JP7824591B2 - 細胞分散システム - Google Patents

Description

本発明は、細胞分散システムに関するものである。

再生医療においては、多能性幹細胞、体性幹細胞、前駆細胞、各種の体細胞の利用が検討されてきた。近年では、人工多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞とも称する。）の発見などにより、さまざまな細胞が臨床応用可能になっている。臨床応用に際しては、細胞浮遊液の注入療法のほか、治療対象となる組織・臓器に細胞をより効率的に移植するため、所望の細胞から作製したシート状の組織の移植療法が採用されている。このシート状の組織は、生分解性の材料（スキャホールド）に対して細胞を播種するなどの方法で作製されていたが、スキャホールドを用いることなくシート状の組織の作製を可能とする技術が開発され（非特許文献１、２）、臨床応用されつつある。このスキャホールドを用いることなく形成されたシート状の組織は、細胞シートとも称され、通常単細胞同士が直接又は細胞外マトリックスを介して相互に接着して平面状の組織を形成した、単細胞の単層シートである。この細胞シートは、例えば、角膜、心臓、食道、軟骨、歯周組織、中耳、肺などを対象として臨床応用が検討されている。

このように、例えば細胞シートなどを用いた再生医療は、臨床応用が広く検討されつつあるが、治療対象に適した細胞を効率よく大量に得る必要があり、適用対象となる患者が多く存在する場合には尚更ある。そこで、患者自身から採取した自家の細胞を培養により増殖させたり、所定の幹細胞を培養により増殖させたりする方法が提案されている（特許文献１～４）。

しかし、例えば特許文献１～４に記載のような３次元培養方法を採用した場合、一般に、複数の単細胞が集合した細胞凝集塊が多量に形成され得ることが知られている。細胞凝集塊が大きくなり過ぎると、内部の細胞に培養液が十分に供給されない、また細胞から分泌される老廃物が蓄積するなどの不具合が生じる場合があることから、特許文献１～４には、メッシュ状のフィルタ等により、継続して培養が可能な程度の大きさに細胞凝集塊を分割することが記載されている。

特許第６９３９６４３号公報 特許第６２９２４１５号公報 特許第６２６８３４２号公報 特許第６２７７４５０号公報

Shimizu T., et al., Curr. Pharm. Des., Vol. 15, 2807-2814(2009) Yamada N., et al., Makromol. Chem. Rapid Commun., Vol. 11, 571-576(1990)

ところで、例えば前述の細胞シートを、培養により得られた細胞凝集塊を用いて製造しようとする場合、一般に細胞シートが単細胞の単層構造であることを踏まえると、細胞凝集塊を、単細胞が多く、望ましくは単細胞のみが、存在するよう分散させたうえで使用する必要がある。このような細胞凝集塊の分散処理は、タンパク質分解酵素を用いて行われるのが一般的である。

しかし、タンパク質分解酵素は、細胞接着因子のみならず膜タンパク質も破壊し得るため、細胞を損傷する可能性がある。また、酵素反応はバラツキが大きく、また、酵素などを除去するための洗浄操作等の煩雑な工程が必要なため、手作業により行われるのが一般的である。この酵素反応を用いた一連の工程は作業者の熟練が必要になり、作業者の熟練度によっても得られる細胞にバラツキが生じる可能性がある。多くの患者に細胞シートなどを用いた再生医療を提供するためには、多量の細胞凝集塊を効率よく処理する必要がある。そのため、タンパク質分解酵素を用いることなく、例えば細胞シートなどの作製に適した各種細胞を自動化が可能な工程で製造可能な技術の開発が求められている。また、細胞を継代培養して大量の細胞を得るためにも、継代培養間に細胞凝集塊を効率よく分散させる技術の開発も求められている。

そこで、本発明の目的は、物理的な作用のみにより、細胞凝集塊から細胞シートの作製にも利用可能な大きさの細胞を簡便な工程により得るための技術を提供することにある。

本発明者らが検討したところによると、例えば特許文献２～４に記載のようなメッシュ状のフィルタを応用し、メッシュサイズを小さくすると、細胞自体が一定程度破壊などにより死滅するとの知見を得た。そこで、このようなフィルタとは異なる構造を種々検討した。その結果、所定長さの狭小流路を通じて細胞凝集塊を含む液を移動させると、タンパク質分解酵素を用いなくとも、狭小流路を通過する際の物理的な作用のみにより、細胞凝集塊の少なくとも一部を細胞シートの作製にも利用可能な大きさに破砕して分散させることが可能であることを見出した。本発明の要旨は以下のとおりである。

（１）多能性幹細胞、体性幹細胞、前駆細胞又は体細胞の細胞凝集塊を破砕して分散させる細胞分散システムであって、前記細胞分散システムは、第１開口部、第２開口部、及び、第１開口部と第２開口部の間に設けられた所定長さの狭小流路を有する分散器を有し、前記第１又は第２開口部から前記第２又は第１開口部に向かって細胞凝集塊を含む液体を、前記狭小流路を通じて移動させ、物理的な作用のみで細胞凝集塊の少なくとも一部を細胞シートの作製にも利用可能な大きさに破砕して分散させることが可能である、細胞分散システム。
（２）前記分散器は、前記第１及び第２開口部において、それぞれシリンジ構造の第１ベッセル及び第２ベッセルと接続され、前記第１ベッセルと前記第２ベッセルは前記狭小流路を介して連通しており、前記第１ベッセル及び第２ベッセルは、それぞれ第１プランジャ及び第２プランジャのガスケットで確定される前記液体を充填可能な空間を有し、前記第１及び第２プランジャを相補的に移動させることで第１又は第２ベッセルの前記空間に充填されている前記液体を前記狭小流路を通じて第２又は第１ベッセルの前記空間に移動させる、前項（１）記載の細胞分散システム。
（３）前記狭小流路の最小幅は、前記細胞凝集塊の粒度分布において１００μｍ以上の最頻値となる粒子径の０．２０～２．０倍の大きさである、前項（１）又は（２）記載の細胞分散システム。
（４）前記狭小流路を通過させる液体の流速が、０．０５～１０ｍ／ｓｅｃである、前項（１）～（３）の何れか一項に記載の細胞分散システム。
（５）前記狭小流路の長さ方向に直交する断面形状が、一重連続円環状、一重離散円環状、多重離散円環状、円形状、方形状から選択される少なくとも一種である前項（１）～（４）の何れか一項に記載の細胞分散システム。
（６）前記狭小流路の長さ方向の最小幅が、一定、又は、前記第１又は第２開口部側から前記第２又は第１開口部側に向かって漸次小さくなった後漸次大きくなる、前項（１）～（５）の何れか一項に記載の細胞分散システム。
（７）前記狭小流路を構成する壁面の少なくとも一部に凹凸が設けられている前項（１）～（６）の何れか一項に記載の細胞分散システム。
（８）前記液体に２回以上繰り返し前記狭小流路を通過させ、前記細胞凝集塊の平均粒径を徐々に小さくする、前項（１）～（７）の何れか一項に記載の細胞分散システム。
（９）前記第１又は第２開口部の近傍に、前記第１又は第２ベッセルから前記第２又は第１ベッセルに向かう前記液体を前記狭小流路の周壁側に向かわせる構造体が設けられている、前項（２）～（８）の何れか一項に記載の細胞分散システム。

