Deprecated: The each() function is deprecated. This message will be suppressed on further calls in /home/zhenxiangba/zhenxiangba.com/public_html/phproxy-improved-master/index.php on line 456
JP7828399B2 - アルロースエピマー化酵素発現カセットおよびこれを用いたアルロース製造方法 - Google Patents
[go: Go Back, main page]

JP7828399B2 - アルロースエピマー化酵素発現カセットおよびこれを用いたアルロース製造方法 - Google Patents

アルロースエピマー化酵素発現カセットおよびこれを用いたアルロース製造方法

Info

Publication number
JP7828399B2
JP7828399B2 JP2024125788A JP2024125788A JP7828399B2 JP 7828399 B2 JP7828399 B2 JP 7828399B2 JP 2024125788 A JP2024125788 A JP 2024125788A JP 2024125788 A JP2024125788 A JP 2024125788A JP 7828399 B2 JP7828399 B2 JP 7828399B2
Authority
JP
Japan
Prior art keywords
allulose
corynebacterium
expression cassette
seq
recombinant
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
JP2024125788A
Other languages
English (en)
Other versions
JP2025069921A (ja
Inventor
キム，ペクチュン
チェ，ウンソク
キム，テギュン
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Daesang Corp
Original Assignee
Daesang Corp
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Daesang Corp filed Critical Daesang Corp
Publication of JP2025069921A publication Critical patent/JP2025069921A/ja
Application granted granted Critical
Publication of JP7828399B2 publication Critical patent/JP7828399B2/ja
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/74—Vectors or expression systems specially adapted for prokaryotic hosts other than E. coli, e.g. Lactobacillus, Micromonospora
    • C12N15/77—Vectors or expression systems specially adapted for prokaryotic hosts other than E. coli, e.g. Lactobacillus, Micromonospora for Corynebacterium; for Brevibacterium
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/90—Isomerases (5.)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P19/00—Preparation of compounds containing saccharide radicals
    • C12P19/02—Monosaccharides
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P19/00—Preparation of compounds containing saccharide radicals
    • C12P19/24—Preparation of compounds containing saccharide radicals produced by the action of an isomerase, e.g. fructose
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y501/00—Racemaces and epimerases (5.1)
    • C12Y501/03—Racemaces and epimerases (5.1) acting on carbohydrates and derivatives (5.1.3)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12R—INDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
    • C12R2001/00—Microorganisms ; Processes using microorganisms
    • C12R2001/01—Bacteria or Actinomycetales ; using bacteria or Actinomycetales
    • C12R2001/15—Corynebacterium
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12R—INDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
    • C12R2001/00—Microorganisms ; Processes using microorganisms
    • C12R2001/01—Bacteria or Actinomycetales ; using bacteria or Actinomycetales
    • C12R2001/265—Micrococcus
    • C12R2001/28—Micrococcus glutamicus ; Corynebacterium glutamicum

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)

