JP7817830B2 - カンナビノイド類似体およびそれらの調製のための方法 - Google Patents

Description

関連出願の相互参照
本出願は、2018年10月31日出願の米国仮特許出願第62/753,708号および2018年11月14日出願の米国仮特許出願第62/767,447号の優先権を主張するものであり、これらの出願はその全体が参照により本明細書に組み入れられる。

発明の背景
世界中でいくつかの用途のために、アサ(Cannabis sativa)の変種が広範に栽培および利用されている。茎、枝、および葉が、繊維および繊維系産物; 食物としての芽および種; 安価な油用の種; 芳香用、レクリエーション用、儀式用、および医療用の花; ならびに栄養用途およびさらなる医療・医薬用途の花および根において使用される。実際、多くのヒト医療条件において植物エキスおよび精製アサ植物化合物の双方の有益な効果を実証する、ヒトにおける多くの対照臨床試験およびアネクドータルまたは非盲検試験が記録されている。ヒト試験から記述されたカンナビノイドファミリーの化合物の有益な活性は神経障害から気分/行動障害、胃腸障害、ならびに睡眠、食欲、および疲労の問題までに及ぶ。他の用途または潜在的用途としては、様々な微生物およびウイルス感染症の処置、ならびにいくつかのがんの処置が挙げられる。

発明の簡単な概要
式Iの化合物
、ならびにその塩およびカンナビノイド誘導体が、本明細書において提供される:
式中、
R¹は、C₁～C₂₀ハロアルキル、C₁～C₂₀ヒドロキシアルキル、重水素化C₁～C₂₀アルキル、トリチウム化C₁～C₂₀アルキル、およびC₂～C₂₀アルケニルからなる群より選択され、
R²は、COOR^2aおよびHからなる群より選択され、
R^2aは、C₁～C₆アルキルおよびHからなる群より選択され、
R³は、Hおよびプレニル部分からなる群より選択される。

いくつかの態様では、カンナビノイド誘導体は、カンナビジオール酸類似体、カンナビジオール類似体、Δ⁹-テトラヒドロカンナビノール酸類似体、Δ⁸-テトラヒドロカンナビノール酸類似体、カンナビクロメン酸類似体、カンナビクロメン類似体、カンナビノール類似体、カンナビノジオール類似体、カンナビノール酸類似体、カンナビバリン類似体、カンナビバリン酸類似体、Δ⁹-テトラヒドロカンナビバリン類似体、Δ⁸-テトラヒドロカンナビバリン類似体、Δ⁹-テトラヒドロカンナビバリン酸類似体、Δ⁸-テトラヒドロカンナビバリン酸類似体、カンナビゲロバリン類似体、カンナビゲロバリン酸類似体、カンナビクロメバリン類似体、カンナビクロメバリン酸類似体、カンナビジバリン類似体、カンナビジバリン酸類似体、カンナビトリオール類似体、またはカンナビシクロール類似体である。

式IVの化合物
、またはその塩を生成する方法も、本明細書において提供され、
式中、R¹は、C₁～C₂₀ハロアルキル、C₁～C₂₀ヒドロキシアルキル、重水素化C₁～C₂₀アルキル、トリチウム化C₁～C₂₀アルキル、およびC₂～C₂₀アルケニルからなる群より選択され、
該方法は、式IIのチオエステル
を含む培地中で改変組換え宿主細胞を培養する段階を含み、
式中、R⁴は、コエンザイムA(CoA)部分、パンテテイン部分、およびシステアミン部分からなる群より選択され;
該改変組換え宿主細胞が、
i. 式IIのチオエステルおよびマロニルCoAを式IIIのテトラケチド
に変換するシンターゼをコードする第1のポリヌクレオチド、ならびに、
ii. 式IIIのテトラケチドを式IVの化合物に変換する2-アルキル-4,6-ジヒドロキシ安息香酸シクラーゼをコードする第2のポリヌクレオチド
を含み、かつ、
該改変組換え宿主細胞が、該第1および該第2のポリヌクレオチドによりコードされる生成物が発現されて式IVの化合物が生成される条件下で、培養される。

式IVの化合物は、本明細書に記載の方法によっていくつかの中性および酸性カンナビノイド類似体に変換可能である。

本開示のカンナビノイド類似体の調製用の合成経路の一例を示す。

発明の詳細な説明
本開示は、神経状態、気分/行動障害、感染症、およびがんを含むいくつかのヒト治療適応症において有用な新規カンナビノイド化合物を提供する。持続的で現代的なバイオ医薬品調製方法を使用する医薬グレードのカンナビノイドの生成のための方法も提供される。

I. 定義
別途定義がない限り、本明細書において使用されるすべての技術用語、表記、および他の科学用語法は、本出願が関係する当業者が通常理解する意味を有するように意図されている。いくつかの場合では、一般的に理解される意味を有する用語が、本明細書において明確性および/または参照容易性のために定義されており、これらの用語が本明細書に含まれることは、当技術分野において一般的に理解される意味との実質的な相違を表すものと必ずしも解釈されるべきではない。

本明細書において使用される「カンナビノイド」、「カンナビノイド化合物」、および「カンナビノイド生成物」という用語は、ポリケチド部分、例えばオリベトール酸または別の2-アルキル-4,6-ジヒドロキシ安息香酸、およびテルペン由来プレニル部分、例えばゲラニル基を含む分子を意味するように互換的に使用される。ゲラニル基は、ゲラニルピロリン酸またはゲラニル二リン酸として知られるゲラニオールの二リン酸エステルに由来するものであり、図1に示すようにオリベトール酸型化合物と反応することで酸性カンナビノイドカンナビゲロール酸(CBGA)およびCBGA類似体を形成しうるものである。CBGAはさらなる生物活性カンナビノイドに酵素的に変換可能であり(例えば中性カンナビノイドカンナビゲロールを形成するためのインビボまたはインビトロ酵素処理による脱炭酸によって)、かつ化学的に(例えば加熱によって)変換可能である。

カンナビノイドという用語は酸性カンナビノイドおよび中性カンナビノイドを含む。「酸性カンナビノイド」という用語は、カルボン酸部分を有するカンナビノイドを意味する。カルボン酸部分はプロトン化形態で(すなわち-COOHとして)または脱プロトン化形態として(すなわちカルボン酸イオン-COO^-として)存在しうる。酸性カンナビノイドの例としてはカンナビゲロール酸、カンナビジオール酸、カンナビクロメン酸、およびΔ⁹-テトラヒドロカンナビノール酸が挙げられるがそれに限定されない。「中性カンナビノイド」という用語は、カルボン酸部分を含まない(すなわち部分-COOHまたは-COO^-を含まない)カンナビノイドを意味する。中性カンナビノイドの例としてはカンナビゲロール、カンナビジオール、カンナビクロメン、およびΔ⁹-テトラヒドロカンナビノールが挙げられるがそれに限定されない。

「2-アルキル-4,6-ジヒドロキシ安息香酸」という用語は、下記構造
を有する化合物を意味し、
式中、RはC₁～C₂₀アルキル基であり、本明細書に記載のようにハロゲン化、ヒドロキシル化、重水素化、および/またはトリチウム化されていてもよい。2-アルキル-4,6-ジヒドロキシ安息香酸の例としてはオリベトール酸(すなわち2-ペンチル-4,6-ジヒドロキシ安息香酸; CAS登録番号491-72-5)およびジバリン酸(すなわち2-プロピル-4,6-ジヒドロキシ安息香酸; CAS登録番号4707-50-0)が挙げられるがそれに限定されない。オリベトール酸類似体としては、他の2-アルキル-4,6-ジヒドロキシ安息香酸誘導体、ならびに、5-ハロメチルレゾルシノール、5-ハロエチルレゾルシノール、5-ハロプロピルレゾルシノール、5-ハロヘキシルレゾルシノール、5-ハロヘプチル-レゾルシノール、5-ハロオクチルレゾルシノール、および5-ハロノニルレゾルシノールを含むがそれに限定されない置換レゾルシノールが挙げられる。

「アルキル」という用語は、それ自体で、または別の置換基の一部として、直鎖状または分岐状の飽和脂肪族基を意味する。アルキルは任意の数の炭素、例えばC_1～2、C_1～3、C_1～4、C_1～5、C_1～6、C_1～7、C_1～8、C_1～9、C_1～10、C_2～3、C_2～4、C_2～5、C_2～6、C_3～4、C_3～5、C_3～6、C_4～5、C_4～6、およびC_5～6を含みうる。例えば、C_1～6アルキルとしてはメチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ブチル、イソブチル、sec-ブチル、tert-ブチル、ペンチル、イソペンチル、ヘキシルなどが挙げられるがそれに限定されない。アルキルは、ヘプチル、オクチル、ノニル、デシルなどであるがそれに限定されない最大20個の炭素を有するアルキル基を意味することもある。

「アルケニル」という用語は、それ自体で、または別の置換基の一部として、1個または複数の炭素-炭素二重結合を含む本明細書に定義のアルキル基を意味する。アルケニル基の例としてはビニル(すなわちエテニル)、クロチル(すなわちブタ-2-エン-1-イル)、ペンタ-1,3-ジエン-1-イルなどが挙げられるがそれに限定されない。アルケニル部分は、例えばアリール置換基(例えば4-ヒドロキシスチリルの場合フェニルまたはヒドロキシフェニル)でさらに置換されていてもよい。

「ハロゲン」および「ハロ」という用語は、それ自体で、または別の置換基の一部として、フッ素原子、塩素原子、臭素原子、またはヨウ素原子を意味する。

「ハロアルキル」という用語は、それ自体で、または別の置換基の一部として、いくつかまたはすべての水素原子がハロゲン原子で置き換えられたアルキル基を意味する。アルキル基と同様に、ハロアルキル基は任意の好適な数の炭素原子、例えばC_1～6を有しうる。例えば、ハロアルキルとしてはトリフルオロメチル、フルオロメチルなどが挙げられる。いくつかの場合では、すべての水素がフッ素で置き換えられた化合物または基を定義するために「ペルフルオロ」という用語が使用されることがある。例えば、ペルフルオロメチルとは1,1,1-トリフルオロメチルを意味する。

「ヒドロキシアルキル」という用語は、それ自体で、または別の置換基の一部として、いくつかまたはすべての水素原子がヒドロキシル基(すなわち-OH基)で置き換えられたアルキル基を意味する。アルキル基およびハロアルキル基と同様に、ヒドロキシアルキル基は任意の好適な数の炭素原子、例えばC_1～6を有しうる。

「重水素化」という用語は、1個または複数の水素原子の代わりに1個または複数の重水素原子(すなわち²H原子)を有する置換基(例えばアルキル基)を意味する。

「トリチウム化」という用語は、1個または複数の水素原子の代わりに1個または複数のトリチウム原子(すなわち³H原子)を有する置換基(例えばアルキル基)を意味する。

「プレニル部分」という用語は、少なくとも1個のメチルブテニル基(例えば3-メチルブタ-2-エン-1-イル基)を含む置換基を意味する。多くの場合、プレニル部分をイソペンテニルピロリン酸および/またはイソペンテニル二リン酸から生化学的に合成することでテルペン天然物および他の化合物が得られる。プレニル部分の例としてはプレニル(すなわち3-メチルブタ-2-エン-1-イル)、イソプレニル(すなわち3-メチルブタ-3-エン-1-イル)、ゲラニル、ミルセニル、オシメニル、ファルネシル、およびゲラニルゲラニルが挙げられるがそれに限定されない。

「ゲラニオール」という用語は(2E)-3,7-ジメチル-2,6-オクタジエン-1-オール(CAS登録番号106-24-1)を意味する。「ゲラニル化」という用語は、2-アルキル-4,6-ヒドロキシ安息香酸などの分子に対する3,7-ジメチル-2,6-オクタジエン-1-イル基の共有結合を意味する。本明細書に記載のように、ゲラニル化は化学的または酵素的に行うことができる。「シトラール」という用語は3,7-ジメチルオクタ-2,6-ジエナールを意味する。

「有機溶媒」とは、周囲温度および周囲圧力で液体であり、かつ実質的に水を含まない、炭素含有物質を意味する。有機溶媒の例としてはトルエン、塩化メチレン、酢酸エチル、アセトニトリル、テトラヒドロフラン、ベンゼン、クロロホルム、ジエチルエーテル、ジメチルホルムアミド、ジメチルスルホキシド、および石油エーテルが挙げられるがそれに限定されない。

「酸」という用語は、プロトン(すなわち水素カチオン)を供与することで酸の共役塩基を形成することが可能な物質を意味する。酸の例としては鉱酸(例えば塩酸、硫酸など)、カルボン酸(例えば酢酸、ギ酸など)、およびスルホン酸(例えばメタンスルホン酸、p-トルエンスルホン酸など)が挙げられるがそれに限定されない。

本明細書において使用される「治療」という用語は、傷害、病態、状態、または症状(例えば疼痛)の処置または緩和の成功に関する任意の兆候を意味するものであり、兆候は、緩解; 寛解; 症状を低減させること、または症状、傷害、病態、もしくは状態に対する患者の耐容性を高めること; あるいは症状もしくは状態の頻度もしくは持続時間を減少させることなどの、任意の客観的または主観的パラメータを含む。症状の処置または緩和は、身体診察の結果を例えば含む任意の客観的または主観的パラメータに基づきうる。

本明細書において使用される「投与」という用語は、対象に対する経口投与、局所投与、非経口投与、静脈内投与、腹腔内投与、筋肉内投与、病変内投与、鼻腔内投与、皮下投与、肺内投与、またはくも膜下腔内投与、および対象における坐薬としての投与または緩徐放出装置、例えばミニ浸透圧ポンプの埋め込みを意味する。

本明細書において使用される「有効量」という用語は、それを投与する目的である治療効果を生じさせる用量を意味する。正確な用量は、処置の目的に依存するものであり、公知の技術を使用して当業者が確認可能である(例えばLieberman, Pharmaceutical Dosage Forms (vols. 1-3, 1992); Lloyd, The Art, Science and Technology of Pharmaceutical Compounding (1999); Pickar, Dosage Calculations (1999); およびRemington: The Science and Practice of Pharmacy, 20th Edition, 2003, Gennaro, Ed., Lippincott, Williams & Wilkins参照)。

本明細書および添付の特許請求の範囲を通じて、「含む(comprise)」という用語、または「含む(comprises)」および「含む(comprising)」などの変形は、記載される整数または整数群の包含を含意するが、任意の他の整数または整数群の排除を含意するものではないものと理解されよう。

2個以上のポリペプチド配列に関する「同一の」または「同一性」パーセントという用語は、比較ウィンドウまたは所定の領域にわたる最大一致に関して比較およびアラインメントする際に、所定の領域にわたって同じであるかまたは同じであるアミノ酸残基を所定の割合で有する(例えば少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、もしくはそれ以上の同一性)、2個以上の配列または部分配列を意味する。アミノ酸配列同一性パーセントを決定するためのアラインメントは、BLAST、BLAST-2、ALIGN、Megalign(DNASTAR)、またはGeneiousソフトウェアなどの公に利用可能なコンピュータソフトウェアを使用する方法を含む様々な方法で実行可能である。配列同一性パーセントおよび配列類似性パーセントを決定するために好適なアルゴリズムの例としてはAltschul et al., Nuc. Acids Res. 25:3389-3402 (1977)およびAltschul et al., J. Mol. Biol. 215:403-410 (1990)に記載のBLAST 2.0アルゴリズムがある。したがって、配列同一性パーセントを決定するために、記載のデフォルトパラメータでBLAST 2.0を使用することができる。

本明細書において使用される「保存的」置換とは、側鎖基の電荷、疎水性、および/またはサイズが維持されるアミノ酸の置換を意味する。互いに置換可能なアミノ酸の例示的セットとしては(i) Lys、Arg、およびHisなどの正に帯電したアミノ酸; (ii) GluおよびAspなどの負に帯電したアミノ酸; (iii) 芳香族アミノ酸Phe、Tyr、およびTrp; (iv) 窒素環アミノ酸HisおよびTrp; (v) 大型脂肪族非極性アミノ酸Val、Leu、およびIle; (vi) わずかに極性のアミノ酸MetおよびCys; (vii) 小型側鎖アミノ酸Ser、Thr、Asp、Asn、Gly、Ala、Glu、Gln、およびPro; (viii) 脂肪族アミノ酸Val、Leu、Ile、Met、およびCys; ならびに(ix) 小型ヒドロキシルアミノ酸SerおよびThrが挙げられる。本段落におけるアミノ酸の電荷に対する言及は、生理的pHでの電荷を指す。

特定の場合では略語が使用される。例えば、「CBGA」という用語はカンナビゲロール酸を意味する。同様に、「OA」とはオリベトール酸を意味し; 「CBG」とはカンナビゲロールを意味し; 「CBDA」とはカンナビジオール酸を意味し; 「CBD」とはカンナビジオールを意味し; 「THC」とはΔ⁹-テトラヒドロカンナビノール(Δ⁹-THC)を意味し; 「Δ⁸-THC」とはΔ⁸-テトラヒドロカンナビノールを意味し; 「THCA」とはΔ⁹-テトラヒドロカンナビノール酸(Δ⁹-THCA)を意味し; 「Δ⁸-THCA」とはΔ⁸-テトラヒドロカンナビノール酸を意味し; 「CBCA」とはカンナビクロメン酸を意味し; 「CBC」とはカンナビクロメンを意味し; 「CBN」とはカンナビノールを意味し; 「CBND」とはカンナビノジオールを意味し; 「CBNA」とはカンナビノール酸を意味し; 「CBV」とはカンナビバリンを意味し; 「CBVA」とはカンナビバリン酸を意味し; 「THCV」とはΔ⁹-テトラヒドロカンナビバリン(Δ⁹-THCV)を意味し; 「Δ⁸-THCV」とはΔ⁸-テトラヒドロカンナビバリンを意味し; 「THCVA」とはΔ⁹-テトラヒドロカンナビバリン酸(Δ⁹-THCV)を意味し; 「Δ⁸-THCVA」とはΔ⁸-テトラヒドロカンナビバリン酸を意味し; 「CBGV」とはカンナビゲロバリンを意味し; 「CBGVA」とはカンナビゲロバリン酸を意味し; 「CBCV」とはカンナビクロメバリンを意味し; 「CBCVA」とはカンナビクロメバリン酸を意味し; 「CBDV」とはカンナビジバリンを意味し; 「CBDVA」とはカンナビジバリン酸を意味し; 「MPF」とは複数前駆体供給を意味し; 「PKS」とはポリケチドシンターゼを意味し; 「GOT」とはゲラニルピロリン酸:オリベトール酸ゲラニルトランスフェラーゼを意味し; 「YAC」とは酵母人工染色体を意味し; 「IRES」または「配列内リボソーム進入部位」とは、キャップ構造とは無関係にリボソーム結合およびmRNA翻訳を直接促進する特殊な配列を意味し; 「HPLC」は高速液体クロマトグラフィーを意味する。

本明細書および添付の特許請求の範囲において使用される単数形「a」、「and」、および「the」は、文脈上別途明らかな断りがない限り、複数の参照対象を含む。

本明細書において使用される「約」および「およそ」という用語は、ある特定の数値を改変するために使用する場合の、その数の周辺の閉鎖的範囲を示す。例えば、その値が「X」であるとすれば、「約X」または「およそX」は0.9X～1.1Xの値、例えば0.95X～1.05Xの値、または0.98X～1.02Xの値、または0.99X～1.01Xの値を示すであろう。「約X」または「およそX」に関する任意の言及は、少なくとも値X、0.9X、0.91X、0.92X、0.93X、0.94X、0.95X、0.96X、0.97X、0.98X、0.99X、1.01X、1.02X、1.03X、1.04X、1.05X、1.06X、1.07X、1.08X、1.09X、および1.1X、ならびにこの範囲内の値を具体的に示すものである。

例えばSambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual 2nd. edition (1989) Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N. Y.に記載の広範に利用されている分子クローニング方法論などの従来の方法論を用いた、本明細書において記載または参照される分子生物学の技術および手法は、一般的によく理解されており、当業者によって一般的に使用される。別途記載がない限り、適宜、市販のキットおよび試薬の使用を包含する手法が、製造者の規定によるプロトコルおよび/またはパラメータに従って一般的に行われる。したがって、本方法、本発現系、および本使用を説明する前に、本発明が、記載される特定の方法論、プロトコル、細胞株、動物の種または属、構築物、および試薬に限定されず、したがって当然変動しうるということを理解されたい。また、本明細書において使用される用語法が、特定の態様のみを記述するためのものであって、本発明の範囲を限定するようには意図されておらず、本発明の範囲が、添付の特許請求の範囲によってのみ限定されるということも理解されたい。

II. カンナビノイド類似体
式Iの化合物
、ならびにその塩およびカンナビノイド誘導体が、本明細書において提供され、
式中、
R¹は、C₁～C₂₀ハロアルキル、C₁～C₂₀ヒドロキシアルキル、重水素化C₁～C₁₀アルキル、トリチウム化C₁～C₂₀アルキル、およびC₂～C₂₀アルケニルからなる群より選択され、
R²は、COOR^2aおよびHからなる群より選択され、
R^2aは、C₁～C₆アルキルおよびHからなる群より選択され、
R³は、Hおよびプレニル部分からなる群より選択される。

いくつかの態様では、R¹はC₁～C₂₀ハロアルキル(例えばC₁～C₁₅ハロアルキルまたはC₁～C₁₀ハロアルキル)である。例えば、R¹はハロエチル(1～5個のハロゲン原子を含む)、ハロプロピル(1～7個のハロゲン原子を含む)、ハロブチル(1～9個のハロゲン原子を含む)、ハロペンチル(1～11個のハロゲン原子を含む)、ハロヘキシル(1～13個のハロゲン原子を含む)、ハロヘプチル(1～15個のハロゲン原子を含む)、ハロオクチル(1～17個のハロゲン原子を含む)、およびハロノニル(1～19個のハロゲン原子を含む)でありうる。ハロアルキル基の例としてはクロロメチル、ジクロロメチル、トリクロロメチル、フルオロメチル、ジフルオロメチル、トリフルオロメチル、2,2,2-トリクロロエチル、2,2,2-トリフルオロエチル、ペンタクロロエチル、ペンタフルオロエチル、1,1,1,3,3,3-ヘキサクロロプロピル、1,1,1,3,3,3-ヘキサフルオロプロピルなどが挙げられるがそれに限定されない。いくつかの態様では、R¹はC₁～C₁₀フルオロアルキル、C₁～C₁₀クロロアルキル、C₁～C₁₀ブロモアルキル、およびC₁～C₁₀ヨードアルキルより選択される。いくつかの態様では、R¹はC₁～C₁₀フルオロアルキル、C₁～C₁₀クロロアルキル、およびC₁～C₁₀ブロモアルキルより選択される。いくつかの態様では、R¹はC₁～C₁₀フルオロアルキルである。

いくつかの態様では、R¹はフルオロエチル(1～5個のフッ素原子を含む)、フルオロプロピル(1～7個のフッ素原子を含む)、フルオロブチル(1～9個のフッ素原子を含む)、フルオロペンチル(1～11個のフッ素原子を含む)、フルオロヘキシル(1～13個のフッ素原子を含む)、フルオロヘプチル(1～15個のフッ素原子を含む)、フルオロオクチル(1～17個のフッ素原子を含む)、およびフルオロノニル(1～19個のフッ素原子を含む)より選択される。

いくつかの態様では、R¹は、3-フルオロプロピル; 3,3,3-トリフルオロプロピル; 1,1-ジフルオロプロピル; ペルフルオロプロピル; 4-フルオロブチル; 1,1-ジフルオロブチル; ペルフルオロブチル; 5-フルオロペンチル; 1,1-ジフルオロペンチル; およびペルフルオロペンチルより選択される。

いくつかの態様では、R¹は、3-フルオロプロピル、4-フルオロブチル、および5-フルオロペンチルからなる群より選択される。

いくつかの態様では、R¹は、3-クロロプロピル、3-ブロモプロピル、3-ヒドロキシプロピル、4-クロロブチル、4-ブロモブチル、4-ヒドロキシブチル、5-クロロペンチル、5-ブロモペンチル、5-ヒドロキシペンチル、6-クロロヘキシル、6-ブロモヘキシル、および6-ヒドロキシヘキシルからなる群より選択される。いくつかの態様では、R¹はペルジュウテロ-ペンチル(すなわち-C₅D₁₁)である。

いくつかの態様では、R²はCOOHである。R²がCOOHであり、R³がHである式Iの化合物としては、R¹がハロペンチル、ヒドロキシペンチル、重水素化ペンチル、またはトリチウム化ペンチルであるオリベトール酸類似体が挙げられる。

いくつかの態様では、R²はHである。R²がHであり、R³がHである式Iの化合物としては、R¹がハロペンチル、ヒドロキシペンチル、重水素化ペンチル、またはトリチウム化ペンチルであるオリベトール類似体が挙げられる。

いくつかの態様では、R²はCOOR^2aであり、R^2aはC₁～C₆アルキルである。例えば、R^2aはメチル、エチル、プロピル、イソプロピル、n-ブチル、イソブチル、sec-ブチル、tert-ブチル、n-ペンチル、イソペンチル、n-ヘキシル、または分岐ヘキシルでありうる。

いくつかの態様では、2,4-ジヒドロキシ-6-ペルジュウテロペンチル安息香酸; 2,4-ジヒドロキシ-6-(5-フルオロペンチル)-安息香酸; 2,4-ジヒドロキシ-6-(4-フルオロブチル)-安息香酸; 6-(4-クロロブチル)-2,4-ジヒドロキシ安息香酸; および/または2,4-ジヒドロキシ-6-(3-フルオロプロピル)-安息香酸が提供される。いくつかの態様では、5-ペルジュウテロペンチルベンゼン-1,3-ジオール; 5-(5-フルオロペンチル)-ベンゼン-1,3-ジオール; 5-(4-フルオロブチル)-ベンゼン-1,3-ジオール; 5-(4-クロロブチル)-ベンゼン-1,3-ジオール; および/または5-(3-フルオロプロピル)-ベンゼン-1,3-ジオールが提供される。

いくつかの態様では、R³はプレニル部分である。例えば、R³はプレニル(すなわち2-メチルブタ-2-エン-1-イル)、ゲラニル(すなわち3,7-ジメチルオクタ-2,6-ジエン-1-イル)、ファルネシル(すなわち3,7,11-トリメチルドデカ-2,6,10-トリエン-1-イル)、またはゲラニルゲラニル(すなわち3,7,11,15-テトラメチルヘキサデカ-2,6,10,14-テトラエン-1-オール)でありうる。いくつかの態様では、プレニル部分はゲラニルである。以下に記載の非限定的な実施例に示すように、プレニル部分の炭素-炭素二重結合はシス(Z)配置でもトランス(E)配置でもよく、ここで波線は式Iの化合物に対するプレニル部分の結合点を表す。いくつかの態様では、R³はtrans-ゲラニル(すなわち(E)-3,7-ジメチルオクタ-2,6-ジエン-1-イル)である。

いくつかの態様では、化合物は式Iaの構造を有する。

R²がCOOHである式Iaの化合物としては、R¹がハロペンチル、ヒドロキシペンチル、重水素化ペンチル、またはトリチウム化ペンチルであるカンナビゲロール酸類似体が挙げられる。R²がHである式Iaの化合物としては、R¹がハロペンチル、ヒドロキシペンチル、重水素化ペンチル、またはトリチウム化ペンチルであるカンナビゲロール類似体が挙げられる。

いくつかの態様では、6-(4-クロロブチル)-3-(3,7-ジメチル-オクタ-2,6-ジエニル)-2,4-ジヒドロキシ-安息香酸; 3-(3,7-ジメチル-オクタ-2,6-ジエニル)-6-(5-フルオロペンチル)-2,4-ジヒドロキシ-安息香酸; 2-メチル-2-(4-メチル-ペンタ-3-エニル)-7-ペルジュウテロペンチル-2H-クロメン-5-オール; 5-ヒドロキシ-2-メチル-2-(4-メチル-ペンタ-3-エニル)-7-ペルジュウテロペンチル-2H-クロメン-6-カルボン酸; 7-(5-フルオロペンチル)-2-メチル-2-(4-メチル-ペンタ-3-エニル)-2H-クロメン-5-オール; および/または7-(5-クロロペンチル)-2-メチル-2-(4-メチル-ペンタ-3-エニル)-2H-クロメン-5-オールが提供される。

いくつかの態様では、式Iおよび式Iaの化合物のカンナビノイド誘導体が提供される。いくつかの態様では、カンナビノイド誘導体はハロゲン化カンナビジオール酸、ハロゲン化カンナビジオール、ハロゲン化Δ⁹-テトラヒドロカンナビノール酸、ハロゲン化Δ⁸-テトラヒドロカンナビノール酸、ハロゲン化カンナビクロメン酸、ハロゲン化カンナビクロメン、ハロゲン化カンナビノール、ハロゲン化カンナビノジオール、ハロゲン化カンナビノール酸、カンナビバリン、ハロゲン化カンナビバリン酸、ハロゲン化Δ⁹-テトラヒドロカンナビバリン、ハロゲン化Δ⁸-テトラヒドロカンナビバリン、ハロゲン化Δ⁹-テトラヒドロカンナビバリン酸、ハロゲン化Δ⁸-テトラヒドロカンナビバリン酸、ハロゲン化カンナビゲロバリン、ハロゲン化カンナビゲロバリン酸、ハロゲン化カンナビクロメバリン、ハロゲン化カンナビクロメバリン酸、ハロゲン化カンナビジバリン、ハロゲン化カンナビジバリン酸、ハロゲン化カンナビトリオール、およびハロゲン化カンナビシクロールより選択される。

いくつかの態様では、カンナビノイド誘導体は重水素化カンナビジオール酸、重水素化カンナビジオール、重水素化Δ⁹-テトラヒドロカンナビノール酸、重水素化Δ⁸-テトラヒドロカンナビノール酸、重水素化カンナビクロメン酸、重水素化カンナビクロメン、重水素化カンナビノール、重水素化カンナビノジオール、重水素化カンナビノール酸、カンナビバリン、重水素化カンナビバリン酸、重水素化Δ⁹-テトラヒドロカンナビバリン、重水素化Δ⁸-テトラヒドロカンナビバリン、重水素化Δ⁹-テトラヒドロカンナビバリン酸、重水素化Δ⁸-テトラヒドロカンナビバリン酸、重水素化カンナビゲロバリン、重水素化カンナビゲロバリン酸、重水素化カンナビクロメバリン、重水素化カンナビクロメバリン酸、重水素化カンナビジバリン、重水素化カンナビジバリン酸、重水素化カンナビトリオール、および重水素化カンナビシクロールより選択される。

いくつかの態様では、カンナビノイド誘導体はトリチウム化カンナビジオール酸、トリチウム化カンナビジオール、トリチウム化Δ⁹-テトラヒドロカンナビノール酸、トリチウム化Δ⁸-テトラヒドロカンナビノール酸、トリチウム化カンナビクロメン酸、トリチウム化カンナビクロメン、トリチウム化カンナビノール、トリチウム化カンナビノジオール、トリチウム化カンナビノール酸、カンナビバリン、トリチウム化カンナビバリン酸、トリチウム化Δ⁹-テトラヒドロカンナビバリン、トリチウム化Δ⁸-テトラヒドロカンナビバリン、トリチウム化Δ⁹-テトラヒドロカンナビバリン酸、トリチウム化Δ⁸-テトラヒドロカンナビバリン酸、トリチウム化カンナビゲロバリン、トリチウム化カンナビゲロバリン酸、トリチウム化カンナビクロメバリン、トリチウム化カンナビクロメバリン酸、トリチウム化カンナビジバリン、トリチウム化カンナビジバリン酸、トリチウム化カンナビトリオール、およびトリチウム化カンナビシクロールより選択される。

いくつかの態様では、カンナビノイド誘導体はヒドロキシ-カンナビジオール酸、ヒドロキシ-カンナビジオール、ヒドロキシ-Δ⁹-テトラヒドロカンナビノール酸、ヒドロキシ-Δ⁸-テトラヒドロカンナビノール酸、ヒドロキシ-カンナビクロメン酸、ヒドロキシ-カンナビクロメン、ヒドロキシ-カンナビノール、ヒドロキシ-カンナビノジオール、ヒドロキシ-カンナビノール酸、カンナビバリン、ヒドロキシ-カンナビバリン酸、ヒドロキシ-Δ⁹-テトラヒドロカンナビバリン、ヒドロキシ-Δ⁸-テトラヒドロカンナビバリン、ヒドロキシ-Δ⁹-テトラヒドロカンナビバリン酸、ヒドロキシ-Δ⁸-テトラヒドロカンナビバリン酸、ヒドロキシ-カンナビゲロバリン、ヒドロキシ-カンナビゲロバリン酸、ヒドロキシ-カンナビクロメバリン、ヒドロキシ-カンナビクロメバリン酸、ヒドロキシ-カンナビジバリン、ヒドロキシ-カンナビジバリン酸、ヒドロキシ-カンナビトリオール、およびヒドロキシ-カンナビシクロールより選択される。

式Iおよび式Iaの化合物のカンナビノイド誘導体としては、表1に記載のカンナビノイド誘導体が挙げられるがそれに限定されない。以下に記載のように、式Iおよび式Iaの化合物はカンナビノイド誘導体に酵素的に(例えばカンナビノイドシンターゼを使用して)または化学的に変換可能である。

（表１）式Iおよび式Iaの化合物のカンナビノイド誘導体

式Iおよび式Iaの化合物のカンナビノイド誘導体としてはCBG、CBDA、CBD、THC、Δ⁸-THC、THCA、Δ⁸-THCA、CBCA、CBC、CBN、CBND、CBNA、CBV、CBVA、THCV、THCVA、Δ⁸-THCA、CBGV、CBGVA、CBCV、CBCVA、CBDV、およびCBDVAの類似体が挙げられるがそれに限定されない。さらなる例としてはカンナビクロマノン、カンナビクマロノン、カンナビシトラン、10-オキソ-Δ^6a(10a)-テトラヒドロヒドロカンナビノール(OTHC)、カンナビグレンドール、およびΔ⁷-イソテトラヒドロカンナビノールが挙げられるがそれに限定されない。

III. カンナビノイド類似体の酵素的および化学酵素的調製のための方法
遺伝子操作宿主細胞中での代謝経路によるカンナビノイド類似体およびその中間体の合成のための方法も本明細書において提供される。「代謝経路」という用語は、1回の酵素反応の生成物が次の酵素反応の基質となる、一連の2回以上の酵素反応を意味する。代謝経路の各段階において、中間体化合物が形成され、次の段階の基質として利用される。いくつかの態様では、代謝経路の各段階は、本明細書に記載の改変組換え細胞中で行われる。いくつかの態様では、代謝経路の少なくとも1つの段階は、本明細書に記載の改変組換え細胞中で行われ、代謝経路の少なくとも1つの段階は、改変組換え細胞外で、酵母培地中で、またはさらなる同時培養された改変組換え細胞中で行われる。

したがって、本開示のいくつかの態様は、式IVの化合物
、またはその塩を生成するための方法を提供し、式中、R¹は、C₁～C₂₀ハロアルキル、C₁～C₂₀ヒドロキシアルキル、重水素化C₁～C₂₀アルキル、トリチウム化C₁～C₁₀アルキル、およびC₂～C₂₀アルケニルからなる群より選択される。

本方法は、式IIのチオエステル
を含む培地中で改変組換え宿主細胞を培養する段階を含み、
式中、R⁴は、コエンザイムA(CoA)部分、パンテテイン部分、およびシステアミン部分からなる群より選択され、
該改変組換え宿主細胞は、
i. 式IIのチオエステルおよびマロニルCoAを式IIIのテトラケチド
に変換するシンターゼをコードする第1のポリヌクレオチド、ならびに、
ii. 式IIIのテトラケチドを式IVの化合物に変換する2-アルキル-4,6-ジヒドロキシ安息香酸シクラーゼをコードする第2のポリヌクレオチド
を含み、かつ、
該改変組換え宿主細胞は、該第1および該第2のポリヌクレオチドによりコードされる生成物が発現されて式IVの化合物が生成される条件下で、培養される。

オリベトール酸シンターゼ
いくつかの態様では、シンターゼはオリベトール酸シンターゼである。いくつかの当該の態様では、宿主細胞は、オリベトール酸シンターゼ、あるいはポリケチドシンターゼ活性を示すその変種、例えば天然相同体もしくは天然オルソログ、または非天然変種をコードする、外因性ポリヌクレオチドを発現するように遺伝子改変されている。オリベトール酸シンターゼ(Taura et al. FEBS Letters 583:2061-2066, 2009)は、3,5,7,-トリオキソドデカノイル-CoAシンターゼ、UniProtKB-B1Q2B6とも呼ばれており、以下に示す3,5,7-トリオキソアルカノイル-CoAテトラケチドを形成するためのアシル-CoAとマロニル-CoAの3個の分子との縮合を触媒するIII型PKSである:
式中、「CoA」はコエンザイムAであり、「R」はアルキル基である。ヘキサン酸が天然の系でカンナビノイド生成の出発原料として使用される場合、ヘキサノイル-CoAとマロニル-CoAの3個の分子とが縮合されて3,5,7-トリオキソドデカノイル-CoAが形成される(すなわち、「R」はn-ペンチル基である)。III型PKSは、(I型PKSおよびII型PKSの場合のアシル担体タンパク質結合基質とは異なり、)アシル-CoA基質に直接作用するホモ二量体酵素である。III型PKSは、例えばYuら(IUBMB Life, 64(4): 285-295, 2012)により特徴が十分に明らかにされている。

いくつかの態様では、オリベトール酸シンターゼポリヌクレオチドは、SEQ ID NO:4に記載の配列に対して約60%以上の同一性(例えば約60%、61%、62%、63%、64%、65%、66%、67%、68%、69%、70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、または100%の同一性)を示すアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードする。いくつかの態様では、オリベトール酸シンターゼポリヌクレオチドは、SEQ ID NO:4に記載の配列に対して約70%、75%、80%、85%、90%、95%、またはそれ以上の同一性を示すアミノ酸配列を含むIII型PKSをコードする。

天然の系で観察される基質特異性は、本明細書に記載のR¹基、例えばC₁～C₂₀ハロアルキル基、C₁～C₂₀ヒドロキシアルキル基、重水素化C₁～C₂₀アルキル基、トリチウム化C₁～C₂₀アルキル基、および/またはC₂～C₂₀アルケニル基を有するいくつかの出発原料まで発展しうる。同様に、本発明の方法において使用されるチオエステルは、天然の系で利用されるコエンザイムA(CoA)エステルに限定されない。R⁴は、以下に示すCoA部分であってもよく、ここで波線は、式IIのチオエステル中の硫黄原子に対するCoA部分の結合点を表す。

あるいは、R⁴はパンテテイン部分
であっても、またはシステアミン部分
であってもよく、式中、波線は、式IIのチオエステル中の硫黄原子に対するR⁴の結合点を表し、R^4aはHまたはアセチル(-C(O)CH₃)である。以下に記載のように、式IIのチオエステルは酵素的に形成または化学的に調製可能である。

