団は、第１のＴＩＬ集団よりも少なくとも５０倍数が多く、ステップ（ｂ）からステップ（ｃ）への移行は系を開放せずに発生すること；
（ｄ） 第２のＴＩＬ集団の細胞培養培地に追加のＩＬ－２、ＯＫＴ－３、及び抗原提示細胞（ＡＰＣ）を添加することにより第２の拡大培養を実施して第３のＴＩＬ集団を生じさせることであって、第３のＴＩＬ集団を入手するために第２の拡大培養が約７～１４日間実施され、第３のＴＩＬ集団は、第２のＴＩＬ集団と比べてエフェクターＴ細胞及び／又はセントラルメモリーＴ細胞の増加サブ集団を含むＴ細胞治療用ＴＩＬ集団であり、第２の拡大培養は第２のガス透過性表面積を提供する閉鎖型容器で行われ、及びステップ（ｃ）からステップ（ｄ）への移行は系を開放せずに発生すること；
（ｅ） ステップ（ｄ）から得られた治療用ＴＩＬ集団を回収することであって、ステップ（ｄ）からステップ（ｅ）への移行は、系を開放せずに発生すること；及び
（ｆ） ステップ（ｅ）で回収したＴＩＬ集団を輸注バッグに移すことであって、ステップ（ｅ）から（ｆ）への移行は、系を開放せずに発生すること；
（ｇ）凍結保存プロセスを使用して、ステップ（ｆ）から回収したＴＩＬ集団を含む輸注バッグを凍結保存することであって、凍結保存プロセスは、回収したＴＩＬ集団で凍結保存培地の混合を含むこと；
（ｈ） ステップ（ｇ）における輸注バッグから治療上有効な投薬量の第３のＴＩＬ集団を患者に投与すること
を含み、ＴＩＬ集団の選択は、ステップ（ａ）から（ｈ）のいずれの間も実施されない。ある実施形態において、表現型に基づく第２のＴＩＬ集団（例えば、プレＲＥＰ集団）の選択は、ステップ（ｄ）の第２の拡大培養を実施する前には実施されない。ある実施形態において、第１のＴＩＬ集団、第２のＴＩＬ集団、第３のＴＩＬ集団、又はＣＤ８発現に
基づく回収ＴＩＬの選択は、ステップ（ａ）～（ｈ）のいずれの間も実施されない。一部の実施形態において、回収ＴＩＬ集団を投与する前に、骨髄非破壊的リンパ球枯渇レジメンが投与される。一部の実施形態において、骨髄非破壊的リンパ球枯渇レジメンは、６０ｍｇ／ｍ２／日の用量で２日間のシクロホスファミドの投与ステップと、それに続く２５ｍｇ／ｍ２／日の用量で５日間のフルダラビンの投与ステップを含む。
[00648] 一部の実施形態において、抗原提示細胞は末梢血単核球（ＰＢＭＣ）である
。一部の実施形態において、ＰＢＭＣは放射線照射された、且つ同種異系のものである。一部の実施形態において、ＰＢＭＣはステップ（ｃ）において９～１４日目のいずれかに細胞培養物に加えられる。
[00649] 一部の実施形態において、抗原提示細胞は人工抗原提示細胞である。
[00650] 一部の実施形態において、ステップ（ｄ）の回収は、LOVO細胞処理系を使用
して実施される。
[00651] 一部の実施形態において、この方法は、ステップ（ｄ）は、Fresenius Kabi
製のLOVO系などのLOVO細胞処理系を介する回収を含む。用語「LOVO細胞処理系」は、滅菌及び／又は閉鎖系環境で、回転膜又は回転フィルターなどの膜又はフィルターを通して細胞を含む溶液を送り出すことができ、ペレット化せず上清又は細胞培養液を除去する連続フロー及び細胞処理を可能にする、機器又は装置も指す。ある場合には、細胞処理系は、閉鎖、無菌系で細胞分離、洗浄、流体交換、濃縮、及び／又は他の細胞処理ステップを実施することができる。
[00652] 一部の実施形態において、腫瘍断片は複数の断片であり、約４～約５０個の
断片を含み、各断片は約２７ｍｍ３の容積を有する。一部の実施形態において、複数の断片は、約１３００ｍｍ３～約１５００ｍｍ３の総容積を有する約３０～約６０個の断片を含む。一部の実施形態において、複数の断片は、約１３５０ｍｍ３の総容積を有する約５０個の断片を含む。一部の実施形態において、複数の断片は、約１ｇ～約１．５ｇの総質量を有する約５０個の断片を含む。
[00653] 一部の実施形態において、複数の断片は、約４個の断片を含む。一部の実施
形態において、４つの断片は、G-REX-100に入れられる。一部の実施形態において、４つ
の断片は、直径が約０．１ｃｍ、０．２ｃｍ、０．３ｃｍ、０．４ｃｍ、０．５ｃｍ、０．６ｃｍ、０．７ｃｍ、０．８ｃｍ、０．９ｃｍ、又は１ｃｍである。一部の実施形態において、４つの断片は、直径が約０．１ｃｍ、０．２ｃｍ、０．３ｃｍ、０．４ｃｍ、０．５ｃｍ、０．６ｃｍ、０．７ｃｍ、０．８ｃｍ、０．９ｃｍ、又は１ｃｍであり、G-REX-100に入れられる。一部の実施形態において、４つの断片は、直径が約０．１ｃｍ、０
．２ｃｍ、０．３ｃｍ、０．４ｃｍ、０．５ｃｍ、０．６ｃｍ、０．７ｃｍ、０．８ｃｍ、０．９ｃｍ、又は１ｃｍであり、G-REX-100と同等の容積の容器に入れられる。一部の
実施形態において、４つの断片は、直径約０．５ｃｍであり、G-REX-100に入れられる。
一部の実施形態において、４つの断片は、直径が約０．５ｃｍであり、G-REX-100と同等
の容積の容器に入れられる。
[00654] 一部の実施形態において、細胞培養培地は、Ｇコンテナ及びXuri細胞培養バ
ッグからなる群から選択される容器内に提供される。
[00655] 一部の実施形態において、ステップ（ｅ）の輸注バッグは、HypoThermosol含有輸注バッグである。
[00656] 一部の実施形態において、ステップ（ｂ）の第１の期間及びステップ（ｃ）
の第２の期間は、１０日、１１日、又は１２日の期間内にそれぞれ個別に実施される。一部の実施形態において、ステップ（ｂ）の第１の期間及びステップ（ｃ）の第２の期間は、１１日の期間内にそれぞれ個別に実施される。一部の実施形態において、ステップ（ａ）～（ｅ）は約２５日～約３０日の期間内に実施される。一部の実施形態において、ステップ（ａ）～（ｅ）は約２０日～約２５日の期間内に実施される。一部の実施形態において、ステップ（ａ）～（ｅ）は約２０日～約２２日の期間内に実施される。一部の実施形態において、ステップ（ａ）～（ｅ）は、２２日以内に実施される。一部の実施形態において、ステップ（ａ）～（ｅ）及び凍結保存は２２日以内に実施される。
[00657] 一部の実施形態において、ステップ（ｂ）～（ｅ）は、単一の容器で実施さ
れ、ステップ（ｂ）～（ｅ）を単一の容器で実施すると、ステップ（ｂ）～（ｅ）を２つ以上の容器で実施した場合に比べ切除された腫瘍毎のＴＩＬ収量が増加する結果となる。
[00658] 一部の実施形態において、抗原提示細胞は、系を開放せずにステップ（ｃ）
の第２の期間中にＴＩＬに追加される。
[00659] 一部の実施形態において、治療用ＴＩＬ集団で得られたエフェクターＴ細胞
及び／又はセントラルメモリーＴ細胞は、第２のの細胞集団から得られるエフェクターＴ細胞及び／又はセントラルメモリーＴ細胞と比べて、ＣＤ２７＋の発現、ＣＤ２８＋の発現、より長いテロメア、ＣＤ５７発現の増加、及びＣＤ５６発現の減少からなる群から選択される１つ以上の特徴を呈する。
[00660] 一部の実施形態において、治療用ＴＩＬ集団で得られたエフェクターＴ細胞
及び／又はセントラルメモリーＴ細胞は、第２の細胞集団から得られるエフェクターＴ細胞及び／又はセントラルメモリーＴ細胞と比べて、ＣＤ５７発現の増加、及びＣＤ５６発現の減少を呈する。
[00661] 一部の実施形態において、微生物汚染のリスクは、開放系と比較して低減さ
れる。
[00662] 一部の実施形態において、ステップ（ｅ）からのＴＩＬは、患者に注入され
る。
[00663] 一部の実施形態において、閉鎖型容器は単一のバイオリアクターを含む。一
部の実施形態において、閉鎖型容器はG-REX-10を含む。一部の実施形態において、閉鎖型容器はG-REX-100を含む。
実施例
[00664] 本明細書に包含される実施形態は、以下の実施例を参照して説明される。こ
れらの実施例は説明のみを目的として提供され、本明細書に包含される開示は決してこれらの実施例に限定されると解釈されるべきではなく、むしろ本明細書に提供される教示の結果として明らかになるありとあらゆる変形を包含すると解釈されるべきである。
実施例１：閉鎖系アッセイ
[00665] 本明細書で考察されるように、閉鎖系で患者の腫瘍からＴＩＬを開発するた
めのプロトコル及びアッセイが開発された。
[00666] この実施例では、G-REX装置で患者の切除腫瘍組織から臨床的に重要な数のＴ
ＩＬを産生し、最終細胞製品を凍結保存するための新規簡略手順について説明する。この手順の追加の側面については、実施例２～８で説明する。
定義／略称
ＢＳＣ－生物学的安全キャビネット
℃－摂氏
ＣＯ２－二酸化炭素
ＣＤ３－分化クラスター３
ＣＭ１－完全培地１
ＣＭ２－完全培地２
ＴＩＷＢ－腫瘍分離洗浄バッファー
ＣＭ４－完全培地４
ＣＲＦ－コントロールレートフリーザー
ＥｔＯＨ－エタノール
ＧＭＰ－医薬品の製造管理及び品質管理に関する基準
ＩＬ－２、ｒＩＬ－２－インターロイキン－２、組換えヒトインターロイキン－２、
ＩＵ－国際単位
Ｌ－リットル
ＬＮ２－液体窒素
ｍＬ－ミリリットル
μｌ－マイクロリットル
ｍＭ－ミリモル濃度
μｍ－マイクロメートル
ＮＡ－該当なし
ＰＢＭＣ－末梢血単核球
ＰＰＥ－個人用防護装備
プレＲＥＰ－腫瘍断片に由来する初めのＴＩＬ培養
ＲＥＰ－迅速拡大培養プロトコル
ＴＩＬ－腫瘍浸潤リンパ球
ＴＩＷＢ－ＴＩＬ分離洗浄バッファー
ＳＯＰ－標準実施要領
手順
１．高度な調製： ０日目（最大３６時間前に実施）
１．１ ５００ｍＬのハンクス平衡塩類溶液に５０μｇ／ｍＬのゲンタマイシンを添加して、ＴＩＬ分離洗浄バッファー（ＴＩＷＢ）を調製した。１０ｍｇ／ｍＬのゲンタマイシンストック溶液には、２．５ｍＬをＨＢＳＳに移した。５０ｍｇ／ｍＬのストック溶液には、０．５ｍＬをＨＢＳＳに移した。
１．２．ＣＭ２の手順については、ＬＡＢ－００５「プレＲＥＰ及びＲＥＰの培地の調製」に従ってGlutaMax（商標）でＣＭ１培地を調製した。４℃で最大２４時間貯蔵。使用前に少なくとも１時間、３７℃で温めた。
１．３．ＩＬ－２アリコートを－２０℃の冷凍庫から取り出し、２～８℃の冷蔵庫に入れた。
２．腫瘍組織の受領
２．１．腫瘍組織とともに受け取った書類を全て保管し、輸送容器及び腫瘍組織の写真を入手した。
２．２． TempTaleが提供され、関連する書類が印刷及び保存された場合、ＰＤＦを保存
した。
２．３．腫瘍標本及び第２の容器（ジップトップバッグ）を梱包から取り出し、処理の準
備ができるまで４℃で貯蔵した。
２．４ HypoThermasolで、又はCryoStor CS10（どちらもBioLife Solutions、Inc.から
市販されている）で凍結断片として未使用腫瘍を出荷した。
３．ＴＩＬの腫瘍処理
３．１．必要に応じて、以下の材料を無菌的にＢＳＣに移し、以下の表３に従って表示を付した。
３．２．腫瘍断片皿の円に文字Ａ～Ｊの表示を付した。
３．３．好ましい組織の皿（Favorable Tissue Dish）のウェルの下側に文字Ａ～Ｊの表
示を付した。
３．４．５ｍＬのゲンタマイシンをＨＢＳＳボトルに移した。ＴＩＷＢと表示を付した。３．５．混ざるように撹拌した。
３．６．５０ｍＬのＴＩＷＢを以下の各々にピペットした。
１．洗浄１（Wash 1）皿
２．洗浄２（Wash 2）皿
３．洗浄３（Wash 3）皿
４．洗浄４（Wash 4）皿
３．７．２ｍＬのＴＩＷＢを好ましい組織の皿（Favorable Tissue Dish）のウェルＡ～
Ｊにピペットした。
３．８．好ましい組織の皿（Favorable Tissue Dish）（６ウェルプレートの下部）を対
応する腫瘍断片皿（６ウェルプレートの蓋）で覆った。
３．９．長鉗子を使用し、標本ボトルから腫瘍を取り出し、洗浄１（Wash 1）皿に移した。
３．１０．洗浄１（Wash 1）皿で、周囲温度で３分間腫瘍をインキュベートした。
３．１１．インキュベート中、標本ボトル「Bioburden」の表示を再作成し、試験のため
に品質管理に提出するまで２～８℃で貯蔵した。
３．１２．長鉗子を破棄し、更なる操作には短鉗子を使用した。
３．１３．鉗子を使用して腫瘍を洗浄２（Wash 2）皿に移した。
３．１４．洗浄２（Wash 2）皿で、周囲温度で３分間腫瘍をインキュベートした。
３．１５．鉗子を使用して腫瘍を洗浄３（Wash 3）皿に移した。
３．１６．洗浄３（Wash 3）皿で、周囲温度で３分間腫瘍をインキュベートした。
３．１７．腫瘍組織片（６ウェルプレートの蓋）を好ましい組織の皿（Favorable Tissue
Dish）（６ウェルプレートの下部）から取り外し、腫瘍片を逆さまにしてＢＳＣ表面に
置いた。
３．１８．ホールピペットを使用して、腫瘍断片皿の各円にＴＩＷＢを約４個、均等に間隔を空けて加えた。
３．１９．剥離皿（Dissection Dish）の下に定規を置いた。
３．２０．鉗子を使用して腫瘍を剥離皿（Dissection Dish）に移した。
３．２１．剥離皿（Dissection Dish）の下の定規を使用して、腫瘍の長さを測定及び記
録した。
３．２２．１ｃｍを超える腫瘍については、追加の好ましい組織の皿（Favorable Tissue
Dish）を用意した。
３．２３．剥離皿（Dissection Dish）の腫瘍片を初めに１０の中間片に剥離し、各中間
片の腫瘍構造を保つように注意を払った。
３．２４．積極的に断片に剥離されていない中間腫瘍片を洗浄４（Wash 4）皿に移し、全剥離手順中に組織が水和したままであることを確認した。
３．２５．参考として、皿の下にある定規を使用して、一度に１つの中間腫瘍片を使用して、剥離皿（Dissection Dish）で腫瘍を最大３×３×３ｍｍの断片に慎重に薄切りにし
た。メスが鈍くなった場合は、新しいメスに交換した。
３．２６．中間片の全ての組織が判定されるまで、中間腫瘍片から断片を剥離し続けた。３．２７．好ましい断片を選択し、ホールピペットを使用して、腫瘍断片皿の１つの円でＴＩＷＢの滴に最大４つの好ましい断片を移した。
３．２８．ホールピペットを使用して、残っている好ましい断片を腫瘍片から、あれば、好ましい組織の皿（Favorable Tissue Dish）の対応するウェルに移した。
３．２９．ホールピペットを使用して、剥離皿（Dissection Dish）をきれいにするため
、好ましくない組織及び廃棄物をできる限り多く好ましくない組織の皿（Unfavorable Tissue Dish）に移した。黄色の脂肪組織又は壊死組織により、好ましくない組織が示され
た。
３．３０．残りの中間腫瘍片に対してステップ７．３．２５～７．３．３０を繰り返し、全ての腫瘍が処理されるまで一度に１つの中間片を処理することにより、処理を継続した。
３．３１．腫瘍断片皿の対応する円で利用可能な腫瘍断片が４つ未満の場合、４０の断片の目標を達成するために利用可能な、好ましい組織の皿（Favorable Tissue Dish）の対
応しないウェルからの断片を使用することが許容された。４０個未満の断片の場合、１０～４０個を単一のG-Rex 100Mフラスコに入れた。
４．G-Rex 100Mフラスコを播種する
４．１．必要に応じて、以下の材料を無菌的にＢＳＣに移し、以下の表４に従って表示を付した。
４．２．ＣＭ１にリットル毎に１ｍＬのＩＬ－２ストック溶液（６×１０６ＩＵ／ｍＬ）を添加した。
４．３．以下の表５で決定されるように、必要な各G-REX 100Mバイオリアクターに６，０００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２を含む１０００ｍＬの予め温めたＣＭ１を入れた。
４．４．ホールピペットを使用して、適切な数の腫瘍断片を各G-Rex 100Mフラスコに移し、表５に従って断片を分配した。
４．５．G-Rex 100Mフラスコに移した１つ以上の腫瘍断片が浮かんでいる場合好ましい組織の皿（Favorable Tissue Dish）から入手可能な場合は追加の腫瘍断片を１つ取得し、G-Rex 100Mフラスコに移した。
４．６．各フラスコに加えられた断片の総数を記録した。
４．７．好ましくない組織の皿（Unfavorable Tissue Dish）を廃棄した。
４．８．各G-REX 100Mバイオリアクターを３７℃、５％ＣＯ２インキュベーターに入れた。
４．９．４０を超える断片が利用可能な場合：
４．９．１．＞４１の断片が得られた場合、１０００ｍＬの予め温めた完全なＣＭ１を第２のG-REX 100Mバイオリアクターに入れた。
５．高度な調製：１１日目（最大２４時間前に調製）
５．１．GlutaMaxで６ＬのＣＭ２を調製した。ＣＭ２の手順については、「プレＲＥＰ及びＲＥＰの培地の調製」の参考検査手順を使用した。使用の１時間前に３７℃で加温した
。
５．２．ＩＬ－２アリコートを解凍した： 冷凍庫からＩＬ－２アリコートを取り出し、
４℃に置いた。
６．ＴＩＬを回収する（１１日目）
６．１．インキュベーターからG-REX -100Mフラスコを慎重に取り外し、ＢＳＣ２に入れ
た。フラスコの底にある細胞を乱さないように注意した。
６．２．GatherRex又は蠕動式ポンプを使用して、フラスコから約９００ｍＬの細胞培養
上清を吸引した。
６．３．フラスコを静かに旋回させてＴＩＬを再懸濁した。全ての細胞が膜から遊離していることが観察された。
６．４．蠕動式ポンプ又はGatherRexを使用して、残留細胞懸濁液を適切なサイズの血液
移送パック（３００～１０００ｍＬ）に移した。断片が血液移送パックに移らよう注意した。
６．５．移送パックに４インチ血漿移送セットを固定した（クランプが閉じていることを確認すること）。
６．６．パックを揉み、細胞懸濁液が十分に混合されていることを確認し、３ｍＬシリンジを使用して、細胞カウントのために１ｍＬのＴＩＬ懸濁液を取り出した。チューブを固定し、新しい滅菌ルアーキャップでメスルアーコネーに再び蓋をした。
６．７．移送パックをプラスチック製のジップトップバッグに入れ、使用する準備ができるまでインキュベーターに戻した。
７．培地の調製
７．１．培地を３７℃で＞１時間温めた。
７．２．３ｍＬの６×１０６ＩＵ／ｍＬストックｒｈＩＬ－２を６ＬのＣＭ２に加え、最終濃度３，０００ＩＵ／ｍＬ ｒｈＩＬ－２にした。「完全ＣＭ２」という表示を付す。７．３．メスルアー付きの４インチ血漿移送セットを１Ｌ移送パックに滅菌溶接した。
７．４．５００ｍＬの完全ＣＭ２を１Ｌ移送パックに移した。液体トランスファーセット又はシリンジを取り外し、滅菌ルアープラグをメスルアーポートに取り付けた。
７．５．試料サイトカプラーでパックを固定した。
７．６．針付きの１．０ｍＬシリンジを使用して、１５０μＬの１ｍｇ／ｍＬ抗ＣＤ３（クローンＯＫＴ３）を吸い上げ、試料サイトカプラーを介して５００ｍＬの「完全ＣＭ２」に移した。全ての試薬がラインから洗い流されるように、シリンジを引き戻した。使用するまで３７℃で貯蔵した。
８．フラスコの調製
８．１．参照用にフラスコの目盛りを使用して、４．５Ｌの「完全なＣＭ２」をG-REX -500Mフラスコに移した。
８．２．準備ができるまでフラスコを３７℃のインキュベーターに入れた。
９．照射フィーダーを解凍する
９．１．２人以上のドナーからの５．０×１０９の同種異系照射フィーダーを使用した。９．２．ＬＮ２冷凍庫からフィーダーを取り外し、バイオハザード移送バッグに入れた。９．３．バイオハザード移送バッグのフィーダーバッグで、３７℃のインキュベーター又はビーズ浴中でフィーダーを解凍した。バッグは静的で浸水しないように保った。ほぼ完全に解凍されたがまだ冷えているときに、フィーダーを浴から取り出した。
９．４．フィーダーバッグに７０％ＥｔＯＨを噴霧するか又はそれで拭き取り、ＢＳＣ２に入れた。十分な数の照射細胞（５×１０９個の細胞、＋／－２０％）を確保するため、各フィーダーバッグをオープンG-Rex 500Mに直接加えた。
９．５．オスルアーロック付きFenwalＹタイプコネクタの両方のクランプを閉じた。
９．６．各フィーダーバッグにＹコネクタの脚を取り付けた。
９．７．５００ｍＬの「完全ＣＭ２」＋ＯＫＴ３を含む１Ｌ移送パックを取り外し、ＢＳＣに移した。
９．８．６０ｍＬシリンジを三方活栓に無菌的に取り付け、移送パックを活栓のオス側に無菌的に取り付けた。
９．９．Ｙコネクタを三方活栓に無菌的に取り付けた。
９．１０．フィーダーバッグの内容物全体をシリンジに引き込み、容積を記録し、５．０×１０９個の同種異系照射フィーダーを移送パックに分配した。
９．１１．移送パックを装置に固定及び装置から取り外し、メスルアーロックを新しい滅菌ルアープラグで差し込んだ。
９．１２．針及び３ｍＬシリンジを使用して、試料サイトカプラーから１ｍＬを細胞カウントのため引き出した。
９．１３．標的細胞数の＋／－１０％（５．０×１０９）に＞７０％の生存率で到達した場合は続行した。
９．１４．標的細胞数の９０％未満（５．０×１０９）に＞７０％の生存率で到達した場合、別のバッグを解凍し、７．９．４～７．９．１２を繰り返した。標的細胞数の１１０％超が達成された場合、所望の細胞用量に必要な適切容積を計算して進めた。
１０．G-REX 500MフラスコでのＴＩＬ及びフィーダーの共培養
１０．１．インキュベーターから調製済み培地を含むG-REX 500Mフラスコを取り外し、ＢＳＣ２に入れた。
１０．２．フィーダー移送パックをG-REX -500Mに取り付け、バッグの内容物を500Mに排
出できるようにした。
１０．３．インキュベーターからＴＩＬ懸濁液を取り出し、ＢＳＣに入れた。
１０．４．合計２００×１０６の生細胞を達成するために追加するＴＩＬ懸濁液の量を計算した。
（ＴＶＣ／ｍＬ）／２００×１０６＝ｍＬ
１０．５．ＴＩＬが５～２００×１０６の合計生細胞の場合、全てのＴＩＬ（全量）をG-REX -500Mに加えた。ＴＩＬカウントが生細胞総数２００×１０６を超えた場合、２００
×１０６個のＴＩＬを個々のG-REX -500Mに分配するのに必要な量計算して加えた。残り
のＴＩＬをスピンダウンし、CS10で最大１０８／ｍＬの少なくとも２つのクライオバイアルで凍結し、ＴＩＬ識別表示及び凍結日付の表示を付した。
１０．６． G-REX -500Mを３７℃、５％ＣＯ２インキュベーターに５日間入れた。
１１．高度な調製：１６～１８日目
１１．１．５０×１０６個未満のＴＩＬで開始した培養用のAIM Vの１０Ｌバッグ１つ、
５０×１０６個を超えるＴＩＬで開始したバッグ２つを３７℃で少なくとも１時間又は使う準備が整うまで温めた。
１２．ＴＩＬ細胞カウントを実施する：１６～１８日目
１２．１．インキュベーターからG-REX -500Mフラスコを取り外し、ＢＳＣ２に入れた。
フラスコの底にある細胞培養物を乱さないように注意した。
１２．２．G-REX -500Mフラスコから４Ｌの細胞培養培地を無菌的に取り出し、滅菌容器
に入れた。
１２．３．全てのＴＩＬが膜から再懸濁されるまで、G-REX -500Mを旋回させた。
１２．４．GatherRex又は蠕動式ポンプを使用して、細胞懸濁液を２Ｌ移送パックに移し
た。後で使用するために500Mフラスコを保持した。ＴＩＬの損失を防ぐため、試料サイトカプラーでポートを密閉した。
１２．５．移送パックに試料サイトカプラーを固定し、３ｍＬシリンジ及び針を使用して、細胞カウントのために２×１ｍＬの独立した試料を取り出した。
１２．６．以下の式に従って、継代培養に必要なフラスコの総数を計算した。端数は切り上げた。
総生細胞／１．０×１０９＝フラスコ数
１３．ＣＭ４を調製する
１３．１．必要な500Mフラスコ２本ごとに１０ＬのAIM-Vバッグを準備した。必要に応じ
て追加の培地を温めた。
１３．２．AIM-Vが１０Ｌ必要になる毎に、１００ｍＬのGlutaMAXを加えてＣＭ４を作成
した。
１３．３．３，０００ＩＵ／ｍＬ ｒｈＩＬ－２の最終濃度のために、ＣＭ４培地にｒｈＩＬ－２を添加した。
１４．細胞培養を分割する
１４．１．フラスコの目盛りを使用して、重力で各G-REX -500Mを５Ｌまで満たした。
１４．２．計算した数のG-REX -500MでＴＩＬ量を均等に分配した。
１４．３．ＲＥＰの２２日目に回収するまで、フラスコを３７℃、５％ＣＯ２インキュベーターに入れた。
１５．高度な調製：２２～２４日目
１５．１．PlasmaLyte A 7.4の２つの１Ｌバッグに４０ｍＬの２５％ＨＳＡを加え、２Ｌの１％ＨＳＡ洗浄バッファーを調製した。LOVO補助バッグにプールする。
１５．２．６００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２で２００ｍＬのCS10を添加した。
１５．３．４つの７５０ｍＬアルミニウム冷凍庫キャニスターを４℃で予め冷却した。
１６．ＴＩＬを回収する：２２～２４日目
１６．１．３７℃インキュベーターからG-REX-500Mフラスコを取り外し、ＢＳＣ２に入れた。フラスコの底にある細胞培養物を乱さないように注意した。
１６．２．各フラスコから細胞培養上清４．５Ｌを吸引して廃棄した。
１６．３．G-REX -500Mフラスコを旋回させて、ＴＩＬを完全に再懸濁した。
１６．４．使用前に３～５Ｌのバイオプロセスバッグの重量を測定した。
１６．５．GatherRex又は蠕動式ポンプを使用して、ＴＩＬをバイオプロセスバッグに回
収した。
１６．６．バッグをよく混合し、３ｍＬシリンジを使用して、細胞カウントのためにシリンジ試料ポートから２×２ｍＬの試料を採取する。
１６．７．バッグの重量を量り、初期重量と最終重量に差を発見した。以下の計算を使用して、細胞懸濁液の量を決定した。
細胞懸濁液の正味重量（ｍＬ）／１．０３＝容積（ｍＬ）
１７．ＴＩＬをろ過してLOVOソースバッグを準備する
１７．１．細胞培養物を含むバッグをＢＳＣ２に入れた。
１７．２．１７０μｍの血液フィルターをＢＳＣ２に置き、全てのクランプを閉じた。
１７．３．フィルターのソース脚を細胞懸濁液に滅菌溶接した。
１７．４．適切なサイズの新しいバイオプロセスバッグの重量を量った（これをLOVOソースバッグと称した）。
１７．５．フィルターの端部をLOVOソースバッグに滅菌溶接した。
１７．６．ＩＶポールに細胞を掛け、細胞の重力流移動を作ることにより、細胞懸濁液を上昇させた。
注記：（ソースバッグをろ過装置には下げないようにした。）
１７．７．必要な全てのクランプを開き、ＴＩＬが細胞懸濁液バッグからフィルターを通ってLOVOソースバッグに排出されるようにした。
１７．８．全細胞がLOVOソースバッグに移ったら、全てのクランプを閉じ、LOVOソースバッグのチューブを密閉してフィルターを取り外した。
１７．９．LOVOソースバッグの重量を量り、容積を計算した。
１７．１０．LOVOソースバッグはLOVOを入れる準備ができていた。
１７．１１．バッグの近くのチューブを密封することにより、その使い捨てキットからLOVO最終産物バッグを取り外した。
１８．６００ＩＵ／ｍＬのｒｈＩＬ－２を添加した冷温のCS10でＴＩＬ１：１を処方する１８．１．必要なクライオバッグの必要数を計算した。
（細胞製品の容積×２）／１００＝必要バッグ数（切り捨て）
１８．２．各バッグに分注する容積を計算した。
（細胞製品の容積×２）／必要バッグ数＝各バッグに加える容積
１８．３．表６の以下の材料をＢＳＣに無菌的に移した。
１９．ＴＩＬの調剤
１９．１．Cell Connect CC1の全てのクランプを閉じた。
１９．２．細胞結合装置には、LOVO最終物、CS10バッグルアーロック及び適切な数のクライオバッグが無菌的に取り付けられた。６０ｍＬシリンジを１００ｍＬシリンジに交換した。
１９．３．必要なCS10容積は、LOVO最終物バッグの容積と同等であった。
１９．４．活栓経路を開き、LOVO最終物バッグ及びシリンジの間のラインのクランプを解除し、CS10をシリンジに引き込み、CS10パスのクランプを再び閉じた。細胞バッグへの経路を開放し、CS10をLOVO最終物バッグに押し込んだ。シリンジを使用して、LOVO最終物バッグに加えられた容量を測定した。必要な量のCS10が移るまで、必要に応じて新しいシリンジを使用して繰り返した。
１９．５．反転によりLOVO最終物バッグを混合した。
１９．６．１００ｍＬシリンジを交換した
１９．７．７５０ｍＬクライオバッグのクランプを一度に１つずつ開けた
１９．８．製剤化された産物及び使用中のクライオバッグに直接関連するクランプのみ開いた。
１９．９．１００ｍＬシリンジを使用して、クライオバッグにつながる調合製品の量を測定した。
１９．１０．製剤化された産物１００ｍＬを各凍結バッグに移した。
１９．１１．各バッグに加えた後、シリンジを引き戻し、クライオバッグから全ての気泡を取り除き、関連するラインのクランクを再び閉じた。
１９．１２．最終バッグで、ＱＣ試験用に１０ｍＬ保持して聞き戻す。
１９．１３．各クライオバッグを密閉し、チューブをできるだけ少なくした。
１９．１４．保持された試料を含むシリンジを取り外し、５０ｍＬコニカルチューブに移した；１．５ｍｌを個々のクリオバイアルに移し、制御された速度の冷凍庫に凍結した。１９．１５．表示の準備中に、密封したバッグを４℃にした。
１９．１６．各クライオバッグに産物説明、名前及び日付、容量、細胞カウント、生存率の表示を付した。
１９．１７．各クライオバッグを、予め冷却したアルミニウム製冷凍キャニスターに置いた。
２０．コントロールレートフリーザー（ＣＲＦ）を使用したＴＩＬの凍結保存
２０．１．速度を制御された冷凍庫の標準手順に従った。
２０．２．ＣＲＦを使用した後、液体窒素（ＬＮ２）にクリオバッグを貯蔵した。
２１．予想される結果及び適合基準
実施例２：８人の患者の腫瘍で実施されるプロセス
[00667] 実施例１のプロセスは、８人の患者の腫瘍を使用して実施され、８バッチの
ＴＩＬを産生した。以下の表７及び図７から図１０に示すように、培養、生存率、細胞カウント、ＣＤ３＋（％Ｔ細胞含有量を示す）及びＩＦＮ－γ（ＩＦＮーｇ又はＩＦＮ－γ）遊離から良好な回復が得られた。
実施例３：修飾ＴＩＬプロセスのスケーラビリティ
[00668] ここに示す研究はプロセス開発（ＰＤ：Process Development）研究所で実施され、その後、エンジニアリングランを利用したプロセス認定（ＰＱ：Process Qualification）の研究が製造施設のＧＭＰ無菌室で行われた。ＧＭＰ施設の無菌室では、認定プ
ロトコルに従って、３つのＰＱ／エンジニアリングランが完了し、ここに示されているＰＤ研究に基づいたバッチ記録が作成された。エンジニアリングランの適合基準は、前向き研究として設定された。ＰＱ研究の詳細を以下に要約し、試作バッチで得られた試験結果を以下のセクションで提供する。
[00669] プレ迅速拡大培養プロトコル（プレＲＥＰ）の培養物から生成された細胞の
数は、しばしば１００×１０６の生細胞を超えた。更に、プレＲＥＰ培養ステップ及びＲＥＰ培養ステップの間に凍結融解サイクルを含めると、生細胞の収量が減少した。プロセス内凍結保存ステップを排除することにより、ＲＥＰは、ＴＩＬの数を増やして確実且つ定期的に開始できた。この変更により、ＲＥＰの期間を、細胞の量に影響を与えることなく、細胞の倍増時間に比例しておよそ１１日間短縮することができた。加えて、活性化から回収までの培養時間の短縮により、製品の差別化が少なくなり、インビボ持続性が向上する可能性がある（Tran 2008）。
[00670] ＰＤ研究では、固定数のフィーダー細胞で最大２００×１０６個の細胞でＲ
ＥＰ培養の開始が実証された。次に、ＲＥＰ培養を回収する最適な時間を９～１４日間にわたって判定した。培養物は、１００：１～２５：１の範囲のＴＩＬ比に対してフィーダーで播種された。総細胞数、生存率、免疫表現型、培地消費、代謝産物分析、インターロイキン－２（ＩＬ－２）分析、及び以下の機能分析を測定することにより、回収時間の最適化を決定した。
[00671] ＲＥＰ培養終了時の細胞の免疫表現型検査は、以下の表８に記載されている
マーカーに基づいて判定された。細胞の表現型の活性化及び分化状態を判定した。表現型
の統計的な差は、いずれの実験条件でも観察されなかった。
[00672] 略称ＰＥ／Ｃｙ７＝フィコエリトリン（Phycoerythrin）：Ｃｙ－７タンデム共役体（Tandem Conjugate）；ＰｅｒＣＰ－Ｃｙ５．５＝ペリジニン・クロロフィル・タンパク質複合体（Peridinin-chlorophyll-protein Complex）：ＣＹ５．５コンジュゲー
ト；ＰＥ＝フィコエリトリン（Phycoerythrin）；ＦＩＴＣ＝フルオレセインイソチオシ
アネート共役体（Fluorescein Isothiocyanate Conjugate）；ＡＰＣ－Ｈ７＝アロフィコシアニン（Allophycocyanin）：Ｈ７タンデム共役体（Tandem Conjugate）；ＡＰＣ＝ア
ロフィコシアニン（Allophycocyanin）；ＰＢ＝Pacific Blue（商標）
[00673] 培地消費及び代謝産物生産は、試験した全ての条件で許容範囲内にとどまっ
た。ＩＬ－２レベルは、培養上清１５０ＩＵ／ｍＬを超えたままであった（データに示さず）。
[00674] Ｔ細胞による腫瘍細胞の死滅は、腫瘍細胞の表面に出現したペプチドに応答
したエフェクターＴ細胞上のＴ細胞受容体の活性化によって媒介されると理解される。エキソビボ拡大培養Ｔ細胞は、注入時にインビボ持続し、腫瘍退縮を媒介する場合、ＴＣＲ活性化に応答して活性化及び成長する能力を保持する必要がある。
[00675] 培養細胞の活性化の可能性を評価するため、異なる時点で回収したＴＩＬを
、ＯＫＴ３をロードした照射同種異系ＰＢＭＣで再活性化した。ＴＩＬ培養物を７日後に回収し、拡大倍数についてアッセイした。この研究の結果は表９にまとめられている。
[00676] この研究は、このアッセイでＴＩＬが活性化する可能性が培養の各日から１
１日目（回収９～１１日目）まで増加することを実証した。変更されたプロセスの１１日目に回収した細胞は、現在のプロセスと同様に１４日間培養物で維持されたＴＩＬを制御するのと同様の働きをした。
[00677] これらの研究は、変更ＴＩＬプロセスのスケーラビリティを実証し、フィー
ダー細胞に対するＴＩＬの播種比の許容範囲を確立した。加えて、培養条件は培養１４日目まで持続することが分かったが、培養条件は１１日目まで最適なままであった。試験された条件は、ＴＩＬ表現型に測定可能な影響を示さなかった。ＲＥＰ培養１１日目に回収した細胞は、細胞培養条件が許容範囲内にとどまっている間、再活性化に応答する最高能力を実証する。これらの変化は、５日目の培養物の分割、１１日目の回収で、本格的に採用及び検証された。

患者に投与するための自己ＴＩＬ産物のＧＭＰ製造に先立って、ＴＩＬ産物の製造及び試
験の経験を積むため、エンジニアリングランがプロセス開発施設で実施された。エンジニアリングランに使用される製造手順は、ＧＭＰ ＴＩＬ製品の製造に使用されるものと同様の規模であった。黒色腫、乳房、頭頸部扁平上皮癌（ＨＮＳＣＣ：Head and Neck Squamous Cell Carcinoma）、子宮頸癌、及び肺癌の転移を含む様々な種類の腫瘍からＴＩＬ
を成長させた経験により、転移性腫瘍試料からのＴＩＬの剥離及び成長はこれらの癌に類似していることが判明した（Sethuraman 2016, JITC P42）。腫瘍断片の初めの分離とリ
ンパ球の成長は腫瘍組織間で類似しているように見えるため、これらのエンジニアリングランは、ＨＮＳＣＣ、子宮頸部及び黒色腫腫瘍からのＴＩＬの生産のプロセスに十分適格である。
[00678] 患者に投与するための自己ＴＩＬ産物のＧＭＰ製造に先立って、ＴＩＬ産物
の製造及び試験の経験を積むため、エンジニアリングランがプロセス開発施設で実施された。エンジニアリングランに使用される製造手順は、ＧＭＰ ＴＩＬ製品の製造に使用されるものと同様の規模であった。黒色腫、乳房、頭頸部扁平上皮癌（ＨＮＳＣＣ：Head and Neck Squamous Cell Carcinoma）、子宮頸癌、及び肺癌の転移を含む様々な種類の腫
瘍からＴＩＬを成長させた経験により、転移性腫瘍試料からのＴＩＬの剥離及び成長はこれらの癌に類似していることが判明した（Sethuraman 2016, JITC P42）。腫瘍断片の初
めの分離とリンパ球の成長は腫瘍組織間で類似しているように見えるため、これらのエンジニアリングランは、ＨＮＳＣＣ、子宮頸部及び黒色腫腫瘍からのＴＩＬの生産のプロセスに十分適格である。
[00679] 表１０は、エンジニアリングランに使用された腫瘍試料の提供元及び特性を
示す。
[00680] プロセス開発施設でのＴＩＬの３つのエンジニアリングランの遊離試験は、
以下に説明するとおり完了した（表１１）。産物は１６日目及び２２日目に試験された。ＩＦＮ－γ分泌は、他の場所で詳述されているように、３回のエンジニアリングラン（表１２）でも測定された。
[00681] 結論として、エンジニアリングランからのデータは、患者への自己投与を目
的としてＴＩＬ製剤産物を製造できることを実証する。
実施例４：リンパ枯渇
[00682] 細胞は、７日目及びリンパ球減少の前にカウントできる。最終細胞製品には
、Plasma-Lyte A（商標）の最小５０％のHypoThermosol（商標）（容積／容積）及び３００ＩＵ／ｍＬのＩＬ２を含む最大０．５％ＨＳＡ（ヒト注入に適合）で製剤化された最大約１５０×１０９個の生細胞が含まれる。最終産物は、注入用の２つの容積のいずれかで投与に使用できた。
１）総ＴＩＬが≦７５×１０９個の場合、２５０ｍＬ（容量３００ｍＬの輸注バッグ内）又は
２）総ＴＩＬが＜１５０×１０９個の場合、５００ｍＬ（容量６００ｍＬの輸注バッグ内）
[00683] ＲＥＰステップ中のＴ細胞拡大培養率に患者間で差があるため、各患者の最
