JP7824934B2 - 操作されたナチュラルキラー細胞の増殖および細胞毒性の増強およびその使用 - Google Patents

Description

関連事例
本出願は、２０２０年９月２日に出願された米国仮特許出願第６３／０７３、６７１号に対する優先権を主張し、その内容全体が参照により本明細書に組み込まれる。

分野
本明細書に開示される方法および組成物のいくつかの実施形態は、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞および／またはＴ細胞などの操作された免疫細胞の増強された増殖および／または増強された細胞毒性に関する。

背景
細胞免疫療法のための操作された細胞の使用は、免疫系の様々な態様を活用して、疾患の細胞または損傷した細胞を標的にして破壊することにより、癌または他の疾患の処置を可能にする。かかる処置は、処置に関連する用量に十分な数の遺伝子操作された細胞を必要とする。

ＡＳＣＩＩテキストファイル内の材料の参照による組み込み
本出願は、本出願と同時に提出される以下のＡＳＣＩＩテキストファイルに含有される配列表を参照により組み込む：ファイル名：ＮＫＴ０６４ＷＯ＿ＳＴ２５．２０２１年８月３１日作成、サイズ１２６１８６バイト。

概要
いくつかの実施形態において、細胞免疫療法における使用のための免疫細胞の増殖を増強するための様々な方法が提供される。例えば、いくつかの実施形態において、刺激性サイトカインを補足した培地中で免疫細胞をフィーダー細胞株と反復共培養する方法が、提供される。いくつかの実施形態において、新鮮な（例えば、未使用の）培地およびフィーダー細胞が、共培養の各反復の開始時に導入される。いくつかの実施形態において、各共培養は、フィーダー細胞に増殖される細胞の特定の比率で開始する。いくつかの実施形態において、反復共培養は、著しく増強したＮＫ細胞の増殖をもたらす（例えば、いくつかの実施形態によれば、１００万倍を超える）。いくつかの実施形態において、免疫細胞はＮＫ細胞である。いくつかの実施形態において、増殖したＮＫ細胞は、（例えば、癌免疫療法における使用のための）キメラ受容体を発現するように細胞を操作するなどの細胞操作に予想外に適している。いくつかの実施形態において、フィーダー細胞と反復共培養されるＮＫ細胞（または他の免疫細胞）は、マルチパルス共培養を受けていないＮＫ細胞よりも確実にかかるキメラ受容体を発現する。さらに、いくつかの実施形態において、操作されたＮＫ細胞は、予想外に増強された細胞毒性を示す。

いくつかの実施形態において、免疫療法において使用するためのナチュラルキラー細胞の増殖を増強する方法が提供され、この方法は、培地中で、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞の集団をフィーダーの第１の集団と第１の期間共培養すること、ここで第１のフィーダー細胞の集団は４－１ＢＢＬおよび膜結合型インターロイキン－１５（ｍｂＩＬ１５）を発現するように操作された細胞を含み、ここでＮＫ細胞の集団はフィーダー細胞の集団よりも小さく、ここで培地はインターロイキン２（ＩＬ２）、インターロイキン１２（ＩＬ１２）およびインターロイキン１８（ＩＬ１８）を含み、ここで第１の期間共培養することは、増殖したＮＫ細胞の集団をもたらし、これに続く第１の期間の後、増殖したＮＫ細胞の集団の少なくとも一部をフィーダー細胞から分離すること、および新鮮な培地において、増殖したＮＫ細胞の集団の少なくとも一部をフィーダー細胞の第２の集団と第２の期間共培養することを含み、ここでＮＫ細胞の集団はフィーダー細胞の集団よりも小さく、ここで培地はインターロイキン２（ＩＬ２）、インターロイキン１２（ＩＬ１２）、およびインターロイキン１８（ＩＬ１８）を含み、およびここで第２の期間共培養することはさらに増殖したＮＫ細胞の集団をもたらす。いくつかの実施形態において、方法は、所望により、ＩＬ２、ＩＬ１２、およびＩＬ１８を含む新鮮な培地を使用して、分離および共培養工程を少なくとも１回追加で繰り返し、それにより、さらに増殖したＮＫ細胞の集団のさらなる増殖をもたらすことをさらに含む。

いくつかの実施形態において、増殖したＮＫ細胞の追加のフィーダー細胞の集団および新鮮な培地との反復共培養は、反復共培養の非存在下でＮＫ細胞をフィーダー細胞で増殖させる場合と比較して、増強したＮＫ細胞の増殖をもたらす。

いくつかの実施形態において、ＩＬ２は、約１０単位／ｍＬから約１００単位／ｍＬの濃度で培地中に存在する。いくつかの実施形態において、ＩＬ２は、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、または１００単位／ｍＬの濃度または前述の濃度の任意の２つによって定義される範囲内の任意の濃度で培地中に存在する。いくつかの実施形態において、ＩＬ１２は、約１０ｎｇ／ｍＬから約１００ｎｇ／ｍＬの間の濃度で培地中に存在する。いくつかの実施形態において、ＩＬ１２は、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、または１００ｎｇ／ｍＬの濃度または前述の濃度の任意の２つによって定義される範囲内の任意の濃度で培地中に存在する。いくつかの実施形態において、ＩＬ１８は、約０．０１ｎｇ／ｍＬから約３０ｎｇ／ｍＬの間の濃度で培地中に存在する。いくつかの実施形態において、ＩＬ１８は、０．０１、０．０２、０．０３、０．０４、０．０５、０．０６、０．０７、０．０８、０．０９、０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、または３０ｎｇ／ｍＬの濃度または前述の濃度の任意の２つによって定義される範囲内の任意の濃度で培地中に存在する。いくつかの実施形態において、第１および第２の期間は約７日である。いくつかの実施形態において、共培養は少なくとも３回繰り返される。いくつかの実施形態において、ＩＬ２は、約１０単位／ｍＬから約１００単位／ｍＬの間の濃度で培地中に存在し、ＩＬ１２は、約１０ｎｇ／ｍＬから約１００ｎｇ／ｍＬの間の濃度で培地中に存在し、ＩＬ１８は、約０．０１ｎｇ／ｍＬから約３０ｎｇ／ｍＬの間の濃度で培地中に存在する。いくつかの実施形態において、ＩＬ２は、約１０単位／ｍＬから約１００単位／ｍＬの間の濃度で培地中に存在し、ＩＬ１２は、約１０ｎｇ／ｍＬから約１００ｎｇ／ｍＬの間の濃度で培地中に存在し、ＩＬ１８は、約０．０１ｎｇ／ｍＬから約３０ｎｇ／ｍＬの間の濃度で培地中に存在し、ここで第１および第２の期間は約７日間であり、およびここで共培養は少なくとも３回繰り返される。単位／ｍＬで表したＩＬ２のこれらの濃度は、ＩＬ２のＷＨＯ国際基準（National Institute for Biological Standards and Control [NIBSC] 86/500）に従って決定してもよい。

いくつかの実施形態において、ＩＬ２は、約０．５７５ｎｇ／ｍＬから約５．７５ｎｇ／ｍＬの間の濃度で培地中に存在する。いくつかの実施形態において、ＩＬ２は、約０．５ｎｇ／ｍＬから約６ｎｇ／ｍＬの間の濃度で培地中に存在する。いくつかの実施形態において、ＩＬ２は、０．５、０．５７５、０．６、０．７、０．８、０．９、１、１．５、２、２．５、３、３．５、４、４．５、５、５．５、５．７５、または６ｎｇ／ｍＬの濃度または前述の濃度のいずれか２つによって定義される範囲内の任意の濃度で存在する。いくつかの実施形態において、ＩＬ１２は、約１０ｎｇ／ｍＬから約１００ｎｇ／ｍＬの間の濃度で培地中に存在する。いくつかの実施形態において、ＩＬ１２は、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、または１００ｎｇ／ｍＬの濃度、または前述の濃度の任意の２つによって定義される範囲内の任意の濃度で存在する。いくつかの実施形態において、ＩＬ１８は、約０．０１ｎｇ／ｍＬから約３０ｎｇ／ｍＬの間の濃度で培地中に存在する。いくつかの実施形態において、ＩＬ１８は、０．０１、０．０２、０．０３、０．０４、０．０５、０．０６、０．０７、０．０８、０．０９、０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、または３０ｎｇ／ｍＬの濃度、または前述の濃度の任意の２つによって定義される範囲内の任意の濃度で培地中に存在する。いくつかの実施形態において、第１および第２の期間は約７日である。いくつかの実施形態において、共培養は少なくとも３回繰り返される。いくつかの実施形態において、ＩＬ２は、約０．５７５ｎｇ／ｍＬから約５．７５ｎｇ／ｍＬの間（または約０．５ｎｇ／ｍＬから約６ｎｇ／ｍＬの間）の濃度で培地中に存在し、ＩＬ１２は、約１０ｎｇ／ｍＬから約１００ｎｇ／ｍＬの間の濃度であり、そしてＩＬ１８は約０．０１ｎｇ／ｍＬから約３０ｎｇ／ｍＬの間の濃度で培地中に存在する。いくつかの実施形態において、ＩＬ２は、約０．５７５ｎｇ／ｍＬから約５．７５ｎｇ／ｍＬの間（または約０．５ｎｇ／ｍＬから約６ｎｇ／ｍＬの間）の濃度で培地中に存在し、ＩＬ１２は約１０ｎｇ／ｍＬから約１００ｎｇ／ｍＬの間の濃度であり、そしてＩＬ１８は約０．０１ｎｇ／ｍＬから約３０ｎｇ／ｍＬの間の濃度で培地中に存在し、ここで第１および第２の期間は約７日間であり、そしてここで共培養は３回以上繰り返される。

いくつかの実施形態において、ＮＫ細胞の集団は、各共培養の開始時のフィーダー細胞の集団よりも約５倍から約２５倍少ない量で存在する。いくつかの実施形態において、増殖したＮＫ細胞は、蛍光活性化セルソーティング（ＦＡＣＳ）によってフィーダー細胞から分離される。

いくつかの実施形態において、フィーダー細胞の集団は、４－１ＢＢＬおよびｍｂＩＬ１５の両方を発現するＫ５６２細胞を含む。いくつかの実施形態において、反復共培養は、ＮＫ細胞活性化のマーカーの発現を増加させる。さらに、いくつかの実施形態において、反復共培養は、増殖したＮＫ細胞の細胞毒性および／または持続性を増加させる。

いくつかの実施形態において、方法は、ＮＫ細胞をキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）をコードするベクターと接触させることをさらに含む。いくつかの実施形態において、ＣＡＲは、ＣＤ１９、ＣＤ１２３、ＣＤ７０、ＢＣＭＡ、またはナチュラルキラー受容体群Ｄ（ＮＫＧ２Ｄ）のリガンドのうちの１つまたは複数を標的とするように構成される。

いくつかの実施形態において、ＩＬ２は、約１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、または１００単位／ｍＬ未満の濃度、または前述の濃度のいずれか２つによって定義される範囲内の任意の濃度で培地中に存在する。いくつかの実施形態において、ＩＬ２は、約５０単位／ｍＬ未満の濃度で培地中に存在する。いくつかの実施形態において、ＩＬ１２は、約１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、または１００ｎｇ／ｍＬ未満の濃度、または前述の濃度のいずれか２つによって定義される範囲内の任意の濃度で培地中に存在する。いくつかの実施形態において、ＩＬ１２は、約３０ｎｇ／ｍＬ未満の濃度で培地中に存在する。いくつかの実施形態において、ＩＬ１８は、約１、５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、もしくは５０ｎｇ／ｍＬ未満の濃度、または前述の濃度のいずれか２つによって定義される範囲内の任意の濃度で培地中に存在する。いくつかの実施形態において、ＩＬ１８は、約１０ｎｇ／ｍＬ未満の濃度で培地中に存在する。いくつかの実施形態において、ＩＬ２は約５０単位／ｍＬ未満の濃度で培地中に存在し、ＩＬ１２は約３０ｎｇ／ｍＬ未満の濃度で培地中に存在し、そしてＩＬ１８は培地中に約１０ｎｇ／ｍＬ未満の濃度で存在する。

いくつかの実施形態において、ＩＬ２は、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０ｍＬ未満の濃度、または前述の濃度のいずれか２つによって定義された範囲内の任意の濃度で培地中に存在する。いくつかの実施形態において、ＩＬ２は、約６ｎｇ／ｍＬ未満の濃度で培地中に存在する。いくつかの実施形態において、ＩＬ１２は、約１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、または１００ｎｇ／ｍＬ未満の濃度で培地中に存在する。いくつかの実施形態において、ＩＬ１２は、約３０ｎｇ／ｍＬ未満の濃度で培地中に存在する。いくつかの実施形態において、ＩＬ１８は、約１、５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、または５０ｎｇ／ｍＬ未満の濃度で培地中に存在する。いくつかの実施形態において、ＩＬ１８は、約１０ｎｇ／ｍＬ未満の濃度で培地中に存在する。いくつかの実施形態において、ＩＬ２は培地中に約６ｎｇ／ｍＬ未満の濃度で存在し、ＩＬ１２は培地中に約３０ｎｇ／ｍＬ未満の濃度で存在し、そしてＩＬ１８は培地中に約１０ｎｇ／ｍＬ未満の濃度で存在する。

いくつかの実施形態において、ＩＬ２は、培地中に約２０単位／ｍＬから約５０単位／ｍＬの濃度で存在する。いくつかの実施形態において、ＩＬ２は、約２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、または５０単位／ｍＬの濃度、または前述の濃度の任意の２つによって定義される範囲内の任意の濃度の濃度で培地中に存在する。いくつかの実施形態において、ＩＬ１２は、約１５ｎｇ／ｍＬから約３０ｎｇ／ｍＬの間の濃度で培地中に存在する。いくつかの実施形態において、ＩＬ１２は、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、または３０ｎｇ／ｍＬの濃度、または前述の濃度の任意の２つによって定義される範囲内の任意の濃度で培地中に存在する。いくつかの実施形態において、ＩＬ１８は、約５ｎｇ／ｍＬ未満の濃度で培地中に存在する。いくつかの実施形態において、ＩＬ１８は、０．０１、０．０２、０．０３、０．０４、０．０５、０．０６、０．０７、０．０８、０．０９、０．１、１、２、３、４、または５ｎｇ／ｍＬ未満の濃度、または前述の濃度の任意の２つによって定義される範囲内の任意の濃度培地中に存在する。いくつかの実施形態において、ＩＬ２は、約２０単位／ｍＬから約５０単位／ｍＬの間の濃度で培地中に存在し、ここでＩＬ１２は約１５ｎｇ／ｍＬから約３０ｎｇ／ｍＬの間の濃度で培地中に存在し、そしてＩＬ１８は約５ｎｇ／ｍＬ未満の濃度で培地中に存在する。

いくつかの実施形態において、ＩＬ２は、約１．１５ｎｇ／ｍＬから約２．８７５単位／ｍＬの間の濃度で培地中に存在する。いくつかの実施形態において、ＩＬ２は、約１ｎｇ／ｍＬから約３単位／ｍＬの間の濃度で培地中に存在する。いくつかの実施形態において、ＩＬ２は、約１、１．１５、１．５、２、２．５、２．８７５、または３ｎｇ／ｍＬの濃度、または前述の濃度の任意の２つによって定義される範囲内の任意の濃度で培地中に存在する。いくつかの実施形態において、ＩＬ１２は、約１５ｎｇ／ｍＬから約３０ｎｇ／ｍＬの間の濃度、または前述の濃度の任意の２つによって定義される範囲内の任意の濃度で培地中に存在する。いくつかの実施形態において、ＩＬ１２は、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、または３０ｎｇ／ｍＬの濃度で培地中に存在する。いくつかの実施形態において、ＩＬ１８は、約５ｎｇ／ｍＬ未満の濃度で培地中に存在する。いくつかの実施形態において、ＩＬ１８は、０．０１、０．０２、０．０３、０．０４、０．０５、０．０６、０．０７、０．０８、０．０９、０．１、１、２、３、４、または５ｎｇ／ｍＬ未満の濃度、または前述の濃度の任意の２つによって定義される範囲内の任意の濃度で培地中に存在する。いくつかの実施形態において、ＩＬ２は、約１．１５ｎｇ／ｍＬから約２．８７５ｎｇ／ｍＬの間の濃度で培地中に存在し、ここでＩＬ１２は約１５ｎｇ／ｍＬから約３０ｎｇ／ｍＬの間の濃度で培地中に存在し、そしてＩＬ１８は約５ｎｇ／ｍＬ未満の濃度で培地中に存在する。いくつかの実施形態において、ＩＬ２は、約１ｎｇ／ｍＬから約３ｎｇ／ｍＬの間の濃度で培地中に存在し、ここでＩＬ１２は約１５ｎｇ／ｍＬから約３０ｎｇ／ｍＬの間の濃度で培地中に存在し、そしてＩＬ１８は約５ｎｇ／ｍＬ未満の濃度で培地中に存在する。

癌の処置のための薬剤の調製のための本明細書に開示される方法によって増殖されるＮＫ細胞の使用も、本明細書において提供される。癌の処置のための本明細書に開示される方法によって増殖されるＮＫ細胞の使用も、本明細書において提供される。

本明細書において、いくつかの実施形態において、標的癌細胞上のマーカーに結合し、結合するとＮＫ細胞を誘導して標的癌細胞に対する細胞傷害効果を発揮するように構成された操作されたキメラ受容体を含む、操作されたナチュラルキラー細胞の集団が提供され、ここでＮＫ細胞はインターロイキン２（ＩＬ２）、インターロイキン１２（ＩＬ１２）、およびインターロイキン１８（ＩＬ１８）を含む培地中で、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞の開始集団をフィーダー細胞の第１の集団と初めて共培養することによって増殖され、ここで第１のフィーダー細胞の集団は４－１ＢＢＬおよび膜結合型インターロイキン－１５（ｍｂＩＬ１５）を発現するように操作された細胞を含み、ここでＮＫ細胞の開始集団はフィーダー細胞の集団よりも小さく、ここで１回目の共培養はＮＫ細胞の中間増殖集団をもたらし、１回目の共培養の後、ＮＫ細胞の中間増殖集団の少なくとも一部をフィーダー細胞から分離すること、新鮮な培地において少なくとも２回目として、中間増殖したＮＫ細胞の集団の少なくとも一部をフィーダー細胞の第２の集団と共培養することを含み、ここで該フィーダー細胞の第２の集団と共培養されるＮＫ細胞の集団の一部はフィーダー細胞の第２の集団よりも小さく、およびここで少なくとも２回目の共培養はさらに増殖したＮＫ細胞の集団をもたらす。

いくつかの実施形態において、操作されたキメラ受容体は、配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１と配列が少なくとも９５％同一である配列によってコードされる。いくつかの実施形態において、操作されたキメラ受容体は、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、または２８と配列が少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列を有する。

癌の処置のための薬剤の調製のためのおよび／または癌の処置のための本明細書に開示される操作されたＮＫ細胞の使用も、本明細書において提供される。

本明細書に開示されるように、処置有効量の操作されたＮＫを対象に投与することを含む、それを必要とする対象において癌を処置する方法もまた提供される。

以下の図の説明は、本明細書に開示される本発明の非限定的な実施形態を表す実験および結果に関連する。

図１Ａおよび１Ｂは、本明細書に開示される実施形態に従って、ＮＫ細胞の増殖を増強するために使用される増殖プロトコルの非限定的な例を示す。

図２は、本明細書に開示されるものの非限定的な実施形態を含む、様々な増殖方法論を使用して、ＮＫ細胞の倍率増殖を比較するデータを示す。

図３Ａ～３Ｂは、４人の異なるドナーからの様々な条件下でのＮＫ細胞の増殖に関するデータを示す。図３Ａは、フィーダー細胞のみで（上段）またはサイトカイン補足を用いて（下段）増殖させる場合のＮＫ細胞の表面でのＮＫＧ２Ｄの発現を測定するフローサイトメトリーデータを示す。図３Ｂは、様々な条件下でのキメラ受容体構築物を有するＮＫＧ２Ｄ（ＮＫＸ１０１）での形質導入を表す平均蛍光強度を測定する。

図４は、フィーダー細胞のみを使用するか、またはサイトカイン補足を伴う条件下での増殖後の様々な時点でのＮＫ細胞の細胞毒性に関連するデータを示す。

図５Ａ～５Ｂは、ＮＫ細胞による記憶表現型を示す特定のマーカーの発現に関連するデータを示す。

図６は、増殖中の示されたサイトカイン刺激ありまたはなしで増殖されるＮＫ細胞の抗腫瘍活性に関連するインビボデータを示す。

図７Ａ～７Ｂは、様々な条件下でのＮＫ細胞増殖に関する。図７Ａは、ＩＬ１２／１８について過飽和、飽和、または亜飽和であると判断される様々な濃度を示す。図７Ｂは、様々な培養条件下でのＮＫ細胞の増殖データを示す。

