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JP7833799B2 - Ｃｏｖｉｄ－１９の処置のためのアロジェニックな組成物 - Google Patents
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JP7833799B2 - Ｃｏｖｉｄ－１９の処置のためのアロジェニックな組成物 - Google Patents

Ｃｏｖｉｄ－１９の処置のためのアロジェニックな組成物

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JP7833799B2 JP2023509458A JP2023509458A JP7833799B2 JP 7833799 B2 JP7833799 B2 JP 7833799B2 JP 2023509458 A JP2023509458 A JP 2023509458A JP 2023509458 A JP2023509458 A JP 2023509458A JP 7833799 B2 JP7833799 B2 JP 7833799B2
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Description

本開示は、ＣＯＶＩＤ－１９感染症の処置および／もしくは予防における、またはＣＯＶＩＤ－１９感染症に関連する症状の処置および／もしくは予防に使用するための、間葉系幹細胞／間質細胞のアロジェニックな集団および関連する組成物の使用に関し、集団および組成物は、複数のドナーから集めた細胞を含む。また本開示は、上記組成物を得るための方法に関する。
間葉系幹細胞（ＭＳＣ）は、表面マーカーＣＤ７３、ＣＤ９０、およびＣＤ１０５を発現し、ＣＤ１４、ＣＤ３４、およびＣＤ４５を発現しない非造血細胞である。ポリクローナルな培養として増殖する場合、これらは、自己再生および様々な形態の間葉への分化に関する能力を保持している不均一な細胞集団である（Ｄｏｍｉｎｉｃｉ， ｅｔ ａｌ． （２００６）， Ｃｙｔｏｔｈｅｒａｐｙ ８： ３１５－３１７）。ｉｎ ｖｉｔｒｏでは、ＭＳＣは標準的な組織培養条件下でプラスチックに接着し、骨芽細胞、脂肪細胞、および軟骨芽細胞へ分化する特性を有する。ＭＳＣは、最初に見出された骨髄でだけではなく、ほとんど全ての他の形態の組織、たとえばホウォートンゼリーおよび胎盤でも見出され得る。たとえば、ホウォートンゼリー由来のＭＳＣは、これらを炎症部位へ進むように誘導し、炎症性／免疫介在性の組織損傷に局所的に影響を与える、ホーミング能を有する。ＭＳＣの第１の作用様式は、内因性の修復を促進および刺激する環境を作製するパラ分泌因子または内分泌因子の放出を含む。ＭＳＣにより調節される特徴的なプロセスは、これらが、免疫調節、常在の組織細胞または局所的な前駆体細胞の増殖の刺激を含む内因性の修復または再生のための環境に寄与していることである。
コロナウイルス－１９（ＣＯＶＩＤ－１９）は、ヒトへとウイルスが侵入する種の第３の文書化された例である。コロナウイルスは、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ、ＭＥＲＳ－ＣｏＶ、およびＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２を含む上気道の感染症に主に関連するウイルスの科である（Ｌｉ Ｙ． Ｚｈｏｕ Ｗ， Ｙａｎｇ Ｌ， Ｙｏｕ Ｒ． Ｐｈａｒｍａｃｏｌ Ｒｅｓ． ２０２０； １５７：１０４８３３）。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２（ＣＯＶＩＤ－１９）に感染した患者は、発熱および乾性咳を含むある範囲の症状を伴う典型的なウイルス性疾患の症状を呈する。呼吸器系の混乱は、この疾患で一般的であり、重篤な場合肺炎および急性呼吸窮迫症候群（ＡＲＤＳ）の発症を含む。また、嗅覚脱失、味覚異常、脳卒中を含む神経性の症状、血管性炎症、および多系統炎症を含む非呼吸器系の症状の有病率および関連性を示唆するエビデンスが増加している。
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２は、主に大気中の液滴の吸入を介して体内に入り、鼻腔および頬側口腔を浸潤し、これにより、呼吸器へのアクセスを得る。宿主の一次感染は、気管、気管支細気管支、および肺胞の表面を裏打ちする上皮を介して起こる。ウイルスの標的細胞への進入は、ウイルスのスパイクタンパク質により促進される。アンジオテンシン変換酵素２（ＡＣＥ２）は、標的細胞の表面で使用される進入受容体であり、セリンプロテアーゼＴＭＰＲＳＳ２は、スパイクタンパク質のプライミングに使用される（Ｌｉ ｅｔ ａｌ． ２００３； Ｎａｔｕｒｅ． ４２６：４５０－４５４； Ｇｌｏｗａｃｋａ ｅｔ ａｌ． ２０１１； Ｊ．Ｖｉｒｏｌ． ８５：４１２２－４１３４）。
ウイルスが呈される過多の症状を誘発できる機構は、調査中のままである。この中心は、自然免疫応答を誘発することである。このプロセスは、粘膜の分泌の誘導を伴い様々な要因により引き起こされ、これにより咳が発症される。同様に、組織に内在する顆粒球およびマクロファージは、ウイルスと相互作用し、炎症誘発性応答、ならびに身体の免疫細胞および防御機構の動員を誘発する。インターロイキン（ＩＬ）－１、ＩＬ－６、および腫瘍壊死因子α（ＴＮＦ－α）を含む炎症誘発性サイトカインは、この応答をさらに刺激する。このような経路の活性化は、視床下部のセットポイントを調節することにより体温の上昇をもたらす。
デキサメタゾンなどの別の目的で使用される薬物、回復期血漿、免疫グロブリンベースの処置を含む選択肢を含む、ＣＯＶＩＤ－１９の処置選択肢は、常に進化しているが、ＣＯＶＩＤ感染症および症状の改善された有効な処置が必要とされている。
ＭＳＣは、ＡＬＳおよびＭＳを含む異なる神経性疾患の処置、および同様に移植片対宿主病（ＧｖＨＤ）、関節炎、ＳＬＥ、自己免疫性糖尿病の処置で提案されており（Ｐａｌａｄｉｎｏ ｅｔ ａｌ．， Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｖｏｌｕｍｅ ２０１９， Ａｒｔｉｃｌｅ ＩＤ ３５４８９１７，）、多くの臨床試験が行われている。
しかしながら、ＭＳＣの使用に関して限定となる要因は、大量の望ましい特性を有する細胞を得ることが困難であることである。さらに、単一のバッチの産生のため１名のドナーからの細胞の増殖が、一般に使用されており、次のバッチは、通常、別のドナー由来の細胞を使用する。よって、バッチ間のばらつきが、安全性および有効性の両方にとって主要な懸念事項である。この問題を克服するため、何名かの研究者が、ドナーを集め、混合したドナー産物としての細胞をｉｎ ｖｉｔｒｏで増殖させるための方法を開発した。これら方法は、細胞数に関連する問題を克服しているが、同様に、ドナーを集めることに対する差次的な応答による同じバッチ間の不均質の問題、たとえば重要な免疫抑制因子の発現の変化および炎症誘発性因子の増大に苦しんでいる（国際特許公開公報第２０１６／１９３８３６号、同第２０１２／１３１６１８号）。
これら課題は、過度な試験を伴う厄介な製造プロセスを経ることを細胞療法産業にもたらし、過剰な増殖の結果として、この細胞は、自身の有効性を失いかつ／または遺伝子が不安定となるリスクが増加し得る。さらに細胞の増殖がケースバイケースで行われ、レシピエント患者にとって最適なＭＳＣの用量を確保することが困難である場合、「本発明者らが増殖しなければならない細胞数を患者に提供すること」が、一般的な手法である。これは、処置のアウトカムおよび潜在的な有害な副作用を著しく予測不可能にする。さらに、適切なドナーを見出すプロセスは、時間と労力がかかり、適切なドナーが見出されるかどうかに関する不確実性を担持する。さらに、患者が移植したＭＳＣに対して抗体を発達させるリスクがある。特に、投与されるＭＳＣと患者が発達させるＭＳＣに対する抗体との間の用量応答の関連が予測される。この作用は、複数回の投与により深刻になり得る。
よって、炎症性疾患または病態、自己免疫疾患、移植拒絶、ＣＮＳ障害および限定するものではないが、ＣＯＶＩＤ－１９などのコロナウイルスを含むウイルス性障害の処置および／または予防を提供することがこの分野で非常に必要とされており、特に、この状況で、それを必要とする患者に適切な用量の細胞の投与を可能にするＭＳＣ集団が必要とされている。この産生は、バッチ間で変動が非常に少ない強力な製造プロセスを確保すべきであり、全てのバッチは、複数回の用量をもたらす。この細胞は、証明された効力を有し、同種感作および／またはドナーに特異的な抗体のリスクを最小限にするように製剤化される必要がある。さらに、上記集団が、ドナー－レシピエントの一致を必要とすることなく患者に即座に利用可能であることが望ましい。