終ＴＩＬ注入産物用に産生される可能性のある細胞の総数は予測できない。３～１４日間のＲＥＰの３、４、５、６、７日目の細胞の下限は、シクロホスファミドとフルダラビンの化学療法レジメンを使用して患者をリンパ球枯渇させる判断を下すために必要な最小細胞数に基づいて設定される。この最小到達細胞数に基づいてリンパ枯渇を開始すると、３日目から１４日目、及び多くの場合は７日目までに、ＲＥＰで生成されるＴＩＬの利用可能な数で患者を処置することが約束される。注入の範囲の上限（１５０×１０９個の生細胞）は、臨床応答が達成された場合に安全に注入された公知の公開上限に基づいている。Radvanyi, et al., Clin Cancer Res 2012, 18, 6758-6770。
実施例５：プロセス２Ａ－０日目
[00684] この実施例では、実施例１～４で説明した２Ａプロセスの詳細な０日目のプ
ロトコルについて説明する。
[00685] 調製。
１．腫瘍洗浄液、ＣＭ１、及びＩＬ－２は有効期限内であることを確認した。
２．インキュベーターにＣＭ１（細胞培地１）を入れた。
[00686] 方法。
１．生物学的安全キャビネット（ＢＳＣ：Biological Safety Cabinet）を洗浄した。
２．プロセス内の監視プレートをセットアップし、手順中に１～２時間バイオセーフティキャビネットに置いた。
３．ＴＩＬ培地ＣＭ１を生物学的安全キャビネットに置いた。
４．６０００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２を含むＴＩＬ培地ＣＭ１を調整した：
４．１．１ＬのＣＭ１
４．２．１ｍＬのＩＬ－２（６，０００，０００ＩＵ／ｍＬ）
４．３．G-REXに加えるときに断片に使用するため、２５ｍＬのＣＭ１＋ＩＬ２を５０ｍ
ｌのコニカルに入れた。
４．４．予温のため３７℃のインキュベーターに入れた
５．G-REX 100MCSパッケージを７０％アルコールで拭き取り、バイオセーフティキャビネットに入れた。フィルターラインを除く全てのクランプを閉じた。
６．アカシアポンプのキャリブレーションを実施した。
７．G-REX 100MCSフラスコの赤ラインをアカシアポンプブーツの排出ラインに取り付けた。
８．ポンプブートの吸入ラインにPumpmaticを取り付け、培地を入れたボトルに入れた。
ポンプブートへのクランプを開放した。
９．各G-REX 100MCSバイオリアクターに６，０００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２を含む、予め温めた残りの９７５ｍｌのＣＭ１を注入した。
１０．赤ラインをヒートシールし、ポンプブートから外した。
１１．G-REXに表示を付した。
１２．必要になるまでインキュベーターにG-REX 100MCSを入れた。
[00687] 組織剥離
１．腫瘍処理の開始時間を記録した。
２．腫瘍洗浄培地をＢＳＣに移した。
３．５つの１００ｍｍペトリ皿をバイオセーフティキャビネットに入れ、３つは洗浄用、１つは保持用、１つは好ましくない組織用とした。それぞれ皿に表示を付した。黄色の脂肪組織又は壊死組織により、好ましくない組織が示された。
４．３つの６ウェルプレートをバイオセーフティキャビネットに入れた。
５．過剰な腫瘍片のために、３～５ｍＬの腫瘍洗浄培地を１つの６ウェルプレートの各ウェルにピペットで入れた。
６．５０ｍＬの腫瘍洗浄液をピペットで移し、皿１～３と保持皿を洗浄した。
７．２つの１５０ｍｍ剥離皿（Dissection Dish）をバイオセーフティキャビネットに入
れた。
８．３本の滅菌５０ｍＬコニカルチューブをＢＳＣに入れた。
９．１つに鉗子腫瘍洗浄液、２つ目にメス腫瘍洗浄液、３つ目に蓋への滴下（lid drops
）に使用する腫瘍洗浄液として表示を付した。
１０．５～２０ｍＬの腫瘍洗浄培地を各コニカルに追加した。腫瘍の洗浄及び剥離プロセス中に、必要に応じて、鉗子及びメスを腫瘍洗浄媒体に浸した。
１１．メス及び鉗子を適切なチューブに入れた。
１２．長鉗子を使用し、標本ボトルから腫瘍を取り出し、洗浄１（Wash 1）皿に移した。１３．洗浄１（Wash 1）皿で、周囲温度で≧３分間腫瘍をインキュベートした。
１４．インキュベーション中、標本ボトル「Bioburden」に表示を付し直し、最終回収又
は更なる無菌試験が必要になるまで２～８℃で貯蔵した。
１５．鉗子を使用して腫瘍を洗浄２（Wash 2）皿に移した。
１６．洗浄２（Wash 2）皿で、周囲温度で≧３分間腫瘍をインキュベートした。
１７．インキュベーション中に、ホールピペットを使用して、腫瘍断片皿に指定された６ウェルプレートの蓋の各円に腫瘍洗浄培地を約４等分間隔で個別に滴下した。
１８．鉗子を使用して腫瘍を洗浄３（Wash 3）皿に移した。
１９．洗浄３（Wash 3）皿で、周囲温度で≧３分間腫瘍をインキュベートした。
２０．剥離には１５０ｍｍの皿蓋を使用した。下に定規を置いた。
２１．調子を使用して、剥離皿（Dissection Dish）に腫瘍を移し、腫瘍の長さを測定及
び記録した。
２２．腫瘍の写真を撮った。
２３．各中間片の腫瘍構造を保つように注意を払いながら、剥離皿（Dissection Dish）
の腫瘍片を初めに中間片に剥離した。
２４．全剥離手順中に組織が水和したままにあるように皿を保持しながら、積極的に断片に剥離されていない中間腫瘍片を組織に移した。
２５．参考として、皿の下にある定規を使用して、一度に１つの中間腫瘍片を使用して、剥離皿（Dissection Dish）で腫瘍をおよそ３×３×３ｍｍの断片に慎重に薄切りにした
。
２６．中間片の全ての組織が判定されるまで、中間腫瘍片から断片を剥離し続けた。
２７．好ましい断片を選択し、ホールピペットを使用して、腫瘍断片皿の１つの円で洗浄培地の滴に最大４つの好ましい断片を移した。ホールピペット、メス又は調子を使用して、剥離皿（Dissection Dish）をきれいにするため、好ましくない組織及び廃棄物をでき
る限り多く好ましくない組織の皿（Unfavorable Tissue Dish）に移した。残りの全ての
組織は、６ウェルプレートのウェルの１つに入れた。（黄色の脂肪組織又は壊死組織により、好ましくない組織が示された。）
２８．残りの中間腫瘍片に対してステップ２３～２６を繰り返し、全ての腫瘍が処理されるまで一度に１つの中間片を処理することにより、処理を継続した。（必要に応じて、処理技術者の判断で、新らたなメス又は鉗子を入手した。）
２９．断片プレートをフードの後ろに移した。
３０．ホールピペット、メス、又は鉗子を使用して、最高５０個の最良の腫瘍断片を、ＣＭ１を含む腫瘍断片と表示が付された５０ｍＬコニカルチューブに移した。
３１．ホールピペットで５０ｍＬコニカルから浮遊物を取り除いた。断片及び浮遊物の数を記録した。
３２．フードから不要な物品を全て取り除き、余分な断片が含まれている場合は好ましい組織プレートを保持した。アルコールワイプでフードを拭き取った。
３３．インキュベーターからG-REX 100MCSを取り出し、７０％アルコールで拭き取り、バ
イオセーフティキャビネットに入れた。
３４．腫瘍断片の入ったコニカルを旋回させ、５０ｍＬコニカルの内容物をG-Rex 100MCSフラスコに注いだ。
３５．G-Rex 100Mフラスコに移した１つ以上の腫瘍断片が浮かんでいる場合好ましい組織の皿（Favorable Tissue Dish）から入手可能な場合は追加の腫瘍断片を１つ取得し、G-Rex 100Mフラスコに移した。
３６．インキュベーター数及び各フラスコに加えられた断片の総数を記録した。
３７．G-REX 100Mバイオリアクターを３７℃、５％ＣＯ２インキュベーターに入れた。
３８．未使用の腫瘍は全て１００ｍＬのHypoThermosolに入れ、研究室に届た。
３９．腫瘍処理の終了時間を記録した。
４０．ＩＬ－２及びＩＬ－２の未使用アリコートを含む未使用のＴＩＬ完全培地を廃棄した。
４１．生物学的安全キャビネットを洗浄した。
４２．Bioburdenの試料を適切な貯蔵条件下に置いた。
４３．データを記録した。
４４．画像をファイル標本ＩＤ番号腫瘍プロセスデータとして準備された患者のファイルに保存した。
４５．沈降プレートの注文をし、その微生物学研究室への配送を確実にした。
実施例６：プロセス２Ａ－１１日目
[00688] この実施例では、実施例１～４で説明した２Ａプロセスの詳細な１１日目の
プロトコルについて説明する。
[00689] 前回の調製
１．処理の前日：
１．１．ＣＭ２は、処理が行われる前日に準備できた。４℃に置いた。
２．処理の日。
２．１．フィーダーセルハーネスを準備した。
２．１．１．ＣＣ２及び４Ｓ－４Ｍ６０コネクタセットの全てのクランプを閉した。
２．１．２．スパイクを取り除きながら、４Ｓ－４Ｍ６０ハーネスの４つのスパイクをＣＣ２のスパイクラインに滅菌溶接した。
２．１．３．フィーダー細胞プーリングのために取っておいた。
２．２．CTF-FORM-318毎に５ｍＬの凍結保存培地を準備し、必要になるまで４℃に置く。
[00690] 無菌室環境監視－前処理
１．無菌室情報を記録した。
２．バイオセーフティキャビネット（ＢＳＣ：Biosafety Cabinet）は、大きな飽和アル
コールワイプ又はアルコールスプレーで洗浄した。
３．処理を開始する前に１０分間の粒子数を確認した。
４．プロセス内の監視プレートをセットアップし、手順中に１～２時間バイオセーフティキャビネットに置いた。
[00691] G-Rex 500MCSフラスコを準備する：
１．１０ｍＬシリンジを使用して、ＣＭ２（細胞培地２）１リットルあたり０．５ｍＬのＩＬ－２（ストックは６×１０６ＩＵ／ｍＬ）を、未使用の滅菌メスルアーコネクタを通してバイオプロセスバッグに無菌的に移した。
２．シリンジ内の過剰な空気を使用してラインをきれいにし、バッグからいくつかの培地を吸い上げて、元に戻した。これにより、全てのＩＬ－２が培地と確実に混合された。十分に混合した。
３．外装を開き、G-Rex 500MCSをＢＳＣに入れた。大きなフィルターラインを除く、装置
の全てのクランプを閉じた。
４．G-Rex 500MCSからの赤い回収ラインをポンプチューブの排出ラインに滅菌溶接した。５．バイオプロセスバッグのメスルアーをポンプブーツのオスルアーに接続した。
６．ＩＶポールにバイオプロセスバッグを掛け、クランプを開き、４．５リットルのＣＭ２培地をG-Rex 500MCSに送り込んだ。ライン、クランプ、及びヒートシールをクリアにした。
７．ポンプから培地までのラインを保持した。これはフィーダー細胞の調製に使用された。
８．G-Rex 500MCSをインキュベーターに入れた。
[00692] 照射フィーダー細胞を準備する
１．ＩＬ ＴＰからスパイクを密閉及び取り除いた。両方のラインを固定した。
２．１Ｌ移送パック（ＴＰ：Transfer Pack）の乾燥重量を記録した。
３．１Ｌ移送パックをバッグからアカシアポンプブーツに約１２インチの位置に滅菌溶接した。
４．ポンプチューブのもう一端は、まだ１０Ｌのlabtainerに接続されていた。
５．重量で５００ｍＬのＣＭ２をＴＰに注入した。
６．クランプを閉じ、溶接継手の近くで密閉した。
７．インキュベーターに入れた。
８．フィーダー細胞バッグの確認及び終了作業を行った。
９．使用したフィーダーロットを記録した。
１０．アルコールでバッグを拭き取った。
１１．ジップロックバッグに入れた。
１２．３７℃（＋／－１℃）の水浴中でフィーダー細胞を解凍した。水浴の温度を記録した。
１３．ガーゼを取り除き乾燥させた。
１４．フィーダー細胞を準備室に渡した。
１５．無菌室のＢＳＣに移した。
１６．予め準備したフィーダーハーネスを使用して、１Ｌ ＴＰを三方活栓のサンプルポート側の未使用ラインの１つに、シールジャンクションに可能な限り近づけて、チューブをできるだけ少なくして溶接した。
１７．フィーダーハーネスをＢＳＣに入れた。
１８．３つのフィーダーバッグの各々に、フィーダーハーネスからのスパイクをフィーダーバッグの単一ポートに固定した。
１９．１Ｌ ＴＰが「ＯＦＦ」位置になるように、活栓バルブを回転させた。
２０．一度に１つのバッグで作業し、フィーダーバッグへのラインのクランプを開き、シリンジ内の空気を排出して、フィーダーバッグの内容物をシリンジに引き込んだ。シリンジから排出された空気は、細胞の回収を補助した。フィーダーバッグへのクランプを閉じた。
２１．各バッグの解凍フィーダー細胞の回収量を記録した。
２２．フィーダーバッグが「ＯＦＦ」位置になるように、活栓バルブを回転させた。
２３．ＴＰのクランプを開き、シリンジの内容物をＴＰに分配した。
２４．ラインがクリアされていることを確認し、ＴＰのクランプを再び閉じた。ラインをクリアする際に使用するため、ＴＰからシリンジに空気を吸引する必要がある場合がある。
２５．細胞をよく混ぜた。
２６．フィーダーバッグへのクランプを閉じた。
２７．シリンジポートが「オフ」の位置になるように活栓を回転した。６０ｍＬシリンジを活栓から外した。
２８．フィーダーバッグ毎に新しいシリンジと交換した。
２９．最終バッグの後、シリンジをオンのままにしておいた。
３０．最終フィーダー配合物をよく混合した。
３１．フィーダー細胞懸濁液が「ＯＦＦ」の位置にあるように活栓を回転した。
３２．細胞を混ぜ、５ｍＬシリンジ及び不要なポートを使用して、１ｍｌの細胞を確実にサンプリング及び除去できるようにポートを細胞溶液で洗浄し、カウント用の表示が付されたチューブに入れた。
３３．第２のシリンジで繰り返した。これらの２つの独立した試料は、それぞれ一回の細胞カウントを実施した。
３４．フィーダー懸濁液が「ＯＰＥＮ」位置になるように活栓を回し、ハーネスに取り付けられた６０ｍｌシリンジを使用して、空気をＴＰに送ってラインをクリアにした。
３５．シリンジを取り外し、ルアーポートを新しい滅菌キャップで覆った。
３６．ＴＰを溶接継手の近くでヒートシールし、ハーネスを取り外した。
３７．細胞懸濁液を含む移送パックの質量を記録し、細胞懸濁液の容積を計算した。
３８．インキュベーターに入れた。
３９．フィーダー細胞試料及び記録データに対し一度の細胞カウントを実施し、バッチ記録に生データのカウントを添付した。
４０．Cellometerカウントプログラムを文書化した。
４１．正しい希釈がCellometerに入力されたことを確認した。
４２．フィーダー移送パックの総生細胞密度を計算した。
４３．細胞数が＜５×１０９の場合、より多くの細胞を解凍してカウントし、フィーダー細胞に加えた。
４４．フィーダーバッグの容積を再計量し容積を計算した。
４５．取り除く細胞の容積を計算した。
[00693] G-REXへのフィーダーの追加
１．フィーダーＴＰに４インチトランスファーセットを滅菌溶接した。
２．ＢＳＣに、フィーダー移送パックに溶接されたメスルアーに適切なサイズのシリンジを取り付けた。
３．細胞をよく混合し、ステップ４０又は４１で計算した容積を取り除き、５．０×１０９個の細胞を達成した。不要な細胞を廃棄した。
４．１ｍＬシリンジと１８Ｇ針を使用して、０．１５０ｍＬのＯＫＴ３を吸引し、針を取り外し、メスルアーを介してフィーダーＴＰに移した。
５．フィーダー細胞及び混合バッグが付いたチューブ及びシリンジをすすいだ。シリンジからの空気でラインをクリアした。
６．インキュベーターからG-Rex 500MCSを取り除き、アルコールワイプで拭き取りＳＣＤの横に置いた。
７．フィーダーバッグをG-Rex 500MCSの赤ラインに滅菌溶接した。ラインのクランプを外し、重力によりフィーダー細胞がフラスコに流れ込むようにした。
８．ラインが完全にクリアされていることを確認してから、ラインを元の溶接部の近くでヒートシールし、フィーダーバッグを取り外した。
９．G-Rex 500MCSをインキュベーターに戻し、時間を記録した。
[00694] ＴＩＬを調整する：ＴＩＬ回収の開始時間を記録する
１．インキュベーターからG-Rex 100MCSを慎重に取り外し、大きなフィルターラインを除く全てのクランプを閉じた。
２．G-REX 100MCSの赤ラインに１Ｌ移送パックを溶接した。
３．３００ｍｌのＴＰのクランプを閉じた。スパイクを取り除き、バッグから約１２インチをヒートシールした。乾燥重量／質量を記録した。
４．３００ｍＬ移送パックを、ヒートシールに近い１００ＭＣＳの細胞収集ラインに滅菌溶接した。ラインのクランプを閉じた。
５．１Ｌ ＴＰにつながる全てのクランプを開放した。
６．GatheRexを使用して、約９００ｍＬの培養上清を１Ｌ移送パックに移した。空気がラインに入ると、Gatherexは停止した。ラインとヒートシールを固定した。
７．全ての細胞が膜から剥離するまでフラスコを旋回した。膜を確認し、全ての細胞が剥離していることを確認した。
８．収集チューブから離してフラスコを傾け、腫瘍破片を縁に沿って沈降させた。
９．断片がフラスコの反対側に残るように、収集チューブに向かってゆっくりとフラスコを傾けた。
１０．GatheRexを使用して、残留細胞懸濁液を、腫瘍破片を避けて３００ｍＬの移動パックに移した。
１１．全ての細胞が膜から離れたことを再確認した。
１２．必要に応じて、GatheRexのクランプを開放して逆洗し、重力によって一部の培地をG-Rex 100MCSフラスコに流入させた。
１３．フラスコを激しく叩いて細胞を遊離させ、３００ｍｌ ＴＰに注入した。
１４．収集が完了した後、赤ラインとヒートシールを閉じた。
１５．乾燥重量が記録されたときとほぼ同じ長さのチューブを残して、収集ラインをヒートシールした。
１６．細胞懸濁液を含む３００ｍｌ ＴＰの記録質量（乾燥質量を含む）及び細胞懸濁液の容積を計算した。
１７．ＢＳＣスパイクでは、３００ｍＬ ＴＰに４インチの血漿移送セットを固定した。細胞をよく混合した。５ｍＬシリンジドロー１ｍＬを無菌的に取り付け、冷凍保存バイアルに入れた。第２のシリンジで繰り返した。これらは、細胞、生存率のカウントに使用された。
１８．ルアーキャップを再クランプし、新しい滅菌ルアーキャップに交換した。
１９．インキュベーターに入れ、インキュベーターで時間及び場所を記録した。
２０．各試料及び記録データに対し一度の細胞カウントを実施し、バッチ記録に生データのカウントを添付した。
２１．Cellometerカウントプログラムを文書化した。
２２．正しい希釈がCellometerに入力されたことを確認した。
２３．必要に応じて、総生細胞ＴＩＬ密度を≦２×１０８個以下の生細胞に調整した。
２４．削除する容積を計算又は不要な調整を記録した。
２５．ＢＳＣ内で、適切なサイズのシリンジを３００ｍＬ ＴＰに無菌的に取り付けた。２６．必要に応じて、「削除する容積の計算」表で計算された細胞の計算された容積を取り除いた。
２７．３００ｍｌ ＴＰをクランプ及びヒートシールした。
２８．過剰な細胞を適切なサイズのコニカルチューブに移し、後に凍結保存するためにキャップを緩めてインキュベーターに入れた。
２９．インキュベーターからG-Rex 500MCSを取り出し、ＳＣＤの横に置いた。
３０．３００ｍｌ ＴＰをアカシアポンプの吸入ラインに滅菌溶接した。
３１．G-Rex 500MCSフラスコの赤ラインをアカシアポンプの排出ラインに滅菌溶接した。３２．フラスコに細胞を注入した。
３３．ラインが完全にクリアされていることを確認してから、赤ラインを元の溶接部の近くでヒートシールした。
３４．大きなフィルターラインを除き、G-Rex 500MCSの全てのクランプが閉じていることを確認した。
３５．G-Rex 500MCSをインキュベーターに戻し、G-Rexインキュベーターに置かれた時間
を記録した。
３６．沈降プレートの注文をし、その微生物学研究室への配送を確実にした。
過剰の凍結保存
[00695] 細胞に加える凍結培地の計算量：
３７．ＴＩＬを４００×ｇで、２０℃で５分間、最大減速及び最大加速で沈下させた。
３８．無菌的に上清を吸引した。
３９．チューブの底を軽く叩き、残った液体に細胞を再懸濁した。
４０．チューブを軽く叩きながら、準備した凍結培地をゆっくりと加えた。
４１．適切なサイズの冷凍保存チューブに分注し、細胞を－８０℃に入れた時間を記録した。
実施例７：プロセス２Ａ－１６日目
[00696] この実施例では、実施例１～４で説明した２Ａプロセスの詳細な１６日目の
プロトコルについて説明する。
[00697] 無菌室環境監視－前処理。
１．バイオセーフティキャビネットは、大きな飽和アルコールワイプ又はアルコールスプレーで洗浄した。
２．処理を開始する前に１０分間の粒子数を確認した。
３．プロセス内の監視プレートをセットアップし、手順中に１～２時間バイオセーフティキャビネットに置いた。
[00698] ＴＩＬの回収及びカウント。
１．５０×１０６個未満のＴＩＬで開始した培養物のＣＭ４の１０Ｌバッグ１つを３７℃のインキュベーターで少なくとも３０分又は使用準備が整うまで温めた。
２．ＢＳＣ内で、１０ＬのLabtainerバッグにBaxterエクステンションセットを無菌的に
取り付けた。
３．G-Rex 500MCSフラスコをインキュベーターから取り外し、GatheRexに隣接するベンチトップに置いた。大きなフィルターラインを除く、装置の全てのクランプを閉じたことを確認した。クイック接続ラインのクランプを「Ｔ」ジャンクションの近くに移動した。
４．Baxterエクステンションの溶接可能なチューブを介して、１０ＬのLabtainerをG-Rex
500MCSの赤回収ラインに滅菌溶接した。
５．スパイク及び記録された乾燥重量を除去する”Ｙの下に２Ｌ移送パック２”をヒートシールした。２Ｌ ＴＰをG-Rex 500MCSのクリア収集ラインに滅菌溶接した。
６．G-Rex 500MCSを水平面に置いた。
７．１０ＬのLabtainerに向かう全てのクランプを開放し、GatheRexを使用して、約４Ｌ
の培養上清を１０ＬのLabtainerに移した。
８．適切なGatheRex回収指示に従って回収した。
９．赤ラインをクランプし、ＴＩＬの回収開始時間を記録した。
１０．空気がラインに入ると、Gatherexは停止した。赤ラインをクランプした。
１１．上清を除去した後、全ての細胞が膜から剥離するまでフラスコを旋回した。フラスコを傾けて、ホースがフラスコの端にくるようにした。
１２．２Ｌ ＴＰに向かう全てのクランプを開放し、GatheRexを使用して、残留細胞懸濁
液を２Ｌ ＴＰに移し、全ての細胞が収集されるまで端を傾斜したまま維持した。
１３．付着した細胞について膜を検査した。
１４．必要に応じて、赤ラインのクランプを開放して逆洗し、重力によって一部の培地をフラスコに流入させた。
１５．赤ライン及びトリプルヒートシールを閉じた。
１６．フラスコを激しく叩いて細胞を遊離させた。
１７．２Ｌ ＴＰに細胞を加えた。
１８．乾燥重量が記録されたときとほぼ同じ長さのチューブを残して、２Ｌ移送パックをヒートシールした。
１９．G-Rex 500MCSを保持し、スプリットで再使用した。
２０．細胞懸濁液を含む移送パックの質量を記録し、細胞懸濁液の容積を計算した。
２１．乾燥質量を含む、細胞懸濁液量を決定した。
２２．細胞懸濁液バッグに４インチトランスファーセットを滅菌溶接した。
２３．ＢＳＣ内で、細胞を静かに混合し、２０ｃｃシリンジで１１ｍｌを吸い上げ、表１４に示すように分注した：
２４．ヒートシールした。クランプを保持しているルアー接続を閉じた
２５．細胞懸濁液に表示を付してインキュベーターに入れ、インキュベーターに入れた時間を記録した。
２６．新たな容積を計算した。
２７．細胞懸濁液量及びＱＣ用に除去された量に基づいた２Ｌ移送パック内の量を記録した（１１ｍＬ）。
２８．植菌及び指示された無菌試験。
２９．マイコプラズマ試験のため、保留中のラックに４℃でマイコプラズマ試料を貯蔵した。
３０．ＴＩＬが播種されるまで取っておいた。
[00699]
細胞カウント：
[00700] 記録データに対し一度の細胞カウントを実施し、バッチ記録に生データのカ
ウントを添付した。文書化された希釈。Cellometerカウントプログラムを文書化した。正しい希釈がCellometerに入力されたことを確認した。
[00701] 続く方法：
３１．継代培養に必要なフラスコの総数を計算した。
＊＊元の容器を再利用し、追加の容器の端数を切り上げた。
[00702] ＣＭへのＩＬ－２の追加
１．Aim Vの１０Ｌバッグ及びGlutamaxをＢＳＣに入れた。
２．培地バッグに４インチの血漿移送セットを固定した。
３．１８Ｇ針を１０ｍＬシリンジに取り付け、５ｍＬのＩＬ－２をシリンジに引き込んだ（最終濃度は３０００ＩＵ／ｍＬ）。
４．針を取り外し、シリンジを無菌的に血漿移送セットに取り付け、ＩＬ－２をバッグに分注した。
５．ラインを空気で洗い流し、培地を吸い上げてバッグに分注した。これにより、全てのＩＬ－２が培地に含まれる。
６．Aim Vの残りのバッグについても繰り返した。
[00703] G-Rex 500MCSフラスコを調製する：
１．フラスコに加えるＣＭ４の量を決定した。フラスコ毎に加えられた細胞の容積及びＣＭ４の５０００ｍＬ－Ａの容積を記録した。
２．大きなフィルターラインを除く全てのクランプを閉じた。
３．アカシアポンプの吸入ラインを、ＣＭ４を含む培地バッグの４インチ血漿移送セットに滅菌溶接した。
４．ポンプの排出ラインをG-Rex 500MCSに赤収集ラインを介して滅菌溶接した。
５．フラスコのラインをガイドとして使用して、決定された量のＣＭ４をG-Rex 500MCSに注入した。
６．G-Rex 500MCSの赤ラインをヒートシールした。
７．各フラスコについてステップ４～６を繰り返した。重力充填又は複数のポンプを使用して、複数のフラスコに同時に充填できた。「Ｙ」コネクタをポンプの排出ラインに溶接し、２本のアームを２本のG-Rex 500MCSフラスコに溶接し、両方を同時に充填した。
８．フラスコを３７℃、５％ＣＯ２に入れた。
[00704] ＴＩＬの入ったフラスコを播種する
１．大きなフィルターラインを除いて、G-Rex 500MCSの全てのクランプを閉じた。
２．細胞産物バッグをアカシアポンプの吸入ラインに滅菌溶接した。
３．アカシアポンプの端をG-Rex 500MCSの赤ラインに滅菌溶接した。
４．ポンプブーツをポンプに入れた。
５．細胞産物バッグを化学天秤に置き、G-REXフラスコにＴＩＬを加えた時間を記録した
。
６．化学天秤の目盛りをゼロに戻した。
７．ラインのクランプを開放し、１ｇ＝１ｍｌの仮定重量でG-Rex 500MCSに必要な量の細胞を注入した。
８．細胞バッグを逆さまにして、空気を送ってラインをクリアにした。G-Rex 500MCSの赤ラインをヒートシールした。フラスコをインキュベーターに入れた。
９．ポンプの排出ラインを以下のG-Rex 500MCSに赤収集ラインを介して滅菌溶接した。
１０．細胞をよく混合した。
１１．全てのフラスコで細胞の移動を繰り返した。
１２．フラスコを３７℃、５％ＣＯ２に置き、ＴＩＬをG_REXフラスコに加えた時間を記
録した。
１３．微生物学研究室へ沈降プレートの試験指示をした。
１４．受託番号を記録した。
１５．好気的及び嫌気的無菌性の試験の指示をした。
１６．プレート及びボトルの微生物学研究室への配送を確実にした。
[00705] 流動性又は過剰細胞の凍結保存：
１．必要な凍結培地の計算量：
ａ．標的細胞濃度は１×１０８／ｍｌであった。除去されたセルの総量を記録した。標的細胞濃度は１×１０８細胞／ｍＬであった。加える凍結培地の総量を計算した。
２．凍結保存培地を調製し、必要になるまで４０℃に置いた。
３．ＴＩＬを４００×ｇで、２０℃で５分間、最大減速及び最大加速で沈下させた。
４．無菌的に上清を吸引した。
５．チューブの底を軽く叩き、残った液体に細胞を再懸濁した。
６．チューブを軽く叩きながら、準備した凍結培地をゆっくりと加えた。
７．適切なサイズの表示が付されたクライオチューブに分注した。
８．バイアルをMr. Frosty又は同等品に入れ、－８０℃の冷凍庫に入れた。
９．７２時間以内に恒久的な貯蔵場所に移し、－８０℃の冷凍庫に入れた日時を文書化して記録した。
実施例８：プロセス２Ａ－２２日目
[00706] この実施例では、実施例１～４で説明した２Ａプロセスの詳細な２２日目の
プロトコルについて説明する。
[00707] 否定的なプロセス内滅菌結果を文書化する
[00708] 回収を開始する前に、微生物学研究室から１６日目の予備無菌結果を取得し
た。結果が肯定的である場合、さらなる指示について研究室長又は指定者に連絡した。
[00709] 無菌室環境監視－前処理
１．処理を開始する前に１０分間の粒子数を確認した。
２．バイオセーフティキャビネットは、大きな飽和アルコールワイプ又はアルコールスプレーで洗浄した。
３．プロセス内の監視プレートをセットアップし、手順中に１～２時間バイオセーフティキャビネットに置いた。
[00710] 高度な調製
１．ＢＳＣ内で、１０ＬのLabtainerバッグ又は同等品にBaxterエクステンションセット
を無菌的に取り付けた。LOVOろ液バッグに表示を付した。
２．PlasmaLyte Aの３つの１ＬバッグをＢＳＣに入れた。
３．プールの準備し、PlasmaLyte Aバッグに１％ＨＳＡの表示を付した。
３．１．４Ｓ－４Ｍ６０コネクタセットの全てのクランプを閉じ、各PlasmaLyteバッグを固定した。
３．２．４Ｓ－４Ｍ６０のオス端部の１つをアカシアポンプブーツの吸入ラインに溶接した。
３．３．ポンプブーツの排出ラインを３リットル収集バッグに溶接した。ポンプするラインを除く３Ｌバッグの全てのクランプを閉じた。
３．４．３リットルのPlasmalyteを３リットルのバッグに注入した。必要に応じて、ポンプを逆転させて３Ｌバッグから空気を抜いた。
３．５．メスルアーのラインを除く全てのクランプを閉じた。
３．６．２つの１００ｍＬシリンジと１６～１８Ｇ針を使用して、１２０ｍＬの２５％Ｈ
ＳＡをロードした。シリンジに赤いキャップを付けた。
３．７．３リットルバッグのメスルアーにシリンジを１つ取り付け、ＨＳＡを３Ｌの PlasmaLyteバッグに移した。よく混合した。
３．８．第２のシリンジで繰り返した。
３．９．十分に混合した。
３．１０．全てのクランプを閉じた。
３．１１．１０ｍＬシリンジを使用して、３リットルバッグの無針ポートから５ｍＬの１％ＨＳＡのPlasmaLyteを取り出した。
３．１２．ＩＬ－２希釈のためにキャップを付けたシリンジをＢＳＣで維持した。
３．１３．全てのクランプを閉じた。
３．１４．ポンプブーツからメスルアーラインを取り外しヒートシールした。
３．１５．LOVO洗浄バッファーに表示と日付を付した。周囲温度で、２４時間以内で期限切れとした。
[00711] ＩＬ－２調製
１．５ｍＬシリンジから表示が付された５０ｍｌの滅菌コニカルチューブにPlasmalyte／１％ＨＳＡを分配した。
２．PlasmaLyteを含むチューブに０．０５ｍＬのＩＬ－２ストックを加えた。
３．ＩＬ－２、６×１０４個に表示を付した
４．ラベルをキャップし、２～８℃で貯蔵した。容積を記録した。
[00712] 細胞の調製
１．１０ＬのLabtainerbagの全てのクランプを閉じた。ルアーの接続を介してBaxter延長セットを１０Ｌバッグに取り付けた。
２．３７℃からG-REX 500Mフラスコを取り外した。
３．G-Rex 500MCSからの赤培地除去ラインを１０Ｌのバイオプロセスバッグの延長セットに滅菌溶接した。
４．G-Rex 500MCSからのクリア細胞除去ラインを３Ｌの収集バッグに滅菌溶接し、「pooled cell suspension」と表示を付した。
５．赤ライン及び１０Ｌのバッグのクランプを開放した。
６．GatheRexポンプを使用すると、第１のフラスコの容積が減少した。
注記：気泡が検出された場合、ポンプが途中で停止する可能性がある。完全に容積減少が完了しなかった場合、GatheRexポンプを再起動した。
７．上清バッグ及び赤ラインのクランプを閉じた。
８．飛散や泡立ちを避けながらＴＩＬが完全に再懸濁されるまで、G-REX 500Mフラスコを旋回させた。全ての細胞が膜から乖離していることを確認した。
９．クリアラインと３Ｌセルバッグのクランプを開いた。
１０．G-Rexフラスコを傾けて、細胞懸濁液が収集ストローのあるフラスコの側面に溜ま
るようにした。
１１．細胞懸濁液を収集するためにGatherRexを開始した。注記：細胞収集ストローが壁
面及び底膜の接合部にない場合、ストローを適切に配置するには、通常、４５°の角度でフラスコを傾けたまま軽く叩くだけで十分であった。
１２．全ての細胞がフラスコから取り除かれるようにした。
１３．細胞がフラスコに残っている場合は、１００ｍＬの上清をフラスコに戻し、旋回させて、細胞懸濁液バッグに集めた。
１４．細胞収集バッグへのラインのクランプを閉じた。GatheRexのクランプを開放した。１５．G-Rex 500MCSのクリアラインをヒートシールした。
１６．G-Rex 500MCSの赤ラインをヒートシールした。
１７．追加のフラスコに対してステップ３～１６を繰り返した。
１８．２フラスコごとに、必要に応じて１０Ｌの上清バッグを交換する必要があった。
１９．複数のGatherRexが使用できた。
２０．G-Rex 500MCSの処理数を文書化した。
２１．細胞収集バッグをヒートシールした。G-REXの回収数を記録した。
２２．新しい３リットル収集バッグのメスルアーコネクタの１つから、マーカーで約２インチに印を付した。
２３．ヒートシールし、印のすぐ下のメスルアーを取り外した。
２４．LOVO Source Bagと表示を付した。
２５．乾燥重量を記録した。
２６．１７０μｍの血液フィルターの全てのクランプを閉じた。
２７．フィルターの端部をLOVO source bagの印のすぐ下に滅菌溶接した。
２８．フィルターのソースラインを、細胞懸濁液を含むバッグに滅菌溶接した。
２９．ＩＶポールに細胞を掛け、細胞の重力流移動を開始して、細胞懸濁液を上昇させた。（注記：ソースバッグをろ過装置には下げないようにした。）
３０．必要な全てのクランプを開き、ＴＩＬが細胞懸濁液バッグからフィルターを通ってLOVOソースバッグに排出されるようにした。
３１．全細胞がLOVOソースバッグに移ったら、全てのクランプを閉じ、印のすぐ上をヒートシールし取り外しフィルターを取り外した。
３２．バッグをよく混合し、２つの３ｍＬシリンジを使用して、細胞及び生存率のカウントのためにシリンジ試料ポートから２つの独立した２ｍＬの試料を採取した。
３３．バッグの重量を量り、初期重量と最終重量に差を判定した。
３４．乾燥質量を含むデータを記録しインキュベーターに入れた。
[00713] 細胞カウント。
[00714] 各試料及び記録データに対し一度の細胞カウントを実施し、バッチ記録に生
データのカウントを添付した。Cellometerカウントプログラムを文書化した。正しい希釈がCellometerに入力されたことを確認した。有核細胞の総数を決定した。除去するＴＮＣの数を決定し、LOVO処理用に＝１．５×１０１１個の細胞を保持した。取り出した細胞を適切なサイズの容器に入れて廃棄した。
[00715] LOVOの回収
[00716] 事前準備で設定されたBaxter延長セットを備えた１０ＬLabtainerは、後にLOVOキットに溶接された交換用ろ液バッグであった。LOVOをオンにして、画面表示に従った。
[00717] 重量計及び圧力センサーを確認する

[00718] 機器操作プロファイル（Instrument Operation Profile）にアクセスするに
は：
１．情報ボタン（Information Button）に触れた。
２．機器設定タブ（Instrument Settings Tab）に触れた。
３．機器操作プロファイル（Instrument Operation Profile）ボタンに触れた。
４．機器操作プロファイル（Instrument Operation Profile）が表示された。
[00719] 重量計を確認する
１．重量計に何も掛かっていないことを確認し、各重量計の測定値を確認した。
２．重量計のいずれかが０＋／－２ｇの範囲外で読み取られた場合、製造元の重量計校正マニュアル（Weigh Scale Calibration Manual）に記載されている重量計校正を実施した。
３．全ての重量計が、重量が掛かっていないのに許容範囲内にある場合は、各重量計に１ｋｇの重量を掛け（番号１～４）、測定値を確認した。
４．重量計のいずれかが、１－ｋｇの重量が掛かっている場合に１０００＋／－１０ｇの範囲外で読み取られた場合、製造元のLOVO使用取扱説明書（Operator’s Manual）に記載されている重量計校正を実施した。
[00720] 圧力センサーを確認する
１．機器操作プロファイルスクリーン（Instrument Operation Profile Screen）で圧力
センサーの読み取り値を確認した。
２．該当なし：圧力センサーの測定値が０＋／－１０ｍｍＨｇの外にあった場合、製造元のLOVO使用取扱説明書（Operator’s Manual）に記載されているように、サービスモードで新しい大気圧設定を貯蔵した。
ａ．機器操作プロファイル画面（Instrument Operation Profile Screen）の確認ボタン
に触れた。
ｂ．機器設定（Instrument Settings Tab）の確認ボタンに触れた。
３．重量計の校正が実施された場合、又は新しい大気圧設定が保存された場合、関連するセクションを繰り返した。
[00721] 手順を開始するため、プロトコル選択画面（Protocol Selection Screen）のドロップダウンメニューから「TIL G-Rex Harvest」プロトコルを選択し、スタート（Start）を押した。
１．手順設定画面（Procedure Setup Screen）が表示された。
２．溶液情報（Solutions Information）ボタンに触れた。
３．溶液１画面（Solution 1 Screen）が表示された。溶液１（Solution 1）に必要な洗