本発明によれば、物理的な作用のみにより、細胞凝集塊から細胞シートの作製にも利用可能な大きさの細胞を簡便な工程により得るための技術を提供するができる。

実施形態に係る細胞分散システムに適用可能な分散器及びベッセルの一構成例を示したものであり、（ａ）は分解状態の部分断面図、（ｂ）は組立状態の部分断面図である。 分散器を介して第１ベッセルと第２ベッセルのヘッドを接続した状態の部分拡大断面図である。 実施形態に係る狭小流路形成部材の第一例を示したものであり、（ａ）は分解状態の部分断面図、（ｂ）は組立状態の部分断面図である。 実施形態に係る狭小流路形成部材の第二例を示した斜視図である。 上側が、図４におけるＩ－Ｉ断面図、下側が、図４におけるII－II断面図である。 実施形態に係る狭小流路形成部材の第三例を示した斜視切り欠き断面図である。 上側が、図６におけるIII－III断面図であり、下側が、図６における断面の正面図である。 細胞凝集塊を含む液体を第１ベッセルから狭小流路を通過させて破砕し、分散させ、第２ベッセルに収容する工程を示し、（ａ）は分散器を介して第１ベッセルと第２ベッセルのヘッドを接続した状態の断面図、（ｂ）は第１ベッセルの下部に沈殿した細胞凝集塊を、狭小流路を通過させて破砕し、分散させ、第２ベッセルに収容した状態の断面図である。 細胞凝集塊分散装置の全体斜視図である。 細胞凝集塊分散装置にベッセルをセットする状態を示す斜視図である。 参考例１で用いた流路形成部材の断面図である。 （ａ）は、実施例１において破砕、分散処理される前の細胞凝集塊の状態を示した撮像及び粒度分布を示したものであり、（ｂ）は、実施例１において破砕、分散処理した後の細胞凝集塊の状態を示した撮像及び粒度分布を示したものである。 （ａ）は、参考例１において破砕、分散処理される前の細胞凝集塊の状態を示した撮像及び粒度分布を示したものであり、（ｂ）は、参考例１において破砕、分散処理した後の細胞凝集塊の状態を示した撮像及び粒度分布を示したものである。

本発明の実施形態に係る細胞分散システムは、多能性幹細胞、体性幹細胞、前駆細胞又は体細胞（以下、「細胞」と称する場合がある。）の細胞凝集塊を破砕して分散させるものであり、第１開口部、第２開口部、及び、第１開口部と第２開口部の間に設けられた所定長さの狭小流路を有する分散器を有する。ここで、「所定長さ」とは、流路の最小幅に対する流路の実効長さの比（アスペクト比）が１より十分に大きいことを意味する。
そして、前記第１又は第２開口部から前記第２又は第１開口部に向かって細胞凝集塊を含む液体を、前記狭小流路を通じて移動させることで、物理的な作用のみで細胞凝集塊の少なくとも一部を細胞シートの作製にも利用可能な大きさ（以下、「所定の大きさ」と称する場合がある。）に破砕して分散させることが可能である。

この細胞分散システムに適用可能な多能性幹細胞、体性幹細胞、前駆細胞又は体細胞は、特に限定はない。各種の多能性幹細胞、各種の体性幹細胞、各種の前駆細胞、所望の組織に由来する自家の体細胞、予め増殖させた未分化状態の多能性幹細胞、体性幹細胞又は前駆細胞を疾患のある組織に適用可能な体細胞に分化させた多能性幹細胞、体性幹細胞又は前駆細胞由来体細胞などが挙げられる。多能性幹細胞は、自己再生が可能で、成体内に存在するあらゆる細胞に分化が可能なものであり、胚性幹細胞（ＥＳ細胞）、ｉＰＳ細胞などである。体性幹細胞（成体幹細胞或いは組織幹細胞とも称される。）は、自己再生が可能で、通常、由来となる組織内の様々な細胞に分化が可能なものである。前駆細胞は、幹細胞から最終分化細胞に至る過程で出現する細胞であり、体性幹細胞より自己再生能に制限があるものであるとされている。また、これらの細胞は、ヒト、イヌ、ネコなどの哺乳動物に由来するものを採用可能であるが、ヒト由来の細胞が好適である。

この細胞分散システムに適用可能な細胞凝集塊を含む液体（以下、「細胞液」と称する場合がある。）は、特に限定はなく、予め増殖培養した後の細胞凝集塊を含む培養液をそのまま使用してもよいし、予め増殖培養した後、増殖培養に使用した培養液の全部又は一部を同一の新鮮な培養液又は培養液以外で細胞の生存維持が可能な成分を含む液体などに入れ替えたものを使用してもよい。予め増殖培養した後の細胞凝集塊を含む培養液は、例えば、特許文献３などに記載の大量細胞培養システムにより培養して得られた、細胞凝集塊（スフェロイド）含有培養液などが挙げられる。

破砕の対象となる細胞凝集塊は、多数の細胞が凝集した塊であり、スフェロイドとも称する。細胞分散システムに適用する液体には、多数の細胞凝集塊が含まれ、その大きさには分布がある。また、この分布は、細胞の種類などによって異なるが、細胞凝集塊の平均粒子径は、典型的には、１００μｍ以上、例えば１００～２０００μｍである。尚、破砕とは、細胞破壊を伴わない細胞凝集塊の分割、微細化及び単細胞化を意図するものであるが、全く細胞破壊を伴わないことを意味するものではない。

狭小流路は、細胞凝集塊の少なくとも一部を所定の大きさに破砕して分散させることが可能な程度に狭小な流路であればよく、例えば、細胞凝集塊を多数含む集団のうちの少なくとも一部の細胞凝集塊を所定の大きさになるように破砕を生じさせ得る程度の最小幅を有する。流路を狭小にすることで、当該流路を通過する細胞凝集塊に対して剪断力を負荷することできる。また、狭小な流路が所定の長さを有することで、狭小な連続する管路を形成し、連続した剪断力の負荷による細胞凝集塊の効率的な破砕、分散が可能になると考えられる。この最小幅は、細胞の種類などに応じて適宜決定することができるが、例えば、細胞凝集塊の粒度分布において、１００μｍ以上の最頻値となる粒子径の０．２０～２倍の大きさとするのが好ましい。１００μｍ以上の細胞凝集塊を対象にするのは、破砕の対象となる細胞凝集塊の大きさであることによる。粒度分布は、顕微鏡等の拡大画像を用いた画像解析により測定し、算出することができる（例えば、株式会社ＳＣＲＥＥＮホールディングス製、Ｃｅｌｌ３ｉＭａｇｅｒを用いて行うことができる。）。狭小流路の長さは、細胞の種類、狭小流路の最小幅の大きさ、細胞凝集塊を含む液体の流速などを考慮して、調整することができる。もっとも、例えばステンレス製のメッシュ状のフィルタのような厚み方向の長さでは、細胞の破壊を抑制しようとすると十分な破砕、分散作用は得られない。このようなメッシュフィルタを用いる場合、開口幅が７０μｍ前後のメッシュフィルタが使われているが、細胞凝集塊はこのような開口幅であれば通過できるものがある。通過できないものは分割されながら通過し、その際に細胞の破壊が起こる場合がある。開口幅を７０μｍより小さくするとその傾向が強くなる。細胞破壊を抑制するため開口幅を大きくすると、細胞凝集塊はより大きい大きさにしか分割されないことになる。分割されず通過可能な細胞凝集塊のうち、メッシュの開口幅より大きいものは、フィルタ通過後の細胞凝集塊は強制的に長細い形状となっている。フィルタを通過した後は、剪断力は負荷されないか、非常に小さく、そのままの形状を維持することになり、所望の大きさに破砕されることはない。一方、前述の狭小流路の場合は、例えば流路断面において最小幅が７０μｍ前後でも、最小幅より大きく狭小流路を通過可能な細胞凝集塊は、変形しながら狭小流路に進入することになるが、狭小流路が所定長さ連続するため、連続する流路を構成する壁面や細胞液の乱流よって細胞凝集塊に変形力及び剪断力が作用し、細胞凝集塊に繰り返し剪断力と変形力が加わることにより破砕、分散される。また、メッシュフィルタによる強制的な分断とは異なり、流路壁面や乱流による応力は細胞を破壊する程度の強力な負荷ではないことで細胞破壊も抑制されると考えられる。狭小流路が、流路断面において最小幅以外の寸法は細胞凝集塊の粒子径よりも十分に大きい場合は、流路の最小幅が細胞凝集塊の粒子径よりも小さい場合でも細胞凝集塊は変形しながら通過し易く、流路通過時には前述のように繰り返し剪断力と変形力が加わるため、より多くの細胞凝集塊を破砕し、分散することができる。

また、狭小流路は、細胞凝集塊の少なくとも一部を所定の大きさに破砕して分散させることが可能な程度に狭小な流路であればよく、その流路構造は特に限定はないが、限られた容積で、効率的に破砕して分散させる観点から、狭小流路の長さ方向に直交する断面形状が、一重連続円環状、一重離散円環状、多重離散円環状、円形状、方形状から選択される少なくとも一種であるのが好ましく、一重連続円環状、一重離散円環状、多重離散円環状、又は、これらと方形状の組み合わせであるのがより好ましい。また、この断面形状は、狭小流路の長さ方向に同じ形状で連続してもよいし、変化させてもよい。変化させる場合は、前記第１又は第２開口部側から前記第２又は第１開口部側に向かって漸次小さくなった後漸次大きくなるようにするのが好ましい。