Description

本発明は、アルロースエピマー化酵素発現カセットなどに関するものであって、より詳しくは、培養初期にはアルロース酵素の発現量が低いため、コリネバクテリウム属宿主微生物の生長阻害を誘導せず、コリネバクテリウム宿主微生物の対数増殖期以降、停滞期にアルロース酵素を高発現させることができるアルロースエピマー化酵素発現カセット、これを含む組換えコリネバクテリウム属菌株およびこれを用いたアルロース製造方法などに関するものである。
Ｄ－アルロース(D-allulose)は、果糖(fructose)の３位炭素のエピマー(epimer)であって、Ｄ－プシコース(D-psicose)とも呼ばれる。アルロースは、砂糖と比較したとき、７０％の甘未度を有するが(Oshima、2006)、エネルギーは０．３％しかないたえ、ダイエット食品の低カロリー甘味料として適用可能な機能性単糖類である(Matsuo et al.，2002)。また、アルロースは、グルコースの吸収を抑制し、血糖抑制作用をする機能があるため、糖尿病患者向け食品、痩身用食品などに応用することができ、肝臓での脂質合成に関与する酵素活性を抑制する機能があり、腹部脂肪蓄積が抑制される得るため、健康食品などの様々な機能性食品などに用いられ得る(Matsuo et al.、2001; Iida et al.、2008; Hayashi et al.、2010; Hossain et al.、2011)。前記のような特徴によりアルロースは、砂糖を代替できる良いソースであるが、自然界にごく稀に存在する単糖類である希少糖に属するため、食品産業に適用するためにはアルロースを効率的に生産する方法が必要である。
アルロースを生産する代表的な生物学的方法としては、果糖をＤ－アルロース３－エピマー化酵素と直接反応させて、アルロースへ転換する方法と、細胞内酵素としてＤ－アルロース３－エピマー化酵素を生産する菌株の菌体と果糖を反応させて、アルロースへ転換する方法がある。前記Ｄ－アルロース３－エピマー化酵素を生産する菌株としてＤ－アルロース３－エピマー化酵素発現カセットの導入により形質転換された組換え菌株を用い、一般に宿主細胞として大腸菌を用いる。しかし、形質転換された組換え大腸菌は、ＧＲＡＳ(Generally Recognized As Safe)菌株でないため、食品素材を生産する菌株として使用するには適合でない。これを解決べくＧＲＡＳ(Generally Recognized As Safe)菌株であるコリネバクテリウム属菌株に適したＤ－アルロース３－エピマー化酵素発現カセットの開発が必要である。
例えば、大韓民国登録特許公報第１０－１６５６０６３号には、コリネバクテリウム属菌株の形質転換に適したＤ－アルロース３－エピマー化酵素発現カセットおよびこれを用いてＤ－アルロースを生産する方法が開示されている。前記先行技術にて使用している転写プロモーターは、コリネバクテリウム・グルタミカム(Corynebacterium glutamicum)菌株の全長塩基配列に存在するスーパーオキシドディスムターゼ（Ｓｕｐｅｒｏｘｉｄｅ ｄｉｓｍｕｔａｓｅ）（ｓｏｄ）)のみならず、ペプチドメチオニンスルホキシドレダクターゼ（Ｐｅｐｔｅｉｄｅ ｍｅｔｈｉｏｎｉｎｅ ｓｕｌｆｏｘｉｄｅ ｒｅｄｕｃｔａｓｅ）（ＭｓｒＡ））遺伝子全部を発現する領域をいずれも含むため、前記転写プロモーターを含む発現カセットを使用すると意図しなかった逆方向の転写が起こるおそれがあり、さらには目的タンパク質発現の低下または非効率的なエネルギー消耗によって細胞成長に悪影響を与えるおそれがある。
本発明は、従来の技術的背景の下で導出されたものであり、本発明の目的は、培養初期にはアルロース酵素の発現量が低いため、コリネバクテリウム属の宿主微生物の生長阻害を誘導せず、コリネバクテリウム属宿主微生物の対数増殖期以降の停滞期にアルロース酵素を高発現させることができるアルロースエピマー化酵素発現カセットおよびその多様な用途を提供することにある。
本発明の発明者は、コリネバクテリウム・グルタミカム(Corynebacterium glutamicum)ＡＴＣＣ １３０３２菌株のゲノムＤＮＡ（ｇｅｎｏｍｉｃ ＤＮＡ）からスーパーオキシドディスムターゼ（Ｓｕｐｅｒｏｘｉｄｅ ｄｉｓｍｕｔａｓｅ）（ｓｏｄ）)遺伝子発現のための２００ｂｐ長さのプロモーター部位をクローニングし、前記プロモーター部位をアルロースエピマー化酵素と順次連結させ、発現カセットを作製した後、これを組換えシャトルベクターに挿入し、組換えアルロースエピマー化酵素発現ベクターを作製した。それから、組換えアルロースエピマー化酵素発現ベクターをＧＲＡＳ(Generally Recognized As Safe)菌株であるコリネバクテリウム・グルタミカム(Corynebacterium glutamicum)に導入し、形質転換させ、組換えコリネバクテリウム・グルタミカム(Corynebacterium glutamicum)菌株を作製した。組換えコリネバクテリウム・グルタミカム(Corynebacterium glutamicum)菌株を培養した結果、対数増殖期および停滞期の生長速度は、野生型コリネバクテリウム・グルタミカム(Corynebacterium glutamicum)菌株と類似し、対数増殖期以降の停滞期から環境的ストレスによりＤ－アルロース３－エピマー化酵素を高発現する点を確認し、本発明を完成した。
前記課題を解決するために、本発明の一例は、アルロースエピマー化酵素をコードするポリヌクレオチドおよびこれと作動可能に連結されたプロモーターを含むアルロースエピマー化酵素発現カセットを提供する。前記プロモーターは、配列番号１の塩基配列、配列番号９の塩基配列、配列番号１０の塩基配列または配列番号１１の塩基配列から構成される。
前記課題を解決するために、本発明の一例は、アルロースエピマー化酵素発現カセットが挿入された組換え発現ベクターを提供する。
前記課題を解決するために、本発明の一例は、アルロースエピマー化酵素発現カセットまたは前記発現カセットが挿入された組換え発現ベクターの導入によりコリネバクテリウム属宿主菌株が形質転換されたものである、組換えコリネバクテリウム属菌株を提供する。
前記課題を解決するために、本発明の一例は、果糖含有溶液に組換えコリネバクテリウム属菌株を添加し反応させる段階を含む果糖からアルロースを製造する方法を提供する。
本発明の一例によるアルロースエピマー化酵素発現カセットは、組換えコリネバクテリウム属菌株を培養する正常な環境ではほとんど作動せず、組換えコリネバクテリウム属菌株の生長阻害を誘導しない。したがって、本発明の一例によるアルロースエピマー化酵素発現カセットにより形質転換された組換えコリネバクテリウム属菌株は、対数増殖期までは正常に成長および増殖することができ、対数増殖期以降にアルロースエピマー化酵素を安定的に高発現する。
商業的なシャトルベクターであるｐＪＣ１ベクターを基盤に組換えプラスミドベクターであるｐＤＳベクターを作製する過程を示す概略図である。
組換えプラスミドベクターであるｐＤＳベクターから組換え発現ベクターであるｐＤＳ＿ＦＤＰＥを作製する過程を示す概略図である。
組換え発現ベクターであるｐＤＳ＿ＦＤＰＥのベクターマップである。
本発明の実施例５にて野生型コリネバクテリウム・グルタミカム(Corynebacterium glutamicum)菌株(ＷＴと表す）と、組換えコリネバクテリウム・グルタミカム(Corynebacterium glutamicum)菌株（ＤＳ００００１と表す）との生長速度を比較した結果である。
本発明の実施例６にて果糖が含有された基質溶液に組換えコリネバクテリウム・グルタミカム(Corynebacterium glutamicum)菌株を接種し、培養したとき、培養時間別に組換えコリネバクテリウム・グルタミカム(Corynebacterium glutamicum)菌株のＤ－アルロース３－エピマー化酵素活性を果糖のアルロースへの転換率で示すものである。
以下、本発明を具体的に説明する。
本発明にて使用される用語「プロモーター」とは、転写対象である目的ヌクレオチド配列に作動可能に連結され、前記目的ヌクレオチド配列の転写を調節する最小核酸配列を意味する。また、前記プロモーターには、細胞種特異的または外部の信号または製剤によって誘導される調節可能なプロモーター依存性遺伝子を発現するのに十分なプロモーター構成が含まれ得、このような構成は、遺伝子の５’または３’領域に位置することができる。前記プロモーターには、保存的プロモーターおよび誘導性プロモーターの両方が含まれる。プロモーター配列は、原核生物、真核生物、またはウィルスに由来することができる。原核生物におけるプロモーターは、大概ＲＮＡポリメラーゼが結合する転写開始点（Transcription Start Site）すぐ近傍の結合部位として定義される。
本発明にて使用される用語「相同性」とは、野生型（wild type）または同一活性を有する変異体の核酸配列との同一性を示すものであり、相同性の比較は肉眼で、または購入が容易な比較プログラムを用いて、２つ以上の配列間の相同性を百分率（％）で計算することができる。また、「相同性」は、野生型（wild type）または同一活性を有する変異体のアミノ酸配列との同一性を示すことに使用される。
本発明にて使用される用語「ポリヌクレオチド」とは、非変性（non-modified）または変性された（modified）全部のポリリボヌクレオチド（ＲＮＡ）またはポリデオキシリボヌクレオチド（ＤＮＡ）を意味する。前記ポリヌクレオチドは、一本鎖または二本鎖ＤＮＡ、一本鎖および二本鎖領域の混合物であるＤＮＡ、一本鎖および二本鎖ＲＮＡ、一本鎖および二本鎖領域の混合物であるＲＮＡまたはこれらのハイブリッド分子を含むが、これらに制限されるものではない。