本開示の目的は、従来技術の欠点を克服する、ＣＯＶＩＤ－１９感染症のための方法、作用物質、および処置、またはＣＯＶＩＤ－１９感染症に関連する症状の処置および／もしくは予防を提供することである。本明細書中記載される単離され、集められたアロジェニックなＭＳＣ集団が、興味深い治療の選択肢であることが想定されている。
よって、本開示は、それを必要とする患者への移植（たとえば限定するものではないが注入または注射）に適したＭＳＣ集団（集団は、強力な細胞を含み、低いまたはさらには統計的に有意ではないバッチ間のばらつきを呈し、処置した患者において低い同種免疫および／または同種感作をもたらす）を使用することにより、ＣＯＶＩＤ－１９感染症の処置またはＣＯＶＩＤ－１９感染症に関連する処置および／もしくは予防を提供することを目的とする。本発明の目的は、本明細書中記載の選択アルゴリズムを使用する、本明細書中開示される方法により入手可能な単離され、集められたアロジェニックなＭＳＣ集団の使用により達成される。
本明細書中使用される場合、用語「選択アルゴリズム」は、以下に定義される方法のステップ２～５を表し、言い換えると、培養または準備するステップおよび集めるステップを除き開示される全ての方法ステップを表す。さらなるステップが、本開示の範囲外となることなく選択アルゴリズムに追加され得ることが理解されるであろう。
ＣＯＶＩＤ－１９の状況下で、炎症誘発性微小環境の存在、たとえばウイルスＲＮＡによる高いレベルのＴＮＦ－αおよびインターフェロン（ＩＦＮ）－γ、ならびに／またはｔｏｌｌ様リガンド受容体３の刺激により、ＭＳＣは、制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）および制御性樹状細胞の頻度を促進し得る抗炎症性シグナルとして作用する、プロスタグランジンＥ２（ＰＧＥ２）、インドールアミン ２，３ ジオキシゲナーゼ（ＩＤＯ）、およびトランスフォーミング増殖因子β１（ＴＧＦβ１）を放出する（Ｂｅｒｎａｒｄｏ ａｎｄ Ｆｉｂｂｅ ２０１３； Ｃｅｌｌｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ． １３（４）：３９２－４０２により概説）。
よって、本開示の第１の態様では、ＣＯＶＩＤ－１９感染症の処置および／もしくは予防に使用するため、またはＣＯＶＩＤ－１９感染症に関連する症状の処置および／もしくは予防に使用するための、単離され、集められたアロジェニックなＭＳＣ集団であって、前記単離され、集められたアロジェニックなＭＳＣ集団が、少なくとも３名の個々のドナーに由来するＭＳＣを含み、いずれか１名のドナーに由来する細胞の数が、総細胞数の５０％を超えず、ＭＳＣが、最大１０回の継代に供されており、前記単離され、集められたアロジェニックなＭＳＣ集団が、
前記少なくとも３名超の個々のドナーからＭＳＣを培養または準備して、少なくとも３名超の個々のドナーに由来するＭＳＣ集団を得るステップと、
少なくとも３つのアッセイを使用して各個々のドナーに由来するＭＳＣ集団をアッセイして、前記各個々のドナーに由来するＭＳＣ集団の少なくとも３つのアッセイの結果を得るステップと、
各アッセイで、前記アッセイ結果に基づき個々のランキングスコアの値を前記各個々のドナー由来のＭＳＣ集団に割り当て、よって各個々のドナー由来のＭＳＣ集団の少なくとも３つの個々のランキングスコアの値を得るステップであって、高いランキングスコアの値が、より望ましいアッセイ結果を表すか、または低いランキングスコアの値が、より望ましいアッセイ結果を表す、ステップと、
前記少なくとも３つの個々のランキングスコアの値に基づき各個々のドナーに由来するＭＳＣ集団に総スコアの値を割り当てるステップであって、高いランキングスコアの値がより望ましいアッセイ結果を表す場合、高い総スコアの値がより望ましい集団特性を表すか、または低いランキングスコアの値がより望ましいアッセイ結果を表す場合、低い総スコアの値がより望ましい集団特性を表す、ステップと、
それらの総スコアの値に基づき望ましい集団特性を有する個々のドナーに由来するＭＳＣ集団のサブセットを選択するステップと、
前記選択された個々のドナーに由来するＭＳＣ集団を集めて、単離され、集められたアロジェニックなＭＳＣ集団を得るステップと
を含み、
前記少なくとも３つのアッセイのうちの少なくとも２つが、インドールアミン－２，３－ジオキシゲナーゼ（ｄｉｏｘｙｇｅｎｓａｓｅ）（ＩＤＯ）の活性を測定する１つのアッセイ；前記ＭＳＣにより分泌されるプロスタグランジンＥ２を測定する１つのアッセイ、および末梢血単核球（ＰＢＭＣ）の増殖に及ぼす前記ＭＳＣの効果を測定する１つのアッセイからなる群から選択され、
前記少なくとも３つのアッセイのうちの少なくとも１つが、免疫応答を抑制するＴ細胞の特性に及ぼす前記ＭＳＣの効果を測定する１つのアッセイ、樹状細胞の増殖および／またはアポトーシスに及ぼす前記ＭＳＣの効果を測定する１つのアッセイ、単球に及ぼす前記ＭＳＣの効果を測定する１つのアッセイ、ならびにミクログリア細胞および／またはミクログリア様細胞に及ぼす前記ＭＳＣの効果を測定する１つのアッセイからなる群から選択される、
方法により、入手可能である、単離され、集められたアロジェニックなＭＳＣ集団が提供される。
少なくとも３名の個々のドナーからの細胞を含む本明細書中開示される使用のための、単離され、集められたアロジェニックなＭＳＣ集団を得るための本明細書中開示される方法において、いずれか１名のドナーに由来する細胞数は、総細胞数の５０％を超えず、よって、集団が各ドナーに由来する有意な細胞数を含むこと、およびいずれか１名のドナーに由来する細胞が集団において優性ではないことが確保される。集団が、同様の数または同じ範囲の数の、異なる個々のドナーに由来する細胞を含むことが有用であるとされている。本発明者らは、本方法により得られる単離され、集められたアロジェニックなＭＳＣ集団が、低い免疫原性の特性を呈することを予測している。望ましい機能を有する細胞を選択するために、本明細書において選択アルゴリズムが使用される。さらに、選択アルゴリズムの基準と一致する複数のドナーから細胞を集めることは、バッチ間のばらつきを減らす。また本方法は、単離され、集められたアロジェニックなＭＳＣ集団が、選択アルゴリズムが望ましい特性を有する細胞を選択するように機能するため、強力な細胞を含むことを確保している。さらに、本明細書中記載の方法は、集めるステップにより大きなバッチの細胞を得ることを可能にする。特に、細胞が少ない回数の継代に供されている大きなバッチの細胞を得ることが可能である。さらに、この産物を集めることは、最終的な薬物産物を得る製剤化ステップに限定されることが強調されており、よって、細胞のさらなる増殖、ならびに産物の効力および機能に及ぼす関連する上記プロセスの負の影響に遭遇しないことが確保される。たとえば、従来技術の文書国際特許公開公報第２０１６／１９３８３６号、同第２０１２／１３１６１８号は、細胞産物を集めることおよびその後の増殖が、免疫抑制および／または免疫調節の可能性の喪失、ならびに炎症性マーカーの増大をもたらし得ることを教示している。さらに、上記文書は、この作用が、集められたバッチ間で差次的であることを開示しており、よって、ドナーを混合する際のバッチ間のばらつきに関する負の影響が表されている。さらに、大きなバッチはまた、製造コストの低減を可能にする。対照的に、細胞が集められない場合、特に細胞を少ない数の継代に供する場合、大きなバッチの細胞を得ることは困難である。驚くべきことに、本発明者らからのデータは、実際に、細胞をさらに増殖することなく産物を集めることが、集められた産物を構成する単一のドナー細胞と比較して、高い免疫抑制および／または免疫調節の可能性をもたらし得ることを示している。さらに、少ない継代の数は、ＭＳＣの高い効力に関連しており、よって、細胞は過度な回数の継代に曝露しないことが望ましい。明確にするため、継代培養は、一部または全ての細胞を以前の培養物から新鮮な増殖培地に移すことにより作製される新規の細胞または微生物の培養である。この行為は、継代培養または細胞の継代培養と呼ばれる。培養中の細胞の分裂のおおよその回数を記録するために、継代の回数が記録され得る。本明細書中使用される場合、用語「継代」は、細胞を以前の培養物から新鮮な増殖培地に移すことを表す。