浄バッファーの種類を確認した。（PlasmaLyteと表示されていなくてはならない。）
４．次へ（Next）ボタンに触れ、溶液２画面（Solution 2 Screen）に進んだ。溶液２（Solution 2）に必要な洗浄バッファーの種類を確認した。（「なし（NONE）」と表示され
ていなくてはならない。これは、１種類の洗浄バッファー（PlasmaLyte）のみを使用するようにプロトコルが構成されていたことを示す）
５．溶液２情報画面（Solution 2 Information Screen）の確認ボタンに触れ、手順設定
画面（Procedure Setup Screen）に戻った。
６．手順情報ボタン（Procedure Information Button）に触れた。
７．手順情報画面（Procedure Information Screen）が表示された。
８．ユーザＩＤ（User ID）入力欄に触れた。キーパッドが表示された。実施者及び検証
者の頭文字を入力した。ボタンに触れ、入力を受諾した。
９．原料ＩＤ（Source ID）入力欄に触れた。キーパッドが表示された。製品ロット番号
を入力した。ボタンに触れ、入力を受諾した。
１０．手順ＩＤ（Procedure ID）入力欄に触れた。キーパッドが表示された。「TIL Harvest」と入力した。ボタンに触れ、入力を受諾した。
１１．記録する追加の中注記がある場合は、手順注記（Procedure Note）入力欄に触れた。キーパッドが表示された。注記を入力した。ボタンに触れ、入力を受諾した。
注記：手順注記（Procedure Note）の入力欄は任意選択であり、空白のままにしてもよい。
１２．手順情報画面（Procedure Information Screen）の確認ボタンに触れ、手順設定画面（Procedure Setup Screen）に戻った。
１３．手順情報（Procedure Information）ボタンに「確認（Check）」が表示されることを確認した。「確認（Check）」が表示されない場合は、手順情報（Procedure Information）ボタンにもう一度触れ、ユーザＩＤ（User ID）、原料ＩＤ（Source ID）、及び手順ＩＤ（Procedure ID）欄が全て入力されていることを確認した。
１４．パラメータ設定ボタン（Parameter Configuration Button）に触れた。
１５．一般手順情報画面（General Procedure Information Screen）が表示された。
１６．原料量（Source Volume）（ｍＬ）入力欄に触れた。テンキーが表示された。表１
から計算された細胞懸濁液の容積（ｍＬ）を入力した。
１７．ボタンに触れ、入力を受諾した。
１８．原料ＰＣＶ（Source PCV）（％）入力欄に触れた。ＴＩＬ（生＋死）画面（TIL Screen）が表示された。
１９．セル濃度（Cell Concentration）入力欄に触れた。テンキーが表示された。「×１０６ｍＬ」の単位で、原料産物（ Source Product）に表１４の総細胞濃度（Total Cellular Concentration）／ｍＬを入力した。入力範囲は００．０～９９．９である。ボタン
に触れて入力を受諾し、一般手順情報画面（Total Cellular concentration）に戻った。注記：細胞濃度（Cell Concentration）が受諾されると、一般手順情報画面（General Procedure Information Screen）の原料ＰＣＶ（Source PCV）（％）入力欄には、作業者が行った細胞濃度（Cell Concentration）入力に基づいて、LOVOによって計算されたＰＣＶ％が表示された。
２０．一般手順画面（General Procedure Screen）で、次へ（Next）ボタンに触れ、画面４／８の最終物量（保持量）画面（Final Product Volume (Retentate Volume) Screen）に進んだ。注記：画面２及び３には、作業者が入力する入力欄がなかった。
２１．最終産物量（保持量）画面（Final Product Volume (Retentate Volume) sScreen
）が表示された。
２２．表１５の総有核細胞（ＴＮＣ）値（Total nucleated cells (TNC) Value）を使用
して、以下の表（表１６）で最終産物の標的容積を決定した。LOVO手順（LOVO Procedure）の設定中に、その細胞範囲（Cell Range）に関連付けられた最終産物容積（ｍＬ）を入力した。
２３．表１６から指定された容積を標的にするため、最終産物容積（ｍＬ）入力欄に触れ
た。テンキーが表示された。ｍＬ単位で所望の最終産物量（Final Product Volume）を入力した。ボタンに触れ、入力を受諾した。
２４．最終産物量（保持量）画面（Final Product Volume (Retentate Volume) Screen）に触れ、手順設定画面（Procedure Setup Screen）に戻った。注記：画面５～８には、作業者が入力する入力欄がなかった。
２５．パラメータ設定（Parameter Configuration）ボタンに「確認（Check）」が表示されることを確認した。「確認（Check）」が表示されない場合は、手順情報（Procedure Information）ボタンにもう一度触れ、ページ１の原料容積（Source Volume）及び原料Ｐ
ＣＶ（Source PCV）が入力されていることを確認した。また、標的最小最終産物量（Target Minimum Final Product Volume）チェックボックスがチェックされていること、又は
、ページ４の最終産物量（Final Product Volume）（ｍＬ）欄が入力されていることを確認した。
２６．画面の右上隅にある推定ボタン（Estimate Button）に触れた。
２７．推定概要画面（Estimation Summary Screen）が表示された。原料（Source）及びPlasmaLyte洗浄バッファー（PlasmaLyte Wash Buffer）の十分且つ正確な値を確認した。
２８．使い捨てキットをロードした：ヘルプボタン「（？）」を選択して、キットをロードする画面の指示に従った。
２９．ろ液（Filtrate）及び溶液１（Solution 1）に表示される容積を書き留めた（PlasmaLyteを読まれたい）。
３０．ろ液（Filtrate）及び溶液１（Solution 1）に表示される容積を書き留めた（PlasmaLyteを読まれたい）。
３１．使い捨てキットのロード手順については、ヘルプボタンにふれるか、詳細な手順についての使用取扱説明書の手順に従った。
３２．標準のLOVO使い捨てキットがロードされたら、次へ（Next）ボタンに触れた。容器情報（Container Information）及び場所情報画面（Location Screen）が表示された。スケール＃３からろ液（Filtrate）バッグを取り外した。
３３．このプロトコルでは、ろ液（Filtrate）容器は新しく、新しく（New）測定上限を
超えていた（Off Scale）。
３４．ろ液（Filtrate）容器がすでに新規（New）及び測定上限超（Off-Scale）と表示された場合、変更は行われなかった。
３５．ろ液の種類が元の（Original）と表示されている場合は、元の（Original）のボタンに触れ新規（New）に切り替えた。
３６．ろ液の位置（Filtrate location）が測定範囲内（On-Scale）と表示されている場
合、測定範囲内（On-Scale）ボタンに触れ測定上限超（Off-Scale）に切り替えた。
３７．生成されるろ液の量が≦２５００ｍＬの場合、ろ液容器の位置（Filtrate Container Location）は、実施中のものの一貫性を図るため、測定範囲内（On-Scale）と表示さ
れ、ろ液容器の位置（Filtrate Container Location）は測定上限超（Off-Scale）に変更され、容器の種類は「新規（New）」であった。
３８．測定範囲内（On-Scale）ボタンに触れ、測定上限超（Off-Scale）に切り替えた。
移送セットを、滅菌溶接技術を使用して取り付け、LOVO使い捨てキットのろ液（Filtrate）容器を１０－Ｌバッグに交換した。溶接部を開いた。
３９．ベンチトップにろ液（Filtrate）容器を置いた。重量計＃３にろ液（Filtrate）バッグを掛けなかった。手順中に計量計＃３は空だった。
４０．ろ液（Filtrate）容器に通じるチューブのプラスチック製クランプを開放した。注記：溶接中にチューブがＦクランプから外れた場合、クランプで交換した。
４１．ろ液容器容量（Filtrate Container Capacity）入力欄に触れた。テンキーが表示
された。新規合計ろ液（Filtrate）容量（１０，０００ｍＬ）を入力した。「確認（Check）」ボタンに触れ、入力を受諾した。
４２．滅菌溶接技術を使用して取り付け、LOVO使い捨てキットのろ液（Filtrate）容器を１０－Ｌバッグに交換した。溶接部を開いた。注記：溶接中にチューブがＦクランプから
外れた場合、クランプで交換した。
４３．ベンチトップに新規ろ液（Filtrate）容器を置いた。重量計＃３にろ液（Filtrate）バッグを掛けなかった。手順中に計量計＃３は空だった。
４４．ろ液（Filtrate）容器に通じるチューブのプラスチック製クランプを開放した。
４５．保持（Retentate）容器の場合、画面には元の（Original）測定範囲内（On-Scale
）が表示された。
４６．保持（Retentate）容器は変更されなかった。
４７．ろ液（Filtrate）容器に全ての変更が加えられ、適切な情報が入力されたら、次へ（Next）ボタンに触れた。
４８．使い捨てキットドライチェック（Disposable Kit Dry Check）オーバーレイが表示された。キットが適切にロードされたことを確認し、はい（Yes）ボタンを押した。
４９．全てのLOVO臨床クランプが自動的に閉じ、使い捨てキットの取り付け確認画面（Checking Disposable Kit Installation Screen）が表示された。LOVOには、キットを確認
するために一連の加圧手順が実施された。
５０．使い捨てキットのチェックに合格すると、溶液の接続画面（Connect Solutions Screen）が表示された。
５１．３Ｌは洗浄量であった。画面にこの値を入力した。
５２．滅菌溶接技術を使用して、PlasmaLyteの３Ｌバッグを、クランプ１を通過するチューブに取り付けた。溶接部を開いた。
５３．PlasmaLyteバッグをＩＶポールに掛け、
５４．PlasmaLyteバッグに通じるチューブのプラスチック製クランプを開放した。
５５．溶液量（Solution Volume）の入力が３０００ｍＬであることを確認した。これは
以前に入力されたものであった。
５６．次へ（Next）ボタンに触れた。使い捨てキット準備（Disposable Kit Prime）オーバーレイが表示された。PlasmaLyteが取り付けられ、PlasmaLyteにつながるチューブの溶接部及びプラスチック製のクランプが開いていることを確認し、はい（Yes）ボタンに触
れた。注記：LOVO手順では１種類の洗浄バッファー（PlasmaLyte）しか使用されなかったため、クランプ２を通るチューブに溶液は付着しなかった。このチューブのRobertsクラ
ンプは、処置中は閉じたままであった。
５７．使い捨てキット準備が開始され、使い捨てキット準備中画面（Priming Disposable
Kit Screen）が表示された。PlasmaLyteのバッグに接続されたチューブを介して、PlasmaLyteが移動することを視覚的に観察した。流体が動いていない場合は、画面上の一時停
止ボタンを押して、クランプ又は溶接がまだ閉じているか否かを確認した。問題が解決したら、画面の再開（Resume）ボタンを押し、使い捨てキット準備を再開した。
５８．使い捨てキット準備が正常に終了すると、原料接続画面（Connect Source Screen
）が表示された。
５９．このプロトコルでは、原料（Source）容器は新しく（New）測定上限を超えていた
（Off Scale）。
６０．原料（Source）容器がすでに新規（New）及び測定上限超（Off-Scale）と表示された場合、変更は行われなかった。
６１．原料の位置（Source location）が測定範囲内（On-Scale）と表示されている場合
、測定範囲内（On-Scale）ボタンに触れ測定上限超（Off-Scale）に切り替えた。
６２．原料容量（Source Capacity）（ｍＬ）入力欄に触れた。テンキーが表示された。
原料（Source）産物を保持した容器の容量を入力した。確認（Check）ボタンに触れ、入
力を受諾した。注記：原料容量（Source Capacity）の入力は、原料準備（Source Prime
）段階中にバッグに加えられた追加の溶液をソースバッグが保持できるようにするために使用された。
６３．滅菌溶接技術を使用して、原料（Source）容器を、クランプＳを通過するチューブに取り付けた。溶接部を開いた。必要に応じて、クランプからチューブを取り外した。
６４．必ずソースチューブをＳクランプに取り付けた。
６５．次へ（Next）ボタンに触れた。原料準備（Source Prime）オーバーレイが表示された。原料（Source）が使い捨てキットに取り付けられ、原料（Source）につながるチューブの溶接部及びプラスチック製のクランプが開いていることを確認し、はい（Yes）ボタ
ンに触れた。
６６．原料（Source）準備が開始され、原料準備中画面（Priming Source Screen）が表
示された。原料（Source）バッグに取り付けられたチューブを介して、PlasmaLyteが移動しているのを視覚的に観察した。流体が動いていない場合は、画面上の一時停止ボタンを押して、クランプ又は溶接がまだ閉じているか否かを確認した。問題が解決したら、画面の再開（Resume）ボタンを押し、原料（Source）準備を再開した。
６７．原料（Source）の準備が正常に終了すると、手順開始画面（Start Procedure Screen）が表示された。
６８．開始（Start）ボタンを押した。「Pre-Wash Cycle 1」（前洗浄サイクル１）の一
時停止画面が表示され、「Coat IP, Mix Source」（ＩＰを塗布、原料を混合する）の指
示が表示された。
６９．ＩＰバッグを前塗布した。
７０．開始（Start）ボタンを押す前に、重量計＃２からＩＰバッグを取り外し（ＩＰト
ップポートチューブガイドからチューブを取り外すこともできた）、手動で反転させ、使い捨てキットの準備ステップ中に加えた洗浄バッファーがバッグの全内部表面に塗布されるようにした。
７１．ＩＰバッグを重量計”＃２（左に面したバッグの表示）に再び掛けた。チューブガイドのトップポートチューブが外れた場合は交換した。
７２．原料（Source）バッグを混合した。
７３．開始（Start）ボタンを押す前に、重量計＃１から原料（Source）バッグを取り出
し、数回反転させて均一な細胞懸濁液を作製した。
７４．原料（Source）バッグを重量計＃１又はＩＶポールに再び掛けた。バッグが揺れていないことを確認した。
７５．開始（Start）ボタンを押した。
７６．LOVOは原料（Source）バッグからの流動を開始し、洗浄サイクル１画面（Wash Cycle 1 Screen）が表示された。
[00722] LOVO手順の間、系は自動的に一時停止して、作業者が異なるバッグを確認で
きるようにした。一時停止中に異なる画面が表示された。各画面に対応する指示に従った。
[00723] 原料洗滌一時停止
[00724] 原料（Source）バッグを排出させた後、LOVOが原料（Source）バッグに洗浄
バッファーを加えバッグをすすいだ。設定量の洗浄バッファーが原料（Source）バッグに加えられた後、LOVOは自動的に一時停止し、原料（Source）洗滌一時停止画面を表示した。
[00725] 原料洗滌一時停止画面（Source Rinse Paused Screen）が表示されたら、作
業者は以下のことを行いった。
１．原料（Source）バッグを重量計＃１から取り外した。
１．原料（Source）バッグを数回反転させ、洗浄バッファーがバッグ内部全体に触れるようにした。
２．原料（Source）バッグを重量計＃１に再び掛けた。原料（Source）バッグが重量計＃１で揺れていないことを確認した。
３．再開（Resume）ボタンを押した。
[00726] LOVOは原料（Source）バッグからの洗滌液を処理し、自動化手順を続けた。
[00727] ＩＰバッグ混合の一時停止
[00728] スピナを通過させる別の細胞を準備するため、ＩＰバッグを洗浄バッファー
で希釈した。ＩＰバッグに洗浄バッファーを追加すると、LOVOは自動的に一時停止し、「Mix IP bag（ＩＰバッグ混合）」一時停止画面（Pause Screen）が表示された。
[00729] 「Mix IP bag（ＩＰバッグ混合）」一時停止画面（Pause Screen）が表示さ
れたら、作業者は以下のことを行った。
１．ＩＰバッグを重量計＃２から取り外した。ＩＰトップポートチューブガイドからチューブを取り外すこともできた。
２．細胞懸濁液を完全に混合するため、ＩＰバッグを数回反転させた。
３．ＩＰバッグを重量計＃２に再び掛けた。また、チューブガイドのＩＰトップポートチューブが外れた場合は交換した。ＩＰバッグが重量計＃２で揺れていないことを確認した。
４．再開（Resume）ボタンを押した。LOVOはＩＰバッグからの液体の処理を開始した。
[00730] ＩＰの角を揉む際の一時停止
[00731] LOVO手順の最終洗浄サイクル中に、細胞をＩＰバッグからスピナを介して保
持液（最終産物）（Retentate (Final Product)）バッグに注入した。ＩＰバッグが空に
なったら、１０ｍＬの洗浄バッファーをＩＰバッグの底部ポートに加え、バッグをすすいだ。洗滌液を追加した後、LOVOは自動的に一時停止し、「Massage IP corners（ＩＰバッグの角を揉む）」一時停止画面（Pause Screen）が表示された。
[00732] 「Massage IP corners（ＩＰバッグの角を揉む）」一時停止画面（Pause Screen）が表示されたら、作業者は以下のことを行った。
１．ＩＰバッグを重量計＃２から決して取り外さなかった。
２．ＩＰバッグを重量計＃２に掛けたまま、バッグの角を揉み、残っている細胞を浮遊させた。
３．ＩＰバッグが重量計＃２で揺れていないことを確認した。
４．再開（Resume）ボタンを押した。
５．LOVOはＩＰバッグから洗滌液をポンプで排出し始めた。
[00733] LOVO手順の最後に、産物除去画面（Remove Products Screen）が表示された
。この画面が表示されたら、LOVOキットの全てのバッグが操作できた。
注記：産物除去画面（Remove Products Screen）が表示されるまで、バッグに触れなか
った。
[00734] 保持（Retentate）バッグのポートに非常に近いチューブに止血剤を入れ、細胞懸濁液がチューブに落ちないようにし、止血剤の下でトリプルヒートシールした。
[00735] 中間シールを破って保持液バッグを取り外し、ＢＳＣに移した。
[00736] 産物除去画面（Remove Products Screen）の指示に従った。
[00737] 次へ（Next）ボタンに触れた。全てのLOVO臨床クランプが開放され、キット
除去画面（Remove Kit Screen）が表示された。
[00738] キット除去画面（Remove Kit Screen）の指示に従った。完了後次に進んだ。
[00739] 次へ（Next）ボタンに触れた。全てのLOVO臨床クランプが閉鎖され、結果概
要画面（Results Summary Screen）が表示された。表１７の結果概要画面のデータを記録した。全てのポンプを閉じ、支持剤をろ過した。
[00740] 次へ（Next）ボタンに触れた。プロトコル選択画面（Protocol Selection Screen）が表示された。
[00741] LOVO終了（LOVO Shutdown）手順
１．全てのクランプが閉鎖され、フィルターサポートが直立位置にあることを確認した。２．LOVOの前面にある停止（STOP）ボタンに触れた。
３．停止ボタン決定オーバーレイ（STOP Button Decision Overlay）が表示された。
４．終了確認オーバーレイ（Shutdown Confirmation Overlay）が表示された。
５．はい（Yes）ボタンに触れた。終了中画面（Shutting Down Screen）が表示された。
６．数秒後、電源オフ画面（Power Off Screen）が表示された。この画面が表示されたら、機器の左後部にあるスイッチを使用してLOVOの電源を切った。
[00742] 最終的な製剤化された産物量を表に記録した。
[00743] 最終産物表から必要なＩＬ－２の量を計算した。
[00744] Cryobagの数と保持量（Retain Volume）を判定した
[00745] 標的容積（Target Volume）に印を付け、凍結保存バッグの数と産物の保持試料の容積の下の表を保持した。
[00746] 標的容積／バッグ計算：（最終製剤量－１００％回収率が得られないための
量調整＝１０ｍＬ）／バッグの数。
[00747] １：１（容積：容積）のCS10（CryoStor 10、BioLife Solutions）及びＩＬ
－２で細胞を調製した。
１．接続装置の組み立て
１．１．CS750クライオバッグをCC2 Cell Connect装置に滅菌溶接し、各バッグの遠位オ
スルアーエンドの１つを交換した。
１．２．クランプを閉鎖位置で保持した。
１．３．バッグ１～４に表示を付した。
２．ＩＬ－２及び接続装置で細胞を調整した。
２．１．ＢＳＣ内で、細胞産物バッグに、メスルアーコネクタ付き４インチ血漿移送セットを取り付けた。移送セットのクランプが閉鎖されていることを確認した。
２．２．適切なサイズのシリンジを使用して、最終産物表から判定されたＩＬ－２作用希釈液の容積を調製した。
２．３．LOVO産物に分配した。
２．４．LOVO産物バッグをＣＣ２シングルスパイクラインに滅菌溶接し、スパイクを取り除いた。
２．５．細胞及び装置を移送バッグに入れ、２～８℃で≦１５分間置いた。
３．CS10の追加
３．１．ＢＳＣ内で、冷却CS10バッグのオスルアーに三方活栓を取り付けた。
３．２．活栓のメスルアーに適切なサイズのシリンジを取り付けた。
３．３．バッグのクランプを開放し、「最終製剤産物量（Final Formulated Product Volume）」表で決定されたCS10の量を調製した。
３．４．シリンジを取り外し、赤キャップをした。
３．５．複数のシリンジが必要な場合には繰り返した。
３．６．２～８℃の冷蔵庫から細胞／ＣＣ２装置を取り出し、ＢＳＣに入れた。
３．７．CS10を含む第１のシリンジを活栓の中央のルアーに取り付けた。活栓を回して、CS750バッグへのラインが「OFF（オフ）」の位置になるようにした。
３．８．ゆっくりと穏やかに混合しながら、CS10（１：１、容積：容積）を細胞に加えた。
３．９．CS10の追加のシリンジについても繰り返した。
[00748] 製剤細胞産物のCryobagへの追加
１．各凍結バッグに入れる細胞の量に合わせて、シリンジを適切なサイズのシリンジに交換した。
２．細胞産物を混合した。
３．細胞産物バッグに通じるクランプを開放し、適切な量を引き出した。
４．細胞産物バッグが「OFF（オフ）」の位置になるように活栓を回し、シリンジの内容
物をCryobag＃１に分配した。シリンジからの空気でラインをクリアした。
[00749] 最終産物の量を記録した
１．不要なポート及び適切なサイズのシリンジを使用して、事前に決定した保持量を調製した。
２．「Retain（保持）」と表示を付した５０ｍＬコニカルチューブに保持した。
３．ハーネスに取り付けられたシリンジを使用して、細胞を約１インチまでチューブに吸い上げながらバッグから全ての空気を取り除いた。クランプを閉鎖しヒートシールした。２～８℃に置いた。
４．活栓を回して、Cryobagが「OFF（オフ）」の位置にあるようにした。
５．細胞産物バッグ内の細胞を混合し、活栓上の新しいシリンジを使用して残りのCS７５０バッグに対してステップ３～８を繰り返して、細胞を保持した。
６．産物がＣＲＦに入ったら、処理のために取っておいた。
[00750] 制御速度フリーザー（ＣＲＦ：Controlled-rate Freezer）手順（実施例９も参照のこと）
１．ＣＲＦ（CryoMed Controlled Rate Freezer、Model 7454）及び関連するラップトッ
プコンピューターの電源を入れた。
２．アカウントとパスワードを使用してコンピュータにログオンした。
３．デスクトップにある制御速度フリーザーアイコンを開いた。
４．主画面（Main Screen）で実施（Run）ボタンをクリックした。
５．プロファイルを開く（Open Profile）をクリックし、開く（Open）をクリックした。６．実施ファイル名（Entered the Run File Name）を入力し、続けて、runMMDDYYYYの形式で日付を入力した。
７．MMDDYYYのようにダッシュなしで日付としてデータタグ（Data Tag）を入力した。
８．ＣＲＦの扉を閉じた。
９．実施の開始（Start Run）をクリックした。
１０．プルダウンメニューで「COM 6」を選択した。
１１．OKをクリックした。約３０秒待った。
１２．「プロファイルをダウンロードする（Profile Download）」がポップアップしたら、「OK」をクリックした。保存（Save）をクリックした。（制御速度の凍結プロファイルの詳細については、実施例９を参照のこと。）
１３．試料がＣＲＦに入るまで、緑色のボタンを押すのを待った。冷凍庫は、それらを追加する準備ができるまで４℃で保持された。
１４．ＣＲＦに試料を加えた。
１５．ＣＲＦが４℃に戻るまで待った。温度が達したら、緑色の続行ボタンをクリックした。これにより、プログラム内の以下のステップに進むプログラムが開始された。
１６．容器の完全性、ポートの完全性、シールの完全性、細胞集塊の存在、及び粒子の存在について、Cryobagの目視検査を実施した（注：過剰又は不足検査は実施しなかった）
。
１７．承認済みの掛札表示を各バッグに付した。
１８．検証済みの最終産物表示：ロット番号、産物名、製造日、産物量、その他の添加物、保管温度、有効期限。
１９．各々のCryobag（掛札付き）をオーバーバッグに入れた。
２０．ヒートシールした。
２１．冷温カセットに入れた。
２２．バッグ毎に繰り返した。
２３．表示を付したCryobagを予め調整したカセットに入れ、ＣＲＦに移した。
２４．カセットをＣＲＦの棚に均等に並べた。
２５．リボン熱電対を中央カセットに使用するか、ダミーバッグを中央位置に置いた。
２６．ＣＲＦの扉を閉じた。
２７．チャンバ温度が４℃＋／－１．５℃に達したら、ＰＣインターフェースソフトウェアの実施（Run）を押した。
２８．産物をＣＲＦに移した時間及びチャンバ温度を記録した。
[00751] 品質管理試料の処理
１．必要に応じて、以下の材料を無菌的にＢＳＣに移し、以下の表に従って表示を付した。
２．以下のピペットに新しいピペットを使用した。
ＱＣ及び保持表
３．ＱＣに配送：１－細胞カウントチューブ、１－エンドトキシンチューブ、１－マイコプラズマチューブ、１－グラム染色チューブ、１チューブ再刺激チューブ、及び１－迅速な試験のためのＱＣへのフローチューブ。残りの複製チューブを制御速度フリーザーに入れた。
４．ＱＣ監督者に連絡し、必要な試験を通知した。
５．試験及び保管の手順については、表１８を参照のこと。
[00752] 細胞カウント
[00753] 各試料及び記録データに対し１度の細胞カウントを実施し、バッチ記録に生
データのカウントを添付した。Cellometerカウントプログラムを文書化した。正しい希釈がCellometerに入力されたことを確認した。
[00754] 製剤後の保持細胞の凍結保存：
１．バイアルをＣＲＦに入れた。
２．凍結完了後に貯蔵場所に移し、ＣＦＲに入れた日時を記録した。ＬＮ２に移した日時を記録した。
[00755] 微生物検査
１．微生物学研究室へ沈降プレートの試験指示をした。
２．受託番号を記録した。
３．好気的及び嫌気的無菌性の試験の指示をした。
４．プレート及びボトルの微生物学研究室への配送を確実にした。
[00756] 細胞産物バッグの凍結保存後
１．実施完了後にフリーザーを停止した。停止（Stop）ボタンをクリックするか、フリーザーキーパッドの戻る（Back）キーを押すと、実施を停止できた。
２．カセットからCryobagを取り外した。
３．カセットを気相ＬＮ２に移した。
４．貯蔵場所を記録した。
５．テキスト入力ウィンドウが再び開いたときに追加のコメントを入力した。このウィンドウは、実施（Run）停止方法に関係なく表示された。
６．プロファイルレポートを印刷し、実施した産物のロット番号の表示を付したバッチ記録に添付した。
７．温モード（Warm Mode）を終了し、終了（Exit）ボタンで実施（Run）画面を閉じた。実施例９：凍結保存プロセス
[00757] この実施例では、CryoMed Controlled Rate Freezer、Model 7454（Thermo Scientific）を使用して、上記の実施例８で説明した短縮閉鎖手順で調製したＴＩＬの凍
結保存プロセス方法について説明する。
[00758] 使用した機器は、実施例９で説明したものに加え、アルミニウム製カセット
ホルダーラック（CS750冷凍バッグと互換性あり）、７５０ｍＬバッグ用の低温保存カセ
ット、低圧（２２ｐｓｉ）液体窒素タンク、冷蔵庫、熱電対センサー（バッグ用のリボンタイプ）、及びCryoStore CS750凍結バッグ（OriGenScientific）である。
[00759] 凍結プロセスは、核形成から－２０℃まで０．５℃の速度及び最終温度－８
０℃まで１分間に１℃の冷却速度を提供する。プログラムパラメータ、 ステップ１ー４
℃で待機；ステップ２：１．０℃／分（試料温度）から－４℃；ステップ３：２０．０℃／分（チャンバ温度）から－４５℃；ステップ４：１０．０℃／分（チャンバ温度）から－１０．０℃；ステップ５：０．５℃／分（チャンバ温度）から－２０℃；及びステップ６：１．０℃／分（試料温度）－８０℃まで、である。
[00760] この実施例の手順を、実施例１～８のプロセスと組み合わせて図１１に示す
。
実施例１０：プロセス２ＡのＴＩＬの特徴付け
この実施例では、上記の短縮閉鎖手順で作製されたＴＩＬの特性付について説明する。要約すると、短縮閉鎖手順（プロセス２Ａ、実施例１～９に記載）は、表１９に示した従来のＴＩＬ製造プロセスよりも優れていた。プレＲＥＰの利点には、フラスコ毎の腫瘍断片の増加、培養時間の短縮、ステップ数の削減、及び／又は閉鎖系に適していることが含まれ得る。プレＲＥＰからＲＥＰへの移行の利点には、プレＲＥＰからＲＥＰへのプロセスの短縮、ステップ数の削減、表現型の選択の排除、及び／又は閉鎖系に適していることが含まれ得る。ＲＥＰの利点には、ステップ数の削減、ＲＥＰ期間の短縮、フラスコ間のＴＩＬの閉鎖系移送、及び／又は閉鎖系培地交換が含まれ得る。Harvest（回収）の利点に
は、ステップ数の削減、自動細胞洗浄、閉鎖系、及び洗浄中の産物損失の減少が含まれ得る。最終製剤及び／又は産物の利点には、出荷の柔軟性が含まれ得る。
[00761] 表２０に記載されている９つの腫瘍に由来するＴＩＬを使用して、合計９つ
の実験を実施した。ここに示されている全てのデータは、プロセス１Ｃ及びプロセス２Ａの実施形態からの解凍された凍結ＴＩＬ産物から測定された。
[00762] プロセス２Ａついてここで説明した手順を使用して、この実施例の特性評価
用ＴＩＬを作製した。簡潔に言えば、ＲＥＰの場合、１１日目に、３０００ＩＵ／ｍｌのｒｈｉＬ－２、３０ｎｇ／ｍＬ抗ＣＤ３（クローンＯＫＴ３）及び５×１０９照射同種異系フィーダーＰＢＭＣ細胞を添加した５ＬのＣＭ２を含む１つのG-REX -500Mフラスコが
調製された。減容後のプレＲＥＰG-REX -100Mフラスコから回収したＴＩＬをカウントし
、５×１０６及び２００×１０６個の細胞の範囲の密度でG-REX -500Mフラスコに播種し
た。次に、フラスコを５日間、加湿した３７℃、５％ＣＯ２の組織培養インキュベーターに入れた。１６日目に、G-REX -500Mフラスコの容量を減らし、ＴＩＬをカウントし、そ
の生存率を判定した。この時点で、ＴＩＬは複数のG-REX -500Mフラスコ（最大６つのフ
ラスコ）に拡大培養され、それぞれ１×１０９個のＴＩＬ／フラスコの播種密度を有した。その後、全てのフラスコを加湿した３７℃、５％ＣＯ２の組織培養インキュベーターに更に６日間入れた。２２日目、回収の日に、各フラスコの容積を９０％減らし、細胞をプールし、１７０μｍの血液フィルターでろ過し、３ＬのOrigin EV3000バッグ又は同等品
に収集し、LOVOを使用して自動洗浄の準備をした。ＴＩＬは、細胞培養培地の９９．９９％を、１％ＨＳＡを添加したPlasmaLyte-Aからなる洗浄バッファーで置き換えたLOVO自動細胞処理系を使用して洗浄した。LOVOは、ＴＩＬの９２％以上を回収しながら、血清、成長因子、及びサイトカイン、並びにその他の破片及び微粒子を含む残留組織培養成分を事実上排除する回転ろ過膜技術を使用して動作する。洗浄完了後、細胞数を測定して、ＴＩＬの拡大率及び回収時の生存率を判定した。プロセス２Ａの最終産物を達成するために、CS10を洗浄したＴＩＬに１：１の容積：容積比で加えた。最終製剤産物を凍結保存バッグに分注し、密封し、予め冷却したアルミニウムカセットに入れた。次に、実施例９を含む本明細書に記載の手順に従って、ＴＩＬを含む凍結保存バッグをCryoMed Controlled Rate Freezer（ThermoFisher Scientific、Waltham, MA）を使用して凍結した。
[00763] ９回の実施における細胞数及び生存率を図１２及び１３で比較した。
[00764] 以下の結果に示す細胞表面マーカーは、適切な市販試薬を使用して、フロー
サイトメトリー（Canto II flow cytometer, Becton, Dickinson, and Co., Franklin Lakes, NJ, USA）を使用して分析した。目的のマーカーの結果を図１４から図２３に示す。
[00765] ゲノムＤＮＡ及び細胞学的調製物中のテロメア長を測定するために、様々な
方法が使用されてきた。テロメア制限フラグメント（ＴＲＦ）分析は、テロメア長を測定するための究極の判断基準である（de Lange et al., 1990）。ただし、ＴＲＦの主な制
限は、大量のＤＮＡ（１．５μｇ）を必要とすることである。ここでは、テロメア長の測定に広く使用されている２つの手法、即ち、蛍光ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ：Fluorescence in situ Hybridization）及び定量的ＰＣＲが適用された。
[00766] フローＦＩＳＨは、Dakoキット（フローサイトメトリー用K532711-8 RUO Code K5327 Telomere PNA Kit/FITC、PNA FISH Kit/FITC。フロー、２０回の試験）及び製造元の指示に従って、テロメアの反復の平均長を測定した。簡潔に言えば、細胞の表面を４℃で２０分間ＣＤ３のＡＰＣで染色し、続いて２０分間GAM Alexa 546で染色した。次に
、抗原抗体複合体を２ｍＭのＢＳ３（Fisher Scientific）化学架橋剤で架橋した。長テ
ロメアを有するＴ細胞の標準集団であるＰＮＡ－テロメアプローブ結合、Jurkat 1301 Ｔ白血病細胞株（１３０１の細胞）は、各アッセイで内部参照標準として使用された。抗体のインキュベーション後に個々のＴＩＬをカウントし、１：１の細胞比で１３０１の細胞（ＡＴＣＣ）と混合した。５×１０５のＴＩＬを５×１０５の１３０１細胞と混合した。ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーションは、ハイブリダイゼーション溶液（７０％ホルムアミド、１％ＢＳＡ、２０ｍＭのTris、ｐＨ７．０）で、ＦＩＴＣ結合テロメアＰＮＡプローブ（Panagene）が在るものと無いもので複製され、ＦＩＴＣ－００－ＣＣＣ－ＴＡＡ－ＣＣＣ－ＴＡＡ－ＣＣＣ－ＴＡＡ、最終濃度６０ｎＭのテロメア反復配列を補足して実施された。テロメアＰＮＡプローブの追加後、細胞を振動水浴中８１℃で１０分間インキュベートした。次に、細胞を室温で一晩暗所に置いた。翌朝、４０℃に予熱したＰＢＳで２回洗浄することにより、過剰なテロメアプローブを除去した。洗浄後、ＤＡＰＩ（Invitrogen、Carlsbad, CA）を最終濃度７５ｎｇ／ｍＬで加えた。ＤＡＰＩによるＤＮＡ染色を使用して、Ｇ０／Ｇ１集団の細胞をゲーティングした。試料分析は、当社のフローサイトメーター（BD Canto II、Mountain View, CA）を使用して実施した。試験試料のテロメア蛍光は、以下の式に従って１３０１の細胞の蛍光（ｆｌ）の割合として表された。相対テロメア長＝［（平均ＦＩＴＣ ｆｌ試験細胞ｗ／プローブ平均ＦＩＴＣ ｆｌ試験細胞ｗ／ｏプローブ）×ＤＮＡ指標１３０１細胞×１００］／［（平均ＦＩＴＣ ｆｌ １３０１細胞ｗ／プローブ－平均ＦＩＴＣ ｆｌ １３０１細胞ｗ／ｏプローブ）×ＤＮＡ指標試験細胞。