本発明にて使用される用語「作動可能に連結された（operably linked）」とは、プロモーター配列と目的とするタンパク質をコードするヌクレオチド配列が機能的に連結され、プロモーターが目的タンパク質の発現を調節することができる状態として定義される。例えば、プロモーターがコード配列の発現を制御することができる場合（すなわち、コード配列がプロモーターの転写調節下にある場合）、プロモーターは、コード配列と連結されて作動したり、リボソーム結合部位が翻訳を促進させることが可能なように位置していれば、リボソーム結合部位は、コード配列に連結され作動するものである。コード配列は、センス方向またはアンチセンス方向で、調節配列に連結され、作動可能である。
本発明にて使用される用語「組換えベクター」とは、プロモーター変異体または目的遺伝子を制限酵素を用いて切り出し、これをベクターに挿入して作製した組換えＤＮＡとして定義される。
本発明にて使用される用語「発現カセット」とは、発現対象ヌクレオチド配列、例えば、アルロースエピマー化酵素をコードするポリヌクレオチド配列に機能的に連結された調節配列を意味する。したがって、発現ユニットとは異なり、発現カセットは、転写および翻訳を調節するヌクレオチド配列だけでなく、転写および翻訳の結果としてタンパク質として発現されるヌクレオチド配列を含む。
本発明にて使用される用語「発現ベクター」とは、適切な宿主内でクローニングされたＤＮＡの転写と翻訳に必要なＤＮＡ配列として定義され、具体的には、個体の細胞内に存在する場合、挿入物が発現されるように挿入物に作動可能に連結された必須の調節エレメントを含む遺伝子作製物を意味する。発現ベクターは、標準的な組換えＤＮＡ技術を利用して、製造および精製することができる。前記発現ベクターの種類は、原核細胞および真核細胞の各種宿主細胞において、所望の遺伝子を発現し、所望のタンパク質を生産する機能をする限り、特に限定されない。発現ベクターは、少なくとも、プロモーター、開始コドン、所望のタンパク質をコードする遺伝子および終止コドンターミネータを含む。また、発現ベクターは、それ以外にシグナルペプチドをコードするＤＮＡ、さらなる発現調節配列、所望する遺伝子の５’側および３’側の非翻訳領域、選択マーカー領域、または複製可能単位などを適切に含むこともできる。前記選択マーカー領域は、目的とするベクターを選別するための抗生物質の選択マーカー遺伝子であることができる。
本発明にて使用される用語「組換え菌株」とは、一つ以上の目的タンパク質をコードするポリヌクレオチドまたはこれを有する発現ベクターが宿主細胞に導入され、形質転換された細胞を意味する。前記発現ベクターを宿主細胞に導入し、形質転換体を製造するための方法としては、一過性トランスフェクション（transient transfection）、マイクロインジェクション、形質導入（transduction）、細胞融合、リン酸カルシウム沈殿法、リポソーム媒介性トランスフェクション（liposome mediated transfection）、ＤＥＡＥデキストラン－媒介性トランスフェクション（DEAE Dextran-mediated transfection）、ポリブレン－媒介性トランスフェクション（polybrene-mediated transfection）、電気穿孔法（electroporation）、電子注入法（electroinjection）、ＰＥＧなどの化学的処理方法、遺伝子銃（gene gun）などを用いる方法、熱ショック（heat shock）方法などがあるが、これらに限定されるものではない。また、組換え菌株の宿主細胞は、発現ベクターに存在するプロモーターが円滑に作動することができるものであれば、その種類が大きく制限されず、原核生物であることが好ましい。
本発明の一側面は、培養初期に宿主細胞の生長阻害を誘導することなく、宿主細胞の対数増殖期以降に目的タンパク質の高発現を誘導することができる発現カセットに関するものである。
本発明の一例によるアルロースエピマー化酵素発現カセットは、アルロースエピマー化酵素をコードするポリヌクレオチドおよびこれと作動可能に連結されたプロモーターを含む。前記プロモーターは、好ましくは、目的タンパク質であるアルロースエピマー化酵素をコードするポリヌクレオチドの上流(upstream)に位置する。また、前記プロモーターは、コリネバクテリウム属菌株において、前記アルロースエピマー化酵素の発現を調節する。
前記アルロースエピマー化酵素発現カセットの構成要素であるプロモーターは、コリネバクテリウム・グルタミカム(Corynebacterium glutamicum)ＡＴＣＣ １３０３２ 菌株のゲノムから特定部分をクローニングしたＳＯＤプロモーターであって、スーパーオキシドディスムターゼ（Ｓｕｐｅｒｏｘｉｄｅ ｄｉｓｍｕｔａｓｅ）（ｓｏｄ）)遺伝子を基準として－２００ｂｐに該当するポリヌクレオチドである。前記プロモーターは、配列番号１の塩基配列から構成される。また、前記プロモーターは、ＳＯＤプロモーターの類似体を含む。前記ＳＯＤプロモーターの類似体は、配列番号９の塩基配列、配列番号１０の塩基配列または配列番号１１の塩基配列から構成されることができる。本発明において、クローニングした特定ＳＯＤプロモーターは、２００ｂｐの長さを有するが、１９１番目の塩基から２００番目までの塩基は、スペーサー配列に該当し、前記スペーサー配列は、遺伝子と遺伝子間に存在する配列であって、目的タンパク質の発現様相に大きく影響を及ぼさないことが推定されるため、一部変形が可能である。前記配列番号９の塩基配列、配列番号１０の塩基配列または配列番号１１の塩基配列は、配列番号１の塩基配列中、１９１番目の塩基から２００番目までの塩基に該当するスペーサー配列が一部変形されたものである。本発明の一例によるアルロースエピマー化酵素発現カセットの構成要素であるプロモーターは、配列番号１の塩基配列、配列番号９の塩基配列、配列番号１０の塩基配列または配列番号１１の塩基配列から構成されるが、前記プロモーターの均等範囲が必ずしもこれに限定されるものではない。例えば、本発明のＳＯＤプロモーターの均等範囲は、配列番号１の塩基配列、配列番号９の塩基配列、配列番号１０の塩基配列または配列番号１１の塩基配列に対して実質的な同一性を有する配列を含む。前記の実質的な同一性は、配列番号１の塩基配列、配列番号９の塩基配列、配列番号１０の塩基配列または配列番号１１の塩基配列と任意の他の配列を最大限対応するようにアライメントし、その配列を解析し、前記任意の他の配列が配列番号１の塩基配列、配列番号９の塩基配列、配列番号１０の塩基配列または配列番号１１の塩基配列と７０％以上、９０％以上、または９８％以上の配列相同性を有することを意味する。当該分野の通常の知識を有する技術者は、当該分野に公知された遺伝子組換え技術などを用いて前記ＳＯＤプロモーター塩基配列中の一つまたはそれ以上の塩基を置換、付加または欠失させることによって実質的な相同性を有する範囲で同一または類似する活性を有するポリヌクレオチドを製造することができることを容易に理解されるであろう。このような相同性の比較は、市販のコンピュータプログラムを用いて、２つ以上の配列間の相同性を百分率（％）で計算して行うことができる。
前記アルロースエピマー化酵素発現カセットの構成要素であるアルロースエピマー化酵素をコードするポリヌクレオチドは、果糖をアルロースへ転換する活性を有する酵素をコードするポリヌクレオチドであれば、その種類が大きく制限されない。例えば、前記アルロースエピマー化酵素は、フラボニフラクター・プラウティ(Flavonifractor plautii)、クロストリジウム・シンデンス(Clostridiun scindens)、トレポネーマ・プリミティア(Treponema primitia)、エンシファー・アドヘレンス(Ensifer adhaerens)またはルミノコッカス・トロクエス(Ruminococcus torques)に由来するものであってもよく、果糖のアルロースへの転換活性を考慮したとき、フラボニフラクター・プラウティ(Flavonifractor plautii)に由来するものであることが好ましい。具体的には、前記アルロースエピマー化酵素は、配列番号３のアミノ酸配列、配列番号１３のアミノ酸配列または配列番号１５のアミノ酸配列から構成されることができる。前記配列番号３のアミノ酸配列から構成されるアルロースエピマー化酵素は、フラボニフラクター・プラウティ（Ｆｌａｖｏｎｉｆｒａｃｔｏｒ ｐｌａｕｔｉｉ)に由来する野生型の酵素である。前記配列番号１３のアミノ酸配列から構成されるアルロースエピマー化酵素は、配列番号３のアミノ酸配列中、２９番目の位置に存在するトリプトファン（Ｔｒｐ）がリシン（Ｌｙｓ）に置換され、２１６番目の位置に存在するグリシン（Ｇｌｙ）がセリン（Ｓｅｒ）に置換され、同時に２３４番目の位置に存在するメチオニン（Ｍｅｔ）がイソロイシン（Ｉｌｅ）に置換されたものである。前記配列番号１５のアミノ酸配列から構成されるアルロースエピマー化酵素は、配列番号３のアミノ酸配列中、２９番目の位置に存在するトリプトファン（Ｔｒｐ）がリシン（Ｌｙｓ）に置換され、７７番目の位置に存在するアラニン（Ａｌａ）がセリン（Ｓｅｒ）に置換され、２１６番目の位置に存在するグリシン（Ｇｌｙ）がセリン（Ｓｅｒ）に置換され、同時に２３４番目の位置に存在するメチオニン（Ｍｅｔ）がイソロイシン（Ｉｌｅ）に置換されたものである。前記アルロースエピマー化酵素をコードするポリヌクレオチドは、その種類が大きく制限されず、好ましくは、配列番号２の塩基配列から構成されたり、配列番号２の塩基配列と７０％以上、８０％以上、９０％以上、９５％以上、または９９％以上の相同性を有する塩基配列を含むことができる。配列番号２の塩基配列は、配列番号３のアミノ酸配列から構成されるアルロースエピマー化酵素をコードするポリヌクレオチドである。また、前記アルロースエピマー化酵素をコードするポリヌクレオチドは、配列番号１２の塩基配列または配列番号１４の塩基配列から構成されることができる。配列番号１２の塩基配列は、配列番号１３のアミノ酸配列から構成されるアルロースエピマー化酵素をコードするポリヌクレオチドであり、配列番号１４の塩基配列は、配列番号１５のアミノ酸配列から構成されるアルロースエピマー化酵素をコードするポリヌクレオチドである。本発明は、アルロースエピマー化酵素およびこれをコードするポリヌクレオチドと関連し、大韓民国登録特許公報第１０－１９１９７１３号、大韓民国登録特許公報第１０－２１８７３５４号、大韓民国登録特許公報第１０－１６５６０６３号、大韓民国登録特許公報第１０－１６９５８３０号、大韓民国登録特許公報第１０－２１８９４５８号、大韓民国登録特許公報第１０－１５３９０９７号、大韓民国登録特許公報第１０－１５３９０９６号、大韓民国登録特許公報第１０－１４５５７５９号、大韓民国登録特許公報第１０－１３１８４２２号などに開示された内容を含む。
