JP7822566B2 - 杜仲葉粉末及びその製造方法 - Google Patents

Description

本発明は、杜仲葉の粉末状加工物及びその製造方法等に関する。

近年の研究により細胞間のコミュニケーションに細胞外小胞（Ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｖｅｓｉｃｌｅｓ、ＥＶｓ）が使用されているということが知られ、そのサイズや生物学的機能からエクソソーム、ＭＶ（ｍｉｃｒｏｖｅｓｉｃｌｅｓ）などに分類され、中でも直径５０～１５０ｎｍの小胞はエクソソームと呼ばれ、近年生体内での機能の解明が急速に進んでいる。エクソソーム研究の中でも、がんとの関連は特に注目されているが、がん細胞は、がん細胞由来のエクソソームが２０％多く放出されることが知られているため、がん組織においてエクソソームは重要なツールとして位置付けられている。また、エクソソームはがんがその兆候を示す前、初期の段階から放出されていることから、がんの早期発見マーカーとして、実用化に向けて研究がすすめられている。また逆に、間葉系幹細胞から産生されるエクソソームや植物由来のエクソソームには、がん抑制効果が見られ、研究対象として注目が集まっている。

「エクソソーム」自体の発見は今から３０年ほど前にさかのぼるが、発見当初は細胞の不要物的な存在としか認知されず、その機能や存在意義などは長い間、不明であった。ところが、２００８年にエクソソーム内にｍＲＮＡやｍｉＲＮＡを含む核酸物質が内包されて他の細胞へと受け渡されている可能性が示されるや否や、ここ数年の間に関連研究が一気に加速し、今日に至っている。

近年、エクソソームを介して細胞外へ放出されているｍｉＲＮＡの存在に着目し、非侵襲性で感度の高いバイオマーカーの確立を目指して、白血病や悪性リンパ腫など造血器腫瘍患者の血清中ｍｉＲＮＡを用いた診断・予後マーカーの探索が行なわれてきた。ｍｉＲＮＡは１８－２２塩基の小分子ＲＮＡの一種で、細胞内でｍＲＮＡと結合してその転写を制御することが知られている。この研究が始まった２００８年頃は、血清を含む体液中（細胞外）にｍｉＲＮＡが存在するメカニズムや意義についてはよくわかっていなかったが、最近、東京医科大学血液内科学分野および分子病理学分野の共同研究により、急性白血病、悪性リンパ腫、骨髄腫患者由来の血清中においてｍｉＲ－９２ａが著減することが見いだされ、次々と報告されている（例えば、非特許文献１参照）。

最近では、「エクソソーム」が細胞の分化・老化や免疫系の制御などさまざまな生命現象に関与していることが明らかになり、今後も本研究は発展して行くことは間違いない。エクソソームは「細胞外小胞」の中の氷山の一角であり、まだ未解明の部分が多く残されている。バイオロジーから臨床研究まで、様々なアプローチで研究を展開されるであろうが、バイオロジーの分野において「エクソソーム」を多く含有している組成物は、研究を進める上からも必要であり求められている。

杜仲葉は三大漢方薬の一つで、ゲニポシド酸、ユーコミシンＡ、アスペルロシドやポリフェノールを豊富に含有し栄養成分も多くきわめて有用な食品である。そのため杜仲葉全体を食せることが好ましいが、杜仲葉は、グッタベルカという固いゴム成分を含むため、粉砕が容易でなく、粒子が細かい均一なものが得られないという問題があった。また、杜仲葉に含まれる有用成分を効率よく抽出するためには、できるだけ温度を上げないで粉末化する技術が必要である。

門田宰他、細胞外小胞・エクソソーム研究の最前線：臨床応用を目指して、日本薬理学雑誌、２０１７年、１４９巻３号、１１９～１２２頁

植物由来のエクソソームは、植物に含有される割合が極めて少なく世界中でいろいろな植物が、試験されている。本発明は、植物由来のエクソソームを高い含有率で含む粉末状組成物及びその製造方法を見出すことを課題とする。

前記の課題を解決するため、本発明者らは鋭意検討を行った結果、杜仲葉を乾燥及び粉砕したときに鮮やかな緑色を呈するような杜仲葉粉末の製造方法を検討する中で、杜仲葉由来のエクソソームを大量に含む杜仲葉粉末の製造方法を見出した。すなわち、本発明は以下の実施形態を含む。