2-アルキル-4,6-ジヒドロキシ安息香酸シクラーゼ
式IVの化合物を生成するために使用される宿主細胞を、2-アルキル-4,6-ジヒドロキシ安息香酸シクラーゼをコードする外因性ポリヌクレオチドを発現するように改変することができる。いくつかの態様では、2-アルキル-4,6-ジヒドロキシ安息香酸シクラーゼは、ストレプトマイセス属（Streptomyces）由来の二量体α+βバレル(DABB)型ポリケチドシクラーゼに似たDABBタンパク質ドメインである。オリベトール酸シクラーゼは例えばGagneら(Proc. Nat. Acad. Sci. USA 109 (31): 12811-12816; 2012)に記載されている。「2-アルキル-4,6-ジヒドロキシ安息香酸シクラーゼ」という用語は、シクラーゼ活性を示す変種、例えば切断型または改変型ポリペプチド; および天然相同体または天然オルソログを含む。いくつかの態様では、2-アルキル-4,6-ジヒドロキシ安息香酸シクラーゼはアサ由来のオリベトール酸シクラーゼ(EC番号4.4.1.26)である。いくつかの態様では、2-アルキル-4,6-ジヒドロキシ安息香酸シクラーゼはジバリン酸を生成する(例えばYang et al., FEBS J. 283:1088-1106, 2016参照)。いくつかの態様では、2-アルキル-4,6-ジヒドロキシ安息香酸シクラーゼはオリベトール酸シクラーゼ相同体であって、シロイヌナズナ(Arabidopsis thaliana)由来のAtHS1(Uniprot Q9LUV2)、ヤマナラシ(Populus tremula)由来のSP1(P0A881)、シロイヌナズナ由来のAt5g22580(Q9FK81)、ストレプトマイセス・グロセッセンス(S. glaucescens)由来のTcmIシクラーゼ(P39890)、ストレプトマイセス・セリカラー(S. coelicolor)由来のActVA-Orf6(Q53908)、シュードモナス・レイネケイ(P. reinekei)由来のMLMI(C5MR76)、ストレプトマイセス・ノガラター(S. nogalater)由来のSnoaB(O54259)、結核菌(M. tuberculosis)由来のRv0793(O86332)、または緑膿菌(P. aeruginosa)由来のPA3566(Q9HY51)である。いくつかの態様では、2-アルキル-4,6-ジヒドロキシ安息香酸シクラーゼは、SEQ ID NO:9に記載の、ストレプトマイセス属種、例えばストレプトマイセス属種A2991200のベナスタチン遺伝子クラスターのbenH遺伝子産物(B1GSN4)由来のシクラーゼドメインを含む。いくつかの態様では、2-アルキル-4,6-ジヒドロキシ安息香酸の2-アルキル基は1～18個の炭素原子を含む。いくつかの態様では、2-アルキル-4,6-ジヒドロキシ安息香酸の2-アルキル基は1～12個の炭素原子を含む。いくつかの態様では、2-アルキル-4,6-ジヒドロキシ安息香酸の2-アルキル基は1～9個の炭素原子を含む。

いくつかの態様では、2-アルキル-4,6-ジヒドロキシ安息香酸シクラーゼをコードするポリヌクレオチドは、SEQ ID NO:5、6、7、または9に記載の配列に対して約60%以上の同一性(例えば約60%、61%、62%、63%、64%、65%、66%、67%、68%、69%、70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、または100%の同一性)を示すポリペプチドをコードする。いくつかの態様では、ポリペプチドは、SEQ ID NO:5、6、7、または9に記載の配列に対して約70%、75%、80%、85%、90%、95%、またはそれ以上の同一性を示す。

アシル-CoAシンテターゼ
式IIのチオエステルを、宿主細胞によって酵素的に形成するか、または細胞培養前に化学的に形成することができる。いくつかの態様では、宿主細胞は、式IIaの出発原料
を式IIのチオエステルに変換するアシル-CoAシンテターゼをコードする第3のポリヌクレオチドをさらに含み、かつ、
段階 (a) は、該第3のポリヌクレオチドによりコードされる生成物が発現されて式IIのチオエステルが生成される条件下で、該宿主細胞を培養することを含む。

本明細書において使用される「アシル-CoAシンテターゼ」という用語は、「アシル-CoAシンターゼ」、「アシル活性化酵素」、または「アシル-CoAリガーゼ」と呼ばれることもあり、カルボン酸およびATPがピロリン酸(PPi)の放出によって酵素結合カルボキシル-AMP中間体(アデニル酸と呼ばれる)に変換される2段階プロセスを通じて、カルボン酸(例えば式IIaの酸出発原料)をアシル-CoAチオエステルに変換する酵素のことである。アデニル酸の活性化カルボニル炭素がCoAのチオールに結合した後、チオエステルおよびAMPの酵素放出が行われる。

任意の数のアシル-CoAシンテターゼを、式IIのチオエステルの形成のために使用することができる。アシル-CoAシンテターゼとしては短鎖アシル-CoAシンテターゼ(EC 6.2.1.1)、中鎖アシル-CoAシンテターゼ(EC 6.2.1.2)、長鎖アシル-CoAシンテターゼ(EC 6.2.1.3)、およびクマル酸-CoAリガーゼ(EC 6.2.1.12)が挙げられるがそれに限定されない。通常、アシル-CoAシンテターゼは、AMP結合モチーフと呼ばれる12アミノ酸残基ドメイン(PROSITE PS00455): [LIVMFY]-{E}-{VES}-[STG]-[STAG]-G-[ST]-[STEI]-[SG]-x-[PASLIVM]-[KR]を含む。PROSITE配列では、配列中の各位置は「-」で隔てられ、記号「x」は、任意の残基が配列中の所与の位置において許容されることを意味する。所与の位置において許容されるアミノ酸は角括弧の間に配置され(例えば、[ST]は、セリンまたはスレオニンが配列中の所与の位置において許容されることを意味する)、一方、所与の位置において許容されないアミノ酸は波括弧の間に配置される(例えば、{VES}は、バリン、グルタミン酸、およびセリン以外の任意の残基が配列中の所与の位置において許容されることを示す)。AMP結合モチーフは、ポリペプチドをアシル活性化酵素(AAE)として分類するために使用されており、シロイヌナズナ属（Arabidopsis）(Shockey et al., 2003, Plant Physiology 132: 1065-1076)、コナミドリムシ(Chlamydomonas reinhardtii)、コットンウッド(Populus trichocharpa)、およびニセツリガネゴケ(Physcomitrella patens)(Shockey and Browse, 2011, The Plant Journal 66: 143-160)に存在する大きなAAE遺伝子スーパーファミリーの同定に役立っている。アシル-CoAシンテターゼは例えばWO 2018/209143; Blackら(Biochim Biophys Acta. 1771(3):286-98, 2007); Miyazawaら(J. Biol. Chem 290 (45): 26994-27011, 2015); およびStoutら(Plant J. 71(3):353-365, 2012)にも記載されている。

いくつかの態様では、アシル-CoAシンテターゼは、レスベラトロールを生合成する生物に由来する。いくつかの態様では、アシル-CoAシンテターゼは、クワ属（Morus）またはブドウ属（Vitis）由来のクマル酸-CoAリガーゼである。いくつかの態様では、アシル-CoAシンテターゼは青枯病菌(Ralstonia solanacearum)に由来する。いくつかの態様では、青枯病菌由来のアシル-CoAシンテターゼはN末端において欠失がある。例えばSEQ ID NO:8参照。いくつかの態様では、膜貫通ドメインがアシル-CoAシンテターゼから欠失していることがある。

いくつかの態様では、宿主細胞は、ストレプトマイセス属種由来のrevSポリペプチド(例えばMiyazawa et al., J. Biol. Chem. 290:26994-27001, 2015参照)、またはアシル-CoAシンテターゼ活性を示すその変種、例えば天然相同体、天然オルソログ、もしくは非天然変種をコードする、外因性ポリヌクレオチドを発現するように遺伝子改変されている。いくつかの態様では、ポリヌクレオチドは、SEQ ID NO:1に記載の配列に対して約60%以上の同一性(例えば約60%、61%、62%、63%、64%、65%、66%、67%、68%、69%、70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、または100%の同一性)を示すポリペプチドをコードする。いくつかの態様では、ポリヌクレオチドは、SEQ ID NO:1に記載の配列に対して約70%、75%、80%、85%、90%、95%、またはそれ以上の同一性を示すRevSポリペプチドをコードする。いくつかの態様では、非天然変種は、例えばAMP結合モチーフまたは触媒部位の外の領域内で、SEQ ID NO:1に対する1個または複数の改変、例えば保存的置換などの置換を含む。

いくつかの態様では、宿主細胞は、アサ由来のアシル活性化酵素(CsAAE3)、またはアシル-CoAシンテターゼ活性を示すその変種、例えば天然相同体、天然オルソログ、もしくは非天然変種をコードする、外因性ポリヌクレオチドを発現するように遺伝子改変されている。いくつかの態様では、該ポリヌクレオチドによりコードされるCsAAE3ポリペプチドは、SEQ ID NO:2に記載の配列に対して少なくとも約60%以上の同一性(例えば約60%、61%、62%、63%、64%、65%、66%、67%、68%、69%、70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、または100%の同一性)を示すアミノ酸配列を含む。いくつかの態様では、アシル-CoAシンテターゼポリヌクレオチドはCsAAE3、またはSEQ ID NO:2に記載の配列に対して約70%、75%、80%、85%、90%、95%、またはそれ以上の同一性を示すアミノ酸配列を含むその相同体もしくは非天然変種をコードする。いくつかの態様では、非天然変種は、例えばAMP結合モチーフまたは触媒部位の外の領域内で、SEQ ID NO:2に対する1個または複数の改変、例えば保存的置換などの置換を含む。

いくつかの態様では、宿主細胞は、アサ由来のアシル活性化酵素(CsAAE1)、またはアシル-CoAシンテターゼ活性を示すその変種、例えば天然相同体、天然オルソログ、もしくは非天然変種をコードする、外因性ポリヌクレオチドを発現するように遺伝子改変されている。いくつかの態様では、該ポリヌクレオチドによりコードされるCsAAE1ポリペプチドは、SEQ ID NO:3に記載の配列に対して少なくとも約60%以上の同一性(例えば約60%、61%、62%、63%、64%、65%、66%、67%、68%、69%、70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、または100%の同一性)を示すアミノ酸配列を含む。いくつかの態様では、アシル-CoAシンテターゼポリヌクレオチドはCsAAE1、またはSEQ ID NO:2に記載の配列に対して約70%、75%、80%、85%、90%、95%、またはそれ以上の同一性を示すアミノ酸配列を含むその相同体をコードする。いくつかの態様では、CsAAE1ポリヌクレオチドは、膜貫通ドメインが欠失しているポリペプチドをコードする。いくつかの態様では、非天然変種は、例えばAMP結合モチーフまたは触媒部位の外の領域内で、SEQ ID NO:3に対する1個または複数の改変、例えば保存的置換などの置換を含む。

いくつかの態様では、R¹は4-フルオロブタン酸; 4,4,4-トリフルオロブタン酸; 2,2-ジフルオロブタン酸; ペルフルオロブタン酸; 5-フルオロペンタン酸; 2,2-ジフルオロペンタン酸; ペルフルオロペンタン酸; 6-フルオロヘキサン酸; 2,2-ジフルオロヘキサン酸; およびペルフルオロヘキサン酸より選択される。

いくつかの態様では、式IIaの出発原料中のR¹は、4-フルオロブタン酸、5-フルオロペンタン酸、および6-フルオロヘキサン酸からなる群より選択される。

いくつかの態様では、R¹は、4-クロロブタン酸、4-ブロモブタン酸、4-ヒドロキシブタン酸、5-クロロペンタン酸、5-ブロモペンタン酸、5-ヒドロキシペンタン酸、6-クロロヘキサン酸、6-ブロモヘキサン酸、6-ヒドロキシヘキサン酸、7-クロロヘプタン酸、7-ブロモヘプタン酸、および7-ヒドロキシヘプタン酸からなる群より選択される。いくつかの態様では、R¹はペルジュウテロヘキサン酸(すなわちD₁₁C₅COOH)である。

チオエステルの化学合成
式IIのチオエステルはCoA R⁴部分、パンテテインR⁴部分、またはシステアミンR⁴部分を含みうる。式IIのチオエステルは、上記の宿主細胞により発現されるアシル-CoAシンテターゼを使用して調製可能であり、あるいは、該チオエステルは、CoA、パンテテイン(すなわち2,4-ジヒドロキシ-3,3-ジメチル-N-[2-(2-スルファニルエチルカルバモイル)エチル]ブタンアミド)、またはシステアミン(すなわち2-アミノエタンチオール)を式IIaのカルボン酸またはその活性化誘導体で化学的にアシル化することで合成可能である。

数多くの好適なカルボン酸が市販されているか、またはFiesers' Reagents for Organic Synthesis Volumes 1-28 (John Wiley & Sons, 2016)、March (Advanced Organic Chemistry 6^th Ed. John Wiley & Sons, 2007)、およびLarock (Comprehensive Organic Transformations 3^rd Ed. John Wiley & Sons, 2018)に記載の方法を含む公知の方法に従って調製可能である。非限定的な例として、α-ハロゲン化カルボン酸を、Hell-Volhard-Zelinsky反応においてハロゲン(例えばBr₂)および触媒亜リン酸を使用することで調製することができる。別の非限定的な例として、フッ素化カルボン酸を、-SELECTFLUOR(クロロメチル-4-フルオロ-1,4-ジアゾニアビシクロ[2.2.2]オクタン ビス(テトラフルオロボレート))、およびBloomら(Angew. Chem. Int. Ed. 2012, 51, 1-5)に記載の銅(I)ビスイミン錯体を含む触媒系を使用して調製することができる。カルボン酸のヒドロキシル化を、KaoおよびSen(J. Chem. Soc., Chem. Commun., 1991, 1242-1243)の方法に従って、白金触媒を使用して行うことができる。カルボン酸の重水素化を、Yamadaら(RSC Adv., 2015,5, 13727-13732)の方法に従って、白金およびロジウム炭素を使用して行うことができる。

アシル化すべきチオール(例えばCoA、パンテテイン、またはシステアミン)のアシル化のために、式IIaのカルボン酸をカップリング剤との組み合わせで使用することができる。カップリング剤としては例えばカルボジイミド(例えばN,N'-ジシクロヘキシルカルボジイミド(DCC)、N,N'-ジシクロペンチルカルボジイミド、N,N'-ジイソプロピルカルボジイミド(DIC)、1-エチル-3-(3-ジメチルアミノプロピル)カルボジイミド(EDC)など)、ホスホニウム塩(HOBt、PyBOP、HOAtなど)、アミニウム/ウロニウム塩(例えばHATUなどのピリミジニウムウロニウム塩、テトラメチルアミニウム塩、ビスピロリジノアミニウム塩、ビスピペリジノアミニウム塩、イミダゾリウムウロニウム塩、N,N,N'-トリメチル-N'-フェニル尿素から誘導されるウロニウム塩、モルホリノ系アミニウム/ウロニウムカップリング試薬、アンチモン酸ウロニウム塩など)、有機リン試薬(例えばホスフィン酸誘導体およびリン酸誘導体)、有機硫黄試薬(例えばスルホン酸誘導体)、トリアジンカップリング試薬(例えば2-クロロ-4,6-ジメトキシ-1,3,5-トリアジン、4-(4,6-ジメトキシ-1,3,5-トリアジン-2-イル)-4メチルモルホリニウムクロリド、4-(4,6-ジメトキシ-1,3,5-トリアジン-2-イル)-4メチルモルホリニウムテトラフルオロボレートなど)、ピリジニウムカップリング試薬(例えば向山試薬、ピリジニウムテトラフルオロボレートカップリング試薬など)、ポリマー担持試薬(例えばポリマー結合カルボジイミド、ポリマー結合TBTU、ポリマー結合2,4,6-トリクロロ-1,3,5-トリアジン、ポリマー結合HOBt、ポリマー結合HOSu、ポリマー結合IIDQ、ポリマー結合EEDQなど)などが挙げられる。

あるいは、アシル化を、活性化カルボン酸誘導体、例えば酸無水物、混合無水物、酸塩化物、または活性化エステル(例えばペンタフルオロフェニルエステルもしくはN-ヒドロキシスクシンイミジルエステル)を使用して行うこともできる。通常、チオールに対して1～10モル当量のカルボン酸または活性化誘導体を使用する。例えば、1～5モル当量の酸/酸誘導体または1～2モル当量の酸/酸誘導体を使用することができる。いくつかの態様では、チオールに対して約1.0、1.1、1.2、1.3、1.4、または1.5モル当量の酸/酸誘導体を使用して式IIのチオエステルを形成する。

塩基を使用してカルボン酸または活性化カルボン酸誘導体によるチオールのアシル化を促進することができる。好適な塩基の例としては炭酸カリウム、炭酸ナトリウム、酢酸ナトリウム、ヒューニッヒ塩基(すなわちN,N-ジイソプロピルエチルアミン)、2,6-ルチジン(すなわち2,6-ジメチルピリジン)を含むルチジン、トリエチルアミン、トリブチルアミン、ピリジン、2,6-ジ-tert-ブチルピリジン、1,8-ジアザビシクロウンデカ-7-エン(DBU)、キヌクリジン、およびコリジンが挙げられる。2種以上の塩基の組み合わせを使用することができる。通常、チオールに対して1モル当量未満の塩基をチオエステルの形成において使用する。例えば、0.05～0.9モル当量または0.1～0.5モル当量の塩基を使用することができる。いくつかの態様では、チオールに対して約0.05、0.1、0.15、または0.2モル当量の塩基を酸/酸誘導体との組み合わせで使用して式IIのチオエステルを形成する。

任意の好適な溶媒を、チオエステルを形成するために使用することができる。好適な溶媒としてはトルエン、塩化メチレン、酢酸エチル、アセトニトリル、テトラヒドロフラン、ベンゼン、クロロホルム、ジエチルエーテル、ジメチルホルムアミド、ジメチルスルホキシド、石油エーテル、およびそれらの混合物が挙げられるがそれに限定されない。通常、アシル化反応を約25℃～約100℃の範囲の温度で、式IIのチオエステルを形成するために十分な期間にわたって行う。反応を、反応に使用される特定のチオールおよび酸/酸誘導体に応じて、数分間～数時間またはそれ以上の範囲の期間にわたって行うことができる。例えば、反応を約40℃、または約50℃、または約60℃、または約70℃、または約80℃で約10分間、または約30分間、または約1時間、または約2時間、または約4時間、または約8時間、または約12時間行うことができる。

アシル化段階中に望ましくない副反応を防止するために、システアミンの第一級アミンまたはパンテテインおよびCoAのヒドロキシル基などの官能基を保護することができる。アミン保護基の例としてはベンジルオキシカルボニル; 9-フルオレニルメチルオキシカルボニル(Fmoc); tert-ブチルオキシカルボニル(Boc); アリルオキシカルボニル(Alloc); p-トルエンスルホニル(Tos); 2,2,5,7,8-ペンタメチルクロマン-6-スルホニル(Pmc); 2,2,4,6,7-ペンタメチル-2,3-ジヒドロベンゾフラン-5-スルホニル(Pbf); メシチル-2-スルホニル(Mts); 4-メトキシ-2,3,6-トリメチルフェニルスルホニル(Mtr); アセトアミド; フタルイミド; などが挙げられるがそれに限定されない。アルコール保護基の例としてはベンジル; tert-ブチル; トリチル; tert-ブチルジメチルシリル(TBDMS; TBS); 4,5-ジメトキシ-2-ニトロベンジルオキシカルボニル(Dmnb); プロパルギルオキシカルボニル(Poc); などが挙げられるがそれに限定されない。Green and Wuts (Protective Groups in Organic Synthesis, 4^th Ed. 2007, Wiley-Interscience, New York)に記載のものを例えば含む他のアルコール保護基およびアミン保護基は当業者に公知である。アシル化段階後に当初の官能基を回復するために、保護基を標準的条件下で除去することができる。