本発明の一例によるアルロースエピマー化酵素発現カセットは、複製起点(replication origin)、目的タンパク質遺伝子をクローニングするためのマルチクローニングサイト(Multi clonig site、MCS)、転写ターミネーター配列(transcription termination sequence)および選択マーカー(selection marker)からなる群より選択される１種以上の配列をさらに含むことができる。前記選択マーカーは、ベクターで形質転換された細胞を選別するためのものであって、薬物耐性、栄養要求性、細胞毒性剤に対する耐性または表面タンパク質の発現のような選択可能表現型を付与するマーカーが使用され得る。例えば、前記選択マーカーは、カナマイシン(Kanamycin)抗生物質耐性遺伝子またはアンピシリン(Ampicillin)抗生物質耐性遺伝子のような抗生物質耐性遺伝子マーカーであってもよい。
本発明の一側面は、アルロースエピマー化酵素発現カセットの多様な用途に関するものである。前記アルロースエピマー化酵素発現カセットは、組換えベクター、組換え菌株、果糖からアルロースの製造などに用いられることができる。
本発明の一例による組換えベクターは、前述したアルロースエピマー化酵素発現カセットが挿入された組換え発現ベクターである。前記組換え発現ベクターは、好ましくは、図３のベクトルマップを有する。図３のベクトルマップを有する組換え発現ベクターは、複製起点、配列番号１の塩基配列からなるプロモーター（ＳＯＤ）、配列番号２の塩基配列からなるアルロースエピマー化酵素をコードするポリヌクレオチド（ＦＤＰＥ）、転写ターミネーター、配列番号４の塩基配列からなるカナマイシン耐性遺伝子マーカー（ＮｅｏＲ／ＫａｎＲ）などが順次連結された構造を有する。
本発明の一例による組換え菌株は、前述したアルロースエピマー化酵素発現カセットまたは前記発現カセットが挿入された組換え発現ベクターの導入により宿主細胞が形質転換されたものであって、組換えコリネバクテリウム属菌株である。前記組換えコリネバクテリウム属菌株を作製するのに用いられる宿主菌株は、コリネバクテリウム属菌株であれば、その種類が大きく制限されず、例えば、コリネバクテリウム・グルタミカム(Corynebacterium glutamicum)、コリネバクテリウム・アセトグルタミカム(Corynebacterium acetoglutamicum)、コリネバクテリウム・アセトアシドフィラム(Corynebacterium acetoacidophilum)、コリネバクテリウム・サーモアミノゲネス(Corynebacterium thermoaminogenes)、コリネバクテリウム・メラセコラ(Corynebacterium melassecola)およびコリネバクテリウム・エフィシェンス(Corynebacterium efficiens)からなる群より選択されることができる。
本発明の一例による果糖からアルロースを製造する方法は、果糖含有溶液に組換えコリネバクテリウム属菌株を添加し反応させる段階を含む。前記果糖含有溶液は、アルロースエピマー化酵素の活性を促進するために、Ｃａ２＋、Ｍｎ２＋のような金属イオンをさらに含むことができる。また、前記果糖からアルロースを製造する方法において、反応温度は５０～７０℃、好ましくは、５５～６５℃、組換え菌株の円滑な酵素発現、酵素の安定性および最大活性を考慮したとき、より好ましくは、６０～６５℃の範囲であり、反応ｐＨは、６．５～８、好ましくは、６．５～７．５、より好ましくは、６．５～７の範囲である。また、前記果糖からアルロースを製造する方法において、果糖含有溶液の果糖濃度は、特に制限されないが、生産性ないし経済性を考慮したとき、果糖含有溶液の全重量を基準として５～７５％（ｗ／ｗ）であることが好ましく、１０～５５％（ｗ／ｗ）であることが好ましい。
以下、本発明を実施例を通じてより具体的に説明する。ただし、下記の実施例は、本発明の技術的特徴を明確に例示するためのものに過ぎず、本発明の保護範囲を制限するものではない。
本開示は、例えば、以下に関する。
［項１］
アルロースエピマー化酵素をコードするポリヌクレオチドおよびこれと作動可能に連結されたプロモーターを含む発現カセットであって、
前記プロモーターは、配列番号１の塩基配列、配列番号９の塩基配列、配列番号１０の塩基配列または配列番号１１の塩基配列から構成されたことを特徴とする、アルロースエピマー化酵素発現カセット。
［項２］
前記アルロースエピマー化酵素は、フラボニフラクター・プラウティ(Flavonifractor plautii)、クロストリジウム・シンデンス(Clostridiun scindens)、トレポネーマ・プリミティア(Treponema primitia)、エンシファー・アドヘレンス(Ensifer adhaerens)またはルミノコッカス・トロクエス(Ruminococcus torques)に由来するものである、項１に記載のアルロースエピマー化酵素発現カセット。
［項３］
前記アルロースエピマー化酵素は、配列番号３のアミノ酸配列から構成されるものである、項１に記載のアルロースエピマー化酵素発現カセット。
［項４］
前記アルロースエピマー化酵素をコードするポリヌクレオチドは、配列番号２の塩基配列から構成されるものである、項１に記載のアルロースエピマー化酵素発現カセット。
［項５］
前記発現カセットは、複製起点(replication origin)、目的タンパク質遺伝子をクローニングするためのマルチクローニングサイト(Multi clonig site、MCS)、転写ターミネーター配列(transcription termination sequence)および選択マーカー(selection marker)からなる群より選択される1種以上の配列をさらに含むものである、項１に記載のアルロースエピマー化酵素発現カセット。
［項６］
項１～５のいずれか１項に記載の発現カセットが挿入された組換え発現ベクター。
［項７］
図３のベクトルマップを有するものである、項６に記載の組換え発現ベクター。
［項８］
項１～５のいずれか１項に記載の発現カセットまたは前記発現カセットが挿入された組換え発現ベクターの導入によりコリネバクテリウム属宿主菌株が形質転換されたものである、組換えコリネバクテリウム属菌株。
［項９］
前記コリネバクテリウム属宿主菌株は、コリネバクテリウム・グルタミカム(Corynebacterium glutamicum)、コリネバクテリウム・アセトグルタミカム(Corynebacterium acetoglutamicum)、コリネバクテリウム・アセトアシドフィラム(Corynebacterium acetoacidophilum)、コリネバクテリウム・サーモアミノゲネス(Corynebacterium thermoaminogenes)、コリネバクテリウム・メラセコラ(Corynebacterium melassecola)およびコリネバクテリウム・エフィシェンス(Corynebacterium efficiens)からなる群より選択されるものである、項８に記載の組換えコリネバクテリウム属菌株。
［項１０］
果糖含有溶液に項９に記載の組換えコリネバクテリウム属菌株を添加し反応させる段階を含む果糖からアルロースを製造する方法。
実施例１：Ｄ－アルロース３－エピマー化酵素の過発現のためのプロモーター配列の増幅および確保
コリネバクテリウム・グルタミカム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ)ＡＴＣＣ １３０３２菌株からスーパーオキシドディスムターゼ（Ｓｕｐｅｒｏｘｉｄｅ ｄｉｓｍｕｔａｓｅ）（ｓｏｄ）)遺伝子発現のためのプロモーター部位のポリヌクレオチド断片を確保するために、コリネバクテリウム・グルタミカム(Corynebacterium glutamicum)ＡＴＣＣ １３０３２菌株からゲノムＤＮＡ(genomic DNA)を抽出した。それから、抽出されたゲノムＤＮＡ（ｇｅｎｏｍｉｃ ＤＮＡ）を鋳型とし、次の表１に記載されたプライマーセットを用いてＰＣＲを行い、増幅したプロモーター断片を確保した。増幅したプロモーター断片をクローニングベクターにクローニングし、塩基配列を分析した結果、２００ｂｐの長さを有し、配列番号１の塩基配列から構成されたポリヌクレオチド断片であることを確認した。