（１）杜仲葉由来のエクソソームを含む杜仲葉粉末であって、抽出可能なエクソソームの粒子数が少なくとも２．３７×１０^８個／ｍｇであることを特徴とする杜仲葉粉末。
（２）マンセル表色系において、色相５ＧＹ～１０Ｇ、明度５～８及び彩度６～１０の範囲の緑色を呈する（１）に記載の杜仲葉粉末。
（３）杜仲生葉を５０～７０℃で加熱して発酵を阻止する加熱工程と、加熱処理した杜仲葉を、各辺の長さが１ｍｍ～３ｃｍの矩形状となるように切断する切断工程と、切断された杜仲葉を３０～６０℃の熱風にて乾燥し、その水分含量を２０％以下にする熱風乾燥工程と、
熱風乾燥後の杜仲葉を、－１５～－２５℃で予備凍結し、その後－７０℃以下の温度で凍結乾燥する凍結乾燥工程と、凍結乾燥後の杜仲葉を、粉砕機を用いて粒子径１～４０μｍとなるように粉砕する粉砕工程と、を含む杜仲葉粉末の製造方法。
（４）発酵加熱工程において、杜仲生葉が６５℃にて２分間維持される（３）に記載の製造方法。
（５）熱風乾燥後の杜仲葉の水分含量が、５～１５％である（３）又は（４）に記載の製造方法。
（６）（３）～（５）のいずれかに記載の方法により得られた杜仲葉粉末を精製水、リン酸緩衝生理食塩水又はアルカリイオン水で抽出して抽出液を得る抽出工程と、この抽出液を超遠心分離して得られた沈殿からエクソソームを回収する工程と、を含み、杜仲葉粉末１ｍｇから、少なくとも２．３７×１０^８個のエクソソームを回収しうることを特徴とする杜仲葉に由来するエクソソームの製造方法。

本発明の杜仲葉粉末は、その製造工程で加熱による変性が極力抑えられているため、鮮やかな緑色を呈する。また、凍結乾燥工程により、ゲニポシド酸などの堅いゴム成分の組織が破壊されることにより、粒子が細かく、水に溶けやすく滑らかな粉体が得られる。そのため、この杜仲葉粉末に含まれるエクソソームの抽出が容易で、その含有量も多く、他の栄養成分等の消失もない杜仲葉粉末を提供することができる。

図１は、本実施形態の杜仲葉粉末の製造方法の概要を説明する工程図である。 図２は、本実施形態の杜仲葉粉末からエクソソームを製造する方法の概要を説明する工程図である。 図３は、本実施形態の杜仲葉粉末からミリＱ水で抽出したエクソソームの粒子数及びその粒子径分布を測定した結果を示すチャート図である。 図４は、本実施形態の杜仲葉粉末からＰＢＳで抽出したエクソソームの粒子数及びその粒子径分布を測定した結果を示すチャート図である。

次に、本発明の各実施形態について、図面を参照して説明する。なお、以下に説明する各実施形態は、特許請求の範囲に係る発明を限定するものではなく、また、各実施形態の中で説明されている諸要素及びその組み合わせの全てが本発明の解決手段に必須であるとは限らない。

（杜仲葉粉末）
本発明の１つの実施形態に係る杜仲葉粉末は、杜仲葉由来のエクソソームを含み、抽出可能なエクソソームの粒子数が少なくとも２．３７×１０^８個／ｍｇであることを特徴とする。この値は、本実施形態の杜仲葉粉末に含まれるエクソソームを水で抽出した際の個数である。一方、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で抽出したときには、杜仲葉粉末１ｍｇあたり５．７２×１０^８個のエクソソームが抽出され、さらに、アルカリイオン水で抽出したときには、杜仲葉粉末１ｍｇあたり２．８５×１０^９個のエクソソームを得ることができる。したがって、本実施形態の杜仲葉粉末に含まれる抽出可能なエクソソームの粒子数は、好ましくは、約５×１０^８個／ｍｇ以上であり、より好ましくは、約１．０×１０^９個／ｍｇ以上である。本実施形態の杜仲葉粉末に含まれるエクソソームの粒子数の上限は特に限定されるものではないが、通常は、１～１０億個／ｍｇ程度であろう。

エクソソームの個数及びその平均粒径は、当該技術分野における任意の測定方法で測定することができる。測定方法としては、例えば、電気抵抗ナノパルス法（ｑＮＡＮＯ）、ナノ粒子トラキング法を用いた、エクソソームが溶液中にある状態で観測する湿式の測定方法や、透過型電子顕微鏡でエクソソームの形態を保ったまま観測する乾式の測定方法がある。