プレニルトランスフェラーゼ
いくつかの態様では、組換え宿主細胞は、活性化プレニル種(例えばゲラニルピロリン酸)を式IVの化合物または式IVaの化合物に結合させることで式IVおよび式Vaの化合物を形成することを触媒するプレニルトランスフェラーゼをコードする外因性ポリヌクレオチドを発現するようにさらに改変されている。プレニルトランスフェラーゼの例としては、FellermeierおよびZenk (FEBS Letters 427:283-285; 1998)に記載のゲラニルピロリン酸:オリベトール酸ゲラニルトランスフェラーゼ(GOT; EC 2.5.1.102)、ならびにWO 2018/200888およびWO 2019/071000に記載のアサプレニルトランスフェラーゼが挙げられるがそれに限定されない。Kumanoら(Bioorg Med Chem. 16(17): 8117-8126; 2008)に記載のNphBを含むストレプトマイセスプレニルトランスフェラーゼを本発明に従って使用してもよい。いくつかの態様では、プレニルトランスフェラーゼはfnq26というストレプトマイセス・シンナモネンシス(Streptomyces cinnamonensis)由来のフラビオリンリナリルトランスフェラーゼである。いくつかの態様では、プレニルトランスフェラーゼを発現するように遺伝子改変された宿主細胞は、以下に記載の改変宿主細胞でありうる。

したがって、本開示のいくつかの態様は、上記式IVの化合物を式Vの化合物
またはその塩に変換する段階を含む方法を提供し、式中、R³はプレニル部分である。例えば、R³は、シス(Z)配置および/またはトランス(E)配置で炭素-炭素二重結合を含むゲラニル、ファルネシル、またはゲラニルゲラニルでありうる。いくつかの態様は、式IVaの脱炭酸化合物
を、式Vaの化合物
に変換する段階を含む方法を提供し、式中、R³はプレニル部分である。

いくつかの態様では、ゲラニルピロリン酸:オリベトール酸ゲラニルトランスフェラーゼのDNA構築物が、酵母選択的コドンを有する野生型または変異酵素をコードする。いくつかの態様では、緩和された基質特異性を示す細菌プレニルトランスフェラーゼ(例えばストレプトマイセスプレニルトランスフェラーゼ)をコードするDNA構築物を使用する(Kumano et al., 2008)。

プレニル化化合物の培養および生成中に、ゲラニオールなどの外因性プレニル種を宿主細胞に供給することができる。あるいは、高レベルのプレニル前駆体、例えばプレノール、イソプレノール、ゲラニオールなどを含む培地中で宿主細胞を培養することもできる。複数前駆体供給(MPF)を含む手法では、5-炭素プレノールおよびイソプレノールを酵素的に一リン酸レベルに(すなわちジメチルアリル一リン酸およびイソペンテニル一リン酸塩に)、次に二リン酸レベルに(すなわちジメチルアリルピロリン酸およびイソペンテニルピロリン酸に)変換した後、結合させて10-炭素ゲラニルピロリン酸を形成することができる。

いくつかの態様では、最初のリン酸化事象を酵素ヒドロキシエチルチアゾールキナーゼが触媒する。この酵素は、大腸菌(E. coli)、枯草菌(Bacillus subtilis)、エンドウ根粒菌(Rhizobium leguminosarum)、パイロコッカス・ホリコシイ(Pyrococcus horikoshii)、S. セレビシエ(S. cerevisiae)、およびトウモロコシ種を含む、コード遺伝子が誘導されているいくつかの生物において、記載されている。二リン酸レベルへのさらなるリン酸化を、米国特許第6,235,514号に記載の酵素イソプレニル二リン酸シンターゼまたはイソペンテニルリン酸キナーゼを使用して実現することができる。いくつかの態様では、この酵素をコードする化学合成遺伝子、またはより高活性の変異体を、サーモプラズマ・アシドフィルム(Thermoplasma acidophilum)、メタノサーモバクター・サームオートトロフィカス(Methanothermobacter thermautotrophicus)、メタノカルドコックス・ヤンナスキイ(Methano-caldococcus jannaschii)、ペパーミント(Mentha x piperita)、もしくはマンゴー(Mangifera indica)のアミノ酸配列、またはキナーゼ活性を示す他の相同配列を使用して誘導する。ゲラニルピロリン酸を形成するための結合を、ゲラニルピロリン酸シンターゼ(GPPシンターゼ)などのトランスフェラーゼ酵素が触媒することができる。

10-炭素ゲラニルピロリン酸を、ゲラニオールを一リン酸レベルにリン酸化するキナーゼ、続いてゲラニルピロリン酸を生じさせる第2のキナーゼによって産生することもできる。いくつかの態様では、第1のキナーゼ事象は酵素ファルネソールキナーゼ(FOLK)(Fitzpatrick, Bhandari and Crowell, 2011; Plant J. 2011 Jun;66(6):1078-88)またはその変種により行われる。このキナーゼ酵素は、植物(シロイヌナズナ、ナガミノアマナズナ(Camelina sativa)、カプセラ・ルベラ(Capsella rubella)、ノカエア・カエルレセンス(Noccaea caerulescens)など)および真菌(カンジダ・アルビカンス(Candida albicans)、タラロマイセス・アトロロセウス(Talaromyces atroroseus)など)を含む、5-炭素プレノールをリン酸化する能力を示すいくつかの生物に存在する。ゲラニルリン酸からゲラニルピロリン酸レベルへのさらなるリン酸化を、イソペンテニル一リン酸キナーゼ(IPK)またはその変種を使用して実現することができる。このキナーゼ酵素は、メタノカルドコックス・ヤンナスキイおよびサーモプラズマ・アシドフィルムを含むがそれに限定されないいくつかの細菌種および古細菌種に見られる。IPKの特定の変異(Val73、Val130、Ile140)がゲラニルリン酸キナーゼ活性を高めることが報告されている(Mabanglo et al., 2012, ACS Chem. Biol., 7, 7, 1241-1246)。

いくつかの態様では、宿主細胞は、以下の3種の外因性ポリヌクレオチドより選択される1種または複数のさらなる外因性ポリヌクレオチドを含む: プレノールおよびイソプレノールキナーゼをコードする外因性ポリヌクレオチド; 外因性プレノールおよびイソプレノールの存在下で増殖する際にジメチルアリルピロリン酸およびイソペンテニルピロリン酸を生成するキナーゼをコードする外因性ポリヌクレオチド; ならびにゲラニルピロリン酸シンターゼをコードする外因性ポリヌクレオチド。

化学的プレニル化
いくつかの態様では、変換段階をインビトロで行う。例えば、変換段階は、(1) 式IVまたは式IVaの化合物と、(2) ゲラニオール、活性化ゲラニオール(例えばゲラニルブロミド、ゲラニルクロリド、ゲラニルトシレート、ゲラニルメシレートなど)、またはシトラールと、(2) 有機溶媒とを含む反応混合物を、式Vまたは式Vaの化合物を生成するために十分な条件下で形成させることを含みうる。

任意の好適な有機溶媒を、本明細書において提供される化学的プレニル化段階において使用することができる。好適な溶媒としてはトルエン、塩化メチレン、ジクロロエタン、酢酸エチル、アセトニトリル、テトラヒドロフラン、ベンゼン、エチルベンゼン、キシレン(すなわちm-キシレン、o-キシレン、p-キシレン、またはそれらの任意の組み合わせ)、クロロホルム、ジエチルエーテル、ジメチルホルムアミド、ジメチルスルホキシド、石油エーテル、およびそれらの混合物が挙げられるがそれに限定されない。いくつかの態様では、有機溶媒はトルエン、ベンゼン、エチルベンゼン、キシレン、またはそれらの混合物である。いくつかの態様では、有機溶媒はトルエンである。いくつかの態様では、有機溶媒はジクロロエタンである。水性有機溶媒混合物(すなわち水とテトラヒドロフランまたはジメチルホルムアミドなどの水混和性有機溶媒との混合物)を使用してもよい。一般に、溶媒対式IVまたは式IVaの化合物の比は重量比で約1:1～約1000:1の範囲である。例えば、溶媒対式IVまたは式IVaの化合物の比は重量比で約100:1、または重量比で約10:1、または重量比で約5:1でありうる。特定の態様では、式IVまたは式IVaの化合物は酵母混合物(例えば乾燥酵母細胞、または培地から回収された湿潤酵母細胞ペレット)中に存在する。いくつかの当該の態様では、反応混合物は宿主細胞(例えば乾燥酵母細胞)を含む。溶媒対酵母混合物(例えば乾燥酵母細胞)の比は重量比で約1:1～約1000:1の範囲でありうる。例えば、溶媒対酵母混合物の比は重量比で約100:1、または重量比で約10:1、または重量比で約5:1、または重量比で約2:1でありうる。

任意の好適な量のゲラニオール、活性化ゲラニオール、またはシトラールを変換段階において使用することができる。一般に、反応混合物は式IVまたは式IVaの化合物に対して少なくとも1モル当量のゲラニオール、活性化ゲラニオール、またはシトラールを含む。例えば、反応混合物は式IVまたは式IVaの化合物に対して約1モル当量～約10モル当量(例えば約1.1モル当量、または約1.2モル当量、または約2モル当量)のゲラニオール、活性化ゲラニオール、またはシトラールを含みうる。

ゲラニオールまたは活性化ゲラニオールが使用される態様を含むいくつかの態様では、反応混合物は酸をさらに含む。任意の好適な酸を変換段階において使用することができる。好適な酸の例としては塩酸、硫酸、硝酸、ギ酸、酢酸、トリフルオロ酢酸、p-トルエンスルホン酸、メタンスルホン酸、およびトリフルオロメタンスルホン酸が挙げられるがそれに限定されない。いくつかの態様では、酸はスルホン酸である。いくつかの態様では、酸はp-トルエンスルホン酸である。任意の好適な量の酸を変換段階において使用することができる。一般に、反応混合物は式IVまたは式IVaの化合物に対して約0.01モル当量～約10モル当量(例えば約0.01モル当量、または約0.1モル当量、または約1モル当量)の酸(例えばp-トルエンスルホン酸)を含む。

シトラールが使用される態様を含むいくつかの態様では、反応混合物はジアミン(例えば1,2-ジアミン)などのアミンをさらに含む。任意の好適なジアミンまたは他のアミンを変換段階において使用することができる。好適なジアミンの例としてはエチレンジアミン、N,N-ジメチルエチレンジアミン、N,N-ジエチルエチレンジアミン、N,N'-ジメチルエチレンジアミン、N,N'-ジフェニルエチレンジアミン、N,N'-ジベンジルエチレンジアミン、およびN,N'-ビス(2-ヒドロキシエチル)エチレンジアミンが挙げられるがそれに限定されない。いくつかの態様では、プレニル化反応混合物はシトラールおよびN,N-ジメチルエチレンジアミンを含む。任意の好適な量のアミンを変換段階において使用することができる。一般に、反応混合物は式IVまたは式IVaの化合物に対して約0.01モル当量～約10モル当量(例えば約0.01モル当量、または約0.25モル当量、または約0.1モル当量、または約1モル当量)のアミン(例えばN,N-ジメチルエチレンジアミン)を含む。

いくつかの態様では、キラルジアミン(例えば(1S,2S)-1,2-ジ-1-ナフチル-エチレンジアミン、(S)-1-[(1-メチル-2-ピロリジニル)メチル]ピペリジンなど)がプレニル化カンナビノイド生成物中での1個または複数の立体中心の形成に役立ちうる。例えば、キラルジアミンの存在下でのオリベトール酸類似体(例えばペルジュウテロペンチル-オリベトール酸)とシトラールとの反応により、対応するカンナビクロメン類似体を立体選択的に得ることができる。キラルジアミンは、特定のカンナビクロメン類似体鏡像異性体(例えば(S)-2-メチル-2-(4-メチルペンタ-3-エン-1-イル)-7-ペルジュウテロペンチル-2H-クロメン-5-オールまたは(R)-2-メチル-2-(4-メチルペンタ-3-エン-1-イル)-7-ペルジュウテロペンチル-2H-クロメン-5-オール)を生成するように選択可能である。また、キラルジアミンを、本明細書に記載のR¹位において非置換アルキル基を有するカンナビノイドの立体選択的合成において使用することもできる。いくつかの態様では、例えば、R¹はC₁～C₁₀アルキルであることができ、プレニル化カンナビノイド生成物を形成することは、5-アルキル-レゾルシノール(例えばオリベトールまたはジバリノール、すなわち5-プロピルレゾルシノール)または2-アルキル-4,6-ジヒドロキシ安息香酸(例えばオリベトール酸またはジバリン酸)とシトラールとをキラルジアミンの存在下で反応させることでプレニル化生成物(例えばカンナビクロメン、カンナビクロメン酸、またはその類似体)を立体選択的に形成することを含みうる。あるいは、鏡像異性体混合物(例えばラセミ混合物)を調製してもよく、所望の鏡像異性体をキラルクロマトグラフィーまたは選択的結晶化により単離してもよい。

任意の好適な温度で化学的プレニル化変換段階を行うことができる。通常、変換段階は約20℃～約200℃、例えば約20℃～約100℃、または約20℃～約80℃、または約20℃～約70℃の範囲の温度で行う。変換段階は、非プレニル化化合物をプレニル化生成物に変換するために十分な時間にわたって行う。使用される特定のプレニル化合物、使用される特定の溶媒、および非プレニル化化合物の状態(例えば酵母混合物中に存在)などの要因に応じて、変換時間は数分から数時間までの範囲となる。いくつかの態様では、反応混合物を約20℃～約100℃の範囲の温度(例えば約60℃)に約5分～約360分の範囲の時間にわたって維持する。いくつかの態様では、反応混合物を60℃または約60℃に60分間未満(例えば約55分間、または約30分間、または約15分間、または約10分間)維持する。いくつかの態様では、反応混合物を20℃～25℃(例えば約23℃)に1時間以上(例えば約60分間、または約2時間、または約4時間、または約12時間、または約18時間、または約24時間)維持する。

宿主細胞
いくつかの態様では、宿主細胞は、アシル-CoAシンテターゼ、例えばrevSポリペプチド、CsAAE3、もしくはCsAAE1ポリペプチドをコードする外因性ポリヌクレオチド; オリベトール酸シンターゼをコードする外因性ポリヌクレオチド; および/または上記の2-アルキル-4,6-ジヒドロキシ安息香酸シクラーゼ(例えばオリベトール酸シクラーゼがアミノ末端、カルボキシ末端、もしくは両末端において切断されている態様を含むオリベトール酸シクラーゼ)をコードする外因性ポリヌクレオチドを発現するように、改変されている。

任意の方法論を使用してポリヌクレオチドを宿主細胞に導入することができる。いくつかの態様では、本明細書に記載の2種以上の酵素、例えばアシル-CoAシンテターゼ、オリベトール酸シンターゼ、例えばrevSまたはCsAAE3、および2-アルキル-4,6-ジヒドロキシ安息香酸シクラーゼ(例えばオリベトール酸シクラーゼまたはその遺伝子操作変異体)のうち2種をコードする外因性ポリヌクレオチドが、同じ発現構築物、例えば自己複製発現ベクター中に存在し、また、発現が同じプロモーターにより駆動されるマルチシストロンRNAとして発現される。したがって、例えば、いくつかの態様では、オリベトール酸シンターゼをコードする外因性ポリヌクレオチド、および2-アルキル-4,6-ジヒドロキシ安息香酸シクラーゼ(例えばオリベトール酸シクラーゼ)をコードする外因性ポリヌクレオチドが、同じ発現構築物、例えば自己複製発現ベクターに含まれており、配列内リボソーム進入部位(IRES)により隔てられ、そのような発現が同じプロモーターにより駆動されることでマルチシストロンmRNAが産生される。いくつかの態様では、プロモーターはアルコール脱水素酵素2プロモーターである。いくつかの態様では、外因性ポリヌクレオチドは同じ発現構築物、例えば自己複製発現ベクター中に存在しており、別々のプロモーターに動作可能に連結されている。いくつかの態様では、外因性ポリヌクレオチドは2個以上の発現構築物、例えば自己複製発現ベクター中に存在する。いくつかの態様では、自己複製発現ベクターは酵母人工染色体である。いくつかの態様では、1個または複数の外因性ポリヌクレオチドが宿主ゲノムに組み込まれている。いくつかの態様では、複数の外因性ポリヌクレオチドがレトロトランスポゾンの組込みにより宿主細胞に導入されている。

いくつかの態様では、カンナビノイド化合物が、宿主細胞中で発現される式IVまたは式IVaの化合物を使用して生成され、宿主細胞は、プレニルトランスフェラーゼ; プレノールおよびイソプレノールキナーゼ; 外因性プレノールおよびイソプレノールの存在下で増殖する際にジメチルアリルピロリン酸およびイソペンテニルピロリン酸を生成するキナーゼ; または本明細書に記載のゲラニルピロリン酸シンターゼをコードするポリヌクレオチドを発現するようにさらに改変されている。前段落に記載のように、これらのポリヌクレオチドは同じまたは別々の発現ベクターに含まれうる。

いくつかの態様では、改変組換え宿主細胞は、宿主細胞中で生成される第1のカンナビノイド化合物中間体の変換を触媒して第2のカンナビノイド化合物を形成するカンナビノイドシンターゼ酵素をコードする、外因性ポリヌクレオチドをさらに含む。