一般にＳＯＤプロモーター部位は、スーパーオキシドディスムターゼ（Ｓｕｐｅｒｏｘｉｄｅ ｄｉｓｍｕｔａｓｅ）（ｓｏｄ）)遺伝子を基準として正確な位置関係が規定されていないが、前記表１におけるプライマーセットを用いて確保した部位は、スーパーオキシドディスムターゼ（Ｓｕｐｅｒｏｘｉｄｅ ｄｉｓｍｕｔａｓｅ）（ｓｏｄ）)遺伝子を基準として－２００ｂｐまでであることが確認された。その反面、大韓民国登録特許公報第１０－１６５６０６３号に記載された発現調節配列は、スーパーオキシドディスムターゼ（Ｓｕｐｅｒｏｘｉｄｅ ｄｉｓｍｕｔａｓｅ）（ｓｏｄ）)遺伝子を基準として－３００ｂｐである。
実施例２：Ｄ－アルロース３－エピマー化酵素を暗号化するポリヌクレオチド配列の増幅および確保
Ｄ－アルロース３－エピマー化酵素を暗号化する遺伝子をクローニングするために、フラボニフラクター・プラウティ(Flavonifractor plautii)ＫＣＴＣ ５９７０菌株からゲノムＤＮＡ(genomic DNA)を抽出した。それから、抽出されたゲノムＤＮＡ(genomic DNA)を鋳型とし、次の表２に記載されたプライマーセットを用いてＰＣＲを行い、増幅したＤ－アルロース３－エピマー化酵素遺伝子断片を確保した。増幅された遺伝子断片をクローニングベクターにクローニングし、塩基配列を分析した結果、８８５ｂｐの長さを有し、配列番号２の塩基配列から構成されたポリヌクレオチド断片であることを確認し、ＦＤＰＥ遺伝子と命名した。前記配列番号２の塩基配列から構成されたポリヌクレオチドにより解読されるＤ－アルロース３－エピマー化酵素は、野生型の酵素であって、配列番号３のアミノ酸配列から構成される。