図８は、培地中のＩＬ１２および／またはＩＬ１８の濃度を変化させて培養されるＮＫ細胞によるインターフェロンガンマの放出に関するデータを示す。

図９Ａ～９Ｈは、示された条件で７日間培養した後のＮＫ細胞増殖の評価に関する。図９Ａは、各培養群の概略データを示す。図９Ｂは、群の統計的比較を提供する。図９Ｃは、ＩＬ１８を４ｎｇ／ｍｌで含む様々な濃度のＩＬ１２を含む特定の滴定データセットについての倍率増殖データ（７日目）を示す。図９Ｄは、２０ｎｇ／ｍＬ ＩＬ１８での同様のデータを示す。図９Ｅは、２０ｎｇ／ｍＬ ＩＬ１８、４０ＩＵ／ｍＬ ＩＬ２、および示された濃度のＩＬ１２を使用した培養７日目の操作されたＮＫ細胞の生存率を示す。図９Ｆは、２０ｎｇ／ｍＬ ＩＬ１８、４００ＩＵ／ｍＬ ＩＬ２、および示された濃度のＩＬ１２を使用した培養８日目の操作されたＮＫ細胞の生存率を示す。図９Ｇは、４ｎｇ／ｍＬ ＩＬ１８、４０ＩＵ／ｍＬ ＩＬ２および示された濃度のＩＬ１２を用いた培養７日目の操作されたＮＫ細胞の生存率を示す。図９Ｈは、４ｎｇ／ｍＬ ＩＬ１８、４００ＩＵ／ｍＬ ＩＬ２および示された濃度のＩＬ１２を用いた培養８日目の操作されたＮＫ細胞の生存率を示す。

図１０Ａ～１０Ｂは、ＮＫ細胞の細胞毒性の評価に関する。図１０Ａは、培養８日後の各培養群におけるＮＫ細胞の細胞毒性に関する概略データを示す。図１０は、細胞毒性の統計的比較を提供する。

図１１Ａ～１１Ｂは、ＮＫ細胞の細胞毒性の評価に関する。図１１Ａは、培養１５日後の各培養群におけるＮＫ細胞の細胞毒性に関する概略データを示す。図１１Ｂは、細胞毒性の統計的比較を提供する。

図１２は、キメラ受容体構築物で形質導入され、２人のドナーから様々な条件で培養されるＮＫ細胞の発現データを示す。

図１３は、キメラ受容体構築物で形質導入され、２人の追加のドナーから様々な条件で培養されるＮＫ細胞の発現データを示す。

図１４Ａ～１４Ｂは、細胞毒性データを示す。図１４Ａは、ＮＫＧ２Ｄリガンドを標的とするキメラ受容体で形質導入され、示された条件で培養されるＮＫ細胞の細胞毒性に関する概略データを示す。図１４Ｂは、群の統計的比較を示す。

図１５Ａ～１５Ｄは、示された条件下で培養された後の、ＮＫＧ２Ｄ標的化キメラ受容体で形質導入されるＮＫ細胞の細胞毒性効果に関する。図１５Ａおよび１５Ｂは、ＧＦＰをコードするベクターまたはＮＫＧ２Ｄリガンドを標的とするキメラ受容体をコードするベクターのいずれかでの形質導入の１３日後の２人の異なるドナーからのＮＫ細胞の細胞毒性に関するデータを示す。図１５Ｃおよび１５Ｄは、形質導入後２１日目の同じ２人のドナーからの対応する細胞毒性データを示す。

図１６Ａ～１６Ｂは、ＮＫ細胞の表現型に関するデータを示す。図１６Ａは、指示された培養条件における経時的なＮＫ細胞による記憶様表現型に関連するマーカーの発現に関するデータを示す。図１６Ｂは、培養中の経時的なマーカー発現の進行を示すフローサイトメトリーデータを示す。

図１７Ａ～１７Ｄは、様々な培養条件におけるＮＫ細胞による選択されたマーカーに関連する概略発現データを示す。図１７ＡはＣＤ６２リガンドに関連する発現データを示し、図１７ＢはＮＫＧ２Ｃの発現を示し、図１７ＣはＣＤ５７の発現を示し、そして図１７ＤはＣＤ６２ＬおよびＮＫＧ２Ｃの両方の発現を示す。

図１８は、形質導入後２１日目のＧＦＰおよび／またはＮＫＧ２Ｄ－リガンド指向性キメラ受容体のいずれかを発現するＮＫ細胞の細胞毒性データを示す。

図１９は、様々な培養条件下で成長させるＮＫ細胞の細胞生存率および増殖データを示す。

図２０は、抗ＣＤ１９ ＣＡＲで形質導入され、示された条件を使用して培養されるＮＫ細胞についての（Ｆｌａｇタグに基づく）発現データを示す。このデータは、増殖の１５日目に収集された。

図２１は、抗ＣＤ１９ ＣＡＲで形質導入され、示された条件を使用して培養されるＮＫ細胞についての（Ｆｌａｇタグに基づく）発現データを示す。このデータは、増殖の２２日目に収集された。

図２２Ａ～２２Ｃは、抗ＣＤ１９ ＣＡＲを発現するＮＫ細胞の細胞毒性に関するデータを示す。ＮＫ細胞は、示された条件を使用して増殖され、図２２Ａに示されたＥ：Ｔ比（３人のドナーの平均）を使用してＮａｌｍ６細胞でチャレンジされた。図２２Ｂは、概略細胞毒性データを示す。図２２Ｃは、エフェクター対標的比の関数としての細胞毒性データを示す。

図２３は、肝細胞癌異種移植片モデルにおいてＮＫＧ２Ｄリガンドを標的とするキメラ受容体を発現するＮＫ細胞の細胞毒性を評価するための実験設定の概略を示す。

図２４は、示された処置下のマウスにおける経時的な腫瘍量の概略を示す。

図２５は、インビボでのＮＫ細胞の細胞毒性に対する増殖培養条件の影響を評価するための模式的実験設定を示す。

図２６Ａ～２６Ｆは、細胞毒性、生存データ、ＮＫ細胞の持続性に関するデータ、および新鮮なまたは冷凍保存されたＮＫ細胞におけるＣＡＲ発現に関するデータを示す。図２６Ａは、異種移植モデルにおけるＮａｌｍ６細胞に対する示された条件下で増殖されるＮＫ細胞の細胞毒性に関連するデータを示す。図２６Ｂは、示された処置を受けたマウスの生存曲線を示す。図２６Ｃは、増殖培養条件に基づいて分離された、注射後１８日目のマウス血液中のヒトＮＫ細胞の検出に関するデータを示す。図２６Ｄは、増殖培養条件に基づいて分離された、注射後１８日目のマウス血液中のＣＡＲ陽性ＮＫ細胞の検出に関連するデータを示す。図２６Ｅは、増殖の１５日目に追加の刺激分子の存在下または非存在下で、抗ＣＤ１９ ＣＡＲの非限定的な実施形態を発現するＮＫ細胞（新鮮または冷凍保存のいずれか）のパーセンテージに関連する発現データを示す。図２６Ｆは、増殖の２２日目に追加の刺激分子の存在下または非存在下で、抗ＣＤ１９ ＣＡＲの非限定的な実施形態を発現するＮＫ細胞（新鮮または冷凍保存のいずれか）のパーセンテージに関連する発現データを示す。

図２７Ａ～２７Ｃは、本明細書に開示される実施形態による様々なＣＤ１９指向性ＣＡＲのインビボ有効性に関する。図２７Ａは、インビボで様々なＣＤ１９指向性ＣＡＲ構築物を発現するヒト化ＮＫ細胞の有効性を評価するための実験プロトコルの模式図を示す。テストされる様々な実験群は、示されているとおりである。「ＩＬ１２／ＩＬ１８」と表示された細胞については、本明細書に開示される実施形態に従って、細胞を可溶性ＩＬ１２および／またはＩＬ１８の存在下で増殖させた。図２７Ｂおよび２７Ｃは、Ｎａｌｍ６腫瘍細胞を投与され、示された構築物で処置される動物からの生物発光データを示す。

図２８Ａ～２８Ｊは、図２７Ｂ～２７Ｃからの生物発光データのグラフ描写を示す。図２８Ａは、形質導入されていないＮＫ細胞を受けた動物からの生物発光を示す（光子／秒流束として）。図２８Ｂは、ビヒクルとしてＰＢＳを受けた動物で測定される流束を示す。図２８Ｃは、（ＣＡＲの非限定的な例として）ＮＫ１９ ＮＦ２ ＣＡＲを発現する予め冷凍されたＮＫ細胞を受けた動物で測定される流束を示す。図２８Ｄは、ＩＬ１２および／またはＩＬ１８を使用して増殖させるＮＫ１９ ＮＦ２ ＣＡＲ（ＣＡＲの非限定的な例として）を発現する予め冷凍されたＮＫ細胞を受けた動物で測定される流束を示す。図２８Ｅおよび図２８Ｆは、（ＣＡＲの非限定的な例として）ＮＫ１９ ＮＦ２ ＣＡＲを発現する新鮮なＮＫ細胞を受けた動物で測定される流束を示す。図２８Ｇおよび図２８Ｈは、ＩＬ１２および／またはＩＬ１８を使用して増殖されるＮＫ１９ ＮＦ２ ＣＡＲ（ＣＡＲの非限定的な例として）を発現する以前に新鮮なＮＫ細胞を受けた動物で測定される流束を示す。図２８Ｉは、腫瘍接種後最初の３０日間にわたって様々な群で測定される生物発光を表す折れ線グラフを示す。図２８Ｊは、腫瘍接種後最初の５６日間にわたって様々な群で測定される生物発光を表す折れ線グラフを示す。

図２９は、示された処置を受けたときの経時的なマウスの体重に関するデータを示す。

図３０Ａ～３０Ｃは、（本明細書に開示されるように）ＣＡＲを発現するように操作され、１つまたは複数の刺激性サイトカインの存在下または非存在下で増殖されるＮＫ細胞を特徴付けるデータに関連するデータを示す。図３０Ａは、経時的な動物の血液中のＣＡＲを発現するＮＫ細胞のパーセンテージに関するデータを示す。図３０Ｂは、５０日間にわたる動物の血液中のＣＡＲを発現するＮＫ細胞のパーセンテージに関するデータを示す。図３０Ｃは、経時的でありかつ試験した生細胞の数に基づくＣＡＲを発現するＮＫ細胞のパーセンテージに関するデータを示す。

図３１Ａ～３１Ｃは、抗ＣＤ１９ ＣＡＲの発現およびどの細胞がＣＡＲを発現するかの特徴付けに関する３匹の異なるマウス（それぞれ３１Ａ、３１Ｂ、および３１Ｃ）からデータを示す。

図３２Ａ～３２Ｃは、抗ＣＤ１９ ＣＡＲの発現およびどの細胞がＣＡＲを発現するかの特徴付けに関する３匹の異なるマウス（それぞれ３２Ａ、３２Ｂ、および３２Ｃ）からのデータを示す。

図３３Ａ～３３Ｃは、インビボ投与（図２７Ａのプロトコル）の４日後に収集される血液試料からの概略発現データを示す。図３３Ａは、示された実験群の全血試料からのＣＤ３^－ＣＤ５６^＋ＮＫ細胞のパーセンテージを示す。図３３Ｂは、各実験群について特異的な抗ＣＤ１９ ＣＡＲを発現するＮＫ細胞のパーセンテージを示す。図３３Ｃは、各実験群について検出されたＧＦＰ陽性腫瘍細胞の数に関するデータを示す。

図３４Ａ～３４Ｃは、インビボ投与（図２７Ａのプロトコル）の１２日後に収集される血液試料からの概略発現データを示す。図３４Ａは、示された実験群の全血試料からのＣＤ３^－ＣＤ５６^＋ＮＫ細胞のパーセンテージを示す。図３４Ｂは、各実験群について特異的な抗ＣＤ１９ ＣＡＲを発現するＮＫ細胞のパーセンテージを示す。図３４Ｃは、各実験群について検出されたＧＦＰ陽性腫瘍細胞の数に関するデータを示す。

図３５Ａ～３５Ｅは、インビボ投与（図２７Ａのプロトコル）の１８日後に収集される血液試料からの概略発現データを示す。図３５Ａは、示された実験群の全血試料からのＣＤ３^－ＣＤ５６^＋ＮＫ細胞のパーセンテージを示す。図３５Ｂは、フィコエリトリン（ＰＥ）結合抗体を用いて測定される各実験群についてのＣＤ１９陽性腫瘍細胞のパーセンテージを示す。図３５Ｃは、各実験群について検出されたＧＦＰ陽性腫瘍細胞の数に関するデータを示す。図３５Ｄは、抗ＣＤ１９ ＦＣ抗体を用いて測定される、各実験群について特異的な抗ＣＤ１９ ＣＡＲを発現するＮＫ細胞のパーセンテージを示す。図３５Ｅは、ＣＤ１９ ＣＡＲを発現する各処置群におけるＮＫ細胞のパーセンテージを示す。

図３６は、１０，０００個の白血球あたりのＮＫ細胞のカウントによって測定される、ＮＫ細胞の２つの用量のそれぞれについての、抗ＣＤ１９ ＣＡＲを発現するＮＫ細胞の半減期に関して４週間にわたって収集されるデータを示す。２つの用量は、（ｉ）抗ＣＤ１９ ＣＡＲを発現する２００万個のＮＫ細胞、および（ｉｉ）抗ＣＤ１９ ＣＡＲを発現する５００万個のＮＫ細胞であった。これらのデータは、ＮＫ細胞の３回目の投与後に収集された。

図３７は、ＮＫＧ２Ｄリガンドを標的とするＣＡＲを発現するように操作され、追加の刺激性サイトカインを使用せずに増殖された冷凍保存ＮＫ細胞の半減期について収集されるデータを示す。

図３８Ａ～３８Ｄは、腫瘍細胞株に対する様々なＣＤ１９標的化ＣＡＲ（または形質導入されていないＮＫ細胞）の比較用量応答細胞毒性データを示す。図３８Ａは、２４時間後の高ＣＤ１９発現Ｎａｌｍ６腫瘍細胞に対する細胞毒性を示す。図３８Ｂは、７２時間後のＮａｌｍ６に対する細胞毒性を示す。図３８Ｃは、２４時間後の、Ｎａｌｍ６細胞よりも低いレベルのＣＤ１９を示すＲｅｈ腫瘍細胞に対する細胞毒性を示す。図３８Ｄは、７２時間後のＲｅｈ細胞に対する細胞毒性を示す。

図３９Ａ～３９Ｂは、ＮＫ細胞（３９Ａ）またはＣＤ１９－ＣＡＲの非限定的実施形態を発現するＮＫ細胞（３９Ａ）の、デキサメタゾンの存在下および非存在下での細胞毒性に関するデータを示す。

図４０Ａ～４０Ｂは、経時的な動物の血流中のＣＡＲ発現ＮＫ（示されるデータは、ＣＡＲ、ここではＣＤ１９標的化ＣＡＲの非限定的な実施形態である）細胞の寿命（例えば、半減期）に関連するデータ（４０Ａと４０Ｂとの間の異なるスケール）を示す。

図４１Ａ～４１Ｂは、ＩＬ２で培地を補足することと併せて、臍帯血（ＣＢ）または末梢血（ＰＢ）のいずれかから得られるＮＫ細胞が増殖プロセス中の複数の時点で１：１０の比率でフィーダー細胞でパルスされた経時的なＮＫ細胞増殖データに関する。図４１Ａは、経時的なＮＫ細胞の増殖の折れ線グラフを示す。図４１Ｂは概略増殖データを示す。

図４２Ａ～４２Ｂは、ＩＬ２およびＩＬ１２の両方で培地を補足することと併せて、臍帯血（ＣＢ）または末梢血（ＰＢ）のいずれかから得られるＮＫ細胞が増殖プロセス中の複数の時点で１：１０の比率でフィーダー細胞でパルスされた経時的なＮＫ細胞増殖データに関する。図４２Ａは、経時的なＮＫ細胞の増殖の折れ線グラフを示す。図４２Ｂは概略増殖データを示す。

図４３Ａ～４３Ｂは、ＩＬ２とＩＬ１８の両方で培地を補足することと併せて、臍帯血（ＣＢ）または末梢血（ＰＢ）のいずれかから得られるＮＫ細胞が増殖プロセス中の複数の時点で１：１０の比率でフィーダー細胞でパルスされた経時的なＮＫ細胞増殖データに関する。図４３Ａは、経時的なＮＫ細胞の増殖の折れ線グラフを示す。図４３Ｂは概略増殖データを示す。

図４４Ａ～４４Ｂは、ＩＬ２およびＩＬ１２とＩＬ１８の組み合わせの両方で培地を補足することと併せて、臍帯血（ＣＢ）または末梢血（ＰＢ）のいずれかから得られるＮＫ細胞が増殖プロセス中の複数の時点で１：１０の比率でフィーダー細胞でパルスされた経時的なＮＫ細胞増殖データに関する。図４４Ａは、経時的なＮＫ細胞の増殖の折れ線グラフを示す。図４４Ｂは概略増殖データを示す。

図４５Ａ～４５Ｅは、フィーダー細胞の複数のパルスの結果としてのＣＤ３陽性細胞の増殖、および培地を補足するために使用される示されたサイトカイン条件に関する。図中の星印は、ＮＫ細胞が新鮮な培地を含む新鮮なフィーダー細胞にいつ再播種されたかを示す（示されている場合、培地成分の補足を含む）。図４５Ａは、高濃度のＩＬ２（４００単位／ｍＬ）を使用して培地を補足したときのデータを示す。図４５Ｂは、培地にＩＬ１２（ならびに４０単位／ｍＬ ＩＬ２）を補足することに関連するデータを示す。図４５Ｃは、培地にＩＬ１８（ならびに４０単位／ｍＬ ＩＬ２）を補足することに関するデータを示す。図４５Ｄは、培地にＩＬ１２およびＩＬ１８の両方（ならびに４０単位／ｍＬ ＩＬ２）を補足することに関連するデータを示す。図４５Ｅは、対照増殖（新しいフィーダー細胞および４０単位／ｍＬ ＩＬ２でパルスするが、サイトカインを添加しない）に関するデータを示す。

図４６Ａ～４６Ｊは、活性化ＮＫＧ２Ｃ受容体の発現に関する。図中の星印は、ＮＫ細胞が新鮮な培地を含む新鮮なフィーダー細胞にいつ再播種されたかを示す（示されている場合、培地成分の補足を含む）。図４６Ａは、高濃度のＩＬ２（４００単位／ｍＬ）を使用していつ培地に補ったかのデータとともに、ＮＫＧ２Ｃ発現陽性のＮＫ細胞のパーセンテージとして表されたデータを示す。図４６Ｂは、高濃度のＩＬ２（４００単位／ｍＬ）を使用していつ培地を補ったかのデータとともに、ＮＫＧ２Ｃ発現を表す全体平均蛍光強度（ＭＦＩ）として表されるデータを示す。図４６Ｃは、培地にＩＬ１２（および４０単位／ｍＬ ＩＬ２）を補足することに関連するデータとともに、ＮＫＧ２Ｃ発現について陽性であるＮＫ細胞のパーセンテージとして提示されるデータを示す。図４６Ｄは、培地にＩＬ１２（および４０単位／ｍＬ ＩＬ２）を補足することに関連するデータとともに、ＮＫＧ２Ｃ発現を表す全体的なＭＦＩとして提示されるデータを示す。図４６Ｅは、培地にＩＬ１８（および４０単位／ｍＬ ＩＬ２）を補足することに関連するデータとともに、ＮＫＧ２Ｃ発現について陽性であるＮＫ細胞のパーセンテージとして示される。図４６Ｆは、培地にＩＬ１８（および４０単位／ｍＬ ＩＬ２）を補足することに関連するデータを示し、データはＮＫＧ２Ｃ発現を表す全体的なＭＦＩとして提示されるデータを示す。図４６Ｇは、培地にＩＬ１２およびＩＬ１８（ならびに４０単位／ｍＬ ＩＬ２）の両方を補足することに関連するデータとともに、ＮＫＧ２Ｃ発現について陽性であるＮＫ細胞のパーセンテージとして提示されるデータを示す。図４６Ｈは、培地にＩＬ１２およびＩＬ１８（ならびに４０単位／ｍＬ ＩＬ２）の両方を補足することに関連するデータとともに、ＮＫＧ２Ｃ発現を表す全体的なＭＦＩとして提示されるデータを示す。図４５Ｉは、対照増殖（新しいフィーダー細胞および４０単位／ｍＬ ＩＬ２でパルスするが、サイトカインを添加しない）に関連するデータとともに、ＮＫＧ２Ｃ発現について陽性であるＮＫ細胞のパーセンテージとして提示されるデータを示す。図４５Ｊは、対照増殖（新しいフィーダー細胞および４０単位／ｍＬ ＩＬ２でパルスするが、サイトカインを添加しない）に関連するデータとともに、ＮＫＧ２Ｃ発現を表す全体的なＭＦＩとして提示されるデータを示す。