他の側面において、本実施形態の杜仲葉粉末は、粉末状態において、あるいは水に溶かしたときに鮮やかな緑色を呈し、甘い杜仲茶として飲用することができる。典型的な実施形態では、この杜仲茶飲料の緑色は、マンセル表色系において、色相５ＧＹ～１０Ｇ、明度５～８及び彩度６～１０の範囲内である。

ここで、マンセル表色系とは、色を表す３属性、色立方体に基づく色の数値表現の一種であり、色票は、円筒座標を用いて配列し、明度Ｖを縦軸、色相Ｈを円周方向に、彩度Ｃを半径方向に配列してなり、この色票を空間的に配列したものを色立方体という。色相Ｈ（Ｈｕｅ）は最初の２桁で示され、１桁目は０～１０からなり２桁目のＹ（黄），ＹＲ（黄赤），Ｒ（赤）などの色相からの隔たり量を表す。次に明度Ｖ（Ｖｌｕｅ）を０（完全暗黒）から１０（完全純白）の範囲の数字で表し、最後に彩度Ｃ（Ｃｈｒｏｍａ）を０（無彩色）から始め鮮やかな色になるにしたがって数字が大きくなるように表す。なお、明度と彩度の数字の間は判別のために「／」（スラッシュ）が入っている。なお、マンセル表色系は、ＪＩＳ Ｚ ８７２１（１９４４）に基づき、測定される。

（杜仲葉粉末の製造方法）
本発明の他の実施形態における杜仲葉粉末の製造方法は、例えば、図１に示す工程に基づいて製造することができる。具体的には、杜仲生葉を加熱する加熱工程Ｓ１０１と、加熱により発酵を阻止した杜仲葉を切断する切断工程Ｓ１０２と、切断された杜仲葉の水分含量を約２０％まで低下させる熱風乾燥工程Ｓ１０３と、凍結乾燥工程Ｓ１０４と、凍結乾燥した杜仲葉を粉砕する粉砕工程Ｓ１０５と、を含む。以下、各工程について詳細に説明する。

原料として使用する杜仲生葉は、収穫後、加熱乾燥処理に供される前の社仲葉を意味するものであり、栽培により生産されたものであっても、天然より生産されたものであってもよい。例えば、当年葉で落葉前の生葉、神奈川県内においては、例えば、４～１０月、好ましくは５～８月、より好ましくは７～８月に採取した生葉を用いることができる。杜仲葉は、自己破壊をおこしやすく劣化が早い。さらに切断された杜仲葉は、切断と同時に劣化が急速に進む。そのため収穫された葉のままで加熱により速やかに発酵を阻止しなければならない。具体的には、早朝、杜仲生葉を傷がつかない様に収穫し、直ちに発酵を阻止するため、加熱工程Ｓ１０１では、５０℃から７０℃の環境下、好ましくは約６５℃の温度で１～１０分程度、好ましくは約５分間加熱する。加熱方法としては、特に限定されないが、例えば、３５０℃の高温に熱したヒーターから温風を送風するなどの方法を用いて行うことができる。加熱後は、０～５℃の冷風にて急速冷却して余熱をとることが、生成物である粉末中のエクソソームの高い含有量と、その鮮やかな緑色を維持する上で好ましい。

切断工程Ｓ１０２では、裁断機を用いて、加熱処理した杜仲葉を各辺の長さが１ｍｍ～３ｃｍの矩形状となるように切断する。切断後の杜仲葉の大きさは、後工程の乾燥を容易にするためには、１ｃｍ四方以下が好ましく、より好ましくは、５ｍｍ四方以下である。

熱風乾燥工程Ｓ１０３では、切断された杜仲葉を３０～６０℃の熱風にて乾燥し、その水分含量を２０％以下にすることが好ましい。後続する凍結乾燥工程をより効率的に行うためには、熱風乾燥後の水分含量は約５～１５％とすることがより好ましい。

凍結乾燥工程Ｓ１０４は、これを、熱風乾燥により水分含量の低下した杜仲葉を、－１５～２５℃の冷凍庫で１０日間保管し、時間をかけてしっかりと予備凍結を行う。時間をかけて凍らせることで、杜仲葉内の水分による氷の球を、よりきめ細かに凍結することができる。これにより氷がきめ細かに製造されることにより細胞の破壊は細かくなる。さらにこれを、真空凍結乾燥機に入れ－７０℃、好ましくは－８０℃にて６時間凍結した。凍結した杜仲葉を－１０℃にて、高真空下で６時間時間をかけゆっくりと昇華乾燥を行い乾燥（昇華）させた。一度乾燥させた杜仲葉を、同じく高真空下で、３０℃の熱を加え、８時間、乾燥具合を高めることが好ましい。これにより水分の含有率を１％にすることができる。