実施例３：ＳＯＤプロモーター断片およびＤ－アルロース３－エピマー化酵素遺伝子が挿入された発現ベクターの作製
商業的なシャトルベクターであるｐＪＣ１ベクターの抗生物質耐性遺伝子であるｎｅｏｍｙｃｉｎ ｐｈｏｓｐｈｏ－ｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ Ｉ（ＮＴＰＩ）をＥ．ｃｏｌｉ Ｋ－１２に由来のＮＴＰＩＩ遺伝子に交替し、マルチクローニングサイト(Multi clonig site、MCS)などを挿入し、組換えプラスミドベクターであるｐＤＳベクターを作製した。図１は、商業的なシャトルベクターであるｐＪＣ１ベクターを基盤に組換えプラスミドベクターであるｐＤＳベクターを作製する過程を示す概略図である。前記ｐＤＳベクターは、複製開始タンパク質(replication initiation protein、repA)遺伝子、配列番号４の塩基配列から構成されたＥ．ｃｏｌｉ Ｋ－１２に由来の抗生物質（カナマイシン）耐性遺伝子などを含む。
それから、上記にて確保した２００ｂｐ長さのＳＯＤプロモーターＤＮＡ断片とＦＤＰＥ遺伝子断片を混合し、ＰＣＲを１０サイクル(cycle)進めた。それから、表１に記載されたＳＯＤプロモーターＦｏｒｗａｒｄプライマーと表２に記載されたＦＤＰＥ Ｒｅｖｅｒｓｅプライマーを添加し、ＰＣＲを１５サイクル(cycle)進め、ＳＯＤ プロモーターとＦＤＰＥ遺伝子を組み合わせた融合ＤＮＡ断片を確保した。それから、制限酵素ＰｓｔＩとＢａｍＨＩを用いて融合ＤＮＡ断片の末端を切断し、ｐＤＳベクターのマルチクローニングサイト(Multi clonig site、MCS)であるＰｓｔＩとＢａｍＨＩ制限酵素サイトに融合ＤＮＡ断片を挿入し、組換え発現ベクターであるｐＤＳ＿ＦＤＰＥを作製した。図２は、組換えプラスミドベクターであるｐＤＳベクターから組換え発現ベクターであるｐＤＳ＿ＦＤＰＥを作製する過程を示す概略図であり、図３は、組換え発現ベクターであるｐＤＳ＿ＦＤＰＥのベクターマップである。図３に示すように組換え発現ベクターであるｐＤＳ＿ＦＤＰＥは、複製開始タンパク質(replication initiation protein、repA)遺伝子、複製起点(replication origin)、制限酵素ＰｓｔＩサイト、ＢａｍＨＩサイト、ＮｄｅＩサイトのようなマルチクローニングサイト(Multi clonig site、MCS)、ＳＯＤプロモーター、目的遺伝子（ＦＤＰＥ）、転写ターミネーター(transcription terminator)および抗生物質耐性遺伝子マーカーを含む。
実施例４：組換え発現ベクターｐＤＳ＿ＦＤＰＥの導入により形質転換された組換え菌株の作製およびＤ－アルロース３－エピマー化酵素活性の確認
上記にて作製した組換え発現ベクターｐＤＳ＿ＦＤＰＥをコリネバクテリウム・グルタミカム(Corynebacterium glutamicum)コンピタント細胞に電気穿孔法(electroporation)を用いて導入し、抗生物質耐性可否を確認し、形質転換された組換えコリネバクテリウム・グルタミカム(Corynebacterium glutamicum)菌株を選別した。選別した組換えコリネバクテリウム・グルタミカム(Corynebacterium glutamicum)菌株を２ＹＴ培地（１６ｇ／Ｌ Ｔｒｙｔｏｎｅ、１０ｇ／Ｌ Ｙｅａｓｔ Ｅｘｔｒａｃｔ、５ｇ／Ｌ ＮａＣｌを含む）に接種し、３０℃で４０時間（ｈｒ）の間、培養した。延伸分離を通じて培養液を除去し、０．８５％（ｗ／ｗ)ＮａＣｌ溶液に懸濁した後、再び延伸分離し、組換えコリネバクテリウム・グルタミカム(Corynebacterium glutamicum)菌株の菌体を収得した。収得した組換えコリネバクテリウム・グルタミカム(Corynebacterium glutamicum)菌株の菌体をＭｎＳＯ４濃度が１Ｍｍである５０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌバッファー（ｐＨ７．０）に０．０６％（ｗ／ｗ）の量で添加し、菌体懸濁液を用意した。その後、果糖濃度が２０％（ｗ／ｗ）であり、ＭｎＳＯ４濃度が１Ｍｍである５０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌバッファー（ｐＨ７．０）と組換えコリネバクテリウム・グルタミカム(Corynebacterium glutamicum)菌株の菌体懸濁液を１：１の体積比で混合し、６５℃で１時間（ｈｒ）の間、酵素変換反応を進めた後、１Ｍ濃度の塩酸溶液を添加し、ｐＨを２以下まで下げて反応を終了した。それから、反応生成液を延伸分離し、菌体および異物を除去した上澄み液を回収し、上澄み液を０．４５μｍシリンジフィルターでろ過し、試料を用意した。その後、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）を用いて、試料中のアルロース濃度および果糖濃度を測定し、形質転換された組換えコリネバクテリウム・グルタミカム(Corynebacterium glutamicum)菌株のＤ－アルロース３－エピマー化酵素活性を確認した。高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）解析条件は、次のとおりである。
* カラム：８７Ｃ（ＢＩＯ－ＲＡＤ）
* カラム温度：８０℃
* 移動相：イオン交換水
* 流速：０．６ｍｌ／分
* 検出器：Refractive Index Detector(Agilent 1260 TID)
実施例５：野生型コリネバクテリウム・グルタミカム(Corynebacterium glutamicum)菌株と組換えコリネバクテリウム・グルタミカム(Corynebacterium glutamicum)菌株との生長速度の比較
２ＹＴＧ培地（１６ｇ／Ｌ Ｔｒｙｔｏｎｅ、１０ｇ／Ｌ Ｙｅａｓｔ Ｅｘｔｒａｃｔ、５ｇ／Ｌ ＮａＣｌ、２０ｇ／Ｌ ｄｅｘｔｒｏｓｅを含む；ｐＨ７）に野生型コリネバクテリウム・グルタミカム(Corynebacterium glutamicum)菌株と組換えコリネバクテリウム・グルタミカム(Corynebacterium glutamicum)菌株をそれぞれ接種し、３０℃で１６時間（ｈｒ）の間、種菌培養(seed cultuer)した。それから、菌体が含まれた種菌培養液を２ＹＴＧ培地に１％（ｖ／ｖ）の量で接種し、３０℃で本培養しながら、時間別にサンプリングした。サンプリングした試料の６００ｎｍでの光学密度（optical density）を測定し、菌株の生長速度を評価した。
図４は、本発明の実施例５において、野生型コリネバクテリウム・グルタミカム(Corynebacterium glutamicum)菌株(ＷＴと表す）と組換えコリネバクテリウム・グルタミカム(Corynebacterium glutamicum)菌株（ＤＳ００００１と表す）との生長速度を比較した結果である。図４に示すように、野生型コリネバクテリウム・グルタミカム(Corynebacterium glutamicum)菌株と組換えコリネバクテリウム・グルタミカム(Corynebacterium glutamicum)菌株との生長速度は、大差がみられなかった。本発明において、作製した組換えコリネバクテリウム・グルタミカム(Corynebacterium glutamicum)菌株は、培養初期にＳＯＤプロモーターによるＤ－アルロース３－エピマー化酵素の過発現が起こらず、野生型コリネバクテリウム・グルタミカム(Corynebacterium glutamicum)菌株と類似する水準の対数増殖期および停滞期を示した。
実施例６：組換えコリネバクテリウム・グルタミカム(Corynebacterium glutamicum)菌株の培養時間別のＤ－アルロース３－エピマー化酵素活性
組換えコリネバクテリウム・グルタミカム(Corynebacterium glutamicum)菌株を２ＹＴ培地（１６ｇ／Ｌ Ｔｒｙｔｏｎｅ、１０ｇ／Ｌ Ｙｅａｓｔ Ｅｘｔｒａｃｔ、５ｇ／Ｌ ＮａＣｌを含む）に接種し、３０℃で４０時間（ｈｒ）の間、培養した。延伸分離を通じて培養液を除去し、０．８５％（ｗ／ｗ)ＮａＣｌ溶液に懸濁した後、再び延伸分離し、組換えコリネバクテリウム・グルタミカム(Corynebacterium glutamicum)菌株の菌体を得た。得られた組換えコリネバクテリウム・グルタミカム(Corynebacterium glutamicum)菌株の菌体をＭｎＳＯ４濃度が１ｍＭである５０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌバッファー（ｐＨ７．０）に０．０６％（ｗ／ｗ）の量で添加し、菌体懸濁液を用意した。それから、果糖濃度が２０％（ｗ／ｗ）であり、ＭｎＳＯ４濃度が１ｍＭである５０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌバッファー（ｐＨ７．０）と組換えコリネバクテリウム・グルタミカム(Corynebacterium glutamicum)菌株の菌体懸濁液を１：１の体積比で混合し、６５℃で酵素変換反応を進めながら、反応時間による組換えコリネバクテリウム・グルタミカム(Corynebacterium glutamicum)菌株のＤ－アルロース３－エピマー化酵素活性を測定した。予め設定した反応時間に到達すると、反応生成液に１Ｍ濃度の塩酸溶液を添加し、ｐＨを２以下まで下げ、反応を終了した。それから、反応生成液を延伸分離し、菌体および異物を除去した上澄み液を回収し、上澄み液を０．４５μｍシリンジフィルターでろ過し、試料を用意した。それから、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）を用いて試料中のアルロース濃度および果糖濃度を測定し、果糖のアルロースへの転換率を計算した。
図５は、本発明の実施例６において、果糖が含有された基質溶液に組換えコリネバクテリウム・グルタミカム(Corynebacterium glutamicum)菌株を接種し、培養したとき、培養時間別に組換えコリネバクテリウム・グルタミカム(Corynebacterium glutamicum)菌株のＤ－アルロース３－エピマー化酵素活性を果糖のアルロースへの転換率で示すものである。図５に示すように、組換えコリネバクテリウム・グルタミカム(Corynebacterium glutamicum)菌株は、培養初期にはＤ－アルロース３－エピマー化酵素の過発現による生長抑制が示されず、対数増殖期まで十分に増殖した後、停滞期からＤ－アルロース３－エピマー化酵素を高発現することが示された。
実施例７：商業的基質含有溶液における組換えコリネバクテリウム・グルタミカム(Corynebacterium glutamicum)菌株を用いたアルロースの生産
固形分濃度が約７５ブリックス（Ｂｒｉｘ）である高果糖シロップ（ＨＦＣＳ；糖類組成：果糖５５重量％、ブドウ糖４５重量％)５００ｇ（約３８０ｍＬに該当する）、組換えコリネバクテリウム・グルタミカム(Corynebacterium glutamicum)菌株の菌体懸濁液５００ｇおよびＭｎＳＯ４・４Ｈ２Ｏ ０．２ｇを混合し、４％のＮａＯＨ水溶液を用いてｐＨを約７に調整した後、６５℃で２００ｒｐｍの攪拌条件で酵素変換反応を行った。酵素変換反応が進められる間、４％のＮａＯＨ水溶液を用いて反応系のｐＨを７に維持した。酵素変換反応時間別にサンプリングし、サンプリングされた試料に１０％のＨＣｌ水溶液を添加し、酵素変換反応を中止させた。それから、サンプリングした試料を蒸留水を用いて、約２５倍に希釈し、０．４５μｍシリンジフィルターでろ過した後、濾過液を高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）により分析し、転換率を測定した。転換率は、次の式で計算した。
次の表３に商業的基質である高果糖シロップに本発明の組換えコリネバクテリウム・グルタミカム(Corynebacterium glutamicum)菌株を接種し、酵素変換反応を進めたとき、反応時間別に果糖のアルロースへの転換率の測定結果をまとめた。