以下では、図面に基づき、実施形態に係る細胞分散システムを説明する。

図１は、実施形態に係る細胞分散システムに適用可能な分散器及びベッセルの一構成例を示したものである。図中符号１ａは第１シリンジ、１ｂは第２シリンジ、２は第１ベッセル、３は第２ベッセル、４は分散器をそれぞれ示している。図１（ａ）は、分解状態の分散器４、及び、分散器４に未接続状態の第１シリンジ１ａ及び第２シリンジ１ｂを示した断面図であり、図２（ｂ）は組立状態の分散器４、第１シリンジ１ａ及び第２シリンジ１ｂを示した断面図である。

第１シリンジ１ａは、図１に示すように、円筒形の外筒部５の両端に外形が同一円形のフロントフランジ６とバックフランジ７を一体的に設け、フロントフランジ６の中心部に設けた吐出口となるヘッド８は、標準的なルアーロック構造とし、プランジャ９の軸部１０の先端には外筒部５内に摺動可能に弾性嵌合するガスケット１１を設け、基端にプランジャボタン１２を設けた構造である。本例では、ガスケット１１と外筒部５内の弾性嵌合は、ガスケット１１の外周部に設けられた２つのＯリング１１Ｂにより行われるが、これに限定されるわけではない。第２シリンジ１ｂも、第１シリンジ１ａと同じ構造を有する。つまり、第１ベッセル２と第２ベッセル３は同じ構造を有している。もっとも、両シリンジを例えば異なる容積にするなどの異なる構造にしてもよい。

本例では、ガスケット１１の先端チップ１１Ａの形状を円錐形凸部とし、外筒部５の先端側内面、即ちフロントフランジ６を設けた側の内面６Ａの形状は、先端チップ１１Ａを受け入れる円錐形凹部とし、外筒部５の内部の液体を残さずに吐出できるようにしている。もっとも、液体を残さずに吐出できように、先端チップ１１Ａの先端面と内面６Ａとが対応する形状を有しておればよく、例えば両者を平面としてもよい。また、フロントフランジ６の外面に一体的に設けられたヘッド８は、ルアーロック構造を有する。

第１ベッセル２及び第２ベッセル３の容量、内径は、処理する細胞液の量等を考慮して、適宜決定することができる。例えば、容量は５～１００ｍＬのものを用いることができ、内径は５～５０ｍｍのものを用いることができる。第１シリンジ１ａ及び第２シリンジ１ｂを構成する部材の材質は、特に限定はなく、各部材の機能に応じて、金属、ガラス、セラミックなどの無機材料、合成樹脂などの有機材料を適宜選択して採用することができる。オートクレーブにより滅菌処理する場合は、滅菌処理条件に対応可能な耐熱性の材質を用いる必要がある。また、電磁波或いはガスによる滅菌処理を行う場合もそれぞれの処理条件に対応可能な材質を用いる必要がある。

分散器４は、図１～３に示すように、ベッセル２、３内の細胞液を通過させることで細胞凝集塊を破砕することが可能な狭小流路４１を有し、両ベッセル２、３のそれぞれのヘッド８、８同士を接続できるものである。分散器４は、狭小流路形成部材４０、第１部材１３及び第２部材１４を有する。第１部材１３は、中心に流路１５を設けるとともに、軸方向一端側に内部が中空のハウジング部１６を設け、ハウジング部１６の内周にメスネジ部１７を設け、軸方向他端側にヘッド８との接続部１８を設けたものである。第２部材１４は、中心に流路１９を設けるとともに、軸方向一端側に第１部材１３のメスネジ部１７に螺合するオスネジ部２０を設け、軸方向他端側に前記ヘッド８との接続部２１を設けたものである。そして、第２部材１４のオスネジ部２０には、その先端で開口する凹部２２を形成し、凹部２２内に狭小流路形成部材４０を配置し、第１部材１３のメスネジ部１７に第２部材１４のオスネジ部２０を螺合した状態で、第１部材１３のハウジング部１６の内側底面と第２部材１４の凹部２２の内側底面との間に狭小流路形成部材４０に設けられているパッキン４３を圧縮してシールする。これに加え、（１）オスネジ部２０の先端側外周面２０Ａとハウジング部１６の底面側内周面１６Ｂ、及び／又は、オスネジ部２０の基端側外周面２０Ｂとハウジング部１６の先端側内周面１６Ａがテーパ嵌合することにより、（２）狭小流路形成部材４０の軸方向両端側又は一方端側に流路１５、１９と連通する中心孔を有するパッキンを設けて圧縮することにより、第１部材１３と第２部材１４の間をシールしてもよい。また、狭小流路形成部材４０の軸方向長さを短くする場合は、流路１５、１９と連通する中心孔を有するスペーサーを、狭小流路形成部材４０と隣接する位置に設けてもよい。

狭小流路形成部材４０は、図３に示すように、内側部材４２、パッキン４３、外側部材４４を有する。内側部材４２には、円柱状の構造の円柱部４５の軸方向一方端（基端）に、フランジ４６が設けられるとともに、断面円形の凹部４７が設けられている。凹部４７の側壁には、凹部４７の内側と外側が連通する小孔４８が複数設けられている（図２、３に示す例では、断面円形の小孔が８個設けられている。）。また、軸方向他方端（先端）から小孔４８に近接する部分に亘る範囲の外周面４９にらせん凸状部４９ａが設けられている。また、凹部４７の底面４７ａは円形平面となっている。パッキン４３は、内側部材４２の円柱部４５を挿通可能な中心孔５０が設けられている。外側部材４４は、円筒状の構造を有し、軸方向一方端から他方端に亘る中空部が形成され、中空部を形成する内周面５１には、らせん凹条部５１ａが形成されている。そして、内側部材４２と外側部材４４の間にパッキン４３を配置し、内側部材４２の円柱部４５をパッキン４３の中心孔５０及び外側部材４４の内周面５１で形成される中空部に挿入し、フランジ４６の円柱部４５側の円環面と外側部材４４の円環状の基端面４４ａとを、パッキン４３を介して当接させ、パッキン４３を前述のように圧縮した状態にすることで、内側部材４２の外周面４９と外側部材４４の内周面５１とで囲まれた一重連続円環状の断面を有する狭小流路４１が形成される。この狭小流路４１は、内側部材４２の小孔４８、並びに、内側部材４２の先端面４５ａの外周縁及び外側部材４４の内周面５１とで囲まれる部分において開口し、開口部を形成している。即ち、これらの開口部が、分散器４の第１開口部及び第２開口部に対応する。また、図２に示すようにシリンジ１ａから細胞液を分散器４に流入させ場合は、細胞液は、内側部材４２の底面４７ａに突き当たり、流れ方向を軸方向からこれに直交する方向に向きを変え、小孔４８から狭小流路４１の外側の周壁である外側部材４４の内周面５１側に向かうことになる。即ち、底面４７ａは、細胞液を狭小流路４４の周壁側に向かわせる構造体を構成する。

狭小流路４１の軸方向の長さは、前述のように諸条件を考慮して決定することができ、例えば、３～２０ｍｍとすることができる。狭小流路４１の最小幅は、内側部材４２の円柱部４５の外径とこれと同心円の位置の外側部材５５の内周面５１の内径により算出される。この最小幅は、前述のように諸条件を考慮して決定することができる。図２、３に示す例では、内側部材４２の円柱部４５の最大外径と、外側部材５５の内周面５１の最小内径は一定である。また、らせん凸条部４９ａとらせん凹条部５１ａとは相互に凹凸が対応するように設けられており、軸方向に概ね同じ幅で軸方向断面において連続する屈曲線状の流路を形成している（図３（ｂ）参照）。このような流路は、例えば、らせん凸条部４９ａとらせん凹条部５１ａをピッチが同じ雄ねじ構造と雌ねじ構造とし、雄ねじ構造の呼び径を雌ねじ構造のものより小さくすることで形成可能である。また、図示した構造以外に、らせん凸条部４９ａとらせん凹条部５１ａをピッチが異なる雄ねじ構造と雌ねじ構造とし、雄ねじ構造の外径（ねじ山径）が雌ねじ構造の内径（ねじ山径）よりも小さい構造とし、両者が螺合せず、雌ねじ構造の部分に雄ねじ構造の部分を落とし込んで組み合わせる構造とすることもできる。小孔４８の大きさは特に限定はなく、小孔４８の設置数、狭小流路４１の最小幅、細胞凝集塊の平均粒子径、細胞液の通過性などを考慮して適宜決定することができる。例えば、らせん凸条部４９ａとらせん凹条部５１ａで囲まれる断面積と小孔４８の全部合わせた断面積をほぼ同一にすることで小孔４８での流速変化を最小に抑えることができる。