粉砕工程Ｓ１０５は、温度を０℃から５０℃以下に抑えた環境で気流式の粉砕機を使用して平均粒径１～４０ミクロンの粉末を得ることができる。粉砕条件としては、３５℃以下で行い、約１０μｍ以下の粉体を得ることが好ましい。

（エクソソームの製造方法）
他の実施形態におけるエクソソームの製造方法は、上述した方法により得られた杜仲葉粉末を精製水、リン酸緩衝生理食塩水又はアルカリイオン水で抽出して抽出液を得る溶媒抽出工程Ｓ２０１と、この抽出液を超遠心分離して得られた沈殿からエクソソームを回収する超遠心分離／回収工程Ｓ２０２と、を含む。

溶媒抽出工程Ｓ２０１で用いる抽出溶媒としては、水又は水溶液であれば特に限定されないが、たとえば、精製水（ミリＱ水）、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）、アルカリイオン水などが挙げられる。

本明細書において、用語「アルカリイオン水」とは、電気分解を施して得られるアルカリイオンを含有する水のことであり、イオン整水器等を用いて、酸性水とともに別途生成される。このアルカリイオン水のｐＨとしては、ｐＨ８～１１程度のアルカリイオン水を用いればよい。これにより、杜仲葉からのエクソソームをより効率的に抽出回収することができる。なお、アルカリイオン水のｐＨ値の調整は、イオン整水器の電気分解の電流値を変化させることにより適宜行うことができる。

超遠心分離／回収工程Ｓ２０２は、例示的な実施形態において、１０００００～２０００００×ｇで１～６時間スクロースクッション密度勾配を用いた超遠心分離及びイオジキサノール（ｉｏｄｉｘａｎｏｌ）密度勾配を用いた超遠心分離を含む一連の超遠心分離工程を通じて実施していてよい。密度勾配液としては、例えば、ＯｐｔｉＰｒｅｐ^ＴＭ（オプティプレップ）多用途密度勾配遠心分離媒体などが市販されている。

（作用効果）
後述する実施例で示すように、植物由来のエクソソームとして高い含有量を有することが知られているグレープフルーツ由来のエクソソームと比較しても、杜仲葉には約２００倍多くのエクソソームが含まれることから、本実施形態の杜仲葉粉末は、杜仲葉由来のエクソソームに含まれるｍｉＲＮＡやタンパク質などの生理活性物質の薬理作用がより強く発揮される可能性がある。また、杜仲葉由来のエクソソームを大量に調製し、薬物送達システム等の研究に用いる上で有利である。

（実施例１）杜仲葉粉末の製造
杜仲生葉３ｋｇに、３５０℃に熱したヒーターからの温風を、２分間送風して葉の表面が瞬時に６５℃になるようにして発酵を阻止した。冷却した杜仲葉を、裁断機を用いて、葉の中央の太い葉脈に平行に３ｍｍにカットしたあと、その短冊形の葉を、直角方向に３ｍｍに、カットし、３ｍｍの四角形の葉を得た。その後、細かく切断した杜仲葉を、４５℃の熱風で２０分間乾燥した。乾燥後の杜仲葉の水分含量を、赤外線水分計ＦＤ－６１０（株式会社ケット科学研究所製）で測定した結果、水分含有量は１０％であった。これを、真空凍結乾燥を行うため－２０℃の冷凍庫で１０日間保管し杜仲葉を、時間をかけてしっかりと予備凍結を行った。

細かく裁断し、予備凍結した杜仲葉を、凍結乾燥機（東京理科器株式会社、ＦＤ０７８０型）に入れ、―８０℃に６時間保持した。続いて、―１０℃にて高真空下で６時間かけて水分を蒸発させ、ゆっくりと凍結乾燥を行った。このようにして乾燥させた杜仲葉を、同じ高真空下で３０℃の熱を加え、８時間処理して、乾燥具合を高めた。これにより、水分の含有率が１％にした杜仲乾燥葉を得た。