よって、一実施形態では、本明細書中開示される使用のための、単離され、集められたアロジェニックなＭＳＣ集団であって、前記単離され、集められたアロジェニックなＭＳＣ集団におけるＭＳＣが、最大１０回の継代、たとえば最大９回の継代、たとえば最大８回の継代、たとえば最大７回の継代、たとえば最大６回の継代、たとえば最大５回の継代、たとえば最大４回の継代、たとえば最大３回の継代、たとえば１回、２回、または３回の継代、たとえば２または３回の継代に供されている、単離され、集められたアロジェニックなＭＳＣ集団が提供される。継代の回数は培養物に存在する細胞数に関連することが予想される。よって、十分な数の望ましい特性を有する細胞を保持するために、細胞数と維持される効力との間の均衡を保持することが有用であり得る。よって、一部の実施形態では、上記ＭＳＣは、２～６、たとえば２～５、たとえば２～４、たとえば２～３回の継代に供されている。
間葉系幹細胞（ＭＳＣ）は、表面マーカーＣＤ７３、ＣＤ９０、およびＣＤ１０５を発現し、ＣＤ１４、ＣＤ３４、およびＣＤ４５またはＣＤ１１ｂ、ＣＤ７９αまたはＣＤ１９およびＨＬＡ－ＤＲ表面分子の発現を欠いている、非造血性細胞である。ｉｎ ｖｉｔｒｏでは、ＭＳＣは、標準的な組織培養条件下でプラスチックに接着し、骨芽細胞、脂肪細胞、および軟骨芽細胞へと分化する特性を有する。本明細書中使用される場合、用語「ＭＳＣ」、「間葉系幹細胞」、「間葉系間質細胞」、および「骨髄間質細胞」は、上述の特性を有する細胞を表す。本開示は、ＩＳＣＴ（Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｓｏｃｉｅｔｙ ｆｏｒ Ｃｅｌｌ ａｎｄ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ）の基準によるＭＳＣの定義を支持している。ＭＳＣは、骨髄、末梢血、脂肪組織、歯組織、胎盤、臍帯、羊水、臍帯血、ホウォートンゼリー、脱落膜、類軟骨膜（ｃｈｏｎｄｒｉｏｎ ｍｅｍｂｒａｎｅ）、および羊膜を含む組織に由来し得る。理論に限定されるものではないが、ＭＳＣは、直接的な細胞の置き換え、栄養性因子の送達、および免疫調節を含む自身の幅広い範囲の潜在的な治療応答により、複合疾患、たとえば炎症性疾患または病態、自己免疫疾患、移植拒絶反応、およびＣＮＳ障害（特にＣＮＳ障害）を処置することに良好に適しているとみなされている。一部の研究者は、前臨床試験において、ＡＬＳなどのＣＮＳ障害の処置において見込みのあるＭＳＣ機構についての洞察を提供している。これらの最も重要なＡＬＳ処置の作用機構は、神経保護因子の分泌、神経炎症の低減、および運動ニューロンのアポトーシスの阻害を介した運動ニューロン近くへの保護環境の作製である可能性が最も高い。神経変性における間葉系幹細胞の有効性の潜在的な機構は、傍分泌作用および常在の神経細胞との細胞間での接触を介して達成され得る。サイトカイン、増殖因子、およびエキソソームを分泌するＭＳＣの特性は、潜在的に、血管新生、シナプス形成、軸索の再ミエリン化、および神経発生を含む再生プロセスを誘導および支持し得る。自身の免疫調節特性のため、ＭＳＣは、樹状細胞の成熟および遊走、リンパ球の活性化および増殖の抑制により、およびグリオーシスを低減することにより、中枢神経系の炎症応答を減弱し得る。さらに、ＭＳＣは、抗アポトーシス特性を有し、アストロサイトの機能を調節することにより興奮毒性を限定し得る。さらに、他の種類の幹細胞（胚性幹細胞または人工多能性幹細胞）と比較して、ＭＳＣは、良好な生体安全性プロファイルを有し、発がん性のリスクが低い（Ｒａ ｅｔ ａｌ．， （２０１１）． Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ Ｄｅｖ， ２０， １２９７－３０８）。
よって、一実施形態では、本明細書中開示される使用のための、単離され、集められたアロジェニックなＭＳＣ集団であって、前記ＭＳＣは、骨髄由来のＭＳＣ、末梢血由来のＭＳＣ、脂肪組織由来のＭＳＣ、歯組織由来のＭＳＣ、口腔粘膜由来のＭＳＣ、胎盤由来のＭＳＣ、臍帯由来のＭＳＣ、羊水由来のＭＳＣ、臍帯血由来のＭＳＣ、ホウォートンゼリー由来のＭＳＣ、脱落膜由来のＭＳＣ、類軟骨膜（ｃｈｏｎｄｒｉｏｎ ｍｅｍｂｒａｎｅ）由来のＭＳＣ、および羊膜由来のＭＳＣからなる群から選択される、単離され、集められたアロジェニックなＭＳＣ集団が提供される。特定の実施形態では、上記ＭＳＣは、胎盤由来のＭＳＣ、臍帯由来のＭＳＣ、羊水由来のＭＳＣ、口腔粘膜由来のＭＳＣ、臍帯血由来のＭＳＣ、ホウォートンゼリー由来のＭＳＣ、脱落膜由来のＭＳＣ、類軟骨膜由来のＭＳＣ、歯髄および羊膜由来のＭＳＣ；たとえば胎盤由来のＭＳＣ、臍帯由来のＭＳＣ、羊水由来のＭＳＣ、臍帯血由来のＭＳＣ、ホウォートンゼリー由来のＭＳＣ、脱落膜由来のＭＳＣ、歯髄由来のＭＳＣ、および羊膜由来のＭＳＣ；たとえば胎盤由来のＭＳＣ、臍帯由来のＭＳＣ、羊水由来のＭＳＣ、臍帯血由来のＭＳＣ、ホウォートンゼリー由来のＭＳＣ、歯髄由来のＭＳＣ；たとえば胎盤由来のＭＳＣ、臍帯由来のＭＳＣ、臍帯血由来のＭＳＣ、およびホウォートンゼリー由来のＭＳＣ；たとえば臍帯由来のＭＳＣ、臍帯血由来のＭＳＣ、およびホウォートンゼリー由来のＭＳＣからなる群から選択される。
ＭＳＣまたは細胞がＭＳＣへと分化形質転換もしくは脱分化したＭＳＣの特徴を呈する細胞は、自身の以前の運命のエピジェネティックな特徴（エピジェネティックメモリーとも呼ばれる）を有し、これは上記分化形質転換または脱分化したＭＳＣの特性に影響し得る。理論により限定されるものではないが、たとえば、上記細胞の集団は、ネイティブなＭＳＣの集団よりも低い度合いでＭＳＣマーカーを発現し得、かつ／またはネイティブなＭＳＣと比較して低い度合いで他の細胞集団に影響し得る。対照的に、限定するものではないが、ホウォートンゼリーを含む上記に列挙された細胞の供給源のいずれか１つに由来する、ネイティブなＭＳＣ供給源に由来するＭＳＣ（言い換えるとネイティブなＭＳＣ）は、自身の胚葉を除く細胞へと操作されておらず、よって、マーカー発現または機能性などの要因に及ぼす負の影響はない。よって、上記ネイティブなＭＳＣ供給源に由来するＭＳＣは、高い度合いの望ましい特性を呈し得るとみなされている。
よって、本態様の一実施形態では、上記ＭＳＣは、ネイティブなＭＳＣ供給源に由来する。
本明細書中使用される場合、ＭＳＣの供給源に関連する用語「～に由来する」は、「～から単離された」と同じ意味を有することが理解される。これら用語は、本開示において互換可能に使用される。
本明細書中使用される場合、用語「ネイティブなＭＳＣ供給源」は、胎児および成年の臓器の中に存するＭＳＣの供給源を表し、それからＭＳＣを単離または派生させることは、特徴的なＭＳＣ表現型を誘導するために細胞の操作を全く必要としない。当業者は、この表現型が増殖したＭＳＣ供給源に関するＩＳＣＴガイドラインの通りに定義されていること、および初代ＭＳＣがプラスチックと接触および増殖する前に異なる細胞表面マーカープロファイルを発現することを理解していることが想定されている。また、ネイティブな供給源からＭＳＣを単離または派生させることは、分化転換および脱分化のステップを全く必要としない。
本明細書中使用される場合、用語「分化転換」は、１つの成熟細胞種が、異なる機能および／または表現型を有する別の成熟種へと移行するプロセスを説明するために使用される。このプロセスは、人工的に、たとえば系統のリプログラミングによるか、またはｉｎ ｖｉｖｏおよびｅｘ ｖｉｖｏでの両方で環境上の合図に応答して、起こり得る。
本明細書中使用される場合、用語「脱分化」は、細胞が特化した機能から幹細胞または前駆体細胞を連想させるより単純な状態へと退行するプロセスを表す。
近年、ＭＳＣは、組織再生における自身の多面的な機能により神経変性疾患の細胞療法において有望な候補として出現している。特に、ＭＳＣの免疫調節特性は、神経変性障害を含む炎症性疾患に関してそれらの治療において重要な役割を果たすことが同定されている。さらに、臍帯由来のＭＳＣまたはホォートンゼリー由来のＭＳＣは、非腫瘍形成性、抗腫瘍原性であり、固形腫瘍の増殖の亢進に関連するＴＡＦ表現型へと形質転換せず、造血性腫瘍の発達を抑制することが試験から表されている。よって、臍帯由来のＭＳＣまたはホトンゼリー由来のＭＳＣ（本明細書中ＷＪＭＳＣとも呼ばれる）は、この状況で特に有用であり得る。よって、一実施形態では、上記ＭＳＣは、臍帯由来のＭＳＣまたはホトンゼリー由来のＭＳＣ、たとえばホウォートンゼリー由来のＭＳＣである。