図４７Ａ～４７Ｂは、０日目に単一のフィーダー刺激（「ＳＯＰ」）を伴う増殖法と比較した、０日目および７日目に２回のフィーダーパルス（「２Ｘ」）または０日目、７日目および１４日目に３回のフィーダーパルス（「３Ｘ」）で増殖させるＮＫ細胞上の活性化（４７Ａ）および阻害（４７Ｂ）マーカーの増加を示す。「純粋なＮＫ」は、フィーダー細胞と共に培養される細胞の最初の集団が精製された群である。「ＰＢＭ」は、フィーダー細胞と共に培養される細胞の最初の集団が精製されたＮＫ細胞ではなく末梢血単核細胞であった群である。

図４８Ａ～４８Ｂは、０日目（丸）または７日目（四角）における活性化（４８Ａ）または阻害（４８Ｂ）マーカーの発現のさらなる評価に関する。

詳細な説明
癌免疫療法、または他の疾患に対する細胞療法は、目的の構築物を発現するように細胞を操作する能力に関して大きく進歩したが、患者への投与のために臨床的に適切な数のそれらの細胞が依然として必要とされている。このことは、操作され、後で投与される基礎となるネイティブ免疫細胞が他の免疫細胞タイプよりも普及していない場合に特に重要である。これは、実用的でない可能性のある大量の出発材料から始めるか、ＮＫ細胞などの目的の免疫細胞を（場合によっては優先的に）増殖するためのより効率的な方法および組成物を開発する必要がある。したがって、本明細書では、いくつかの実施形態において、ＮＫ細胞（または他の免疫細胞）の増強された増殖を有利に可能にするだけでなく、それらの細胞の細胞毒性の増強も可能にする方法および組成物が提供される。

いくつかの実施形態において、本明細書に開示される修飾された「フィーダー」細胞を免疫細胞の開始集団と共培養し、増殖中の特定の時点で共培養物に様々なサイトカインを補足することから得られる、増殖および活性化されたＮＫ細胞の集団が提供される。

免疫細胞増殖における使用のための細胞
いくつかの実施形態において、細胞株は、増殖されるべき免疫細胞の集団との共培養において使用される。かかる細胞株は、本明細書では「刺激細胞」と呼ばれ、「フィーダー細胞」とも呼ばれる。いくつかの実施形態において、免疫細胞の全集団が増殖され、いくつかの実施形態において、選択された免疫細胞亜集団が増殖される。例えば、いくつかの実施形態において、ＮＫ細胞は、他の免疫細胞亜集団（Ｔ細胞など）と比較して増殖される。他の実施形態において、ＮＫ細胞およびＴ細胞の両方が増殖される。いくつかの実施形態において、フィーダー細胞自体が遺伝子修飾される。いくつかの実施形態において、フィーダー細胞は、ＮＫ細胞に対して阻害効果を有するＭＨＣＩ分子を発現しない。いくつかの実施形態において、フィーダー細胞は、ＭＨＣＩ発現を完全に欠く必要はないが、野生型細胞よりも低いレベルでＭＨＣＩ分子を発現してもよい。例えば、いくつかの実施形態において、野生型細胞がＸのレベルでＭＨＣを発現する場合、使用される細胞株は、Ｘの９５％未満、Ｘの９０％未満、Ｘの８５％未満、Ｘの８０％未満、Ｘの７０％未満、Ｘの５０％未満、Ｘの２５％未満、および列挙されるものの間の（およびそれらを含む）任意の発現レベル未満のレベルでＭＨＣを発現してもよい。いくつかの実施形態において、刺激細胞は不死化されている、例えば癌細胞株である。しかしながら、いくつかの実施形態において、刺激細胞は初代細胞である。

実施形態に応じて、フィーダー細胞として様々な細胞型を使用してもよい。これらは、限定されないが、Ｋ５６２細胞、特定のウィルムス腫瘍細胞株（例えば、ウィルムス腫瘍細胞株ＨＦＷＴ）、子宮内膜腫瘍細胞（例えば、ＨＨＵＡ）、黒色腫細胞（例えば、ＨＭＶ－ＩＩ）、肝芽腫細胞（例えば、ＨｕＨ－６）、肺小細胞癌細胞（例えば、Ｌｕ－１３０およびＬｕ－１３４－Ａ）、神経芽細胞腫細胞（例えば、ＮＢ１９およびＮＢ６９）、胚性癌精巣細胞（例えば、ＮＥＣ１４）、子宮頸癌細胞（ＴＣＯ－２）、神経芽細胞腫細胞（例えば、ＴＮＢ１）、７２１．２２１ＥＢＶ形質転換Ｂ細胞株などを含む。

追加の実施形態において、フィーダー細胞はまた、ＭＨＣＩＩ発現が減少している（または欠如している）だけでなく、ＭＨＣＩ発現が減少している（または欠如している）。いくつかの実施形態において、最初にＭＨＣクラスＩ分子を発現してもよい他の細胞株を、ＭＨＣＩ発現を低減またはノックアウトするためのそれらの細胞の遺伝子修飾と併せて使用してもよい。遺伝子修飾は、遺伝子編集技術（例えば、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステム、ＲＮＡに作用するアデノシンデアミナーゼ（ＡＤＡＲ）、ジンクフィンガー、ＴＡＬＥＮＳなどによるＲＮＡ編集）、阻害性ＲＮＡ（例えば、ｓｉＲＮＡ）、または細胞表面上のＭＨＣＩ分子の発現を破壊および／または減少させるための他の分子的方法の使用により達成されることができる。

以下により詳細に論じるように、いくつかの実施形態において、フィーダー細胞は、免疫細胞の増殖および活性化を増強するために、特定の刺激分子（例えば、インターロイキン、ＣＤ３、４－１ＢＢＬなど）を発現するように操作される。操作されたフィーダー細胞は、例えば、その全体が参照により本明細書に組み込まれる国際特許出願ＰＣＴ／ＳＧ２０１８／０５０１３８に開示される。いくつかの実施形態において、インターロイキン１２、１８、および／または２１などの刺激分子は、共培養培地に、例えば規定の時間および特定の量で別々に添加されて免疫細胞の所望の亜集団の増強された増殖をもたらす。

刺激分子
上記で簡単に論じたように、特定の分子は、操作されたＮＫ細胞またはＴ細胞を含むＮＫ細胞またはＴ細胞などの免疫細胞の増殖を増強する。実施形態に応じて、１つまたは複数の刺激分子は、免疫集団を増殖するために使用されるフィーダー細胞の表面に発現させることができる。例えば、いくつかの実施形態において、Ｋ５６２フィーダー細胞の集団は、４－１ＢＢＬおよび／または膜結合型インターロイキン１５（ｍｂＩＬ１５）を発現するように操作される。さらなる実施形態は、さらなる膜結合インターロイキンまたは刺激剤に関する。かかる追加の膜結合刺激分子の例は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる国際特許出願ＰＣＴ／ＳＧ２０１８／０５０１３８に見ることができる。

いくつかの実施形態において、本明細書に開示される方法は、操作されたフィーダー細胞および操作されたＮＫ細胞が共培養される培地への１つまたは複数の刺激分子の添加に関する。いくつかの実施形態において、１つまたは複数のインターロイキンが添加される。例えば、いくつかの実施形態において、ＩＬ２が培地に添加される。いくつかの実施形態において、ＩＬ１２が培地に添加される。いくつかの実施形態において、ＩＬ１８が培地に添加される。いくつかの実施形態において、ＩＬ２１が培地に添加される。いくつかの実施形態において、ＩＬ２、ＩＬ１２、ＩＬ１８、および／またはＩＬ２１の２つ以上の組み合わせが培地に添加される。いくつかの実施形態において、ｍｂＩＬ１５を有するフィーダー細胞を使用するのではなく、可溶性ＩＬ１５を培地に添加する（単独で、またはＩＬ２、ＩＬ１２、ＩＬ１８、およびＩＬ２１のいずれかと組み合わせて）。

いくつかの実施形態において、培地は、１つまたは複数のビタミン、無機塩および／またはアミノ酸を含む。いくつかの実施形態において、培地は、グリシン、Ｌ－アルギニン、Ｌ－アスパラギン、Ｌ－アスパラギン酸、Ｌ－シスチン（例えば、Ｌ－シスチン２ＨＣｌ）、Ｌ－グルタミン酸、Ｌ－グルタミン、Ｌ－ヒスチジン、Ｌ－ヒドロキシプロリン、Ｌ－イソロイシン、Ｌ－ロイシン、Ｌ－リジン塩酸塩、Ｌ－メチオニン、Ｌ－フェニルアラニン、Ｌ－プロリン、Ｌ－セリン、Ｌ－スレオニン、Ｌ－トリプトファン、Ｌ－チロシン（Ｌ－チロシン二ナトリウム塩脱水物など）、およびＬ－バリンのうちの１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、８つ、９つ、１０つまたはすべてを含む。いくつかの実施形態において、培地は、ビオチン、塩化コリン、Ｄ－パントテン酸カルシウム、葉酸、ｉ－イノシトール、ナイアシンアミド、パラ－アミノ安息香酸、ピリドキシン塩酸塩、リボフラビン、チアミン塩酸塩、およびビタミンＢ１２のうちの１つ、２つ、３つ、４つ、またはそれ以上を含む。いくつかの実施形態において、培地は、硝酸カルシウム（Ｃａ（ＮＯ_３）２・４Ｈ_２Ｏ）、硫酸マグネシウム（ＭｇＳＯ_４）（例えば、硫酸マグネシウム（ＭｇＳＯ_４）（無水））、塩化カリウム（ＫＣｌ）、重炭酸ナトリウム（ＮａＨＣＯ_３）、塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）、および二塩基性リン酸ナトリウム（Ｎａ_２ＨＰＯ_４）（例えば、二塩基性リン酸ナトリウム（Ｎａ_２ＨＰＯ_４）無水物）のうちの１つ、２つ、３つ、４つ、またはそれ以上を含む。

いくつかの実施形態において、培地は、Ｄ－グルコースおよび／またはグルタチオン（所望により還元グルタチオン）をさらに含む。いくつかの実施形態において、培地は、血清（例えば、ウシ胎児血清）を約１％から約２０％の範囲の量でさらに含む。いくつかの実施形態において、血清は熱不活化されている。いくつかの実施形態において、培地は無血清である。いくつかの実施形態において、培地はゼノフリーである。

実施形態に応じて、ＩＬ２は、培地を補足し、ＮＫ細胞の増殖または他の特徴を増強するために使用される。いくつかの実施形態において、使用されるＩＬ２の濃度は、例えば、約１ＩＵ／ｍＬから約５ＩＵ／ｍＬ（例えば、１、２、３、４、および５）、約５ＩＵ／ｍＬから約１０ＩＵ／ｍＬ（例えば、５、６、７、８、９、および１０）、約１０ＩＵ／ｍＬから約２０ＩＵ／ｍＬ（例えば、約１０、１２、１４、１６、１８、および２０）、約２０ＩＵ／ｍＬから約３０ＩＵ／ｍＬ（例えば、約２０、２２、２４、２６、２８、および３０）、約３０ＩＵ／ｍＬから約４０ＩＵ／ｍＬ（例えば、３０、３２、３４、３６、３８、および４０）、約４０から約５０ＩＵ／ｍＬ（例えば、４０、４２、４４、４６、４８、５０）、約５０ＩＵ／ｍＬから約７５ＩＵ／ｍＬ（例えば、５０、５５、６０、６５、７０、および７５）、約７５ＩＵ／ｍＬから約１００ＩＵ／ｍＬ（例えば、７５、８０、８５、９０、９５、および１００）、約１００ＩＵ／ｍＬから約２００ＩＵ／ｍＬ（例えば、１００、１２５、１５０、２７５、および２００）、約２００ＩＵ／ｍＬから約３００ＩＵ／ｍＬ（例えば、２００、２２５、２５０、２７５、および３００）、約３００ＩＵ／ｍＬから約４００ＩＵ／ｍＬ（例えば、３００、３２５、３５０、３７５、および４００）、約４００ＩＵ／ｍＬから約５００ＩＵ／ｍＬ（例えば、４００、４２５、４５０、４７５、および５００）、約５００ＩＵ／ｍＬから約７５０ＩＵ／ｍＬ（例えば、５００、５５０、６００、６５０、７００、および７５０）、または約７５０ＩＵ／ｍＬから約１０００ＩＵ／ｍＬ（例えば、７５０、８００、８５０、９００、９５０、および１０００）、および終点を含むそれらの間の任意の濃度である。いくつかの実施形態において、培養中の複数の時点でＩＬ２を添加してもよい。いくつかのかかる実施形態において、使用されるＩＬ２の濃度は、選択された時点間で異なってもよい。

本明細書で使用され、当技術分野で従来から理解されている「単位」および「国際単位（ＩＵ）」なる用語は、生物学的活性などの活性の測定によって決定される、物質、分子、または化合物の標準化された量または尺度を指す。この開示の目的のために、用語「単位」および「ＩＵ」は交換可能である。一般に理解されているように、単位またはＩＵによる測定は、それが例えば異なる産生プロセスまたはバッチ間の同じ物質の相関を可能にするため、質量または体積などの他の従来の定量化モードと比較して有利でも有利でなくてもよい。本明細書で使用されるＩＬ２に適用される場合、ＩＬ２の単位またはＩＵの定義は、ＮＩＢＳＣコード８６／５００の下でＩＬ２のＷＨＯ国際基準に従って標準化される。単位／ｍＬまたはＩＵ／ｍＬの測定によるＩＬ２濃度の開示は、ＮＩＢＳＣ標準に従って産生されている限り、使用されるＩＬ２の供給源に関係なく、過度の実験なしに譲渡可能であるべきであることは、当業者には理解されるであろう。

本明細書における開示の目的のために、使用されるＩＬ２は、２．３ｎｇ／ｍＬに対応する４０ＩＵ／ｍＬの濃度を有する（すなわち、１ＩＵ／ｍＬは５７．５ｐｇ／ｍＬに対応する）。したがって、ＩＵ／ｍＬまたは単位／ｍＬで表したＩＬ２の任意の濃度は、この同等性に従って、それらの質量濃度で解釈してもよい。代替物が使用される場合、当業者は、ＩＵ／ｍＬで測定されるＩＬ２産物の対応する質量濃度当量を決定できることが理解される。

実施形態に応じて、ＩＬ２は、培地を補足し、ＮＫ細胞の増殖または他の特徴を増強するために使用される。いくつかの実施形態において、使用されるＩＬ２の濃度は、例えば、約５５ｐｇ／ｍＬから約５００ｐｇ／ｍＬ（例えば、５５、６０、１００、２００、３００、４００、５００ｐｇ／ｍＬ）、約５００ｐｇ／ｍＬから約１０００ｐｇ／ｍＬ（例えば、５００、６００、７００、８００、９００、１０００ｐｇ／ｍＬ）、約１ｎｇ／ｍＬから約１０ｎｇ／ｍＬ（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０ｎｇ／ｍＬ）、または約１０ｎｇ／ｍＬから約６０ｎｇ／ｍＬｍＬ（例えば、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０ｎｇ／ｍＬ、および終点を含むそれらの間の任意の濃度を含む、５７．５ｐｇ／ｍＬから約５７．５ｎｇ／ｍＬ（または５５ｐｇ／ｍＬから約６０ｎｇ／ｍＬ）の範囲である。いくつかのかかる実施形態において、使用されるＩＬ２の濃度は、選択された時点間で異なってもよい。

実施形態に応じて、ＩＬ１２Ａおよび／またはＩＬ１２Ｂを使用して、培地を補足し、ＮＫ細胞の増殖または他の特徴を増強する。いくつかの実施形態において、使用されるＩＬ１２（ＩＬ１２ＡまたはＩＬ１２Ｂのいずれか）の濃度は、例えば、約０．０１ｎｇ／ｍＬから約０．０５ｎｇ／ｍＬ（例えば、０．０１、０．０２、０．０３、０．０４、および０．０５）、約０．０５ｎｇ／ｍＬから約０．１ｎｇ／ｍＬ（例えば、０．０５、０．０６、０．０７、０．０８、０．０９および０．１）、約０．１ｎｇ／ｍＬから約０．５ｎｇ／ｍＬ（例えば、０．１、０．２、０．３、０．４、および０．５）、約０．５ｎｇ／ｍＬから約１．０ｎｇ／ｍＬ（例えば、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、および１．０）、約１．０ｎｇ／ｍＬから約２．０ｎｇ／ｍＬｍＬ（例えば、１．１、１．２、１．３、１．４、１．５、１．６、１．７、１．８、１．９、および２．０）、約２．０ｎｇ／ｍＬから約５．０ｎｇ／ｍＬ（例えば、２．０、３．０、４．０、および５．０）、約５．０ｎｇ／ｍＬから約１０．０ｎｇ／ｍＬ（例えば、５．０、６．０、７．０、８．０、９．０および１０．０）、約１０．０ｎｇ／ｍＬから約１５．０ｎｇ／ｍＬ（例えば、１０．０、１１．０、１２．０、１３．０、１４．０、および１５．０）、約１５．０ｎｇ／ｍＬから約２０．０ｎｇ／ｍＬ（例えば、１５．０、１６．０、１７．０、１８．０、１９．０、および２０．０）、約２０．０ｎｇ／ｍＬから約２５．０ｎｇ／ｍＬ（例えば、２０．０、２１．０、２２．０、２３．０、２４．０、および２５．０）、約２５．０ｎｇ／ｍＬから約３０．０ｎｇ／ｍＬ（例えば、２５．０、２６．０、２７．０、２８．０、２９．０、および３０．０）、約３０．０ｎｇ／ｍＬから約５０．０ｎｇ／ｍＬ（例えば、３０．０、３５．０、４０．０、４５．０、および５０．０）、約５０．０ｎｇ／ｍＬから約７５．０ｎｇ／ｍＬ（例えば、５０．０、５５．０、６０．０、６５．０、７０．０、および７５．０）、約７５．０ｎｇ／ｍＬから約１００．０ｎｇ／ｍＬ（例えば、７５．０、８０．０、８５．０、９０．０、９５．０、および１００．０）、および終点を含むその間の任意の濃度を含む、約０．０１ｎｇ／ｍＬから１００ｎｇ／ｍＬの範囲である。いくつかの実施形態において、ＩＬ１２の濃度は、終点を含むその間の任意の濃度を含む、約０．０１ｎｇ／ｍＬから約８ｎｇ／ｍＬの間である。

いくつかの実施形態において、ＩＬ１２ＡおよびＩＬ１２Ｂの混合物が使用される。いくつかの実施形態において、ＩＬ１２Ａ：ＩＬ１２Ｂの特定の比率、例えば、１：１０、１：５０、１：１００、１：１５０、１：２００、１：２５０：、１：５００、１：１０００、１：１０，０００、１０，０００：１、１０００：１、５００：１、２５０：１、１５０：１、１００：１、１０：１、および終点を含むその間の任意の比率が使用される。

いくつかの実施形態において、インターロイキン１８（ＩＬ１８）を使用して、ＮＫ細胞の増殖または他の特徴を増強する。いくつかの実施形態において、使用されるＩＬ１８の濃度は、例えば、約０．０１ｎｇ／ｍＬから約０．０５ｎｇ／ｍＬ（例えば、０．０１、０．０２、０．０３、０．０４、および０．０５）、約０．０５ｎｇ／ｍＬから約０．１ｎｇ／ｍＬ（例えば、０．０５、０．０６、０．０７、０．０８、０．０９および０．１）、約０．１ｎｇ／ｍＬから約０．５ｎｇ／ｍＬ（例えば、０．１、０．２、０．３、０．４、および０．５）、約０．５ｎｇ／ｍＬから約１．０ｎｇ／ｍＬ（例えば、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、および１．０）、約１．０ｎｇ／ｍＬから約２．０ｎｇ／ｍＬ（例えば、１．１、１．２、１．３、１．４、１．５、１．６、１．７、１．８、１．９、および２．０）、約２．０ｎｇ／ｍＬから約５．０ｎｇ／ｍＬ（例えば、２．０、３．０、４．０、および５．０）、約５．０ｎｇ／ｍＬから約１０．０ｎｇ／ｍＬ（例えば、５．０、６．０、７．０、８．０、９．０および１０．０）、約１０．０ｎｇ／ｍＬから約１５．０ｎｇ／ｍＬ（例えば、１０．０、１１．０、１２．０、１３．０、１４．０および１５．０）、約１５．０ｎｇ／ｍＬから約２０．０ｎｇ／ｍＬ（例えば、１５．０、１６．０、１７．０、１８．０、１９．０、および２０．０）、約２０．０ｎｇ／ｍＬから約２５．０ｎｇ／ｍＬ（例えば、２０．０、２１．０、２２．０、２３．０、２４．０、および２５．０）、約２５．０ｎｇ／ｍＬから約３０．０ｎｇ／ｍＬ（例えば、２５．０、２６．０、２７．０、２８．０、２９．０、および３０．０）、約３０．０ｎｇ／ｍＬから約５０．０ｎｇ／ｍＬ（例えば、３０．０、３５．０、４０．０、４５．０、および５０．０）、約５０．０ｎｇ／ｍＬから約７５．０ｎｇ／ｍＬ（例えば、５０．０、５５．０、６０．０、６５．０、７０．０、および７５．０）、約７５．０ｎｇ／ｍＬから約１００．０ｎｇ／ｍＬ（例えば、７５．０、８０．０、８５．０、９０．０、９５．０、および１００．０）、および終点を含むそれらの間の任意の濃度を含む、約０．０１ｎｇ／ｍＬから約１００ｎｇ／ｍＬの範囲である。