凍結乾燥後の杜仲葉を、気流式の粉砕機を用い、温度を３５℃以下にして粉砕し、粒子径が９μｍの微紛体を得た。得られた粉末を、ＪＩＳ Ｚ ８７２１「色の表示方法-三属性による表示」に準拠した標準色票を用いてマンセル表色系で表記すると、色相５Ｇ、明度５～８及び彩度６～１０の範囲の緑色を呈した。

（実施例２）杜仲葉粉末からのエクソソームの抽出
実施例１で製造した杜仲葉粉末２５０ｍｇを、それぞれ１００ｍＬの精製水（ミリＱ水）、ＰＢＳ及びアルカリイオン水に添加して、室温で２時間攪拌して完全に溶解した。さらに室温で1時間静置した後、各溶液の上清をとり、２０００ｇにて１０分間、高速遠心分離を行った。上清を回収し、０．２２μｍのフィルターでろ過して得られたろ液５５ｍＬを、１０００００×ｇにて１時間、超遠心分離した。超遠心分離により得られた沈殿を、１２０μＬのＰＢＳで懸濁し、ナノパーティクルトラッキングシステムを用いて粒子数を計測した。

ＰＢＳに懸濁した沈殿を、さらにＰＢＳで希釈系を調製し、日本カンタム・デザイン株式会社製のナノ粒子解析システムＮａｎｏＳｉｇｈｔ（ナノサイト）（ＬＭ１０、ソフトウェアＶｅｒ．２．０３）で分析した。表１に示したように、測定した粒子数に希釈倍率を乗じ、超遠心分離により回収した溶液１２０μＬ中の粒子濃度、及び全粒子数を計算した。さらに、超遠心分離に用いたろ液５５ｍＬ中の杜仲葉粉末の使用量から、杜仲葉１ｍｇあたりの粒子数を計算した。

図３は、ミリＱ水で抽出したエクソソームの粒子数及びその粒子径分布を測定した結果を示す。平均粒子径は、１２９．３ｎｍ、測定試料（１５０倍希釈）の濃度は、１．８１×１０^９個／ｍＬであった。図４は、ＰＢＳで抽出したエクソソームの粒子数及びその粒子径分布を測定した結果を示す。平均粒子径は、１３１．９ｎｍ、測定試料（５００倍希釈）の濃度は、１．３１×１０^９個／ｍＬであった。これらの結果より、杜仲葉粉末１ｍｇあたりに含まれる粒子数は、２．３７×１０^８個（溶媒ＭｉｌｌｉＱ Ｗａｔｅｒ）、５．７２×１０^８個（溶媒ＰＢＳ）及び２．８５×１０^９個（アルカリイオン水）であった。また、計算上、ティースプーン１杯（約１．５ｇ）には、８．５７×１０^１１個（溶媒ＰＢＳ）、３．５５×１０^１１個（溶媒ＭｉｌｌｉＱ Ｗａｔｅｒ）及び４．２７５×１０^１２個（アルカリイオン水）の粒子数のエクソソームが含まれると推測された。

（比較例１）
グレープフルーツ乾燥粉末を、実施例２と同様の方法で、精製水で抽出後、超遠心分離して得た沈殿からエクソソームを回収した。得られたエクソソーム溶液は、２×１０^９個／ｍＬであった。これに対し、同時に杜仲葉粉末から抽出、回収したエクソソーム溶液は、５×１０^１１個／ｍＬとなり、グレープフルーツの約２５０倍の量であった。

Claims (1)

1. 杜仲生葉を５０～７０℃で加熱して発酵を阻止する加熱工程と、
   加熱処理した前記杜仲葉を、各辺の長さが１ｍｍ～３ｃｍの矩形状となるように切断する切断工程と、
   前記切断された杜仲葉を３０～６０℃の熱風にて乾燥し、その水分含量を２０％以下にする熱風乾燥工程と、
   前記熱風乾燥後の杜仲葉を、－１５～－２５℃で予備凍結し、その後－７０℃以下の温度で凍結乾燥する凍結乾燥工程と、
   前記凍結乾燥後の杜仲葉を、粉砕機を用いて粒子径１～４０μｍとなるように粉砕する粉砕工程と、
   を含む方法により製造された杜仲葉粉末を、精製水、リン酸緩衝生理食塩水又はアルカリイオン水で抽出して抽出液を得る抽出工程と、
   前記抽出液を超遠心分離して得られた沈殿からエクソソームを回収する工程と、
   を含み、前記杜仲葉粉末１ｍｇから、少なくとも２．３７×１０^８個から２．８５×１０ ^９ 個のエクソソームを回収しうることを特徴とする杜仲葉に由来するエクソソームの製造方法。