[00767] リアルタイムｑＰＣＲは、相対テロメア長の測定にも使用された（Nucleic A
cids Res.2002 May 15; 30(10): e47., 20, Leukemia, 2013, 27, 897-906）。簡潔に言
えば、９６ウェル形式のBioRad PCRサーマルサイクラー（Hercules、CA）を使用して、テロメアの反復複製数と単一遺伝子複製数（Ｔ／Ｓ）の比率を決定した。１０ｎｇのゲノムＤＮＡがテロメア又はヘモグロビン（ｈｇｂ）ＰＣＲ反応に使用され、使用されたプライマーは以下のとおりであった。ＴｅＬ－１ｂプライマー（ＣＧＧ ＴＴＴ ＧＴＴ ＴＧＧ ＧＴＴ ＴＧＧ ＧＴＴ ＴＧＧ ＧＴＴ ＴＧＧ ＧＴＴ ＴＧＧ ＧＴＴ）、ＴｅＬ－２ｂプライマー（ＧＧＣ ＴＴＧ ＣＣＴ ＴＡＣ ＣＣＴ ＴＡＣ ＣＣＴ ＴＡＣ ＣＣＴ ＴＡＣ ＣＣＴ ＴＡＣ ＣＣＴ）、ｈｇｂ１プライマー（ＧＣＴＴＣＴＧＡＣＡＣＡＡＣＴＧＴＧＴＴＣＡＣＴＡＧＣ）、及びｈｇｂ２プライマー（ＣＡＣＣＡＡＣＴＴＣＡＴＣＣＡＣＧＴＴＣＡＣＣ）。全試料は、テロメア反応とヘモグロビン反応の両方によって分析され、分析は同じプレート上で３回実施された。試験試料に加えて、各９６ウェルプレートには、１３０１細胞株から分離されたゲノムＤＮＡを使用した０．０８ｎｇから２５０ｎｇの５点標準曲線が含まれていた。各試料のＴ／Ｓ比（－ｄＣｔ）は、テロメアＣｔ値の中央値からヘモグロビン閾値サイクル（Ｃｔ）の値を差し引くことによって計算された。相対Ｔ／Ｓ比（－ｄｄＣｔ）は、未知の各試料のＴ／Ｓ比から１０．０ｎｇの標準曲線点のＴ／Ｓ比を差し引くことで決定した。
[00768] フローＦＩＳＨの結果は図２４及び２５に示されているが、プロセス１Ｃ及
びプロセス２Ａの間に有意な差は観察されず、プロセス２Ａによって産生されたＴＩＬの驚くべき特性はＴＩＬのみの年齢からは予測できないことが示唆された。
[00769] 結論として、プロセス２Ａは、高レベルの共刺激分子、低レベルの消耗マー
カー、及び再活性化時にサイトカインを分泌する能力の増加によって定義される「若い」表現型を持つ強力なＴＩＬ産物を産生した。短縮された２２日間の拡大培養プラットフォームにより、治療が緊急に必要な患者のために、ＴＩＬの臨床規模の用量を迅速に生成できる。凍結保存された製剤産物は、重要な物流効率をもたらし、急速な製造と流通の柔軟性を可能にする。この拡大培養方法は、ＴＩＬ療法のより広範な適用に対する従来の障壁を克服する。
実施例１１：ＩＬ－２、ＩＬ－１５、及びＩＬ－２１サイトカインカクテルの使用
[00770] この実施例では、追加のＴ細胞成長因子として機能するＩＬ－２、ＩＬ－１
５、及びＩＬ－２１サイトカインの使用を、実施例１～１０のＴＩＬプロセスと組み合わせて説明する。
[00771] 実施例１～１０のプロセスを使用して、実験の片腕で、ＩＬ－２の存在下で
、結腸直腸、黒色腫、子宮頸、三種陰性乳房、肺及び腎臓の腫瘍から、もう一方で、培養の開始時にＩＬ－２の代わりにＩＬ－２、ＩＬ－１５、及びＩＬ－２１の組み合わせで、ＴＩＬを成長させた。プレＲＥＰの完了時に、培養物の拡大率、表現型、機能（ＣＤ１０７ａ＋及びＩＦＮ－γ）及びＴＣＲ Ｖβレパートリーを評価した。ＩＬ－１５及びＩＬ－２１は、本明細書の他の箇所及びGruijl, et al.,に記載されているとおり、ＩＬ－２
１は、ＣＤ２７＋ＣＤ２８＋腫瘍浸潤リンパ球の成長を促進し、細胞傷害能が高く、制御性Ｔ細胞の副次的成長が少ない。Santegoets, S. J., J Transl Med., 2013, 11:37 (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3626797/)。
[00772] 結果は、ＩＬ－２、ＩＬ－１５、及びＩＬ－２１で処理した条件のＣＤ４＋
及びＣＤ８＋細胞の両方で、ＩＬ－２のみの条件と比較して複数の組織でＴＩＬ拡大培養の増強（＞２０％）が観察されたことを示した。ＩＬ－２のみの培養物に比べて、ＩＬ－２、ＩＬ－１５、及びＩＬ－２１で処理した培養物から得られたＴＩＬには、偏ったＴＣＲ Ｖβレパートリーを含むＣＤ８＋集団が主に偏っていた。ＩＦＮ－γ及びＣＤ１０７ａは、ＩＬ－２のみで処理したＴＩＬと比較して、ＩＬ－２、ＩＬ－１５、及びＩＬ－２
１で処理したＴＩＬで上昇した。
実施例１２：第２段階、多施設、黒色腫における３コホート研究
[00773] この第２段階の多施設３コホート研究は、転移性黒色腫患者のプロセス１Ｃ
（本明細書に記載されるとおり）に従って製造されたＴＩＬ療法の安全性及び有効性を評価するよう設計されている。コホート１及び２は、それぞれ最大３０人の患者を登録し、コホート３は最大１０人の患者への第２のＴＩＬ注入用の再処置コホートである。第１の２つのコホートは、２つの異なる製造プロセス（プロセス１Ｃ及びプロセス２Ａの実施形態（それぞれ実施例１～１０で説明））を評価している。コホート１の患者は新鮮な非凍結保存ＴＩＬを受け取り、コホート２の患者は実施例１～１０で説明したプロセスで製造された産物を受け取り、凍結保存製品を産生する。研究設計を図２６に示す。この研究は、転移性黒色腫患者のサブ集団の処置のための自己ＴＩＬの安全性及び有効性を評価する第２段階、多施設、３コホート研究である。主要な選択基準には、測定可能な転移性黒色腫及びＴＩＬ生成のために切除可能な病変が≧１；全身療法の少なくとも１つの前の段階；年齢≧１８歳；０～１のＥＣＯＧパフォーマンスステータス、が含まれる。処置コホートには、非凍結保存ＴＩＬ産物（プロセス１Ｃを使用して調製）、凍結保存ＴＩＬ産物（プロセス２Ａの実施形態を使用して調製）、及び無応答又は初期応答後に進行する患者に対するＴＩＬ産物による再処置が含まれる。主要終了点は安全性であり、副次終了点は有効性であり、客観的奏効率（ＯＲＲ：Objective Response Rate）、完全寛解率（ＣＲＲ
：Complete Remission Rate）、無増悪生存率（ＰＦＳ：Progression Free Survival）、奏効期間（ＤＯＲ：Duration of Response）、及び全生存期間（ＯＳ：Overall Survival）で定義される。
実施例１３：ガンマ線照射末梢単核球の個々のロットの適格性
[00774] 本実施例は、γ線照射した末梢単核球（ＰＢＭＣ、別名ＭＮＣ）の個々のロ
ットが本明細書に記載される例示的方法における同種異系フィーダー細胞としての使用に適格か判定するための新規簡略手順について説明する。
[00775] 各照射ＭＮＣフィーダーロットは個別のドナーから調製した。精製抗ＣＤ３
（クローンＯＫＴ３）抗体及びインターロイキン－２（ＩＬ－２）の存在下におけるＲＥＰでＴＩＬを拡大培養するその能力に関して各ロット又はドナーを個別にスクリーニングした。加えて、フィーダー細胞の各ロットを、ＴＩＬを加えずに試験して、受けたガンマ線線量がそれらを複製不能にするのに十分であったことを確認した。
定義／略称
ＢＳＣ－生物学的安全キャビネット
ＣＤ３－分化クラスター３；表面マーカータンパク質Ｔリンパ球
ＣＦ－遠心力
ＣＭ２－ＴＩＬ＃用の完全培地
ＣＭＯ－医薬品製造受託機関
ＣＯ２－二酸化炭素
ＥｔＯＨ－エチルアルコール
ＧＭＰ－医薬品の製造管理及び品質管理に関する基準
ＩＬ－２－インターロイキン２
ＩＵ－国際単位
ＬＮ２－液体窒素
ミニＲＥＰ－ミニ迅速拡大培養プロトコル
ｍＬ－ミリリットル
ＭＮＣ－単核球
ＮＡ－該当なし
ＯＫＴ３－MACS GMP CD3純粋（クローンＯＫＴ３）抗体
ＰＰＥ－個人用防護装備
プレＲＥＰ－迅速拡大培養プロトコル前
ＱＳ－適量；この量まで充填
ＲＥＰ－迅速拡大培養プロトコル
ＴＩＬ－腫瘍浸潤リンパ球
Ｔ２５－２５ｃｍ２組織培養フラスコ
μｇ－マイクログラム
μＬ－マイクロリットル
手順
背景
７．１．１ ＴＩＬのＲＥＰには、γ線照射した増殖が止まったＭＮＣフィーダー細胞が必要であった。ＲＥＰフラスコ内でフィーダーＭＮＣ上の膜受容体が抗ＣＤ３（クローンＯＫＴ３）抗体に結合し、ＴＩＬに架橋することにより、ＴＩＬが拡大するように刺激される。フィーダーロットは、個別のドナーから採取された全血の白血球アフェレーシスから調製した。白血球アフェレーシス産物をFicoll-Hypaqueで遠心に供し、洗浄し、照射し、及びＧＭＰ条件下で凍結保存した。
７．１．２ 移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）を引き起こし得るため、ＴＩＬ療法を受ける患者が生細胞のフィーダー細胞を注入されないことが重要である。従って、フィーダー細胞は、ガンマ線照射を細胞に与え、その結果二本鎖ＤＮＡ切断が生じて再培養時にＭＮＣ細胞が細胞生存能力を失うことにより、増殖が止められる。
判定基準及び実験セットアップ
[00776] フィーダーロットは２つの基準で判定された。１）共培養においてＴＩＬを
＞１００倍に拡大するその能力、及び２）その複製不能性。
７．２．２ 直立Ｔ２５組織培養フラスコ内で成長させた２つの初代プレＲＥＰ ＴＩＬ株を利用するミニＲＥＰフォーマットでフィーダーロットを試験した。
７．２．３ 各ＴＩＬ株がＲＥＰにおいて活性化に応答して増殖するその能力はユニークであるため、フィーダーロットは２つの異なるＴＩＬ株に対して試験した。
７．２．４ 対照として、後ろ向き的に７．２．１の基準に適合することが示されている照射ＭＮＣフィーダー細胞の１ロットを、実験ロットと並行して実施した。
７．２．５ 単一の実験で試験した全てのロットが等価な試験を受けることを確実にするため、全ての条件及び全てのフィーダーロットの試験に同じプレＲＥＰ ＴＩＬ株の十分なストックが利用可能であった。
７．２．６ 試験したフィーダー細胞の各ロットにつき、合計６つのＴ２５フラスコがあった：
７．２．６．１ プレＲＥＰ ＴＩＬ株＃１（２フラスコ）
７．２．６．２ プレＲＥＰ ＴＩＬ株＃２（２フラスコ）
７．２．６．３ フィーダー対照（２フラスコ）
注記：ＴＩＬ株＃１及び＃２が入ったフラスコは、フィーダーロットがＴＩＬを拡大させる能力を判定した。フィーダー対照フラスコは、フィーダーロットの複製不能性を判定した。
[00777] 実験プロトコル
７．３．１ ２／３日目、ＴＩＬ株の解凍
７．３．１．１ ＣＭ２培地を調整した。
７．３．１．２ ３７℃の水浴中でＣＭ２を加温した。
７．３．１．３ ３０００ＩＵ／ｍｌ ＩＬ－２を添加した４０ｍｌのＣＭ２を調製した。使用時まで保温する。
７．３．１．４ 使用したＴＩＬ株の名前の表示を付した２つの５０ｍｌコニカルチューブの各々に、ＩＬ－２を含まない２０ｍｌの予め加温したＣＭ２を入れた。
７．３．１．５ ＬＮ２貯蔵庫から２つの指定のプレＲＥＰ ＴＩＬ株を取り出し、バイアルを組織培養室に移した。
７．３．１．６ ＴＩＬ株識別を記録した。
７．３．１．７ 残りの氷が少量になるまでバイアルを３７℃の水浴中の密封されたジッパー式貯蔵用バッグの内部に置くことにより、バイアルを解凍した。
７．３．１．８ 解凍したバイアルは７０％エタノールを噴霧するか、又はそれで拭き取り、バイアルをＢＳＣに移す。
７．３．１．９ 滅菌ホールピペットを使用してバイアルの内容物を直ちに表示を付した調製済み５０ｍｌコニカルチューブ内の２０ｍｌのＣＭ２中に移した。
７．３．１．１０ ＩＬ－２を含まないＣＭ２を使用して４０ｍｌまでＱＳして細胞を洗浄した。
７．３．１．１１ ４００×ＣＦで５分間遠心した。
７．３．１．１２ 上清を吸引し、３０００ＩＵ／ｍｌ ＩＬ－２を添加した５ｍｌの温ＣＭ２に再懸濁した。
７．３．１．１３ 少量のアリコート（２０μｌ）をデュプリケートで取り出し、自動セルカウンターを使用して細胞をカウントした。カウントを記録した。
７．３．１．１４ カウントする一方で、ＴＩＬ細胞が入った５０ｍｌコニカルチューブは、キャップを緩めてガス交換を可能にして、加湿した３７℃、５％ＣＯ２インキュベーターに置いた。
７．３．１．１５ 細胞濃度を決定し、３０００ＩＵ／ｍｌのＩＬ－２を添加したＣＭ２でＴＩＬを１×１０６細胞／ｍｌに希釈した。
７．３．１．１６ 加湿した３７℃インキュベーター内で必要に応じた数のウェルにおいて２４ウェル組織培養プレートのウェル当たり２ｍｌでミニＲＥＰの０日目まで培養した。
７．３．１．１７ 混同及び潜在的な交差汚染を避けるため、異なるＴＩＬ株は別個の２４ウェル組織培養プレートにおいて培養した。
７．３．２ ０日目、ミニＲＥＰを開始する
７．３．２．１ 試験するフィーダーロットの数に十分なＣＭ２培地を調製した（例えば、１回に４つのフィーダーロットを試験するために、８００ｍｌのＣＭ２培地を調製した）。
７．３．２．２ ７．３．２．１で調製したＣＭ２の一部をアリコートに分け、細胞の培養のため、それに３０００ＩＵ／ｍｌ ＩＬ－２を添加する（例えば、１回に４つのフィーダーロットを試験するために、５００ｍｌの３０００ＩＵ／ｍｌ ＩＬ－２含有ＣＭ２培地を調製する）。
７．３．２．３ ＩＬ－２を含まない残りのＣＭ２は、以下に記載するとおり細胞の洗浄に使用される。
７．３．２．４ 各ＴＩＬ株を別々に作業して交差汚染を防ぎながら、ＴＩＬ培養物が入った２４ウェルプレートをインキュベーターから取り出し、ＢＳＣに移した。
７．３．２．５ 滅菌ホールピペット又は１００～１０００μｌピペッター及びチップを使用して、使用するＴＩＬの各ウェルから約１ｍｌの培地を取り出し、２４ウェル組織培養プレートの使用されていないウェルに入れた。これは洗浄ウェルに使用した。
７．３．２．６ 新鮮な滅菌ホールピペット又は１００～１０００μｌピペッター及びチップを使用して、ウェル内で残りの培地をＴＩＬと混合して細胞を再懸濁し、次にＴＩＬ名が表示された５０ｍｌコニカルチューブに細胞懸濁液を移し、容積を記録した。
７．３．２．７ 確保しておいた培地でウェルを洗浄し、その容積を同じ５０ｍｌコニカルチューブに移した。
７．３．２．８ 細胞を４００×ＣＦでスピンして細胞ペレットを収集した。
７．３．２．９ 培地上清を吸引して取り除き、３０００ＩＵ／ｍｌ ＩＬ－２を含有する２～５ｍｌのＣＭ２培地中に細胞ペレットを再懸濁した；使用される容積は、回収されるウェルの数及びペレットのサイズに基づく（容積は＞１．３×１０６細胞／ｍｌの濃度を確保するのに十分であろう）。
７．３．２．１０ 血清用ピペットを使用して、細胞懸濁液を完全に混合し、容積を記録した。
７．３．２．１１ ２００μｌを取り出し、自動セルカウンターを使用して細胞をカウントした。
７．３．２．１２ カウントする一方で、ＴＩＬ細胞が入った５０ｍｌコニカルチューブは、キャップを緩めてガス交換を可能にして、加湿した、５％ＣＯ２、３７℃のインキュベーターに置いた。
７．３．２．１３ カウントを記録した。
７．３．２．１４ ＴＩＬ細胞が入った５０ｍｌコニカルチューブをインキュベーターから取り出し、３０００ＩＵ／ｍｌ ＩＬ－２を添加した温ＣＭ２中にそれらの細胞を１．３×１０６細胞／ｍｌの濃度で再懸濁した。キャップを緩めたまま、５０ｍｌコニカルチューブをインキュベーターに戻した。
７．３．２．１５ 必要に応じて、元の２４ウェルプレートは残りのＴＩＬの再培養用にそのままにしておいた。
７．３．２．１６ 第２のＴＩＬ株についてステップ７．３．２．４～７．３．２．１５を繰り返した。
７．３．２．１７ 実験用のＴ２５フラスコにＴＩＬをプレーティングする直前に、ＴＩＬは以下のステップ７．３．２．３５に従い１．３×１０５細胞／ｍｌの最終濃度に１：１０希釈した。
[00778] MACS GMP CD3純粋（ＯＫＴ３）作業溶液を調製する
７．３．２．１８ ４℃の冷蔵庫からＯＫＴ３のストック溶液（１ｍｇ／ｍｌ）を取り出し、ＢＳＣに置いた。
７．３．２．１９ ミニＲＥＰの培地中には３０ｎｇ／ｍｌ ＯＫＴ３の最終濃度を使用した。
７．３．２．２０ 実験の各Ｔ２５フラスコ内の２０ｍｌにつき６００ｎｇのＯＫＴ３が必要であった；これは各２０ｍｌにつき６０μｌの１０μｇ／ｍｌ溶液、又は各フィーダーロットについて試験する６つ全てのフラスコにつき３６０μｌの相当量であった。
７．３．２．２１ 試験する各フィーダーロットについて、１０μｇ／ｍｌの作業濃度に対して４００μｌの１：１００希釈の１ｍｇ／ｍｌのＯＫＴ３を作成した（例えば、１回に４つのフィーダーロットを試験するために、１６００μｌの１：１００希釈の１ｍｇ／ｍｌのＯＫＴ３： １６μｌの１ｍｇ／ｍｌのＯＫＴ３＋１．５８４ｍｌの３０００ＩＵ
／ｍｌのＩＬ－２含有ＣＭ２培地を作成した）。
[00779] Ｔ２５フラスコを調製する
７．３．２．２２ 各フラスコに、試験したＴＩＬ株の名前、フラスコレプリケート番号、フィーダーロット番号、日付、及び分析者のイニシャルの表示を付した。
７．３．２．２３ フィーダー細胞を調製する前にフラスコにＣＭ２培地を充填した。
７．３．２．２４ フラスコを３７℃の加湿された５％ＣＯ２インキュベーターに置くことにより、残りの構成成分を加えるまでの間、培地を保温した。
７．３．２．２５ フィーダー細胞を調製し終えたら、各フラスコ内のＣＭ２に構成成分を加える。
[00780] MACS GMP CD3純粋（ＯＫＴ３）作業溶液を調製する。
[00781] フィーダー細胞を調製する
７．３．２．２６ 本プロトコルについては、試験したロット当たり最低７８×１０６個のフィーダー細胞が必要であった。ＳＤＢＢによって凍結された各１ｍｌバイアルは、凍結時に１００×１０６個の生細胞を有した。ＬＮ２貯蔵庫からの解凍時に５０％回収率と仮定すると、各ＲＥＰにつき推定１００×１０６個の生細胞を所与として、ロット当たりフィーダー細胞の１ｍｌバイアルを少なくとも２本解凍することが推奨された。或いは、１．８ｍｌバイアルで供給される場合、１本のバイアルのみで十分なフィーダー細胞が提供された。
７．３．２．２７ フィーダー細胞の解凍前に、試験しようとする各フィーダーロットにつき約５０ｍｌのＩＬ－２を含まないＣＭ２を予め加温した。
７．３．２．２８ ＬＮ２貯蔵庫から指定のフィーダーロットバイアルを取り出し、ジッパー式貯蔵用バッグに入れ、氷上に置いた。バイアルを組織培養室に移した。
７．３．２．２９ ３７℃の水浴に浸すことにより、閉じたジッパー式貯蔵用バッグ内でバイアルを解凍した。
７．３．２．３０ ジッパー式バッグからバイアルを取り出し、７０％ＥｔＯＨを噴霧するか又はそれで拭き取り、バイアルをＢＳＣに移した。
７．３．２．３１ ホールピペットを使用して、フィーダーバイアルの内容物を５０ｍｌコニカルチューブ内の３０ｍｌの温ＣＭ２中に直ちに移した。バイアルを少量のＣＭ２で洗浄してバイアル内に残った細胞を全て取り出した。
７．３．２．３２ ４００×ＣＦで５分間遠心した。
７．３．２．３３ 上清を吸引し、４ｍｌ温ＣＭ２＋３０００ＩＵ／ｍｌ ＩＬ－２に再懸濁した。
７．３．２．３４ ２００μｌを取り出し、自動セルカウンターを使用して細胞をカウントした。カウントを記録した。
７．３．２．３４ 細胞を温ＣＭ２＋３０００ＩＵ／ｍｌ ＩＬ－２中に１．３×１０７細胞／ｍｌで再懸濁した。
７．３．２．３４ ＴＩＬ細胞を１．３×１０６細胞／ｍｌ～１．３×１０５細胞／ｍｌに希釈した。交差汚染を防ぐため、各ＴＩＬ株は独立に作業した。
[00782] 共培養をセットアップする
７．３．２．３６ ＴＩＬ細胞を１．３×１０６細胞／ｍｌ～１．３×１０５細胞／ｍｌに希釈した。交差汚染を防ぐため、各ＴＩＬ株は独立に作業した。
７．３．２．３６．１ １５ｍｌコニカルチューブに４．５ｍｌのＣＭ２培地を加えた。７．３．２．３６．２ インキュベーターからＴＩＬ細胞を取り出し、１０ｍｌ血清用ピペットを使用して十分に再懸濁した。
７．３．２．３６．３ １．３×１０６細胞／ｍｌ ＴＩＬ懸濁液から０．５ｍｌの細胞を取り出し、１５ｍｌコニカルチューブ内の４．５ｍｌの培地に加えた。ＴＩＬストックバイアルをインキュベーターに戻した。
７．３．２．３６．４ 十分に混合した。
７．３．２．３６．５ 第２のＴＩＬ株についてステップ７．３．２．３６．１～７．３．２．３６．４を繰り返した。
７．３．２．３６．６ １回に２つ以上のフィーダーロットを試験する場合、各フィーダーロットについてＴＩＬのプレーティング直前にＴＩＬをより低い濃度に希釈した。
７．３．２．３７ 単一のフィーダーロットについての予め加温した培地が入ったフラスコをインキュベーターからＢＳＣに移した。
７．３．２．３８ １ｍｌピペットチップで上下に数回ピペッティングすることによりフィーダー細胞を混合し、１ｍｌ（１．３×１０７細胞）を当該のフィーダーロットの各フラスコに移した。
７．３．２．３９ 各フラスコに６０μｌのＯＫＴ３作業ストック（１０μｇ／ｍｌ）を加えた。
７．３．２．４０ ２つの対照フラスコをインキュベーターに戻した。
７．３．２．４１ １ｍｌ（１．３×１０５）の各ＴＩＬロットを対応する表示のＴ２５フラスコに移した。
７．３．２．４２ フラスコをインキュベーターに戻し、直立でインキュベートした。５日目まで手を加えなかった。
７．３．２．４３ 試験した全てのフィーダーロットについて７．３．２．３６～７．３．２．４２を繰り返した。
[00783] ５日目、培地交換
７．３．３．１ ３０００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２でＣＭ２を調製した。各フラスコに１０ｍｌ必要である。
７．３．３．２ 交差汚染を防ぐため、一度に単一のフィーダーロットのフラスコを取り扱った。インキュベーターからフラスコを取り出してＢＳＣに移し、フラスコの底にある細胞層を乱さないよう注意を払った。
７．３．３．３ 対照フラスコを含む全てのフラスコについて繰り返した。
７．３．３．４ １０ｍｌピペットで、３０００ＩＵ／ｍｌ ＩＬ－２を含む１０ｍｌ温ＣＭ２を各フラスコに移した。
７．３．３．５ フラスコをインキュベーターに戻し、７日目まで直立でインキュベートした。試験した全てのフィーダーロットについて７．３．３．１～７．３．３．６を繰り返した。
[00784] ７日目、回収
７．３．４．１ 交差汚染を防ぐため、一度に単一のフィーダーロットのフラスコを取り扱った。
７．３．４．２ インキュベーターからフラスコを取り出してＢＳＣに移し、フラスコの底にある細胞層を乱さないよう注意を払った。
７．３．４．３ フラスコの底に成長する細胞を乱すことなく、各試験フラスコから１０ｍｌの培地、及び対照フラスコの各々から１５ｍｌの培地を取り出した。
７．３．４．４ １０ｍｌ血清用ピペットを使用して、残りの培地に細胞を再懸濁し、十分に混合して細胞集塊を全て壊した。
７．３．４．５ 各フラスコの容積を記録した。
７．３．４．６ ピペッティングにより細胞懸濁液を完全に混合した後、２００μｌを取り出して細胞をカウントした。
７．３．４．７ 適切な標準実施要領を自動セルカウンター装置と併せて用いてＴＩＬをカウントした。
７．３．４．８ ７日目のカウントを記録した。
７．３．４．９ 試験した全てのフィーダーロットについて７．３．４．１～７．３．４．８を繰り返した。
７．３．４．１０ 表２１（下記）に挙げる基準に従い、フィーダー対照フラスコについて複製不能性を判定し、及びＴＩＬが入ったフラスコについて０日目からの拡大倍数を判定した。
[00785] ７日目、１４日目までのフィーダー対照フラスコの継続
７．３．５．１ ７日目にフィーダー対照フラスコをカウントし終えた後、対照フラスコの各々に、３０００ＩＵ／ｍｌ ＩＬ－２を含有する新鮮ＣＭ２培地１５ｍｌを加えた。７．３．５．２ 対照フラスコをインキュベーターに戻し、１４日目まで直立位置でインキュベートした。
[00786] １４日目、フィーダー対照フラスコの非増殖の延長
７．３．６．１ 交差汚染を防ぐため、一度に単一のフィーダーロットのフラスコを取り扱った。
７．３．６．２ インキュベーターからフラスコを取り出してＢＳＣに移し、フラスコの底にある細胞層を乱さないよう注意を払った。
７．３．６．３ フラスコの底に成長する細胞を乱すことなく、各対照フラスコから約１７ｍｌの培地を取り出した。
７．３．６．４ ５ｍｌ血清用ピペットを使用して、残りの培地に細胞を再懸濁し、十分に混合して細胞集塊を全て壊した。
７．３．６．５ 各フラスコの容積を記録した。
７．３．６．６ ピペッティングにより細胞懸濁液を完全に混合した後、２００μｌを取り出して細胞をカウントした。
７．３．６．７ 適切な標準実施要領を自動セルカウンター装置と併せて用いてＴＩＬをカウントした。
７．３．６．８ カウントを記録した。
７．３．６．９ 試験した全てのフィーダーロットについて７．３．４．１～７．３．４．８を繰り返した。
結果及び適合基準
[00787] 結果
１０．１．１ ガンマ線照射の線量はフィーダー細胞を複製不能にするのに十分であった。全てのロットが判定基準に適合するものと予想され、また、０日目と比較してＲＥＰ培養の７日目に残る生存フィーダー細胞総数の減少も実証された。
１０．１．２ 全てのフィーダーロットが、ＲＥＰ培養の７日目までにＴＩＬ成長の１００倍の拡大という判定基準に適合するものと予想された。
１０．１．３ フィーダー対照フラスコの１４日目のカウントは、７日目に見られた非増殖傾向が続くものと予想された。
[00788] 適合基準
１０．２．１ フィーダー細胞の各ロットについて試験した各レプリケートＴＩＬ株は、以下の適合基準を満たしていた。
１０．２．２ 以下のとおり（以下の表に概説する）、適合は２倍であった。
１０．２．２．１ ３０ｎｇ／ｍｌ ＯＫＴ３抗体及び３０００ＩＵ／ｍｌ ＩＬ－２の存在下で培養したとき放射線量がＭＮＣフィーダー細胞を複製不能にするのに十分であったかどうかを判定した。
１０．２．２．１．１ 複製不能かどうかは、ＲＥＰの７日目及び１４日目に自動細胞カウントによって決定したときの総生細胞数（ＴＶＣ）によって判定した。
１０．２．２．１．２ 適合基準は「成長なし」であったが、これは、ＲＥＰの０日目に培養を開始した初期生細胞数から７日目及び１４日目に総生細胞数が増加しなかったことを意味する。
１０．２．２．２ フィーダー細胞がＴＩＬ拡大培養を支持する能力を判定した。
１０．２．２．２．１ ＲＥＰの０日目の培養開始からＲＥＰの７日目までの生細胞の拡大倍数の点でＴＩＬ成長を測定した。
１０．２．２．２．１ ７日目、自動細胞カウントによって判定したとき、ＴＩＬ培養物は最低でも１００倍の拡大（即ち、ＲＥＰ ０日目に培養を開始した総ＴＩＬ生細胞数の１００倍より多い）を実現した。
１０．２．２．３ ロットが上記の２つの基準に適合しない場合、そのロットは、以下のセクション１０．３に概説するコンティンジェンシープランに従い再試験した。
１０．２．２．４ 不適合ロットの再試験後、当初の判定及びコンティンジェンシーテストの両方で２つの適合基準を満たさなかったＭＮＣフィーダーロットはいずれも除外した。
１０．２．２．５ 適合基準を満たしたが、同じプレＲＥＰ ＴＩＬ株で並行して試験したそれまでの他のフィーダーロットと比べてＴＩＬの拡大培養能力に関して性能が低いと判断されたＭＮＣフィーダーロットはいずれも除外した。
[00789] 適合基準を満たさないＭＮＣフィーダーロットのコンティンジェンシーテス
ト
１０．３．１ ＭＮＣフィーダーロットが上記のセクション１０．２に概説される適合基準のいずれかを満たさなかった場合、その原因として単純な実験者エラーを排除するため以下のステップを行ってロットを再試験する。
１０．３．２ ロットのサテライトの試験バイアルが２つ以上残っている場合、そのロットは再試験した。ロットのサテライトの試験バイアルが１つ残っているか又は残っていなかった場合、上記のセクション１０．２に挙げる適合基準に基づきそのロットは不適合とした。
１０．３．３ 問題のロットを判定した当初の人を含め、２人の訓練された担当者が、両者ともロットを同時に試験した。
１０．３．４ セクション７．２～７．３の繰り返しを行い、問題のロットを再判定した。
１０．３．５ 各自が問題のロット並びに対照ロット（上記のセクション７．２．４に定義されるとおり）を試験した。
１０．３．６ 適格とされるには、コンティンジェンシーテストを行う担当者の両方について、問題のロット及び対照ロットがセクション１０．２の適合基準を達成しなければな
らなかった。
１０．３．７ これらの基準に適合すると、次にはそのロットは、上記のセクション１０．２に概説したとおりのＣＭＯ使用にリリースされた。
実施例１４：ガンマ線照射末梢血単核球の個々のロットの適格性
[00790] 本実施例は、ガンマ線照射末梢血単核球（ＰＢＭＣ）の個々のロットが本明
細書に記載される例示的方法における同種異系フィーダー細胞としての使用に適格か判定するための新規簡略手順について記載する。本例は、臨床用ＴＩＬロットの生産における使用に関する照射ＰＢＭＣ細胞ロットの判定プロトコルを提供する。個別のドナーから各照射ＰＢＭＣロットを調製した。１００を超える適格性判定プロトコルを通して、いずれの場合にも、ＳＤＢＢ（サンディエゴ血液バンク（San Diego Blood Bank））からの照射ＰＢＭＣロットはＲＥＰの７日目にＴＩＬを＞１００倍に拡大することが示された。この改良された適格性判定プロトコルは、受けたガンマ線線量がそれらを複製不能にするのに十分であったことを確認するため更に試験されたＳＤＢＢからの照射ドナーＰＢＭＣロットに適用することが意図された。それが１４日間にわたって複製不能を維持することが実証されると、ドナーＰＢＭＣロットは、臨床用ＴＩＬロットの生産への使用に「適格である」と見なした。
[00791] キーワード及び定義
μｇ－マイクログラム
μｌ－マイクロリットル
AIM-V－市販の細胞培養培地、生物学的安全キャビネット
ＢＳＣ－分化クラスター
ＣＤ－ＴＩＬ用の完全培地＃２
ＣＭ２－３０００ＩＵ／ｍｌ ＩＬ－２を添加したＣＭ２
ＣＭ２ＩＬ２－医薬品製造受託機関
ＣＯ２－二酸化炭素
ＥｔＯＨ－エタノール
ＧＭＰ－医薬品の製造管理及び品質管理に関する基準
Ｇｙ－グレイ
ＩＬ－インターロイキン
ＩＵ－国際単位
ＬＮ２－液体窒素
ＭＩ－ミリリットル
ＮＡ－該当なし
ＯＫＴ３－抗ＣＤ３モノクローナル抗体名
Ｐ２０－２～２０μｌピペッター
Ｐ２００－２０～２００μｌピペッター
ＰＢＭＣ－末梢血単核球
Ｐ１０００－１００～１０００μｌピペッター
ＰＰＥ－個人用防護装備
ＲＥＰ－迅速拡大培養プロトコル
ＳＤＢＢ－サンディエゴ血液バンク（San Diego Blood Bank）
ＴＩＬ－腫瘍浸潤リンパ球
Ｔ２５－２５ｃｍ２組織培養フラスコ
×ｇ－「重力の～倍」－相対遠心力の尺度
[00792] 標本には照射ドナーＰＢＭＣ（ＳＤＢＢ）が含まれる。
手順
背景
７．１．１ ＴＩＬの現行の標準ＲＥＰには、ガンマ線照射した増殖が止まったＰＢＭＣが必要であった。培養下でＰＢＭＣ上の膜受容体が抗ＣＤ３（クローンＯＫＴ３）抗体に結合し、ＴＩＬに架橋することにより、ＴＩＬが拡大するように刺激される。ＰＢＭＣロットは、個別のドナーから採取された全血の白血球アフェレーシスから調製した。白血球アフェレーシス産物をFicoll-Hypaqueで遠心に供し、洗浄し、照射し、及びＧＭＰ条件下で凍結保存した。
移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）を引き起こし得るため、ＴＩＬ療法を受けた患者が生細胞ＰＢＭＣを注入されないことが重要である。従ってドナーＰＢＭＣは、ガンマ線照射を細胞に与え、その結果二本鎖ＤＮＡ切断が生じて再培養時にＰＢＭＣが細胞生存能力を失うことにより、増殖が止められる。
判定基準
７．２．１ 照射ＰＢＭＣロットの判定基準はその複製不能性であった。
実験セットアップ
７．３．１ 直立Ｔ２５組織培養フラスコを使用して、フィーダーロットをＴＩＬと共培養したかのようにミニＲＥＰフォーマットで試験した。
７．３．１．１ 対照ロット：歴史的に７．２．１の基準に適合することが示されている照射ＰＢＭＣの１つのロットを、対照として実験ロットと並行して実行した。
７．３．２ 試験する照射ドナーＰＢＭＣの各ロットについて、デュプリケートのフラスコを実行した。
実験プロトコル
[00793] 本プロトコルにおける全ての組織培養作業は、ＢＳＣにおいて無菌法を用い
て行った。
０日目
７．４．１ 試験しようとするドナーＰＢＭＣの各ロットにつき約９０ｍｌのＣＭ２培地を調製した。ＣＭ２は３７℃の水浴中に保温した。
７．４．２ ６×１０６ＩＵ／ｍｌ ＩＬ－２のアリコートを解凍した。
７．４．３ ＣＭ２培地をＢＳＣに戻し、７０％ＥｔＯＨで拭き取った後、フードに置いた。試験するＰＢＭＣの各ロットについて、約６０ｍｌのＣＭ２を別個の滅菌ボトルに取り出した。解凍した６×１０６ＩＵ／ｍｌストック溶液からのＩＬ－２を３０００ＩＵ／ｍｌの最終濃度でこの培地に加えた。このボトルに「ＣＭ２／ＩＬ２」（又は類似）の表示を付して、それを無添加のＣＭ２と区別した。
７．４．４ 試験しようとするＰＢＭＣの各ロットにつき２つのＴ２５フラスコに表示を付した。表示には最低限、以下が含まれた：
７．４．４．１ ロット番号
７．４．４．２ フラスコ番号（１又は２）
７．４．４．３ 培養開始日（０日目）
ＯＫＴ３を調製する
７．４．５ ４℃の冷蔵庫から抗ＣＤ３（ＯＫＴ３）のストック溶液を取り出し、ＢＳＣに置いた。
７．４．６ ミニＲＥＰの培地中には３０ｎｇ／ｍｌ ＯＫＴ３の最終濃度を使用した。７．４．７ １ｍｇ／ｍｌストック溶液からの抗ＣＤ３（ＯＫＴ３）の１０μｇ／ｍｌ作業溶液を調製した。必要になるまで冷蔵庫に置いた。
７．４．７．１ 試験した各ＰＢＭＣロットにつき、１５０μｌの１：１００希釈の抗ＣＤ３（ＯＫＴ３）ストックを調製する。
例えば、１回に４つのＰＢＭＣロットを試験するために、３０００ＩＵ／ｍｌ ＩＬ－２を添加した５９４μｌのＣＭ２に６μｌの１ｍｇ／ｍｌストック溶液を加えることにより、６００μｌの１０μ／ｍｌ抗ＣＤ３（ＯＫＴ３）を調製する。
フラスコを調製する
７．４．８ 表示を付したＴ２５フラスコに、フラスコ当たり１９ｍｌのＣＭ２／ＩＬ－２を加え、細胞を調製する間、フラスコを加湿した３７℃、５％ＣＯ２のインキュベーターに置いた。
照射ＰＢＭＣを調製する
７．４．９ ロットの潜在的な交差汚染を防ぐため、ドナーＰＢＭＣロット毎に個別に作業した。
７．４．１０ 試験しようとするＰＢＭＣロットのバイアルをＬＮ２貯蔵庫から取り出した。それらのバイアルは解凍時まで－８０℃に置くか、又はドライアイス上に保った。
７．４．１１ 解凍しようとする各ロットにつき３０ｍｌのＣＭ２（ＩＬ－２の添加なし）を５０ｍｌコニカルチューブに入れた。各チューブに解凍しようとするＰＢＭＣの異なるロット番号の表示を付した。使用時まで、チューブのキャップをしっかりと閉めて３７℃の水浴中に置いた。必要に応じて、５０ｍｌコニカルチューブをＢＳＣに戻し、７０％ＥｔＯＨで拭き取った後、フードに置いた。
７．４．１２ 低温貯蔵庫からバイアルＰＢＭＣを取り出し、３７℃の水浴中のフローティングチューブラックに置いて解凍した。解凍は、バイアル内に少量の氷が残るまで進行させた。
７．４．１３ 解凍したバイアルは７０％ＥｔＯＨを噴霧するか又はそれで拭き取り、ＢＳＣに移した。
７．４．１４ 滅菌ホールピペットを使用して、バイアルの内容物を５０ｍｌコニカルチューブ内の３０ｍｌのＣＭ２中に直ちに移した。チューブから約１ｍｌの培地を取り出してバイアルをリンスした；リンス液を５０ｍｌコニカルチューブに戻した。キャップをしっかりと閉め、静かに回して細胞を洗浄した。
７．４．１５ 室温において４００×ｇで５分間遠心した。
７．４．１６ 上清を吸引し、１０００μｌピペットチップを使用して１ｍｌの温ＣＭ２／ＩＬ－２中に細胞ペレットを再懸濁した。或いは、培地を加える前に、キャップを閉めたチューブを空のチューブラックに沿って引きずることにより細胞ペレットを再懸濁した。細胞ペレットの再懸濁後、ＣＭ２／ＩＬ－２培地を使用して容積を４ｍｌにした。容積を記録した。
７．４．１７ 少量のアリコート（例えば１００μｌ）を取り出し、自動セルカウンターを使用して細胞をカウントした。
７．４．１７．１ カウントは、詳細な自動セルカウンターＳＯＰに基づきデュプリケートで実施した。細胞カウントの実施前にＰＢＭＣの希釈を実施する必要がある可能性が最も高かった。推奨される出発希釈は１：１０であったが、これは使用するセルカウンターのタイプに応じて異なっていた。
７．４．１７．２ カウントを記録した。
７．４．１８ ステップ７．４．１５．２のワークシートに従いＣＭ２／ＩＬ－２培地を使用してＰＢＭＣの濃度を１．３×１０７細胞／ｍｌに調整した。静かに回すことによるか、又は血清用ピペットを使用して静かに上下に吸引することにより十分に混合した。
培養フラスコをセットアップする
７．４．１９ ２つの表示を付したＴ２５フラスコを組織培養インキュベーターからＢＳＣに戻した。
７．４．２０ 抗ＣＤ３／ＯＫＴ３の１０μｇ／ｍｌバイアルをＢＳＣに戻した。
７．４．２１ 各フラスコに１ｍｌの１．３×１０７ＰＢＭＣ細胞懸濁液を加えた。
７．４．２２ 各フラスコに６０μｌの１０μｇ／ｍｌ抗ＣＤ３／ＯＫＴ３を加えた。
７．４．２３ キャップを閉めたフラスコを組織培養インキュベーターに戻し、手を加えることなく１４日間成長させた。
７．４．２４ 次のロットに必要になるまで抗ＣＤ３／ＯＫＴ３バイアルを冷蔵庫に入れ戻した。
７．４．２５ 判定しようとするＰＢＭＣのロット毎にステップ７．４．９～７．４．２４を繰り返した。
１４日目、ＰＢＭＣの非増殖性の測定
７．４．２６ ロット毎に独立に作業して、デュプリケートＴ２５フラスコをＢＳＣに慎重に戻した。