ＷＪＭＳＣは、高い免疫調節能、ならびに良好な増殖および分化の可能性を有することが示されており、細胞供給源から容易に入手可能であり、よって、ＷＪＭＳＣは、重要な細胞療法の供給源であり得る。ＷＪＭＳＣは、免疫特権的な特徴を有することが知られており、アロジェニックな状況に好適であり得るＢＭ－ＭＳＣおよび胎児ＭＳＣよりも免疫原性が低い。
前臨床試験は、ＭＳＣが、１２の神経遺伝子および１１の転写因子を発現することを示している（Ｂｌｏｎｄｈｅｉｍ， ２００６， Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ Ｄｅｖ． Ａｐｒ；１５（２）：１４１－６４．）。ＢＭ－ＭＳＣと比較して、ＷＪ－ＭＳＣは、神経栄養の支援、神経の成熟（（Ｄｒｅｌａ ｅｔ ａｌ， ２０１６ Ｃｙｔｏｔｈｅｒａｐｙ． Ａｐｒ；１８（４）：４９７－５０９、細胞接着、増殖、および免疫系の機能に関与する遺伝子を過剰発現することが示されており、適切な刺激の下、ＷＪＭＳＣは、ｉｎ ｖｉｔｒｏでニューロン様細胞へと分化し得る（Ｄｏｎｄｅｒｓ， ２０１８， Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ Ｄｅｖ． Ｊａｎ １５；２７（２）：６５－８４； Ｉｓｈｉｉ， Ｎｅｕｒｏｓｃｉ Ｌｅｔｔ；１６３：１５９－６２）。よって、理論により拘束されるものではないが、ＷＪＭＳＣは、神経変性障害を含むＣＮＳ障害の細胞療法に適切であり得る。
本明細書中開示される使用のための、単離され、集められたアロジェニックなＭＳＣ集団の一部の実施形態では、単離され、集められたアロジェニックなＭＳＣ集団が、いずれかのアロジェニックなヒト白血球抗原（ＨＬＡ）の濃度が単一のドナー由来の細胞または数名のドナー由来の細胞を使用した場合よりも低いことを確かにするために、３名超のドナーに由来するＭＳＣを含むことが有用であり得る。これは、単離され、集められたアロジェニックなＭＳＣ集団を投与した患者において抗ＨＬＡ抗体（すなわちドナーに特異的な抗体、ＤＳＡ）の産生のリスクを低減することが想定されている。本発明者らは、単離され、集められたアロジェニックなＭＳＣ集団におけるいずれかの特異的なＨＬＡのアレルの低い濃度が、上記細胞の単回および複数回の投与に関連する有害な作用のリスクを低減すると予想している。さらに、複数のドナー由来の細胞を使用することにより、バッチのばらつきを少なくし得る。製造のため認定されており、大きなスケールの臨床グレードの薬物産物への拡大におけるすべてのＧＭＰの品質基準を通過したドナー間のばらつきは、全てのドナーからの結果を集めるために選択されたドナーからの結果と比較する場合、最大４０％またはさらにはそれ以上、低減している。特異的なアッセイのばらつきの低減は、選択アルゴリズムに基づき、特定のバッチに関して評価される選択されるドナーと全てのドナーとの間に最大４０％またはさらにはそれ以上の、全体的なばらつきの評価の低減をもたらすことが想定される。ＭＳＣのＧＭＰ生産は、ドナーのばらつきを顕著に低減し、選択アルゴリズムは、最大４０％またはさらにはそれ以上、ばらつきをさらに低減し、統計的有意性を伴わないバッチ間のばらつきをもたらす。
よって、一実施形態では、上記本明細書中開示される使用のための集団は、少なくとも４名の個々のドナー、たとえば少なくとも５名の個々のドナー、たとえば少なくとも６名の個々のドナー、たとえば少なくとも７名の個々のドナー、たとえば少なくとも８名の個々のドナー、たとえば少なくとも９名のドナー、たとえば少なくとも１０名の個々のドナーに由来するＭＳＣを含む。別の実施形態では、使用のための、単離され、集められたアロジェニックなＭＳＣ集団は、３～２０の個々のドナー、たとえば３－１５名の個々のドナー、たとえば３－１０名の個々のドナー、たとえば４－８名の個々のドナー、たとえば５－７名の個々のドナー、たとえば５、６、または７名の個々のドナーに由来するＭＳＣを含む。１つの特定の実施形態では、各個々のドナーに由来するＭＳＣ集団をアッセイするステップは、集めるステップで集めた個々のドナーに由来するＭＳＣ集団の数よりも少なくとも１個多い、たとえば少なくとも２個多い、たとえば少なくとも３個多い、たとえば少なくとも４個多い、たとえば少なくとも５個多い、たとえば少なくとも６個多い、たとえば少なくとも７個多い、たとえば少なくとも８個多い、たとえば少なくとも９個多い、たとえば少なくとも１０個多い、個々のドナーに由来するＭＳＣ集団をアッセイするステップを含む。１つの特定の実施形態では、上記各個々のドナーに由来するＭＳＣ集団をアッセイするステップは、集めるステップで集めた個々のドナーに由来するＭＳＣ集団の数よりも少なくとも１～４倍、たとえば２～４倍、たとえば２～３または３～４倍多い個々のドナーに由来するＭＳＣ集団をアッセイするステップを含む。よって、たとえば、本明細書中開示される使用のための、単離され、集められたアロジェニックなＭＳＣ集団が、３名の個々のドナーに由来するＭＳＣ集団に由来するＭＳＣを含む場合、各個々のドナーに由来するＭＳＣ集団をアッセイするステップは、３～１２、たとえば６～１２、たとえば６～９または９～１２の個々のドナーに由来するＭＳＣ集団をアッセイするステップを含む。この例では、３名のみの個々のドナーに由来するＭＳＣ集団が、集めるために選択され、残りの個々のドナーに由来するＭＳＣ集団は廃棄される。
本開示の一実施形態では、上記ＭＳＣを培養または準備するステップは、少なくとも４名の個々のドナーに由来するＭＳＣ集団、たとえば少なくとも５、たとえば少なくとも６、たとえば少なくとも７、たとえば少なくとも８、たとえば少なくとも９、たとえば少なくとも１０、たとえば少なくとも１１、たとえば少なくとも１２、たとえば少なくとも１３、たとえば少なくとも１４、たとえば少なくとも１５、たとえば少なくとも１６、たとえば少なくとも１７、たとえば少なくとも１８、たとえば少なくとも１９、たとえば少なくとも２０の個々のドナーに由来するＭＳＣ集団を得るために少なくとも４名の個々のドナーからＭＳＣを培養または準備するステップを含む。たとえば約３～約５０の個々のドナーに由来するＭＳＣ集団、たとえば約４～約５０、たとえば約５～約５０、たとえば約６～約５０、たとえば約６～約３０、たとえば約６～約２０、たとえば約６～約１５、たとえば約８～約１２の個々のドナーに由来するＭＳＣ集団が、準備または培養され得る。
本明細書中開示される使用のための、単離され、集められたアロジェニックなＭＳＣ集団の一部の実施形態では、上記各個々のドナーに由来するＭＳＣ集団をアッセイするステップは、少なくとも３、たとえば少なくとも４、たとえば少なくとも５、たとえば少なくとも６、たとえば少なくとも７、たとえば少なくとも８、たとえば少なくとも９、たとえば少なくとも１０、たとえば少なくとも１１、たとえば少なくとも１２、たとえば少なくとも１３、たとえば少なくとも１４、たとえば少なくとも１５、たとえば少なくとも１６、たとえば少なくとも１７、たとえば少なくとも１８、たとえば少なくとも１９、たとえば少なくとも２０の個々のドナーに由来するＭＳＣ集団をアッセイするステップを含む。別の実施形態では、上記各個々のドナーに由来するＭＳＣ集団をアッセイするステップは、約３～５０の個々のドナーに由来するＭＳＣ集団、たとえば約４～約５０、たとえば約５～約５０、たとえば約６～約５０、たとえば約６～約３０、たとえば約６～約２０、たとえば約６～約１５、たとえば約８～約１２の個々のドナーに由来するＭＳＣ集団をアッセイするステップを含む。一実施形態では、約３～約２０の個々のドナーに由来するＭＳＣ集団がアッセイされ、たとえば８、９、１０、１１、１２、１３、１４の個々のドナーに由来するＭＳＣ集団がアッセイされ得る。本明細書中記載の方法の本ステップでアッセイされる個々のドナーに由来するＭＳＣ集団は、上記方法による培養または準備のステップで得られることを理解されたい。
本明細書中開示されるＭＳＣの免疫抑制能は、治療での使用でのそれらの適合性に非常に重要であり得ることが理解される。本明細書中使用される場合、用語「免疫抑制能」は、免疫系の機能の活性化または有効性または調節の低減を誘発する特性を表す。当業者は、免疫抑制能が、アッセイにおいて直接または間接的に測定され得ることを理解している。
本明細書中記載の使用のための、単離され、集められたアロジェニックなＭＳＣ集団は、少なくとも３つのアッセイを使用して各個々のドナーに由来するＭＳＣ集団をアッセイして、前記各個々のドナーに由来するＭＳＣ集団の少なくとも３つのアッセイ結果を得るステップを含む方法により、入手可能である。本明細書中開示されるように、上記少なくとも３つのアッセイのちの２つは、インドールアミン－２，３－ジオキシゲナーゼ（ｄｉｏｘｙｇｅｎｓａｓｅ）（ＩＤＯ）の活性を測定する１つのアッセイ；上記ＭＳＣにより分泌されるプロスタグランジンＥ２を測定する１つのアッセイ；および末梢血単核球（ＰＢＭＣ）の増殖に及ぼすＭＳＣの効果を測定する１つのアッセイからなる群から選択される。