いくつかの実施形態において、インターロイキン２１（ＩＬ２１）を使用して、ＮＫ細胞の増殖または他の特徴を増強する。いくつかの実施形態において、使用されるＩＬ２１の濃度は、例えば、約０．０１ｎｇ／ｍＬから約０．０５ｎｇ／ｍＬ（例えば、０．０１、０．０２、０．０３、０．０４、および０．０５）、約０．０５ｎｇ／ｍＬから約０．１ｎｇ／ｍＬ（例えば、０．０５、０．０６、０．０７、０．０８、０．０９および０．１）、約０．１ｎｇ／ｍＬから約０．５ｎｇ／ｍＬ（例えば、０．１、０．２、０．３、０．４、および０．５）、約０．５ｎｇ／ｍＬから約１．０ｎｇ／ｍＬ（例えば、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、および１．０）、約１．０ｎｇ／ｍＬから約２．０ｎｇ／ｍＬ（例えば、１．１、１．２、１．３、１．４、１．５、１．６、１．７、１．８、１．９、および２．０）、約２．０ｎｇ／ｍＬから約５．０ｎｇ／ｍＬ（例えば、２．０、３．０、４．０、および５．０）、約５．０ｎｇ／ｍＬから約１０．０ｎｇ／ｍＬ（例えば、５．０、６．０、７．０、８．０、９．０および１０．０）、約１０．０ｎｇ／ｍＬから約１５．０ｎｇ／ｍＬ（例えば、１０．０、１１．０、１２．０、１３．０、１４．０および１５．０）、約１５．０ｎｇ／ｍＬから約２０．０ｎｇ／ｍＬ（例えば、１５．０、１６．０、１７．０、１８．０、１９．０、および２０．０）、約２０．０ｎｇ／ｍＬから約２５．０ｎｇ／ｍＬ（例えば、２０．０、２１．０、２２．０、２３．０、２４．０、および２５．０）、約２５．０ｎｇ／ｍＬから約３０．０ｎｇ／ｍＬ（例えば、２５．０、２６．０、２７．０、２８．０、２９．０、および３０．０）、約３０．０ｎｇ／ｍＬから約５０．０ｎｇ／ｍＬ（例えば、３０．０、３５．０、４０．０、４５．０、および５０．０）、約５０．０ｎｇ／ｍＬから約７５．０ｎｇ／ｍＬ（例えば、５０．０、５５．０、６０．０、６５．０、７０．０、および７５．０）、約７５．０ｎｇ／ｍＬから約１００．０ｎｇ／ｍＬ（例えば、７５．０、８０．０、８５．０、９０．０、９５．０、および１００．０）、および終点を含むそれらの間の任意の濃度を含む、約０．０１ｎｇ／ｍＬから約１００ｎｇ／ｍＬの範囲である。

いくつかの実施形態において、インターロイキン１５（ＩＬ１５）は、ＮＫ細胞の増殖または他の特徴を増強するために、（フィーダー細胞上のｍｂＩＬ１５の代わりに、またはそれに加えて）可溶性形式で使用される。いくつかの実施形態において、使用されるＩＬ１５の濃度は、例えば、約０．０１ｎｇ／ｍＬから約０．０５ｎｇ／ｍＬ（例えば、０．０１、０．０２、０．０３、０．０４、および０．０５）、約０．０５ｎｇ／ｍＬから約０．１ｎｇ／ｍＬ（例えば、０．０５、０．０６、０．０７、０．０８、０．０９および０．１）、約０．１ｎｇ／ｍＬから約０．５ｎｇ／ｍＬ（例えば、０．１、０．２、０．３、０．４、および０．５）、約０．５ｎｇ／ｍＬから約１．０ｎｇ／ｍＬ（例えば、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、および１．０）、約１．０ｎｇ／ｍＬから約２．０ｎｇ／ｍＬ（例えば、１．１、１．２、１．３、１．４、１．５、１．６、１．７、１．８、１．９、および２．０）、約２．０ｎｇ／ｍＬから約５．０ｎｇ／ｍＬ（例えば、２．０、３．０、４．０、および５．０）、約５．０ｎｇ／ｍＬから約１０．０ｎｇ／ｍＬ（例えば、５．０、６．０、７．０、８．０、９．０および１０．０）、約１０．０ｎｇ／ｍＬから約１５．０ｎｇ／ｍＬ（例えば、１０．０、１１．０、１２．０、１３．０、１４．０および１５．０）、約１５．０ｎｇ／ｍＬから約２０．０ｎｇ／ｍＬ（例えば、１５．０、１６．０、１７．０、１８．０、１９．０、および２０．０）、約２０．０ｎｇ／ｍＬから約２５．０ｎｇ／ｍＬ（例えば、２０．０、２１．０、２２．０、２３．０、２４．０、および２５．０）、約２５．０ｎｇ／ｍＬから約３０．０ｎｇ／ｍＬ（例えば、２５．０、２６．０、２７．０、２８．０、２９．０、および３０．０）、約３０．０ｎｇ／ｍＬから約５０．０ｎｇ／ｍＬ（例えば、３０．０、３５．０、４０．０、４５．０、および５０．０）、約５０．０ｎｇ／ｍＬから約７５．０ｎｇ／ｍＬ（例えば、５０．０、５５．０、６０．０、６５．０、７０．０、および７５．０）、約７５．０ｎｇ／ｍＬから約１００．０ｎｇ／ｍＬ（例えば、７５．０、８０．０、８５．０、９０．０、９５．０、および１００．０）、および終点を含むそれらの間の任意の濃度を含む、約０．０１ｎｇ／ｍＬから約１００ｎｇ／ｍＬの範囲である。

いくつかの実施形態において、インターロイキン２２（ＩＬ２２）を使用して、ＮＫ細胞の増殖を増強する。いくつかの実施形態において、使用されるＩＬ２２の濃度は、例えば、約０．０１ｎｇ／ｍＬから約０．０５ｎｇ／ｍＬ（例えば、０．０１、０．０２、０．０３、０．０４、および０．０５）、約０．０５ｎｇ／ｍＬから約０．１ｎｇ／ｍＬ（例えば、０．０５、０．０６、０．０７、０．０８、０．０９および０．１）、約０．１ｎｇ／ｍＬから約０．５ｎｇ／ｍＬ（例えば、０．１、０．２、０．３、０．４、および０．５）、約０．５ｎｇ／ｍＬから約１．０ｎｇ／ｍＬ（例えば、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、および１．０）、約１．０ｎｇ／ｍＬから約２．０ｎｇ／ｍＬ（例えば、１．１、１．２、１．３、１．４、１．５、１．６、１．７、１．８、１．９、および２．０）、約２．０ｎｇ／ｍＬから約５．０ｎｇ／ｍＬ（例えば、２．０、３．０、４．０、および５．０）、約５．０ｎｇ／ｍＬから約１０．０ｎｇ／ｍＬ（例えば、５．０、６．０、７．０、８．０、９．０および１０．０）、約１０．０ｎｇ／ｍＬから約１５．０ｎｇ／ｍＬ（例えば、１０．０、１１．０、１２．０、１３．０、１４．０および１５．０）、約１５．０ｎｇ／ｍＬから約２０．０ｎｇ／ｍＬ（例えば、１５．０、１６．０、１７．０、１８．０、１９．０、および２０．０）、約２０．０ｎｇ／ｍＬから約２５．０ｎｇ／ｍＬ（例えば、２０．０、２１．０、２２．０、２３．０、２４．０、および２５．０）、約２５．０ｎｇ／ｍＬから約３０．０ｎｇ／ｍＬ（例えば、２５．０、２６．０、２７．０、２８．０、２９．０、および３０．０）、約３０．０ｎｇ／ｍＬから約５０．０ｎｇ／ｍＬ（例えば、３０．０、３５．０、４０．０、４５．０、および５０．０）、約５０．０ｎｇ／ｍＬから約７５．０ｎｇ／ｍＬ（例えば、５０．０、５５．０、６０．０、６５．０、７０．０、および７５．０）、約７５．０ｎｇ／ｍＬから約１００．０ｎｇ／ｍＬ（例えば、７５．０、８０．０、８５．０、９０．０、９５．０、および１００．０）、および終点を含むそれらの間の任意の濃度を含む、約０．０１ｎｇ／ｍＬから約１００ｎｇ／ｍＬの範囲である。

２つの刺激剤が使用される場合、２つの間の相対比は、１：１０、１：２０、１：５０、１：１００、１：１５０、１：２００、１：２５０、１：５００、１：７５０、１：１，０００、１：１０，０００、１：５０，０００、１：１００，０００、１００，０００：１、５０，０００：１、１０，０００：１、１，０００：１、７５０：１、５００：１、２５０：１、２００：１、１５０：１、１００：１、５０：１、２０：１、１０：１の比、および終点を含む列挙されるものの間の任意の比率の範囲であることができる。同様に、３つ以上の薬剤が使用される場合、それらの追加の薬剤と他の薬剤との間の比率は、前述の比率のいずれかを採用することができる。

以下でより詳細に議論されるように、実施形態に応じて、刺激分子は、増殖プロセス中の特定の時点で添加されるかまたは共培養プロセスを通して培地の成分として存在するように添加されることができる。

共培養および免疫細胞増殖の方法
いくつかの実施形態において、末梢血ドナー試料から単離されたＮＫ細胞は、４－１ＢＢＬおよびｍｂＩＬ１５を発現するように修飾されたＫ５６２細胞と共培養される。他のアプローチは他の膜結合型サイトカインの発現を伴う一方、複数の刺激分子を含むフィーダー細胞の生成は生成が困難な場合がある（例えば、所望のレベルの様々な刺激分子の発現、増殖中の適切なタイミングでの発現などを達成するために）。したがって、本明細書に開示されるいくつかの実施形態は、特定の時間における特定の濃度の様々な刺激剤による培地の補足に関する。いくつかの実施形態において、フィーダー細胞を培養容器に播種し、ほぼコンフルエントに到達させる。いくつかの実施形態において、次いで免疫細胞を、終点を含む列挙されるものの間の任意の密度を含む、約０．５×１０^６細胞／ｃｍ^２から約５×１０^６細胞／ｃｍ^２の範囲の所望の濃度で培養物に添加してもよい。

いくつかの実施形態において、免疫細胞は末梢血試料から分離される。その後、いくつかの実施形態において、免疫細胞を一緒に増殖させるか、またはＮＫ細胞などの単離された細胞の亜集団を使用してもよい。いくつかの実施形態において、臍帯血または他の血液源が、免疫細胞源として使用される。いくつかの実施形態は、免疫細胞の特定の集団または亜集団を使用する。いくつかの実施形態において、集団または亜集団は、培養で増殖する前に精製される。例えば、いくつかの実施形態において、精製されたＮＫ細胞が増殖に使用される。他の実施形態において、単核細胞（例えば、末梢血単核細胞または臍帯血単核細胞）が増殖に使用される細胞である。

その後、ＮＫ細胞はフィーダー細胞、所望により１つまたは複数のサイトカイン（培地中または外因性補足物として）で播種され、第１の期間、例えば約６時間、約１２時間、約１８時間、約２４時間、約２日、約３日、約４日、約５日、約６日、約７日、約８日、約９日、約１０日、約１１日、約１２日、約１３日、約１４日、または終点を含む列挙されるものの間の任意の時間、培養される。

実施例（例えば、実施例４を参照）においてさらに詳細に議論されるように、増殖される細胞は、新鮮な培地およびフィーダー細胞、ならびに所望により、培地を補足するために使用される刺激性サイトカインの１つまたは複数で「パルス」される。例えば、いくつかの実施形態において、増殖中の細胞を収集し、中にフィーダー細胞の新しい「バッチ」を有する培養容器に再播種する。増殖中の細胞は、新鮮な培地を含む新しい培養容器／フィーダー細胞に追加される。いくつかの実施形態において、共培養物に添加される培地も新鮮であり、所望により、増殖培地に最初に存在した刺激性サイトカインのいずれかを培地に補足することを含む（例えば、増殖の０日目）。本明細書で議論されるように、培地に添加される刺激性サイトカインの濃度は、前の増殖期と同じであるか、または所望により異なる濃度（より高いまたはより低い）であり得る。いくつかの実施形態において、増殖中の細胞は、増殖中に少なくとも１回追加でパルスされる。いくつかの実施形態において、増殖中の細胞は、２回、３回、４回、５回、６回、７回、８回、９回、１０回、またはそれ以上パルスされる。

いくつかの実施形態において、第１のパルスと第２のパルスの間の持続時間は、約５から７日である。いくつかの実施形態において、所与の第１のパルスと所与の第２のパルスとの間の持続時間は、約２日、約３日、約４日、約５日、約６日、約７日、約８日、約９日、約１０日、約１１日、約１２日、約１３日、または約１４日（または終点を含む、列挙されるものの間の任意の時間）である。実施形態に応じて、パルス間の期間は比較的一定であり、例えば、増殖の０日目と第１のパルスとの間の時間が約５日から約７日である場合、第１のパルスから第２のパルスまでの期間は約５日から約７日である。しかしながら、いくつかの実施形態において、例えば便宜上、または増殖中の細胞の健康状態の変化が観察されるまで、時間を調整してもよい。いくつかの実施形態において、パルス増殖は、増殖される細胞（ＮＫ細胞など）が増殖し続けて、最初の細胞カウントから少なくとも２０，０００倍の増殖を達成することを可能にする。いくつかの実施形態において、少なくとも約５０，０００倍の増殖、少なくとも約１００，０００倍の増殖、少なくとも約１５０，０００倍の増殖、少なくとも約２００，０００倍の増殖、少なくとも約２５０，０００倍の増殖、少なくとも約３００，０００倍の増殖、少なくとも約３５０，０００倍の増殖、少なくとも約４００，０００倍の増殖、少なくとも約４５０，０００倍の増殖、少なくとも約５００，０００倍の増殖、少なくとも約７５０，０００倍の増殖、で少なくとも約１，０００，０００倍の増殖、少なくとも約１，２５０，０００倍の増殖、少なくとも約１，５００，０００倍の増殖、少なくとも約１，７５０，０００倍の増殖、少なくとも約２，０００，０００倍の増殖、約２，５００，０００倍の増殖、または約３，０００，０００倍の増殖、または終点を含む列挙されるものの間の任意の程度の増殖など、より大きな増殖が達成される。いくつかの実施形態において、約４，０００，０００倍または約５，０００，０００倍を超える増殖が達成される。

いくつかの実施形態において、増殖開始時に増殖される免疫細胞の数に対する増殖終了時の増殖した細胞の数の比は、約１：２５，０００；約１：５０，０００、約１：１００，０００、約１：２００，０００、約１：５００，０００、約１：１，０００，０００、約１：１，５００，０００、約１：２，０００，０００、約１：２，５００，０００、または約１：３，０００，０００、または終点を含む列挙されるものの間の任意の比率である。

増殖の程度は、いくつかの実施形態において、増殖される細胞の開始数に対するフィーダー細胞の数の比を調整することによって調整してもよい。例えば、いくつかの実施形態において、１：１の比率が使用されるが、追加の実施形態において、約１：２、１：５、１：１０、１：２０、１：５０、１：１００、１：１，０００、１：１０，０００、１：５０，０００、１：１００，０００、１００，０００：１、５０，０００：１、１０，０００：１、１，０００：１、１００：１、５０：１、２０：１、１０：１、５：１、２：１、および終点を含む列挙されるものの間の任意の比率の範囲であることができる。いくつかの実施形態において、増殖の開始時の比率は、各後続のパルスについて同じおおよその比率に維持される。しかしながら、いくつかの実施形態において、比率は、例えば細胞の増殖速度を調整するために、より速い増殖速度が望まれるかより遅い増殖速度が望まれるかにかかわらず、経時的に変更される。

いくつかの実施形態において、第１の増殖の期間後、増殖した細胞（例えば、ＮＫ細胞）は、キメラ抗原受容体などの操作された構築物で形質導入される。任意の種類のキメラ抗原受容体は、それぞれが参照によりその全体が本明細書に組み込まれる国際ＰＣＴ出願ＰＣＴ／ＵＳ２０１８／０２４６５０、ＰＣＴ／ＩＢ２０１９／０００１４１、ＰＣＴ／ＩＢ２０１９／０００１８１、および／またはＰＣＴ／ＵＳ２０２０／０２０８２４、ＰＣＴ／ＵＳ２０２０／０３５７５２、米国仮出願第６２／９２４９６７、６２／９６０２８５、および／または６３／０３８６４５に記載のものを含む、ＮＫ細胞などの操作された細胞で発現させ得る。

ウイルス形質導入後、操作された細胞を、第２の期間、例えば、約６時間、約１２時間、約１８時間、約２４時間、約２日、約３日、約４日、約５日、約６日、約７日、約８日、約９日、約１０日、約１１日、約１２日、約１３日、約１４日、または終点を含む列挙されるものの間の任意の時間培養する。本明細書に提示される特定のデータは、ＮＫＧ２Ｄリガンド結合ドメイン（例えば、ＮＫＸ１０１）またはＣＤ１９（例えば、ＮＫ１９－１またはＮＫＸ１０１）を発現するキメラ受容体複合体のウイルス発現に関することに留意されたい。しかしながら、任意の適切なキメラ受容体またはキメラ抗原受容体を使用し得る。

ＩＬ１２および／またはＩＬ１８などの１つまたは複数の刺激剤による培地の補足は、培養プロセス中の任意の時点で生じ得る。例えば、培養の開始時、例えばゼロ時点（例えば、培養の開始時）に、１つまたは複数の刺激剤を添加し得る。１つまたは複数の剤を、２回目、３回目、４回目、５回目、またはそれ以上追加できる。その後の添加は、前の添加と同じ濃度であってもなくてもよい。複数の追加の間の間隔は、例えば、約１２時間、約２４時間、約３６時間、約４８時間、約７２時間、またはそれ以上の時間間隔、および終点を含むそれらの間の任意の時間で変化し得る。

刺激剤の複数回の添加が使用される場合、第１の補足添加の濃度は、第２の（および／または任意の補足添加）と同じかまたは異なる濃度であり得る。例えば、いくつかの実施形態において、複数の時点にわたる刺激剤の添加は、増加、減少、一定のまま、または複数の非等価濃度にわたって変化し得る。

いくつかの実施形態において、フィーダー細胞に対する増殖される細胞の特定の比率が使用される。例えば、いくつかの実施形態において、約５：１のフィーダー細胞：「標的」細胞比が使用される。いくつかの実施形態において、１：１の比率が使用される一方、追加の実施形態において、約１：１０、１：２０、１：５０、１：１００、１：１，０００、１：１０，０００、１：５０，０００、１：１００，０００、１００，０００：１、５０，０００：１、１０，０００：１、１，０００：１、１００：１、５０：１、２０：１、１０：１、および終点を含む列挙されるものの間の任意の比率の範囲であり得る。

実施例
実施例に開示される材料および方法は、本出願において提供される様々な実施形態に適用可能な材料および方法（試薬および条件を含む）の非限定的な例である。

実施例１－増殖条件の最初の評価
図１Ａは、増殖プロセスの非限定的な例を示す。この実施例において、刺激性サイトカインを０日目に添加し、同じ用量を４日目に再度添加し、これは本明細書で論じる特定の実施形態に使用した。図１Ｂは、本明細書で論じる特定の実施形態に使用された単回投与プロセスの非限定的な実施形態を表す。