いくつかの態様では、宿主細胞は酵母、またはアスペルギルス属（Aspergillus ）宿主細胞などの糸状菌宿主細胞である。宿主細胞として使用可能な酵母の属種としてはサッカロマイセス属（Saccharomyces）、シゾサッカロマイセス属（Schizosaccharomyces）、カンジダ属（Candida）、ハンゼヌラ属（Hansenula）、ピキア属（Pichia）、クリベロマイセス属（Kluyveromyces）、ヤロウイア属（Yarrowia ）、およびファフィア属（Phaffia）の細胞が挙げられるがそれに限定されない。好適な酵母種としてはサッカロマイセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）、シゾサッカロマイセス・ポンベ(Schizosaccharomyces pombe)、カンジダ・アルビカンス、ハンセヌラ・ポリモルファ(Hansenula polymorpha)、ピキア・パストリス(Pichia pastoris)、パピリオ・カナデンシス(P. canadensis)、クリベロマイセス・マルクシアヌス(Kluyveromyces marxianus)、クリベロマイセス・ラクティス(Kluyveromyces lactis)、ファフィア・ロドジマ(Phaffia rhodozyma)、およびヤロウィア・リポリティカ(Yarrowia lipolytica)が挙げられるがそれに限定されない。宿主細胞として使用可能な糸状菌属としてはアクレモニウム属（Acremonium)、アスペルギルス属（Aspergillus)、アウレオバシジウム属（Aureobasidium)、ブエルカンデラ属（Bjerkandera)、セリポリオプシス属（Ceriporiopsis)、クリソスポリウム属(Chrysoporium)、ヒトヨタケ属（Coprinus)、カワラタケ属（Coriolus)、コリナスカス属（Corynascus)、ケトミウム属(Chaertomium)、クリプトコッカス属（Cryptococcus)、フィロバシディウム属（Filobasidium)、フザリウム属（Fusarium)、ジベレラ属（Gibberella)、フミコラ属（Humicola)、マグナポルテ属（Magnaporthe)、ケカビ属（Mucor)、ミセリオフトラ属（Myceliophthora)、ケカビ属（Mucor)、ネオカリマスティクス属（Neocallimastix)、アカパンカビ属（Neurospora)、ペシロマイセス属（Paecilomyces)、アオカビ属（Penicillium)、ファネロカエテ属（Phanerochaete)、シワウロコタケ属（Phlebia)、ピロミセス属（Piromyces)、ヒラタケ属（Pleurotus)、シタリジウム属(Scytaldium)、スエヒロタケ属（Schizophyllum)、スポロトリクム属（Sporotrichum)、タラロマイセス属（Talaromyces)、サーモアスカス属（Thermoascus)、チエラビア属（Thielavia)、トリポクラジウム属（Tolypocladium)、ホウロクタケ属（Trametes)、およびトリコデルマ属（Trichoderma）の細胞が挙げられるがそれに限定されない。糸状菌種の例示的な種としてはアワモリコウジカビ(Aspergillus awamori)、アスペルギルス・フミガーツス(Aspergillus fumigatus)、アスペルギルス・フォエティダス(Aspergillus foetidus)、アスペルギルス・ジャポニクス(Aspergillus japonicus)、アスペルギルス・ニデュランス(Aspergillus nidulans)、クロコウジカビ(Aspergillus niger)、コウジカビ(Aspergillus oryzae)、クリソスポリウム・ルクノウェンス(Chrysosporium lucknowense)、フザリウム・バクトリジオイデス(Fusarium bactridioides)、フザリウム・セレアリス(Fusarium cerealis)、フザリウム・クルックウェレンス(Fusarium crookwellense)、フザリウム・クルモルム(Fusarium culmorum)、フザリウム・グラミネアルム(Fusarium graminearum)、フザリウム・グラミヌム(Fusarium graminum)、フザリウム・ヘテロスポルム(Fusarium heterosporum)、フザリウム・ネグンディ(Fusarium negundi)、フザリウム・オキシスポルム(Fusarium oxysporum)、フザリウム・レチクラツム(Fusarium reticulatum)、フザリウム・ロゼウム(Fusarium roseum)、フザリウム・サムブシヌム(Fusarium sambucinum)、フザリウム・サルコクロウム(Fusarium sarcochroum)、フザリウム・スポロトリキオイデス(Fusarium sporotrichioides)、フザリウム・スルフレウム(Fusarium sulphureum)、フザリウム・トルロスム(Fusarium torulosum)、フザリウム・トリコテシオイデス(Fusarium trichothecioides)、フザリウム・ベネナツム(Fusarium venenatum)、ブエルカンデラ・アズスタ(Bjerkandera adusta)、セリポリオプシス・アネイリナ(Ceriporiopsis aneirina)、セリポリオプシス・アネイリナ、セリポリオプシス・カレギエア(Ceriporiopsis caregiea)、セリポリオプシス・ギルベセンス(Ceriporiopsis gilvescens)、セリポリオプシス・パンノシンタ(Ceriporiopsis pannocinta)、セリポリオプシス・リブロサ(Ceriporiopsis rivulosa)、セリポリオプシス・スブルファ(Ceriporiopsis subrufa)、セリポリオプシス・スブベルミスポラ(Ceriporiopsis subvermispora)、ネナガヒトヨタケ(Coprinus cinereus)、コリオリス・ヒルスツス(Coriolus hirsutus)、フミコラ・インソレンス(Humicola insolens）、フミコラ・ラヌギノサ(Humicola lanuginosa)、ムコール・ミエヘイ(Mucor miehei)、ミセリオフトラ・サーモフィラ(Myceliophthora thermophila)、アカパンカビ(Neurospora crassa)、ネウロスポラ・インテルメディア(Neurospora intermedia)、ペニシリウム・プルプロゲヌム(Penicillium purpurogenum)、ペニシリウム・カネセンス(Penicillium canescens)、ペニシリウム・ソリツム(Penicillium solitum)、ペニシリウム・フニクロスム(Penicillium funiculosum)、ファネロカエテ・クリソスポリウム(Phanerochaete chrysosporium)、フレビア・ラジアータ(Phlebia radiate)、エリンギ(Pleurotus eryngii)、タラロマイセス・フラバス(Talaromyces flavus)、チエラビア・テレストリス(Thielavia terrestris)、トラメテス・ビロサ(Trametes villosa)、カワラタケ(Trametes versicolor)、トリコデルマ・ハルジアヌム(Trichoderma harzianum)、トリコデルマ・コニンギイ(Trichoderma koningii)、トリコデルマ・ロンギブラキアツム(Trichoderma longibrachiatum)、トリコデルマ・リーゼイ(Trichoderma reesei)、およびトリコデルマ・ビリデ(Trichoderma viride)が挙げられる。

いくつかの態様では、宿主細胞は、サッカロマイセス・セレビシエ、クリベロマイセス・ラクティス、クリベロマイセス・マルクシアヌス、ピキア・パストリス、ヤロウィア・リポリティカ、ハンセヌラ・ポリモルファ、およびアスペルギルス属からなる群より選択される。

上記態様では、遺伝子は、酵母コドン最適化により、アサ、シロイヌナズナ、またはシュードモナス（Pseudomonas）属種に由来する野生型または変異酵素をコードする化学合成遺伝子によって、コードされうる。

S. セレビシエおよび他の酵母中の遺伝子の転写を駆動するために使用されるプロモーターは、当技術分野において周知であり、アルコール脱水素酵素2(ADH2)プロモーターなどの、増殖培地中でグルコース濃度により制御されるDNAエレメントが挙げられる。条件的発現が必要である場合、他の制御性プロモーターまたは誘導性プロモーター、例えばGAL1、MET25、およびCUP1遺伝子の発現を駆動するプロモーターが使用される。GAL1、CUP1はそれぞれガラクトース、銅により誘導され、一方、MET25はメチオニンの非存在下で誘導される。

いくつかの態様では、1個または複数の外因性ポリヌクレオチドがグルコース制御性プロモーターに動作可能に連結されている。いくつかの態様では、1個または複数の外因性ポリヌクレオチドの発現がアルコール脱水素酵素2プロモーターにより駆動される。

他のプロモーターは構成的様式で転写を強力に駆動する。これらのプロモーターとしては、グリセルアルデヒド-3-リン酸脱水素酵素(GPD)、ホスホグリセリン酸キナーゼ(PGK)、ピルビン酸キナーゼ(PYK)、トリオースリン酸イソメラーゼ(TPI)、エノラーゼ(ENO2)、およびアルコール脱水素酵素1(ADH1)などの高発現酵母解糖酵素の調節エレメントが挙げられるがそれに限定されない。使用可能である他の強力な構成的プロモーターとしては、S. セレビシエ転写伸長因子EF-1α遺伝子(TEF1およびTEF2)に由来するプロモーター(Partow et al., Yeast. 2010, (11):955-64; Peng et al., Microb Cell Fact. 2015, (14):91-102)、ならびにS. セレビシエのジオーキシックシフト後に低グルコース条件下で十分に機能する高親和性グルコース輸送体(HXT7)およびシャペロニン(SSA1)プロモーター(Peng et al., Microb Cell Fact. 2015, (14):91-102)がある。

他の態様では、宿主細胞は、前駆体プールなどを増加させることでカンナビノイド生成を増加させることができる。マロン酸供給によるマロニル-CoAシンターゼ(Mutka et al., FEMS Yeast Res. 2006)ならびにアセチル-CoAカルボキシラーゼ1および2などの酵素の異種由来の天然または化学合成遺伝子が、PKS生合成に重要なマロニル-CoAを上方制御する。同様に、アセチル-CoAシンターゼ-1および-2、ならびにメバロン酸経路中での他の遺伝子産物、例えばアセトアセチル-CoAチオラーゼまたはストレプトマイセス属種由来のNphT7遺伝子産物(Okamura et al., Proc Natl Acad Sci USA. 2010)、HMG-CoAシンターゼ、メバロン酸キナーゼ、ホスホメバロン酸キナーゼ、メバロン酸二リン酸デカルボキシラーゼ、イソペンテニル二リン酸:ジメチルアリル二リン酸イソメラーゼ、HMG-CoA還元酵素、サッカロマイセス属または他の真核生物種由来の変異ファルネシルピロリン酸シンターゼ(ERG20; Zhao et al., 2016)を、当業者に周知の方法を使用して、高レベル発現プラスミドベクター上にまたはゲノムの組込みを通じて導入することもできる。該方法はCRISPR Cas-9技術、酵母人工染色体(YAC)、またはレトロトランスポゾンの使用を包含しうる。あるいは、宿主生物にとって自然であれば、これらの遺伝子を、当業者に公知の遺伝子エレメント組込み方法により上方制御することもできる。

さらに他の局面では、炭素源を利用する天然物、例えばエタノールの生成を減少させるために同様の遺伝子操作を使用することができ、これが、カンナビノイド生成のための該炭素源の利用の減少をもたらす。これらの遺伝子は、ゲノムから欠失によって完全に「ノックアウト」されていることもあれば、プロモーター強度の低下などを通じて活性が低下していることもある。これらの遺伝子としては酵素ADH1および/またはADH6の遺伝子が挙げられる。他の遺伝子「ノックアウト」としては、エルゴステロール経路に関与する遺伝子、例えば、ERG9、ならびに酵母の最も有望な2種の芳香族デカルボキシラーゼ遺伝子PAD1およびFDC1が挙げられる。

さらなる態様としては、最終生成物カンナビノイドの生成を促進することを目的とするアクセサリー酵素の遺伝子が挙げられる。この酵素の1種であるカタラーゼは、CBGAおよび類似体の酸化的環化に関与する特定の酵素、例えばカンナビジオール酸シンターゼ(Taura et al., 2007, FEBS Lett 581: 2929-2934)、Δ⁹-テトラヒドロカンナビノール酸シンターゼ(Sirikantaramas et al., 2004, J. Biol. Chem., 279:39767-39774.)、およびカンナビクロメン酸シンターゼ(Morimoto et al., 1998, Phytochemistry 49: 1525-1529)により生成される過酸化水素を中和可能である。

さらなる態様では、遺伝子操作宿主細胞は、例えばカンナビノイド生合成用の前駆体プールを最適化するように上方制御または下方制御された内在性遺伝子または異種由来遺伝子を含む。さらに、細胞内で「アクセサリー」機能を示すように、さらなる異種由来遺伝子産物を発現させることができる。例えば、CBDA、Δ⁹-THCA、およびCBCAなどの重要な酸性カンナビノイドが得られる酸化的環化段階において形成される過酸化水素を中和するように、過剰発現カタラーゼを発現させることができる。「アクセサリー」遺伝子およびそれらの発現生成物は、当技術分野において周知の技術を通じた酵母ゲノムへの組込みを通じて得てもよく、プラスミド(酵母発現ベクターとしても知られる)、酵母人工染色体(YAC)、または酵母トランスポゾンから発現させてもよい。

いくつかの態様では、以下でさらに説明するように、上記各遺伝子を含むプラスミドもしくはベクターによって形質転換されたかまたはゲノムが組み込まれた宿主細胞、例えば酵母株は、CBGAまたはCBGA類似体の変換用の別の発現系と共に、第2の酸性カンナビノイドに形質転換される。いくつかの当該の態様では、発現系は、同じベクターもしくは別々のベクター上にあるか、または宿主細胞ゲノムに組み込まれている。

カンナビノイドを生成する本発明の遺伝子操作細胞は、宿主細胞の形質転換を、ゲノムの組込みを通じて行うか、あるいは遺伝子操作代謝経路に関与する少なくとも1個のヌクレオチド配列コード酵素と共にエピソームプラスミド(発現ベクター、または単にベクターとも呼ばれる)を使用して行うことで、作製可能である。本明細書において使用される「ヌクレオチド配列」、「核酸配列」、および「遺伝子構築物」という用語は、互換的に使用されるものであり、合成、非天然、または改変ヌクレオチド塩基を任意で含む一本鎖または二本鎖のRNAまたはDNAのポリマーを意味する。ヌクレオチド配列はcDNA、ゲノムDNA、合成DNA、またはRNAの1個または複数のセグメントを含みうる。いくつかの態様では、ヌクレオチド配列は、ヌクレオチド配列によりコードされるポリペプチドを改変することなく宿主細胞の通常のコドン使用を反映するようにコドン最適化されている。特定の態様では、「コドン最適化」または「コドン最適化された」という用語は、特定の宿主細胞中での発現を高めるように、核酸によりコードされるポリペプチドの配列を改変することなく該核酸配列のコドンの内容を改変することを意味する。特定の態様では、この用語は、ポリペプチドの発現レベルを調節する(例えば発現レベルを増加または減少させる)ための手段として核酸配列のコドンの内容を改変することを包含するように意図されている。したがって、代謝経路の遺伝子操作に関与する酵素をコードする核酸配列が記載される。いくつかの態様では、代謝的に遺伝子操作された細胞は、以下に記載の段階を行うために必要な酵素活性を示す1個または複数のポリペプチドを発現しうる。いくつかの態様では、ヌクレオチド配列が酵母中での発現のために米国特許第7,561,972号に記載の方法に従って合成およびコドン最適化される。

例えば、特定の細胞が1個、2個、3個、4個、5個、または5個超の核酸配列を含むことがあり、各1個の核酸配列は、カンナビノイド化合物、または本明細書に記載のカンナビノイド化合物中間体を生成するために必要なポリペプチドをコードする。あるいは、1個の核酸分子が1個または1個超のポリペプチドをコードすることもある。例えば、1個の核酸分子が、2個、3個、4個、さらには5個の異なるポリペプチドをコードする核酸配列を含むことがある。本明細書に記載の本発明に有用な核酸配列を、多様な供給源、例えばcDNA配列の増幅、DNAライブラリー、新規合成、ゲノムセグメントの切除により得ることができる。次に、これらの供給源により得られた配列を、標準的な分子生物学的技術および/または組換えDNA技術を使用して改変することで、所望の改変を有する核酸配列を生成することができる。核酸配列の改変に関する例示的な方法としては、例えば、部位指向性変異誘発、PCR変異誘発、任意でライゲーションと組み合わせた制限酵素を使用した配列の一部分の欠失、挿入、置換、交換、相同組換え、部位特異的組換え、またはそれらの様々な組み合わせが挙げられる。他の態様では、核酸配列は合成核酸配列でありうる。合成ポリヌクレオチド配列は、米国特許第7,323,320号ならびに米国特許出願公開第2006/0160138号および第2007/0269870号に記載の種々の方法を使用して生成可能である。酵母細胞の形質転換方法は当技術分野において周知である。

発酵条件
一般に、本明細書において提供される方法によるカンナビノイド生成は、上記の発現系を含むように遺伝子操作された宿主細胞(例えば酵母または糸状菌)の培養を含む。いくつかの態様では、酵母増殖の炭素源としては、例えば糖、例えばグルコース、ブドウ糖、キシロース、または他の持続可能な原料糖、例えばセルロース源に由来する原料糖がある。他の態様では、使用される炭素源はメタノール、グリセロール、エタノール、または酢酸塩でありうる。いくつかの態様では、HPLCなどの分析技術を使用して測定される酵母増殖レベルおよび最終カンナビノイド生成レベルを最適化するように、原料組成を実験によって精密化する。当該の態様では、方法は、グルコース対2炭素源(エタノールまたは酢酸塩)のモル比が50/50、60/40、80/20、または90/10の範囲であるグルコース/エタノールまたはグルコース/酢酸塩混合物の利用を含む。原料供給は、グルコース制御プロモーターを誘導するように、かつ生成株中でのアセチル-CoAおよびマロニル-CoA前駆体の生成を最大化するように最適化される。いくつかの態様では、長鎖炭化水素成分(例えばデカン、ドデカン、オレイン酸、オレイン酸メチル、またはミリスチン酸イソプロピル)を培養物に加えることがある(例えば約1%(w/v)～約20%(w/v)、例えば1～10%(w/v)の範囲の量で)。

いくつかの態様では、マロン酸塩(ナトリウム塩)を供給し、マロニル-CoAシンターゼ(例えばリゾビウム・トリフォリイ(Rhizobium trifolii)由来のMatB/C、またはストレプトマイセス属種などの関連生物由来の相同体。Biochem. J. (1999) 344: 159-166参照)を発現させることで、マロニル-CoAレベルを増加させることができる。いくつかの態様では、ビオチン生合成およびビオチンライゲーションにおけるアセチル-CoAカルボキシラーゼおよび関連経路の過剰発現、ならびにマロニル-CoAの前駆体であるアセチル-CoAを産生する経路の過剰発現により、マロニル-CoAレベルを増加させることができる。

本発明のさらなる局面では、オリベトール酸またはその類似体を化学合成により得てもよく、組換え産生系で生合成してもよい。いくつかの態様では、オリベトール酸およびその類似体が、カンナビノイド生成用の代謝経路を含む同じ酵母細胞株中にて高レベルで生成される。酵母中での単環式ポリケチド芳香族化合物の高レベル産生系は当分野において公知である。例えば米国特許第9,637,763号参照。他の態様では、高レベルのオリベトール酸またはその類似体を生成する酵母株に由来する培地を濃縮し、カンナビノイド製造用のMPF手法における高適合性原料として使用することができる。

発酵方法を、炭素利用経路または発現調節様式の違いによって、特定の酵母株に適合化させることができる。例えば、サッカロマイセス属酵母の発酵は1回のグルコース供給、複雑な窒素源(例えばカゼイン加水分解物)、および複数回のビタミン補充を必要としうる。これは、最適な増殖および発現のためにグリセロール、メタノール、および微量のミネラル原料を必要としうるが単純なアンモニウム(窒素)塩しか必要ない、メチロトローフ酵母ピキア・パストリスとは対照的である。例えばElliott et al. J. Protein Chem. (1990) 9:95 104、米国特許第5,324,639号、およびFieschko et al. Biotechnol. Bioeng. (1987) 29:1113 1121参照。培養培地は、酵母エキス、ペプトンなどの成分を含みうる。微生物は、回分、流加回分、および連続流を含むがそれに限定されない通常の発酵様式で培養可能である。

いくつかの態様では、発酵槽へのグルコース添加の速度を、グルコース添加速度が酵母によるグルコース消費の速度とほぼ等しくなるように、調節する。このような条件では、グルコースまたはエタノールの量はそれほど蓄積されない。この場合のグルコース添加速度は、特定の酵母株、発酵温度、および発酵装置の物理的寸法を含むがそれに限定されない要因に依存しうる。

MPF手法において、回分様式では、前駆体オリベトール酸(もしくは別の2-アルキル-4,6-ジヒドロキシ安息香酸などのオリベトール酸類似体)、プレノール、イソプレノール、またはゲラニオールが0.1～50グラム/L(例えば1～10g/L)の濃度で存在しうる。流加回分様式では、各必須前駆体1～100グラム/L(例えば1～10グラム/L、または10～100グラム/L)が最終的に添加されるように、前駆体を2～20時間かけて発酵装置中にゆっくりと供給することができる。

同様に、カルボン酸出発原料(置換カルボン酸、例えばハロゲン化カルボン酸、重水素化カルボン酸、トリチウム化カルボン酸、およびヒドロキシル化カルボン酸を含む)、例えば置換ヘキサン酸、置換ブタン酸、置換ペンタン酸などが0.1～50グラム/L(例えば1～10g/L)の濃度で存在しうる。流加回分様式では、カルボン酸1～100グラム/L(例えば1～10グラム/L、または10～100グラム/L)が最終的に添加されるように、カルボン酸を2～72時間(例えば15～60時間)かけて発酵装置中にゆっくりと供給することができる。

目的カンナビノイド中間体(例えばオリベトール酸類似体)および/または目的カンナビノイド生成物(例えばCBGA類似体、CBG類似体)を高収量で得るように発現時間、温度、およびpHなどの培養条件を調節することができる。一般に、宿主細胞を、ヘキサン酸、プレノール、イソプレノールなどの出発原料の存在下、使用される特定の宿主細胞に応じて数時間～1日以上の範囲の時間(例えば24時間、30時間、36時間、または48時間)にわたって、約20℃～約40℃の範囲の温度で培養する。例えば、S. セレビシエを25～32℃で24～40時間(例えば30℃で30時間)培養することができる。培養培地のpHを酸、塩基、および/または緩衝剤の添加によって特定のレベルに維持することができる。特定の態様では、酵母をpH 6以上で培養することで、オリベトールなどの望ましくない副生成物の生成を減少させることができる。いくつかの態様では、酵母培養のpHは約6～約8の範囲である。いくつかの態様では、酵母培養のpHは約6.5である。いくつかの態様では、酵母培養のpHは約7である。いくつかの態様では、酵母培養のpHは約8である。

いくつかの態様では、組換え酵母細胞は、上記の好適な前駆体含有培地中でインビボ培養される際に、関心対象のカンナビノイド生成物、または中間体を少なくとも約0.1g/L、少なくとも約0.25g/L、少なくとも約0.5g/L、少なくとも約0.75g/L、少なくとも約1g/L、少なくとも約1.5g/L、少なくとも約2g/L、少なくとも約2.5g/L、少なくとも約3g/L、少なくとも約3.5g/L、少なくとも約4g/L、少なくとも約4.5g/L、少なくとも約5g/L、少なくとも約5.5 g/L、少なくとも約6g/L、少なくとも約7g/L、少なくとも約8g/L、少なくとも約9g/L、または少なくとも10g/Lのレベルで生成するように遺伝子改変されている。いくつかの態様では、組換え酵母細胞は、好適な培地中でインビボ培養される際に、関心対象のカンナビノイド生成物、または中間体を少なくとも約20g/L、少なくとも約30g/L、少なくとも約50g/L、または少なくとも約80g/Lのレベルで生成するように遺伝子改変されている。