図３に示す狭小流路形成部材４０では、図に示す実施形態以外に、例えば、以下のような変形例を採用することができる。内側部材４２の小孔４８の形状は断面円形に限らず、断面方形でもよいし、その他の形状でもよい。狭小流路４１を構成する円柱部４５の外周面４９と内周面５１にはそれぞれらせん凸条部４９ａとらせん凹条部５１ａが形成されて、それぞれの周面４９、５１には凹凸が設けられているが、なくてもよい。また、らせん形状に限らず、閉じた環状の凹凸を軸方向に等間隔または任意の間隔で設けたものであってもよい。また、狭小流路４１の幅は軸方向で概ね一定であるが、小孔４８の側から漸次小さくなった後漸次大きくなるように円柱部４５の外径と内周面５１の内径を変化させてもよい。この場合、軸方向で対称構造にするのが好ましい。また、内側部材４２を軸方向で対称になるように配置した構造、即ち、内側部材４２のフランジ４６、凹部４７、小孔４８を軸方向両側に設けた構造となるようにしてもよい。

図３（ｂ）に示す狭小流路形成部材４０を用い、内側部材４２の凹部４７の側から細胞液を送液する場合を説明すると以下のとおりである。内側部材４２の凹部４７の側から送液された細胞液は、内側部材４２の凹部４７の底面４７ａに突き当たり流れ方向を変えて第１開口部となる各小孔４８から、軸方向に直交する断面形状が一重連続円環状の狭小流路４１内に流入する。そして、外側部材４４の内周面５１に突き当たり、さらに流れ方向を変えて軸方向に沿って狭小流路４１内を通り、内側部材４２の先端面４５ａの外周縁及び外側部材４４の内周面５１とで囲まれる開口部（第２開口部）から流出する。このように軸方向に直交する断面形状が円環状で、軸方向に所定の長さを有する狭小流路４１を通過することで、細胞凝集塊は、内周面５１と外周面４９に衝突することで剪断応力が負荷されたり、液体の流動により生じる剪断流による剪断力が負荷されたりすることで、細胞の破壊を抑制しながら、破砕され、所定の大きさになると考えられる。また、第１回開口部となる小孔４８の近傍の外側と内側に細胞液の流れ方向を変更する構造を有することで剪断力がより効果的に作用し、細胞凝集塊の効率的な破砕が促進されると考えられる。小孔４８の大きさより大きい細胞凝集塊は、その程度に応じてより小さい細胞凝集塊に分割されたり、変形したりして小孔４８を通過し得ると考えられる。本例では、狭小流路４１を構成する周面４９、５１には凹凸が設けられていることで、さらに効率よく細胞凝集塊が破砕されると考えられる。

一方、前述の第２開口部の側から細胞液を送液する場合はこれとは反対方向の流れになる。この場合、細胞液は第２開口部に直接流入するもの、内側部材４２の先端面４５ａに突き当たり流れ方向を変え、さらに流れ方向を変えて第２開口部に流入するものがある。第２開口部から狭小流路４１に流入した細胞液は、軸方向に沿って狭小流路４１内を通り、小孔４８の内側近傍で流れ方向を変えて第１開口部である小孔４８から流出する。このように反対方向からでも、第２開口部の外側近傍から流入し狭小流路４１を通過して第１開口部から流出することで、同様に、細胞凝集塊に対して剪断力が効率よく負荷され、細胞凝集塊は、細胞の破壊を抑制しながら効率的に破砕され、所定の大きさになると考えられる。

図２、３に示す構造の狭小流路形成部材４０以外に、例えば、図４～７に示す構造の狭小流路形成部材４０ａ、４０ｂを採用することができる。

図４、５に示す狭小流路形成部材４０ａは、円柱状の形状を有し、その軸方向の一方端の端面９２から他方端の端面９３に亘り軸方向に平行に伸びる複数の狭小な中空部が形成された構造を有する。そして、これらの中空部が狭小流路となり、図中、符号９０ａ～９０ｃ、９１ａ～９１ｃがこれらに対応する。各狭小流路は両端面９２，９３で開口し、当該部分においてそれぞれ開口部を形成している。一方を第１開口部、他方を第２開口部とする。符号９０ａ～９０ｃの狭小流路（外側狭小流路）と符号９１ａ～９１ｃの狭小流路（内側狭小流路）は、それぞれ、軸方向（狭小流路の長さ方向に対応する。）に直交する断面（軸方向直交断面とも称する。）形状が不連続な円環形状、即ち、離散円環状であり、外側狭小流路９０ａ，…と内側狭小流路９１ａ，…とは、円柱構造の中心軸を中心とする同心円状に配置され、二重円環状となっている。図４、５に示す例では、各円環は、３つずつに均等に分割されているが、これに限定されず、２つでも良いし、４つ以上でもよく、これらの分割は均等でもよいし、不均等でもよい。また、軸方向直交断面の放射方向の外側狭小流路９０ａ，…と内側狭小流路９１ａ，…の配置の仕方も特に限定はない。外側狭小流路９０ａ，…の幅は、外側狭小流路９０ａ，…を形成する外側の周面９４，…と内側の周面９５，…の軸方向直行断面の径から算出することができる。また、同様に、内側狭小流路９１ａ，…の幅は、内側狭小流路９１ａ，…を形成する外側の周面９６，…と内側の周面９７，…の軸方向直行断面の径から算出することができる。図４、５に示す例では、各周面の軸方向直行断面の径が軸方向に沿って同じであるため、これらの幅は軸方向に沿って同じであり、軸方向の何れかの直行断面における径から最小幅を算出することができ、各狭小流路において同じである。これらの各狭小流路における最小幅は、細胞凝集塊を最終的に所定の大きさに破砕して分散できれば、それぞれ同じであっても異なってもよいが、同じであるのが好ましい。外側狭小流路９０ａ，…と内側狭小流路９１ａ，…の軸方向の長さは、前述のように諸条件を考慮して決定することができ、例えば、３～２０ｍｍとすることができる。

図４、５に示す狭小流路形成部材４０ａでは、図に示す実施形態以外に、例えば、以下のような変形例を採用することができる。図に示す例では、各周面は平滑面であるが、何れかに凹凸を設けてもよい。また、外側狭小流路９０ａ，…と内側狭小流路９１ａ，…の幅は軸方向のいずれの位置でも同じであるが、端面９２の側から端面９３の側に向かって漸次小さくなった後漸次大きくなるように周面９４，…の軸方向直行断面における径を変化させてもよい。この際の最小幅となる位置は両端面９２，９３から等距離の位置が好ましい。また、外側狭小流路９０ａ，…の軸方向一の端部が第１開口部に連続し且つ軸方向二の端部は閉鎖し、一方、内側狭小流路９１ａ，…の軸方向二の端部が第２開口部に連続し且つ軸方向一の端部が閉鎖し、軸方向中間部或いは内側狭小流路９１ａ，…の軸方向一の端部の近傍部で、外側狭小流路９０ａ，…と内側狭小流路９１ａ，…を連通させた構造でも良い。