図２は、様々な方法を用いたＮＫ細胞の増殖倍数に関するデータを示す。一番左のデータセットは、Ｋ５６２（ｍｂＩＬ１５および４－１ＢＢＬを発現する）フィーダー細胞のみを使用したＮＫ細胞の増殖を示す一方、右側の３つのデータセットのそれぞれは、培地に様々な濃度でＩＬ１２およびＩＬ１８を補足した場合の増加した増殖倍率を示す。任意の量の補助的なＩＬ１２およびＩＬ１８の存在により、ＮＫ細胞の増殖が有意に増加し、それによって追加の刺激剤がＮＫ細胞の増殖を増強できることが実証された。

図３Ａは、Ｋ５６２細胞単独（上段）またはＩＬ１２／１８補足のいずれかで増殖させた、４人の異なるドナーからのＮＫ細胞におけるＮＫＧ２Ｄの発現に関連するフローサイトメトリーデータを示す。（ＮＫＸ１０１で形質導入される細胞に関連する）右にシフトした曲線の高さが増加していることからわかるように、ＮＫＧ２Ｄの発現が大きくなっている。ＮＫＸ１０１の指定は、ＮＫＧ２Ｄ受容体のリガンドに結合できる切断されたＮＫＧ２Ｄ細胞外ドメインを発現する操作されたＮＫ細胞を指す。いくつかの実施形態において、短縮型ＮＫＧ２Ｄドメインは、ＣＤ８アルファヒンジおよびＣＤ８アルファＴＭドメインに結合される。いくつかの実施形態において、切断型ＮＫＧ２Ｄドメインは、ＯＸ４０共刺激ドメインおよびＣＤ３ゼータシグナル伝達ドメインに結合される。いくつかの実施形態において、構築物は、膜結合ＩＬ１５をさらに含む。いくつかの実施形態において、ＮＫＸ１０１は、配列番号１のヌクレオチド配列または配列番号２に示されるアミノ酸配列を有する。図３Ａは、ＮＫＧ２Ｄの増強された発現をさらに支持し、ここで、より大きな平均蛍光強度（ＭＦＩ）追加の可溶性ＩＬ１２／１８を使用すると、特定の細胞でＮＫＧ２Ｄがより多く存在することが示される。したがって、フィーダー細胞に可溶性ＩＬ１２／１８を補足すると、ＮＫ細胞の増殖が増強されるだけでなく、これらのＮＫ細胞によるキメラ受容体の発現も改善される。ＮＫ細胞の数が増えると、腫瘍などの望ましくない細胞を標的とする受容体が大量に発現するようになるため、これは予想外の利点である。

ＮＫ細胞を腫瘍に標的化するために、他の受容体を使用してもよい。例えば、いくつかの実施形態において、受容体は、腫瘍細胞上のＣＤ１９を標的とするキメラ抗原受容体である。いくつかの実施形態において、抗ＣＤ１９ ＣＡＲは、ＯＸ４０共刺激ドメインおよびＣＤ３ゼータシグナル伝達ドメインに結合されたＣＤ１９に結合するｓｃＦｖ（例えば、ＦＭＣ６３ｓｃＦｖまたはそのバリアント）を含む。いくつかの実施形態において、ＣＡＲをコードする核酸配列は、ＩＬ１５をさらにコードする。いくつかの実施形態において、ＩＬ１５は、膜結合形態で宿主細胞（例えば、ＮＫ細胞またはＴ細胞）によって発現されるように構成される。いくつかの実施形態において、ＣＡＲは、配列番号３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５または２７の配列に対して少なくとも９５％、９７％、９８％、９９％またはそれ以上の配列同一性を有するヌクレオチド配列によってコードされる。いくつかの実施形態において、ＣＡＲは、配列番号４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、または２８の配列と少なくとも９５％、９７％、９８％、９９％またはそれ以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を有する。いくつかの実施形態において、ＣＡＲはヒト化抗ＣＤ１９結合剤を使用する。

図４は、ＮＫ細胞を増殖させる場合の補足的な可溶性ＩＬ１２／１８の使用が実際にこれらの増殖したＮＫ細胞の細胞毒性の増強をもたらすデータを示す。図４は、ウイルス形質導入後１４日および２１日の２つの時点での２人の異なるドナーからのデータを示す。ＮＫ細胞の増殖に使用した培養条件は、可溶性ＩＬ１２／１８（破線）またはＫ５６２（４－１ＢＢＬおよびｍｂＩＬ１５を発現）のみ（実線）を使用したものであった。ＧＦＰ形質導入細胞を対照として使用した－ＮＫＸ１０１曲線は図４の矢印で示されている。データが示すように、Ｋ５６２細胞単独での増殖と比較して、ＩＬ１２／１８の使用は形質導入後２１日でＮＫ細胞の細胞毒性を増強する（下のパネル）。この特定の実験において、１４日目の効果は限定的であったが、いくつかの実施形態において、おそらくドナーおよび／または特定のＩＬ濃度に応じて、いくつかの実施形態において、ウイルス形質導入後１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、または２３日などのより早い時点で細胞毒性の増強が達成される。時間に関係なく、増殖プロセス中に可溶性インターロイキンを使用すると、増殖した細胞の細胞毒性が大幅に向上する可能性があることは予想外である。

いくつかの実施形態において、操作されたＮＫ細胞の細胞毒性の増加は、少なくとも部分的に、細胞が特定の表現型に向かって移動することに起因する。図５Ａおよび５Ｂは、経時的なＮＫ細胞記憶に関連する特定のマーカーに関連するデータを示す。図５Ａは、フィーダー細胞のみで増殖させるＮＫ細胞におけるＣＤ５７、ＮＫＧ２Ｃ、およびＣＤ６２Ｌの発現を示す。一方、図５Ｂは、フィーダー細胞と可溶性ＩＬ１２／１８の使用を示す。ＮＫＧ２Ｃ発現は、ＩＬ１２／１８で増殖されるＮＫ細胞で２１日目に上昇した。ＮＫＧ２Ｃは、サイトカイン誘導性ＮＫ細胞記憶のマーカーである。可溶性ＩＬ１２／１８を使用して増殖させるＮＫ細胞において、後の時点でＣＤ６７Ｌの増加も観察された。ＣＤ６７Ｌは、リンパ球の血管外遊出の増加と関連している（細胞活性の増加の証拠）。まとめると、これらのデータは、ＮＫ細胞の増殖中に可溶性インターロイキンを使用すると、ＮＫ細胞の抗原記憶に関連する様々なシグナル伝達経路を開始し、それらの抗原を有する細胞に対する細胞毒性を増強する能力があることを示唆している。

図６は、増殖培地を可溶性ＩＬ１２／１８で置き換えた場合と比較して、Ｋ５６２細胞のみを使用して基礎となるＮＫ細胞を増殖させる場合の、ＮＫＸ１０１を発現するＮＫ細胞の抗腫瘍効果に関するインビボデータを示す。動物モデルでは、０日目に４ｘ１０^６個のＳＮＵ４９９肝細胞癌細胞をマウスに投与し（腹腔内）、続いてＮＫＸ１０１を発現する３ｘ１０^６個のＮＫ細胞を、増殖培地を補足するＩＬ１２／１８ありまたはなしで（または対照）増殖させる。左のパネルに示すように、対照マウスは７日目にかなりの腫瘍負荷があり、腫瘍シグナルが存在し、一部のマウスでは１４日目および２１日目にわずかに増加した。画像の下にインビボ生物発光イメージング（ＢＬＩ）が示されている。右側のパネルは、ＮＫＸ１０１を発現するＮＫ細胞で行われた実験を示す。画像に示されているように、腫瘍量は７日目に存在していたが、１４日目までにほとんど検出されず、２１日目まではそのまま維持されていた。中央のパネルにおいて、ＮＫＸ１０１を発現するＮＫ細胞の実験画像が示されており、該ＮＫ細胞は可溶性ＩＬ１２／１８を使用して増殖されている。ＮＫＸ１０１の有効性がかなり高いため、ＩＬ１２／１８による改善効果を検出するのは困難な場合があるが、腫瘍負荷に対する効果は、少なくともＮＫＸ１０１細胞（「標準」増殖）と同じくらい効果的であった。それにもかかわらず、本明細書に開示されるいくつかの実施形態によれば、可溶性ＩＬ１２／１８を使用してＮＫ細胞増殖培地を補足すると、増殖が増強されるだけでなく、キメラ受容体発現が増強され、細胞毒性が増強される。

実施例２－増殖および有効性のさらなる評価
上述のように、本明細書に開示されるいくつかの実施形態において、１つまたは複数の可溶性刺激因子を使用して、ＮＫ細胞、Ｔ細胞、またはそれらの組み合わせなどの操作された免疫細胞の増殖および／または細胞毒性を増強する。本実施例のために実施された実験を、確立された増殖系と比較して、選択された刺激因子分子の様々な濃度の有効性を評価するために実施した。実施形態に応じて、他の刺激剤を使用してもよいが、この実施例では、可溶性インターロイキン１２および可溶性インターロイキン１８を使用した。これらのサイトカインを（以下に記載する様々な濃度で）添加し、得られた増殖した細胞を、膜結合型インターロイキン１５および４－１ＢＢＬを発現するように修飾されるＫ５６２細胞を使用して、増殖される細胞と比較した（それぞれの内容全体が参照により本明細書に組み込まれる米国特許第７，４３５，５９６号および第８，０２６，０９７号に詳細に記載される）。増殖した細胞を、増殖、サイトカイン分泌、細胞毒性、および表現型に関して評価した。

実験を、様々な条件を使用して増殖された複数のドナーからのＮＫ細胞を使用して設定した。ＮＫ細胞の１つの群を、ｍｂＩＬ１５発現フィーダー細胞（Ｋ５６２／４－１ＢＢＬ／ｍｂＩＬ１５）で増殖させた。ＮＫ細胞の別の群を、細胞表面にＩＬ１２およびＩＬ１８を発現するようにさらに修飾されたｍｂＩＬ１５発現細胞上で増殖させた。他の群全体で様々な培養条件を使用し、様々な濃度の刺激性サイトカインの効果を決定するために増殖アッセイを行った。たとえば、細胞の１つの群を、固定濃度のＩＬ１２（５ｎｇ／ｍＬ）と様々な濃度のＩＬ１８にさらした。追加の群を、別の固定濃度のＩＬ１２（２．５ｎｇ／ｍＬ）および様々な濃度のＩＬ１８に曝露した。可溶型のＩＬ１２およびＩＬ１８に曝露された培養物を、培養の０日目（そして再び４日目）にＩＬ１２／１８の用量に曝露したことに留意されたい。上述のように、０日目および４日目に可溶性サイトカインを添加して、図２～１８および図２３～２４に示すデータを生成する実験に使用した。他の実験において、可溶性サイトカインへの曝露を０日目のみに利用した。

図７Ａは、ＮＫ細胞の増殖に使用される様々な培養条件の概略表である。図７Ｂは、様々な条件に７２時間さらした後の細胞カウントに関するデータを示す。下のトレースからわかるように、任意の濃度でＩＬ１８を単独で添加すると、ＮＫ細胞の増殖に対する影響は限定的であった。対照的に、ＩＬ１２単独の添加は、用量依存的にＮＫ細胞の増殖を増加させた。様々な濃度のＩＬ１２（２．５ｎｇ／ｍＬまたは５ｎｇ／ｍＬのいずれか）の組み合わせにより、ＮＫ細胞の増殖がさらに増強され、これら２つのインターロイキン間の相乗的相互作用が示唆された。２．５ｎｇ／ｍＬおよび５ｎｇ／ｍＬでのＩＬ１２のデータは両方とも、ＩＬ１８が約０．１から約１ｎｇ／ｍＬの濃度で存在する場合にほぼ最大レベルが達成され、ロバストなＮＫ細胞増殖を示す。高濃度のＩＬ１８を添加しても、ＮＫ細胞の増殖を積極的に増強することができ、最高濃度の５０ｎｇ／ｍＬのＩＬ１８と５ｎｇ／ｍＬのＩＬ１２の組み合わせでは、２．５ｎｇ／ｍＬのＩＬ１２と比較してわずかに増殖が増強された。過飽和濃度のＩＬ１２またはＩＬ１８による増殖のデータはスケール外であり、表示されていない。

図８は、ＩＬ１２またはＩＬ１８のいずれかの濃度を変化させて７２時間培養した後のＩＦＮγ濃度に関連するデータを示す。データプロットは、選択したインターロイキンの濃度の増加に対するＩＦＮｇの濃度（ＥＬＩＳＡアッセイ中の吸光度によって測定）を表す。増殖データと同様に、ＩＬ１２の添加は、ＩＬ１８の添加と比較して、より多くのＩＦＮｇの産生をもたらした。とはいえ、増加する濃度のＩＬ１８を添加すると、ＩＦＮｇ産生が増加した。一方、ＩＬ１２は、試験したほぼすべての濃度でＮＫ細胞によるＩＦＮｇ産生を増加させた。増殖と同様に、いずれかの濃度のＩＬ１２と約１ｎｇ／ｍＬ（またはそれ以上）の濃度のＩＬ１８の組み合わせにより、ＩＦＮｇ産生が増強された。ＩＬ１２（いずれかの濃度）と約０．５ｎｇ／ｍＬ未満の濃度のＩＬ１８との組み合わせは、ＩＬ１２単独で達成されたものと同様のＩＦＮγ産生をもたらした。一方、約１ｎｇ／ｍＬ以上のＩＬ１８を含むことは、有意に増強したＩＦＮｇ産生をもたらし、ＮＫ細胞の相乗的刺激が再び示された。

図９Ａ～９Ｂは、示された培養条件における７日間の増殖後のＮＫ細胞（形質導入されていない）の増殖に関するデータを示す。第１の群は、ＩＬ１２（２０ｎｇ／ｍＬ）とＩＬ１８（２５ｎｇ／ｍＬ）の両方の飽和濃度を使用して増殖された。第２の群は、ＩＬ１２の飽和濃度（２０ｎｇ／ｍＬ）および亜飽和濃度のＩＬ１８（０．０５ｎｇ／ｍＬ）を使用して増殖された。第３の群は、ＩＬ１５、ＩＬ１２、およびＩＬ１８のそれぞれの膜結合型を発現するように操作されたフィーダー細胞を使用して増殖された（このフィーダー細胞株のさらなる詳細は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる国際特許出願番号ＰＣＴ／ＳＧ２０１８／０５０１３８７に見出され得る）。対照として、第４の群は、確立されたフィーダー細胞株（ｍｂＩＬ１５および４－１ＢＢＬを発現するＫ５６２細胞）で増殖させた。図９Ａは計算された増殖データを示し、図９Ｂは統計分析を示す。図９Ｃおよび９Ｄは、特定の滴定曲線およびＮＫ細胞の増殖に対するデータを表示す。図９Ｃは、ＩＬ１８を４ｎｇ／ｍＬで一定に保ちながら、様々な濃度のＩＬ１２のデータを示す。図９Ｄは、ＩＬ１２を変化させ、ＩＬ１８を２０ｎｇ／ｍＬとした同様のデータを示す。まとめると、これらのデータは、ＩＬ１２およびＩＬ１８の添加が、可溶性形式でもフィーダー細胞（ｍｂＩＬ１５を発現するＫ５６２細胞など）に結合した膜でも、ＮＫ細胞の増殖を有意に増強することを示す。興味深いことに、ＩＬ１２は、低濃度であっても、ＩＬ１８を含めることによってその活性が増強され、増殖の主要な駆動体であるように思われる（例えば、ＩＬ１８の飽和濃度および亜飽和濃度の同様の増殖数を参照されたい。これらのデータは、ＩＬ１２およびＩＬ１８の組み合わせがＮＫ細胞の増殖を強力に増強することを示す。

図１０Ａ～１０Ｂは、示された条件（および４０ＩＵ／ｍＬでのＩＬ２培地補足）での８日間の増殖後の形質導入されていないＮＫ細胞の細胞毒性データを示す。標的細胞は、１：１のエフェクター標的比のＲｅｈ急性リンパ球性白血病（非Ｔ；非Ｂ）細胞であった。培養条件に関係なく、すべての細胞が約４０％から約６５％の細胞毒性を示した。ＩＬ１２またはＩＬ１８を含まないｍｂＩＬ１５発現フィーダー細胞で増殖させた細胞は、最高度の細胞毒性を示し、可溶性ＩＬ１２／ＩＬ１８で培養したいずれの群よりも有意に高かった。膜結合ＩＬ１２およびＩＬ１８を含むフィーダー細胞の使用は、可溶性サイトカインを含むフィーダー細胞よりも高い程度の細胞毒性を示した。

図１１Ａ～１１Ｂは、１：１のエフェクター標的比でのＲｅｈ細胞に対する培養１５日目（４００ＩＵ／ｍＬ ＩＬ２濃度）での非形質導入ＮＫ細胞の細胞毒性データを示す。これらのデータは、テストされた群全体でより高い程度の細胞毒性を示すだけでなく、群間の差が限定的であることを示す。換言すれば、すべての群が、培養条件間に有意差がない程度に増加した細胞毒性を示す。いくつかの実施形態によれば、ＩＬ１２およびＩＬ１８の使用は、培養の初期部分における増殖に影響を与える経路またはシグナル伝達カスケードを誘導する。いくつかの実施形態において、その経路またはカスケード（または経路／カスケード）は、増強された細胞毒性に対して遅延効果を有する。いくつかの実施形態において、特定の刺激因子の使用は、記憶様表現型などのＮＫ細胞の表現型変化を誘導し、ＮＫ細胞を刺激して標的細胞に対して細胞毒性効果を発揮させる。いくつかの実施形態において、その表現型変化の誘導は、評価されるＮＫ細胞の特徴に応じて、認識されるまでに１～２、３～４、５～６、７～８日またはそれ以上かかり得る。

上記の実験は形質導入されていないＮＫ細胞で実施されたが、ＩＬ１２およびＩＬ１８を様々な濃度で含めると、ＮＫ細胞の増殖および細胞毒性を増強できることが実証された。キメラ受容体で形質導入されるＮＫ細胞を用いてさらなる実験を行った（ＧＦＰ形質導入細胞または非形質導入（ＮＴ）ＮＫ細胞と比較して）。非限定的な例として、使用されるキメラ受容体は、ＣＤ８αヒンジおよびＣＤ８αＴＭドメイン、ＯＸ４０共刺激ドメイン、ＣＤ３ｚｅｔａシグナル伝達ドメイン、および膜結合ＩＬ１５に結合された切断型ＮＫＧ２Ｄドメインを含む。図１２は、様々な条件下で培養された様々なドナーからのＮＫ細胞上のキメラ受容体の発現を評価するフローサイトメトリーデータを示す（４５＿４として示される）。図１２の左の列には、２人のドナーのｍｂＩＬ１５発現フィーダー細胞で培養されたＮＫ細胞のデータが示されている（上に２２７、下に７３２）。「４５＿４」として識別される曲線は、ＮＫＧ２Ｄのより大きな発現を示す（ＮＫＧ２Ｄ含有キメラ受容体で形質導入される細胞について予想されるように）。右の列は、ｍｂＩＬ１５発現フィーダー細胞で培養したＮＫ細胞の発現結果を示す。可溶性ＩＬ１２と可溶性ＩＬ１８は、０日目にそれぞれ２０ｎｇ／ｍＬおよび２５ｎｇ／ｍＬで培地に追加されている。図１３は、２人の追加ドナーの対応するデータを示す。図１２および図１３の両方のＭＦＩデータからわかるように、ＩＬ１２およびＩＬ１８の使用はＮＫＧ２Ｄ発現の増強をもたらし、特定の刺激因子がＮＫ細胞の増殖を強力に駆動できるという以前のデータをさらに裏付けている。これらのデータは、ＩＬ１２およびＩＬ１８などの刺激分子の使用が、形質導入されるＮＫ細胞と互換性があることも確認している。

刺激性サイトカインが形質導入ＮＫ細胞の増殖を増強することを確認したので、細胞毒性を評価した。図１４Ａおよび１４Ｂは、示された構築物で形質導入され、示された培養条件を使用して増殖されるＮＫ細胞の細胞毒性に関するデータを示す。群は次のとおりである：ｍｂＩＬ－１５発現フィーダー細胞で成長させるＧＦＰ形質導入ＮＫ細胞；ｍｂＩＬ－１５発現フィーダー細胞上で成長させ、ＩＬ１２およびＩＬ１８に曝露されるＧＦＰ形質導入ＮＫ細胞、ｍｂＩＬ－１５発現フィーダー細胞上で成長させるＮＫＸ１０１形質導入ＮＫ細胞およびｍｂＩＬ－１５発現フィーダー細胞上で成長させ、ＩＬ１２およびＩＬ１８に曝露されるＮＫＸ１０１形質導入ＮＫ細胞。標的細胞は、１：１のＥ：Ｔ比のＲｅｈ細胞であった。細胞毒性は、４人の異なるドナーからの細胞を使用して、増殖後１３日目に評価された。示されているように、ＧＦＰ形質導入およびＮＫＸ１０１形質導入ＮＫ細胞の両方が細胞毒性を示し、ＮＫＸ１０１発現細胞は標的細胞に対してより大きな効果を示した。使用した増殖培養条件に基づいて、有意差は検出されなかった（１４Ｂを参照）。