カンナビノイド生成を、細胞増殖および/またはインキュベーションを可能にする任意の容器中で行うことができる。例えば、反応混合物はバイオリアクター、細胞培養フラスコもしくは細胞培養プレート、マルチウェルプレート(例えば96、384、1056ウェルマイクロタイタープレートなど)、培養フラスコ、発酵槽、または細胞増殖もしくはインキュベーション用の他の容器でありうる。生物学的に生成された関心対象の生成物を、当技術分野において公知の方法を使用して発光培地または細胞抽出液から単離することができる。例えば、固体または細胞片を遠心分離または濾過により除去することができる。関心対象の生成物を例えば蒸留、液液抽出、膜蒸発、吸着、または他の方法により単離することができる。

2-アルキル-4,6-ジヒドロキシ安息香酸からカンナビノイド生成物への変換
カンナビノイド生成物を生成するための方法も本明細書において提供される。いくつかの態様では、本方法は、カンナビノイド出発原料を発現するように遺伝子改変された酵母細胞中でカンナビノイド出発原料を発現させる段階、酵母細胞を単離する段階、および単離酵母細胞中でカンナビノイド出発原料をカンナビノイド生成物に変換する段階を含む。カンナビノイド出発原料は酸性カンナビノイド、中性カンナビノイド、またはカンナビノイド前駆体、例えばオリベトール酸もしくは別の2-アルキル-4,6-ジヒドロキシ安息香酸でありうる。カンナビノイド出発原料を変換する段階は、本明細書に記載の手法(例えば化学的または酵素的ゲラニル化、熱的または酵素的脱炭酸など)を使用して行ってもよく、特定のカンナビノイド出発原料または特定のカンナビノイド生成物の独自性に従って改変してもよい。カンナビノイド出発原料を例えば本明細書に記載のいずれかの発現系を使用して発現させることができる。酵母細胞を単離する段階は、任意で、遠心分離、濾過、もしくは他の手段によって培養培地から酵母細胞を収集すること; 酵母細胞を洗浄して培養培地もしくは他の成分を除去すること; 該細胞から液体(例えば培養培地)の少なくとも一部分を除去すること; および/または該細胞を乾燥させること(例えば凍結乾燥もしくは他の手段によって)を含んでもよい。単離酵母細胞を、カンナビノイド生成物を形成するための反応条件に直接供することができる。例えば、酵母細胞と以下に記載の溶媒および他の試薬とを直接組み合わせることができる。

いくつかの態様では、酸性種、例えば式Vの化合物またはそのカンナビノイド誘導体がカンナビノイド生成物である。いくつかの態様では、本方法は、酸性種を脱炭酸カンナビノイド生成物、例えば式Vaの化合物またはそのカンナビノイド誘導体に変換する段階をさらに含む。したがって、最終カンナビノイド生成物は中性カンナビノイドまたは酸性カンナビノイドでありうる。いくつかの態様では、中間体化合物、例えばハロゲン化CBGAから別のカンナビノイドへの変換を加熱、自動酸化、または紫外光処理などの物理的または化学的プロセスによって行う。例えば、本方法は、酸性カンナビノイドの脱炭酸を、遺伝子操作酵母細胞内で、または該細胞の完全もしくは部分精製後に、熱の作用を通じて、または該カンナビノイド酸とインビボもしくはインビトロで接触する野生型もしくは変異デカルボキシラーゼ酵素の作用を通じて行うことを含みうる。酸性カンナビノイドの脱炭酸によって対応する中性カンナビノイドが得られる。非限定的な例として、R¹がハロアルキルであるハロゲン化CBGAの脱炭酸によって、対応するハロゲン化CBGが得られる。

エステル、エーテル、およびハロゲン化誘導体などの完全に非天然の類似体を作り出すように形成されたカンナビノイドに対して、プロドラッグとしての、またはより活性もしくはバイオアベイラビリティの高い原薬としての使用のために、さらなる化学的形質転換を行うことができる。いくつかの態様では、生合成カンナビノイド基質を保有する酵母細胞全体に対して、所望の最終生成物の形成前に不必要な精製段階を回避するために、この化学反応を行うことができる。

いくつかの態様では、式Vまたは式Vaの化合物である第1のカンナビノイド生成物を、同じ遺伝子操作宿主細胞内で、または2種以上の組換え宿主細胞株、例えば酵母株の同時培養を通じて、野生型もしくは変異カンナビノイドシンターゼまたは野生型もしくは変異カンナビノイド酸シンターゼの作用を通じて第2のカンナビノイド生成物に変換する。例えば、発現系はアサTHCAシンターゼ、アサCBDAシンターゼ、および/またはアサCBCAシンターゼをコードすることができる。いくつかの態様では、シンターゼはホップ由来の相同体、例えばホップ由来のCBDAシンターゼ相同体である。CBGA類似体をそれぞれ酵素CBDAシンターゼ、THCAシンターゼ、およびCBCAシンターゼによって対応するCBDA類似体、THCA類似体、およびCBCA類似体に酵素的に変換することができ、酵素的変換はインビボまたはエクスビボで行うことができる。

いくつかの態様では、デカルボキシラーゼ、例えばアスペルギルス・ニデュランスorsBデカルボキシラーゼを使用して酸性カンナビノイド、例えばハロゲン化CBGAまたはハロゲン化CBDAを脱炭酸することで、中性カンナビノイド化合物、例えばハロゲン化CBGまたはハロゲン化CBDを形成することができる。あるいは、酸性カンナビノイドを高温(例えば約40℃、50℃、または100℃)で数分～数時間の範囲の時間にわたって維持することで、酸性カンナビノイドを脱炭酸することもできる。

IV. 薬学的組成物
上記の1種もしくは複数のカンナビノイド誘導体、またはその1種もしくは複数の薬学的に許容される塩と、1種もしくは複数の薬学的に許容される賦形剤とを含む、薬学的組成物も、本明細書において提供される。

薬学的組成物は、薬学および薬物送達の分野において周知であるいずれかの方法により調製可能である。一般に、本組成物を調製する方法は、有効成分と1種または複数の副成分を含む担体とを結合させる工程を含む。通常、薬学的組成物は、有効成分と液体担体もしくは微粉固体担体またはその両方とを均一かつ密接に結合させ、次に、必要であれば生成物を所望の製剤に成形することで調製される。本組成物は単位剤形で好都合に調製および/または包装可能である。

薬学的組成物は、滅菌注射用の水性または油性液剤および懸濁剤の形態でありうる。滅菌注射用製剤は、水、リンゲル液、および等張食塩水、ならびに1,3-ブタンジオールなどの許容される溶媒を含む無毒の非経口的に許容される媒体を使用して製剤化可能である。さらに、滅菌不揮発性油が溶媒または懸濁媒として通常使用される。この目的で、合成モノグリセリドまたはジグリセリドを含む任意の無刺激不揮発性油を使用することができる。さらに、オレイン酸などの脂肪酸が注射液剤の調製において使用される。

水性懸濁剤は、活性物質と水性懸濁剤の製造に好適な賦形剤との混合物を含む。これらの賦形剤としてはナトリウムカルボキシメチルセルロース、メチルセルロース、油性プロピルメチルセルロース、アルギン酸ナトリウム、ポリビニル-ピロリドン、トラガントゴム、およびアラビアゴムなどの懸濁化剤; レシチン、ポリオキシエチレンステアレート、およびポリエチレンソルビタンモノオレエートなどの分散剤または湿潤剤; ならびにエチル、n-プロピル、およびp-ヒドロキシ安息香酸塩などの保存剤が挙げられるがそれに限定されない。

油性懸濁剤は、有効成分を植物油、例えばラッカセイ油、オリーブ油、ゴマ油もしくはヤシ油、またはミネラルオイル、例えば流動パラフィンに懸濁させることで製剤化可能である。油性懸濁剤は増粘剤、例えばミツロウ、固形パラフィン、またはセチルアルコールを含みうる。これらの組成物はアスコルビン酸などの抗酸化剤の添加により保存可能である。

分散性散剤および顆粒剤(水の添加による水性懸濁剤の調製に好適)は、有効成分と分散剤、湿潤剤、懸濁化剤、またはそれらの組み合わせとの混合物を含みうる。さらなる賦形剤が存在してもよい。

薬学的組成物は水中油型乳剤の形態であってもよい。油相は植物油、例えばオリーブ油もしくはラッカセイ油、またはミネラルオイル、例えば流動パラフィン、あるいはこれらの混合物でありうる。好適な乳化剤はアラビアゴムまたはトラガントゴムなどの天然ゴム; ダイズレシチンなどの天然リン脂質; ソルビタンモノオレエートなどの、脂肪酸および無水ヘキシトールから誘導されるエステルまたは部分エステル; ならびにポリオキシエチレンソルビタンモノオレエートなどの、該部分エステルとエチレンオキシドとの縮合生成物でありうる。

化合物を含む薬学的組成物は、経口用に好適な形態であってもよい。経口投与に好適な組成物としては錠剤、トローチ剤、舐剤、水性または油性懸濁剤、分散性散剤または顆粒剤、乳剤、硬または軟カプセル剤、シロップ剤、エリキシル剤、液剤、頬側パッチ剤、経口ゲル剤、チューインガム、咀嚼錠剤、発泡散剤、および発泡錠剤が挙げられるがそれに限定されない。経口投与用組成物は、当業者に公知の任意の方法に従って製剤化可能である。これらの組成物は、薬学的に上品で口当たりの良い製剤が得られるように、甘味料、香味料、着色料、抗酸化剤、および保存剤からなる群より選択される1つまたは複数の剤を含みうる。

一般に、錠剤は、有効成分と、セルロース、二酸化ケイ素、酸化アルミニウム、炭酸カルシウム、炭酸ナトリウム、グルコース、マンニトール、ソルビトール、乳糖、リン酸カルシウム、およびリン酸ナトリウムなどの不活性希釈剤; トウモロコシデンプンおよびアルギン酸などの造粒剤および崩壊剤; ポリビニルピロリドン(PVP)、セルロース、ポリエチレングリコール(PEG)、デンプン、ゼラチン、およびアラビアゴムなどの結合剤; ならびにステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸、およびタルクなどの潤滑剤を含む、無毒の薬学的に許容される賦形剤との混合物を含む。錠剤はコーティングされていなくてもよく、あるいは胃腸管での崩壊および吸収を遅延させることでいっそう長期間にわたって持続的作用を実現するための公知の技術により腸溶コーティングまたは別のやり方でコーティングされていてもよい。例えば、モノステアリン酸グリセリンまたはジステアリン酸グリセリンなどの時間遅延物質が使用可能である。錠剤は、制御放出用の浸透圧ポンプ組成物を形成するための公知の技術に従って、半透過膜および任意的なポリマーオスモジェントでコーティングされていてもよい。

経口投与用組成物は、有効成分が不活性固体希釈剤(例えば炭酸カルシウム、リン酸カルシウム、もしくはカオリン)と混合された硬ゼラチンカプセル剤として、あるいは有効成分が水または油媒体(例えばピーナッツ油、流動パラフィン、もしくはオリーブ油)と混合された軟ゼラチンカプセル剤として製剤化可能である。

また、肺内投与用組成物としては、本明細書に記載のカンナビノイド誘導体を含む乾燥散剤組成物が挙げられるがそれに限定されない。肺内投与用組成物は、当業者に公知である任意の好適な乾燥散剤吸入装置から吸入可能である。特定の場合では、本組成物を、好適な噴霧剤、例えばジクロロジフルオロメタン、トリクロロフルオロメタン、ジクロロテトラフルオロエタン、二酸化炭素、または他の好適なガスの使用を伴う加圧パックまたは噴霧器からのエアロゾルスプレーの形態で好都合に送達することができる。加圧エアロゾルの場合、投与単位は、定量を送達するためのバルブを設けることで決定可能である。本化合物と好適な粉末基剤、例えば乳糖またはデンプンとの粉末混合物を含む、吸入器またはガス注入器中での使用のための例えばゼラチンのカプセルおよびカートリッジを製剤化することができる。

本明細書において提供されるカンナビノイド誘導体を液剤、軟膏剤、クリーム剤、ゲル剤、懸濁剤、点眼剤などとして局所投与してもよい。さらに、カンナビノイド誘導体の経皮送達をイオン注入パッチなどによって実現することができる。カンナビノイド誘導体は、薬物の直腸投与用坐薬の形態で投与してもよい。これらの組成物は、薬物と常温では固体であるが直腸温では液体である好適な非刺激性の賦形剤とを混合することで調製可能であり、したがって、直腸内で溶融して薬物を放出する。これらの材料としてはカカオバターおよびポリエチレングリコールが挙げられる。

V. カンナビノイド受容体媒介疾患を治療する方法
カンナビノイド受容体活性により媒介されるそれらを含む疾患、状態、および/または障害を治療するための方法も本明細書において提供される。本方法は、その必要がある対象に有効量の上記のカンナビノイド誘導体を投与する段階を含む。本方法は、疼痛; 皮膚状態; 筋ジストロフィーを含むがそれに限定されない筋状態; 2型糖尿病、脂質異常症、および肥満などのメタボリックシンドローム; 摂食障害; 胃腸障害; アレルギー; 喘息; 慢性閉塞性肺障害; 緑内障; 高血圧、うっ血性心不全、心肥大、末梢動脈疾患、アテローム性動脈硬化症、脳卒中、心筋梗塞、および化学療法に関連する心毒性などの心血管疾患または心血管障害; 脂肪性肝疾患(脂肪性肝炎)および非アルコール性脂肪性肝疾患; 腎疾患; 喫煙嗜癖または喫煙離脱、アルコール嗜癖またはアルコール離脱、および薬物嗜癖または薬物離脱などの嗜癖成分を特徴とする疾患または障害; 骨粗鬆症、骨パジェット病、および骨がんなどの骨疾患または骨障害; 乳がんを含むがそれに限定されないがん; 関節リウマチ、炎症性腸疾患、および乾癬などの炎症性疾患または自己免疫疾患; トゥレット症候群; うつ病、不安、躁病、統合失調症などの精神疾患または精神障害; 睡眠障害(例えば不眠); 疲労; パーキンソン病、アルツハイマー病、および認知症などの、記憶障害および/または認知機能喪失に関連する障害または疾患; 多発性硬化症; てんかん; 脊髄損傷; ならびに細菌感染症、真菌感染症、およびウイルス感染症などの感染症を含むがそれに限定されないいくつかの状態を治療するために使用可能である。

本化合物を、本方法において任意の好適な用量で投与することができる。一般に、本化合物を対象の体重1キログラム当たり約0.1ミリグラム～約1000ミリグラム(すなわち約0.1～1000mg/kg)の範囲の用量で投与する。化合物の用量は、例えば約0.1～1000mg/kg、または約1～500mg/kg、または約25～250mg/kg、または約50～100mg/kgでありうる。用量は約1、2、3、4、5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、150、200、250、300、350、400、450、500、550、600、650、700、750、800、850、900、950、または1000mg/kgでありうる。

投与量は、患者の必要量、治療される障害の重症度、および投与される特定の製剤に応じて変動しうる。患者に投与される用量は、患者において有益な治療応答を得るために十分であるべきである。また、用量のサイズは、特定の患者における薬物の投与に伴う任意の有害副作用の存在、性質、および程度により決定される。特定の状況に適した投与量の決定は通常の医療従事者の技能の範囲内である。総投与量を分割し、状態または障害を治療するために好適な時間にわたって数回に分けて投与することができる。

投与はある期間にわたって行うことができ、これは、特定の障害の性質、その重症度、および患者の全身的状態に応じて変動する。投与は例えば1時間毎、2時間毎、3時間毎、4時間毎、6時間毎、8時間毎、もしくは12時間毎を含む1日2回、またはそれらの間の中間間隔で実行可能である。投与は1日1回、36時間毎もしくは48時間毎に1回、または毎月もしくは数ヶ月に1回実行可能である。処置後、患者を患者自身の状態の変化、および障害の症状の軽減に関してモニタリングすることができる。患者が特定の投与量レベルに対して有意に応答しない場合には、投与量を増加させてもよく、障害の症状の軽減が観察される場合、または障害が除去された場合、または許容されない副作用が特定の投与量で見られる場合には、用量を減少させてもよい。

治療有効量のカンナビノイド誘導体を、投与間に少なくとも1時間、または6時間、または12時間、または24時間、または36時間、または48時間の間隔を含む処置レジメンで、対象に投与することができる。投与は少なくとも72時間、96時間、120時間、168時間、192時間、216時間、もしくは240時間、または同等量の日数の間隔で実行可能である。投与レジメンは2つ以上の異なる間隔セットからなりうる。例えば、投与レジメンの第1の部分は対象に1日複数回、1日1回、2日に1回、または3日に1回実行されうる。投与レジメンは、対象に2日に1回、3日に1回、週1回、2週間に1回、または月1回投与することで開始しうる。投与レジメンの第1の部分は例えば最大30日間、例えば7日間、14日間、21日間、または30日間実行されうる。週1回、14日に1回、または月1回実行される、異なる実行間隔による投与レジメンの後続の第2の部分が続いてもよく、4週間～最大2年間以上、例えば4週間、6週間、8週間、12週間、16週間、26週間、32週間、40週間、52週間、63週間、68週間、78週間、または104週間続く。あるいは、障害が寛解に向かうかまたは徐々に改善される場合、投与量を最大量未満に維持または保持してもよい。状態または障害が再発する場合、第1の投与レジメンを改善が見られるまで再開してもよく、第2の投与レジメンを再度実行してもよい。このサイクルを必要に応じて複数回繰り返してもよい。

追加の活性剤または治療薬をカンナビノイド誘導体と同時投与するかまたは他のやり方で組み合わせることができる。本方法における使用に好適な追加の活性剤および治療薬としては、2型糖尿病および肥満の処置において使用される化合物、例えばインスリンおよびインスリンアナログ、ジペプチジルペプチダーゼ4(DPP-4)阻害剤、グルカゴン様ペプチド1類似体、血糖降下剤、例えばα-グルコシダーゼ阻害剤、ビグアナイド、スルホニル尿素、チアゾリジンジオン、減量治療薬、例えば食欲抑制剤、セロトニン再取り込み阻害剤、ノルアドレナリン再取り込み阻害剤、β₃-アドレナリン受容体アゴニスト、およびリパーゼ阻害剤が挙げられるがそれに限定されない。利尿剤、アンジオテンシン変換酵素(ACE)阻害剤、アンジオテンシンIIアンタゴニスト、β遮断薬、カルシウムアンタゴニスト、例えばニフェジピン、HMG-CoA還元酵素阻害剤、例えばスタチン、ジゴキシン、アルドステロンアンタゴニスト、および有機硝酸塩を含むがそれに限定されない、心血管疾患および心血管機能障害の処置において使用される化合物を、本方法において使用してもよい。フィブラートおよび胆汁酸結合樹脂を含むがそれに限定されない他の脂質調節剤を本方法において使用してもよい。ブプロピオンなどのノルエピネフリン-ドーパミン再取り込み阻害剤を含むがそれに限定されない、禁煙を支援するために使用される化合物と共に、カンナビノイド誘導体を使用してもよい。

本方法では、骨疾患および骨障害の処置において使用される化合物をカンナビノイド誘導体との組み合わせで使用してもよい。これらの化合物としては抗吸収剤、例えばビスホスホネート、タンパク質同化剤、例えば副甲状腺ホルモン、RANKL阻害剤、例えばデノスマブ; ならびにエストロゲン補充および選択的エストロゲン受容体調節剤、例えばラロキシフェンが挙げられるがそれに限定されない。がんの処置において使用される剤をカンナビノイド誘導体との組み合わせで使用してもよい。抗がん剤の例としては化学療法剤(例えばカルボプラチン、パクリタキセル、ペメトレキセドなど)、チロシンキナーゼ阻害剤(例えばエルロチニブ、クリゾチニブ、オシメルチニブなど)、および免疫療法剤(例えばペンブロリズマブ、ニボルマブ、デュルバルマブ、アテゾリズマブなど)が挙げられるがそれに限定されない。