７．４．２７ 各フラスコについて、新鮮な１０ｍｌ血清用ピペットを使用してフラスコの各々から約１７ｍｌを取り出し、次に残りの培地を慎重に抜き取って、フラスコ内に残る容積を測定した。容積を記録した。
７．４．２８ 同じ血清用ピペットを使用して上下にピペッティングすることにより試料を十分に混合した。
７．４．２９ カウントのため各フラスコから２００μｌ試料を取り出した。
７．４．３０ 自動セルカウンターを使用して細胞をカウントした。
７．４．３１ 判定しようとするＰＢＭＣのロット毎にステップ７．４．２６～７．４．３１を繰り返した。
結果及び適合基準
結果
１０．１．１ ガンマ線照射の線量はフィーダー細胞を複製不能にするのに十分であると予想された。全てのロットが判定基準に適合するものと予想され、０日目と比較してＲＥＰ培養の１４日目に残る生存フィーダー細胞総数の減少が実証された。
適合基準
１０．２．１ 試験した各照射ドナーＰＢＭＣロットについて、以下の適合基準が満たされた：
１０．２．２ 「成長なし」－１４日目の総生細胞数が、ＲＥＰの０日目に培養を開始した初期生細胞数より少なかったことを意味した。
１０．２．３ ロットが上記の基準に適合しなかった場合、そのロットは、セクション１０．４に概説するコンティンジェンシーテスト手順に従い再試験した。
１０．２．４ 不適合ロットの再試験後、当初の判定及びコンティンジェンシーテストの両方で適合基準を満たさなかったＭＮＣフィーダーロットは、いずれも除外した。
適合基準を満たさないＰＢＭＣロットのコンティンジェンシーテスト
１０．４．１ 照射ドナーＰＢＭＣロットが上記の適合基準を満たさなかった場合、その不適合の原因として単純な実験者エラーを排除するため以下のステップを行ってロットを再試験した。
１０．４．２ ロットのサテライトのバイアルが２つ以上残っていた場合、そのロットは再試験した。ロットのサテライトのバイアルが１つ残っているか又は残っていない場合、上記のセクション１０．２の適合基準に基づきそのロットは不適合とした。
１０．４．３ 可能な場合は常に、２人の訓練された担当者（好ましくは問題のロットを判定した当初の人を含む）が２つの別個のバイアルの試験を独立に行った。これが好ましいコンティンジェンシーテスト方法であった。ＰＢＭＣの別個のバイアルの他に、両方の担当者が同じ試薬を使用することもできた。
１０．４．３．１．２人の担当者が利用可能でない場合、１人が不適合とされたロットについての２つのＰＢＭＣバイアルの試験を、各バイアルを独立に作業して行った。
１０．４．４ セクション７．４「実験プロトコル」の繰り返しを行い、問題のロットを再判定した。
１０．４．５ 問題のロットに加えて、コンティンジェンシーテストの実行者各々が対照ロットを試験した。
１０．４．５．１ ２人の担当者がコンティンジェンシーテストを実施する場合、両方の担当者が対照ロットを独立に試験した。
１０．４．５．２ コンティンジェンシーテストの実施に１人のみが利用可能である場合、対照ロットについて必ずしもデュプリケートで実行する必要はない。
１０．４．５．３ 適格とされるには、コンティンジェンシーテストを受けるＰＢＭＣロットが、セクション１０．２の適合基準への合格に達する対照ロットと問題のロットの両方のレプリケートとの両方を有していた。
１０．４．５．４ この基準を満たしたとき、次にはそのロットをセクション１０．２に概説するとおりのＣＭＯ使用にリリースした。
実施例１５：Cellometer IC2 Image Cytometer自動セルカウンター
[00794] 本例は、Cellometer K2 Image Cytometer自動セルカウンターの操作手順を説明する。
１．定義
μｌ マイクロリットル
ＡＯＰＩ アクリジンオレンジヨウ化プロピジウム（propidium iodine）
ＢＳＣ 生物学的安全キャビネット
ＤＰＢＳ ダルベッコリン酸緩衝生理食塩水
ｍｌ ミリリットル
ＭＮＣ 単核血球
ＮＡ 該当なし
ＰＢＭＣ 末梢血単核球
ＰＰＥ 個人用防護装備
プレＲＥＰ 培養物の迅速拡大培養プロトコル前の初期ＴＩＬ培養
ＲＥＰ 迅速拡大培養プロトコル
ＴＩＬ 腫瘍浸潤リンパ球
７．手順
７．１ 細胞懸濁液調製
７．１．１ トリパンブルー調製
最終トリパンブルー濃度は０．１％であった。製造者は０．２％のストック溶液を調製することを推奨した。
７．１．１．１ Cellometer K2でトリパンブルーを使用するときは、ストック（０．４
％）をＰＢＳで０．２％に希釈した。
７．１．１．２ トリパンブルーは０．２～０．４ミクロンフィルターでろ過し、少量ずつアリコートに分けて、表示を付したキャップ付きのチューブに入れた。
７．１．１．３ 細胞懸濁液を０．２％トリパンブルーと１：１で混合した。
７．１．２ ＡＯＰＩ調製
７．１．２．１ Cellometer K2でＡＯＰＩを使用するときは、ＡＯＰＩ溶液を入手した
。
７．１．２．２ 細胞試料をＡＯＰＩ溶液によって１：１で染色した。
注記：高濃度培養物をカウントする際は、トリパンブルー又はＡＯＰＩとの最終的な１：１希釈の前に細胞試料を細胞培養培地で希釈した。
製造者の推奨するカウント範囲を使用して、使用するのに最良の希釈を決定した。
７．２ Cellometer K2セットアップ
７．２．１ Cellometer K2装置の電源を入れた。
７．２．２ 関連するコンピュータモニタ上でCellometer Image Cytometerアイコンを選択した。
７．２．３ ソフトウェアのメイン画面上で、ドロップダウンボックスのリストにあるアッセイ（Assay）のうちの１つを選択した。
７．２．３．１ 適切なアッセイ（Assay）を選択すると、細胞型（Cell Type）及びイメージモード（Image Mode）が自動で取り込まれた。
７．２．３．２ 「試料（Sample）」セクションで、ユーザ／試料ＩＤを設定する（Set User/Sample ID）をクリックして、標本に作業者の情報を入力する別画面を開いた。
７．２．３．２．１ 「ユーザＩＤ（User ID）」を入力した。これはユーザの３文字の
イニシャルからなる。
７．２．３．２．２ 「試料ＩＤ（Sample ID）」を入力した。試料ＩＤは、受け取った
標本情報に基づく。
７．２．３．３ 希釈パラメータをセットアップした。
７．２．３．３．１ １：１の混合を除いて他の希釈を行わなかった場合、希釈係数は２であった。
７．２．３．３．２ 最終的な１：１混合の前に希釈を行った場合、希釈係数は前の希釈の２倍であった。
７．２．３．３．３ 希釈係数は、画面の希釈セクションにおいて使用した混合物に応じて更新した。鉛筆のアイコンをクリックしてダイアログ画面を立ち上げた。
７．２．３．３．４ Ｆｌ画像（Fl Image）及びＦ２画像（F2 Image）セクションが互いに同じであることを確認した。
７．２．３．３．５ セットアップの完了後に「保存する（Save）」ボタンをクリックした。
７．３細胞カウント
７．３．１ Cellometerカウントチャンバスライド（SD100）の両側からプラスチックの
裏当て材を取り外し、清浄なリントフリーワイプの上に置いた。
７．３．２ 細胞懸濁液の調製後、試料の少量のアリコートを取り出し、マルチウェル細胞培養プレートのウェル又はチューブに移した。
７．３．３ 試料を希釈する場合、希釈は細胞培養培地を使用して実施した。
７．３．４ マルチウェル細胞培養プレートのウェル又はチューブに２０Ｉｌｌの細胞懸濁液を加えた。
７．３．５ ２０ １１１の細胞懸濁液に２０１１１の０．２％トリパンブルー又はＡＯＰＩ溶液を加え、試料を完全に混合した。
７．３．６ ２０ＩＡの１：１溶液を測定し、それをカウントチャンバの片側に移した。注記：スライドの透明な領域には触れなかった。
７．３．７ 必要に応じて、試料をスライドの他方の側で繰り返した。７．３．８．Cellometerの前面にあるスロットにチャンバを挿入した。
７．３．８ ＡＯＰＩ細胞カウントについては、メイン画面上で「プレビュー蛍光（Preview Fl）」をクリックして緑色蛍光像（生細胞）画像をプレビューした。トリパンブルーカウントについては、「プレビュー明視野（Preview Brightfield）」をクリックした。
７．３．９ ピント合わせホイールを使用して画像の焦点を最適にした。細胞は明るい中心及びはっきりと画定された輪郭線を有した。
７．３．１０ 「カウント（Count）」をクリックしてカウントプロセスを開始した。
７．３．１１ コンピュータ画面上のカウント結果のポップアップボックス内に結果が表示され、カウントプロセスの結果を示した。
実施例１６：ＩＬ－２ストック溶液の調製（CellGenix）
[00795] この実施例は、精製され凍結乾燥された組換えヒトインターロイキン－２を
、ｒｈＩＬ－２の使用を含むものを含む本願及び実施例に記載されたものを全て含む更なる組織培養プロトコルでの使用に適したストック試料に溶解するプロセスを説明する。
３．定義／略称
μｌ：マイクロリットル
ＢＳＣ：生物学的安全キャビネット
ＢＳＬ２：バイオセーフティレベル２
Ｄ－ＰＢＳ：ダルベッコリン酸緩衝生理食塩水
Ｇ：ゲージ
ＧＭＰ：医薬品及び医薬部外品の製造管理及び品質管理の基準（Good Manufacturing Processing）
ＨＡｃ：酢酸
ＨＳＡ：ヒト血清アルブミン
ｍＬ：ミリリットル
ＮＡ：該当なし
ＰＰＥ：個人用防護装備
ｒｈＩＬ－２、ＩＬ－２：組換えヒトインターロイキン－２
ＣＯＡ：分析証明書
６．手順
６．１ ０．２％酢酸溶液（ＨＡｃ）を調製する。
６．１．１ ２９ｍＬ滅菌水を５０ｍＬコニカルチューブに移した。
６．１．２ １ｍＬの１Ｎ酢酸を５０ｍＬのコニカルチューブに加えた。
６．１．３ チューブを２～３回反転させることにより十分に混合した。
６．１．４ Steriflipフィルターを使用してろ過することによりＨＡｃ溶液を滅菌した
。
６．１．５ キャップを閉め、日付を付し、溶液に「滅菌０．２％酢酸溶液」の表示を付した。
６．１．６ 溶液は２ヵ月後に期限切れとした。室温で貯蔵した。
６．２ ＰＢＳ中で１％ＨＳＡを調製した。
６．２．１ １５０ｍＬ滅菌フィルタユニット内の９６ｍＬ ＰＢＳに４ｍＬの２５％ＨＳＡストック溶液を加えた。
６．２．２ 溶液をろ過した。
６．２．３ キャップを閉め、日付を付し、溶液に「ＰＢＳ中１％ＨＳＡ」の表示を付した。
６．２．４ 溶液は２ヵ月後に期限切れとした。４℃で貯蔵した。
６．３ 調製したｒｈＩＬ－２の各バイアルについて、書式に記入した。
６．４ ｒｈＩＬ－２ストック溶液（６×１０６ＩＵ／ｍＬ最終濃度）を調製した
６．４．１ ｒｈ１Ｌ－２はロット毎に異なり、製造者の分析証明書（ＣＯＡ）に掲載されている以下のような情報が必要であった：
６．４．１．１ バイアル１本当たりのｒｈＩＬ－２の質量（ｍｇ）
６．４．１．２ ｒｈＩＬ－２の比活性（ＩＵ／ｍｇ）
６．４．１．３ 推奨される０．２％ＨＡｃ再構成容積（ｍＬ）
６．４．２ ｒｈＩＬ－２ロットに必要な１％ＨＳＡの容積は、以下の式を用いて計算した：
６．４．２．１ 例えば、CellGenixのｒｈＩＬ－２ロット１０２００１２１ ＣＯＡに
よれば、１ｍｇバイアルの比活性は２５×１０６ｌＵ／ｍｇである。２ｍＬの０．２％ＨＡｃ中にｒｈＩＬ－２を再構成することが推奨されている。
６．４．３ ＩＬ－２バイアルのゴム栓をアルコールワイプで拭き取った。
６．４．４ ３ｍＬシリンジに取り付けた１６Ｇ針を使用して、推奨容積の０．２％ＨＡｃをバイアルに注入した。針を引き抜くときに栓が外れないよう注意を払った。
６．４．５ バイアルを３回反転させて、粉末が全て溶解するまで回した。
６．４．６ 栓を慎重に取り外し、アルコールワイプ上に置いておいた。
６．４．７ 計算した容積の１％ＨＳＡをバイアルに加えた。
６．４．８ バイアルにゴム栓をした。
６．５ ｒｈＩＬ－２溶液の貯蔵
６．５．１ 短期貯蔵（＜７２時間）の場合、バイアルを４℃で貯蔵した。
６．５．２ 長期貯蔵（＞７２時間）については、バイアルを少量のアリコートに分け、使用直前まで－２０℃でクライオバイアルに貯蔵した。凍結／解凍サイクルを避けた。調製日から６ヵ月後に期限切れとした。
６．５．３ Ｒｈ－ＩＬ－２表示には、販売業者及びカタログ番号、ロット番号、有効期限、作業者イニシャル、アリコートの濃度及び容積が含まれた。
実施例１７：プレＲＥＰ及びＲＥＰプロセス用の培地調製
[00796] 本例は、限定はされないが、転移性黒色腫、頭頸部扁平上皮癌（ＨＮＳＣＣ
）、卵巣癌、トリプルネガティブ乳癌、及び肺腺癌を含めた様々な腫瘍型に由来する腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）の培養が関わるプロトコルに用いられる組織培養培地の調製手順について説明する。本願及び実施例に記載される任意のＴＩＬの調製にこの培地を使用することができる。
３．定義
μｇ マイクログラム
μｍ マイクロメートル
μＭ マイクロモル
AIM-V（登録商標） 無血清組織培養培地（Thermo Fisher Scientific）
ＢＳＣ 生物学的安全キャビネット
ＣＭ１ 完全培地＃１
ＣＭ２ 完全培地＃２
ＣＭ３ 完全培地＃３
ＣＭ４ 完全培地＃４
ＩＵ又はＵ 国際単位
ｍｌ ミリリットル
ｍＭ ミリモル
ＮＡ 該当なし
ＰＰＥ 個人用防護装備
プレＲＥＰ プレ迅速拡大培養プロセス
ＲＥＰ 迅速拡大培養プロセス
ｒｈＩＬ－２、ＩＬ－２ 組換えヒトインターロイキン－２
ＲＰＭＩ１６４０ ロズウェルパーク記念研究所（Roswell Park Memorial Institute）
培地、配合１６４０
ＳＯＰ 標準実施要領
ＴＩＬ 腫瘍浸潤リンパ球
７．手順
７．１ 手順は全て、ＢＳＣ（クラスＩＩ、タイプＡ２）において無菌法を用いて行われる。
７．１．１ 使用前にフードの表面に７０％エタノールを噴霧した。
７．１．２ 物品及び試薬は全て、組織培養フード内に置く前に７０％エタノールを噴霧した。
７．２ ２００ｍＭ Ｌ－グルタミンのアリコート分注
７．２．１ Ｌ－グルタミンは、血清の調製に必要な容積よりも大きい容積で供給された（例えば、１００ｍｌ又は５００ｍｌ容積）。
７．２．２ Ｌ－グルタミンのボトルを３７℃の水浴中で解凍した。
７．２．３ Ｌ－グルタミンは解凍後に沈殿するため、解凍後、Ｌ－グルタミンを十分に混合した。アリコートに分ける前に、沈殿物が全て溶液に戻ったことを確認した。
７．２．４ Ｌ－グルタミンの５～１０ｍｌアリコートを滅菌１５ｍｌコニカルチューブに入れた。
７．２．５ チューブに、濃度、販売業者、ロット番号、アリコート分注日、及び有効期限の表示を付す。
７．２．６ その後、チューブを－２０℃で貯蔵し、必要に応じて培地調製のため抜き取った。
７．３ ＣＭ１の調製
７．３．１ 低温貯蔵庫から以下の試薬を取り出し、３７℃の水浴中で加温した：
７．３．１．１ ＲＰＭＩ１６４０
７．３．１．２ ヒトＡＢ血清
７．３．１．３ ２００ｍＭ Ｌ－グルタミン
７．３．２ ４℃の貯蔵庫からＢＭＥを取り出し、組織培養フードに置いた。
７．３．３ ゲンタマイシンストック溶液を室温貯蔵庫から組織培養フードに入れた。
７．３．４ 以下の表２３に従い、ろ過される容積に適切な０．２μｍフィルタユニットの上部に成分の各々を加えることによりＣＭ１培地を調製した。
７．３．５ ＣＭ１培地ボトルに、その名前、調製者のイニシャル、それがろ過／調製された日付、２週間の有効期限の表示を付し、組織培養に必要になるまで４℃で貯蔵した。必要に応じて培地をアリコートに分け、少容量ボトルに入れることができる。
７．３．６ 残ったＲＰＭＩ１６４０、ヒトＡＢ血清、又はＬ－グルタミンは全て、次回の培地調製まで４℃で貯蔵した。
７．３．７ ＢＭＥのストックボトルは４℃の貯蔵庫に戻した。
７．３．８ ゲンタマイシンのストックボトルはその適切な室温貯蔵場所に戻した。
７．３．９ 培地の緩衝能力は限られているため、ＣＭ１は調製後２週間以内に、又はフェノールレッドｐＨ指示薬がｐＨの極端なシフトを示したこと（明るい赤色乃至ピンクの呈色）に伴い廃棄した。
７．３．１０ 使用当日、所要量のＣＭ１を３７℃の水浴中で予め加温し、６０００ＩＵ／ｍｌ ＩＬ－２を加えた。
７．３．１１ 追加の添加－必要に応じて
７．３．１１．１ ＣＭ１にGlutaMAX（登録商標）を添加した
７．３．１１．１．１ ２ｍＭグルタミン（最終濃度、表２を参照）の代わりに２ｍＭのGlutaMAX（商標）を用いることによりＣＭ１を調製することができた。それが終わると、標準配合のＣＭ１との混同を防ぐため、上記ステップ７．３．５のように、培地ボトルに「２ｍＭ GlutaMAX」を追加して表示を付した。
７．３．１１．２ ＣＭ１に追加の抗生物質／抗真菌薬を添加した
７．３．１１．２．１ 一部のＣＭ１配合物は、ある種の腫瘍型から成長させるプレＲＥＰ ＴＩＬの汚染を防ぐため、追加の抗生物質又は抗真菌薬が必要であった。
７．３．１１．２．２ 以下の表２４に示す最終濃度となるように抗生物質／抗真菌薬を加えた。
７．３．１１．２．３ それが終わると、標準配合のＣＭ１との混同を防ぐため、上記ステップ７．３．１のように、追加の抗生物質／抗真菌薬の名前を追加して培地ボトルに表示を付した。
７．４ ＣＭ２の調製
７．４．１ 冷蔵庫から調製済みのＣＭ１を取り出した、又は上記セクション７．３に従い新鮮なＣＭ１を調製する。
７．４．２ 冷蔵庫からAIM-V（登録商標）を取り出した。
７．４．３ 滅菌培地ボトル内に調製済みＣＭ１を等容積のAIM-V（登録商標）と混合す
ることにより、必要な量のＣＭ２を調製した。
７．４．４ 使用当日、ＣＭ２培地に３０００ＩＵ／ｍｌ ＩＬ－２を加えた。
７．４．５ 使用当日、十分な量の３０００ＩＵ／ｍｌ ＩＬ－２含有ＣＭ２を作成した。
７．４．６ ＣＭ２培地ボトルに、その名前、調製者のイニシャル、それがろ過／調製された日付、２週間の有効期限の表示を付し、組織培養に必要になるまで４℃で貯蔵した。必要に応じて培地をアリコートに分け、より小さい容量のボトルに入れた。
７．４．７ ＩＬ－２を含まないＣＭ２は全て冷蔵庫に戻し、そこで最長２週間にわたり、又はフェノールレッドｐＨ指示薬がｐＨの極端なシフト（明るい赤色乃至ピンクの呈色）を示すまで貯蔵することができる。
７．５ ＣＭ３の調製
７．５．１ 使用が必要になった当日に、ＣＭ３を調製した。
７．５．２ ＣＭ３はAIM-V（登録商標）培地と同じであり、使用当日に３０００ＩＵ／
ｍｌ ＩＬ－２を添加した。
７．５．３ AIM-Vのボトル又はバッグにＩＬ－２ストック溶液を直接加えることにより
、実験の必要上十分な量のＣＭ３を調製した。軽く振盪することにより十分に混合した。AIM-Vに加えた後すぐに、ボトルに「３０００ＩＵ／ｍｌ ＩＬ－２」の表示を付す。過
剰なＣＭ３がある場合、これを培地名、調製者のイニシャル、培地の調製日、及びその有効期限（調製後７日）を表示したボトルに４℃で貯蔵した。
７．５．４ ＩＬ－２を添加した培地は４℃で７日間の貯蔵後に廃棄した。
７．６ ＣＭ４の調製
７．６．１ ＣＭ４はＣＭ３と同じであり、加えて２ｍＭのGlutaMAX（商標）（最終濃度）を添加した。
７．６．１．１ １ＬのＣＭ３につき１０ｍｌの２００ｍＭ GlutaMAX（商標）を加えた。
７．６．２ AIM-Vのボトル又はバッグにＩＬ－２ストック溶液及びGlutaMAX（商標）ス
トック溶液を直接加えることにより、実験の必要上十分な量のＣＭ４を調製した。軽く振盪することにより十分に混合した。
７．６．３ AIM-Vに加えた後すぐに、ボトルに「３０００ＩＬ／ｎｉｌ ＩＬ－２及びGlutaMAX」の表示を付した。
７．６．４ 過剰なＣＭ４がある場合、これを培地名、「GlutaMAX」、調製者のイニシャ
ル、培地の調製日、及びその有効期限（調製後７日）を表示したボトルに４℃で貯蔵した。
７．６．５ ＩＬ－２を添加した培地は４℃で７日間の貯蔵後に廃棄した。
実施例１８：ポストＲＥＰ ＴＩＬの表面抗原染色
１．目的
[00797] この実施例は、フローサイトメトリーによるポストＲＥＰ ＴＩＬの細胞表
面染色の手順を説明する。この手順は、本願及び実施例で説明されている任意のＴＩＬに適用され得る。
[00798] キーワード及び定義
α：アルファ
β：ベータ
μｌ：マイクロリットル
ＡＰＣ：アロフィコシアニン
Ａｘ６４７：Alex Fluor 647
ＢＤ：Becton Dickinson Company
ＢＳＡ：ウシ血清アルブミン
ＢＳＣ：生物学的安全キャビネット
ＢＶ４２１:Brilliant Violet 421
ＣＤ：分化クラスター
ＣＳＴ：サイトメーターのセットアップ及び追跡
Ｃｙ：シアニン
ＤＰＢＳ：ダルベッコリン酸緩衝生理食塩水
ＦＡＣＳ：蛍光活性化細胞ソーター
ＦＢＳ：胎児ウシ血清
ＦＩＴＣ：フルオレセインイソチオシアネート（Fluorescein Isothiocyanate）
ＦＭＯ：蛍光マイナス１
Ｇ：グラム
Ｈ７：Ｃｙ７の類似物
Ｍｌ：ミリリットル
ＰＥ：フィコエリトリン
ＰｅｒＣＰ－Ｃｙ５．５：ペリジニン・クロロフィル・タンパク質
ＰＰＥ：個人用防護装備
ＲＥＰ：迅速拡大培養プロトコル
ＳＩＴ：試料注入チューブ
ＴＣＲ：Ｔ細胞受容体
ｗ／ｖ：容積に対する重量
フローサイトメトリー抗体及び染色
７．手順
７．１ 試薬調製
７．１．１ ＦＡＣＳ洗浄バッファー
７．１．１．１ ２％（ｗ／ｖ）熱不活性化ＦＢＳをＤＰＢＳに加えた（１０ｍｌのＦＢＳを４９０ｍＬの１×ｄＰＢＳに追加）。
７．１．１．２ ０．１％（ｗ／ｖ）ＮａＮ３（５００ｍＬボトルに７６．９ｕｌ）を加えた。
７．１．１．３ 溶液は４０℃で貯蔵された。３０日後に破棄した。
７．１．２ Aqua色素
７．１．２．１ 反応性色素のバイアルに５０μｌのＤＭＳＯを加えた。
７．１．２．２ よく混合し、色素が全て溶解したことを視覚的に確認した。
７．１．２．３ 手順に使用しなかった色素を等分し、次の使用まで２０℃で凍結した。二度目の凍結／解凍はしなかった。
７．１．３ 抗体カクテルの調製。
７．１．３．１ カクテルは、Eppendorfチューブなどのポリプロピレン製チューブで構
成されていた。
７．１．３．２ カクテルは最大６ヶ月貯蔵された。
７．２ フローサイトメトリーアッセイ要件
７．２．１ フローサイトメーターキャリブレーション
７．２．１．１ フローサイトメーターは、製造業者の指示に従ってＣＳＴビーズを使用して、アッセイの日に較正された。
７．２．１．２ 作業者は、フローサイトメーターが較正に合格したことを確認した。較正は、パフォーマンス及びベースラインのチェックが有効である。
７．２．２ コンペンセーション／ＦＭＯコントロール
７．２．２．１ ＢＤコンペンセーションビーズ及びArCTM Amine Reactive Compensation Bead Kitを使用して、単色コンペンセーション試料を調製した。
７．２．２．２ ＦＭＯコントロール、試料を含む細胞は、以下の単一抗体コンジュゲート、ＣＤ２７、ＣＤ２８、及びＣＤ５７を差し引いた抗体のカクテルで染色された。
７．２．３ ＭＦＩ標準化
７．２．３．１ サイトメーターの電圧は、ビーズコントロール及び目標電圧値で毎日判定された。
７．３ 試料染色
７．３．１ 試料ＩＤ－ＤＦ１、試料ＩＤ－ＤＦ２、試料ＩＤ－Ｔ１、試料ＩＤ－Ｔ２の表示をＦＡＣＳチューブに付した。
７．３．２ １組のＦＭＯコントロールにＣＤ２７－ＡＰＣ－Ｈ７、ＣＤ２８－ＰＥ、ＣＤ５７－ＰｅｒＣＰＣｙ５．５、ＣＤ４５ＲＡ－ＰＥＣｙ７、ＣＣＲ７－ＰＥ、ＣＤ３８－ＡＰＣ、ＣＤ１３７－ＰＥ７、Ｌａｇ３－ＰＥ、ＰＤ１ ＡＰＣ、Ｔｉｍ３－ＢＶ４２１、ＣＤ６９－ＰＥ７、ＴＩＧＩＴ－ＰＥ、ＫＬＲＧ１－Ａｘ６４７、及びＣＤ１５４－ＢＶ４２１の表示を付した。
７．３．３ 各チューブに５０万～２００万個の細胞を加えた。
７．３．４ 各チューブに３ｍＬの１×ＰＢＳをＱＳした。
７．３．５ チューブを４００×ｇ、高加速及び減速で５分間回転させた。
７．３．６ 試料が遠心分離されている間に、Aqua色素の表示を付して死細胞を調製した。
７．３．７ 冷凍庫からAquaアリコートを取り出し、ＰＢＳ中で１／２００に希釈した。暗所に置いた。２ｕＬの色素を１９８ｕＬのＤＰＢＳに加えた。
７．３．８ ステップ７．３．５の上清を静かに移す又は吸引した。
７．３．９ 上記の２５ｕＬのAqua溶液を試料及びＦＭＯコントロールに加えた。
７．３．１０ 暗所で、室温（ＲＴ：Room Temperature）で１５分間インキュベートした。
７．３．１１ 注記：細胞を無タンパク質培地で初めに貯蔵した場合、５ｕＬのTruStainなどのブロッキングステップを室温で１０分間追加する必要があった。
７．３．１２ ５０ｕＬの抗体カクテルを適切なチューブに加えた。
７．３．１３ チューブラックを振って混合した。
７．３．１４ 暗所で、ＲＴで１５分間インキュベートした。
７．３．１５ 開始時間と終了時間を記録した。３ｍＬのＦＡＣＳ洗浄バッファーを加えた。
７．３．１６ チューブを４００×ｇ、高加速及び減速で５分間回転させた。
７．３．１７ 遠心回転が完了したら、上清を静かに移す又は吸引した。
７．３．１８ 空のラックに沿ってチューブをスライドさせて、細胞を再懸濁した。
７．３．１９ 各チューブに１００ｕＬの１％のParaFormaldehydeを加えた。
７．３．２０ フローサイトメーターで収集する準備ができるまで、暗所で、４０℃で貯蔵した。
注記：試料は最大７２時間貯蔵できた。
７．４ Ｌ／Ｄ Aquaコンペンセーションコントロール 。
７．４．１ ＦＡＣＳチューブにＬ／Ｄ Aquaコンペンセーションコントロールと表示を付した。
７．４．２ １滴のArcビーズをチューブに加えた。
７．４．３ ３μｌのＬ／Ｄ Aquaをビーズに直接加えた。
７．４．４ チューブを室温で、暗所で１０～３０分間インキュベートした。
７．４．５ ワークシートにインキュベーションの開始及び終了時間を記録した。
７．４．６ インキュベーション後、３ｍｌのＦＡＣＳ洗浄液を各チューブに加えた。
７．４．７ チューブを４００×ｇ、高加速及び減速で５分間回転させた。
７．４．８ 上清を静かに移す又は吸引した。
７．４．９ ５００μｌの１％ＰＦＡ溶液でチューブを再懸濁した。１滴の陰性ビーズを加えた。回収するまで、４０℃で暗所に置いた。
７．５ コンペンセーションコントロール染色。
７．５．１ ポストＲＥＰ ＴＩＬ表現型ワークシートに示されている通りＦＡＣＳチューブに表示を付した。
７．５．２ ポストＲＥＰ ＴＩＬ表現型ワークシートに示されている通り抗体を加えた。
７．５．３ インキュベーション後、３ｍＬのＦＡＣＳバッファーを各チューブに加えた。
７．５．４ チューブを５００ｇ、高加速及び減速で２分間回転させた。
７．５．５ 上清を静かに移す又は吸引した。
７．５．６ ＰＢＳ中で、５００μｌの１％ＰＦＡでチューブを再懸濁し、暗所で２～８０℃で貯蔵した。
７．６ データ収集
７．６．１ FACSDivaソフトウェアを開いてログインした。
７．６．２ サイトメーター不一致ダイアログで、「ＣＳＴ設定を使用（Use CST Settings）」をクリックした。
７．６．３ 「実験（Experiment）」タブをクリックし、「拡大表現型（Extended Pheno
type）」テンプレートを選択して、新規実験を作成した。
７．６．４ 目標値（Target Values）実験をダブルクリックし、手順中心作業者が決定
した目標値に達するように電圧を調整した。
７．６．５ 機器の設定を複写して、新規実験に貼り付けた。
７．６．６ 個体毎に標本（Specimen）を作成し、適切な名称を付けた。
７．６．７ チューブの表示に従って試料の名称を作成した。
７．６．８ チューブをＳＩＴに入れる前に、静かにボルテックスするか、又は指で弾いた。
７．６．９ 収集（Acquisition）ボードのＲＥＣＯＲＤ（記録）の下にデータを収集し
た。
７．６．１０ １秒あたり７，５００事象未満の速度で試料に実施した。
７．６．１１．破片を除く５０，０００～１００，０００の生事象を収集した。
実施例１９：プロセス２Ａ検証プロセスの開発
[00799] この実施例の実験は、黒色腫の患者由来の腫瘍からのＴＩＬの製造、及びプ
レＲＥＰの手順の腫瘍からのＴＩＬの成長を含む単一乳癌、その後の修正ＲＥＰについてプロセス２Ａを分析すべく完了した。凍結ＴＩＬ産物の確立、及び凍結ＴＩＬ産物の現在の新鮮ＴＩＬ産物プロセス（プロセス１Ｃ）に対する性能の比較に特に重点が置かれた。この報告は、同様のプロファイルが新鮮及び解凍されたものの重要な品質属性（細胞数、生存率、ＣＤ３＋Ｔ細胞の割合、ビーズ刺激ガンマインターフェロン（ＩＦＮ－ｙ）生産）並びに同一のＴＩＬが新鮮か凍結かを問わず再刺激拡大表現型手順（ｒｅＲＥＰ）の評価において観察されることを実証する。この結論を裏付けるために提示されたデータには、成長、生存率、表現型、ＩＦＮ－ｙ遊離、効力、テロメア長、及び代謝活性が含まれる。結果は、プロセス２Ａ、ＴＩＬの凍結保存の前の短縮プレＲＥＰ／ＲＥＰプロセスを特徴付けるとともに、本明細書に記載されるとおり２Ａプロセスをより長い１Ｃプロセスと比較する。
[00800] 腫瘍提供者の説明、処理日及び処理場所は、以下の表１に記載されている（
＊ＲＥＰが凍結ＲＥＰ ＴＩＬ株を使用して開始されたことを示す）。
３．背景情報
３．１ ＬＮ－１４４は、転移性黒色腫の患者を処置するための免疫療法製品である。本製品は、腫瘍の外科的切除後の個々の患者から得られた自己腫瘍浸潤Ｔリンパ球（ＴＩＬ）で構成され、細分化された腫瘍断片の細胞培養（プレＲＥＰ）を介してエキソビボで拡大培養され、その後高用量のＩＬ－２、抗ＣＤ３、及び共刺激ＡＰＣの存在下でＴＩＬが急速に拡大培養された。骨髄非破壊リンパ枯渇の事前調整に続き、患者は自身のＴＩＬの１回の注入を受け、その後８時間毎にアルデスロイキン（ＩＬ－２）の静脈内注入を最大６回投与された。腫瘍内微小環境（ＴＮＥ：Tmor Microenvironment）内の損傷関連分子
パターン（ＤＡＭＰ：Damage Associated Molecular Pattern Molecule）の設定のＴＩＬ拡大培養の代替方法を含む研究も、治療に役立つＴ細胞の効果的な拡大培養を実証した（Donia 2014; Sommerville, 2012）。
ＴＩＬの商業生産に使用されているプロセス１Ｃには、２４時間以内に免疫枯渇患者へ送達される注入可能なＴＩＬ産物を生産するのに約４５～５５日かかり得る生産スケジュールが含まれる。受容体である患者の免疫枯渇は、現在のＴＩＬ産物の回収にタイミングを正確に合わせなければならない。新鮮産物の回収又は送達の遅れは、注入を待つ免疫枯渇患者に悪影響を及ぼす可能性がある。プロセス２Ａは、プロセス１Ｃを改良し、プレＲＥＰ及びＲＥＰの両方の手順が短縮されたため、製造リードタイムと材料が減少した。更に、プロセス２Ａにより、産物の出荷時間の柔軟性が向上した。プレＲＥＰ、ＲＥＰ、及びプロセス回収（表２を参照のこと）におけるプロセス１Ｃ及びプロセス２Ａの差には、以下が含まれる：
３．１．１ プレＲＥＰの手順で使用されるフラスコは、腫瘍断片容量が増加し、より大きい。
３．１．２ 閉鎖系を使用したステップ、又は閉鎖系の将来的な適応に適したステップ。３．１．３ プレＲＥＰの手順及びＲＥＰの手順の両方で日数が減少した。
３．１．４ ＲＥＰへの直接アプローチにより、ＲＥＰに進むプレＲＥＰ ＴＩＬの特定集団を選択する前に、プレＲＥＰ集団の表現型分類の必要がなくなった。
３．１．５ ＴＩＬの十分な拡大培養について計算された、抗ＣＤ３（クローンＯＫＴ３）と組み合わせた、予め設定された数の照射同種異系ＰＢＭＣ ＡＰＣとの共培養。
３．１．６ 回収のための自動細胞洗浄系。
３．１．７ 出荷前に極低温保存されたCS10ベースの最終製剤。
４．略称
μｇ マイクログラム
μｌ マイクロリットル
μｍ マイクロメートル
ＡＰＣ 抗原提示細胞
ＣＤ 分化クラスター
ＣＭ セントラルメモリー
ＣＭ１，ＣＭ２， 培養培地１、２
ＣＯ２ 二酸化炭素
ＣＳ１０ CryoStor（登録商標）CS10凍結保存培地（BioLife Solutions）
Ｃｔ ＰＣＲ閾値サイクル
ＤＡＭＰｓ 損傷関連分子パターン分子
ｄＣｔ 参照Ｃｔ値と試験Ｃｔ値の違い
ｄｄＣｔ ｄＣｔと１０ｎｇの標準Ｃｔ値の違い
ＥＣＡＲ 細胞外酸性化率（解糖の尺度）
ＥＭ エフェクターメモリー
ＥＲ＋／ＰＲ＋ エストロゲン受容体＋／プロゲステロン受容体＋
ＧＭＰ 医薬品の製造管理及び品質管理に関する基準
ＨＢＳＳ ハンクスバランス塩溶液
ＨＳＡ ヒト血清アルブミン
ＩＦＮ－γ インターフェロンガンマ
ＩＬ インターロイキン
ＩＵ 国際単位
ＬＮ２ 液体窒素
Ｍｌ ミリリットル
Ｍｍ ミリメートル
ＮＤ 測定されず
Ｎｇ ナノグラム
℃ 摂氏
ＯＣＲ 酸素消費率（酸化的リン酸化の尺度）
ＯＫＴ３ 抗ＣＤ３モノクローナル抗体のクローン名
ＰＢＭＣ 末梢血単核球
ＰＤ プロセス開発
ＲＥＰ 迅速拡大培養プロトコル
Ｒｈ 組換えヒト
ＳＯＰ 標準実施要領
Ｔ／Ｓ テロメアの反復コピー数と単一遺伝子コピー数の比率
ＴＩＬ 腫瘍浸潤リンパ球
ＶＤＪ Ｔ細胞受容体の可変、多様性、及び結合セグメント
Ｖα，Ｖβ 優勢な腫瘍浸潤リンパ球における成熟Ｔ細胞受容体可変領域セグメント
μｇ マイクログラム
μｌ マイクロリットル
μｍ マイクロメートル
ＡＰＣ 抗原提示細胞
ＣＤ 分化クラスター
ＣＭ セントラルメモリー
ＣＭ１，ＣＭ２， 培養培地１、２
ＣＯ２ 二酸化炭素
ＣＳ１０ CryoStor（登録商標）CS10凍結保存培地（BioLife Solutions）
Ｃｔ ＰＣＲ閾値サイクル
ＤＡＭＰｓ 損傷関連分子パターン分子
ｄＣｔ 参照Ｃｔ値と試験Ｃｔ値の違い
ｄｄＣｔ ｄＣｔと１０ｎｇの標準Ｃｔ値の違い
ＥＣＡＲ 細胞外酸性化率（解糖の尺度）
ＥＭ エフェクターメモリー
ＥＲ＋／ＰＲ＋ エストロゲン受容体＋／プロゲステロン受容体＋
ＧＭＰ 医薬品の製造管理及び品質管理に関する基準
ＨＢＳＳ ハンクスバランス塩溶液
ＨＳＡ ヒト血清アルブミン
ＩＦＮ－γ インターフェロンガンマ
ＩＬ インターロイキン
ＩＵ 国際単位
ＬＮ２ 液体窒素
Ｍｌ ミリリットル
Ｍｍ ミリメートル
ＮＤ 測定されず
Ｎｇ ナノグラム
℃ 摂氏
ＯＣＲ 酸素消費率（酸化的リン酸化の尺度）
ＯＫＴ３ 抗ＣＤ３モノクローナル抗体のクローン名
ＰＢＭＣ 末梢血単核球
ＰＤ プロセス開発
ＲＥＰ 迅速拡大培養プロトコル
Ｒｈ 組換えヒト
ＳＯＰ 標準実施要領
Ｔ／Ｓ テロメアの反復コピー数と単一遺伝子コピー数の比率
ＴＩＬ 腫瘍浸潤リンパ球
ＶＤＪ Ｔ細胞受容体の可変、多様性、及び結合セグメント
Ｖα，Ｖβ 優勢な腫瘍浸潤リンパ球における成熟Ｔ細胞受容体可変領域セグメント
５．実験設計
５．１ プロセス２Ａ
５．１．１ プレＲＥＰ：受領後、腫瘍は生物学的安全キャビネット（クラスＩＩ、タイプＡ２）に移された。滅菌技術を使用して、腫瘍を輸送用容器から取り出し、５０μｇ／ｍＬゲンタマイシンを含むＨＢＳＳで洗浄した。技術者は腫瘍を４０×３×３×３ｍｍの断片に細分化し、６０００ＩＵ／ｍＬのｒｈＩＬ－２を添加した予め温めたＣＭ１培地を含むG-REX -100Mフラスコに移した。フラスコを３７℃、５％ＣＯ２の加湿組織培養イン
キュベーターに１１日間入れた。腫瘍が４０を超える断片を生成する場合、２つ以上のG-REX -100Mをセットアップしてもよい。次に、細胞を回収し、ＲＥＰ用に調製した。
５．１．２ ＲＥＰ：１１日目に、３０００ＩＵ／ｍｌのｒｈＩＬ－２、３０ｎｇ／ｍＬの抗ＣＤ３（クローンＯＫＴ３）及び５×１０９照射同種異系フィーダーＰＢＭＣ細胞を添加した５ＬのＣＭ２を含む１つのG-REX -500Mフラスコが調製される。減容後のプレＲ
ＥＰG-REX -100Mフラスコから回収したＴＩＬをカウントし、５×１０６及び２００×１
０６個の細胞の範囲でもよい密度でG-REX -500Mフラスコに播種した。次に、フラスコを
５日間、加湿した３７℃、５％ＣＯ２の組織培養インキュベーターに入れる。１６日目に、G-REX -500Mフラスコの容量を減らし、ＴＩＬをカウントし、その生存率を判定する。
この時点で、ＴＩＬは複数のG-REX -500Mフラスコ（最大６つのフラスコ）に拡大培養さ
れ、それぞれ１×１０９個のＴＩＬ／フラスコの播種密度を有する。その後、全てのフラスコを加湿した３７℃、５％ＣＯ２の組織培養インキュベーターに更に６日間入れる。２２日目、回収の日に、各フラスコの容積を９０％減らし、細胞をプールし、１７０μｍの
血液フィルターでろ過し、３ＬのOrigin EV3000バッグ又は同等品に収集し、LOVOを使用
して自動洗浄の準備をする。
５．１．３ 回収及び最終製剤：ＴＩＬは、細胞培養培地の９９．９９％を、１％ＨＳＡを添加したPlasmaLyte-Aからなる洗浄バッファーで置き換えたLOVO自動細胞処理系を使用して洗浄する。LOVOは、ＴＩＬの９２％超を回収しながら、血清、成長因子、及びサイトカイン、並びにその他の破片及び微粒子を含む残留組織培養成分を事実上排除する回転ろ過膜技術を使用して動作する。洗浄完了後、細胞数を測定して、ＴＩＬの拡大率及び回収時の生存率を判定する。プロセス２Ａの最終産物を達成するために、CS10を洗浄したＴＩＬに１：１の容積：容積比で加える。最終製剤産物を凍結保存バッグに分注し、密封し、予め冷却したアルミニウムカセットに入れる。次に、SOP LAB-018 Rev 000制御速度フリ
ーザーの操作に従って、ＴＩＬを含む凍結保存バッグをCryoMed Controlled Rate Freezer（ThermoFisher Scientific、Waltham, MA）を使用して凍結する。
５．２ ＴＩＬ試料：特徴付け比較のために、４つの状態のＴＩＬが収集された。
５．２．１ 新鮮回収ＴＩＬ（１％ＨＳＡ洗浄バッファーを含むPlasmaLyte-Aから直接）解凍ＴＩＬ（解凍最終製品バッグから直接）
５．２．２ 新鮮拡大培養表現型ＲｅＲＥＰ ＴＩＬ（ＩＬ－２、ＰＢＭＣフィーダー、及び抗ＣＤ３クローンＯＫＴ３で７～１４日間培養した新鮮収穫ＴＩＬ）