図４、５に示す狭小流路形成部材４０ａを用い、軸方向の一方端の端面９２から他方端の端面９３に細胞液を送液する場合を説明すると以下のとおりである。端面９２の側から送液された細胞液は、外側狭小流路９０ａ，…と内側狭小流路９１ａ，…の端面９２の開口部（第１開口部）に直接流入するもの、端面９２に突き当たり流れ方向を変えて第１開口部に流入するものがある。第１開口部から外側狭小流路９０ａ，…と内側狭小流路９１ａ，…に流入した細胞液は、軸方向に沿って外側狭小流路９０ａ，…と内側狭小流路９１ａ，…を通り、それぞれの端面９３の開口部（第１開口部）から流出する。このように軸方向に直交する断面形状が二重離散円環状で、軸方向に所定の長さを有する外側狭小流路９０ａ，…と内側狭小流路９１ａ，…を通過することで、細胞凝集塊は、外側の周面９４，…と内側の周面９５，…、外側の周面９６，…と内側の周面９７，…に衝突することで剪断応力が負荷されたり、液体の流動により生じる剪断流による剪断力が負荷されたりすることで、細胞の破壊を抑制しながら、破砕され、所定の大きさになると考えられる。また、第１回開口部の近傍に細胞液の流れ方向を変更し得る構造を有することで剪断力がより効果的に作用し、細胞凝集塊の効率的な破砕が促進されると考えられる。第１開口部の大きさより大きい細胞凝集塊は、その程度に応じてより小さい細胞凝集塊に分割されたり、変形したりして第１開口部を通過し得ると考えられる。尚、本実施形態は軸方向において同じ形状、構造を有するため、端面９３から端面９２に向かって細胞液を送液する場合も同じである。

図６、７に示す狭小流路形成部材４０ｂは、円柱状の内側部４０ｃと、この外周において支持しつつ内側部４０ｃの外側全体を囲むように設けられる円筒状の外側部４０ｄで構成される。部材４０ｂの軸方向の両端において端面９９，１００を有する。端面９９，１００は外側部４０ｄに形成されている。両端面９９，１００の中心には開口部１０１，１０２が形成されている。尚、２つの開口部１０１，１０２の一方を第１開口部、他方を第２開口部とする。また、部材４０ｂの内部には、内側部４０ｃと外側部４０ｄで囲まれる中空部が形成され、この中空部が狭小流路１０５を形成している。狭小流路１０５は、部材４０ｂの軸方向の一方端側から他方端側に向かって軸方向に平行に伸びる円環状に配置された複数の狭小な中空部９８ａ，９８ｂ，９８ｃ，９８ｄと、これらの中空部９８ａ，…の軸方向両端において連続し、軸方向に直交する方向に延びる円板状の狭小な中空部１０３，１０４とを有する。この狭小流路１０５は、両端面９９，１００の開口部１０１，１０２と連通し、開口している。

中空部９８ａ，９８ｂ，９８ｃ，９８ｄで構成される部分の狭小流路１０５は、軸方向（狭小流路の長さ方向に対応する。）に直交する軸方向直交断面形状が不連続な円環状、即ち、離散円環状であり、中空部９８ａ，…は、円柱状の内側部４０ｃの中心軸を中心とする同一円周上に配置されている。図６、７に示す例では、円環が、４つずつに均等に分割された円弧状の形状を有するが、これに限定されず、分割数は２つでも、３つでも、５つ以上でもよく、これらの分割は均等でもよいし、不均等でもよい。中空部９８ａ，…の幅は、中空部９８ａ，…を形成する外側部４０ｄの内周面１０６，…と内側部４０ｃの外周面１０７，…の軸方向直行断面の径から算出することができる。図６、７に示す例では、各周面の軸方向直行断面の径が軸方向に沿って同じであるため、これらの幅は軸方向に沿って同じであり、軸方向の何れかの直行断面における径から最小幅を算出することができ、各中空部９８ａ，…において同じである。これらの各中空部９８ａ，…における最小幅は、細胞凝集塊を最終的に所定の大きさに破砕して分散できれば、それぞれ同じであっても異なってもよいが、同じであるのが好ましい。軸方向直交断面形状が離散円環状である中空部９８ａ，…で構成される部分の狭小流路１０５の軸方向の長さは、前述のように諸条件を考慮して決定することができ、例えば、３～２０ｍｍとすることができる。

中空部１０３，１０４で構成される部分の狭小流路１０５は、軸方向直交断面形状が円形状を有し、軸方向に平行な方向な断面が方形状を有し、全体として円板形状を有する。中空部１０３，１０４で構成される部分の狭小流路１０５の幅は内側部４０ｃの軸方向の両端面１０８，１０９と、これと対向する外側部４０ｄの軸方向の両内側底面１１０，１１１との間の最短距離から算出することができる。図に示す例では、端面１０８，１０９と底面１１０，１１１とは平行で、それらの間の最短距離は同じであり、中空部１０３，１０４全体で同じ幅である。中空部９８ａ，…と、中空部１０３，１０４の幅は同じでも異なってもよいが、同じであるのが好ましい。中空部１０３，１０４で構成される部分の狭小流路１０５において、軸方向に直交する方向の大きさは、両内側底面１１０，１１１の直径により規定することができ、この大きさは、前述のように諸条件を考慮して決定することができ、例えば、３～２０ｍｍとすることができる。

ここで、中空部１０３，１０４を流れる細胞液は、例えば開口部１０１から流入して開口部１０１の中心から放射方向外側に向かって流れるため、狭小流路の長さ方向は、部材４０ｂの軸方向に直行する方向である。そのため、中空部１０３，１０４の長さ方向に直交する断面形状は方形状である。このように、狭小流路１０５は、その長さ方向に直交する断面形状が、一重離散円環状と方形状とを組み合わせた断面形状となっている。

また、例えば後述する図８に示すようにして、シリンジ１ａから細胞液Ｙを分散器４に流入させた場合は、細胞液Ｙは、外側部４０ｄの開口部１０１から狭小流路１０５に流入し、内側部４０ｃの端面１０８に突き当たり、流れ方向を軸方向からこれに直交する方向に向きを変え、軸方向直行断面形状が離散円環状の狭小流路１０５の外側の周壁側である外側部４０ｄの内周面１０６側に向かうことになる。即ち、内側部４０ｃの軸方向端面１０８は、細胞液Ｙを軸方向に沿って延びる部分の狭小流路１０５の周壁側に向かわせる構造体を構成する。尚、シリンジ１ｂから細胞液Ｙを分散器４に流入させた場合は、内側部４０ｃの軸方向端面１０９が、細胞液Ｙを軸方向に沿って延びる部分の狭小流路１０５の周壁側に向かわせる構造体を構成する。

図６、７に示す狭小流路形成部材４０ｂでは、図に示す実施形態以外に、例えば、以下のような変形例を採用することができる。図に示す例では、各中空部９８ａ，…を形成する壁面は平滑面であるが、何れかに凹凸を設けてもよい。また、図に示す例では、狭小流路１０５の幅は軸方向のいずれの位置でも、軸方向に直交する何れの位置でも同じであるが、（１）離散円環状の中空部９８ａ，…において、端面１０８の側から端面１０９の側に向かって漸次小さくなった後漸次大きくなるように内周面１０６，…、外周面１０７の軸方向直行断面における径を変化させてもよいし、或いは、（２）開口部１０１から開口部１０２の側に向かって漸次小さくなった後漸次大きくなるように各中空部の幅を変化させてもよい。この際の最小幅となる位置は両端面１０８，１０９から等距離の位置が好ましい。また、両端面１０８，１０９は平坦面であるが、例えば、円錐形、円錐台形などとし、これに対応するように、底面１１０，１１１を傾斜面としてもよい。

図６、７に示す狭小流路形成部材４０ｂを用い、軸方向の一方の端面９９の開口部１０１から他方の端面１００の開口部１０２に向かって細胞液を送液する場合を説明すると以下のとおりである。端面９９の側から送液された細胞液は、開口部１０１（第１開口部）に直接流入するもの、端面９９に突き当たり流れ方向を変えて第１開口部に流入するものがある。開口部１０１から中空部１０３で構成される部分の狭小流路１０５に流入した細胞液は、端面１０８に突き当たり流れ方向を変えて内周面１０６側に向かう。次いで、内周面１０６に突き当たり方向を変えて最終的に中空部９８ａ，…で構成される部分の狭小流路１０５に流入し、軸方向に沿って他方の端面１００側に向かう。次いで、底面１１１に突き当たり方向を変えて、中空部１０３，１０４で構成される部分の狭小流路１０５に流入し、底面１０９の周縁部から最終的に底面１０９即ち端面１００の中心に形成されている開口部１０２から流出する。このように軸方向に直交する断面形状が二重離散円環状で、軸方向に所定の長さを有する中空部９８ａ，…で構成される部分、及び、円板形状の中空部１０３，１０４で構成される部分を有する狭小流路１０５を通過することで、細胞凝集塊は、壁面と衝突することで剪断応力が負荷されたり、液体の流動により生じる剪断流による剪断力が負荷されたりすることで、細胞の破壊を抑制しながら、破砕され、所定の大きさになると考えられる。また、開口部１０１の近傍や、狭小流路１０５に細胞液の流れ方向を変更し得る構造を設けることで剪断力がより効果的に作用し、細胞凝集塊の効率的な破砕が促進されると考えられる。開口部１０１の大きさより大きい細胞凝集塊は、その程度に応じてより小さい細胞凝集塊に分割されたり、変形したりして開口部１０１を通過し得ると考えられる。尚、本実施形態は軸方向において同じ形状、構造を有するため、端面１００から端面９９に向かって細胞液を送液する場合も同様に考えることができる。