免疫抑制の潜在力は、培養物の上清におけるトリプトファンおよびキヌレニンを測定することにより決定される、ＩＤＯ活性の測定値として報告され得る。ＩＤＯは、ヒトにおいて、ＩＤＯ１遺伝子によりコードされるヘム含有酵素である。ＩＤＯ酵素は、Ｌ－トリプトファンを、Ｔ細胞を含む免疫細胞の増殖の阻害剤として作用する免疫抑制分子である、Ｎ－ホルミルキヌレニン（またはキヌレニン）に変換する。ＩＤＯ活性は、キヌレニン／トリプトファンの比率として提示され得、たとえばＥＬＩＳＡキットを使用して細胞培養物の上清に存在するトリプトファンおよびキヌレニンの量を計算することにより決定され得る。腫瘍壊死因子の存在下または不存在下でインターフェロンγ（ＩＦＮγ）を用いて刺激した場合、間葉系幹細胞／間質細胞（ＭＳＣ）は、刺激しない場合よりも多くのＩＤＯを分泌する。一実施形態では、上記ＩＤＯ活性を測定するアッセイは、刺激したＰＢＭＣまたは精製したＴ細胞または活性化した単球／マクロファージまたはミクログリアと共培養したＭＳＣの培養上清の中のＩＤＯ活性を測定するステップを含むかまたはからなる。一実施形態では、ＩＤＯ活性を測定することは、上述のように行われ得る。誘導性ＩＤＯ活性は、細胞が、本発明者らが本明細書中記載されるＭＳＣの重要な品質特性を検討する、抗細菌性および抗ウイルス性の機能、免疫調節、および／または免疫抑制に関連した機能的な効力を有することを表している。上記アッセイは、インドールアミン－２，３－ジオキシゲナーゼ（ｄｉｏｘｙｇｅｎｓａｓｅ）（ＩＤＯ）の活性、よって上記ＭＳＣの免疫抑制能を測定する。
さらに、ＭＳＣは、上記ＭＳＣにより分泌されるプロスタグランジンＥ２を測定するようにアッセイされ得る。プロスタグランジンＥ２（ＰＧＥ２）は、酵素プロスタグランジンシンテターゼによりアラキドン酸から合成されるプロスタグランジンＨ２から、様々な細胞において形成される。ＰＧＥ２は、血管拡張、抗炎症作用および炎症誘発性作用、睡眠／覚醒サイクルの調節、ならびにヒト免疫不全ウイルスの複製の促進を含む多くの生体作用を有する。ＰＧＥ２は、炎症、免疫制御、発熱の発生、疼痛知覚、胃粘膜（ｇａｓｔｒｉｃ ｍｕｓｃｏｓａ）の保護、妊孕性および分娩、ならびにナトリウムおよび水の保持において活性である。同様に、ＰＧＥ２は、抗線維化機能を有する。ＰＧＥ２は、ｉｎ ｖｉｖｏで迅速に代謝され、循環系におけるＰＧＥ２の半減期は、約３０秒であり、正常な血漿レベルは、３～１２ｐｇ／ｍＬである。ＰＧＥ２は、異なる段階の免疫応答および異なる免疫のエフェクター機能の制御に関与している。ＭＳＣは、構成的にＰＧＥ２を産生し、それらの増殖は、ｃＡＭＰ依存性タンパク質キナーゼのアイソフォームの差次的な活性化を介してこのプロスタグランジンにより制御される。このＰＧＥ２の産生は、局所的な環境に感受性があり、ここで炎症性シグナルはその誘導を刺激する。免疫細胞、および／または（ＩＮＦγと組み合わせるかまたは単独での）腫瘍壊死因子αと共培養する間、ＭＳＣによりＰＥＧ２の産生は、実質的に増大し、ＭＳＣの免疫調節作用に関与する。さらに、ＭＳＣ誘導性免疫抑制効果におけるＰＧＥ２の役割は、Ｒａｓｍｕｓｓｏｎら（Ｒａｓｍｕｓｓｏｎ ｅｔ ａｌ．， （２００５） Ｅｘｐ．Ｃｅｌｌ．Ｒｅｓ， ３０５ （１） （２００５）， ｐｐ． ３３－４１）により報告されているように、Ｔ細胞の刺激に応じて変化する。ＰＧＥ２は、同種抗原よりもＰＨＡにより活性化されるＴ細胞のＭＳＣ阻害に有効である。ＭＳＣは、リンパ球の活性化を予防し、ＣＯＸ１／ＣＯＸ２発現の調節を介したＴ細胞増殖、および最終的にＰＧＥ２の産生の阻害を誘導する。よって、免疫抑制能の測定値として、末梢血単核球（ＰＢＭＣ）およびＭＳＣの共培養物からの細胞培養物の上清で見出されるＰＧＥ２の分泌の量を使用することが可能である。一実施形態では、上記ＭＳＣの免疫抑制能を測定する少なくとも１つのアッセイは、上記ＭＳＣにより分泌されるプロスタグランジンＥ２を測定する。一実施形態では、上記ＭＳＣにより分泌されるプロスタグランジンＥ２を測定する少なくとも１つのアッセイは、ＰＢＭＣ、たとえばＰＨＡで刺激したＰＢＭＣ、たとえばＰＨＡで刺激したＴリンパ球、活性化した単球／マクロファージおよび／またはミクログリアと共培養した際の、上記ＭＳＣにより分泌されるプロスタグランジンＥ２を測定するステップを含む。一実施形態では、上記ＭＳＣにより分泌されるプロスタグランジンＥ２を測定する１つのアッセイは、ＩＮＦγおよび／または腫瘍壊死因子αと共培養したＭＳＣにより分泌されるＰＧＥ２の分泌を測定するステップを含むかまたはからなる。
また、ＭＳＣが有する末梢血単核球（ＰＢＭＣ）の増殖に及ぼす免疫抑制作用を定量的に測定することが可能である。ＭＳＣは、Ｔリンパ球の増殖を抑制することが示されている。ＭＳＣとの混合リンパ球反応は、ＭＳＣの免疫抑制活性を示すために頻繁に使用されている。一実施形態では、前記ＭＳＣの免疫抑制能を測定する少なくとも１つのアッセイは、末梢血単核球（ＰＢＭＣ）、たとえばＴリンパ球の増殖、たとえばＴリンパ球の増殖、たとえばフィトヘマグルチニン（ＰＨＡ）で刺激したＴリンパ球の増殖に及ぼすＭＳＣの効果を測定する。ＰＨＡは、Ｔリンパ球の増殖を活性化するマイトジェンとして使用される。よって、一実施形態では、上記ＰＢＭＣの増殖は、Ｔリンパ球の増殖、たとえばＰＨＡで刺激したＴリンパ球の増殖である。ＭＳＣの免疫抑制活性は、ＰＨＡで刺激したＴリンパ球の増殖の減少として定量化され得る。
上記少なくとも３つのアッセイのうちの少なくとも２つは、独立して、インドールアミン－２，３－ジオキシゲナーゼ（ｄｉｏｘｙｇｅｎｓａｓｅ）（ＩＤＯ）の活性を測定する１つのアッセイ；上記ＭＳＣにより分泌されるプロスタグランジンＥ２を測定する１つのアッセイ；および末梢血単核球（ＰＢＭＣ）の増殖に及ぼす上記ＭＳＣの効果を測定する１つのアッセイから選択され得る。よって、上記少なくとも２つのアッセイは、ＩＤＯ活性を測定する１つのアッセイおよびＰＧＥ２を測定する１つのアッセイ；またはＩＤＯ活性を測定する１つのアッセイおよびＰＢＭＣの増殖を測定する１つのアッセイ；またはＰＧＥ２を測定する１つのアッセイおよびＰＢＭＣの増殖を測定する１つのアッセイであり得る。上記少なくとも２つのアッセイはまた、上記３つのアッセイ全てを含み得る。
同様に、上記少なくとも３つのアッセイのうちの少なくとも１つは、独立して、免疫応答を抑制するＴ細胞の特性に及ぼすＭＳＣの効果を測定する１つのアッセイ；樹状細胞の増殖および／またはアポトーシスに及ぼす上記ＭＳＣの効果を測定する１つのアッセイ、単球に及ぼす上記ＭＳＣの効果を測定する１つのアッセイ、ならびにミクログリア細胞および／またはミクログリア様細胞に及ぼす上記ＭＳＣの効果を測定する１つのアッセイからなる群から選択され得る。しかしながら、上記少なくとも１つのアッセイは、上記アッセイのうちのいずれか２、または３、または４つ全てを含み得る。よって、上記少なくとも１つのアッセイは、免疫応答を抑制するＴ細胞の特性に及ぼすＭＳＣの効果を測定する１つのアッセイならびに樹状細胞の増殖および／もしくはアポトーシスに及ぼす上記ＭＳＣの効果を測定する１つのアッセイ；または樹状細胞の増殖および／もしくはアポトーシスに及ぼす上記ＭＳＣの効果を測定する１つのアッセイならびにミクログリア細胞および／もしくミクログリア様細胞に及ぼす上記ＭＳＣの効果を測定する１つのアッセイ；または、免疫応答を抑制するＴ細胞の特性に及ぼすＭＳＣの効果を測定する１つのアッセイならびにミクログリア細胞および／もしくはミクログリア様細胞に及ぼす上記ＭＳＣの効果を測定する１つのアッセイ；または免疫応答を抑制するＴ細胞の特性に及ぼすＭＳＣの効果を測定する１つのアッセイならびに単球に及ぼす上記ＭＳＣの効果を測定する１つのアッセイ；または樹状細胞の増殖および／もしくはアポトーシスに及ぼす上記ＭＳＣの効果を測定する１つのアッセイならびに単球に及ぼす上記ＭＳＣの効果を測定する１つのアッセイ；またはミクログリア細胞および／もしくはミクログリア様細胞に及ぼす上記ＭＳＣの効果を測定する１つのアッセイならびに単球に及ぼす上記ＭＳＣの効果を測定する１つのアッセイであり得る。一実施形態では、上記少なくとも１つのアッセイは、免疫応答を抑制するＴ細胞の特性に及ぼすＭＳＣの効果を測定する１つのアッセイ；樹状細胞の増殖および／またはアポトーシスに及ぼす上記ＭＳＣの効果を測定する１つのアッセイ、単球に及ぼす上記ＭＳＣの効果を測定する１つのアッセイ、ならびにミクログリア細胞および／またはミクログリア様細胞に及ぼす上記ＭＳＣの効果を測定する１つのアッセイからなる群から選択される３つのアッセイのうちの１つのアッセイであり得る。また、上記少なくとも１つのアッセイはまた、４つ全てのアッセイを含み得る。