５．２．３ 解凍拡大培養表現型ＴＩＬ（ＩＬ－２、ＰＢＭＣフィーダー、及び抗ＣＤ３クローンＯＫＴ３で７～１４日間培養した解凍ＴＩＬ）
５．３ 試験概要（図２を参照のこと）
５．３．１ プレＲＥＰ試験には、ＩＬ－２の量の評価及び、プレＲＥＰ全体のグルコース、乳酸、Ｌ－グルタミン及びアンモニアなどの細胞培養代謝物の分析が含まれる。
５．３．１．１ ＩＬ－２の定量化：プレＲＥＰ培養から培地を定期的に除去し、ＩＬ－２の定量化についてＥＬＩＳＡで試験した。R＆D Systems Human IL-2 Quantikine ELISA
Kitの製造者の指示を参照のこと。
５．３．１．２ 細胞培養代謝物の分析：培地は、プレＲＥＰ培養から定期的に除去され、以下の代謝物について試験された：グルコース、乳酸、Ｌ－グルタミン及びアンモニア。手順については、Roche Cedex Bioanalyzerユーザマニュアルを参照のこと。
５．３．２ ＲＥＰ試験には、細胞数、％生存率、細胞表面分子のフローサイトメトリー分析、効力（ＩＦＮ－γ産生）、生物発光リダイレクト溶解アッセイ、グランザイムＢ産生、細胞代謝、テロメア長測定などの拡大アッセイが含まれる。
５．３．２．１ 細胞数及び生存率：ＴＩＬ試料をカウントし、SOP LAB-003 Rev 000 Cellometer K2 Image Cytometer Automatic Cell Counterに従ってCellometer K2自動セル
カウンター（Nexcelom Bioscience、Lawrence, MA）を使用して生存率を測定した。
５．３．２．２ 細胞表面バイオマーカーのフローサイトメトリー分析：ポストＲＥＰ ＴＩＬのWRK LAB-041 Rev 000表面抗原染色に概説されている手順を使用して、細胞表面
マーカーのフローサイトメトリー分析用にＴＩＬ試料を分けた。
５．３．２．３ 効力アッセイ（ＩＦＮ－γ産生）：ＣＤ３、ＣＤ２８、及びＣＤ１３７／４－１ＢＢに対する抗体で刺激されたＴＩＬの培地中のサイトカインＩＦＮ－γのレベルを決定することで細胞傷害能の測定値を測定した。これらの刺激ＴＩＬからの培地中のＩＦＮ－γレベルは、ＩＦＮ－γ遊離測定のためのＴＩＬのWRK LAB-016 Rev 000刺激を
使用して決定した。
５．３．２．４ 生物発光リダイレクト溶解アッセイ：標的細胞を溶解するＴＩＬの細胞傷害能は、ＴＩＬのためのWRK LAB-040生物発光リダイレクト溶解アッセイ（効力アッセ
イ）に概説されているＳＯＰに従って、生物発光細胞株Ｐ８１５（クローンＧ６）とのＴＩＬの共培養アッセイを使用して評価した。
５．３．２．５ グランザイムＢ産生：グランザイムＢは、ＴＩＬが標的細胞を死滅させる能力の別の尺度である。５．２．５．３に記載したとおり再刺激した培地上清について、そのグランザイムＢレベルもまた、Human Granzyme B DuoSet ELISA Kit（R & D Systems、Minneapolis, MN）を製造者の指示に従い使用して評価した。
５．３．２．６ 細胞（呼吸）代謝：細胞をミトコンドリア呼吸及び解糖の阻害薬で処理して、以下の尺度からなるＴＩＬの代謝プロファイルを決定した：ベースライン酸化的リン酸化（ＯＣＲによる測定時）、予備呼吸容量、ベースライン解糖活性（ＥＣＡＲによる測定時）、及び解糖予備能。代謝プロファイルは、WRK LAB-029 Seahorseコンビネーションミトコンドリア／解糖ストレステストアッセイで概説された手順を使用して実施した。５．３．２．７ テロメア長の測定：ゲノムＤＮＡ及び細胞学的調製物中のテロメア長を測定するために、様々な方法が使用されてきた。テロメア制限フラグメント（ＴＲＦ）分析は、テロメア長を測定するための究極の判断基準である（de Lange et al., 1990）。
ただし、ＴＲＦの主な制限は、大量のＤＮＡ（１．５＾ｇ）を必要とすることである。テロメア長の測定に広く使用されている２つの技術、即ち、蛍光ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ；Agilent Technologies、Santa Clara, CA）及び定量的ＰＣＲ
。
５．３．３ 以下の試験のために追加試料が採取され、必要に応じて将来分析される可能性があった：
５．３．３．１ サイトカイン分析の詳細
５．３．３．２ ＴＣＲの配列
６．達成した結果
セクション２．３で説明した腫瘍に由来するＴＩＬ、セクション５．１での実験設計及び回収条件を使用して、合計９回の実験を実施した。プロセス２Ａを使用して回収したＴＩＬは、その拡大能力、生存率、表現型、細胞傷害能、及び代謝プロファイルを理解するために、セクション５．３．２で概説された試験に供した。新鮮回収ＴＩＬ産物と解凍した凍結ＴＩＬ産物に対して全ての測定を行った（プロセス２Ａ）。
６．１ 細胞数及び生存率
６．１．１ プレＲＥＰ、ＲＥＰの５日目又は６日目（拡大培養の日）、及びLOVO洗浄前及びLOVO洗浄後のＲＥＰの終了時に細胞数をカウントした。次に、その細胞数を使用して、ＲＥＰ中のＴＩＬの拡大培養及びLOVOの洗浄後のＴＩＬの回復を判定した。解凍後、細胞を再度カウントし、解凍後の回復（ＴＩＬを凍結した時点の濃度に基づく）及び他の分析アッセイに進む前の解凍後生存率を判定した。表３は、９回のプロセス２Ａの実施に関するこれらの結果を全てまとめたものである。
６．１．２ プロセス２Ａ ＳＯＰは、ＲＥＰのＴＩＬの開始番号を５ ２００×１０６
ＴＩＬの範囲で定義する。プロセス２Ａ ＲＥＰを開始するために使用された９つのＴＩＬ試料の範囲は４．１×１０６（Ｍ１０６５Ｔ）－１．８×１０８（Ｍ１０６４Ｔ）で、平均開始ＴＩＬ番号は６．５８×１０７であった。興味深いことに、最小数のＴＩＬとともにプレートに入れたＲＥＰは、ＲＥＰ回収時に最大限まで拡大した（９回のＲＥＰ全ての拡大範囲：１３０～１９００倍；平均拡大率、８４０倍）。これら９回のプロセス２Ａ ＲＥＰの終了時に回収したＴＩＬの平均数は、４．４９×１０１０（範囲７．８×１０９～６．７×１０１０）であった。
６．１．３ プロセス１Ｃの比較統計については、ＬＮ１４４／ＬＮ－１４５の治験薬（ＩＮＤ：Investigational New Drug）適用の化学、製造、及び管理（ＣＭＣ：Chemistry,
Manufacturing, and Controls）セクションを参照のこと。
６．１．４ プロセス１Ｃでは、手動操作及び遠心分離を利用してＴＩＬ産物を洗浄する。これには時間がかかるが、更に重要なことに、回収から最終製剤までの間に産物の最大２５％が失われる可能性がある。自動細胞洗浄LOVO系は、細胞損失を最小限に抑える方法を提供し、閉鎖系洗浄を導入し、洗浄ステップ中の産物の汚染のリスクを低減している。プロトコルのLOVO洗浄ステップ後の産物の回収率は、洗浄ステップに入るＴＩＬ産物の平均９３．８±１０．４％を示した。この統計には、Ｍ１０６２ＴのＴＩＬ産物が含まれており、このLOVOの回復率は６８％であり、その間にLOVOの操作中の作業者の過失により、試料を遠心分離してからLOVO手順をやり直さなければならなかった（セクション７、偏差及び不一致を参照））。これは、ＲＥＰ回収日のプロセス１Ｃ洗浄ステップでの非常に好ましい改善を示している。
６．１．５ 解凍後のＴＩＬの回復も、凍結ＴＩＬ産物の主要懸念事項である。凍結保存の前に各凍結バッグに入れた細胞の数と比較して、解凍後にバッグから回収した細胞の数を測定することにより、産物の回収を判定した。解凍からの回復範囲は７８～１０３％で、平均回復率は８８．２±８．６％であった。
６．１．６ 解凍前又は解凍後の試料の生存率には有意な差があるが、平均して、解凍時の生存率の損失はわずか２％である。凍結保存に入るＴＩＬの生存率は８４．３±４．７
％で、解凍後の同じＴＩＬの生存率は８２．１±４．４％であった（ｐ＝０．０７４２、対のスチューデントのｔ検定、ノンパラメトリック）。新鮮臨床ＴＩＬプロセス１Ｃ産生の遊離基準には、最低７０％の生存率が必要である。解凍時の生存率のわずかな損失に関わらず、プロセス２Ａの９回の実施は全て、極低温産物の解凍後にこの放出基準を満たした。表４及び図３は、凍結保存（新鮮＋CS10）に移行するＴＩＬの生存率と、解凍時のＴＩＬの生存率を示す。
６．２ ＴＩＬのＲｅ－ＲＥＰ拡大培養。ＲＥＰで拡大培養する新鮮な産物の能力を調べることに加え、新鮮な照射異系同種ＰＢＭＣフィーダーＡＰＣ及び新鮮抗ＣＤ３で再刺激による新鮮ＴＩＬ産物と解凍ＴＩＬ産物の両方の拡大培養の能力を判定した。７日後、これらの再刺激されたＴＩＬ産物の、初めの培養状態からの拡大培養能力について分析した。図４及び表５は、７日間培養して成長させた後のｒｅ－ＲＥＰ ＴＩＬ細胞の平均拡大率を示している。対のスチューデントのｔ検定を使用したデータの分析により、ＴＩＬがｒｅ－ＲＥＰで拡大する能力は、ＲＥＰを新鮮ＴＩＬ産物から開始しても解凍ＴＩＬ産物から開始しても有意な差はないことを示している（ｐ＝０．８１）。
６．３ 細胞培養代謝産物。Ｌｉｏｎ ２Ａの主要な前提の１つは、技術時間及びプロセス移行が少なくなると、経費が削減され、ばらつきが制限されることである。これにより起こり得る悪影響は、望ましくない代謝産物の増加と栄養源の減少であった。図５に示すように、電解質（ナトリウム及びカリウム）、栄養素（グルタミン及びグルコース）、及び代謝産物（乳酸及びアンモニア）の正常な血液値は、プレＲＥＰ１１日の結果を評価する際の参照範囲を提供する。図６に示すように、３回のＴＩＬ（Ｍ１０６１Ｔ、Ｍ１０６２Ｔ、及びＭ１０６４Ｔ）が順次判定された。この設定では、カリウム及びナトリウムは正常レベルに維持され、グルコースは＞１．０ｇ／Ｌ、グルタミンは＞０．３ｍｍｏｌ／Ｌを超えており、正常血中値よりもかなり高くなった。予測通り、乳酸塩は、通常の血液に見られるレベルの約５倍である０．８ｇ／Ｌ、アンモニアは３ｍｍｏｌ／Ｌに上昇にまで上昇し、これは急速に拡大した細胞であることから予想され、また、通常の血液に見られる値よりも大幅に高くなった。
６．４ ＩＬ－２の定量化。
６．４．１ 補足グルコース、グルタミン及び十分な酸素化に加えて、プレＲＥＰにおけるＴＩＬ成長の主な駆動要因は、高レベルのｒｈＩＬ－２の提供である。血清含有培地への添加後、ＩＬ－２レベルは２～３．５×１０３ＩＵ／ｍＬと測定され、培養１１日間で約１．０×１０３ＩＵ／ｍＬに低下したのみであった。これは、Ｔ細胞の成長を維持するのに必要な３０～１００ＩＵ／ｍＬを大きく上回っている。ＩＬ－２の異なる材料（Prom
etheus、Akron、 Cellgenix）を使用したＩＬ－２濃度の評価が現在、個別の実験（QP-17-010：Cellgenix、Akron、PrometheusからのＩＬ－２の認定）がLion Biotechnologies、Tampaで行われている。
６．５ ＩＦＮ－γ産生
６．５．１ セクション５．３．５．３で説明したように、磁気抗ＣＤ３、ＣＤ２８及び4-1BB DynabeadsでＴＩＬを２４時間刺激した後、培養物の上清を収集し、ＥＬＩＳＡキ
ットを使用してＩＦＮ－γについて分析した。全ての再刺激されたＴＩＬは、刺激されていない物よりも多くのＩＦＮ－γを産生し、ＴＩＬの刺激がそれらの活性化をもたらしたことを示している。図８は、再刺激時に周囲の培地にＩＦＮ－γを遊離させる４つの異なるＴＩＬ組成物（新鮮、解凍、新鮮ｒｅ－ＲＥＰ及び解凍ｒｅ－ＲＥＰ ＴＩＬ）の試験結果を示している。
表６及び７は、９回のプロセス２Ａ実施におけるＩＦＮ－γ分泌の平均値を示している。再刺激時の周囲の培地へのＩＦＮ－γ分泌は、新鮮ＴＩＬ産物と解凍され、凍結保存されたＴＩＬの間で差はない。表６は、新鮮産物が平均４１４３±２２８５ｐｇ ＩＦＮ－γ／１０６ＴＩＬを産生したのに対し、解凍産物は３９１０±１４８７ｐｇ ＩＦＮ－γ／１０６ＴＩＬを産生したことを示している（対のスチューデントのｔ検定を使用してｐ＝０．５５）。総ＴＩＬ産物（表７）に基準をあわせると、平均して、刺激された新鮮ＴＩＬは８６±６１ｇのＩＦＮ－γを産生し、解凍して刺激されたＴＩＬは６８±４０ｇのＩＦＮ－γを産生した（ｐ＝０．１３）。これらの発見は、新鮮ＴＩＬ産物と解凍ＴＩＬ産物の両方がＩＦＮ－γを産生し、抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８／抗４－１ＢＢで刺激すると、新鮮又は解凍した一致するＴＩＬがＩＦＮ－γを産生する能力に差がないことを示している。
６．６ グランザイムＢ産生
６．６．１ セクション５．２．５．３で説明したように、磁気抗ＣＤ３、ＣＤ２８及び4-1BB DynabeadsでＴＩＬを２４時間刺激し、２４時間後に収集した培養物の上清を、Ｅ
ＬＩＳＡによりグランザイムＢレベルについて分析した。全ての再刺激されたＴＩＬは、刺激されていない物よりも多くのグランザイムＢを産生し、ＴＩＬの刺激がそれらの活性化をもたらしたことを示している。図９は、サイトカインカクテルで再刺激すると、周囲の培地にグランザイムＢを遊離させる新鮮ＴＩＬ、新鮮ｒｅ－ＲＥＰ ＴＩＬ、及び解凍ｒｅ－ＲＥＰ ＴＩＬの能力を示している。
[00801] 全産物は、９１９０ｐｇ／１０６生細胞から２６２０００ｐｇ／１０６生細
胞までの範囲のグランザイムＢ産生を示した（表８）。表６は、新鮮産物が平均６０６４４＋４２９５９を産生し、新鮮及び再解凍ｒｅ－ＲＥＰがそれぞれ９３６００＋６７５５８お及び１０３８７８＋８４５１５を産生したことを示す。新鮮ｒｅ－ＲＥＰ及び解凍ｒｅ－ＲＥＰの比較により、どちらの条件から得られたＴＩＬの能力にも差がないことが示された（ｐ＝０．７）。解凍産物にはグランザイムＢの測定値がないため、新鮮ＴＩＬ産物を使用した統計分析は実施しなかった。
６．７細胞表面バイオマーカーのフローサイトメトリー分析
[00802] ＴＩＬの表現型プロファイリング：Ｔ細胞の機能的プロファイルを広く特徴
付けるために、ＬＩＯＮでは４つの抗体パネルを標準化してきた。これらのパネルを使用して、新鮮ＴＩＬ、解凍ＴＩＬ、新鮮ｒｅ－ＲＥＰ ＴＩＬ、及び解凍ｒｅ－ＲＥＰ ＴＩＬの免疫表現型を評価した。このセクションの画像表示に使用される全てのデータは、付録セクション１０の表形式（表１４～２４）でも提供されている。
６．８ 生物発光リダイレクト溶解アッセイ
６．８．１ プロセス２Ａ ＴＩＬの標的腫瘍細胞を死滅させる潜在能力を決定するために、セクション５．３．２．４に記載されている通り、生物発光代替標的細胞株Ｐ８１５を伴うＴＩＬの共培養を含む潜在アッセイを開発した。抗ＣＤ３刺激の存在下でＰ８１５を伴う、異なるＴＩＬ組成物を４時間共培養すると、標的細胞の５０％の死滅に必要なＴＩＬ数として定義できる溶解単位ＬＵ５０で表されるＴＩＬ細胞の細胞傷害能の尺度が得られる。この測定値はＬＵ５０／１０６ＴＩＬとして表される。下の図３２は、新鮮産物、及び２つのｒｅ－ＲＥＰ ＴＩＬ条件、新鮮ｒｅ－ＲＥＰ及び解凍ｒｅ－ＲＥＰからのＴＩＬの細胞傷害能を示す。
６．８．２ 新鮮ｒｅ－ＲＥＰ及び解凍ｒｅ－ＲＥＰ比較により、ＴＩＬが標的細胞の死滅能力にも有意な差がないことが示される（ｐ＝０．３１２６）。このデータは、ＴＩＬ産物の細胞傷害能に関して、新鮮産物及び解凍産物の間に差がないという結論を裏付ける。ＴＩＬを解凍した直後に細胞傷害能が測定されなかったため、新鮮な細胞間の比較は実施しなかった。表９は、Ｐ８１５標的細胞株の５０％の死滅に必要なＴＩＬの溶解単位を示す。
６．９ ＴＩＬの細胞代謝プロファイル
６．９．１ ポストＲＥＰ ＴＩＬの代謝的健康を評価するため、セクション５．３．２．６で概説したプロトコルに従って、Agilent Technologies (Santa Clara, CA)のSeahorse代謝分析装置（XFp及びXFe96）を使用した。簡潔に言えば、酸化的リン酸化又は解糖のいずれかの特定の側面を標的とする阻害剤で細胞を処理することにより、細胞にかかるＳＲＣ及び解糖予備能の判定を可能にする方法でストレスをかける。更に、酸化的リン酸化（基礎ＯＣＲ）及び解糖（基礎ＥＣＡＲ）の両方の基礎レベルを判定できる。最後に、酸化的リン酸化と解糖の阻害剤が同じ試験で組み合わされるため、細胞が、２－デオキシグルコース（２－Ｄ）のＧ拮抗阻害剤（ＳＲＣ２ＤＧと表示が付された）で処理された場合にのみ明らかな、ＳＲＣの潜在的な隠れた予備能を識別することができ、結果としてともすれば隠れたままのＳＲＣの増加をもたらす。この余分な呼吸容量は、「Covert」ＳＲＣと表示が付された。表９に、細胞で実施された代謝ストレス試験から得られた、新鮮回収ＴＩＬ、新鮮ｒｅ－ＲＥＰ ＴＩＬ、及び解凍ｒｅ－ＲＥＰ ＴＩＬの代謝プロファイルを示す。
６．９．２ 図５５Ａ～Ｆ、表３８のデータを画像形式で示している。新鮮回収ＲＥＰ産物は、新鮮ｒｅ－ＲＥＰ及び解凍ｒｅ－ＲＥＰ産物との統計的な差を示している。ｒｅ－ＲＥＰ産物は、ＲＥＰ直後又は解凍時に、新鮮照射ＰＢＭＣ ＡＰＣ及び新鮮抗ＣＤ３抗体で再刺激されているため、これは驚くべきことではない。ただし、全ての場合において、生製品及び解凍産物の両方がｒｅ－ＲＥＰ手順で再刺激された場合、有意な差はない（表９のｐ値を参照のこと）。これは、凍結保存プロセスがＴＩＬ産物に悪影響を及ぼさないことを示している。最も注目すべきは、酸化的リン酸化の場合、ｒｅ－ＲＥＰ産物は一致する新鮮回収ＲＥＰ産物よりも高いＳＲＣを有していることである。解糖の場合、ｒｅ－ＲＥＰ ＴＩＬは、新鮮ＲＥＰ産物よりも、解糖の基礎レベルが統計的に有意に高く、逆に解糖予備能のレベルが統計的に低くなる。注目に値するのは、活性化された健康なＴＩＬが高レベルの解糖活性を持つことが報告されている通り、ｒｅ－ＲＥＰ ＴＩＬが新鮮に回収したＴＩＬよりも高度に活性化されることを示す可能性があることである（Buck
et al., JEM 212:1345-1360; 2015）。
６．９．３ ｒｅ－ＲＥＰ手順を使用した新鮮産物及び凍結産物の直接比較により、同一の刺激条件では新鮮ＴＩＬ産物及び凍結ＴＩＬ産物の両方が統計的に不明瞭な代謝プロファイルをもたらすことが確認できた。新鮮ｒｅ－ＲＥＰ及び解凍ｒｅ－ＲＥＰ ＴＩＬの両方が、同様のレベルの基礎呼吸（図６０Ａ、３６．７±１０．６及び４４．８±１２．９ｐｍｏｌ／分；それぞれｐ＝０．１１）及び同様の（明白な）ＳＲＣ（図６０Ｂ、４１．６±２７．２及び６２．７±３０．８；ｐ＝０．１２）を有する。これらのｒｅ－ＲＥＰ細胞を、解糖の阻害をもたらす結果をもたらす２－ＤＧ、グルコースの拮抗阻害剤で処理すると、新鮮及び解凍ｒｅ－ＲＥＰ ＴＩＬの両方が、回収新鮮ＴＩＬ試料にほとんど含まれていないか、存在しない余分な「隠れた」予備呼吸容量（ＳＲＣ２ＤＧ；Covert
ＳＲＣ）を示すことが分かる（図６０Ｃ）；回収新鮮ＴＩＬでＳＲＣ２ＤＧのレベルが高かったのは１試料のみで（図６０Ｃ）、逆に、試験した７試料のうち１つだけがｒｅ－ＲＥＰでCovert ＳＲＣの欠如を示した。新鮮ｒｅ－ＲＥＰのCovert ＳＲＣ（図６０Ｄ）は平均２０．７±２０．１であったが、解凍ｒｅ－ＲＥＰのCovert ＳＲＣ（図６０Ｄ）は２７．８±１６．１であった。ｐ＝０．５２）。
６．９．４ 拡大表現型（ｒｅ－ＲＥＰ）ＴＩＬの最も顕著な代謝読み取りは、拡大表現型（ｒｅ－ＲＥＰ）試料の一貫した高レベルの基礎解糖である。基礎解糖（図６０Ｅ）はｒｅ－ＲＥＰ試料で一貫して高く、新鮮ｒｅ－ＲＥＰでは平均１１８．７±４４．２ｍｐＨ／分、解凍ｒｅ－ＲＥＰでは平均１３２．０±４３．２±ｍｐＨ／分である。これらの試料は、互いに統計的差がない（ｐ＝０．３８）。しかし、上記のように、新鮮回収試料は、解糖のかかる高基礎レベルを有していない。新鮮ｒｅ－ＲＥＰ ＴＩＬと比較すると、この差はかなり大きいが、有意ではない（ｐ＝０．１０）；ただし、解凍ｒｅ－ＲＥＰ試料と比較すると、その差は有意である（ｐ ０．０１）。これらのｒｅ－ＲＥＰ細胞は、Seahorse代謝試験でストレスを受けた場合解糖予備能がほとんど残っていないため、エネルギーの必要性のため解糖に大きく依存しているようである（図６０Ｆ）：新鮮ｒｅ－ＲＥＰ ＴＩＬ平均１２．９±１４．９ｍｐＨ／分；解凍ｒｅ－ＲＥＰ ＴＩＬ平均、３．３５±２３．８ｍｐＨ／分）。これらのｒｅ－ＲＥＰは互いに差はないが（ｐ＝０．４
７）、両方とも新鮮回収ＴＩＬ試料に見られる解糖予備能の貯蔵量とは統計的に異なり、平均４０．８±１７．６ｍｐＨ／分である（新鮮ｒｅ－ＲＥＰ及び解凍ｒｅ－ＲＥＰ ＴＩＬと比較してそれぞれ、ｐ＝０．００３及び０．０１）。これらの新鮮回収試料及びｒｅ－ＲＥＰ ＴＩＬ試料の解糖で見られる差の背後にある原因を特定するため、さらなる研究を実施する必要がある。
６．１０．テロメア長の測定
６．１０．１ フローＦＩＳＨ及びｑＰＣＲによるポストＲＥＰ ＴＩＬのテロメア長の測定。
６．１０．１．１ Dako/Agilent Pathology Solutions（フローサイトメトリー用テロメアＰＮＡ／ＦＩＴＣ）キットを使用してフローＦＩＳＨを実施し、製造者の指示に従ってテロメア反復の平均長を測定した。１３０１ Ｔ細胞白血病細胞株（Sigma-Aldrich、St.
Louis, MO）を各アッセイの内部参照標準として使用した。個々のＴＩＬをカウントし、１：１の細胞比で１３０１細胞と混合した。２×１０６ ＴＩＬを２×１０６の１３０１細胞と混合した。ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーションは、ハイブリダイゼーション溶液（７０％ホルムアミド、１％ＢＳＡ、２０ｍＭのTris、ｐＨ７．０）で、ＦＩＴＣ結合テロメアＰＮＡプローブ（ＦＩＴＣ－００－ＣＣＣＴＡＡ－ＣＣＣ－ＴＡＡ－ＣＣＣ－ＴＡＡ）が在るものと無いもので複製され、最終濃度６０ｎＭのテロメア反復配列を補足して実施された。テロメアＰＮＡプローブの追加後、細胞をヒートブロックで、８２℃で１０分間インキュベートした。次に、細胞を室温で一晩暗所に置いた。翌朝、４０℃のヒートブロック上でWash Solutionを用いて１０分間ずつ２回洗浄することにより、過剰なテ
ロメアプローブを除去した。洗浄後、ＤＡＰＩ（Invitrogen、Carlsbad, CA）を最終濃度７５ｎｇ／ｍｌで加えた。ＤＡＰＩによるＤＮＡ染色を使用して、Ｇ０／Ｇ１集団の細胞をゲーティングした。Yetiフローサイトメーター（Propel-Labs、Fort Collins, CO）を
使用して試料分析を実施した。試験試料のテロメア蛍光は、以下の式に従って１３０１細胞の蛍光（ｆｌ）の割合として表された：相対テロメア長＝［（平均ＦＩＴＣ ｆｌ試験細胞ｗ／プローブ－平均ＦＩＴＣ ｆｌ試験細胞ｗ／ｏプローブ）×１３０１細胞のＤＮＡ指標×１００］／［（平均ＦＩＣＴ ｆｌ １３０１細胞ｗ／プローブ－平均ＦＩＴＣ
ｆｌ １３０１細胞ｗ／プローブ）×試験細胞のＤＮＡ指標。
６．１０．１．２ ｑＰＣＲ：相対テロメア長を測定するために、リアルタイムｑＰＣＲが使用された。簡潔に言えば、９６ウェル形式のBio-Rad PCRサーマルサイクラー（Bio-Rad Laboratories、Hercules, CA）を使用して、テロメアの反復複製数と単一遺伝子複製
数（Ｔ／Ｓ）の比率を決定した。１０ｎｇのゲノムＤＮＡがテロメア（Ｔｅｌ）又はヘモグロビン（ｈｇｂ）ＰＣＲ反応に使用され、使用されたプライマーは以下のとおりであった。ＴｅＬ－１ｂプライマー（ＣＧＧ ＴＴＴ ＧＴＴ ＴＧＧ ＧＴＴ ＴＧＧ ＧＴＴ ＴＧＧ ＧＴＴ ＴＧＧ ＧＴＴ ＴＧＧ ＧＴＴ）、ＴｅＬ－２ｂプライマー（ＧＧＣ ＴＴＧ ＣＣＴ ＴＡＣ ＣＣＴ ＴＡＣ ＣＣＴ ＴＡＣ ＣＣＴ ＴＡＣ ＣＣＴ ＴＡＣ ＣＣＴ）、ｈｇｂ１プライマー（ＧＣＴＴＣＴＧＡＣＡＣＡＡＣＴＧＴＧＴＴＣＡＣＴＡＧＣ）、及びｈｇｂ２プライマー（ＣＡＣＣＡＡＣＴＴＣＡＴＣＣＡＣＧＴＴＣＡＣＣ）。全試料は、テロメア反応とヘモグロビン反応の両方によって分析され、分析は同じプレート上で３回実施された。試験試料に加えて、各９６ウェルプレートには、１３０１細胞から分離されたゲノムＤＮＡを使用した０．０８ｎｇから２５０ｎｇの５点標準曲線が含まれていた。各試料のＴ／Ｓ比（－ｄＣｔ）は、テロメアＣｔ値の中央値からヘモグロビン閾値サイクル（Ｃｔ）の値を差し引くことによって計算された。相対Ｔ／Ｓ比（－ｄｄＣｔ）は、未知の各試料のＴ／Ｓ比から１０ｎｇの標準曲線点のＴ／Ｓ比を差し引くことで決定した。
６．１０．１．３ テロメア長の結果と考察：テロメアは、完全な染色体複製を促進する上で重要な役割を果たす線形染色体の端部のキャップ（反復ヌクレオチド配列）である。テロメア測定は、変性疾患、癌、及び老化などの状態の研究における新たなツールである。ＮＩＨの以前の研究（J Immunol.2005, Nov 15;175(10):7046-52; Clin Cancer Res.2011, Jul 1; 17(13):4550- 4557）は、ＴＩＬのより長いテロメア長が臨床応答に関連して
いることを示している。一方、Radvanyiのグループは、レスポンダーと非レスポンダーの間でＴＩＬのテロメア長に有意な差がないことを発見した（Clin Cancer Res; 18(24); 6758-70）。これまでのところ、テロメア長がｉｎ ｖｉｔｒｏ Ｔ細胞培養の長さに関連していることを証明する証拠は無い。プロセス２Ａ（２２日間培養）で培養されたポストＲＥＰ ＴＩＬは、プロセス１Ｃプロセス（２５～３６日間培養）で培養されたＴＩＬと比較して、テロメア長が長くなる可能性がある。
７．差及び偏差
７．１ プロセス偏差
７．１．１ Ｍ１０６１Ｔ：ＲＥＰ細胞を６日目に４つのG-Rex500Mフラスコに分割した
。
７．１．２ Ｍ１０６２Ｔ：ＲＥＰ細胞を６日目に４つのG-Rex500Mフラスコに分割した
。LOVOろ過系のオペレーターエラーにより、処置中に緊急停止が発生し、使い捨てキットからＴＩＬを手動で収集する必要があった。ＴＩＬは、２回目のLOVO実施中に正常にろ過された。
７．１．３ Ｍ１０６３Ｔ：偏差なし Ｍ１０６４Ｔ：偏差なし
７．１．４ Ｍ１０６５Ｔ：プレＲＥＰ細胞は、１１日目の細胞カウント仕様を下回っていた（＜５×１０６個の細胞）が、ＲＥＰまで継続された。ＲＥＰ６日目に、細胞を数え、G-Rex500Mに戻し、４．５Ｌの新鮮培地を与えた。ＴＩＬは、細胞数が不十分（ＲＥＰ
６日目で＜１×１０９個の細胞）のため、この日は拡大培養しなかった。
７．１．５ ＥＰ１１００１Ｔ：偏差なし
７．１．６ Ｍ１０５６Ｔ：プレＲＥＰ細胞は、G-Rex 100フラスコ内のＬＩＯＮで最大
２１日間培養した。プレＲＥＰ１１日目に腫瘍断片をろ過除去し、回収日には１．５ｍｌバイアルあたり３０×１０６個の細胞の１００％CS10でＴＩＬを凍結した。凍結ＴＩＬを６０００ＩＵ／ｍＬのｒｈＩＬ－２を添加したＣＭ１のMoffitt PDで解凍し、ＲＥＰ０日目を開始する前に３日間休ませた。ＲＥＰ６日目に、ＴＩＬは４つのフラスコに拡大培養され、ＲＥＰ１１日目に回収に進んだ。
７．１．７ Ｍ１０５８Ｔ：プレＲＥＰ細胞は、G-Rex 100フラスコ内のＬＩＯＮで最大
２１日間培養した。プレＲＥＰ１１日目に腫瘍断片をろ過除去し、回収日には１．５ｍｌバイアルあたり３０×１０６個の細胞の１００％CS10でＴＩＬを凍結した。凍結ＴＩＬを６０００ＩＵ／ｍＬのｒｈＩＬ－２を添加したＣＭ１のMoffitt PDで解凍し、ＲＥＰ０日目を開始する前に３日間休ませた。ＲＥＰ６日目に、細胞は４つのフラスコに分割され、ＲＥＰ１１日目に回収に進んだ。
７．１．８ Ｍ１０２３Ｔ：プレＲＥＰ細胞は、G-Rex 10フラスコ内のＬＩＯＮで最大２１日間培養した。プレＲＥＰ１１日目に腫瘍断片をろ過除去し、回収日には１．５ｍｌバイアルあたり３０×１０６個の細胞の１００％CS10でＴＩＬを凍結した。凍結ＴＩＬを６０００ＩＵ／ｍＬのｒｈＩＬ－２を添加したＣＭ１のMoffitt PDで解凍し、ＲＥＰ０日目を開始する前に３日間休ませた。ＲＥＰ６日目に、細胞は４つのフラスコに拡大培養され、ＲＥＰ１１日目に回収に進んだ。
７．２ 偏差の試験
７．２．１ 詳細なサイトカイン分析及びＴＣＲシーケンスは実施されなかった。
８．結論及び提言
８．１ より堅牢なプロセスの開発。Ｌｉｏｎの課題は、処理時間が長い初期のＬｉｏｎプロセス１Ｃを、より短い処理時間及びＴＩＬ産物の凍結保存最終製剤をもたらす改良版を使用した、より商業化可能な可能性のあるＬｉｏｎプロセス２Ａに変えることであった。この目的のために、９回のプロセス開発を実施し、古いプロセス及び新しいプロセスが同等の細胞収量並びに同等のＴＩＬ効力及び表現型を実証したことを確認した。特に注目すべきは、プロセス全体の複雑さが著しく減少し、結果としてプレＲＥＰ及びＲＥＰプロセス全体の長さが５０％短縮され、なおかつ現在、当社の契約製造業者で実施されている
従来のＬｉｏｎプロセス１Ｃと比較して同等のＴＩＬ収量（７．８×１０９～６７×１０９個の細胞）が得られたことである。これは、２０１７年６月のＡＳＣＯプレゼンテーション用に更新された（平均：１．２～９６×１０９個の細胞の範囲で４１．０４×１０９個の細胞）。更に、Ｌｉｏｎは凍結保存ＴＩＬ産物の開発に成功し、これは、現在のプロセス１Ｃリリース基準と一致するＴＩＬの生存率は＞７０％であり、解凍後の回復が７８～１０３％であることを実証した（表２を参照のこと）。
８．２ 拡大表現型分析（ｒｅ－ＲＥＰ）の役割。分裂刺激に応答して成長する能力（本報告書に示されている実験的なｒｅ－ＲＥＰように）は、ＴＩＬの重要な品質属性である。ここで紹介する実験では、８／９の解凍ＴＩＬ産物が７／９の一致した新鮮ＴＩＬ産物と比較して１週間で＞１００倍拡大培養でき、解凍ＴＩＬ産物と新鮮ＴＩＬ産物の比較可能性を裏付けている（表２）。ＴＩＬの２つの追加の重要な品質特性は、サイトカイン（ＣＤ３／ＣＤ２８／４－１ＢＢ）刺激後にＩＦＮ－γ及び／又はグランザイムＢを遊離させる能力である。新鮮産物及び解凍産物の両方のサイトカイン刺激により、７／９の新鮮産物と全ての解凍産物で２ｎｇ／１０６個の細胞／２４時間を超えるＩＦＮ－γ遊離が生じた（図３５）（本報告書のセクション６．２を参照のこと）。グランザイムＢの遊離（図３６）は、９つの全てのプロセスで観察された。ＣＤ４及びＣＤ８レベル（図３９及び図４０）は、新鮮ＴＩＬ産物及び解凍ＴＩＬ産物の間で顕著な内部一貫性を実証する。更に、代理腫瘍標的細胞株を死滅させるＴＩＬの能力の分析（Ｐ８１５、図５９）は、新鮮ＴＩＬ及び解凍ＴＩＬが同様の細胞傷害能を有することを示した。
８．３ ＴＩＬ代謝ストレス試験は、堅牢な生体エネルギーを明らかにする。ｒｅ－ＲＥＰで刺激された新鮮及び解凍ＴＩＬ産物の代謝プロファイルの分析は、新鮮及び解凍ＴＩＬの両方が代謝ストレス試験に同様に反応し、代謝特性のパネルに実質的な違いを示さなかったことを実証した（表３９）。したがって、凍結保存されたプロセス２ＡのＴＩＬ産物は、本報告書に記載されている同一性、効力、細胞数、及び生存率の４つの品質属性に基づいて、新鮮プロセス１Ｃ産物と同等であると見なすことができる。一致した新鮮細胞と解凍細胞を比較するアッセイは、本報告書で概説した全てのアッセイで非常に同等であった。
８．４ 適合基準：各患者に合わせた個別療法のＴＩＬ産物の固有の不均一性は、以下を反映する：（１）分子を制限する独自の主要組織適合性複合体（ヒト生物学で最も多型の遺伝子産物）；（２）ゲノムの不安定性及びユニークな個々のドライバー及びパッセンジャー変異を伴う腫瘍微小環境で生じる個々の腫瘍のユニークな進化の軌跡；及び（３）ネオエピトープの認識に使用されるＴ細胞受容体を定義する＼／α及び＼／βセグメントの対立遺伝子変異、Ｎ領域の多様性、及びＶＤＪ再配列によって付与される不均一性、及び腫瘍にコードされた産物。したがって、プロセス変更の結果として発生する追加変動を評価することは困難な作業であり、本質的に不均質な材料の「比較可能性」をできる限り確保するため、できるだけ多くのパラメータの評価が必要である。これは、以下の表４０に詳述されているように、実現可能性及び比較可能性に関するいくつかの適合基準を忠実に検査することによって達成された。
表１１に挙げた実施可能性基準に基づいて、ＴＩＬは要件が満たされているか否かで判定される。各実験及び各ＴＩＬ株で全ての個々の基準が満たされた（ｎ＝９）。スチューデントｔ－検定を統計分析に使用した。生存率の尺度はガウス分布ではないため、ノンパラメトリックスチューデントＴ－検定を使用して、％生存率のｐ値を計算した。以下の表４１を参照のこと。
[00803] 表４０に挙げた適合基準に基づいて、新鮮及び凍結ｒｅ－ＲＥＰ ＴＩＬは
要件が満たされているか否かで判定される。（ｒｅ－ＲＥＰの期間は７日間であり、残存照射ＰＢＭＣはＴＩＬと区別できなかったため、生存率は報告していない。）括弧内の数字は、満たされなかった基準を示す。ＣＤ３＋発現を使用して測定された純度基準に基づいて、６／９の新しいＲｅ－ＲＥＰ ＴＩＬ産物は厳しい＞９０％基準を満たし（Ｍ１０６１、Ｍ１０６５及びＥＰ１１００１は満たさなかった）、８／９の解凍産物はＲｅ－ＲＥＰ後も適合基準を満たした。ＥＰ１１００１Ｔの新しいｒｅ－ＲＥＰのＣＤ３＋ ＴＩＬが低数であるのは、Ｔ細胞受容体の極端な発現低下に起因する可能性がある。純度の尺度としてのＣＤ３ ＴＩＬの測定は、Ｍ１０２３Ｔ解凍ｒｅ－ＲＥＰ ＴＩＬについては判定しなかった。このＴＩＬ組成では、純度はＴＣＲａｐ染色を使用して推定され、アスタリスク（＊）で示す。スチューデント－ｔ検定を統計分析に使用した。以下の表４２を参照のこと。
書誌
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９．追加の表
実施例２０：転移性黒色腫の患者に投与される新規凍結保存腫瘍浸潤リンパ球（ＬＮ－１４４）
[00804] 転移性黒色腫患者に投与された新規凍結保存腫瘍浸潤リンパ球（ＬＮ－１４
４）は、多施設第２相臨床試験で有効性と忍容性を実証する。
序論：
[00805] 非凍結保存腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）を用いた養子細胞療法（ＡＣＴ）の
安全性及び有効性は、何百人もの転移性黒色腫患者で研究された。この多施設臨床試験は、非凍結保存及び凍結保存の注入産物として、集中的に製造されたＴＩＬ（ＬＮ－１４４）で開始された。非凍結保存ＬＮ－１４４の新規製造プロセスはコホート１で使用され、短縮された３週間の凍結保存ＬＮ－１４４はコホート２で使用される。コホート２の製造は、患者のスケジューリングと投与の柔軟性を可能にする凍結保存ＴＩＬ産物と相まって、有意的に短いプロセスを提供する。製造プロセスの短縮により、患者がＴＩＬ産物を受け取るまでの待ち時間が短縮され、凍結保存により、物流及び臨床現場への配送が便利になる。
方法：
[00806] Ｃ－１４４－０１は、ＬＮ－１４４を投与された転移性黒色腫患者を評価す
る前向き多施設共同研究である。Ｃｙ／Ｆｌｕプレコンディショニングレジメンによる骨髄非破壊的リンパ球除去の後、患者は１回のＬＮ－１４４注入を受け、その後６回までＩ
Ｌ－２（６００，０００ＩＵ／ｋｇ）の投与を受ける。患者は、最大２４か月の主要エンドポイントとして客観的な応答について判定される。
結果：
[00807] コホート１で使用したのと同じプレ及びポストＴＩＬ注入処置レジメンに従
って、患者の第２のコホート、コホート２（Ｎ＝１０）に投与された凍結保存ＬＮ－１４４を特徴付ける。
[00808] コホート２の患者は、全ての患者が抗ＣＴＬＡ－４及び抗ＰＤ－１療法を受
けており、腫瘍の負担がより大きく（コホート２、１の平均ＳＯＤ：１５．３、１０．９ｃｍ）、以前の株数を増やして重度に前処置された。以前の全身療法の中央値は、コホート２、１でそれぞれ４、３である。安全性データの初期分析は、凍結保存ＬＮ－１４４と同等の忍容性を実証する。凍結保存されていないＬＮ－１４４を投与されたコホート１の患者の安全性プロファイルは、この後期患者集団に対して引き続き許容可能である。頻度によって両方のコホートで観察される最も一般的なＴＥＡＥは、悪心、貧血、発熱性好中球減少症、好中球数の減少、血小板数の減少である。有効性データの早期評価は、コホート２で処置された患者で観察されたＴＩＬ療法に対するＰＲを含む抗腫瘍活性を示す。
結論：
[00809] これは、有意に短いプロセス（約３週間）で凍結保存された自己由来産物の
新規プロセスを評価する、集中的に製造されたＴＩＬを使用した多施設環境での初の臨床試験である。予備的な結果として、凍結保存ＬＮ－１４４が、チェックポイント阻害剤を含む複数の以前の治療に失敗した転移性黒色腫患者の安全で耐容性のある治療選択肢であることが示される。凍結保存ＬＮ－１４４は、患者と介護者により大きな柔軟性を提供し、医学的必要性が高く満たされていない患者に対するより迅速な処置を可能にする。NCT02360579。
実施例２１：２Ａプロセスで使用する無血清培地の評価
[00810] この例実施では、２Ａプロセスで現在使用されている標準ＣＭ１、ＣＭ２、
及びＣＭ４培地の代替としての無血清培地の有効性の評価を示すデータを提供する。この研究では、３つの段階の代替として利用可能な無血清培地（ＳＦＭ）及び無血清代替品の有効性を試験した。
[00811] 段階－１：標準対CTS Optimizer又はPrime T CDM又はXvivo-20無血清培地と
、血清代替物又は血小板溶解物の有無を使用して、ＴＩＬ拡大培養（ｎ＝３）の有効性を比較した。
[00812] 段階－２：G-Rex 5M（ｎ＝３）を使用して、ミニスケール２Ａプロセスで無
血清培地条件の候補を試験した。
背景情報
[00813] プレ及びポストＲＥＰ培養で使用されている現在の培地の組み合わせは効果
的であることが証明されているが、AIM-VではＲＥＰ障害が発生する可能性がある。効果
的な無血清代替物が特定された場合、使用する培地の種類の数を３から１に減らすことで、ＣＭＯで実施するプロセスをより容易且つ単純にすることができる。更に、ＳＦＭは、ヒト血清の使用を排除することにより、外因性疾患の可能性を減らす。この実施例は、２Ａプロセスでの無血清培地の使用を裏付けるデータを提供する。