図１５Ａ～１５Ｂは、異なるＥ：Ｔ比が試験された２人のドナーからのさらなる細胞毒性データを示す。これらのデータは、図１４に示したものと一致するパターンを示す。図１５Ａは、第１のドナーの４つの培養条件のデータを示し、１５Ｂは、第２のドナーの対応するデータを示す。ドナー５４３（図１５Ａ）はサイトメガロウイルス陰性であり、ドナー２２４（１５Ｂ）はＣＭＶ陽性であったことに留意されたい。ＣＭＶ陽性の個体は、記憶様表現型を有するＮＫ細胞の亜集団を有し、このことはそれらが標的細胞に対するより迅速な反応を特徴とすることを意味する。１５Ａ～１５Ｂのデータは、増殖後１３日目に収集された。これらの曲線は上記のデータと類似しており、この比較的初期の時点では、ＩＬ１２／ＩＬ１８の有無によるＮＫ細胞による細胞毒性への影響は限定的である。図１５Ｃおよび１５Ｄは、同じドナー／条件からのデータを示すが、増殖後２１日目である。特に、ＩＬ１２／ＩＬ１８を使用すると、テストしたほとんどのＥ：Ｔ比で標的細胞に対する細胞毒性が増強される。これらのデータは、増強された細胞毒性の誘導に遅延があるという点で、形質導入されていないＮＫ細胞について上記で議論されたものと一致しているが、それは後の時点で検出可能である。前述のように、この効果は、ＮＫ細胞の表現型の変化を誘導するのに必要な時間による可能性がある。

図１６Ａ～１６Ｂは、経時的な異なる条件で培養されるＮＫ細胞の表現型の評価に関する。図１６Ａは、示された条件下での５週間の培養にわたるＮＫＧ２ＣおよびＣＤ６２Ｌ（Ｌ－セレクチン）の発現レベルを示す。ｍｂＩＬ１５発現フィーダー細胞を使用した場合、ＣＤ６２ＬまたはＮＫＧ２Ｃの発現レベルは５週間の培養で有意に変化しなかった。しかしながら対照的に、これらのフィーダー細胞を使用し、０日目に培地にＩＬ１２およびＩＬ１８を補足すると、ＮＫＧ２ＣとＣＤ６２Ｌの両方の発現に大きな影響があった。ＣＤ６２Ｌは、培養の１週間後にＮＫ細胞の約５０％に最初に存在していた。これは１週間後に増加したが、その後、ＣＤ６２Ｌ発現が大幅に低下し、４週間の培養では限られた検出しかできなかった。対照的に、ＮＫＧ２Ｃの発現は培養１週間後にわずかに増加し、ＮＫ細胞においてＮＫＧ２Ｃの発現が増加し、５週間後に細胞の４０％以上がＮＫＧ２Ｃを発現した。したがって、培養物は、５週間で、刺激性サイトカインなしで増殖されるＮＫ細胞と比較して上昇したＮＫＧ２Ｃを有し、刺激性サイトカインなしで増殖されるＮＫ細胞と比較して減少または同等のＣＤ６２Ｌ発現を有すると特徴付けることができる。図１６Ｂは、ＮＫ細胞による改変された記憶様表現型の発達を支持するさらなるデータを示す。図１６Ｂは、ｍｂＩＬ１５発現細胞（左の列）または０日目にＩＬ１２およびＩＬ１８を添加するｍｂＩＬ１５発現細胞（右の列）で培養される１４日目（上段）および２１日目（下段）のドナーＮＫ細胞のＦＡＣＳ分析による発現データを示す。ＣＤ５７の発現も示され、発現陽性の細胞のパーセンテージが比較的低いことから、ＮＫ細胞を培養するとそのマーカーの発現が失われる傾向が確認される（新鮮なＮＫ細胞はＣＤ５７の発現が高くなる）。ｍｂＩＬ１５の列に見られるように、ＮＫＧ２Ｃの発現（Ｘ軸）は大幅に変化していない。対照的に（矢印で示されるように）ＮＫＧ２Ｃを発現する細胞のパーセンテージは、可溶性ＩＬ１２および可溶性ＩＬ１８への最初の曝露後、さらに１週間培養すると４０％増加する。

図１７Ａ～１７Ｄは、示された条件下で培養１４日後のＮＫ細胞におけるマーカー発現に関連する概略データを示す。１７Ａに示されるように、この時点で、ＣＤ６２Ｌは、可溶性形式または膜結合形式のいずれであっても、ＩＬ１２およびＩＬ１８の使用によって増強される。上記で説明したように、この発現は培養時間が長くなるにつれて低下する。図１７Ｂは、１日目にＩＬ１２およびＩＬ１８を培地に導入した場合のＮＫＧ２Ｄ発現の増強を示す。他のデータと同様に、ＩＬ１８濃度を変化させる場合、ＮＫ細胞表現型に対する効果（増殖および細胞毒性など）はほぼ同等であることが注目される（例えば、ＩＬ１８の飽和または亜飽和濃度で効果が見られる）。ＣＤ５７発現レベルは、１７Ｄに示されるように、（新たに単離されたものではなく）培養される細胞を反映して、すべての条件下で比較的低かった。図１７Ｄは、ＣＤ６２ＬおよびＮＫＧ２Ｃの二重陽性マーカー発現を示し、培養物中のＩＬ１２およびＩＬ１８の存在により発現レベルが増強された。これらのデータは、ＩＬ１２およびＩＬ１８（可溶性でも膜結合型でも）と共に培養したＮＫ細胞の表現型が、より強力な記憶様表現型にシフトしていることを反映している。いくつかの実施形態において、この表現型は、ＮＫ細胞、特にキメラ受容体を発現するように操作されたものに、増強された増殖能力および／または増強された細胞毒性を付与し、より強力な癌免疫療法製品を作る。

図１８は、ＩＬ１２およびＩＬ１８の使用が、後の時点でも操作されたＮＫ細胞の細胞毒性を増強することを示す（増殖後２１日での細胞毒性を示す）。特に、図の中央の２点は、ＮＫＸ１０１を導入したＮＫ細胞を表し、どの群よりも最大の細胞傷害効果を示す。重要なことに、ｍｂＩＬ１５発現フィーダー細胞上で可溶性ＩＬ１２および１８とともに培養されたＮＫＸ１０１形質導入ＮＫ細胞は、標的細胞に対して最高度の細胞毒性を示す（非限定的な例として、ここでの標的はＲｅｈ白血病細胞であった）。したがって、いくつかの実施形態によれば、ＮＫ細胞の培養におけるＩＬ１２、ＩＬ１８、ＩＬ２１などの可溶性刺激因子の使用は、予想外に改善された細胞増殖（これは、臨床的に意味のある細胞数を産生することに非常に関連する）ならびに標的細胞に対する予想外に増強された細胞毒性を提供する。

実施例３－増殖、冷凍保存および細胞毒性の評価
本明細書に開示されるように、いくつかの実施形態において、増殖される操作されたＮＫ細胞は、自己シナリオで使用される。いくつかの実施形態において、同種異系アプローチが使用される。いくつかの実施形態において、ＮＫ細胞は、「既製品」となるように設計されており、これは、増殖および操作されたＮＫ細胞の既存の集団を指し、その後患者への投薬のために保存される。いくつかの実施形態において、保存は冷凍保存による。冷凍融解サイクルと同様に、細胞の生存率および活性が問題になる可能性がある。図１９は、培養開始時にｍｂＩＬ１５発現フィーダー細胞または可溶性ＩＬ１２／１８を補足したｍｂＩＬ１５発現フィーダー細胞で培養した３人の異なるドナーからのＮＫ細胞の特性に関するデータを示す。表の下の３行は、培養中のＮＫ細胞に対する可溶性ＩＬ１２および１８のプラスの影響を示す。増殖の６日後、ＩＬ１２／１８培地でのＮＫ細胞の生存率はわずかに高くなったが、ＩＬ１２／１８を使用した場合、総細胞数、したがって倍率増殖は著しく高くなった。

このデータに基づいて、細胞に抗ＣＤ１９キメラ抗原受容体を形質導入し、可溶性ＩＬ１２および１８の存在下または非存在下で培養した（ｍｂＩＬ１５発現フィーダー細胞を使用）。細胞の一部を冷凍保存し、対応する新鮮な細胞と比較した。ＦＡＣＳを使用して、ＮＫ細胞をＦＬＡＧ（ＮＫ１９－１構築物内のタグ、ただし、対応する非タグ化構築物が本明細書で提供されることを理解されたい）の発現について評価した。図２０に示すように、３人のドナーからのＮＫ細胞は、新鮮な細胞と冷凍保存された細胞の両方で、ＣＤ１９ ＣＡＲの発現を維持している。ＩＬ１２／１８の存在は、ＣＡＲ発現に限定的な影響を与えるようである。図２１は、増殖２２日目の同じドナーからの細胞を示す。興味深いことに、抗ＣＤ１９ ＣＡＲを発現する細胞のパーセンテージは、２１日目と比較して１４日目に減少した。２１日目の構築物の発現は、新鮮なＮＫ細胞（例えば、冷凍されていない）とほぼ同じであった（３－４行を７－８行と比較されたい）。これらのデータは、本明細書に開示される方法に従って培養されるＮＫ細胞がロバストな細胞の集団であり、冷凍保存を生き残り、生存率を維持し、細胞毒性誘導構築物の有意な発現レベルを維持してもよいことを示す。

ＮＫ細胞に対する冷凍保存の効果のさらなる分析が行われた。Ｎａｌｍ６－ｎｕｃｌｅａｒＲｅｄ細胞株を標的細胞として使用し、抗ＣＤ１９ ＣＡＲを発現するＮＫ細胞株によって標的にされた。非限定的な例として、この実験において、配列番号１によってコードされるＣＡＲを使用した。アッセイの結果を図２２Ａ～２２Ｂに提供する。図２２Ａは、アッセイ時間にわたる細胞カウント曲線（３人のドナーの平均）を示す。示されているように、形質導入されていないＮＫ細胞およびＮａｌｍ６細胞単独では、同様の程度のＮａｌｍ６標的細胞の増加を示す。可溶性ＩＬ１２／１８で増殖させる非形質導入ＮＫ細胞は、わずかな細胞毒性効果を示した（ウェル曲線あたりの細胞カウントの下方シフト。特に、培養１４日目に冷凍保存した細胞は、Ｎａｌｍ６細胞に対して有意な細胞毒性効果を示し、成長を制限した）。重要なことに、可溶性ＩＬ１２／１８を含む培養で増殖させた１４日目の冷凍保存細胞は、Ｎａｌｍ６細胞の増殖を完全に制限した。いくつかの実施形態において、長期間増殖させた細胞（新鮮または冷凍保存のいずれか）も、有意に腫瘍増殖を減少させる。１４日目の概略データを図２２Ｂに示す。形質導入されていないＮＫ細胞に関しては、培養０日目に可溶性ＩＬ１２／１８を添加したＮＫ細胞の増殖は、標的に対するＮＫ細胞の細胞毒性を有意に増加させた．腫瘍細胞．同様のデータがＣＡＲを発現するＮＫ細胞について示されている。標的細胞に対してほぼ８０％の細胞毒性をもたらすＣＡＲが存在する場合でも、ＣＡＲを発現するＮＫ細胞を可溶性ＩＬ１２／１８と共に培養すると、細胞毒性が大幅に増強された。図２２Ｃは、様々なＥ：Ｔ比での増殖中の培地中のＩＬ１２／１８の存在下または非存在下で培養されるＮＫ細胞についての追加の細胞毒性データを示す。示されるように、抗ＣＤ１９ ＣＡＲの非限定的な実施形態を発現するように操作された細胞は、ほぼすべてのＥ：Ｔ比で増強された細胞毒性を示す。標的細胞の数が増加するにつれて、本明細書に開示されるように、ＩＬ１２およびＩＬ１８を使用して増殖されるＮＫ細胞の細胞毒性は、フィーダー細胞のみで増殖した細胞と比較して、高い細胞毒性効果を示す。まとめると、これらのデータは、培地でのＩＬ１２／１８の使用がＮＫ細胞の増殖の増強と細胞毒性の増強をもたらすという証拠を提供する。さらに、これらのデータは、細胞が冷凍保存された後でも、細胞の活性が保持されているという重要な追加の証拠を提供する。このデータは、いくつかの実施形態によれば、ロバストな抗腫瘍効果を有する「冷凍庫から」操作されたＮＫ細胞産物が生成されたことを示す。

図２３は、肝細胞癌細胞をドナーマウスに注射し、様々な培養条件を用いて増殖させるＮＫ細胞を投与するインビボ実験の模式図を示す。その後、生物発光を使用して腫瘍量をモニターする。投与された細胞は、１日目に可溶性ＩＬ１２／ＩＬ１８を添加した培地中で増殖させる非形質導入ＮＫ細胞、ＩＬ２を添加して増殖させるＮＫＸ１０１を発現するＮＫ細胞、または１日目に可溶性ＩＬ１２／ＩＬ１８を添加した培地中で増殖させるＮＫＸ１０１を発現するＮＫ細胞のいずれかである。全ての細胞は、ｍｂＩＬ１５発現フィーダー細胞で成長させた。図２４は、経時的な腫瘍負荷分析の結果を示す。対照動物、ならびに形質導入されていないＮＫ細胞を受けた動物は、経時的な中程度の腫瘍増殖を示した。対照的に、ＮＫＸ１０１を発現するＮＫ細胞を受け、ＩＬ１２／１８またはＩＬ２とともに成長した動物は、有意に高い抗腫瘍効果を示した。腫瘍量は両方の群で減少したが、ＩＬ２群では１４日目から２１日目にわずかに増加しただけであった。これらのデータは、培養ＮＫ細胞の細胞毒性を増強するために、増殖培地にＩＬ１２、ＩＬ１８、またはＩＬ２１などの刺激性サイトカインを使用することをさらに裏付けている。

図２５は、今回はＮａｌｍ６細胞の異種移植片および抗ＣＤ１９ ＣＡＲを発現するＮＫ細胞での処理による同様の実験設定を示す。図２６Ａは、得られた生物発光データを示す。以前の実験と同様に、対照動物および形質導入されていないＮＫ細胞を受けた動物は、腫瘍量の急速な増加を示したが、後の時点に向かって減少した。ＮＫ１９－１（抗ＣＤ１９ ＣＡＲ）を発現するＮＫ細胞を受けた動物は、腫瘍増殖の効果的な遅延を示し、後の時点まで有意な増加を制限した。ＮＫ１９－１を発現し、ＩＬ１２／１８で増殖させた細胞は、腫瘍増殖の顕著な制御を示し、実験の後期段階まで増加を制限し、その後でも他の群と比較して著しく低い全体的な腫瘍量であった。生存に関するさらなるデータを図２６Ｂに示す。ＰＢ（対照）またはＮＴＮＫ細胞を受けたマウスは、約３０日で生存率が急速に低下した。ＮＫ１９－１を受けた動物は、これらの群よりも長く生存し、ＮＫ１９－１ＩＬ１２／１８動物は、他のすべての群に生存するものがいなくても、８０％生存していた。図２６Ｃおよび２６Ｄは、ＩＬ１２／１８を添加した培地中で培養される場合のインビボでのＮＫ細胞の持続性に関するデータを示す。図２６Ｃは、全マウス末梢血中のヒトＣＤ５６^＋細胞（ＮＫ細胞のマーカー）のパーセンテージの尺度を示す。示されているように、可溶性ＩＬ１２／１８を使用したＮＫ細胞の増殖は、投与後１８日であっても、マウス血液内のヒトＮＫ細胞のパーセンテージを有意に増強する。これは、増殖中に刺激性サイトカインを使用することにより、ＮＫ細胞に付与された持続性の向上を証明している。同様に、一般にインビボで持続するのはＮＫ細胞だけではないが、ＣＡＲを発現する細胞は、可溶性ＩＬ１２／１８（または他の刺激分子）を使用することで持続性が向上する。図２６Ｄは、異種移植片レシピエントマウスにおける注射の１８日後の抗ＣＤ１９ ＣＡＲ陽性ＮＫ細胞のパーセンテージを示す（全マウス末梢血細胞カウントのうち）。前の図と同様に、これらのデータは、キメラ抗原受容体を発現するＮＫ細胞などの遺伝子操作された免疫細胞が、少なくとも１つの刺激性サイトカインを使用して増殖させると、インビボでの持続性が高まることを示す。ＮＫ細胞によるＣＡＲの発現に対する増殖培養および冷凍保存（またはその欠如）において使用されるサイトカインの効果を評価するために、追加の実験を実施した。図２６Ｅは、培養１５日目において、抗ＣＤ１９ ＣＡＲの非限定的実施形態の発現が、サイトカインを増殖培養に使用した場合に変化しないことを示す。すなわち、１つまたは複数の追加の刺激分子を使用する増殖培養に基づいて本明細書で実証される増強された効果は、減少したＣＡＲ発現によって相殺されない。さらに、ＮＫ細胞の冷凍保存は、操作されたＮＫ細胞によるＣＡＲの発現に悪影響を与えない。図２６Ｆは、ＣＡＲ発現が培養のさらなる時間後に侵食されないことを確認する。これらのデータは、ＩＬ１２やＩＬ１８などの刺激性サイトカインの影響下で増殖されるＮＫ細胞による細胞毒性の増強、持続性、および安定したＣＡＲ発現を再度裏付けている。同様に、操作されたＮＫ細胞の冷凍保存は、これらの有益な特性に大きな悪影響を与えない。

実施例４－細胞毒性、ＮＫ細胞の特徴、およびＮＫ細胞の生存に対する冷凍保存および増殖の影響を評価するための追加の実験
冷凍保存とそれに続く解凍のプロセスが、操作されたＮＫ細胞の生存率、持続性、または細胞毒性を低下させることなどによって、操作されたＮＫ細胞に悪影響を与えるかどうかを決定するために、追加の実験を行った。図２７Ａは、使用した模式的実験プロトコル、ならびに使用した実験群および他の条件を示す。上記のように、「ＩＬ１２／ＩＬ１８」と表示された処置群については、本明細書に記載の実施形態に従って、可溶性ＩＬ１２および／またはＩＬ１８の存在下で細胞を増殖させた。処置群は、対照として新鮮な形質導入されていないＮＫ細胞（Ｇ１）およびＰＢＳ（Ｇ２）を含む。実験群は、抗ＣＤ１９ ＣＡＲの非限定的な実施形態を発現するように操作され、追加の刺激性サイトカインなし（Ｇ３）およびあり（Ｇ４）で増殖される冷凍保存および解凍されたＮＫ細胞ならびに抗ＣＤ１９ ＣＡＲの非限定的な実施形態を発現するように操作され、追加の刺激性サイトカインなし（Ｇ５、Ｇ６）およびあり（Ｇ７、Ｇ８）で増殖される新鮮なＮＫ細胞を含んだ。採血および画像化は、図２７Ａに示した時点で行った。

図２７Ｂおよび２７Ｃは、示された実験群からのインビボ生物発光イメージングを示す。図２８Ａ～２８Ｈは、経時的な生物発光強度を反映する折れ線グラフを示す。これらのデータは、処置後最初の３０日間を示す図２８Ｉ、および５６日間のデータを示す図２８Ｊにまとめられている。図２８Ｉは、ＣＤ１９ ＣＡＲを発現するＮＫ細胞と２つの対照群との間の明確な違いを示すが、実験群のそれぞれは、実験の最初の３０日間にわたって測定されるＢＬＩの検出不可能な増加に限定されていることを示す（増加したＢＬＩは、増加した腫瘍成長を示す）、これは腫瘍成長の制御を示す。図２８Ｊは、５６日間のデータを示しており、様々なＣＡＲ構築物を発現し、腫瘍細胞の増殖を阻害する際に示された条件下で処理された実験群がより大きく分離している。対照群（Ｇ１およびＧ２）は腫瘍増殖の有意な増加を示し、これらの群の実験は３０日で終了した。抗ＣＤ１９ ＣＡＲを発現する新鮮なＮＫ細胞を受け取り、可溶性インターロイキンを使用せずに増殖させた群（Ｇ５）は、３０日から５６日の間にＢＬＩの急激な増加を示した。この群の別の実験的複製（Ｇ６）は、腫瘍増殖を阻害するより顕著な能力を示した。抗ＣＤ１９ ＣＡＲを発現する冷凍ＮＫ細胞を受け、可溶性インターロイキン（Ｇ３）を使用せずに増殖させた群でも、３０日目から５６日目の間にＢＬＩの増加が示されたが、新鮮な細胞で検出されたほどではなかった。新鮮であるか冷凍されているかにかかわらず、（本明細書に開示される実施形態に従って）増殖中に追加の刺激因子を使用して増殖された抗ＣＤ１９ ＣＡＲ発現ＮＫ細胞を受けた実験群は、腫瘍増殖の最もロバストな防止を示した。特に、どちらも冷凍保存されたＮＫ細胞である群４および８は、腫瘍増殖の最大の阻害を示した。新鮮な操作されたＮＫ細胞が投与されたときに収集されるデータと組み合わせると、これらのデータは、いくつかの実施形態によれば、抗ＣＤ１９ ＣＡＲを発現する操作されたＮＫ細胞が、新鮮な状態で調製および投与される場合以外にも、調製、冷凍、次いで解凍および投与される場合にも有効であることを示している（例えば、特定の同種異系の実施形態におけるように）。