明確にするため、上記少なくとも３つのアッセイのうちの少なくとも２つは、独立して、インドールアミン－２，３－ジオキシゲナーゼ（ｄｉｏｘｙｇｅｎｓａｓｅ）（ＩＤＯ）の活性を測定する１つのアッセイ；上記ＭＳＣにより分泌されるプロスタグランジンＥ２を測定する１つのアッセイ；および末梢血単核球（ＰＢＭＣ）の増殖に及ぼす上記ＭＳＣの効果を測定する１つのアッセイからなる群から選択され得、これらは、独立して、免疫応答を抑制するＴ細胞の特性に及ぼすＭＳＣの効果を測定する１つのアッセイ；樹状細胞の増殖および／またはアポトーシスに及ぼす上記ＭＳＣの効果を測定する１つのアッセイ、単球に及ぼす上記ＭＳＣの効果を測定する１つのアッセイ、ならびにミクログリア細胞および／またはミクログリア様細胞に及ぼす上記ＭＳＣの効果を測定する１つのアッセイからなる群から選択され得る少なくとも３つのアッセイのうちのいずれかの少なくとも１つと組み合わされてもよい。
Ｔ制御性（Ｔｒｅｇ）細胞は、免疫応答を抑制する特性を有するＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｔ細胞の下位集団として同定されている。この下位集団は、ＣＤ１２７の発現の欠損またはＦｏｘＰ３の陽性発現によりさらに特徴づけられ得る。この細胞のフラクションは、Ｔ細胞が上記ＭＳＣに曝露する場合に増大すると予測されている。この作用は、たとえば、フローサイトメトリーにより分析され得る。よって、一実施形態では、上記少なくとも３つのアッセイのうちの少なくとも１つは、免疫応答を抑制するＴ細胞の特性に及ぼす上記ＭＳＣの作用を測定するアッセイである。一実施形態では、上記免疫応答を抑制するＴ細胞の特性は、Ｔ細胞集団のＴ制御性細胞のフラクション、たとえばＣＤ２５＋Ｔ細胞のフラクション、たとえば総ＣＤ４＋Ｔ細胞集団のＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｔ細胞のフラクションとして測定される。一実施形態では、作用は、上記ＭＳＣおよびＴ細胞の共培養の間に測定される。一実施形態では、上記共培養は、刺激、たとえばＰＨＡおよびリポ多糖（ＬＰＳ）から選択される刺激の存在下にある。一実施形態では、Ｔｒｅｇ発現のフラクションの増加は、望ましい結果を表す。
Ｆｍｓ関連チロシンキナーゼ３－リガンド（ＦＬＴ３Ｌ）は、造血における樹状細胞（ＤＣ）の関与の重要な制御因子であり、ＦＬＴ３への結合を介して造血性細胞の増殖、分化、およびアポトーシスを制御する（Ｙｕａｎ ｅｔ ａｌ （２０１９）， Ｎａｔｕｒｅ Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ ｖｏｌｕｍｅ １０， Ａｒｔｉｃｌｅ ｎｕｍｂｅｒ： ２４９８）。ＭＳＣは、ＣＤ１ｃ＋ＤＣ上のＦＬＴ３に結合するＦＬＴ３Ｌを発現して免疫寛容原性ＣＤ１ｃ＋ＤＣの増殖を促進し、アポトーシスを阻害する。ＭＳＣのＦＬＴ３Ｌの発現は、たとえばＰＨＡまたはＬＰＳで刺激するかまたは刺激せずに、ＰＢＭＣとの共培養においてＥｌＩＳＡにより測定され得る。
ＣＤ１ｃ＋である細胞のフラクションは、ＭＳＣが寛容性を誘導する際に上記ＭＳＣの存在下で増大することが予測される。この作用は、たとえばフローサイトメトリーにより分析され得る。
よって、一実施形態では、上記少なくとも３つのアッセイのうちの少なくとも１つは、樹状細胞の増殖および／またはアポトーシスに及ぼす上記ＭＣＳの作用を測定するアッセイである。一実施形態では、上記作用は、上記ＭＳＣおよびＤＣの共培養の間に測定される。一実施形態では、上記共培養は、ＰＨＡおよびリポ多糖（ＬＰＳ）から選択される刺激などの刺激の存在下にある。一実施形態では、ＣＤ１ｃを発現するＤＣのフラクションの増大は、望ましい結果を表す。
たとえば、本明細書中開示される使用のための、単離され、集められたアロジェニックなＭＳＣ集団の一部の実施形態では、上記少なくとも３つのアッセイは、インドールアミン－２，３－ジオキシゲナーゼ（ｄｉｏｘｙｇｅｎｓａｓｅ）（ＩＤＯ）の活性を測定する１つのアッセイ；上記ＭＳＣにより分泌されるプロスタグランジンＥ２を測定する１つのアッセイ；および免疫応答を抑制するＴ細胞の特性に及ぼす上記ＭＳＣの効果を測定する１つのアッセイ、またはインドールアミン－２，３－ジオキシゲナーゼ（ｄｉｏｘｙｇｅｎｓａｓｅ）（ＩＤＯ）の活性を測定する１つのアッセイ；ＰＢＭＣの増殖に及ぼす上記ＭＳＣの効果を測定する１つのアッセイ；および免疫応答を抑制するＴ細胞の特性に及ぼす上記ＭＳＣの効果を測定する１つのアッセイ、
または上記ＭＳＣにより分泌されるプロスタグランジンＥ２を測定する１つのアッセイ；ＰＢＭＣの増殖に及ぼす上記ＭＳＣの効果を測定する１つのアッセイ；および免疫応答を抑制するＴ細胞の特性に及ぼす上記ＭＳＣの効果を測定する１つのアッセイ、
またはインドールアミン－２，３－ジオキシゲナーゼ（ｄｉｏｘｙｇｅｎｓａｓｅ）（ＩＤＯ）の活性を測定する１つのアッセイ；上記ＭＳＣにより分泌されるプロスタグランジンＥ２を測定する１つのアッセイ；および末梢血単核球（ＰＢＭＣ）の増殖に及ぼす上記ＭＳＣの効果を測定する１つのアッセイ；および免疫応答を抑制するＴ細胞の特性に及ぼす上記ＭＳＣの効果を測定する１つのアッセイ
を含む。
たとえば、本明細書中開示される一部の実施形態では、上記少なくとも３つのアッセイは、
インドールアミン－２，３－ジオキシゲナーゼ（ｄｉｏｘｙｇｅｎｓａｓｅ）（ＩＤＯ）の活性を測定する１つのアッセイ；上記ＭＳＣにより分泌されるプロスタグランジンＥ２を測定する１つのアッセイ；ならびに樹状細胞の増殖および／またはアポトーシスに及ぼす上記ＭＳＣの効果を測定する１つのアッセイ、
またはインドールアミン－２，３－ジオキシゲナーゼ（ｄｉｏｘｙｇｅｎｓａｓｅ）（ＩＤＯ）の活性を測定する１つのアッセイ；ＰＢＭＣの増殖に及ぼす上記ＭＳＣの効果を測定する１つのアッセイ；ならびに樹状細胞の増殖および／またはアポトーシスに及ぼす上記ＭＳＣの効果を測定する１つのアッセイ、
または上記ＭＳＣにより分泌されるプロスタグランジンＥ２を測定する１つのアッセイ；ＰＢＭＣの増殖に及ぼす上記ＭＳＣの効果を測定する１つのアッセイ；ならびに樹状細胞の増殖および／またはアポトーシスに及ぼす上記ＭＳＣの効果を測定する１つのアッセイ、
またはインドールアミン－２，３－ジオキシゲナーゼ（ｄｉｏｘｙｇｅｎｓａｓｅ）（ＩＤＯ）の活性を測定する１つのアッセイ；上記ＭＳＣにより分泌されるプロスタグランジンＥ２を測定する１つのアッセイ；および末梢血単核球（ＰＢＭＣ）の増殖に及ぼす上記ＭＳＣの効果を測定する１つのアッセイ；ならびに樹状細胞の増殖および／またはアポトーシスに及ぼす上記ＭＳＣの効果を測定する１つのアッセイ
を含む。
本明細書中開示される使用のための、単離され、集められたアロジェニックなＭＳＣ集団を得るための方法はまた、さらなるアッセイを含み得ることを理解されたい。
ミクログリアは、脳および脊髄にわたり局在している神経膠細胞（グリア細胞）の一種である。ミクログリアは、脳の中で見出される全細胞の１０～１５％を構成しており、それらは、中枢神経系（ＣＮＳ）において能動的な免疫防御の最初の主な形態として作用する。活性化後、ミクログリアは、異なる細胞表面および細胞内のマーカーを提示し、異なる因子を分泌し、かつ異なる機能を呈する多様な表現型を獲得することができる。さらに、この細胞は、炎症応答の間、異なる表現型の間、たとえばＭ１からＭ２への表現型へと移行することができる。Ｍ１ミクログリアは、通常、侵襲に対する最初のレスポンダーである。ＩＮＦγおよびＴＮＦ－α（腫瘍壊死因子α）を含むアストロサイトおよびＴｈ１細胞により放出されるサイトカイン、細菌由来産物、たとえばリポ多糖（ＬＰＳ）、ならびに外傷により誘導される細胞のデブリは、Ｍ１表現型に向けてミクログリアを極性化する。Ｍ１ミクログリアは、炎症誘発性サイトカイン、ケモカイン、およびレドックスシグナリング分子を産生する。またこれらは、自身の細胞表面にスカベンジャー受容体、およびＭＨＣクラスＩＩおよび共刺激分子を発現する。これら作用は、Ｍ１ミクログリアに、外来のデブリおよび細胞のデブリを殺滅および貪食させ、免疫応答に着手するためにＴ細胞を動員および分化させる。経時的に、炎症応答はより抗炎症性にシフトされ、これはＭ２ミクログリアにより促進される。ミクログリアは、通常Ｔｈ２細胞から放出されるＩＬ－４またはＩＬ―１３で刺激された後に、Ｍ２表現型へと極性化される。Ｍ２ミクログリアは、炎症応答の減弱および損傷した組織の修復を促進する抗炎症性サイトカインおよび増殖因子を分泌する。