炎症性成分または自己免疫成分を伴う疾患または障害の処置において使用される化合物をカンナビノイド誘導体との組み合わせで使用してもよい。これらの化合物としては非ステロイド性抗炎症薬(NSAID); 疾患修飾性抗リウマチ薬、例えば免疫抑制剤; 抗TNF剤、例えばインフリキシマブ、エタネルセプト、およびアダリムマブ; ならびに抗B細胞治療薬、例えばリツキシマブが挙げられる。

本方法では、精神疾患および精神障害の処置において使用される化合物をカンナビノイド誘導体との組み合わせで使用してもよい。これらの化合物としてはGABA_A調節剤、例えばベンゾジアゼピン; 5HT_1A受容体アゴニスト、例えばブスピロン; β遮断薬; 抗精神病薬、例えばドパミン受容体遮断薬、およびモノアミン受容体、モノアミン輸送体、またはモノアミン代謝を調節する他の薬物、例えば三環系抗うつ薬、セロトニン再取り込み阻害剤、およびモノアミンオキシダーゼ阻害剤; リチウム; ならびに抗てんかん薬、例えばナトリウムチャネルを遮断する薬、T型カルシウムチャネルを遮断する薬、またはフェニトイン、カルバマゼピン、バルプロ酸、およびビガバトリンを含む、GABAトランスアミナーゼまたはGABA再取り込みを遮断する薬が挙げられる。これらのドパミンアゴニストおよび抗コリンエステラーゼ剤を含むがそれに限定されない、記憶障害および/または認知機能喪失を特徴とする疾患または障害の処置において使用される化合物を、本方法において使用してもよい。

細菌感染症の処置においてカンナビノイド誘導体と共に使用可能な抗生物質の例としては、キノロン(例えばモキシフロキサシン、ゲミフロキサシン、シプロフロキサシン、オフロキサシン、トロバフロキサシン、シタフロキサシンなど)、β-ラクタム(例えばペニシリン、例えばアモキシシリン、アモキシシリン-クラブラン酸、ピペラシリン-タゾバクタム、ペニシリンGなど); ならびにセファロスポリン、例えばセフトリアキソンなど)、マクロライド(例えばエリスロマイシン、アジスロマイシン、クラリスロマイシンなど)、アミノグリコシド(例えばアミカシン、ゲンタマイシン、カナマイシン、ネオマイシン、ネチルマイシン、トブラマイシンなど)、モノバクタム(例えばアズトレオナムなど)、カルバペネム(例えばドリペネム、イミペネム、メロペネム、エルタペネムなど)、チアゾリド(thiazolides)(例えばチゾキサニジン(tizoxanidine)、ニタゾキサニジン(nitazoxanidine)、RM 4807、RM 4809など)、テトラサイクリン(例えばテトラサイクリン、ミノサイクリン、ドキシサイクリン、エラバサイクリンなど)、リンコサミド(例えばリンコマイシン、クリンダマイシンなど)、スルホンアミド(例えばトリメトプリム、スルファメトキサゾールなど)、およびニトロイミダゾール(例えばメトロニダゾール、サトラニダゾールなど)が挙げられるがそれに限定されない。ウイルス感染症の処置においてカンナビノイド誘導体と共に使用可能な抗ウイルス剤の例としては、ウイルス脱殻阻害剤(例えばアマンタジン、リマンタジンなど)、ノイラミニダーゼ阻害剤(例えばオセルタミビル、ザナミビル、ラニナミビル、およびペラミビル)、逆転写酵素阻害剤(例えばテノホビル、スタブジン、ジドブジン、ザルシタビン、エムトリシタビン、ラミブジンなど)、ならびにプロテアーゼ阻害剤(例えばリトナビル、インジナビル、ボセプリビル(boceprivir)など)、ならびにポリヌクレオチド合成阻害剤(例えばソフォスブビル、ダサブビルなど)が挙げられるがそれに限定されない。

VI. 実施例
実施例1
S. セレビシエ中での2,4-ジヒドロキシ-6-ペルジュウテロペンチル安息香酸および5-ペルジュウテロペンチルベンゼン-1,3-ジオールの生成
S. セレビシエADH2プロモーターを化学合成し、膜貫通ドメインコード配列(アミノ酸245～267)が欠失した変異アサアシル活性化酵素1(CsAAE1ΔTM)の合成遺伝子に融合した。また、S. セレビシエADH2転写終結配列を、合成停止コドンに隣接する遺伝子配列に融合した。発現カセットを、URA3選択マーカーを含む酵母発現ベクターにクローニングした。同様に、アシル活性化酵素CsAAE3(アサ由来)およびrevS(ストレプトマイセス属種SN-593由来の中鎖脂肪酸アシル-CoAリガーゼ)の合成遺伝子を別々のURA3ベクターにクローニングした。各URA3系ベクターをコンピテントなサッカロマイセス・セレビシエInvSc1(MATa/alpha his3D1 leu2 trp1-289 ura3-52)細胞(Invitrogen)に形質転換した。これらの細胞は選択マーカーLEU2系ベクターによって既に形質転換されたものであり、これは、S. セレビシエp150配列内リボソーム進入部位(IRES)およびヒトユビキチン遺伝子を通じて、いくつかの個々に変異したアサオリベトール酸シクラーゼ遺伝子と、シロイヌナズナシクラーゼ酵素AtHS1をコードする合成遺伝子に融合された、アサオリベトール酸シンターゼ/テトラケチドシンターゼ(OAS/TKS)遺伝子とを含む。

ウラシルおよびロイシン原栄養性に基づく選択用のアミノ酸を含む最少寒天プレート(アミノ酸または硫酸アンモニウムのない酵母窒素塩基(DIFCO)6.7g/L、グルコース20g/L、寒天20g/L)上に形質転換細胞を播種した。形質転換細胞を取り出し、ウラシルおよびロイシン欠乏最少培地中で24時間増殖させた。プラスミドDNAを形質転換細胞から単離し、制限消化分析により分析することで同一性を確認した。

各菌株について成功した形質転換細胞を使用してウラシルおよびロイシン欠乏最少培地2mLに播種し、これをオービタルシェーカー中、30℃で終夜増殖させた。この培養物の500μLアリコートを使用して同じ培地50mLに播種し、培養物を振盪機中、30℃で24時間増殖させた。培養物を同じ培地300mL中に同様に播種し、終夜増殖後、2X YEP培地(Wobbe, in Current Protocols in Molecular Biology, Supplement 34:13.0.1-13.13.9 (Wiley, 1996))(酵母エキス20g/L、ペプトン40g/L)1.2Lを含む酸素供給・攪拌調節型7リットル発酵槽(Eppendorf)中に移した。

播種の約16時間後、すべての残留グルコースが消費された後で、過重水素化ヘキサン酸(D₁₁-HA)0.2グラムを発酵槽中に直接加え、培養物にグルコース14.3%、酢酸ナトリウム3.5%、および D₁₁-HA 0.8グラムを含む2X YEPDを経過発酵時間72時間にわたって供給した。

細胞を、24時間、48時間、および72時間の増殖後に採取した培養物の500μLアリコートの遠心分離により収集し、2X SDSゲルローディングバッファー50μL中で約2分間沸騰させることで溶解させた。細胞溶解液を4～20% SDS-PAGEゲルにロードすることで分析した。コードされた酵素の予想サイズに対応するバンドを観測した。

さらなる定量化および類似体確認のために、細胞を遠心分離により培地から分離し、培地を氷酢酸で酸性化し、重水素化生成物を酢酸エチルを使用して抽出した。生成物をカラムクロマトグラフィーによって、またはアセトニトリル/ギ酸溶離によりSep-Pak C18カートリッジを使用することによってさらに精製し、NMRおよび質量分析に供した。

2,4-ジヒドロキシ-6-ペルジュウテロペンチル安息香酸(1)。

5-ペルジュウテロペンチルベンゼン-1,3-ジオール(2)。LC-MS/ESI: 計算値[C₁₁H₅D₁₁O₂] 191.18; 実測値[M+H] 192.35。

高レベルの類似体が、様々なアシル活性化酵素revS(＞40mg/L); CsAAE3(約20～30mg/L); CsAAE1ΔTM(3～4mg/L)を使用して生合成されたことが観察された。オリベトール酸からオリベトール類似体までの生成物分布は、使用される変異シクラーゼの実際の長さに応じて異なり、AtHS1シクラーゼで得られたのは実質的にすべてオリベトール類似体(5-ペルジュウテロペンチルベンゼン-1,3-ジオール)であった。

実施例2
S. セレビシエ中での2,4-ジヒドロキシ-6-(5-フルオロペンチル)-安息香酸、2,4-ジヒドロキシ-6-(4-フルオロブチル)-安息香酸、5-(5-フルオロペンチル)-ベンゼン-1,3-ジオール、および5-(4-フルオロブチル)-ベンゼン-1,3-ジオールの生成
アシル活性化酵素revSおよびCsAAE3を発現する実施例1に記載の菌株を選択培地4mL中、30℃で24時間増殖させた後、1X YPDに接種して合計40mLの細胞培養物量を得た。30℃で30時間の増殖後、6-フルオロヘキサン酸または5-フルオロペンタン酸を培養物に加えて合計濃度2mMを得て、培養物を30℃でさらに48時間増殖させた。類似体生成をHPLCによりモニタリングし、精製を上記のように実現した。2,4-ジヒドロキシ-6-(4-フルオロブチル)-安息香酸の収量は約5mg/Lであり、一方、2,4-ジヒドロキシ-6-(5-フルオロペンチル)-安息香酸の収量は約60mg/Lであった。

2,4-ジヒドロキシ-6-(4-フルオロブチル)-安息香酸。LC-MS/ESI: 計算値[C₁₁H₁₃FO₄] 228.08; 実測値[M-H] 226.95, [M-H-CO₂] 183.05。

2,4-ジヒドロキシ-6-(5-フルオロペンチル)-安息香酸。LC-MS/ESI: 計算値[C₁₂H₁₅FO₄] 242.10; 実測値[M-H] 240.95, [M-H-CO₂] 197.05, [2M-H] 482.80。

実施例3
S. セレビシエ中での2,4-ジヒドロキシ-6-(5-フルオロペンチル)-安息香酸および5-(5-フルオロペンチル)-ベンゼン-1,3-ジオールの生成
アシル活性化酵素revSおよびCsAAE3を発現する実施例1に記載の菌株を選択培地4mL中、30℃で24時間増殖させた後、1X YPDに接種して合計40mLの細胞培養物量を得る。30℃で30時間の増殖後、6-フルオロヘキサン酸を培養物に加えて合計濃度2mMとし、培養物を30℃でさらに48時間増殖させる。類似体生成をHPLCによりモニタリングし、精製を上記のように実現する。

実施例4
S. セレビシエ中での2,4-ジヒドロキシ-6-(3-フルオロプロピル)-安息香酸および5-(3-フルオロプロピル)-ベンゼン-1,3-ジオールの生成
revSおよびCsAAE3を発現する実施例1に記載の菌株を選択培地4mL中、30℃で24時間増殖させた後、1X YPDに接種して合計40mLの細胞培養物を得た。30℃で30時間の増殖後、4-フルオロブタン酸を培養物に加えて合計濃度2mMとし、培養物を30℃でさらに48時間増殖させた。類似体生成をHPLCによりモニタリングし、精製を上記のように実現した。ペルジュウテロ類似体生成とは異なり、3-フルオロプロピルジバリン酸類似体は、revSを発現する菌株でのみ観察された。CsAAE3を発現する菌株は、HPLCによる検出限界を超えるレベルで該類似体を生成しなかった。上記のように、酸類似体対脱炭酸フルオロ-ジバリノール類似体の比の完全な変化が、切断型(95アミノ酸)アサシクラーゼまたはAtHS1シクラーゼを使用して観察された。

実施例5
S. セレビシエ中での6-(4-クロロブチル)-2,4-ジヒドロキシ安息香酸および5-(4-クロロブチル)-ベンゼン-1,3-ジオールの生成
revSを発現する実施例1に記載の菌株を、選択培養プレートから直接、選択培地50mL中、30℃で24時間増殖させた後、2X YEPDに接種して合計500mLの細胞培養物量を得た。30℃で30時間の増殖後、5-クロロペンタン酸を培養物に加えて合計濃度2mMとし、培養物を30℃でさらに48時間増殖させた。類似体生成を予測領域中での逆相HPLCピークの出現によりモニタリングし、精製を上記のように実現した。培養物中での6-(4-クロロブチル)-2,4-ジヒドロキシ安息香酸の収量は約30mg/Lであった。

6-(4-クロロブチル)-2,4-ジヒドロキシ安息香酸。LC-MS/ESI: 計算値[C₁₁H₁₃ClO₄] 244.05; 実測値[M-H] 242.95。

上記すべての実施例では、所望であれば、遠心分離により酵母細胞を除去し、残留類似体含有培地を100℃で1時間加熱することで、様々な量の酸類似体およびオリベトール/ジバリノール類似体を含む培地を定量的に脱炭酸類似体に変換することができた。

実施例6
出発原料および生成物の毒性を減少させるための有機相オーバーレイの使用
ペルジュウテロヘキサン酸、6-フルオロヘキサン酸、4-フルオロブタン酸、5-クロロペンタン酸、ヘキサン酸、およびブタン酸を上記実施例1～3に記載の酵母株に個々に供給した。30時間の時点で10体積%のオレイルアルコールを脂肪族酸または脂肪族酸類似体と共に培養物に加えた以外は、細胞の培養は実施例3に記載のように進行した。この手法により、増加したレベルの所望の生成物が得られた。

実施例7
S. セレビシエ中でのCBGA類似体の直接生成
高レベルのゲラニル二リン酸を生成するように酵母メバロン酸経路の上方制御に関与する遺伝子の組込み形質転換によって既に改変されていること以外は上記実施例1～3に記載のように増殖させた酵母株それぞれに、上記ジュウテロ、フルオロ、およびクロロ脂肪族酸類似体を、ヘキサン酸およびブタン酸と共に供給する。また、菌株は、オリベトール酸類似体からCBGA類似体への変換のための様々なプレニルトランスフェラーゼを個々に発現する組込み遺伝子を保有する。得られたCBGA類似体を、メタノール、エタノール、または酢酸エチルを使用する溶媒抽出により遠心分離酵母細胞から単離し、質量分析およびNMR分析により特性評価する。この手法を使用して6-(4-クロロブチル)-3-(3,7-ジメチル-オクタ-2,6-ジエニル)-2,4-ジヒドロキシ-安息香酸を調製した。LC-MS/ESI: 計算値[C₂₁H₂₉ClO₄] 380.18; 実測値[M+H] 380.95 (Cl), [M-H] 378.85 (Cl)。

3-(3,7-ジメチル-オクタ-2,6-ジエニル)-6-(5-フルオロペンチル)-2,4-ジヒドロキシ-安息香酸(5-フルオロ-カンナビゲロール酸)もこの手法を使用して調製した。LC-MS/ESI: 計算値[C₂₂H₃₁FO₄] 278.22; 実測値[M+H] 379.05, [M-H] 376.90。

実施例8
オリベトール/オリベトール酸類似体からCBC/CBCA類似体への化学的形質転換
CBCA類似体およびCBC類似体を以下のように調製した。ペルジュウテロペンチル-オリベトール酸またはペルジュウテロペンチル-オリベトール35mg(0.2mmol)のジクロロエタン0.5mL溶液にE/Z-シトラール0.085mL(約2.5当量)を加えた後、N,N-ジメチルエチレンジアミン0.005mL(25mol%)を加えて反応を23℃で開始した。反応を定量的RP-HPLCによりモニタリングしたところ、18時間後には基質は残留していなかった。水/MeOH/0.1%ギ酸(2.5mL/分)の急峻な直線勾配を使用するGilson分取C18 RP-HPLC自動システムに対する1回の注入により、反応混合物を直接精製した。画分を紫外線(230nm)でモニタリングし、適切な画分を一緒にし、減圧濃縮し、MeOH中で再濃縮して残留水を除去することで、生成物を65%～73%の範囲のモル収率で得た。CBCA類似体およびCBC類似体を質量分析およびNMR分析により特性評価した。

2-メチル-2-(4-メチル-ペンタ-3-エニル)-7-ペルジュウテロペンチル-2H-クロメン-5-オール(ペルジュウテロペンチル-CBC)。LC-MS/ESI: 計算値[C₂₁H₁₉D₁₁O₂] 325.29; 実測値: [M+H] 326.25。

5-ヒドロキシ-2-メチル-2-(4-メチル-ペンタ-3-エニル)-7-ペルジュウテロペンチル-2H-クロメン-6-カルボン酸(ペルジュウテロペンチル-CBCA)。LC-MS/ESI: 計算値[C₂₂H₁₉D₁₁O₄] 369.28; 実測値: [M-H] 367.90, [M-H-CO₂] 324.00。

フッ素化および塩素化CBC/CBCA類似体を、過重水素化類似体について先に記載のように調製する。

実施例9
N-アセチルシステインアミドおよびパンテテインチオエステルの調製および使用
ジクロロメタン(DCM)4mlに溶解したコハク酸5mmolを含むカルボン酸5.5mmolおよびN-アセチルシステアミン(またはパンテテイン)5mmolの0℃攪拌溶液に、ジシクロヘキシルカルボジイミド(DCC)5.25mmolを含むDCMの冷溶液1mLを加えた。溶液を23℃に昇温させ、18時間攪拌した。0℃に冷却後、得られた不溶性N,N'-ジシクロヘキシル尿素を濾去し、冷DCMで洗浄した。溶媒を除去し、残渣をDCMに再溶解させ、必要に応じて再濾過した後、1N HCl、続いて飽和NaCl水溶液中5% NaHCO3で抽出した。有機層をNaSO₄で乾燥させ、濃縮してチオエステルを高収率で得た。生成物を再結晶、蒸留、またはクロマトグラフィーでさらに精製した。特定の例としては、ヘキサン酸、ブタン酸、ペンタン酸、ヘプタン酸、オクタン酸、ならびにフッ素置換または重水素置換アルキル酸およびアルケニル酸、例えば4-フルオロブタン酸、5-フルオロペンタン酸、6-フルオロヘキサン酸、およびペルジュウテロヘキサン酸から調製されるチオエステルが挙げられる。

チオエステルを、実施例1および2に記載のものなどの培養物中に2mMのレベルまで供給し、30時間後、およびさらに46時間の増殖後に、試料をHPLC分析用に採取する。各酸生成物の収量は40mg/L超と測定される。

実施例10
オリベトール酸類似体からCBGA類似体への化学的形質転換
ジュウテロ、フルオロ、またはクロロオリベトール酸類似体20mgのトルエン0.25mL懸濁液にp-トルエンスルホン酸2.6mgおよびゲラニオール18μLを加える。懸濁液を60℃に加熱し、逆相HPLC(Kinetex 5μm-XB、50x4.6mm、100A、20% 50mMギ酸アンモニウム/アセトニトリル～100%アセトニトリルの直線勾配、2.5mL/分で6分にわたる)でモニタリングする。対応するCBGA類似体は最大収量に約50分後に到達し、質量分析およびNMRにより同定および特性評価される。