図２９は、５６日間の実験にわたって示された構築物で処置されるマウスの体重の折れ線グラフを示す。体重の減少は腫瘍増殖の増加と相関しており、例えば、腫瘍の進行はマウスの健康状態の低下、および対応する体重の減少（例えば、消耗）をもたらす。示されているように、対照群は３０日までに体重の大幅な減少を示すが、実験群の１つを除くすべてが、実験の大部分で体重が増加している。上記の生物発光データと同様に、新鮮な調製物および冷凍した調製物の多くが体重に対して実質的に同様の効果を示すという顕著な傾向がある。いくつかの実施形態によれば、抗ＣＤ１９ ＣＡＲを発現する操作されたＮＫ細胞は、新たに調製および投与された場合以外にも有効である。さらに、いくつかの実施形態によれば、抗ＣＤ１９ ＣＡＲを発現する操作されたＮＫ細胞は、調製、冷凍、解凍、および投与された場合以外にも（例えば、同種異系の場合のように）有効である。

１つまたは複数の追加の刺激因子を使用して、または使用せずに増殖させるＮＫ細胞の特徴を特徴付けるために、追加のデータを収集した。図３０Ａは、培養中のＮＫ細胞の寿命（例えば持続性）に関するデータを示す。これらのデータは、（活性化キメラ受容体（ＡＣＲ）陽性に基づいて）操作されたＮＫ細胞のパーセンテージを示す（ＣＤ５６陽性に基づく）。これらのデータは、増殖中にＩＬ１２および／またはＩＬ１８などの追加の刺激因子ありまたはなしで増殖されるＮＫ細胞がインビボで同様の持続性プロファイルを示し、かかる操作されたＮＫ細胞は血液中に比較的一定のレベル（約５～１０％）で約７日間存在することを示します。再度、操作されたＣＡＲの発現およびＣＤ５６陽性の検出に基づいて測定して、動物の血液中に存在するＮＫ細胞のパーセンテージを約５０日間にわたって測定し、そのデータを図３０Ｂに示す。７日間にわたる同様のプロファイルとは対照的に、１つまたは複数の追加の刺激因子を使用せずに増殖されるＮＫ細胞は、約２５～３０日後に数が減少し始めた。これらの細胞は、細胞数がゼロに近づいた約４８日までゆっくりと数が減少し続けた。約２５～３０日の同じ時点から、操作されたＮＫ細胞は、追加の刺激因子（例えば、いくつかの実施形態によれば、ＩＬ１２および／またはＩＬ１８）で増殖し、約１０％で４５日間血中に存在し続けた。過去３日間だけ、わずかに減少した（約５～７％まで）。これらのデータは、ＩＬ１２、ＩＬ１８、および／またはＩＬ２１などの１つまたは複数の追加の刺激分子の使用が、かかる刺激分子を使用せずに培養／増殖されるＮＫ細胞と比較して、操作されたＮＫ細胞にインビボでの持続性を増強することを示す強力な指標である。図３０Ｃは、１０，０００個のカウントされた生細胞あたりの操作されたＣＡＲ発現ＮＫ細胞の数のカウントに基づいて、持続データを異なる方法で提示する。これらのデータは、図３０Ｂに示す一般的な傾向を反映している、つまり、１つまたは複数の刺激分子（例えば、可溶性ＩＬ１２および／または可溶性ＩＬ１８）を使用して増殖される細胞は、かかる刺激分子なしで増殖される操作されたＮＫ細胞と比較して長期間にわたってより多くの数で血中に留まる。いくつかの実施形態において、本明細書に開示される方法は、特定のサイトカインに基づく増殖方法に共通するサイトカイン中毒を回避するという点で特に有利である。いくつかの方法において、高濃度の可溶性サイトカインを使用すると細胞の増殖が増強されるが、細胞は、患者への投与時など人工的な条件のない環境にさらされる場合、それらの濃度に慣れて成長し、離脱の兆候（例えば、アポトーシス、生存率の低下、またはその他の機能の低下）を示す。本明細書に開示される方法に従って増殖される操作されたＮＫ細胞によって示される継続的な高いサイトカイン濃度に対する必要性の欠如は、インビボでの細胞のより長い寿命（および活性寿命）に、少なくとも部分的に寄与する。

図３１Ａ～３１Ｃは、本明細書に開示される実施形態に従って産生される操作されたＮＫ細胞を特徴付ける追加のデータを示す。これらのデータは、抗ＣＤ１９ ＣＡＲを発現する新鮮な（冷凍保存されていない）操作されたＮＫ細胞を投与され、本明細書に開示されるいくつかの実施形態に従って、可溶性ＩＬ１２および可溶性ＩＬ１８を使用して増殖される３匹のマウス（投与後５１日目）の血液から収集される。データは、ＣＤ５６陽性（ＮＫ細胞の指標）およびＣＤ１９－Ｆｃ陽性（操作された抗ＣＤ１９ ＣＡＲを発現する細胞の指標）である全血試料からの細胞のパーセンテージを示す。図３１Ａ、３１Ｂ、および３１Ｃのそれぞれに示されるように、二重陽性細胞（右上の四角で囲まれた領域）のパーセンテージは、約４．７５％から約６．７％の範囲である。図３２Ａ～３２Ｃは、図３１と同じマウスからの全血の分析を示すが、ＣＤ１９－Ｆｃ陽性（操作された抗ＣＤ１９ ＣＡＲを発現する細胞を示す）およびＣＤ３陽性（Ｔ細胞を示す）である細胞を同定する。これらのデータは、抗ＣＤ１９ ＣＡＲを発現する細胞の大部分がＣＤ３陰性であることを示す。これは、それらがＴ細胞ではないことを意味する。いくつかの実施形態によれば、特定のＮＫ細胞産生方法は、最初のドナー全血試料からＴ細胞を除去する工程を含むが、公称数のＴ細胞が残る可能性がある。しかしながら、いくつかの実施形態において、図３１Ａ～３２Ｃに示されるデータに従って、抗ＣＤ１９ ＣＡＲを発現する操作された細胞の大部分は、ＮＫ細胞の特徴を示し（ＣＤ５６陽性）、Ｔ細胞の特徴を示さない（ＣＤ３陰性）。

図３３、３４、および３５は、腫瘍接種後の様々な時点での動物の全血からの細胞をさらに特徴付けるデータに関する。図３３は投与後４日目のデータに関するものであり、図３４は腫瘍接種後１２日目のデータに関するものであり、図３５は腫瘍接種後１８日目のデータに関するものである。これらのデータは、対照として処置され、形質導入されていないＮＫ細胞（ＮＴＮＫ）またはＰＢＳのいずれかを受けた動物の全血からの、または各条件についての新鮮および冷凍処置群とともに培養中のＩＬ２または培養中のＩＬ１２／１８で増殖された操作されたＮＫ細胞を受けた他の群のものからの細胞に関連している。図３３Ａは、４日目の動物の全血からのＮＫ細胞（ＣＤ５６－ｐｏｓ／ＣＤ３－ｎｅｇ）のパーセンテージを示す。各処置群は、この点に関して比較的類似しており、全血中の細胞の約３～５％が操作されたＮＫ細胞であった。図３３Ｂは、抗ＣＤ１９－ＣＡＲの非限定的な実施形態を特異的に発現する細胞のパーセンテージに関するデータを示す。図３３Ａと同様に、各処置群における抗ＣＤ１９－ＣＡＲ発現細胞のパーセンテージは、約３～５％の範囲である。図３３Ｃは、投与後４日目に血液中に存在するＧＦＰ陽性腫瘍細胞のパーセンテージに関するデータを示す。前の図に示されているＢＬＩイメージングと一致して、どの処置群でも検出可能な腫瘍細胞の存在はほとんどない。検出された低信号は、循環から様々な組織へのＧＦＰ＋腫瘍細胞の移動を反映していてもよい（ＢＬＩイメージングによってそれらを潜在的に検出可能にするが、血液試料自体においてはそうではない）。図３４Ａ～３４Ｃは、腫瘍接種の１２日後の対応するデータを示す。初期の時点でそうであったように、各処置群は、試料中の血液細胞の約３％～５％がＮＫ細胞であった（図３４Ａ）。図３４Ｂは、抗ＣＤ１９ ＣＡＲ構築物について陽性の細胞のパーセンテージを示す。この時点での発現レベルは処置群全体で類似していたが、各実験群は対照群よりも顕著なレベルで存在していた。また、１２日目には、抗ＣＤ１９を発現するＣＡＲ細胞（例えば、ＮＫ細胞）のパーセンテージがわずかに高くなり（血球の約７～９％）、循環中の操作された細胞の持続性の増加が示唆された。図３４Ｃは、全血中の腫瘍細胞の数を示す。興味深いことに、すべての群は、特に対照で増加した発光を示すＢＬＩイメージングにもかかわらず、ほとんどＧＦＰ発現を示さない。繰り返しになるが、これらのデータは、特定の浮遊腫瘍細胞が示す生理学的な「滞留性」を反映していてもよい。

図３５Ａは、腫瘍接種後１８日でのＮＫ細胞のパーセンテージ（ＣＤ５６陽性に基づく）を示す。実験群はすべて、全血中の細胞の約１５％から約２５％の範囲で、対照群と比較して著しく高いパーセンテージを示す。この増加したパーセンテージは、図３０Ｂおよび３０Ｃに示すように、ＮＫ細胞の増加の時間ウィンドウと一致している。この特定の実験において統計的に異なるわけではないが、これらのデータは、ＩＬ１２／ＩＬ１８培地中で増殖し、冷凍保存されるＮＫ細胞が実験群の中で最も生産的（ｐｒｏｌｉｆｉｃ）であることを示す。いくつかの実施形態によれば、フィーダー細胞＋サイトカインベースの増殖は、冷凍保存と相まって、より正常なサイトカイン条件下で（例えば、サイトカイン中毒なしで）生存することができ、健康状態でより長期間持続してもよい、よりロバストなＮＫ細胞をもたらす。図３５Ｂおよび３５Ｃは、１８日目の腫瘍負荷の２つの測定値を示す。図３５Ｂは、抗ＣＤ１９ ＰＥ結合抗体を使用して測定される、ＣＤ１９（この非限定的な実施形態における操作されたＣＡＲの標的）に対して陽性である血液中の細胞のパーセンテージを示す。これらのデータは、対照群の腫瘍負荷が上昇傾向にあることを示しており、対照的に、処置群の遺伝子操作されたＮＫ細胞が腫瘍増殖を制限する能力を示す。図３５Ｃは同様のデータを示すが、ＧＦＰシグナル（例えば、～ＢＬＩ）の検出によるものである。これらのデータは、ＰＥ対ＧＦＰベースの検出の感度により３５Ｂのデータとは異なるが、同様の傾向を示す。実験用のＮＫ細胞は、対照と比較して、腫瘍細胞の増殖を防ぐ能力が高いことを示す。図３５Ｄは、操作された抗ＣＤ１９を発現しているＮＫ細胞の数に関するデータに関する（例えば、ＣＤ５６およびＣＤ１９Ｆｃ陽性）。図３５Ａのデータと同様に、これらのデータは、血液試料中のＮＫ細胞のパーセンテージの増加が、操作された抗ＣＤ１９ ＣＡＲを発現するＮＫ細胞であることを示しており、それらの持続性の向上を反映している。図３５Ｅは、ＣＡＲに対して陽性である各実験群のＮＫ細胞のほぼ全集団が、本明細書に開示される抗ＣＤ１９ ＣＡＲを発現するように操作されたＮＫ細胞であることを確認するデータを示す。

本明細書に開示される実施形態に従って増殖される操作されたＮＫ細胞の持続性をさらに調査するために、本明細書に開示される可溶性サイトカインを使用して増殖される操作されたＮＫ細胞の２用量がマウスに投与され、細胞数がさらに４週間にわたって追跡された（図２７Ａによる投与プロトコル）。図３６は、これらのデータのボックスプロットを示す。簡単に言うと、ボックスプロットのＸ軸は、ｉ）３回目の投与後の時間、またはｉｉ）腫瘍接種からの合計時間（括弧内に表示）のいずれかの２つの形式で時間を表す。Ｙ軸は、抗ＣＤ１９ ＣＡＲ発現ＮＫ細胞の数（１０，０００個の白血球あたり）を表す。２００万個のＮＫ細胞用量のボックスプロットはボックスの下のトレース（破線の矢印で示される）であり、５００万個の細胞用量は上のトレース（実線の矢印で示される）である。これらのデータは、１つまたは複数の刺激分子（ＩＬ１２および／またはＩＬ１８など）が（本明細書のいくつかの実施形態で説明されるようにフィーダー細胞と併せて）使用される条件で増殖される操作されたＮＫ細胞の半減期が、フィーダー細胞のみの条件で拡張された操作されたＮＫ細胞と比較して延長されることを示す。２００万の操作されたＮＫ細胞用量の半減期は、～１５日である。クリアランスおよび／または分布容積の１つまたは複数の分散に基づくと、５００万個の操作されたＮＫ細胞用量の半減期は、～１８日である。これらは、図３７に示されている、１つまたは複数の追加の刺激分子を使用せずに増殖させた別の操作されたＮＫ細胞の用量とは対照的であり、５００万個の細胞の用量で約５日の半減期を示す。したがって、本明細書に開示されるいくつかの実施形態によれば、フィーダー細胞系と併せて、１つまたは複数の追加のサイトカインを使用する操作されたＮＫ細胞の増殖は、ＮＫ細胞の増殖の増加を可能にし、それらの細胞に増強された持続性および／または細胞毒性を与える。

実施例５－マルチパルスフィーダー細胞および増強ＮＫ細胞増殖
本明細書に開示される実施形態は、ＮＫ細胞のロバストな増殖をもたらすが、増殖したＮＫ細胞に付与される有利な特徴を維持し、および／または有害な影響または細胞の特徴を最小限に抑えながら、より大きな程度の増殖が達成され得るかどうかを決定するために、追加の実施形態が評価された。ＮＫ細胞を、４０単位／ｍＬのＩＬ２を添加した培地中でフィーダー細胞と１：１０の比率で播種した（ここで、フィーダー細胞の非限定的な例として、膜結合型ＩＬ１５および４－１ＢＢリガンドを発現するＫ５６２細胞を使用した）。ＮＫ細胞は、臍帯血または末梢血から得た。ＮＫ細胞を、０日目から開始して約３週間培養し、７日目および１４日目に新しいフィーダー細胞および培地で再度パルスした。増殖した細胞は、７、１４、２２、２９日目にカウントされた。増殖の結果を図４１Ａにグラフで示し、図４１Ｂに数値でまとめた。増殖される各試料は、２２日目に細胞数のピークに達し、２９日目までほぼ同じ数を維持した。これらのデータは、細胞増殖が約１００，０００倍から１００万倍以上の範囲であることを示す（末梢血からのＮＫ細胞について）。

本明細書で考察するように、いくつかの実施形態において、培地にＩＬ１２またはＩＬ１８の１つまたは複数を補足する。かかる実施形態に関するさらなる情報は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる２０２０年７月２９日に出願された国際ＰＣＴ特許出願番号：ＰＣＴ／ＵＳ２０２０／０４４０３３に開示されている。複数パルス増殖形式で使用される場合のこれらの効果を調べるために、培地に４０ＩＵ／ｍＬのＩＬ２および２０ｕｇ／ｍＬ ＩＬ１２を添加し、臍帯血または末梢血のいずれかからのＮＫ細胞を０、７、および１４日目にパルスし、７、１４、２２、および２９日目にカウントした場合を使用した。増殖の結果を図４２Ａにグラフで示し、図４２Ｂに数値でまとめた。興味深いことに、細胞増殖はいくつかの試料で２２日目にピークに達したが、１人のドナーからの末梢血において２９日目にピークに達した。これらのデータは、ＩＬ１２が特に末梢血からのＮＫ細胞の増殖を増強できることを示す。

同様に、培地に０．０５ｎｇ／ｍＬ ＩＬ１８（および４０ＩＵ／ｍＬ ＩＬ２）を補足することによって、ＩＬ１８の効果を調査した。増殖の結果を、図４３Ａにグラフで示し、図４３Ｂに数値でまとめた。これらのデータは、ＩＬ１８が、臍帯血および末梢血由来のＮＫ細胞の両方について実質的な細胞増殖を増強できることを示す。１人のドナーは、７日目および１４日目（および培養開始時）に最初のＮＫ細胞をパルスした結果、２０００万倍を超えるＮＫ細胞の増加を示した。

図４４Ａおよび４４Ｂは、臍帯血由来または末梢血由来のＮＫ細胞を、新しいフィーダー細胞およびＩＬ１２（２０ｎｇ／ｍＬ）およびＩＬ１８（０．０５ｎｇ／ｍＬ）の両方（ならびに４０ＩＵ／ｍＬのＩＬ２）を補足した培地でパルスする結果を示す。ＮＫ細胞は、７日目および１４日目（および培養開始時）にパルスされ、７、１４、２２、および２９日目にカウントされた。興味深いことに、これらのデータは、３パルスアプローチでは、ＩＬ１２およびＩＬ１８を補足した培地の組み合わせが減少した細胞増殖をもたらしたことを示しており、それはおそらくＩＬ１２、ＩＬ１８、およびＩＬ２の反復提示によって細胞が過剰に刺激されたかまたは増殖枯渇に追い込まれたことを示唆する。これは、２０２０年７月２９日に出願された国際ＰＣＴ特許出願番号：ＰＣＴ／ＵＳ２０２０／０４４０３３に示されているデータとは対照的であり、そこに開示されているいくつかの実施形態によれば、可溶性ＩＬ１２およびＩＬ１８の添加（しかしこの特定の実験のように３－パルス様式ではない）は、ロバストなＮＫ細胞の増殖を増強する。

免疫細胞、ここではＮＫ細胞の増殖に対するフィーダー細胞および刺激性サイトカインの複数パルスの効果をさらに特徴付けるために、細胞のＣＤ３陽性亜集団の増殖を評価するために追加のデータを収集した。いくつかの実施形態によれば、ＮＫ細胞は精製されるが（例えば、Ｔ細胞および他の非ＮＫ細胞を除去するために）、いくつかの小さな残留Ｔ細胞亜集団が残る。あるいは、いくつかの実施形態によれば、ＮＫ細胞は増殖前に精製されない。したがって、特定の条件下では、Ｔ細胞亜集団は、ドナーから収集された細胞の増殖から生じる可能性がある。これは、図４５Ａ～４５Ｅで評価される。図４５Ａは、血液細胞（ＮＫ細胞（図４５Ｂ～Ｅの出発材料がＣＢＭＣまたはＰＢＭＣであるのとは対照的））の出発集団が高濃度のＩＬ２中で増殖された場合のＣＤ３陽性集団の制限された増殖を示す（データは、ＣＤ３陽性である細胞のパーセンテージとして示される）。対照的に、図４５Ｂは、３パルス増殖設定でのＩＬ１２の使用が、経時的なＣＤ３陽性細胞のより大きな程度の増殖をもたらすことを示す。図４５Ｃに示されるように、３パルス増殖中のＩＬ１８の使用は、ＣＤ３陽性細胞の増殖を増加させなかった。ＩＬ１２およびＩＬ１８を組み合わせて使用すると、ＣＤ３陽性亜集団が同様に増加し（図４５Ｄを参照）、したがってこのことは、ＩＬ１２の存在が、ＩＬ１８と組み合わせても少なくとも特定の条件下で細胞のＣＤ３陽性亜集団の増殖をもたらす可能性があることを示す（かかる細胞が増殖される細胞の開始集団中に存在する場合）。図４５Ｅは、対照条件下での制限されたＣＤ３陽性増殖を示す。したがって、いくつかの実施形態において、ＩＬ１２は、ＣＤ３陽性亜集団の増殖をもたらさない濃度で使用され、および／またはＩＬ１２は、前のパルスで使用されたＩＬ２と同じ濃度で所与のパルスで使用される培地に導入されない。いくつかの実施形態において、ＩＬ１２は、例えば１パルスおき、３パルスおきなど、増殖中に使用されるパルスの総数よりも少ない数で培地に含まれる。いくつかの実施形態において、ＩＬ１２は、約２０ｎｇ／ｍＬ未満、例えば、約１５ｎｇ／ｍＬ、約１２ｎｇ／ｍＬ、約１５ｎｇ／ｍＬ、約１５ｎｇ／ｍＬ、約１５ｎｇ／ｍＬ、約１５ｎｇ／ｍＬ、または列挙されるものの間の任意の濃度で存在する。いくつかの実施形態において、ＩＬ１２が使用される場合でも、ＣＤ３陽性細胞増殖を相殺するＩＬ１８の濃度、例えば、約０．０７ｎｇ／ｍＬ、約０．１０ｎｇ／ｍｌ、約０．１２ｎｇ／ｍｌ、約０．１５ｎｇ／ｍｌ、約０．２ｎｇ／ｍｌまたはそれ以上が使用される。いくつかの実施形態において、ＣＤ３陽性細胞の増殖にもかかわらず、ＣＤ３陽性サブセットの全体的な増殖は、ＣＤ３陽性細胞のパーセンテージが結果として得られる増殖された集団全体において無視できるようになるようにＮＫ細胞成長によって相殺される（例えば、ＣＤ５６^＋／ＣＤ３^－細胞）。いくつかの実施形態において、ＣＤ３陽性細胞が増殖後に検出される場合、それらは、例えば固相親和性によって除去される（例えば、セファロースビーズまたは抗ＣＤ３抗体を有する別の固体支持体）。