図３～７に示す狭小流路形成部材４０，…、第１部材１３及び第２部材１４を構成する部材の材質は特に限定はなく、各部材の機能に応じて、金属、セラミックなどの無機材料、合成樹脂などの有機材料を適宜選択して採用することができるが、細胞液と接する部分は、細胞凝集塊やその破砕物等の付着を抑制することが可能なコーティングが施されたものを用いるのが好ましい。尚、滅菌処理条件に応じて各条件に適応可能な材質を用いる必要がある。

次に、図８により、細胞分散システムの概要を説明する。まず、第１ベッセル２に所定数の細胞を含む細胞液を注入する。細胞液は、前述のように例えば特許文献３などに記載の大量細胞培養システムにより培養して得られた、細胞凝集塊を含有する培養液をそのまま用いてもよい。第１ベッセル２に充填される細胞液に含まれる細胞数は、移植手術等に必要な細胞数を含むように適宜決定することができる。また、心筋細胞の細胞凝集塊は、ｃＴｎＴ陽性率が８０％以上のものを用いるのが好ましい。

図８（ａ）に示すように、細胞液Ｙが入った第１ベッセル２のヘッド８と、分散器４の一方の接続部１８に接続するとともに、第２ベッセル３のヘッド８に分散器４の他方の接続部２１を接続し、第１ベッセル２のヘッド８が下向きになるように配置して静置する。このように静置すると、第１ベッセル２のヘッド８側の下部に細胞凝集塊Ｘが沈殿する。その状態で、第１ベッセル２のプランジャ９を押し込むと同時に、第２ベッセル３のプランジャ９を引き抜き方向へ後退させて、両プランジャ９，９を相補的に移動させ、上流側と下流側とで差圧を生じさせて、第１ベッセル２内の細胞液Ｙを第２ベッセル３に移動させる（図８（ｂ））。この時、例えば、図３～７に示す狭小流路形成部材４０，…を用いた場合、第１ベッセル２から押し出された細胞液Ｙは、ヘッド８から第１部材１３の管路１５を通って狭小流路形成部材４０，…に到達する。そして、前述のようにして、細胞液Ｙは第１開口部から流入し、狭小流路４１，…を通過して第２開口部から流出する。細胞凝集塊Ｘは、所定の大きさに破砕、分散されるため、細胞凝集塊Ｘが破砕、分散された分散液Ｚが得られる（図８（ｂ））。細胞液Ｙの供給速度（ｍｌ／ｓｅｃ）は、細胞の種類、狭小流路の構造などに応じて適宜決定可能であり、ｉＰＳ細胞由来の心筋細胞の場合は、例えば、０．１～５ｍｌ／ｓｅｃとすることができる。また、狭小流路内を通過する細胞液Ｙの流速（線速度）は、ｉＰＳ細胞由来の心筋細胞の場合は、例えば、０．０５～１０ｍ／ｓｅｃとすることができ、０．１～１ｍ／ｓｅｃが好ましい。この流速は、例えば、供給速度（ｍｌ／ｓｅｃ）と、第１開口部から軸方向の同じ位置における細胞液の通過する断面積とから算出することができる。断面積が所定の位置で異なる場合は、そのうち供給速度が最大の値を採用するものとする。

細胞液Ｙは、前述のように１回狭小流路を通過させただけでは細胞凝集塊Ｘを所望の所定の大きさに破砕、分散することができない場合は、２回以上、狭小流路を通過させてもよい。この場合、図８（ｂ）に示す状態から、第２ベッセル３のプランジャ９を押し込むと同時に、第１ベッセル２のプランジャ９を引き抜き方向へ後退させ、上流側と下流側とで差圧を生じさせて、第２ベッセル３内の１回破砕分散済みの細胞液Ｙ（分散液Ｚ）を第１ベッセル２に移動させ、再び図８（ａ）に示す状態にする。この時、例えば、図３～７に示す狭小流路形成部材４０，…を用いた場合、分散液Ｚが狭小流路４１，…を通過する際に、再度、分散液Ｚ中の十分に破砕されていない細胞凝集塊に剪断力が負荷され、破砕が促進される。細胞凝集塊Ｘが所望の所定の大きさに破砕、分散されるまで、以上の操作を繰り返し、細胞凝集塊Ｘの平均粒径を徐々に小さくすることができる。但し、繰り返し回数が多すぎると、細胞の破壊或いは破壊されないものの死細胞が増加する傾向にあるため、使用する細胞腫などに応じて繰り返し回数を適宜決定するのが好ましい。例えばｉＰＳ細胞由来の心筋細胞の場合は、繰り返し回数は、５回以内が好ましい。

以上のような一連の工程を経て得られる細胞凝集塊の破砕物は、死細胞の発生が抑制され、かつ、例えば細胞シートの製造にも適用可能な大きさを有したものとなる。また、細胞シートの製造以外にも、立体的な細胞組織の製造などに適用可能である。

前述の一連の工程は、例えば、図９、１０に示す細胞凝集塊分散装置Ａにより自動的に行うことができる。尚、この装置Ａは、特許文献３、４に記載のベッセル間細胞液移送装置を応用したものである。

図９、１０に示す細胞凝集塊分散装置Ａは、２つのベッセルのヘッド８，８同士を接続具４で接続した状態で、外筒部５のフロントフランジ６を軸方向移動不能に保持し、プランジャボタン１２を把持してプランジャ９を軸方向へ駆動し、一定速度で所定量の細胞液を一方のベッセルから他方のベッセルに移動させ、細胞凝集塊を破砕し、分散させることができる自動化装置の一例である。

細胞凝集塊分散装置Ａは、互いに同一鉛直方向に対向する第１機構２７と第２機構２８とを共通のベース部２９を設け、それぞれにベッセルを装着して、外筒部５を固定した状態で、プランジャ９を前進、後退駆動するのである。ここで、「前進」とはベッセルのヘッド８から細胞液を吐出する方向に進むことを意味し、「後退」とは外部から細胞液を吸引する方向に進むことを意味し、前進と逆に進むことを意味している。

細胞凝集塊分散装置Ａは、図９、１０に示すように、第１機構２７には、第１ベッセル２の外筒部５を固定する固定部３０とプランジャ９を進退駆動する可動部３１を備え、可動部３１の背面にはこれを駆動する第１駆動機構部が設けられている。また、第２機構２８にも、第２ベッセル３の外筒部５を固定する固定部３３とプランジャ９を進退駆動する可動部３４を備え、可動部３１の背面にはこれを駆動する第２駆動機構部が設けられている。ここで、第１機構２７の可動部３１と第１駆動機構部は、第２機構２８の可動部３４と第２駆動機構部と同一構造であり、互いに上下反転したものとなっている。第１機構２７の可動部３１と、第２機構２８の可動部３４は、分散器４を流れる流量が一致するように、同調して進退駆動される。また、それぞれのベッセルの断面積が異なる場合も断面積に応じて流量が一致するように、同調して進退駆動される。尚、第１及び第２駆動機構部は、例えば、特許文献３、４に記載と同様に構成することができる。

ベース部２９は、保護カバー類３６で覆われている部分において、水平なベース板３７の上面の中央部に垂直な支持板を立起状態で固定するとともに、この支持板の背面側の両側縁に沿って２つの補強板を立設し、ベース板３７と支持板に固定し、平面視コ字形の剛性の高い構造となっている。そして、この支持板の前面上部に第１駆動機構部、前面下部に第２駆動機構部が配置されるとともに、前面中央部で両駆動機構部の間に第１機構２７の固定部３０と第２機構２８の固定部３３が配置されている。