実施例11
5-フルオロカンナビクロメンおよび5-クロロカンナビクロメンの生成
2,4-ジヒドロキシ-6-(5-フルオロペンチル)-安息香酸を実施例2に従って調製し、脱炭酸し、5-フルオロカンナビクロメンに変換した。2,4-ジヒドロキシ-6-(5-フルオロペンチル)-安息香酸の37.5mg試料を95%エタノール1mLに取り込み、80℃で18時間加熱して完全に脱炭酸し、5-(5-フルオロペンチル)-ベンゼン-1,3-ジオールを得た。LC-MS/ESI: 計算値[C₁₁H₁₅FO₂] 198.11; 実測値[M+H] 199.25、[M-H] 197.05。 得られた溶液を(減圧下で)濃縮乾固させ、実施例8に概要を示す反応条件と同様の反応条件に供した。7-(5-フルオロペンチル)-2-メチル-2-(4-メチル-ペンタ-3-エニル)-2H-クロメン-5-オール(5-フルオロカンナビクロメン)11.1mgを得た。

同様にして、5-クロロカンナビクロメンを2,4-ジヒドロキシ-6-(4-クロロブチル)-安息香酸から調製した(実施例5参照)。

実施例12
5-フルオロカンナビクロメンのCB2受容体アゴニスト活性
Udohら("Cannabichromene is a cannabinoid CB2 receptor agonist." British Journal of Pharmacology, 2019, doi: 10.1111/bph.14815)に記載のように、HAタグ付加ヒトCB1およびCB2受容体を安定的に発現するAtT20細胞中で5-フルオロカンナビクロメン(5F-CBC)の活性を試験した。CB2での5F-CBCのEC₅₀観測値は2.1μMであった。

VII. 例示的態様
本明細書に開示される主題に従って提供される例示的態様としては、添付の特許請求の範囲および以下の態様が挙げられるがそれに限定されない。
１. 式Iの化合物
、またはその塩もしくはカンナビノイド誘導体:
式中、
R¹は、C₁～C₂₀ハロアルキル、C₁～C₂₀ヒドロキシアルキル、重水素化C₁～C₂₀アルキル、トリチウム化C₁～C₂₀アルキル、およびC₂～C₂₀アルケニルからなる群より選択され、
R²は、COOR^2aおよびHからなる群より選択され、
R^2aは、HおよびC₁～C₆アルキルからなる群より選択され、
R³は、プレニル部分およびHからなる群より選択される。
２. R¹が、C₁～C₁₀ハロアルキル、C₁～C₁₀ヒドロキシアルキル、重水素化C₁～C₁₀アルキル、トリチウム化C₁～C₁₀アルキル、およびC₂～C₁₀アルケニルからなる群より選択される、態様1の化合物、またはその塩もしくはカンナビノイド誘導体。
３. R¹が、C₁～C₁₀ハロアルキル、C₁～C₁₀ヒドロキシアルキル、重水素化C₁～C₁₀アルキル、およびトリチウム化C₁～C₁₀アルキルからなる群より選択される、態様1の化合物、またはその塩もしくはカンナビノイド誘導体。
４. R¹がC₁～C₁₀ハロアルキルである、態様1の化合物、またはその塩もしくはカンナビノイド誘導体。
５. R¹が、フルオロペンチル、フルオロエチル、フルオロプロピル、フルオロブチル、フルオロヘキシル、フルオロオクチル、およびフルオロノニルからなる群より選択される、態様4の化合物、またはその塩もしくはカンナビノイド誘導体。
６. R¹が、5-フルオロプロピル、4-フルオロブチル、および3-フルオロペンチルからなる群より選択される、態様4の化合物、またはその塩もしくはカンナビノイド誘導体。
７. R¹がC₁～C₁₀ブロモアルキルまたはC₁～C₁₀クロロアルキルである、態様4の化合物、またはその塩もしくはカンナビノイド誘導体。
８. R¹がC₁～C₁₀ヒドロキシアルキルである、態様1の化合物、またはその塩もしくはカンナビノイド誘導体。
９. R¹が重水素化C₁～C₁₀アルキルまたはトリチウム化C₁～C₁₀アルキルである、態様1の化合物、またはその塩もしくはカンナビノイド誘導体。
１０. R²が、COOHおよびHからなる群より選択される、態様1～9のいずれかの化合物、またはその塩もしくはカンナビノイド誘導体。
１１. R²がCOOHである、態様1～10のいずれかの化合物、またはその塩もしくはカンナビノイド誘導体。
１２. R²がHである、態様1～10のいずれかの化合物、またはその塩もしくはカンナビノイド誘導体。
１３. R³がHである、態様1～12のいずれかの化合物、またはその塩もしくはカンナビノイド誘導体。
１４. R³がプレニル部分である、態様1～12のいずれかの化合物、またはその塩もしくはカンナビノイド誘導体。
１５. 前記プレニル部分が3,7-ジメチルオクタ-2,6-ジエン-1-イルである、態様1～12および14のいずれかの化合物、またはその塩もしくはカンナビノイド誘導体。
１６. 前記化合物が式Iaの構造
を有する、態様1の化合物、またはその塩もしくはカンナビノイド誘導体。
１７. 態様1～16のいずれかの化合物のカンナビノイド誘導体またはその塩。
１８. ハロゲン化カンナビジオール酸、ハロゲン化カンナビジオール、ハロゲン化Δ⁹-テトラヒドロカンナビノール酸、ハロゲン化Δ⁸-テトラヒドロカンナビノール酸、ハロゲン化カンナビクロメン酸、ハロゲン化カンナビクロメン、ハロゲン化カンナビノール、ハロゲン化カンナビノジオール、ハロゲン化カンナビノール酸、カンナビバリン、ハロゲン化カンナビバリン酸、ハロゲン化Δ⁹-テトラヒドロカンナビバリン、ハロゲン化Δ⁸-テトラヒドロカンナビバリン、ハロゲン化Δ⁹-テトラヒドロカンナビバリン酸、ハロゲン化Δ⁸-テトラヒドロカンナビバリン酸、ハロゲン化カンナビゲロバリン、ハロゲン化カンナビゲロバリン酸、ハロゲン化カンナビクロメバリン、ハロゲン化カンナビクロメバリン酸、ハロゲン化カンナビジバリン、ハロゲン化カンナビジバリン酸、ハロゲン化カンナビトリオール、およびハロゲン化カンナビシクロールからなる群より選択される、態様17のカンナビノイド誘導体またはその薬学的に許容される塩。
１９. 態様17または態様18のカンナビノイド誘導体と薬学的に許容される賦形剤とを含む、薬学的組成物。
２０. その必要がある対象に、有効量の態様17または態様18のカンナビノイド誘導体またはその薬学的に許容される塩、あるいは有効量の態様19の組成物を投与する段階を含む、カンナビノイド受容体活性により媒介される疾患または状態を治療するための方法。
２１. 式IVの化合物
、またはその塩を生成する方法であって、
式中、R¹は、C₁～C₂₀ハロアルキル、C₁～C₂₀ヒドロキシアルキル、重水素化C₁～C₂₀アルキル、トリチウム化C₁～C₂₀アルキル、およびC₂～C₂₀アルケニルからなる群より選択され、
該方法は、式IIのチオエステル
を含む培地中で改変組換え宿主細胞を培養する段階を含み、
式中、R⁴は、コエンザイムA(CoA)部分、パンテテイン部分、およびシステアミン部分からなる群より選択され、
該改変組換え宿主細胞が、
iii. 式IIのチオエステルおよびマロニルCoAを式IIIのテトラケチド
に変換するシンターゼをコードする第1のポリヌクレオチド、ならびに、
iv. 式IIIのテトラケチドを式IVの化合物に変換する2-アルキル-4,6-ジヒドロキシ安息香酸シクラーゼをコードする第2のポリヌクレオチド
を含み、かつ、
該改変組換え宿主細胞が、該第1および該第2のポリヌクレオチドによりコードされる生成物が発現されて式IVの化合物が生成される条件下で、培養される、
方法。
２２. R¹が、C₁～C₁₀ハロアルキル、C₁～C₁₀ヒドロキシアルキル、重水素化C₁～C₁₀アルキル、トリチウム化C₁～C₁₀アルキル、およびC₂～C₁₀アルケニルからなる群より選択される、態様21の方法。
２３. 前記シンターゼがオリベトール酸シンターゼである、態様21または態様22の方法。
２４. 前記2-アルキル-4,6-ジヒドロキシ安息香酸シクラーゼが切断型オリベトール酸シクラーゼである、態様21～23のいずれかの方法。
２５. R⁴がCoA部分である、態様21～24のいずれかの方法。
２６. 前記宿主細胞が、式IIaの出発原料
を式IIのチオエステルに変換するアシル-CoAシンテターゼをコードする第3のポリヌクレオチドをさらに含み、かつ、 段階 (a) が、該第3のポリヌクレオチドによりコードされる生成物が発現されて式IIのチオエステルが生成される条件下で、該宿主細胞を培養することを含む、
態様21～25のいずれかの方法。
２７. 前記アシル-CoAシンテターゼがrevSまたはCsAAE3である、態様26の方法。
２８. 式IIのチオエステル中のR⁴がパンテテイン部分またはシステアミン部分である、態様21～24のいずれかの方法。
２９. 式IVの化合物を式Vの化合物
またはその塩に変換する段階をさらに含み、式中、R³はプレニル部分である、態様21～28のいずれかの方法。
３０. 式Vの化合物を脱炭酸して式Vaの化合物
を得る段階をさらに含む、態様29の方法。
３１. 式IVの化合物を脱炭酸して式IVaの化合物
を得る段階をさらに含む、態様21～28のいずれかの方法。
３２. 式IVaの化合物を式Vaの化合物
に変換する段階をさらに含み、式中、R³はプレニル部分である、態様31の方法。
３３. 前記宿主細胞が、式IVの化合物を式Vの化合物に変換するプレニルトランスフェラーゼ酵素をコードする第4のポリヌクレオチドをさらに含み、かつ、変換段階 (b) が、該第4のポリヌクレオチドによりコードされる生成物が発現されて式Vの化合物が生成される条件下で、該宿主細胞を培養することを含む、態様29、30、および32のいずれかの方法。
３４. 前記宿主細胞が、式IVaの化合物を式Vaの化合物に変換するプレニルトランスフェラーゼ酵素をコードする第4のポリヌクレオチドをさらに含み、かつ、変換段階 (b) が、該第4のポリヌクレオチドによりコードされる生成物が発現されて式Vaの化合物が生成される条件下で、該宿主細胞を培養することを含む、態様32の方法。
３５. 前記プレニルトランスフェラーゼがゲラニルピロリン酸:オリベトール酸ゲラニルトランスフェラーゼである、態様33または態様34の方法。
３６. 変換段階 (b) が、(1) 式IVの化合物と、(2) ゲラニオール、活性化ゲラニオール、またはシトラールと、(3) 有機溶媒とを含む反応混合物を形成すること、および、式Vの化合物のために十分な条件下で該反応混合物を維持することを含む、態様29または態様30の方法。
３７. 変換段階 (b) が、(1) 式IVaの化合物と、(2) ゲラニオール、活性化ゲラニオール、またはシトラールと、(3) 有機溶媒とを含む反応混合物を形成すること、および、式Vaの化合物のために十分な条件下で該反応混合物を維持することを含む、態様32の方法。
３８. カンナビジオール酸類似体、カンナビジオール類似体、Δ⁹-テトラヒドロカンナビノール酸類似体、Δ⁸-テトラヒドロカンナビノール酸類似体、カンナビクロメン酸類似体、カンナビクロメン類似体、カンナビノール類似体、カンナビノジオール類似体、カンナビノール酸類似体、カンナビバリン類似体、カンナビバリン酸類似体、Δ⁹-テトラヒドロカンナビバリン類似体、Δ⁸-テトラヒドロカンナビバリン類似体、Δ⁹-テトラヒドロカンナビバリン酸類似体、Δ⁸-テトラヒドロカンナビバリン酸類似体、カンナビゲロバリン類似体、カンナビゲロバリン酸類似体、カンナビクロメバリン類似体、カンナビクロメバリン酸類似体、カンナビジバリン類似体、カンナビジバリン酸類似体、カンナビトリオール類似体、またはカンナビシクロール類似体である、態様29、30、および32～37のいずれかに従って調製される化合物。

本明細書に例示的に記載されている本発明は、本明細書に具体的に開示されていない任意の1つまたは複数の要素、1つまたは複数の限定の非存在下で好適に実施可能である。したがって、例えば、本明細書の各場合において、「を含む」、「から本質的になる」、および「からなる」という用語のいずれかを他の2つの用語のうちいずれかで置き換えることができる。したがって、例えば、いくつかの態様は、いくつかの成分「を含む」宿主細胞を包含しうるし、他の態様は、同じ成分「から本質的になる」宿主細胞を包含するであろうし、さらに他の態様は、同じ成分「からなる」宿主細胞を包含するであろう。使用された用語および表現は、限定の用語ではなく記述の用語として使用されており、これらの用語および表現の使用において、提示および記述される特徴の任意の均等物またはその一部を排除するという意図はなく、むしろ、特許請求される本発明の範囲内で様々な修正が可能であると認識される。したがって、本発明が好ましい態様および任意的な特徴によって具体的に開示されているが、当業者は本明細書に開示される概念の修正および変形を行うことができること、および、これらの改変および変形が添付の特許請求の範囲により規定される本発明の範囲内であると考えられることを理解すべきである。

上記の書面による記載は、当業者が本発明を実施することを可能にするために十分であると考えられる。以下の実施例は例示目的のみで示されるものであり、本発明の範囲を限定するようには決して意図されていない。実際、本明細書に示されかつ記載される改変以外にも、本発明の様々な改変が、上記の説明から当業者に明らかになるであろうし、それらは添付の特許請求の範囲内である。

本明細書において、特許明細書、他の外部文献、または他の情報源に対する言及が行われている場合、これは一般に、本発明の特徴を説明するための文脈を示すことが目的である。別途具体的な記載がない場合、これらの外部文献に対する言及は、これらの文献またはこれらの情報源が、いかなる解釈範囲においても、先行技術であるか、または当技術分野における共通の一般的知識の一部を形成することの承認として解釈されるべきではない。本明細書において引用されるすべての特許、特許出願、および参考文献は、その全体が参照により本明細書に組み入れられる。

例示的配列
SEQ ID NO:1 例示的RevSポリペプチド配列GenBank BAK64635.1

SEQ ID NO:2 例示的アサCSAAE3ポリペプチド配列; GenBank AFD33347.1

SEQ ID NO:3 例示的アサCSAAE1ポリペプチド配列; GenBank AFD33345.1 膜貫通ドメインに下線を付す

SEQ ID NO:4 例示的オリベトール酸シンターゼポリペプチド配列; UniProtKB/Swiss-Prot: B1Q2B6.1

SEQ ID NO:5 例示的オリベトール酸シクラーゼポリペプチド配列; UniProtKB/Swiss-Prot: I6WU39.1

SEQ ID NO:6 N末端メチオニンおよびC末端リジンをSEQ ID NO:5に比べて欠くオリベトール酸シクラーゼポリペプチド配列

SEQ ID NO:7 N末端メチオニンおよびC末端における5アミノ酸配列YTPRKをSEQ ID NO:5に比べて欠く切断型のシクラーゼ95 aa

SEQ ID NO:8 青枯病菌(Ralstonia solanacearum)アシル-CoAシンターゼの415アミノ酸C末端ドメインのアミノ酸配列

SEQ ID NO:9 ストレプトマイセス属種のベナスタチン遺伝子クラスターのbenH遺伝子産物由来のシクラーゼドメインのアミノ酸配列

Claims (22)

1. 式I：
   の化合物、またはその塩もしくはカンナビノイド誘導体、および薬学的に許容される賦形剤を含む、薬学的組成物:
   式中、
   R¹は、C₅～C₂₀ハロアルキル、C₁～C₄ハロアルキル、重水素化C₁～C₂₀アルキル、トリチウム化C₁～C₂₀アルキル、およびC₂～C₂₀アルケニルからなる群より選択され、
   R²は、COOR^2aおよびHからなる群より選択され、
   R^2aは、HおよびC₁～C₆アルキルからなる群より選択され、
   R³は、プレニル部分およびHからなる群より選択され、
   プレニル部分は、プレニル、イソプレニル、ゲラニル、ミルセニル、オシメニル、ファルネシル、およびゲラニルゲラニルからなる群より選択され、
   カンナビノイド誘導体は、
   からなる群より選択され、
   式中、Rは、水素またはCH₃である。
2. 前記化合物またはその塩もしくはカンナビノイド誘導体中のR¹が、C₅～C₁₀ハロアルキル、C₁～C₄ハロアルキル、重水素化C₁～C₁₀アルキル、トリチウム化C₁～C₁₀アルキル、およびC₂～C₁₀アルケニルからなる群より選択される、請求項1記載の薬学的組成物。
3. 前記化合物またはその塩もしくはカンナビノイド誘導体中のR¹が、C₅～C₁₀ハロアルキル、C₁～C₄ハロアルキル、重水素化C₁～C₁₀アルキル、およびトリチウム化C₁～C₁₀アルキルからなる群より選択される、請求項1記載の薬学的組成物。
4. 前記化合物またはその塩もしくはカンナビノイド誘導体中のR¹が、C₅～C₁₀ハロアルキル、C₁～C₄ハロアルキル、またはC₂～C₁₀アルケニルである、請求項1記載の薬学的組成物。
5. 前記化合物またはその塩もしくはカンナビノイド誘導体中のR¹が、C₅～C₁₀ハロアルキルまたはC₁～C₄ハロアルキルである、請求項1記載の薬学的組成物。
6. 前記化合物またはその塩もしくはカンナビノイド誘導体中のR¹が、フルオロペンチル、フルオロエチル、フルオロプロピル、フルオロブチル、フルオロヘキシル、フルオロオクチル、およびフルオロノニルからなる群より選択される、請求項5記載の薬学的組成物。
7. 前記化合物またはその塩もしくはカンナビノイド誘導体中のR¹が、3-フルオロプロピル、4-フルオロブチル、5-フルオロペンチル、および3-フルオロペンチルからなる群より選択される、請求項5記載の薬学的組成物。
8. 前記化合物またはその塩もしくはカンナビノイド誘導体中のR¹がC₁～C₁₀ブロモアルキルまたはC₁～C₁₀クロロアルキルである、請求項5記載の薬学的組成物。
9. 前記化合物またはその塩もしくはカンナビノイド誘導体中のR¹が重水素化C₁～C₁₀アルキルまたはトリチウム化C₁～C₁₀アルキルである、請求項1記載の薬学的組成物。
10. 前記化合物またはその塩もしくはカンナビノイド誘導体中のR²が、COOHおよびHからなる群より選択される、請求項1記載の薬学的組成物。
11. 前記化合物またはその塩もしくはカンナビノイド誘導体中のR²がCOOHである、請求項1記載の薬学的組成物。
12. 前記化合物またはその塩もしくはカンナビノイド誘導体中のR²がHである、請求項1記載の薬学的組成物。
13. 前記化合物またはその塩もしくはカンナビノイド誘導体中のR³がHである、請求項1記載の薬学的組成物。
14. 前記化合物またはその塩もしくはカンナビノイド誘導体中のR³がプレニル部分である、請求項1記載の薬学的組成物。
15. 前記化合物またはその塩もしくはカンナビノイド誘導体中のプレニル部分が3,7-ジメチルオクタ-2,6-ジエン-1-イルである、請求項1記載の薬学的組成物。
16. 前記化合物またはその塩もしくはカンナビノイド誘導体が式Ia：
    の構造を有する、請求項1記載の薬学的組成物。
17. 前記化合物が式Iの化合物のカンナビノイド誘導体またはその塩である、請求項１記載の薬学的組成物。
18. 前記化合物またはその塩が、
    からなる群より選択され、式中、RはHまたはCH₃である、請求項1記載の薬学的組成物。
19. 前記化合物またはその塩が、
    からなる群より選択され、式中、RはHまたはCH₃である、請求項1記載の薬学的組成物。
20. 前記化合物またはその塩が、
    からなる群より選択される、請求項1記載の薬学的組成物。
21. カンナビノイド誘導体の塩が、薬学的に許容される塩である、請求項1～20のいずれか一項記載の薬学的組成物。
22. 対象におけるカンナビノイド受容体活性により媒介される疾患または状態を治療するための、請求項1～21のいずれか一項記載の薬学的組成物。