様々な条件下で増殖させるＮＫ細胞上の活性化ＮＫＧ２Ｃ受容体の発現の程度に関する追加のデータを収集した。図４６Ａは、高ＩＬ２で増殖させる場合の経時的なＮＫＧ２Ｃを発現するＮＫ細胞のパーセンテージを示し、図４６Ｂは同じ細胞を示すが、データは全体のＭＦＩに関して表される（これは、より高い程度のＮＫＧ２Ｃを発現する細胞を説明する。％陽性データによって実証される）。３回のパルスで培地にＩＬ１２を使用すると、約２２日間（４６Ｃ）ＮＫＧ２Ｃ発現が時間依存的に増加し、その後所定の細胞による全体的な発現が低下した（４６Ｄ）。培地中のＩＬ１８は、同様のＮＫＧ２Ｃ発現プロファイルをもたらしたが、経時的に発現の安定性がわずかに向上した（図４６Ｅおよび４６Ｆ）。ＩＬ１２とＩＬ１８を３パルス増殖と組み合わせて使用すると、経時的にＮＫＧ２Ｃ発現が着実に増加し、ＮＫＧ２Ｃを発現する細胞のパーセンテージは、いずれかのサイトカインを個別に使用した場合と同様のレベルに達した。しかしながら、サイトカインが個々に引き起こしたように、組み合わせは１４日目から２２日目までの一般的な減少には至らなかった。さらに、ＭＦＩによって測定されるように、ＩＬ１２とＩＬ１８を一緒に使用すると、ＮＫＧ２Ｃ発現の「密度」が増強された（図４６Ｈ）。対照ＮＫＧ２Ｃデータを図４６Ｉおよび４６Ｊに示す）。

様々な条件下で増殖させるＮＫ細胞による様々なマーカー（例えば、活性化マーカーまたは阻害マーカー）の発現に関して、さらなる特徴付けデータを収集した。図４７Ａは、マルチパルス増殖プロトコルが、天然の細胞毒性受容体ＮＫｐ４６およびＮＫｐ４４、ＮＫＧ２Ｃ受容体ならびにグルココルチコイド誘導腫瘍壊死因子受容体（ＧＩＴＲ）の発現増加などの活性化マーカーを発現するＮＫ細胞のパーセンテージの増加をもたらすことを示すデータを示す。興味深いことに、図４７Ｂに示すように、阻害の２つのマーカー、チェックポイント受容体ＴＩＧＩＴおよびＴＩＭ３（Ｔ細胞寛容に関与するタンパク質ドメイン）も増加した。

図４８Ａ～４８Ｂは、０日目（丸）または７日目（四角）における活性化（４８Ａ）または阻害（４８Ｂ）マーカーの発現のさらなる評価に関する。図４８Ａは、上述のように、天然の細胞毒性受容体ＮＫｐ４４およびＮＫｐ４６が、０日目（パルス１）と比較して、パルス培養の７日目でより多くのＮＫ細胞によって発現されることを示す。２Ｂ４発現、ＣＤ２５発現などの他の活性化マーカーは、ＤＮＡＭ－１発現であり、培養中に一貫して上昇したままであり、約７５％以上のＮＫ細胞がこれらのマーカーを発現している。図４８Ｂは、ＴＩＧＩＴおよびＴＩＭ３が、パルス培養アプローチを使用する際に経時的に適度に増加する追加データを示す。しかしながら、いくつかの実施形態において、増殖中に使用される複数のパルスは、活性化ＮＫ細胞の特徴を発現する臨床的に関連するＮＫ細胞の産生を可能にし、それによって癌免疫療法におけるそれらの使用を可能にする。

上で開示される実施形態の特定の特徴および態様の様々な組み合わせまたはサブ組み合わせがなされてもよく、依然として本発明の１つまたは複数の範囲内にあることが企図される。さらに、実施形態に関連する任意の特定の特徴、態様、方法、特性、特徴、品質、属性、要素などの本明細書での開示は、本明細書で述べる他のすべての実施形態で使用してもよい。したがって、開示される発明の様々なモードを形成するために、開示される実施形態の様々な特徴および態様を互いに組み合わせたり、置き換えたりしてもよいことを理解されたい。したがって、本明細書で開示される本発明の範囲は、上記で開示される特定の実施形態によって限定されるべきではないことが意図される。さらに、本発明は様々な変更および代替形態が可能であるが、その特定の例が図面に示され、本明細書で詳細に説明されている。しかしながら、本発明は、開示される特定の形態または方法に限定されるべきではないが、逆に、本発明は、記載される様々な実施形態および添付の特許請求の範囲の精神および範囲内にあるすべての変更、等価物、および代替物をカバーするものである。本明細書に開示される任意の方法は、列挙される順序で実行される必要はない。本明細書で開示される方法は、開業医によって行われる特定の行為を含むが、それらは明示的または暗示的にこれらの行為に関する第三者の指示を含むこともできる。例えば、「増殖したＮＫ細胞の集団を投与すること」等の行為は、「増殖したＮＫ細胞の集団の投与を指示すること」を含む。さらに、本開示の特徴または態様がマーカッシュ群に関して説明される場合、当業者は、本開示がそれによって任意の個々の構成物またはマーカッシュ群の構成物の亜群に関しても説明されることを理解するであろう。

本明細書に開示される範囲はまた、いずれかおよびすべての重複、サブ範囲、およびそれらの組み合わせを包含する。「～まで」、「少なくとも」、「よりも大きい」、「よりも小さい」、「～の間」などの言葉は、列挙される数を含む。「約」または「およそ」などの用語が前に付いている数字は、列挙される数字を含む。たとえば、「９０％」は「９０％」を含む。いくつかの実施形態において、参照配列と少なくとも９５％の配列同一性を有する配列は、参照配列と９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一である配列を含む。さらに、配列がヌクレオチドまたはアミノ酸配列を「含む」と開示されている場合、かかる言及は、特に明記しない限り、その配列が列挙される配列を「含む」、「からなる」、または「から本質的になる」ことも含むものとする。

「ａ」、「ａｎ」、「ｔｈｅ」などの冠詞は、反対の指示がない限り、または文脈から明らかでない限り、１つまたは複数を意味してもよい。本明細書および特許請求の範囲で使用される場合、「および／または」なる語句は、そのように結合された要素の「いずれかまたは両方」を意味すると理解されるべきである。「および／または」で列挙される複数の要素は、同じように解釈されるべきである、つまりそのように結合された要素の「１つまたは複数」である。「および／または」なる句によって具体的に識別される要素以外の他の要素が所望により存在してもよい。本明細書および特許請求の範囲で使用される場合、「または」は、上記で定義した「および／または」と同じ意味を有すると理解されるべきである。たとえば、要素のリストで使用される場合、「または」または「および／または」は包括的であると解釈されるべきである、すなわち少なくとも１つ、しかし所望により複数の要素のリスト、および所望により追加のリストされていない要素を含む。「～の１つのみ」または「～の正確に１つ」など、明確に反対を示す用語のみが、数または要素のリストの正確に１つの要素を含むことを示す。したがって、群の１つまたは複数の構成物間に「または」を含む請求項は、反対の指示がない限り、群構成物の１つ、２つ以上、またはすべてが、所与の製品またはプロセスに存在するか、利用されるか、または関連している場合に充足されると見なされる。群の正確に１つの構成物が存在し、使用され、または所与の製品またはプロセスに関連する実施形態が、提供される。群構成物の２つ以上、またはすべてが、所与の製品またはプロセスに存在する、使用される、または関連する実施形態が、提供される。任意の１つまたは複数の請求項を補正して、任意の実施形態、態様、特徴、要素、または特性、またはそれらの任意の組み合わせを明示的に除外してもよい。任意の１つまたは複数の請求項を補正して、任意の薬剤、組成物、量、用量、投与経路、細胞型、標的、細胞マーカー、抗原、標的部分、またはそれらの組み合わせを除外してもよい。

いくつかの実施形態において、核酸コードの縮重を説明する一方で本明細書に開示される核酸のいずれかに対応するアミノ酸配列が、提供される。さらに、本明細書に明示的に開示される配列とは異なるが、機能的類似性または同等性を有する配列（核酸またはアミノ酸）もまた、本開示の範囲内であると考えられる。前述のものは、変異体、切断、置換、または他のタイプの修飾を含む。

本明細書で使用されるタイトルまたは小見出しは、整理目的のためのものであり、本明細書で開示される実施形態の範囲を限定するために使用されるべきではない。

Claims (36)

1. ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞の増殖を増強する方法であって、該方法は、以下：
   （ａ）フィーダー細胞の第１の集団とのＮＫ細胞の集団の１回目の共培養を培地中で行うこと、
   ここでフィーダー細胞の第１の集団は、４－１ＢＢＬおよび膜結合型インターロイキン－１５（ｍｂＩＬ１５）を発現するように操作された細胞を含み、
   ここで１回目の共培養におけるＮＫ細胞の集団は、フィーダー細胞の第１の集団よりも少ない細胞を含み、
   ここで１回目の共培養における培地は、インターロイキン２（ＩＬ２）、ならびにインターロイキン１２（ＩＬ１２）およびインターロイキン１８（ＩＬ１８）のうち１つを含み、および
   ここで１回目の共培養は、増殖したＮＫ細胞の集団を産生する；
   （ｂ）（ａ）で産生された増殖したＮＫ細胞の集団の少なくとも一部をフィーダー細胞の第１の集団から分離すること；
   （ｃ）（ａ）で産生された増殖したＮＫ細胞の集団の少なくとも一部と、フィーダー細胞の第２の集団との２回目の共培養を新鮮な培地中で行うこと、ここでフィーダー細胞の第２の集団は、４－１ＢＢＬおよび膜結合型インターロイキン－１５（ｍｂＩＬ１５）を発現するように操作された細胞を含み、
   ここで２回目の共培養におけるＮＫ細胞の集団は、フィーダー細胞の集団よりも少ない細胞を含み、
   ここで２回目の共培養における培地は、インターロイキン２（ＩＬ２）、ならびにインターロイキン１２（ＩＬ１２）およびインターロイキン１８（ＩＬ１８）のうち１つを含み、および
   ここで２回目の共培養は、さらに増殖したＮＫ細胞の集団を産生する；および
   （ｄ）工程（ｂ）および（ｃ）を１回または複数回繰り返して増殖したＮＫ細胞の集団のさらなる増殖をもたらすこと
   を含む、方法であって、少なくとも１００，０００倍～５，０００，０００倍のＮＫ細胞の増殖をもたらす、方法。
2. １回または複数回の共培養工程において使用される培地中に存在するＩＬ２が、約１０単位／ｍＬ～約１００単位／ｍＬの濃度である、請求項１に記載される方法。
3. １回または複数回の共培養工程において使用される培地中に存在するＩＬ２が、約５０単位／ｍＬ未満の濃度である、請求項１または２に記載される方法。
4. １回または複数回の共培養工程において使用される培地中にＩＬ１２が存在する場合、ＩＬ１２が、約１０ｎｇ／ｍＬ～約１００ｎｇ／ｍＬの濃度である、請求項１～３のいずれか一項に記載される方法。
5. １回または複数回の共培養工程において使用される培地中にＩＬ１２が存在する場合、ＩＬ１２が、約３０ｎｇ／ｍＬ未満の濃度である、請求項１～４のいずれか一項に記載される方法。
6. １回または複数回の共培養工程において使用される培地中にＩＬ１８が存在する場合、ＩＬ１８が、約０．０１ｎｇ／ｍＬ～約３０ｎｇ／ｍＬの濃度である、請求項１～５のいずれか一項に記載の方法。
7. １回または複数回の共培養工程において使用される培地中にＩＬ１８が存在する場合、ＩＬ１８が、約１０ｎｇ／ｍＬ未満の濃度である、請求項１～６のいずれか一項に記載の方法。
8. １回または複数回の共培養工程におけるＮＫ細胞 対 フィーダー細胞の比が、約１：２～約１：２０である、請求項１～７のいずれか一項に記載の方法。
9. 増殖したＮＫ細胞が、蛍光活性化セルソーティング（ＦＡＣＳ）によってフィーダー細胞から分離される、請求項１～８のいずれか一項に記載の方法。
10. フィーダー細胞の集団が、４－１ＢＢＬおよびｍｂＩＬ１５の両方を発現するＫ５６２細胞を含む、請求項１～９のいずれか一項に記載の方法。
11. １回または複数回の共培養工程が、ＮＫ細胞活性化のマーカーの発現を増加させる、請求項１～１０のいずれか一項に記載の方法。
12. １回または複数回の共培養工程が、増殖したＮＫ細胞の細胞毒性を増加させる、請求項１～１１のいずれか一項に記載の方法。
13. １回または複数回の共培養工程が、増殖したＮＫ細胞の持続性を増加させる、請求項１～１２のいずれか一項に記載の方法。
14. １回目の共培養が、約７日間行われる、請求項１～１３のいずれか一項に記載の方法。
15. 共培養が、少なくとも３回繰り返される、請求項１～１４のいずれか一項に記載の方法。
16. ＮＫ細胞をキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）をコードするベクターと接触させることをさらに含む、請求項１～１５のいずれか一項に記載の方法。
17. ＣＡＲが、ＣＤ１９、ＣＤ１２３、ＣＤ７０、ＢＣＭＡ、またはナチュラルキラー受容体群Ｄ（ＮＫＧ２Ｄ）のリガンドのうちの１つまたは複数を標的とするように構成される、請求項１６に記載の方法。
18. ＮＫ細胞が、２回目の共培養の前にＣＡＲをコードするベクターと接触させる、請求項１６または請求項１７に記載の方法。
19. ２回目の共培養が、約６時間から約１４日の間である、請求項１８に記載の方法。
20. （ｄ）において、工程（ｂ）および（ｃ）が１回繰り返される、請求項１～１９のいずれか一項に記載の方法。
21. ＮＫ細胞の集団が末梢血由来である、請求項１～２０のいずれか一項に記載の方法。
22. 標的癌細胞上のマーカーに結合し、結合すると、ＮＫ細胞が標的癌細胞に対して細胞傷害効果を発揮するように誘導するように構成された、操作されたキメラ受容体を含む、操作されたナチュラルキラー（ＮＫ）細胞の集団であって、
    ここでＮＫ細胞は、以下：
    ａ）フィーダー細胞の第１の集団とのＮＫ細胞の集団の１回目の共培養を培地中で行うこと、
    ここで、フィーダー細胞の第１の集団は、４－１ＢＢＬおよび膜結合インターロイキン－１５（ｍｂＩＬ１５）を発現するように操作された細胞を含み、
    ここで１回目の共培養におけるＮＫ細胞の集団は、フィーダー細胞の第１の集団よりも少ない細胞を含み、
    ここで１回目の共培養における培地は、インターロイキン２（ＩＬ２）、ならびにインターロイキン１２（ＩＬ１２）およびインターロイキン１８（ＩＬ１８）のうち１つを含み、および
    ここで１回目の共培養は、増殖したＮＫ細胞の集団を産生する；
    （ｂ）（ａ）で産生されたＮＫ細胞の増殖集団の少なくとも一部を、フィーダー細胞の第１の集団から分離すること；
    （ｃ）（ａ）で産生された増殖したＮＫ細胞の集団の少なくとも一部と、フィーダー細胞の第２の集団との２回目の共培養を新鮮な培地中で行うこと、ここでフィーダー細胞の第２の集団は、４－１ＢＢＬおよび膜結合インターロイキン－１５（ｍｂＩＬ１５）を発現するように操作された細胞を含み、
    ここで２回目の共培養におけるＮＫ細胞の集団は、フィーダー細胞の集団よりも少ない細胞を含み、
    ここで２回目の共培養における培地は、インターロイキン２（ＩＬ２）、ならびにインターロイキン１２（ＩＬ１２）およびインターロイキン１８（ＩＬ１８）のうち１つを含み、および
    ここで２回目の共培養は、さらに増殖したＮＫ細胞の集団を産生する；および
    （ｄ）工程（ｂ）および（ｃ）を１回または複数回繰り返して増殖したＮＫ細胞の集団のさらなる増殖をもたらすこと
    を含む方法によって増殖されており、少なくとも１００，０００倍～５，０００，０００倍増殖されたＮＫ細胞である、集団。
23. １回または複数回の共培養工程において使用される培地中に存在するＩＬ２が、約１０単位／ｍＬ～約１００単位／ｍＬの濃度である、請求項２２に記載の操作されたＮＫ細胞の集団。
24. １回または複数回の共培養工程において使用される培地中に存在するＩＬ２が、約５０単位／ｍＬ未満の濃度である、請求項２２または２３に記載の操作されたＮＫ細胞の集団。
25. １回または複数回の共培養工程において使用される培地中にＩＬ１２が存在する場合、ＩＬ１２が、約１０ｎｇ／ｍＬ～約１００ｎｇ／ｍＬの濃度である、請求項２２～２４のいずれか一項に記載の操作されたＮＫ細胞の集団。
26. １回または複数回の共培養工程において使用される培地中にＩＬ１２が存在する場合、ＩＬ１２が、約３０ｎｇ／ｍＬ未満の濃度である、請求項２２～２５のいずれか一項に記載の操作されたＮＫ細胞の集団。
27. １回または複数回の共培養工程において使用される培地中にＩＬ１８が存在する場合、ＩＬ１８が、約０．０１ｎｇ／ｍＬ～約３０ｎｇ／ｍＬの濃度である、請求項２２～２６のいずれか一項に記載の操作されたＮＫ細胞の集団。
28. １回または複数回の共培養工程において使用される培地中にＩＬ１８が存在する場合、ＩＬ１８が、約１０ｎｇ／ｍＬ未満の濃度である、請求項２２～２７のいずれか一項に記載の操作されたＮＫ細胞の集団。
29. １回目の共培養におけるＮＫ細胞 対 フィーダー細胞の比が、約１：２～約１：２０である、請求項２２～２８のいずれか一項に記載の操作されたＮＫ細胞の集団。
30. フィーダー細胞が、４－１ＢＢＬおよびｍｂＩＬ１５の両方を発現するＫ５６２細胞である、請求項２９に記載の操作されたＮＫ細胞の集団。
31. １回目の共培養が、約７日間行われる、請求項２２～３０のいずれか一項に記載の操作されたＮＫ細胞の集団。
32. キメラ受容体が、ＣＤ１９、ＣＤ１２３、ＣＤ７０、ＢＣＭＡ、またはナチュラルキラー受容体群Ｄ（ＮＫＧ２Ｄ）のリガンドのうちの１つまたは複数を標的とするように構成されたキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）である、請求項２２～３１のいずれか一項に記載の操作されたＮＫ細胞の集団。
33. （ｄ）において、工程（ｂ）および（ｃ）が１回繰り返される、請求項２２～３２のいずれか一項に記載の操作されたＮＫ細胞の集団。
34. ＮＫ細胞の集団が末梢血由来である、請求項２２～３３のいずれか一項に記載の操作されたＮＫ細胞の集団。
35. 疾患の処置において使用するための、請求項２２～３４のいずれか一項に記載の操作されたＮＫ細胞の集団。
36. 疾患が癌である、請求項３５に記載の操作されたＮＫ細胞の集団。