第１機構２７の固定部３０と第２機構２８の固定部３３は、前記支持板の表面側に間隔を置いて平行に固定した共通の固定ステージ５４に直接又は間接的に取付けて設けている。本実施形態では、固定部３３は、固定ステージ５４の下部に直接取付け、固定部３０は、固定ステージ５４の上部に設けた上下方向に移動可能となした可動ステージ５５上に取付けている。分散器４の寸法や、前記ベッセルのヘッド８に対する分散器４の接続深さの誤差を吸収するため、必要に応じて、固定部３３と固定部３０とを間隔調整具を介して連結してもよい。この間隔調整具は、例えば、特許文献３、４に記載のものを採用することができる。

第１機構２７の可動部３１は、ステージ３８上に設けられ、ステージ３８に対してプランジャ９のプランジャボタン１２を保持するプランジャ保持部５７を、上下方向に位置を微調整して固定できるようになっている。具体的には、ステージ３８の表面に調整板５８を接合状態で上下方向に移動案内可能になるように構成し、調整板５８の中心に開口した上下方向に延びた長孔を通して締付ネジ６２をステージ４４に螺合した構造である。締付ネジ６２に設けたハンドル６３を持って手動で簡単に締め付け、緩めることができるようになっている。ここで、前記プランジャ保持部５７は、図１０に示すように、プランジャボタン１２を前面側から係合する係合凹部６４で構成している。

また、同様に、第２機構２８の可動部３４は、ステージ５１上に設けられ、ステージ５１に対してプランジャ９のプランジャボタン１２を保持するプランジャ保持部６５を、上下方向に位置を微調整して固定できるようになっている。具体的には、ステージ５１の表面に調整板６６を接合状態で上下方向に移動案内可能になるように構成し、調整板６６の中心に開口した上下方向に延びた長孔６９を通して締付ネジ７０をステージ５１に螺合した構造である。締付ネジ７０に設けたハンドル７１を持って手動で簡単に締め付け、緩めることができるようになっている。ここで、前記プランジャ保持部６５は、図１０に示すように、前記プランジャボタン１２を前面側から係合する係合凹部７２で構成している。

第１機構２７の固定部３０には、第１ベッセル２の外筒部５を保持する外筒部保持部７３を設けている。具体的には、外筒部保持部７３は、図１０に示すように、外筒部５を受け入れるＵ字状凹部７４と、フロントフランジ６を嵌合するフランジ嵌合溝７５と、フロントフランジ６を外側から押さえて保持する保持部材７６とからなる。保持部材７６は、一端を水平回動可能に保持するとともに、他端を弾性的にフック７７で係脱できるように構成している。ここで、外筒部保持部７３は、バックフランジ７も同時に保持できるように、上下２カ所に設けることも好ましい。

また、同様に、第２機構２８の固定部３３には、第２ベッセル３の外筒部５を保持する外筒部保持部７８を設けている。具体的には、外筒部保持部７８は、図１０に示すように、外筒部５を受け入れるＵ字状凹部７９と、フロントフランジ６を嵌合するフランジ嵌合溝８０と、フロントフランジ６を外側から押さえて保持する保持部材８１とからなる。保持部材８１は、一端を水平回動可能に保持するとともに、他端を弾性的にフック８２で係脱できるように構成している。ここで、外筒部保持部７８は、バックフランジ７も同時に保持できるように、上下２カ所に設けることも好ましい。

また、図示しないが、安全のためとホームポジションを決定するために、各可動部の可動範囲を制限するリミット機構が設けられている。このリミット機構は、例えば、特許文献３、４に記載のものを採用することができる。尚、下側の第２ベッセル３を単純な容器とし、第１ベッセル２から分散器４の狭小流路を通過させて細胞凝集塊が所定の大きさに破砕され、分散された細胞液を直接所望の容器に採取することも可能である。つまり、細胞凝集塊分散装置Ａの第１機構２７のみを備えた装置でも、細胞凝集塊の破砕、分散作業は可能である。

以上のように構成した細胞凝集塊分散装置Ａに、第１ベッセル２と第２ベッセル３を装着するには、図１０に示すように、先ず第１ベッセル２と第２ベッセル３のヘッド８，８同士を分散器４で連結しておき、保持部材７６，８１は解放するとともに、締付ネジ６２，７０を緩めておいた状態で、第１ベッセル２のフロントフランジ６をフランジ嵌合溝７５に嵌合するとともに、プランジャボタン１２を係合凹部６４に係合し、第２ベッセル３のフロントフランジ６をフランジ嵌合溝８０に嵌合するとともに、プランジャボタン１２を係合凹部７２に係合し、それから保持部材７６，８１を閉じてそれぞれフロントフランジ６を保持する。それから、締付ネジ６２，７０を締め付けてセットする。

細胞凝集塊分散装置Ａを用いて細胞凝集塊を破砕、分散する場合、前述のようにして、図８（ａ）に示す状態で連結した第１シリンジ１ａ、分散器４及び第２シリンジ１ｂを細胞凝集塊分散装置Ａにセットし、静置する。暫くこの状態を維持して、第１ベッセル２の内部で細胞凝集塊を沈殿させる。それから、第１機構２７の可動部３１を前進させて第１ベッセル２のプランジャ９を押し込むと同時に、可動部３４を後退させて第２ベッセル３のプランジャ９を引き抜き方向へ移動させて、両プランジャ９，９を相補的に移動させ、細胞液に含まれる細胞凝集塊を破砕、分散し、第２ベッセル３に細胞凝集塊の破砕物が分散した分散液を収容する。破砕物が所定の大きさになっている場合は、破砕、分散を終了する。所定の大きさになっていない場合は破砕物に対して再度破砕、分散処理を行う。

第２ベッセル３に収容した分散液（細胞液）に対して再度破砕、分散処理を行う場合は、引き続き、第１機構２７の可動部３１を後退させて第１ベッセル２のプランジャ９を引き抜き方向へ移動させると同時に、可動部３４を前進させて第２ベッセル３のプランジャ９を押し込む方向へ移動させ、分散液（細胞液）に含まれる細胞凝集塊を所定の大きさに破砕、分散し、第１ベッセル２に所定の大きさの破砕物が分散した分散液を収容する。必要に応じて、以上の破砕、分散処理を繰り返すことで、当初の細胞凝集塊を所定の大きさに破砕、分散させることができる。

以下、実施例に基づき本発明の実施形態を詳細に説明する。

（実施例１）
先ず、容量１０ｍｌの第１ベッセル２に、生細胞数換算で１×１０^７個のｉＰＳ細胞（２５３Ｇ１株）の細胞凝集塊と１０ｍｌの培地（ＳｔｅｍＦｉｔ ＡＫ０２Ｎ、１０ｍＭ Ｙ－２７６３２添加）を含む細胞液を入れた。図３に示すような狭小流路形成部材４０を有する分散器４を用い、図１に示すように第１シリンジ１ａ、分散器４、容量１０ｍｌの第２ベッセルを有する第２シリンジ１ｂを接続し、前述の細胞凝集塊分散装置Ａに取り付け、静置した。ついで、狭小流路４１を通過する流速が０．１６ｍ／ｓｅｃとなるように細胞凝集塊分散装置Ａの可動部３１，３４を前述のように移動させて両プランジャ９，９を相補的に移動させることで、細胞液を狭小流路４１を通じて移動させて、細胞凝集塊を破砕し、分散させた細胞液（分散液）を第２ベッセル３に収容した。得られた分散液及び処理前の細胞液について、株式会社ＳＣＲＥＥＮホールディングス製、Ｃｅｌｌ３ｉＭａｇｅｒを用いて、撮像を取得し、粒度分布を測定した。尚、粒度分布の測定には、４０μｍストレーナーを通過したものについて測定した。破砕、分散処理前の分散液の結果を図１２（ａ）に、同処理後の分散液の結果を図１２（ｂ）に示す。また、トリパンブルー染色法による測定より、生細胞を確認できた。