たとえば、上記ＭＳＣが有するミクログリア細胞の増殖に及ぼす免疫抑制作用を定量的または定性的に測定するか、またはミクログリアの表現型に及ぼす上記ＭＳＣの作用をアッセイする１つまたは複数のアッセイが使用され得る。本明細書中使用される場合、これらアッセイは、「ミクログリアアッセイ」と呼ばれる。上記ミクログリアアッセイは、たとえばＨＭＣ３細胞またはＣＨＭＥ５細胞などの不死化細胞株を使用し得る。あるいは、生検由来の初代ミクログリア、または臍帯血から培養した初代ミクログリア様細胞、または不死化したミクログリア細胞、たとえばＤＵＯＣ－０１細胞が使用され得る。当業者は、ミクログリアアッセイでの使用に適切であり得る他の細胞株（不死化または初代）に精通している。
本明細書中開示される使用のための、単離され、集められたアロジェニックなＭＳＣ集団の一実施形態では、上記ミクログリア細胞またはミクログリア様細胞に及ぼす上記ＭＳＣの効果を測定する１つのアッセイは、ミクログリア細胞またはミクログリア様細胞の増殖を測定する１つのアッセイ；ミクログリア細胞またはミクログリア様細胞のＭ１表現型に特有のマーカーの発現を測定する１つのアッセイ；ミクログリア細胞またはミクログリア様細胞のＭ２表現型に特有のマーカーの発現を測定する１つのアッセイ；ならびにミクログリア細胞またはミクログリア様細胞におけるＭ１ミクログリア表現型からＭ２ミクログリア表現型への移行を測定するアッセイからなる群から選択される。
ＭＳＣは、ミクログリアの増殖を抑制することが示されている。ミクログリアおよびＭＳＣの共培養は、ＭＳＣの免疫抑制活性を示すために使用され得る。リポ多糖（ＬＰＳ）は、ミクログリアの増殖を活性化するマイトジェンとして使用され得る。上記ＭＳＣの免疫抑制作用は、マイトジェンにより刺激、たとえばＬＰＳにより刺激されたミクログリア細胞またはミクログリア様細胞の増殖の減少として定量化され得る。
一実施形態では、上記ミクログリアの増殖を測定する１つのアッセイは、上記個々のドナーに由来するＭＳＣ集団のミクログリア細胞および／またはミクログリア様細胞との共培養を含む。ミクログリアまたはミクログリア様細胞に及ぼす上記ＭＳＣの免疫抑制作用を測定するアッセイは、共培養の条件下で行われ得るが、また、トランスウェルでの細胞培養の状況においてまたはＭＣＳ培養からの条件付け培地を使用しても行われ得ることが理解されるであろう。当業者は、使用され得る異なる異形および実験上の設定を認識している。
一実施形態では、上記ミクログリア細胞またはミクログリア様細胞は、不死化細胞株、たとえばヒトミクログリアＨＭＣ３細胞株またはＣＨＭＥ－５細胞株；生検から得た初代ミクログリア；臍帯血から培養した初代ミクログリア様細胞；ならびに臍帯血由来の不死化したミクログリア様細胞、たとえばＤＵＯＣ－０１細胞株からなる群から選択される。一実施形態では、上記ミクログリア細胞またはミクログリア様細胞は、不死化細胞株から選択される。一実施形態では、上記ミクログリア細胞またはミクログリア様細胞は、ＨＭＣ３細胞株、ＣＨＭＥ－５細胞株、およびＤＵＯＣ－０１細胞株からなる群から選択される不死化細胞株からなる群から選択される。
一実施形態では、上記ミクログリアの増殖を測定する１つのアッセイは、ミクログリア細胞またはミクログリア様細胞の増殖の減少が、マイトジェン、たとえばリポ多糖での刺激で起こるかどうかをアッセイするステップか、またはマイトジェン、たとえばリポ多糖での刺激の後にミクログリア細胞またはミクログリア様細胞の増殖の減少を定量化するステップを含む。上記増殖は、増殖のパーセンテージとして測定されてよく、増殖指数（ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ ｉｎｄｅｘ）として測定されてもよく、細胞を計測することにより測定されてもよく、または増殖指標（ｇｒｏｗｔｈ ｉｎｄｅｘ）として測定されてもよく、たとえば増殖指標として測定されてもよい。
Ｍ１表現型のミクログリアおよび／またはミクログリア様細胞は、以下のマーカー：ＣＤ１８３、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ１４、Ｂ７－２／ＣＤ８６、インテグリンαＶβ３、ＭＦＧ－Ｅ８、ＮＯ、ＲＯＳ、ＲＮＳ、ＣＣＬ２／ＭＣＰ－１、ＣＣＬ３／ＭＩＰ－１α、ＣＣＬ４／ＭＩＰ－１β、ＣＣＬ５／ＲＡＮＴＥＳ、ＣＣＬ８／ＭＣＰ－２、ＣＣＬ１１／エオタキシン、ＣＣＬ１２／ＭＣＰ－５、ＣＣＬ１５／ＭＩＰ－１δ、ＣＣＬ１９／ＭＩＰ－３β、ＣＣＬ２０／ＭＩＰ－３α、ＣＸＣＬ１／ＧＲＯα／ＫＣ／ＣＩＮＣ－１、ＣＸＣＬ９／ＭＩＧ、ＣＸＣＬ１０／ＩＰ－－１０、ＣＸＣＬ１１／Ｉ－ＴＡＣ、ＣＸＣＬ１３／ＢＬＣ／ＢＣＡ－１、ＣＸ３ＣＬ１／フラクタルカイン、ＭＭＰ－３、ＭＭＰ－９、グルタマート、ＩＬ－１β／ＩＬ－１Ｆ２、ＩＬ－２、ＩＬ－６、ＩＬ－１２、ＩＬ－１５、ＩＬ－１７／ＩＬ－１７Ａ、ＩＬ－１８／ＩＬ－１Ｆ４、ＩＬ－２３、ＩＦＮγ、ＴＮＦ－α、ＦｃγＲＩＩＩ／ＣＤ１６、ＦｃγＲＩＩ／ＣＤ３２、ＣＤ３６／ＳＲ－Ｂ３、ＣＤ４０、ＣＤ６８／ＳＲ－Ｄ１、Ｂ７－１／ＣＤ８０、ＭＨＣＩＩ、ｉＮＯＳ、およびＣＯＸ－２のうちの１つ以上の発現により特徴づけられる。
Ｍ２表現型のミクログリアおよび／またはミクログリア様細胞は、以下のマーカー：ＣＸ３ＣＲ１、ＣＤ２００Ｒ、ＣＤ２０６、ＩＬ－１Ｒａ／ＩＬ－１Ｆ３、ＩＬ－４、ＩＬ－１０、ＩＬ－１３、ＴＧＦ－β、ＣＣＬ１３／ＭＣＰ－４、ＣＣＬ１４、ＣＣＬ１７／ＴＡＲＣ、ＣＣＬ１８／ＰＡＲＣ、ＣＣＬ２２／ＭＤＣ、ＣＣＬ２３／ＭＰＩＦ－１、ＣＣＬ２４／エオタキシン－２／ＭＰＩＦ－２、ＣＣＬ２６／エオタキシン－３、ＦＩＺＺ１／ＲＥＬＭα、ＹＭ１／キチナーゼ３－様３、ＣＬＥＣ１０Ａ／ＣＤ３０１、ＭＭＲ／ＣＤ２０６、ＳＲ－ＡＩ／ＭＳＲ、ＣＤ１６３、アルギナーゼ１／ＡＲＧ１、トランスグルタミナーゼ２／ＴＧＭ２、ＰＰＡＲ、およびγ／ＮＲ１Ｃ３のうちの１つ以上の発現により特徴づけられる。
上記マーカーのうちのいずれか１つ以上の発現を測定することにより、ミクログリアおよび／またはミクログリア様細胞の表現型の特徴が決定され得る。ＣＸ３ＣＲ１（フラクタルカイン受容体）は、Ｍ２表現型のミクログリアでアップレギュレートされる（望ましい）。またＭＳＣは、ＣＸ３ＣＬ１（フラクタルカインのリガンド）の発現を増大していた。このリガンドは、メタロプロテイナーゼにより切断され、受容体に結合する。よって、活性Ｍ２表現型を反映するため、フラクタルカインリガンドの培地濃度は低い。ＣＤ２００Ｒは、Ｍ２表現型のミクログリアでアップレギュレートされ、これは本発明の状況で望ましい。またＭＳＣは、（ＣＤ２００Ｒに結合するリガンドである）ＣＤ２００の発現を増大させている。
この発現は、限定するものではないが、フローサイトメトリー、抗体染色、ｉｎ ｓｉｔｕでのハイブリダイゼーションを含む当業者に知られているいずれかの方法により分析され得る。
よって、一実施形態では、上記ミクログリアおよび／またはミクログリア様細胞におけるＭ１表現型に特有のマーカーの発現を測定する１つのアッセイは、ＣＤ１８３、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ１４、Ｂ７－２／ＣＤ８６、インテグリンαＶβ３、ＭＦＧ－Ｅ８、ＮＯ、ＲＯＳ、ＲＮＳ、ＣＣＬ２／ＭＣＰ－１、ＣＣＬ３／ＭＩＰ－１α、ＣＣＬ４／ＭＩＰ－１β、ＣＣＬ５／ＲＡＮＴＥＳ、ＣＣＬ８／ＭＣＰ－２、ＣＣＬ１１／エオタキシン、ＣＣＬ１２／ＭＣＰ－５、ＣＣＬ１５／ＭＩＰ－１δ、ＣＣＬ１９／ＭＩＰ－３β、ＣＣＬ２０／ＭＩＰ－３α、ＣＸＣＬ１／ＧＲＯα／ＫＣ／ＣＩＮＣ－１、ＣＸＣＬ９／ＭＩＧ、ＣＸＣＬ１０／ＩＰ－１０、ＣＸＣＬ１１／Ｉ－ＴＡＣ、ＣＸＣＬ１３／ＢＬＣ／ＢＣＡ－１、ＣＸ３ＣＬ１／フラクタルカイン、ＭＭＰ－３、ＭＭＰ－９、グルタメート、ＩＬ－１β／ＩＬ－１Ｆ２、ＩＬ－２、ＩＬ－６、ＩＬ－１２、ＩＬ－１５、ＩＬ－１７／ＩＬ－１７Ａ、ＩＬ－１８／ＩＬ－１Ｆ４、ＩＬ－２３、ＩＦＮγ、ＴＮＦ－α、ＦｃγＲＩＩＩ／ＣＤ１６、ＦｃγＲＩＩ／ＣＤ３２、ＣＤ３６／ＳＲ－Ｂ３、ＣＤ４０、ＣＤ６８／ＳＲ－Ｄ１、Ｂ７－１／ＣＤ８０、ＭＨＣＩＩ、ｉＮＯＳ、およびＣＯＸ－２からなる群から選択される少なくとも１つのマーカー；たとえばＣＤ１８３、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ１４、Ｂ７－２／ＣＤ８６、ＣＤ４０、およびＢ７－１／ＣＤ８０からなる群から選択される少なくとも１つのマーカー；たとえばＣＤ１８３、ＣＤ１１ｂ、およびＣＤ１４からなる群から選択される少なくとも１つのマーカーの発現を測定するステップを含む。特に、一実施形態では、上記ミクログリアおよび／またはミクログリア様細胞におけるＭ１表現型に特有のマーカーの発現を測定する１つのアッセイは、少なくともＣＤ１８３の発現を測定するステップを含む。