前記表３に示すように、本発明の組換えコリネバクテリウム・グルタミカム(Corynebacterium glutamicum)菌株を用いて、高果糖シロップからアルロースを製造する場合、約１２時間(ｈｒ)以内に３０％水準の転換率に到達した。
上述のように、本発明を前記の実施例を通じて説明したが、本発明の保護範囲が必ずしもこれに限定されるものではなく、本発明の範疇と思想を逸脱しない範囲内で多様な変形実施が可能であることは勿論である。したがって、本発明の保護範囲は、最上の様式として開示された特定の実施形態に局限されるものでなく、本発明に添付された特許請求の範囲に属する全ての実施形態を含むものと解釈されるべきである。

Claims (9)

  1. アルロースエピマー化酵素をコードするポリヌクレオチドおよびこれと作動可能に連結されたプロモーターを含む発現カセットであって、
    前記プロモーターは、配列番号１の塩基配列、配列番号９の塩基配列、配列番号１０の塩基配列または配列番号１１の塩基配列から構成されたことを特徴とする、アルロースエピマー化酵素発現カセット。
  2. 前記アルロースエピマー化酵素は、フラボニフラクター・プラウティ(Flavonifractor plautii)、クロストリジウム・シンデンス(Clostridiun scindens)、トレポネーマ・プリミティア(Treponema primitia)、エンシファー・アドヘレンス(Ensifer adhaerens)またはルミノコッカス・トロクエス(Ruminococcus torques)に由来するものである、請求項１に記載のアルロースエピマー化酵素発現カセット。
  3. 前記アルロースエピマー化酵素は、配列番号３のアミノ酸配列から構成されるものである、請求項１に記載のアルロースエピマー化酵素発現カセット。
  4. 前記アルロースエピマー化酵素をコードするポリヌクレオチドは、配列番号２の塩基配列から構成されるものである、請求項１に記載のアルロースエピマー化酵素発現カセット。
  5. 前記発現カセットは、複製起点(replication origin)、目的タンパク質遺伝子をクローニングするためのマルチクローニングサイト(Multi clonig site、MCS)、転写ターミネーター配列(transcription termination sequence)および選択マーカー(selection marker)からなる群より選択される1種以上の配列をさらに含むものである、請求項１に記載のアルロースエピマー化酵素発現カセット。
  6. 請求項１～５のいずれか１項に記載の発現カセットが挿入された組換え発現ベクター。
  7. 請求項１～５のいずれか１項に記載の発現カセットまたは前記発現カセットが挿入された組換え発現ベクターの導入によりコリネバクテリウム属宿主菌株が形質転換されたものである、組換えコリネバクテリウム属菌株。
  8. 前記コリネバクテリウム属宿主菌株は、コリネバクテリウム・グルタミカム(Corynebacterium glutamicum)、コリネバクテリウム・アセトグルタミカム(Corynebacterium acetoglutamicum)、コリネバクテリウム・アセトアシドフィラム(Corynebacterium acetoacidophilum)、コリネバクテリウム・サーモアミノゲネス(Corynebacterium thermoaminogenes)、コリネバクテリウム・メラセコラ(Corynebacterium melassecola)およびコリネバクテリウム・エフィシェンス(Corynebacterium efficiens)からなる群より選択されるものである、請求項７に記載の組換えコリネバクテリウム属菌株。
  9. 果糖含有溶液に請求項８に記載の組換えコリネバクテリウム属菌株を添加し反応させる段階を含む果糖からアルロースを製造する方法。
JP2024125788A 2023-10-18 2024-08-01 アルロースエピマー化酵素発現カセットおよびこれを用いたアルロース製造方法 Active JP7828399B2 (ja)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR10-2023-0139567 2023-10-18
KR1020230139567A KR20250057175A (ko) 2023-10-18 2023-10-18 알룰로스 에피머화 효소 발현 카세트 및 이를 이용한 알룰로스 제조방법

Publications (2)

Publication Number Publication Date
JP2025069921A JP2025069921A (ja) 2025-05-01
JP7828399B2 true JP7828399B2 (ja) 2026-03-11

Family

ID=92108518

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP2024125788A Active JP7828399B2 (ja) 2023-10-18 2024-08-01 アルロースエピマー化酵素発現カセットおよびこれを用いたアルロース製造方法

Country Status (4)

Country Link
EP (1) EP4541888A1 (ja)
JP (1) JP7828399B2 (ja)
KR (1) KR20250057175A (ja)
CN (1) CN119842773A (ja)