略称
μｌ マイクロリットル
ＣＭ１，２，４ 完全培地１，２，４
CTS OpTimizer SFM 細胞治療システムOpTimizer無血清培地
ｇ グラム
Ｈｒ 時間
ＩＦＵ 使用説明書
ＩＬ－２ インターロイキン－２サイトカイン
Ｍｉｎ 分
ｍＬ ミリリットル
℃ 摂氏
ＰｒｅＲＥＰ プレ迅速拡大培養プロトコル
ＲＥＰ 迅速拡大培養プロトコル
ＲＴ 室温
ＳＲ 血清補充
ＴＩＬ 腫瘍浸潤リンパ球
実験設計
[00814] プレＲＥＰ及びＲＥＰは、LAB-008で述べたとおり開始された。この３つの段階の実験概要を以下のチャートに示す。
[00815] 上記のチャートで提供されているとおり、このプロジェクトは、２つのステ
ップで無血清培地及び添加物を試験するため詳細に実施された。
[00816] ステップ１：無血清培地提供者の選択。プレＲＥＰ及びポストＲＥＰは、G-Rex２４ウェルプレートで２Ａプロセスを模倣するよう設定された。プレＲＥＰは、G-Rex
２４ウェルプレートの各断片／ウェルを条件ごとに３回又は４回培養することにより開始された。ＲＥＰは、１１日目にG-Rex２４ウェルの４×１０ｅ５ＴＩＬ／ウェルを培養し
て開始し、１６日目に分割し、２２日目に回収した。CTS OpTimizer、X-Vivo 20、及びPrime T-CDMは、プレＲＥＰ及びＲＥＰで使用できる無血清培地の代替候補として使用され
た。CTS Immune SR血清代替品（Life Technologies）又は血小板溶解物血清（ＳＤＢＢ）をＳＦＭに３％加えた。各条件は、プレＲＥＰ及びポストＲＥＰの両方で少なくとも３つの腫瘍で試験し、２Ａプロセスを模倣するように計画された。
[00817] ステップ２：特定された候補者を、プロトコル（ＴＰ－１７－００７）毎に
ミニスケール２Ａプロセスで更に試験した。簡潔に言えば、プレＲＥＰは、条件ごとに２断片／G-Rex 5Mフラスコを３回培養することによって開始された。ＲＥＰは、１１日目に２×１０ｅ６／G-Rex 5Mフラスコを使用して開始され、１６日目に分割され、２２日目に回収された。
[00818] 注記：いくつかの腫瘍は処理され、１実験で複数のパラメータを測定するた
めにセットアップされた。
観察
[00819] 無血清培地を２Ａプロセスで使用される標準と比較した場合、同等又は統計
的に優れた細胞成長の結果が観察された。
[00820] ２Ａプロセスで使用される標準培地で成長したＴＩＬと比較した場合、無血
清培地で成長したＴＩＬから同様の表現型、ＩＦＮ－ｙ産生、及び代謝物分析が観察された。
結果
プレ及びポストＲＥＰ ＴＩＬ拡大培養の無血清培地の有効性を試験する。
[00821] CTS Optimizer + SR（Serum Replacement：血清交換）は、増強したプレＲＥＰ ＴＩＬ拡大培養と同等のＲＥＰ ＴＩＬ拡大培養を示した。CTS OpTimizer、X-Vivo 20、及びPrime T-CDMは、３％ＣＴＳ免疫ＣＴＳ ＳＲの有無にかかわらず追加され、標
準条件に対して試験された。Ｍ１０７９及びＬ４０２６では、CTS OpTimizer + CSR条件
は、標準条件（ＣＭ１、ＣＭ２、ＣＭ４）と比較した場合、プレＲＥＰ ＴＩＬの有意な増強（ｐ＜０．０５）を示した（図６２Ａ）。一方、ＣＳＲを使用しないCTS Optimizer
はプレＲＥＰ ＴＩＬの拡大培養に役立たなかった（付録－１，２、３）。CTS Optimizer + CSRは、試験された３つの腫瘍のうち２つでポストＲＥＰに匹敵するＴＩＬ拡大培養
を示した（図２Ｂ）。X-Vivo 20及びPrime T-CDM条件では、プレ及びポストＲＥＰで大きなばらつきが発生したが、CTS Optimizerは４組の間で比較的一貫性があった。更に、血
小板溶解物を加えたＳＦＭは、標準と比較した場合、プレＲＥＰ及びポストＲＥＰ ＴＩＬの拡大培養を促進しなかった（図６２Ａ）。この調査結果は、当社の標準に匹敵する成長を提供するために血清置換が確かに必要であることを示唆しており、CTS optimizer +CSRが候補となり得る。
[00822] G-Rex 5Mミニスケールで候補条件を試験する（図６４を参照のこと）。
[00823] ポストＲＥＰ ＴＩＬの表現型分析。以下の図６６及び表５６を参照のこと
。
[00824] インターフェロンガンマの比較可能性
[00825] インターフェロンガンマＥＬＩＳＡ（Quantikine）。ＩＦＮ－ｙの産生は、R&D SystemsのQuantikine ELISA kitを使用して測定した。ＣＴＳ＋ＳＲは、標準条件と比較した場合、同量のＩＦＮーｙを産生した。図６７を参照のこと。
実施例２２：Ｔ細胞成長因子カクテルＩＬ－２／ＩＬ－１５／ＩＬ－２１は、腫瘍浸潤Ｔ細胞の拡大培養とエフェクター機能を増強する
[00826] 自己腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）を用いた養子Ｔ細胞療法は、転移性黒色腫
及び子宮頸癌の患者で臨床的有効性を実証している。いくつかの研究では、より良い臨床結果では、注入された細胞の総数及び／又はＣＤ８＋Ｔ細胞の割合と正の相関を示している。現在のほとんどの生産計画では、ＴＩＬの成長を促進するためにＩＬ－２のみを使用している。ＩＬ－１５及びＩＬ－２１を含むレジメンを使用すると、リンパ球の成長が促進されることが報告されている。この研究では、最近診療所で実施された第２のジェネレーションＩＬ－２ ＴＩＬプロトコルにＩＬ－１５及びＩＬ－２１を加えることの前向きな効果について説明する。
材料及び方法
[00827] ＴＩＬを生成するプロセスには、１～３ｍｍ３サイズの腫瘍断片を、ＩＬ－
２を含む培地に配置する、プレ迅速拡大培養プロトコル（プレＲＥＰ：pre-Rapid Expansion Protocol）が含まれる。プレＲＥＰ間に、ＴＩＬは腫瘍断片から移り、ＩＬ－２刺激に応じて拡大培養する。
[00828] ＴＩＬの成長を更に促進するために、ＴＩＬは、照射ＰＢＭＣフィーダー、
ＩＬ－２及び抗ＣＤ３を含む迅速拡大培養プロトコル（ＲＥＰ：Rapid Expansion Protoc
ol）と呼ばれる二次培養期間を通して拡大培養される。この研究では、最終的なＴＩＬ産物の表現型と機能の属性を維持しながらＴＩＬを拡大培養するために、短縮プレＲＥＰ及びＲＥＰ拡大培養プロトコルが開発された。
[00829] この短縮ＴＩＬ産生プロトコルを使用し、ＩＬ－２単独とＩＬ－２／ＩＬ－
１５／ＩＬ－２１の組み合わせの影響を評価した。これらの２つの培養レジメンは、結腸直腸癌、黒色腫、子宮頸癌、トリプルネガティブ乳癌、肺癌及び腎癌から成長したＴＩＬの産生について比較された。プレＲＥＰの完了時に、培養ＴＩＬの拡大率、表現型、機能（ＣＤ１０７ａ＋及びＩＦＮγ）及びＴＣＲ Ｖβレパートリーを評価した。
[00830] プレＲＥＰ培養は、標準ＩＬ－２（６００ＩＵ／ｍＬ）プロトコルを使用し
て、又はＩＬ－２に加えてＩＬ－１５（１８０ＩＵ／ｍＬ）及びＩＬ－２１（ＩＵ／ｍＬ）で開始した。プレＲＥＰの完了時に細胞の拡大を評価した。全体の成長が少なくとも２０％向上した場合、培養はＩＬ－２に比べて拡大が増加していると分類された。黒色腫及び肺癌の表現型及び機能についての研究をここに示す。以下の表５７を参照のこと。
[00831] これらのデータは、肺癌の表現型及び機能の違いに加え、ＩＬ－２単独と比
較してＴＩＬをＩＬ－２／ＩＬ－１５／ＩＬ－２１とともに培養した場合のＴＩＬ産物収量の増加を実証する。
[00832] ＴＩＬの拡大に対するトリプルカクテルの効果は適応症に特異的であり、ほ
とんどの低収量腫瘍に利益をもたらした。
[00833] ＣＤ８＋／ＣＤ４＋Ｔ細胞比は、ＮＳＣＬＣ ＴＩＬ産物での処理により増
加した。
[00834] Ｔ細胞活性は、黒色腫及びＮＳＣＬＣの両方でのＣＤ１０７ａ発現レベルに
よって評価されるように、ＩＬ－１５及びＩＬ－２１をＩＬ－２に加えることにより増強されるようであった。
[00835] ここで提供されるデータは、本願明細書や他の実施例で説明している２Ａプ
ロセスなど、より短く、より堅牢なプロセスを使用したＴＩＬ拡大培養を、ＩＬ－２／ＩＬ－１５／ＩＬ－２１サイトカインカクテルの包含に適応できることを示しており、これにより、特に特定の適応症においてＴＩＬ拡大培養を更に促進する手段を提供する。
[00836] 進行中の実験は、ＴＩＬ機能に対するＩＬ－２／ＩＬ－１５／ＩＬ－２１の
効果を更に評価している。
[00837] 追加の実験では、ＲＥＰ（第１の拡大培養）中のトリプルカクテルの効果を
判定する。
[00838] これらの観察結果は、主流の抗癌療法に必要な幅広い適用性及び可用性を備
えたＴＩＬの大規模な製造に必要なＴＩＬ培養レジメンの最適化及び標準化に特に関連する。
実施例２３：短縮方法で生成された凍結保存ＴＩＬ
背景
[00839] この実施例では、ＬＮ－１４４の凍結保存腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ：Tumor
Iinfiltrating Lymphocyte）産物に関連するデータを提供し、これは、高生産性の商業
生産に適した簡略化された方法で産生され、養子細胞移植（ＡＣＴ：Adoptive Cell Transfer）に適した品質属性を示す。
[00840] 臨床ＴＩＬ産物を産生する既存の方法は、作業者の介入に対して開放的であ
り、それに続く治療産物を産生するためのインキュベーション期間が長くなる。ジェネレーション１プロセスには約６週間かかり、新鮮産物が得られる。その可能性から恩恵を受ける可能性のある全ての患者にＴＩＬ療法をもたらすため、遠方の臨床現場に出荷可能な凍結保存製剤産物を使用した集中型製造に適した、２２日間の短縮培養法、ジェネレーション２が開発された。ジェネレーション２は、商業規模での高生産性製造に適した柔軟性があり、堅牢で、閉鎖的、且つ半自動化された細胞生産プロセスを表す。この方法で産生された製剤産物は、ジェネレーション１プロセスで産生されたものと同等の品質属性を有する。
研究の目的：
[00841] ジェネレーション１（プロセス１Ｃの実施形態）及びジェネレーション２（
プロセス２Ａの実施形態）プロセスによって産生された製剤産物をアッセイし、以下の品質属性に関する比較可能性を判断した。
投与量及び拡大倍数。
Ｔ細胞の純度及びＴ細胞サブセットの割合。
Ｔ細胞サブセット上の共刺激分子の表現型発現。
テロメア反復の平均相対長。
ＴＣＲの再活性化に応答してサイトカインを分泌する能力。
Ｔ細胞受容体の多様性。
ＴＩＬ治療プロセスの概要：
[00842] 抽出：患者のＴＩＬは抑制性腫瘍微小環境から除去される（病変の外科的切
除を介して）
[00843] 拡大培養：ＴＩＬを、ＩＬ－２を含む培養で指数関数的に拡大し、１０９～
１０１１個のＴＩＬを生成した後、患者に注入する
[00844] 調製：患者は、潜在的に抑制性腫瘍微小環境を排除し、ＴＩＬ療法の生着と
効力を最大化するため、ＮＭＡ－Ｄ（骨髄非破壊的リンパ球枯渇、シクロホスファミド：６０ｍｇ／ｋｇ、ＩＶ×２用量及びフルダラビン：２５ｍｇ／ｍ２×５用量）を投与される
[00845] 注入：ＴＩＬの活性化、成長、及び抗腫瘍細胞溶解活性を促進するため、患
者に拡大ＴＩＬ（ＬＮ－１４４）及び高用量のＩＬ－２を短時間（６００，０００Ｉｕ／ｋｇ、最大６回）注入する
分析方法及び計装：
[00846] 用量及び生存率：最終製剤産物をサンプリングし、NC-200自動細胞カウンタ
ーを使用して、アクリジンオレンジ／ＤＡＰＩ対比染色によって判定された全有核細胞、総生細胞、及び生存率についてアッセイした。
[00847] フローサイトメトリー：製剤済製剤産物をサンプリングし、ＦＡＣＳによっ
て同一性をアッセイした。Ｔ細胞の割合は、生細胞のＣＤ４５、ＣＤ３二重陽性集団として判定された。各プロセスの凍結サテライト又はセンチネルバイアルを解凍し、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ２７、ＣＤ２８などの拡大表現型マーカーについてアッセイした。
[00848] テロメア反復の平均相対長：フローＦＩＳＨテクノロジーを使用して、テロ
メアの反復の平均長を測定した。このアッセイは、DAKO（登録商標）Telomere PNA Kit/FITC for Flow Cytometryプロトコルの説明に従って完了した。簡潔に言えば、２×１０６個のＴＩＬ細胞を２×１０６個の１３０１白血病細胞と組み合わせた。ＤＮＡを８２℃で１０分間変性させ、PNA-FITCプローブを暗所で、室温で一晩ハイブリダイズさせた。ヨウ化プロピジウム（Propidium Iodide）を使用して、Ｇ０／１期の細胞を特定した。
[00849] 免疫学的検査：再活性化時にサイトカインを分泌する製剤産物の能力を、ｍ
Ａｂコーティングビーズ（Life Technologies、抗ＣＤ３、抗ＣＤ２８及び抗ＣＤ１３７
）との共培養後に測定した。２４時間後、培養上清を回収し、凍結、解凍し、製造者の指示に従ってQuantikine IFNγ ELISAキット（R&D systems）を使用してＥＬＩＳＡでアッ
セイした。
[00850] Ｔ細胞受容体の多様性：最終製剤産物からのＲＮＡを分離し、ＶＤＪ特異的
プライマーを用いた多重ＰＣＲに供した。ＴＩＬ産物内で発現したＣＤＲ３配列を半定量的に増幅し、ユニークなＴＩＬクローンの頻度及び有病率を判定した。Illumina MiSeqベンチトップシーケンサーで配列決定を実施した。値には、産物内のＴ細胞受容体の相対的な多様性を表すスコアを得るため、インデックスを付した。
結果及び結論：
[00851] 結果を図７５～８１に示す。
[00852] ジェネレーション２プロセスは、ジェネレーション１と同等の品質属性を持
つＴＩＬ産物を産生する。
[00853] ジェネレーション２は、Ｇｅｎ１と比較して同程度のレベルの共刺激分子を
発現するＴ細胞サブセットの同じ割合で構成される、同量の高純度のＴＩＬ産物を産生する。
[00854] ジェネレーション２のＴＩＬは、ＴＣＲ受容体の多様性の上昇を示し、関与
した場合に、サイトカインの強力な分泌を開始する。
[00855] 凍結保存された製剤産物は、重要な物流効率をもたらし、流通の柔軟性を可
能にする。
[00856] 従来のプロセスとは異なり、ジェネレーション２の短縮された２２日間拡大
培養プラットフォームは、治療が緊急に必要な患者の臨床規模の線量を迅速に生成できる、スケーラブル且つ物流上実施可能なＴＩＬ製造プラットフォームを提供する。
[00857] ジェネレーション２のＴＩＬ製造プロトコルは、これまでＴＩＬ療法の幅広
い適用を妨げてきた多くの障壁に対処する。
実施例２４：同種異系フィーダー細胞の範囲を評価する：ＴＩＬ比率１００：１から２５：１まで
[00858] この研究では、プロセス１Ｃで現在利用されているＴＩＬに対する１００：
１の同種異系フィーダー細胞のコントロールに対して、２５：１及び５０：１でＴＩＬの成長を試験した。
[00859] 国立癌研究所の外科部門が発表した研究では、ＲＥＰ（１）の開始時にｃｍ
２あたり５×１０６個の同種異系フィーダー細胞でG-Rex 100フラスコのＴＩＬの最適な
活性化の閾値が示された。これは数学的モデリングを通じて検証されており、同モデルで、単位面積あたりの細胞：細胞接触に最適化されたフィーダー層を使用すると、ＴＩＬの活性化及び拡大への影響は最小限で、ＴＩＬに対する同種異系フィーダー細胞の割合は２５：１に減少することが予測された。
[00860] この研究では、ＲＥＰ開始時に単位面積あたりのフィーダー細胞の最適密度
を確立し、臨床ロットあたりの使用フィーダー細胞の量を減らして正規化するために必要なＲＥＰ開始時の同種異系フィーダー比の有効範囲を検証した。本研究では、固定数のフィーダー細胞で最大２００×１０６個未満の共培養されたＴＩＬを伴うＲＥＰ培養の開始も実証された。
[00861] Ａ．Ｔ細胞の容積（直径１０μｍ）：Ｖ＝（４／３）πｒ３＝５２３．６μ
ｍ３
[00862] Ｂ．高さ４０μｍ（４細胞）のG-Rex 100（Ｍ）の円柱フラスコ：Ｖ＝（４／３）πｒ３＝４×１０１２μｍ３
[00863] Ｃ．円柱フラスコＢを満たすために必要な細胞数：４×１０１２μｍ３／５
２３．６μｍ３＝７．６×１０８μｍ３＊０．６４＝４．８６×１０８
[00864] Ｄ．４Ｄ空間で最適に活性化できる細胞数：４．８６×１０８／２４＝２０
．２５×１０６
[00865] Ｅ．G-Rex 500に外挿されたフィーダー及びＴＩＬの数： ＴＩＬ：１００×
１０６及びフィーダー：２．５×１０９
[00866] 式１。１００ｃｍ２ベースのシリンダー内でＴＩＬを活性化するための正二
十面体ジオメトリを提供するために必要な単核細胞の数の概算。この計算は、ＮＣＩの実験データを厳密に反映したＴ細胞の閾値活性化の約５×１０８の実験結果を導き出す。（１）（Ｃ）乗数（０．６４）は、１９９２年にJaeger及びNagelによって計算された等価
球のランダムデータ密度である（２）。（Ｄ）除数２４は、４次元空間の「ニュートン数」（３）で同様のオブジェクトに接触する可能性のある等価球の数である。
参照資料
[00867] (1) Jin, Jianjian, et.al., Simplified Method of the Growth of Human Tumor Infiltrating Lymphocytes (TIL) in Gas-Permeable Flasks to Numbers Needed for Patient Treatment.J Immunother.2012 Apr; 35(3):283-292。
[00868] (2) Jaeger HM, Nagel SR.Physics of the granular state.Science.1992 Mar 20;255(5051):1523-31。
[00869] (3) O. R.Musin (2003).“The problem of the twenty-five spheres”.Russ.Math.Surv.58 (4):794-795。
実施例２５：ＴＩＬ産物の主要品質属性の研究
背景
[00870] 自己腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）を用いた養子Ｔ細胞療法は、転移性黒色腫
及びその他の癌患者で臨床的有効性を実証している１～３。
[00871] 臨床研究のほとんどの報告が、製品の有効性及び／又は安全性に関連する可
能性のある無菌性、同一性、純度、及び効力などの品質属性を特定することを目的とした、注入されたＴＩＬ産物の探索的分析を含んでいる。４,５
[00872] ここでは、ＴＩＬの商業生産で使用するための将来の品質管理プラットフォ
ームに貢献する可能性があるＴＩＬ産物の３つの主要な製品パラメータの評価を示す。
ＴＩＬ治療プロセスの概要
[00873] １．腫瘍が患者から切除され、ＧＭＰ製造施設に運ばれた。
[00874] ２．到着すると、腫瘍は断片化され、プレ迅速拡大培養プロトコル（ＲＥＰ
）のためにＩＬ－２とともにフラスコに入れられる。
[00875] ３．プレＲＥＰ ＴＩＬは、照射ＰＢＭＣ、抗ＣＤ３抗体（３０ｎｇ／ｍＬ
）、及びＩＬ－２（３０００ＩＵ／ｍＬ）の存在下で、ＲＥＰプロトコルで更に成長された。
[00876] ４．ＴＩＬ産物製品は、次を含む重要品質属性について評価された：（１）
同一性（２）純度、及び（３）効力。
[00877] ５．拡大培養ＴＩＬ（ＬＮ－１４４）の注入前に、患者はシクロホスファミ
ド及びフルダラビンからなる骨髄非破壊的リンパ球枯渇療法を受けた。ＴＩＬの注入後、移植されたＴＩＬの成長及び生着のサポートのため、患者は短期間（最大６回用量）の高用量ＩＬ－２（６００，０００ＩＵ／ｋｇ）を受けた。
研究の目的
[00878] 目標：ＴＩＬ産物の同一性、純度、及び効力を完全に特徴付けることにより
、（ａ）重要品質属性の定義を導き、（ｂ）ＴＩＬ産物の商業生産で実装される正式なリリース基準の確立をサポートする。
[00879] 戦略：ＴＩＬ産物の特性評価をサポートするため、以下の分析手法を開発す
る。特に、以下の方法を実施した：同一性及び純度評価のためのフローサイトメトリーによる表現型分析、純度測定のための残留腫瘍細胞検出アッセイ、及び効力評価のためのインターフェロンガンマ遊離アッセイ。
材料及び方法
同一性及び純度
[00880] 表現型の特徴付け：ＴＩＬ産物は、抗ＣＤ４５、抗ＣＤ３、抗ＣＤ８、抗Ｃ
Ｄ４、抗ＣＤ４５ＲＡ、抗ＣＣＲ７、抗ＣＤ６２Ｌ、抗ＣＤ１９、抗ＣＤ１６、及び抗ＣＤ５６抗体で染色され、Ｔ及び非Ｔ細胞サブセットの定量化のためフローサイトメトリーにより分析された。
純度
[00881] 残存腫瘍検出アッセイ：ＴＩＬ産物は、抗ＭＣＳＰ（黒色腫関連コンドロイ
チン硫酸プロテオグリカン（melanoma-associated chondroitin sulfate proteoglycan））及び抗ＣＤ４５抗体、Live/Dead fixable Aqua色素で染色され、その後、黒色腫細胞の検出のためにフローサイトメトリーで分析された。混入対照を使用して、腫瘍検出の精度を評価し、データ分析のゲーティング基準を確立した。
効力
[00882] ＩＦＮγ遊離アッセイ：ＴＩＬ産物を抗ＣＤ３／ＣＤ２８／ＣＤ１３７コー
ティングビーズで１８～２４時間再刺激した後、ＥＬＩＳＡアッセイを使用してＩＦＮγ
分泌の評価のために上清を回収した。
結果
[00883] 同一性：黒色腫ＴＩＬ産物の大部分（＞９９％）は、ＣＤ４５＋ＣＤ３＋細
胞で構成されていた
[00884] 図８６Ａ～８６Ｃは、１０色フローサイトメトリーアッセイを使用したＴＩ
Ｌ産物の表現型の特性評価を示す。（Ａ）Ｔ細胞及び非Ｔ細胞サブセットの割合は、それぞれＣＤ４５＋ＣＤ３＋及びＣＤ４５－（非リンパ球）／ＣＤ４５＋ＣＤ３－（非Ｔ細胞リンパ球）によって定義された。全体として、検定されたＴＩＬ産物の＞９９％がＴ細胞（ＣＤ４５＋ＣＤ３＋）で構成されていた。示されているのは、ＴＩＬ産物の平均である（ｎ＝１０）。（Ｂ）ＣＤ４５＋ＣＤ３＋ＣＤ８＋（青い白抜きの丸）及びＣＤ４５＋ＣＤ３＋ＣＤ４＋（ピンクの白抜きの丸）を含む２つのＴ細胞サブセットの割合。スチューデントの非対Ｔ検定を使用しても、両方のサブセットの割合に統計的な差は認められなかった（Ｐ＝０．６８）。（Ｃ）非Ｔ細胞集団は、以下を含む４つの異なるサブセットで特徴付けられた。１）非リンパ球（ＣＤ４５－）、２）ＮＫ細胞（ＣＤ４５＋ＣＤ３－ＣＤ１６＋／５６＋）、３）Ｂ細胞（ＣＤ４５＋ＣＤ１９＋）、及び４）非ＮＫ／Ｂ細胞（ＣＤ４５＋ＣＤ３－ＣＤ１６－ＣＤ５６－ＣＤ１９－）。
[00885] 同一性：黒色腫ＴＩＬ産物の大部分は、Ｔ細胞の細胞傷害機能に関連するエ
フェクター又はメモリーＴ細胞の表現型を示した。
[00886] 図８７Ａ及び８７Ｂは、ＣＤ４５＋ＣＤ３＋ＣＤ４＋及びＣＤ４５＋ＣＤ３
＋ＣＤ８＋細胞集団のＴ細胞サブセットの特徴付けを示す。ナイーブ、セントラルメモリー（ＴＣＭ）、エフェクターメモリー（ＴＥＦ）、及びエフェクターメモリーＲＡ＋（ＥＭＲＡ）Ｔ細胞サブセットは、ＣＤ４５ＲＡ及びＣＣＲ７を使用して定義された。図８７Ａ及び８７Ｂは、ＣＤ４＋（Ａ）、及びＣＤ８＋（Ｂ）の両方の細胞集団における１０の最終ＴＩＬ産物からの代表的なＴ細胞サブセットを示す。エフェクターメモリーＴ細胞サブセット（青い白抜き丸）は、最終ＴＩＬ産物のＣＤ４＋及びＣＤ８＋サブセットの両方で主要な集団（＞９３％）であった。ＴＩＬ産物の７％未満の細胞がセントラルメモリーサブセットであった（ピンクの白抜き丸）。ＥＭＲＡ（灰色の白丸）及びナイーブ（黒の白丸）サブセットは、ＴＩＬ産物でほとんど検出されなかった（＜０．０２％）。ｐ値は、スチューデントの対になっていないＴ検定を使用したＥＭ及びＣＭの差を表す。
[00887] 純度：ＭＣＳＰは、純度アッセイに適したメラノーマ腫瘍マーカーである。
[00888] 図８８Ａ及び８８Ｂは、黒色腫腫瘍細胞におけるＭＣＳＰ及びＥｐＣＡＭ発
現の検出を示す。黒色腫腫瘍細胞株（ＷＭ３５、５２６、及び８８８）、患者由来の黒色腫細胞株は、本明細書に記載された方法に従って生成され（１０２８、１０３２、及び１０４１）、結腸直腸腺腫がん細胞株（陰性対照としてＨＴ２９）は、ＭＣＳＰ（黒色腫（コンドロイチン硫酸プロテオグリカン）及びＥｐＣＡＭ（上皮細胞接着分子）マーカーにより特徴付けられた。（Ａ）黒色腫腫瘍細胞の平均９０％がＭＣＳＰを発現した。（Ｂ）ＥｐＣＡＭ＋腫瘍細胞株である陽性対照ＨＴ２９と比較して、黒色腫腫瘍細胞株ではＥｐＣＡＭ発現は検出されなかった。
[00889] 純度：ＴＩＬ産物中の残留腫瘍細胞を検出するためのフローサイトメトリー
ベースのアッセイの開発。
[00890] 図８９Ａ及び８９Ｂは、腫瘍検出精度を決定するための混入対照の検出を示
す。アッセイは、既知量の腫瘍細胞をＰＢＭＣ懸濁液（ｎ＝１０）に混入させることによ
って実施された。ＭＣＳＰ＋５２６黒色腫腫瘍細胞を１：１０、１：１００、及び１：１，０００の比率で希釈し、その後ＰＢＭＣと混合し、抗ＭＣＳＰ及び抗ＣＤ４５抗体と生／死染料で染色し、フローサイトメトリーで分析した。（Ａ）約３０００、３００、及び３０の細胞がそれぞれ１：１０、１：１００、及び１：１０００の希釈で検出された。（Ｂ）各条件で取得された細胞の平均（ＡＶ）及び標準偏差（ＳＤ）を使用して、基準の上限及び下限を定義した。
[00891] 純度：混入対照を使用した残留腫瘍検出アッセイの適格性
[00892] 図９０Ａ及び９０Ｂは、混入対照の上限と下限の再現性研究を示す。混入ア
ッセイの再現性を決定するため、３つの独立した実験を３回繰り返し実施した。（Ａ）ＭＣＳＰ＋で検出された腫瘍細胞の数は、一貫して基準の上限から下限の範囲内であった。（Ｂ）線形回帰図は、ＭＣＳＰ＋細胞及び混入希釈（Ｒ２＝０．９９）の相関関係を示しており、黒実線が最適値を実証する。緑色と灰色の破線は、それぞれ標準曲線及び試料（Ｅｘｐ＃１～３）の９５％の予測限界を表す。
[00893] 純度：メラノーマ腫瘍細胞の混入物は、最終ＴＩＬ産物のアッセイ検出限界
を下回っていた。
[00894] 図９１Ａ及び９１Ｂは、ＴＩＬ産物中の残存黒色腫腫瘍の検出を示す。ＴＩ
Ｌ産物を、開発されたアッセイを使用して残った腫瘍汚染について評価した（ｎ＝１５）。検出可能なＭＣＳＰ＋事象の中央値及び割合は、それぞれ２及び０．０００２％であった。
[00895] 効力：ＴＩＬによるＩＦＮγの分泌（一貫して＞１０００ｐｇ／ｍｌ）は、
ＴＩＬ産物のエフェクター機能を実証した。
[00896] 図９２は、Ｔ細胞活性化後のＴＩＬ産物の効力評価を示す。ＥＬＩＳＡで重
複して評価されたＴＩＬ産物中の抗ＣＤ３／ＣＤ２８／ＣＤ１３７による再刺激後のＩＦＮγ分泌（ｎ＝５）。ＴＩＬ産物によるＩＦＮγの分泌は、ウィルコクソンの符号付き順位検定を使用した非刺激対照よりも有意に高く（Ｐ＝０．０２）、一貫して＞１０００ｐｇ／ｍｌであった。２００ｐｇ／ｍｌより大きいＩＦＮγ分泌は効力があると考えられている。ｐ値＜０．０５は統計的に有意と見なされた。
結論：
[00897] ＴＩＬ産物の同一性、純度、及び効力の主要な製品パラメータが判定された
。本明細書に記載の方法に従って製造されたＴＩＬ産物は、９９％を超えるＣＤ４５＋ＣＤ３＋Ｔ細胞で構成されていた。ＣＤ４＋及びＣＤ８＋ＴＩＬ産物の大部分は、Ｔ細胞の細胞傷害機能に関連するエフェクターメモリー表現型を示した。最終的なＴＩＬ産物中の汚染黒色腫腫瘍細胞を検出するフローサイトメトリーに基づいたアッセイの開発と認定に成功した。このアッセイを適用すると、最終ＴＩＬ産物中の汚染黒色腫腫瘍細胞がアッセイ検出の限界を下回ることが示された。抗ＣＤ３／ＣＤ２８／ＣＤ１３７再刺激後の最終ＴＩＬ産物によるＩＦＮγ分泌は、市販のＴＩＬの効力アッセイとして働く可能性がある。これらのデータは、ＴＩＬ産物の商業生産のための重要品質属性のさらなる開発をサポートする品質管理プラットフォームの基盤を提供する。
実施例２６：高生産性の商業生産に適した簡略化された方法で産生された凍結保存ＴＩＬ産物は、養子細胞移植に適した品質属性を示す。
背景
[00898] 養子細胞移植（ＡＣＴ）のために腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）を産生する旧
知の方法には、新鮮（凍結保存されていない）注入産物を得るための複数のインビボインキュベーションステップが含まれる。
[00899] 第１の世代（Ｇｅｎ１）プロセスでは、約６週間で新鮮ＴＩＬが投与された
。エキソビボでの培養期間を２２日に短縮する第２の世代（Ｇｅｎ２）ＴＩＬ製造プロセスが開発された（図９３）。
[00900] Ｇｅｎ２プロセスは、集中型製造に適しており、凍結保存ＴＩＬ注入産物を
産生し、臨床現場に対するスケジュール、物流、及び配送に便宜性をもたらす。Ｇｅｎ２プロセスによって製造されたＬＮ－１４４の凍結保存ＴＩＬ注入産物は、Ｇｅｎ１方法によって産生されたＴＩＬの凍結保存されていないＴＩＬ注入産物と同等の品質属性を有する。Ｇｅｎ２ＴＩＬ製造方法は、商業規模での高生産性ＴＩＬ製造に適した柔軟性があり、堅牢で、閉鎖的、且つ半自動化された細胞生産プロセスを表す。
研究の目的
[00901] Ｇｅｎ１及びＧｅｎ２の製造プロセスで産生されたＴＩＬ注入産物を評価し
、以下の品質属性の観点から比較可能性を判断した。（１）細胞数（用量）、生存率、ＲＥＰ期の成長率、（２）Ｔ細胞サブセット上の共刺激分子のＴ細胞純度及び表現型発現、（３）テロメア反復の平均相対長さ、（４）ＣＤ３、ＣＤ２８、ＣＤ１３７関与に応答してＩＦＮγを分泌する能力、及び（５）最終注入産物に存在するＴ細胞受容体の多様性（図９４）。
分析方法及び計装
[00902] 細胞数及び生存率：最終製剤注入産物をサンプリングし、NC-200自動細胞カ
ウンターを使用して、アクリジンオレンジ／ＤＡＰＩ対比染色によって判定された全有核細胞、総生細胞、及び生存率についてアッセイした。プロセス開発ロットは、アクリジンオレンジ／プロピジウムヨード（propidium iodine）デュアル蛍光染色を使用して、Nexcellom Cellometer K2セルバイアビリティーカウンターでアッセイした。
[00903] 表現型マーカー：製剤された注入産物をサンプリングし、免疫蛍光染色によ
り同一性をアッセイした。Ｔ細胞の割合は、生細胞のＣＤ４５＋、ＣＤ３＋（二重陽性）集団として判定された。各プロセスの凍結サテライト又はセンチネルバイアルを解凍し、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ２７、ＣＤ２８などの拡大表現型マーカーについてアッセイした。BD FACS Canto IIで新鮮な注入産物を取得し、Bio-Rad ZE5セルアナライザーで
解凍した注入産物の拡大表現型マーカーを取得した。
[00904] テロメア反復の平均相対長：フローＦＩＳＨテクノロジーを使用して、テロ
メアの反復の平均長を測定した。このアッセイは、DAKO（登録商標）Telomere PNA Kit/FITC for Flow Cytometryプロトコルの説明に従って完了した。簡潔に言えば、２．０×１０６個のＴＩＬ細胞を２．０×１０６個のヒト細胞株（１３０１）白血病Ｔ細胞と組み合わせた。ＤＮＡを８２℃で１０分間変性させ、PNA-FITCプローブを暗所で、室温で一晩ハイブリダイズさせた。ヨウ化プロピジウム（Propidium Iodide）を使用して、Ｇ０／１期の細胞を特定した。
[00905] 免疫機能：再活性化時にＩＦＮγを分泌する注入産物の能力を、抗体コーテ
ィングビーズ（Life Technologies、抗ＣＤ３、抗ＣＤ２８及び抗ＣＤ１３７）との共培
養後に測定した。２４時間後、培養上清を回収し、凍結、解凍し、製造者の指示に従ってQuantikine IFNγ ELISAキット（R&D systems）を使用してＥＬＩＳＡでアッセイした。
[00906] Ｔ細胞受容体の多様性：注入産物からのＲＮＡを分離し、ＶＤＪ特異的プラ
イマーを用いた多重ＰＣＲに供した。ＴＩＬ産物内で発現したＣＤＲ３配列を半定量的に増幅しディープシーケンスして、ユニークなＴＩＬクローンの頻度及び有病率を判定した。Illumina MiSeqベンチトップシーケンサーで配列決定を実施した。値には、産物内のＴ細胞受容体の相対的な多様性を表すスコアを得るため、インデックスを付した。
結果
[00907] ２２日目に、洗浄及び製剤化の前に培養細胞の性能を決定するため、容積が
減少した細胞産物をプールしてサンプリングした。図９５Ａ～９５Ｃは、総生細胞、成長率、及び生存率を示す。（Ａ）試料は、前述のようにNC-200自動セルカウンターで分析された。総生細胞密度は、４つの独立した試料からの重複カウントの総平均によって決定される。Ｇｅｎ２プロセスでは、Ｇｅｎ１（Ｇｅｎ１の平均＝４．１０×１０１０±２．８×１０１０、Ｇｅｎ２の平均＝４．１２×１０１０±２．５×１０１０）と同様の用量のＴＩＬ産物が産生された。（Ｂ）ＲＥＰ段階の成長率が計算された。（Ｃ）前述のように、Cellometer K2を使用して、９つのプロセス開発ロットから細胞生存率を評価した。製
剤化された産物の単一の凍結融解サイクルの後、細胞生存率の有意な減少は観察されなかった。解凍及びサンプリング時の生存率の平均低下は２．１９％であった。
[00908] 図９６Ａ～９６Ｃは、Ｇｅｎ２産物は、Ｇｅｎ１と同等のレベルで共刺激分
子を発現する高純度のＴ細胞培養物であることを示す。（図９６Ａ）遊離のためのフローサイトメトリーにより、新鮮な調剤済製剤産物を同一性のためにアッセイした。Ｇｅｎ１及びＧｅｎ２プロセスは、ＣＤ４５＋、ＣＤ３＋（二重陽性）表現型で定義される高純度のＴ細胞培養物を産生する。（図９６Ｂ及び９６Ｃ）調剤済製剤産物の凍結保存サテライトのバイアルを解凍し、前述のようにフローサイトメトリーにより拡大培養表現型についてアッセイした。Ｇｅｎ１及びＧｅｎ２産物は、Ｔ細胞サブセット上で同レベルの共刺激分子ＣＤ２７及びＣＤ２８を発現した。ＣＤ２７及びＣＤ２８などの共刺激分子は、Ｔ細胞受容体の関与時にエフェクター細胞の成長に必要な二次及び三次シグナルを供給するために必要でる場合がある。Ｐ値は、Mann-Whitneyの「ｔ」検定を使用して計算された。
[00909] 図９７は、Ｇｅｎ２産物がより長い相対テロメア長に向かう傾向を示してい
る。長さ。フローＦＩＳＨテクノロジーを使用して、前述のようにテロメアの反復の平均長を測定した。ＲＴＬ値は、対照細胞株のＧｅｎ１の染色体／ゲノムあたりの平均テロメア蛍光が７．５％±２．１％であり、Ｇｅｎ２が染色体／ゲノムあたりのテロメア蛍光が８．４％±１．８％であることを示す（１３０１白血病細胞株）。データは、Ｇｅｎ２産物が、平均してＧｅｎ１産物と同等のテロメア長を有していることを示す。テロメア長は、エキソビボ細胞培養物の長さの代替測定値である。
[00910] 図９８は、Ｇｅｎ２製剤産物は、ＣＤ３、ＣＤ２８、及びＣＤ１３７の関与
に応じてＩＦＮγを分泌することを示す。凍結保存製剤産物を解凍し、前述のように抗体コーティングビーズと共にインキュベートした。データは、２４時間で５×１０５個の生存細胞によって産生されるＩＦＮγの量として表される。Ｇｅｎ２製剤産物は、Ｇｅｎ１製剤産物と比較して、再活性化時にＩＦＮγを産生する能力の増加を示した。製剤産物が再活性化され、サイトカインを分泌する能力は、ＨＬＡのコンテキストで同種抗原にＴＣＲが結合した際のインビボ機能の代替手段である。
[00911] 図９９Ａ及び９９Ｂは、Ｇｅｎ２製剤産物のユニークＴ細胞受容体の多様性
が増加していることを示す。Ｔ細胞受容体の多様性は以下のように評価された。Ｇｅｎ１及びＧｅｎ２からの１０×１０６個のＴＩＬからのＲＮＡをアッセイして、各製品に存在するユニークＣＤＲ３配列の総数と頻度を決定した。（図９９Ａ）固有のＣＤＲ３配列には、産物内のＴ細胞受容体の全体的な多様性を表すスコアを得るため、各産物における頻度に対してインデックスを付した。（図９９Ｂ）各注入製品に存在するユニークなＣＤＲ
３配列の平均総数。両方のプロセスのＴＩＬ産物は、異なる抗原特異性と結合活性を持つＴ細胞のポリクローナル集団で構成されていた。総Ｔ細胞レパートリーの幅は、腫瘍細胞上に現れる作用可能なエピトープの数の指標である場合がある。
結論
[00912] Ｇｅｎ２の製造プロセスでは、Ｇｅｎ１と同等の品質特性を持つＴＩＬ注入
産物（ＬＮ－１４４）が産生された。Ｇｅｎ２は、同様の用量の高純度ＴＩＬを産生した。Ｔ細胞サブセットは同様の割合であり、Ｇｅｎ１と比較して同程度のレベルで共刺激分子を発現した。Ｇｅｎ２ＴＩＬは、エキソビボでの培養期間の短縮に対応し、相対テロメア長が長くなる傾向があった。Ｇｅｎ２ＴＩＬは、ＴＣＲ受容体の多様性の増加を示し、関与すると、細胞溶解性エフェクター機能の尺度であるＩＦＮ－γの強力な分泌を開始した。即ち、Ｇｅｎ２の、凍結保存注入産物を伴う短縮された２２日間閉鎖拡大培養プロセスは、新規の療法選択肢が直ちに必要な癌患者の臨床規模の線量を迅速に生成できる、スケーラブル且つ物流上実施可能なＴＩＬ製造プラットフォームを提供する。
参照資料
[00913] 1Dudley,M.E.et al.Adoptive cell transfer therapy following non-myeloablative but lymphodepleting chemotherapy for the treatment of patients with refractory metastatic melanoma.J Clin Oncol 23,2346-2357,doi:10.1200/JCO.2005.00.240(2005).