尚、本実施例で用いた狭小流路形成部材４０の形状、構造、寸法は以下のとおりである。円柱部４５は、小孔４８より先端側にＭ３．５、ピッチ０．３５ｍｍの雄ねじ構造の凹凸を有し、小孔４８は、φ０．７ｍｍの断面円形で、その中心の位置が、フランジ４６の上面から１．３５ｍｍとなるように、かつ、周方向に等間隔で８個形成されており、小孔４８の中心から先端４５ａまでの距離が３．５ｍｍである。外側部材４４は内周面５１の軸方向全体が、Ｍ４、ピッチ０．５ｍｍの雌ねじ構造の凹凸を有し、軸方向長さが３．５ｍｍである。雄ねじ構造の部分と雌ねじ構造の部分とは、螺合ではなく落とし込みによる組み合わせが可能であった。パッキン４３の厚みは１ｍｍである。以上より、狭小流路の幅は、０．２～０．５ｍｍ（最小幅は０．２ｍｍ）であり、軸方向長さ（小孔４８のフランジ４６に近い位置から円柱部４５の先端４５ａまでの距離）は、２．５ｍｍである。
図１２（ａ）に示すように、分散処理前の細胞凝集塊の粒度分布において１００μｍ以上における最頻値となる粒子径は４２０μｍであり、狭小流路の最小幅０．２ｍｍは、その粒子径の０．４８倍である。

（参考例１）
図３に示すような狭小流路形成部材４０に変えて、図１１に示す流路形成部材２００を用い、０．５ｍｌ／ｓｅｃの流量で細胞液を送液した以外は、実施例１と同様にして細胞凝集塊を破砕した。実施例１と同様にして、処理前後の画像を取得して、粒度分布を測定した。結果を図１３に示す。処理前の細胞液の結果を図１３（ａ）に、同処理後の処理液の結果を図１３（ｂ）に示す。

尚、図１１に示す流路形成部材２００は、中心に径１ｍｍの貫通孔２０３を有する厚み１ｍｍの円板（Ａ）２０１、中心に径４ｍｍの貫通孔２０４を有する厚み１ｍｍの円板（Ｂ）２０２を、Ａ、Ｂ、Ａ、Ｂ、Ａ、Ａの順に積層し、流路内に連続する大きな段を設けた構造を有する。径１ｍｍの貫通孔を通過する際の流速は０．１６ｍ／ｓｅｃである。
図１３（ａ）に示すように、分散処理前の細胞凝集塊の粒度分布において１００μｍ以上における最頻値となる粒子径は４２０μｍであり、流路の最小幅１ｍｍは、その粒子径の２．４倍である。

狭小流路を通過させることで、図１２に示すように、分散処理前後で細胞凝集塊の影が薄くなっており、細胞凝集塊は、分散処理前後で４０μｍ以下の数が飛躍的に増加し、細胞シートの製造にも適用可能な大きさに破砕され、分散されていることが分かる。一方、参考例１は、図１１に示すように、流路内に大きな段を複数設けて、細胞凝集塊に対する剪断力による負荷の拡大を試みたが、図１３に示すように、処理前後で細胞凝集塊の画像に大きな変化は見られず、ある程度４０μｍ以下の数は増加しているものの、実施例１と比較して、十分な破砕効果が得られないことがわかる。これは、流路幅が小さくても１ｍｍと細胞凝集塊よりも比較的大きく狭小ではなかったことによると考えられる。

Ａ 細胞凝集塊分散装置、Ｘ 細胞凝集塊、Ｙ 細胞液、Ｚ 分散液、 １ａ 第１シリンジ、１ｂ 第２シリンジ、２ 第１ベッセル、３ 第２ベッセル、４ 分散器、５ 外筒部、６ フロントフランジ、７ バックフランジ、８ ヘッド、９ プランジャ、１０ 軸部、１１ ガスケット、１１Ａ 先端チップ、１１Ｂ Ｏリング、１２ プランジャボタン、１３ 第１部材、１４ 第２部材、１５ 流路、１６ ハウジング部、１６Ａ 先端側内周面、１６Ｂ 底面側内周面、１７ メスネジ部、１８ 接続部、１９ 流路、２０ オスネジ部、２１ 接続部、２２ 凹部、２７ 第１機構、２８ 第２機構、２９ ベース部、３０ 固定部、３１ 可動部、３３ 固定部、３４ 可動部、３６ 保護カバー類、３７ ベース板、３８ ステージ、４０ 狭小流路形成部材、４０ａ 狭小流路形成部材、４０ｂ 狭小流路形成部材、４０ｃ 内側部、４０ｄ 外側部、４１ 狭小流路、４２ 内側部材、４３ パッキン、４４ 外側部材、４４ａ 基端面、４４ｂ 先端面、４５ 円柱部、４５ａ 先端面、４６ フランジ、４７ 凹部、４７ａ 底面、４８ 小孔、４９ 外周面、４９ａ らせん凸条、５０ 中心孔、５１ 内周面、５１ａ らせん凹条、５４ 固定ステージ、５５ 可動ステージ、５７ プランジャ保持部、５８ 調整板、６２ 締付ネジ、６３ ハンドル、６４ 係合凹部、６５ プランジャ保持部、６６ 調整板、７０ 締付ネジ、７１ ハンドル、７２ 係合凹部、７３ 外筒部保持部、７４ Ｕ字状凹部、７５ フランジ嵌合溝、７６ 保持部材、７７ フック、７８ 外筒部保持部、７９ Ｕ字状凹部、８０ フランジ嵌合溝、８１ 保持部材、８２ フック、８３ 接地パッド、９０ａ 外側狭小流路、９０ｂ 外側狭小流路、９０ｃ 外側狭小流路、９１ａ 内側狭小流路、９１ｂ 内側狭小流路、９１ｃ 内側狭小流路、９２ 端面、９３ 端面、９４ 外側の周面、９５ 内側の周面、９６ 外側の周面、９７ 内側の周面、９８ａ 中空部、９８ｂ中空部、９８ｃ中空部、９８ｄ中空部、９９ 端面、１００ 端面、１０１ 開口部、１０２ 開口部、１０３ 中空部、１０４ 中空部、１０５ 狭小流路、１０６ 内周面、１０７ 外周面、１０８ 端面、１０９ 端面、１１０ 内側底面、１１１ 内側底面、２００ 流路形成部材、２０１ 円板（Ａ）、２０２ 円板（Ｂ）、２０３ 貫通孔、２０４ 貫通孔。

Claims (6)

1. 多能性幹細胞、体性幹細胞、前駆細胞又は体細胞の細胞凝集塊を破砕して分散させる細胞分散システムであって、
   前記細胞分散システムは、第１開口部、第２開口部、及び、第１開口部と第２開口部の間に設けられた所定長さの狭小流路を有する分散器を有し、
   前記狭小流路の長さ方向に直交する断面形状が、一重連続円環状、一重離散円環状、多重離散円環状から選択される少なくとも一種であり、
   前記狭小流路の前記断面形状における流路断面の最小幅は、前記細胞凝集塊の粒度分布において１００μｍ以上の最頻値となる粒子径の０．２０倍以上、当該粒子径より小さい範囲とし、
   前記第１又は第２開口部から前記第２又は第１開口部に向かって細胞凝集塊を含む液体を、前記狭小流路を通じて移動させ、物理的な作用のみで細胞凝集塊の少なくとも一部を細胞シートの作製にも利用可能な大きさに破砕して分散させることが可能である、細胞分散システム。
2. 前記分散器は、前記第１及び第２開口部において、それぞれシリンジ構造の第１ベッセル及び第２ベッセルと接続され、前記第１ベッセルと前記第２ベッセルは前記狭小流路を介して連通しており、
   前記第１ベッセル及び第２ベッセルは、それぞれ第１プランジャ及び第２プランジャのガスケットで確定される前記液体を充填可能な空間を有し、
   前記第１及び第２プランジャを相補的に移動させることで第１又は第２ベッセルの前記空間に充填されている前記液体を前記狭小流路を通じて第２又は第１ベッセルの前記空間に移動させる、請求項１記載の細胞分散システム。
3. 前記狭小流路を通過させる液体の流速が、０．０５～１０ｍ／ｓｅｃであり、供給速度が０．１～５ｍｌ／ｓｅｃである、請求項１又は２記載の細胞分散システム。
4. 前記狭小流路の長さ方向の最小幅が、一定、又は、前記第１又は第２開口部側から前記第２又は第１開口部側に向かって漸次小さくなった後漸次大きくなる、請求項１～３の何れか一項に記載の細胞分散システム。
5. 前記狭小流路を構成する壁面の少なくとも一部に凹凸が設けられている請求項１～４の何れか一項に記載の細胞分散システム。
6. 前記液体に２回以上繰り返し前記狭小流路を通過させ、前記細胞凝集塊の平均粒径を徐々に小さくする、請求項１～５の何れか一項に記載の細胞分散システム。