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2017531437A (ja) 2014-10-30 2017-10-26 サムヤン コーポレイション プシコースエピメラーゼの発現システムおよびこれを用いたプシコースの生産

Family Cites Families (12)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR101539096B1 (ko) 2012-08-10 2015-07-24 주식회사 삼양제넥스 사이코스 에피머화 효소 및 이를 이용한 사이코스로 전환용 조성물
KR101318422B1 (ko) 2013-04-09 2013-10-15 주식회사 삼양제넥스 D-사이코스 에피머화 효소, 및 이를 이용하는 사이코스 생산방법
KR101455759B1 (ko) 2013-04-23 2014-10-28 씨제이제일제당(주) 사이코스 에피머화 효소 변이체 및 이를 이용한 사이코스의 제조 방법
JP6774875B2 (ja) 2013-09-03 2020-10-28 ロケット フレールＲｏｑｕｅｔｔｅ Ｆｒｅｒｅｓ Ｄ−プシコース ３−エピメラーゼの改良された変異体およびその使用
KR101539097B1 (ko) 2013-12-26 2015-07-23 주식회사 삼양제넥스 사이코스 에피머화 효소를 암호화 하는 폴리뉴클레오타이드, 및 이를 이용하는 사이코스 생산방법
KR101656063B1 (ko) 2015-05-22 2016-09-08 주식회사 삼양사 사이코스 에퍼머화 효소의 발현 시스템 및 이를 이용한 사이코스의 생산
KR101695830B1 (ko) 2014-10-30 2017-01-12 주식회사 삼양사 사이코스 에퍼머화 효소의 발현 시스템 및 이를 이용한 사이코스의 생산
KR101919713B1 (ko) 2016-11-16 2018-11-19 씨제이제일제당 (주) 신규한 d-사이코스 3-에피머화 효소 및 이를 이용한 d-사이코스의 제조 방법
KR102187354B1 (ko) 2017-06-02 2020-12-04 주식회사 삼양사 사이코스 에피머화 효소 및 이를 이용한 사이코스의 제조 방법
KR102223521B1 (ko) * 2019-02-26 2021-03-05 한국과학기술원 안트라닐산 메틸 생성능을 가지는 재조합 미생물 및 이를 이용한 안트라닐산 메틸의 제조방법
KR102682846B1 (ko) * 2021-11-19 2024-07-08 대상 주식회사 열 안정성이 우수한 알룰로스 에피머화 효소 변이체, 이의 제조방법 및 이를 이용한 알룰로스의 제조방법
KR102797051B1 (ko) * 2022-12-27 2025-04-21 대상 주식회사 과당으로부터 알룰로스를 제조하는 방법

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2017531437A (ja) 2014-10-30 2017-10-26 サムヤン コーポレイション プシコースエピメラーゼの発現システムおよびこれを用いたプシコースの生産

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
ZHANG Wei et al.，Fine-Tuning of Carbon Flux and Artificial Promoters in Bacillus sutilis Enables High-Level Biosynthesis of D-Allulose，Journal of Agricultural and Food Chemistry，2022年10月24日，Vol.70，p.13935-13944

Also Published As

Publication number Publication date
EP4541888A1 (en) 2025-04-23
JP2025069921A (ja) 2025-05-01
CN119842773A (zh) 2025-04-18
KR20250057175A (ko) 2025-04-29

Similar Documents

Publication Publication Date Title
AU2018310134B2 (en) Atp phosphoribosyltransferase variant and method for producing l-histidine using the same
RU2770464C1 (ru) Новая аденилосукцинат-синтетаза и способ получения нуклеотидов пурина с ее использованием
EP4105229A1 (en) Microorganism comprising variant lyse and method of l-amino acid production using same
KR20180077008A (ko) 신규한 이소프로필말레이트 신타제 변이체 및 이를 이용한 l-류신의 생산 방법
CN113853429A (zh) 产生嘌呤核苷酸的微生物以及使用其产生嘌呤核苷酸的方法
JP7749799B2 (ja) ラムノースの特異性の高い糖転移酵素及びその応用
KR20210030487A (ko) 변이형 rpoc 암호화 서열을 포함하는 핵산 분자
KR20190003401A (ko) 신규한 o-숙시닐 호모세린 트랜스퍼라제 변이체 및 이를 이용한 o-숙시닐 호모세린의 제조방법
KR102277407B1 (ko) 신규한 글루타메이트 합성 효소 서브 유니트 알파 변이체 및 이를 이용한 l-글루탐산 생산 방법
KR20230122116A (ko) 변형 유전자 bbd29_04920에 의한 l-글루탐산 생산용재조합 균주, 이의 구축 방법 및 응용
KR20230149787A (ko) L-히스티딘 배출 단백질 및 이를 이용한 l-히스티딘 생산 방법
KR101836719B1 (ko) O-아세틸호모세린 설피드릴라제 변이체 및 이를 이용한 l-메치오닌 제조 방법
KR102112208B1 (ko) 신규한 o-숙시닐 호모세린 트랜스퍼라제 변이체 및 이를 이용한 o-숙시닐 호모세린의 제조방법
JP7828399B2 (ja) アルロースエピマー化酵素発現カセットおよびこれを用いたアルロース製造方法
KR20230122117A (ko) 변형 유전자 bbd29_09525에 의한 l-글루탐산 생산용재조합 균주, 이의 구축 방법 및 응용
US20250197872A1 (en) Allulose epimerase expression cassette and manufacturing method of allulose using the same
EP4428226A1 (en) Recombinant microorganism constructed based on lysine efflux protein and method for producing lysine
CN112877269A (zh) 生产赖氨酸的微生物以及赖氨酸的生产方法
KR20240104295A (ko) 과당으로부터 알룰로스를 제조하는 방법
EP4257689A1 (en) Novel promoter variant for constitutive expression and use thereof
KR102232837B1 (ko) 글루코실글리세롤 생산 활성을 가지는 신규한 폴리펩티드 및 이를 이용한 글루코실글리세롤 제조방법
CN116601300A (zh) 阿魏酸生物转化为香草醛
RU2841249C2 (ru) Рекомбинантный штамм с модифицированным геном bbd29_04920 для получения l-глутаминовой кислоты, а также способ его конструирования и применение
JP7634110B2 (ja) 変異型ＳｐｏＴタンパク質及びそれを用いたＬ－アミノ酸を生産する方法
RU2838163C1 (ru) Рекомбинантный штамм с модифицированным геном bbd29_09525 для получения l-глутаминовой кислоты, а также способ его конструирования и его применение

Legal Events

Date Code Title Description
A621 Written request for application examination

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621

Effective date: 20240801

RD04 Notification of resignation of power of attorney

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A7424

Effective date: 20250217

A131 Notification of reasons for refusal

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131

Effective date: 20250723

A601 Written request for extension of time

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A601

Effective date: 20250930

A521 Request for written amendment filed

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523

Effective date: 20251217

A521 Request for written amendment filed

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A821

Effective date: 20251217

TRDD Decision of grant or rejection written
A01 Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model)

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01

Effective date: 20260203

A61 First payment of annual fees (during grant procedure)

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61

Effective date: 20260227

R150 Certificate of patent or registration of utility model

Ref document number: 7828399

Country of ref document: JP

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150