[00914] 2Chandran,S.S.et al.Treatment of metastatic uveal melanoma with adoptive transfer of tumour-infiltrating lymphocytes:a single-centre,two-stage,single-arm,phase 2 study.Lancet Oncol,doi:10.1016/S1470-2045(17)30251-6(2017).
[00915] 3Stevanovic,S.et al.Complete regression of metastatic cervical cancer
after treatment with human papillomavirus-targeted tumor-infiltrating T cells.J
Clin Oncol 33,doi:10.1200/jco.2014.58.9093(2015).

[00916] 4FDA Reviewers and Sponsors:Content and Review of Chemistry,Manufacturing,and Control(CMC)Information for Human Gene Therapy Investigational New Drug
Applications (INDs),21 CFR 610.3(r),2008.
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実施例２７：Ｔ細胞成長因子カクテルＩＬ－２／ＩＬ－１５／ＩＬ－２１は、本明細書に記載された新規のプロセスで腫瘍浸潤Ｔ細胞の拡大培養及びエフェクター機能を増強した背景
[00918] 自己ＴＩＬを用いた養子Ｔ細胞療法は、転移性黒色腫及び子宮頸癌の患者で
臨床的有効性を実証している。いくつかの研究では、より良い臨床結果では、注入された細胞の総数及び／又はＣＤ８＋Ｔ細胞の割合と正の相関を示している。現在のほとんどの生産計画では、ＴＩＬの成長を促進するためにＩＬ－２のみを使用している。ＩＬ－１５及びＩＬ－２１を含むレジメンを使用すると、リンパ球の成長が促進されることが報告されている。この研究では、プロセス２Ａ及びジェネレーション２のＴＩＬ製造プロセスの実施形態にＩＬ－１５及びＩＬ－２１を追加することのプラスの効果と相乗効果について説明する。
本明細書に記載の新規プロセスを使用したＴＩＬの産生
[00919] 腫瘍が患者から切除され、研究目的でＧＭＰ製造施設又は研究室に運ばれる
。到着すると、腫瘍は断片化され、プレ迅速拡大培養プロトコル（プレＲＥＰ）のためにＩＬ－２とともにフラスコに１１日間入れられた。トリプルカクテル研究では、プレＲＥ
Ｐの開始時にＩＬ－２、ＩＬ－１５、及びＩＬ－２１（ＩＬ－２／ＩＬ－１５／ＩＬ－２１）が追加される。迅速拡大培養プロトコル（ＲＥＰ）の場合、ＴＩＬは更に１１日間のＲＥＰ拡大培養のためにフィーダー及び抗ＣＤ３で培養された（図１００）。
材料及び方法
[00920] ＴＩＬを生成するプロセスには、１～３ｍｍ３サイズの腫瘍断片を、ＩＬ－
２を含む培地に配置する、プレ迅速拡大培養プロトコル（プレＲＥＰ）が含まれた。プレＲＥＰ間に、ＴＩＬは腫瘍断片から移り、ＩＬ－２刺激に応じて拡大培養した。
[00921] ＴＩＬの成長を更に促進するために、ＴＩＬは、照射ＰＢＭＣフィーダー、
ＩＬ－２及び抗ＣＤ３抗体を含む迅速拡大培養プロトコル（ＲＥＰ）と呼ばれる二次培養期間を通して拡大培養された。最終的なＴＩＬ産物の表現型と機能の属性を維持しながらＴＩＬを拡大培養するために、短縮プレＲＥＰ及びＲＥＰ拡大培養プロトコルが開発された。この短縮ＴＩＬ生成プロトコルを使用し、プレＲＥＰステップに加えられるＩＬ－２単独とＩＬ－２／ＩＬ－１５／ＩＬ－２１の組み合わせの影響を評価した。これらの２つの培養レジメンは、結腸直腸癌、黒色腫、子宮頸癌、トリプルネガティブ乳癌、肺癌及び腎癌から成長したＴＩＬの生成について比較された。プレＲＥＰの完了時に、培養ＴＩＬの拡大率、表現型、機能（ＣＤ１０７ａ＋及びＩＦＮγ）及びＴＣＲ Ｖβレパートリーを評価した。
[00922] 本研究は、複数の腫瘍組織におけるＩＬ－２／ＩＬ－１５／ＩＬ－２１によ
るプレＲＥＰ中の拡大培養の亢進を示す。プレＲＥＰ培養は、標準ＩＬ－２（６０００ＩＵ／ｍＬ）プロトコルを使用して、又はＩＬ－２に加えてＩＬ－１５（１８０ＩＵ／ｍＬ）及びＩＬ－２１（１ＩＵ／ｍＬ）で開始した（図１０１）。プレＲＥＰの完了時に細胞の拡大を評価した。全体の成長が少なくとも２０％向上した場合、培養はＩＬ－２に比べて拡大が増加していると分類された。黒色腫及び肺癌の表現型及び機能研究については、以下の段落で更に考察する（図１０１の太字）。
[00923] ＩＬ－２／ＩＬ－１５／ＩＬ－２１は、肺癌ではＣＤ８＋細胞の割合を増加
させたが、黒色腫では増加しなかった。図１０２Ａ及び１０２Ｂにおいて、（Ａ）黒色腫由来のＴＩＬ（ｎ＝４）、及び（Ｂ）肺（ｎ＝７）は、ポストプレＲＥＰのフローサイトメトリーを使用して、ＣＤ４＋及びＣＤ８＋細胞の表現型を評価した。ｐ値は、スチューデントの非対応ｔ検定を使用した条件におけるＩＬ－２及びＩＬ－１２／ＩＬ－１５／ＩＬ－２１の差を表す。
[00924] ＣＤ２７の発現は、ＩＬ－２／ＩＬ－１５／ＩＬ－２１で処理した培養物の
ＣＤ８＋細胞でわずかに亢進した。図１０３Ａ及び１０３Ｂにおいて、（Ａ）黒色腫由来のＴＩＬ（ｎ＝４）、及び（Ｂ）肺（ｎ＝７）は、ポストプレＲＥＰのフローサイトメトリーを使用して、ＣＤ４＋及びＣＤ８＋細胞のＣＤ２７＋及びＣＤ２８＋の表現型を評価した。養子Ｔ細胞療法の結果と相関しているより若い表現型に関連する細胞マーカーであるＣＤ２７の発現は、ＩＬ－２／ＩＬ－１５／ＩＬ－２１対ＩＬ－２単独の培養に由来するＣＤ８＋ＴＩＬでわずかに増強された。
[00925] Ｔ細胞サブセットは、ＩＬ－１５／ＩＬ－２１の添加では変化しなかった。
図１０４Ａ及び１０４Ｂにおいて、ＴＩＬは、（Ａ）黒色腫（ｎ＝４）からのＣＤ８＋及びＣＤ４＋（データに示さず）のエフェクター／メモリーサブセット（ＣＤ４５ＲＡ及びＣＣＲ７）、及びフローサイトメトリーポストプレＲＥＰを介して（Ｂ）肺（ｎ＝８）の表現型で評価された。ＴＥＭ＝エフェクターメモリー（ＣＤ４５ＲＡ－、ＣＣＲ７－）、ＴＣＭ＝セントラルメモリー（ＣＤ４５ＲＡ－、ＣＣＲ７＋）、ＴＳＣＭ＝幹細胞様メモリー（ＣＤ４５ＲＡ＋、ＣＣＲ７＋）、ＴＥＭＲＡ＝エフェクターＴ細胞（ＣＤ４５ＲＡ
＋、ＣＣＲ７－）。
[00926] ＴＩＬの機能的能力は、ＩＬ－２／ＩＬ－１５／ＩＬ－２１で差別的に強化
された。図１０５Ａ及び１０５Ｂにおいて、（Ａ）黒色腫（ｎ＝４）及び（Ｂ）肺（ｎ＝５）に由来するＴＩＬを、ＣＤ４＋及びＣＤ８＋細胞における４時間のＰＭＡ刺激に応答したＣＤ１０７ａ＋発現について、フローサイトメトリーにより評価した。（Ｃ）黒色腫及び肺に由来するプレＲＥＰ ＴＩＬを可溶性抗ＣＤ３抗体で２４時間刺激し、上清をＥＬＩＳＡによりＩＦＮγについて評価した。
[00927] ＴＣＲｖβレパートリーの相対頻度は、肺癌ではＩＬ－２／ＩＬ－１５／Ｌ
－２１に応答して変化したが、黒色腫では変化しなかった。図１０６Ａ及び１０６Ｂにおいて、ＴＣＲｖβレパートリー（２４の特異性）は、フローサイトメトリー用のBeckman Coulterキットを使用して、（Ａ）黒色腫及び（Ｂ）肺腫瘍に由来するＴＩＬで評価され
た。
概要
[00928] この研究は、表現型及び機能特性に影響を与えることに加え、ジェネレーシ
ョン２プロセスでＩＬ－２単独（＞２０％）と比較してＴＩＬ数を高めるＩＬ－２／ＩＬ－１５／ＩＬ－２１カクテルの能力を実証する。
[00929] ＴＩＬの拡大培養に対するトリプルカクテルの効果は、組織学に依存するも
のであった。ＣＤ８＋／ＣＤ４＋Ｔ細胞比は、肺腫瘍にＩＬ－２／ＩＬ－１５／ＩＬ－２１を加えることで増加した。ＩＬ－１５及びＩＬ－２１の添加により、肺腫瘍由来のＴＩＬでのＣＤ１０７ａ発現及びＩＦＮγ産生が増強された。ＩＬ－２／ＩＬ－１５／ＩＬ－２１を追加すると、肺のＴＣＲｖβレパートリーが変化した。ジェネレーション２ＴＩＬ拡大培養プロセスは、ＩＬ－２／ＩＬ－１５／ＩＬ－２１サイトカインカクテルを包含するために使用され、それにより肺及び結腸直腸腫瘍などの特定の腫瘍組織におけるＴＩＬ拡大培養を更に促進する手段を提供した。これらの観察結果は、主流の抗癌療法に必要な幅広い適用性及び可用性を備えたＴＩＬの大規模な製造に必要なＴＩＬ培養レジメンの最適化及び標準化に特に関連する。
実施例２８：転移性黒色腫患者に投与された新規凍結保存腫瘍浸潤リンパ球（ＬＮ－１４４）は、多施設第２相臨床試験で有効性と忍容性を実証した
背景
[00930] 腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）を利用した養子細胞療法（ＡＣＴ）の安全性及
び有効性は、何百人もの転移性黒色腫患者で研究され、有意且つ永続的な客観的応答率（ＯＲＲ）を実証している。１進行中のフェーズ２試用では、ＴＩＬの集中ＧＭＰ製造を利用するＣ－１４４－０１が、非凍結保存ジェネレーション１（Ｇｅｎ１）及び凍結保存ジェネレーション２（Ｇｅｎ２）ＴＩＬ製造プロセスの両方を評価した。
[00931] Ｇｅｎ１は、製造期間が約５～６週間（Ｃ－１４４－０１研究のコホート１
で投与）であるのに対し、Ｇｅｎ２は、製造期間が２２日間である（プロセス２Ａ、Ｃ－１４４－０１研究のコホート２で投与）。Ｇｅｎ１のＬＮ－１４４製造製品を注入したコホート１患者からの予備データは、ＴＩＬ療法が応答を生じたため、ポストＰＤ－１の転移性黒色腫患者の処置に有望であった。２Ｇｅｎ２の利点は以下のとおりである。（Ａ）患者にＴＩＬを注入するのを待つ患者及び医師の時間の短縮；（Ｂ）凍結保存により、スケジューリング、販売、及び配送の柔軟性が得られる；及び（Ｃ）製造コストの削減。コホート２からの予備データを以下に示す。図１０７は、Ｇｅｎ２凍結保存ＬＮ－１４４製造プロセス（プロセス２Ａ）の実施形態を示す。
研究設計：Ｃ－１４４－０１転移性黒色腫へのフェーズ２試用
[00932] 転移性黒色腫患者の処置のための自己腫瘍浸潤リンパ球（ＬＮ－１４４）の
有効性及び安全性を評価するフェーズ２、多施設共同３コホート研究。
[00933] 主要包含基準：（１）測定可能な転移性黒色腫及びＴＩＬ生成のために切除
可能な病変が≧１；（２）全身療法の少なくとも１つの前の段階までの進歩；（３）年齢≧１８歳；及び（４）ＥＣＯＧ ＰＳ０～１。
[00934] 処置コホート：（１）非凍結保存ＬＮ－１４４産物；（２）凍結保存ＬＮ－
１４４産物；（３）応答のない患者又は初期応答後に進行した患者に対するＬＮ－１４４による再処置。図１０８に研究設計を示す。
[00935] エンドポイント：（１）初代：ＯＲＲとして定義された有効性、及び（２）
二次：安全性及び有効性。
方法
[00936] コホート２安全セット：ＴＩＬ生成の目的で切除を受け、試験処置のなんら
かの成分を投与された１３人の患者。
[00937] コホート２の有効性セット：ＮＭＡ－ＬＤプレコンディショニング、ＬＮ－
１４４注入、及び少なくとも１回のＩＬ－２投与を受け、少なくとも１回の有効性評価を受けた９人の患者。４人の患者は、データカットの時点で有効性評価を受けていなかった。
[00938] データカットの日付までに読み取られた全ての利用可能なデータのバイオマ
ーカーデータが表示されていた。
結果
[00939] 図１０９は、コホート１（ＡＳＣＯ２０１７）とコホート２の患者特性の比
較を示す表を提供する。コホート２には以下のようなものがある：療法前の４つの中央値；全ての患者は、事前に抗ＰＤ－１及び抗ＣＴＬＡ－４を受けていた；及び、標的病変の直径の合計（ＳＯＤ）が大きいことと、ベースラインでの平均ＬＤＨが高いことにより、腫瘍量が増加した。図１１０は、処置による有害事象（≧３０％）を示す表である。
[00940] コホート２（凍結保存ＬＮ－１４４）の場合、注入産物及びＴＩＬ療法の特
性は、（１）注入されたＴＩＬ細胞の平均数：３７×１０９、及び（２）ＩＬ－２投与回数の中央値は４．５であった。図１１１は、患者＃１～＃８に対する注入産物及びＴＩＬ療法の有効性を示す。
[00941] 図１１２は、症状が安定した疾病（ＳＤ）又はより良い応答を示す評価可能
な患者の応答の臨床状態を示す。患者６の部分奏効（ＰＲ）は、患者がまだ第２の有効性評価に達していないため確認しなっかった。１人の患者（患者９）は、第１の評価の前に死亡した（まだ有効性セットで考慮されている）。
[00942] 有効性セットの９人の患者のうち、１人の患者（患者９）は、図１１２に示
さない最初の腫瘍評価の前に黒色腫関連で死亡したため評価できなかった（ＮＥ）。応答は、Ｇｅｎ２で処置された患者で見られた。疾病制御率（ＤＣＲ）は７８％であった。応答までの時間はコホート１に類似していた。最良の反応として進行性疾患（ＰＤ）を有する１人の患者（患者３）は、スイムレーンプロットに含まれていなかった。
[00943] 図１１３は、直径の合計の変化率を示す。患者９は、４２日目の前のメラノ
ーマに関連する死亡によりポストＬＮ－１４４の疾患評価がなかった。－１４日目：スクリーニングからベースラインへの直径の合計の％変化（－１４日目）。－１４日目から１２６日目：ベースラインからのＳＯＤの％変化。－１４日目＝ベースライン。０日目＝ＬＮ－１４４注入。
[00944] ＴＩＬ処置を行うと、ＨＭＧＢ１の増加が観察された（図１１４）。HMGB1 ELISA kit（Tecan US, Inc）を使用して、血漿ＨＭＧＢ１レベルを測定した。示されてい
るデータは、コホート１及びコホート２の患者におけるＬＮ－１４４注入前（７日目）及び後（４日目及び１４日目）のＨＭＧＢ１レベルの倍数変化を表す（ｐ値は、対数変換データに基づいた両側対応ｔ検定を使用して計算された）。サンプルサイズ（太字及び斜体）及び平均値（斜体）は、各時点の括弧内に示されている。ＨＭＧＢ１は、活性化された免疫細胞から分泌され、損傷した腫瘍細胞から遊離する。したがって、ＬＮ－１４４での処置後に観察されたＨＭＧＢ１レベルの増加は、抗腫瘍活性の免疫媒介メカニズムを示唆している。
[00945] Luminexアッセイを使用して、血漿ＩＰ－１０レベルを測定した。図１１５に示されているデータは、コホート１及びコホート２の患者におけるＬＮ－１４４注入前（－７日目）及び後（４日目及び１４日目）のＩＰ－１０レベルの倍数変化を表す（ｐ値は、対数変換データに基づいた両側対応ｔ検定を使用して計算された）。サンプルサイズ（太字及び斜体）及び平均値（斜体）は、各時点の括弧内に示されている。ＩＰ－１０でのＬＮ－１４４注入後の増加は、ＴＩＬ持続性との可能な相関を理解するために監視されている。
[00946] コホート２（ｎ＝１７患者）からの更新データは、図１１６から図１２１に
報告されている。コホート１と、６４％のＤＣＲ及び２９％（Ｎ＝１４）の全体的な応答率（ＯＲＲ）を示したＧｅｎ１プロセスの実施形態に対し、コホート２及びＧｅｎ２プロセスの実施形態は、ＤＣＲ８０％及びＯＲＲ４０％（Ｎ＝１０）を示した。
結論
[00947] 既存データからの予備的結果は、Ｇｅｎ１及びＧｅｎ２のＬＮ－１４４のＴ
ＩＬ産物間で同等の安全性を示す。Ｇｅｎ２プロセス（本明細書に記載する、プロセス２Ａ）で製造されたＴＩＬを投与すると、進行転移性黒色腫患者で見られる臨床反応が驚くほど増加し、療法前の抗ＰＤ－１及び抗ＣＴＬＡ－４について全てが進行した。コホート２のＤＣＲは７８％であった。
[00948] 予備的なバイオマーカーデータは、ＴＩＬ療法に提案されている細胞溶解作
用のメカニズムを裏付けるものである。
[00949] 本明細書に記載されているＧｅｎ２製造プロセスの実施には２２日を要す。
このプロセスは、患者がＴＩＬを受け取るまでに待機する時間を大幅に短縮し、患者に投与するタイミングの柔軟性を提供し、製造コストの削減につながる一方で、商業化及び健康規制機関への登録を可能にする従来のアプローチに勝る他の利点を提供している。Ｇｅｎ２製造プロセスの実施形態を使用した転移性黒色腫の予備的な臨床データは、Ｇｅｎ１プロセスを使用して製造されたＴＩＬに比較して、同様の応答時間及び安全性プロファイルと共に、ＤＣＲ、ＯＲＲ、及び他の臨床反応によって測定されるＴＩＬの臨床効果の驚くべき改善を示す 。Ｇｅｎ２ ＴＩＬ産物の予想外に改善された効率は、ＩＦＮ－γ産
物の５倍以上の増加によっても実証され（図９８）、これは一般的な効力の改善（図１２２）、有意に改善されたポリクローナル性（図９９Ａ及び図９９Ｂ）、及びより高い平均ＩＰ－１０及びＭＣＰ－１産物（図１２３～図１２６）と相関関係がある。驚くべきこと
に、Ｇｅｎ２はプロセスがはるかに短いにもかかわらず、ＴＩＬ産物の他の多くの重要な特性が、相対テロメア長（図９７）及びＣＤ２７及びＣＤ２８発現（図９６Ｂ及び図９６Ｃ）を含む、より伝統的な製造プロセスを使用して観察されたものと類似している。
参照資料
[00950]
1Goff,et al.Randomized,Prospective Evaluation Comparing Intensity of Lymphodepletion Before Adoptive Transfer of Tumor-Infiltrating Lymphocytes for Patients With Metastatic Melanoma.J Clin Oncol.2016 Jul 10;34(20):2389-97.
[00951]
2Sarnaik A,Kluger H,Chesney J,et al. Efficacy of single administration of tumor-infiltrating lymphocytes(TIL)in heavily pretreated patients with metastatic melanoma following checkpoint therapy.J Clin Oncol.2017;35[suppl;abstr 3045].
実施例２９：ＨＮＳＣＣ及び子宮頸癌のフェーズ２研究
[00952] ＨＮＳＣＣ（頭頸部扁平上皮癌；Ｃ－１４５－０３）フェーズ２研究への登
録。１３人の患者が研究に同意し、１０人の患者からＴＩＬが回収され、最終的に７人の患者に注入され、更にもう１人が進行中であった。
[00953] 子宮頸癌のフェーズ２研究への登録（Ｃ－１４５－０４）。８人の患者が研
究に同意し、４人の患者からＴＩＬが回収され、最終的に２人の患者に注入され、更にもう２人が進行中であった。
[00954] 進行中の研究の初期データを図１２７に示す。症状が安定した疾患（ＳＤ）
及び／又は進行性の反応が、８４日までにＴＩＬ療法で処置されたＨＣＮＳＣＣ及び子宮頸癌患者の両方で観察された。
[00955] 上記に示す例は、本発明の組成物、システム及び方法の実施形態をどのよう
に作成及び使用すればよいかについて当業者に完全な開示及び説明を付与するために提供され、本発明者らがその発明と見なすものの範囲を限定することは意図されない。当業者には明らかな本発明を実施するための上述の態様の変形例は、以下の特許請求の範囲内にあることが意図される。本明細書において言及される全ての特許及び刊行物は、本発明が関係する技術分野の当業者の技能水準の指標である。
[00956] 全ての見出し及びセクション表示は、明確にするために、且つあくまでも参
考として使用され、いかなる形であっても限定するものと考えられてはならない。例えば、当業者は、異なる見出し及びセクションからの様々な態様を本明細書に記載される本発明の趣旨及び範囲に従い適宜組み合わせることの有用性を理解するであろう。
[00957] 本明細書に引用する全ての参考文献は、各個別の刊行物又は特許又は特許出
願があらゆる目的から全体として参照により援用されると具体的且つ個別的に指示されたものとみなすのと同程度に、本明細書によって全体として及びあらゆる目的から参照により本明細書に援用される。
[00958] 当業者には明らかであろうとおり、本願の多くの改良及び変形をその趣旨及
び範囲から逸脱することなく行うことができる。本明細書に記載される具体的な実施形態及び例は単に例として提供され、本願は、特許請求の範囲に認められる均等物の全範囲と共に、添付の特許請求の範囲の用語によってのみ限定されるべきである。
配列表：
配列番号１は、ムロモナブの重鎖のアミノ酸配列である。
配列番号２は、ムロモナブの軽鎖のアミノ酸配列である。
配列番号３は、組換えヒトＩＬ－２タンパク質のアミノ酸配列である。
配列番号４は、アルデスロイキンのアミノ酸配列である。
配列番号５は、組換えヒトＩＬ－４タンパク質のアミノ酸配列である。
配列番号６は、組換えヒトＩＬ－７タンパク質のアミノ酸配列である。
配列番号７は、組換えヒトＩＬ－１５タンパク質のアミノ酸配列である。
配列番号８は、組換えヒトＩＬ－２１タンパク質のアミノ酸配列である。

Claims (20)

  1. 対象の癌を治療する方法において使用するための、治療用腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）集団であって、
    （ａ） 前記対象から切除された腫瘍から得られた腫瘍試料を複数の腫瘍断片に処理するか、又は当該腫瘍試料を腫瘍消化物に消化することにより、前記対象から切除された腫瘍から第１のＴＩＬ集団を得ること；
    （ｂ） 前記腫瘍断片又は腫瘍消化物を閉鎖系に加えること；
    （ｃ） ＩＬ－２を含む細胞培養培地で前記第１のＴＩＬ集団を培養することにより第１の拡大培養を実施して第２のＴＩＬ集団を生じさせること、ここで、前記第１の拡大培養は、第１のガス透過性表面積を提供する前記閉鎖系で実施され、前記第１の拡大培養は、前記第２のＴＩＬ集団を得るため３日間、４日間、５日間、６日間、７日間、８日間、９日間、１０日間、１１日間又は１２日間行われ、ステップ（ｂ）からステップ（ｃ）への移行は前記系を開放せずに発生する；
    （ｄ） 前記第２のＴＩＬ集団の細胞培養培地に追加のＩＬ－２、ＯＫＴ－３、及び抗原提示細胞（ＡＰＣ）を添加することにより第２の拡大培養を実施して第３のＴＩＬ集団を生じさせること、ここで、前記第３のＴＩＬ集団を入手するために前記第２の拡大培養が７日間、８日間、９日間、１０日間、１１日間又は１２日間実施され、前記第３のＴＩＬ集団は、治療用ＴＩＬ集団であり、前記第２の拡大培養は第２のガス透過性表面積を提供する前記閉鎖系で行われ、及びステップ（ｃ）からステップ（ｄ）への移行は前記系を開放せずに発生する；
    （ｅ） ステップ（ｄ）から得られた前記治療用ＴＩＬ集団を回収すること、ここで、ステップ（ｄ）からステップ（ｅ）への移行は、前記系を開放せずに発生する；
    （ｆ） ステップ（ｅ）で回収したＴＩＬ集団を輸注バッグに移すこと、ここで、ステップ（ｅ）から（ｆ）への移行は、前記系を開放せずに発生する；及び
    （ｇ） 凍結保存プロセスを使用して、ステップ（ｆ）からの前記回収したＴＩＬ集団を含む前記輸注バッグを凍結保存すること、
    を含む、ＴＩＬを拡大培養する方法によって得られる、治療用ＴＩＬ集団。
  2. 対象の癌を治療する方法において使用するための、治療用腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）集団であって、
    （ａ） 腫瘍消化物又は腫瘍断片であって、第１のＴＩＬ集団を含み、前記対象から切除された腫瘍から得られる腫瘍消化物又は腫瘍断片を閉鎖系に加えること；
    （ｂ） ＩＬ－２を含む細胞培養培地で前記第１のＴＩＬ集団を培養することにより第１の拡大培養を実施して第２のＴＩＬ集団を生じさせること、ここで、前記第１の拡大培養は、第１のガス透過性表面積を提供する前記閉鎖系で実施され、前記第１の拡大培養は、前記第２のＴＩＬ集団を得るため３日間、４日間、５日間、６日間、７日間、８日間、９日間、１０日間、１１日間又は１２日間行われ、ステップ（ａ）からステップ（ｂ）への移行は前記系を開放せずに発生する；
    （ｃ） 前記第２のＴＩＬ集団の細胞培養培地に追加のＩＬ－２、ＯＫＴ－３、及び抗原提示細胞（ＡＰＣ）を添加することにより第２の拡大培養を実施して第３のＴＩＬ集団を生じさせること、ここで、前記第３のＴＩＬ集団を入手するために前記第２の拡大培養が７日間、８日間、９日間、１０日間、１１日間又は１２日間実施され、前記第２の拡大培養は第２のガス透過性表面積を提供する前記閉鎖系で行われ、及びステップ（ｂ）からステップ（ｃ）への移行は前記系を開放せずに発生する；
    （ｄ） ステップ（ｃ）から得られた第３のＴＩＬ集団を回収すること、ここで、ステップ（ｃ）からステップ（ｄ）への移行は、前記系を開放せずに発生する；
    （ｅ） ステップ（ｄ）で回収した第３のＴＩＬ集団を輸注バッグに移すこと、ここで、ステップ（ｄ）から（ｅ）への移行は、前記系を開放せずに発生する；及び
    （ｆ） 凍結保存プロセスを使用して、ステップ（ｅ）からの前記回収したＴＩＬ集団を含む前記輸注バッグを凍結保存すること、
    を含む、ＴＩＬを拡大培養する方法によって得られる、治療用ＴＩＬ集団。
  3. 前記第１の拡大培養及び／又は第２の拡大培養における培地がヒト血清を含まない、請求項１又は２に記載の治療用ＴＩＬ集団。
  4. 回収された前記ＴＩＬ集団は、治療上有効な投薬量のＴＩＬを含む、請求項１又は２に記載の治療用ＴＩＬ集団。
  5. 治療上有効な投薬量のＴＩＬが１×１０ ９ ～９×１０ ９ 個である、請求項４に記載の治療用ＴＩＬ集団。
  6. 前記ＡＰＣが、末梢血単核球（ＰＢＭＣ）である、請求項１～５のいずれか一項に記載の治療用ＴＩＬ集団。
  7. 回収された前記ＴＩＬ集団が、第１及び／又は第２のＴＩＬ集団と比べてＣＤ８＋細胞の亜集団の増加を示す、請求項１～６のいずれか一項に記載の治療用ＴＩＬ集団。
  8. 前記ＰＢＭＣに対してＴＩＬ：ＰＢＭＣの比率が１：２５で添加される、請求項６又は７に記載の治療用ＴＩＬ集団。
  9. 前記癌が、黒色腫（転移性黒色腫を含む）、卵巣癌、子宮頸癌、非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）、肺癌、膀胱癌、乳癌、ヒトパピローマウイルスによって引き起こされる癌、頭頸部癌（頭頸部扁平上皮癌（ＨＮＳＣＣ）を含む）、腎癌、及び腎細胞癌からなる群から選択される、請求項１～８のいずれか一項に記載の治療用ＴＩＬ集団。
  10. 前記癌が、黒色腫、転移性黒色腫、ＨＮＳＣＣ、子宮頸癌、及びＮＳＣＬＣからなる群から選択される、請求項９に記載の治療用ＴＩＬ集団。
  11. 前記第１の拡大培養及び前記第２の拡大培養が、最大１２日の期間内にそれぞれ個別に実施される、請求項１～１０のいずれか一項に記載の治療用ＴＩＬ集団。
  12. 前記第１の拡大培養及び前記第２の拡大培養が、１２日間それぞれ個別に実施される、請求項１～１０のいずれか一項に記載の治療用ＴＩＬ集団。
  13. 前記第１の拡大培養及び前記第２の拡大培養が、最大１１日の期間内にそれぞれ個別に実施される、請求項１～１０のいずれか一項に記載の治療用ＴＩＬ集団。
  14. 前記第１の拡大培養が第１の期間実施され、前記第２の拡大培養が第２の期間実施され、第１の期間と第２の期間の合計が最大１２日である、請求項１～１０のいずれか一項に記載の治療用ＴＩＬ集団。
  15. 前記第１の拡大培養が第１の期間実施され、前記第２の拡大培養が第２の期間実施され、第１の期間と第２の期間の合計が最大１２日である、請求項１～１０のいずれか一項に記載の治療用ＴＩＬ集団。
  16. 前記第１のＴＩＬ集団が腫瘍断片から得られる、請求項１～１５のいずれか一項に記載の治療用ＴＩＬ集団。
  17. ステップ（ａ）の前記腫瘍消化物が、前記対象から切除された腫瘍の試料を酵素培地中でインキュベートすることによって調製されている、請求項１～１５のいずれか一項に記載の治療用ＴＩＬ集団。
  18. 前記腫瘍試料が解離するよう、前記腫瘍試料を機械的に破壊することを更に含む、請求項１７に記載の治療用ＴＩＬ集団。
  19. 密度勾配分離を用いて解離した腫瘍試料を精製することを更に含む、請求項１８に記載の治療用ＴＩＬ集団。
  20. 前記酵素培地がＤＮアーゼ又はコラゲナーゼを含む、請求項１７に記載の治療用ＴＩＬ集団。
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