一実施形態では、発現が上記ミクログリアおよび／またはミクログリア様細胞におけるＭ１表現型に特有のマーカーの発現を測定する１つのアッセイにより測定されるマーカーのうちの少なくとも１つの発現の減少が、望ましい結果を表す。
一実施形態では、上記ミクログリアおよび／またはミクログリア様細胞におけるＭ２表現型に特有のマーカーの発現を測定する１つのアッセイは、ＣＸ３ＣＲ１、ＣＤ２００Ｒ、ＣＤ２０６、ＩＬ－１Ｒａ／ＩＬ－１Ｆ３、ＩＬ－４、ＩＬ－１０、ＩＬ－１３、ＴＧＦ－β、ＣＣＬ１３／ＭＣＰ－４、ＣＣＬ１４、ＣＣＬ１７／ＴＡＲＣ、ＣＣＬ１８／ＰＡＲＣ、ＣＣＬ２２／ＭＤＣ、ＣＣＬ２３／ＭＰＩＦ－１、ＣＣＬ２４／エオタキシン－２／ＭＰＩＦ－２、ＣＣＬ２６／エオタキシン－３、ＦＩＺＺ１／ＲＥＬＭα、ＹＭ１／キチナーゼ３－様３、ＣＬＥＣ１０Ａ／ＣＤ３０１、ＭＭＲ／ＣＤ２０６、ＳＲ－ＡＩ／ＭＳＲ、ＣＤ１６３、アルギナーゼ１／ＡＲＧ１、トランスグルタミナーゼ２／ＴＧＭ２、ＰＰＡＲ、およびγ／ＮＲ１Ｃ３からなる群から選択される少なくとも１つのマーカー；たとえばＣＸ３ＣＲ１／フラクタルカイン受容体、ＣＤ２００Ｒ、ＣＤ２０６、およびＣＤ１６３からなる群から選択される少なくとも１つのマーカー；たとえばＣＸ３ＣＲ１、ＣＤ２００Ｒ、およびＣＤ２０６からなる群から選択される少なくとも１つのマーカーの発現を測定するステップを含む。特に、一実施形態では、上記ミクログリアおよび／またはミクログリア様細胞におけるＭ２表現型に特有のマーカーの発現を測定する１つのアッセイは、少なくともＣＤ２００Ｒの発現を測定するステップを含む。
一実施形態では、発現が上記ミクログリアおよび／またはミクログリア様細胞におけるＭ２表現型に特有のマーカーの発現を測定する１つのアッセイにより測定されるマーカーのうちの少なくとも１つの発現の増大が、望ましい結果を表す。
さらに、Ｍ１表現型からＭ２表現型への移行は、上記マーカーのうちのいずれか１つ以上の発現の変化により測定され得る。たとえば、上記ミクログリアおよび／またはミクログリア様細胞のＭ１表現型からＭ２表現型への移行は、Ｍ１マーカーのうちのいずれか１つ以上の発現レベルの減少およびＭ２マーカーのうちのいずれか１つ以上の発現レベルの増大に関連している。
よって、一実施形態では、上記Ｍ１ミクログリアおよび／またはミクログリア様細胞の表現型からＭ２ミクログリアおよび／またはミクログリア様細胞の表現型への移行は、上記に定義されるＭ１マーカーのうちのいずれか１つ以上の発現の減少および上記に定義されるＭ２マーカーのうちのいずれか１つ以上の発現の増大として測定される。特に、上記Ｍ１ミクログリアおよび／またはミクログリア様細胞の表現型からＭ２ミクログリアおよび／またはミクログリア様細胞の表現型への移行は、ＣＤ１８３、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ１４、Ｂ７－２／ＣＤ８６、ＣＤ４０、およびＢ７－１／ＣＤ８０から選択されるマーカーのうちのいずれか１つ以上の発現の減少、ならびにＣＸ３ＣＲ１／フラクタルカイン受容体、ＣＤ２００Ｒ、ＣＤ２０６、およびＣＤ１６３から選択されるマーカーのいずれか１つ以上の発現の増大として測定され、たとえば上記Ｍ１ミクログリアおよび／またはミクログリア様細胞の表現型からＭ２ミクログリアおよび／またはミクログリア様細胞の表現型への移行は、ＣＤ１８３、ＣＤ１１ｂ、およびＣＤ１４から選択されるマーカーのうちのいずれか１つ以上の発現の減少、ならびにＣＸ３ＣＲ１、ＣＤ２００Ｒ、およびＣＤ２０６から選択されるマーカーのいずれか１つ以上の発現の増大として測定され、たとえば上記Ｍ１ミクログリアおよび／またはミクログリア様細胞の表現型からＭ２ミクログリアおよび／またはミクログリア様細胞の表現型への移行は、ＣＤ１８３の発現の減少およびＣＤ２００Ｒの発現の増大として測定される。一実施形態では、上記Ｍ１ミクログリアおよび／またはミクログリア様細胞の表現型からＭ２ミクログリアおよび／またはミクログリア様細胞の表現型への移行は、望ましい結果、たとえば上記ミクログリアおよび／またはミクログリア様細胞における抗炎症性作用の誘導を表す。たとえば、移行スコアは、以下の一般式：
により計算され得る。
よって、本明細書中開示される使用のための、単離され、集められたアロジェニックなＭＳＣ集団の一実施形態では、上記Ｍ１ミクログリアの表現型からＭ２ミクログリアの表現型への移行は、式１による移行スコアとして計算される。式１を使用する場合、移行スコアの値が高いと、Ｍ２表現型のミクログリア細胞またはミクログリア様細胞が多く存在する。
当業者は、移行スコアが、いずれかのＭ１マーカーおよびいずれかのＭ２の発現、たとえばＣＤ２００Ｒ発現の倍数増加およびＣＤ１８３発現の抑制に基づき計算され得ることを理解している。
さらに、ＣＸ３ＣＬ１／ＦｒａｋｔａｌｉｎｅおよびＣＤ２００のアップレギュレーションは、ミクログリアまたはミクログリア様細胞のＭ２表現型への移行が起こる際に上記ＭＳＣで観察され得る。よって、本明細書中開示される使用のための、単離され、集められたアロジェニックなＭＳＣ集団の一実施形態では、上記少なくとも３つのアッセイは、上記ＭＳＣによるＣＸ３ＣＬ１／ＦｒａｋｔａｌｉｎｅおよびＣＤ２００の発現を測定する少なくとも１つのアッセイをさらに含み得る。
一実施形態では、上記ミクログリア細胞またはミクログリア様細胞は、不死化細胞株、たとえばヒトミクログリアＨＭＣ３細胞株またはＣＨＭＥ－５細胞株；生検から得た初代ミクログリア；臍帯血から培養した初代ミクログリア様細胞；および臍帯血由来の不死化したミクログリア様細胞、たとえばＤＵＯＣ－０１細胞株からなる群から選択される。一実施形態では、上記ミクログリア細胞またはミクログリア様細胞は、不死化細胞株からなる群から選択され、たとえばＨＭＣ３細胞株、ＣＨＭＥ－５細胞株、およびＤＵＯＣ－０１細胞株からなる群から選択される。
たとえば、本明細書中開示される使用のための、単離され、集められたアロジェニックなＭＳＣ集団の一部の実施形態では、上記少なくとも３つのアッセイは、インドールアミン－２，３－ジオキシゲナーゼ（ｄｉｏｘｙｇｅｎｓａｓｅ）（ＩＤＯ）の活性を測定する１つのアッセイ；上記ＭＳＣにより分泌されるプロスタグランジンＥ２を測定する１つのアッセイ；ならびにミクログリア細胞および／またはミクログリア様細胞に及ぼす上記ＭＳＣの効果を測定する１つのアッセイ
またはインドールアミン－２，３－ジオキシゲナーゼ（ｄｉｏｘｙｇｅｎｓａｓｅ）（ＩＤＯ）の活性を測定する１つのアッセイ；ＰＢＭＣの増殖に及ぼす上記ＭＳＣの効果を測定する１つのアッセイ；ならびにミクログリア細胞および／またはミクログリア様細胞に及ぼす上記ＭＳＣの効果を測定する１つのアッセイ
または上記ＭＳＣにより分泌されるプロスタグランジンＥ２を測定する１つのアッセイ；ＰＢＭＣの増殖に及ぼす上記ＭＳＣの効果を測定する１つのアッセイ；ならびにミクログリア細胞および／またはミクログリア様細胞に及ぼす上記ＭＳＣの効果を測定する１つのアッセイ
またはインドールアミン－２，３－ジオキシゲナーゼ（ｄｉｏｘｙｇｅｎｓａｓｅ）（ＩＤＯ）の活性を測定する１つのアッセイ；上記ＭＳＣにより分泌されるプロスタグランジンＥ２を測定する１つのアッセイ；および末梢血単核球（ＰＢＭＣ）の増殖に及ぼす上記ＭＳＣの効果を測定する１つのアッセイ；ならびにミクログリア細胞および／またはミクログリア様細胞に及ぼす上記ＭＳＣの効果を測定する１つのアッセイ
を含む。
さらなるアッセイ、たとえば免疫応答を抑制するＴ細胞の特性に及ぼす上記ＭＳＣの効果を測定する１つのアッセイならびに／または樹状細胞の増殖および／もしくはアポトーシスに及ぼす上記ＭＳＣの効果を測定する１つのアッセイが含まれ得る。また、他のさらなるアッセイも含まれ得る。
単球は、骨髄において骨髄前駆体から生じ、これらは炎症の間ＣＮＳに進入する。従来より、単球はＣＤ１４を発現するが、ＣＤ１６を発現しない（ＣＤ１４＋＋ＣＤ１６－単球と呼ばれる）。これらの古典的な単球（ｃｌａｓｓｉｃａｌ ｍｏｎｏｃｙｔｅ）は、著しく可塑性であり、炎症を起こした組織に動員されると、これらは、マクロファージまたは樹状細胞へと変化し得る。非古典的な単球は、ＣＤ１４および高レベルのＣＤ１６を発現し（ＣＤ１４＋ＣＤ１６＋＋単球と呼ばれる）、組織のホメオスタシスおよび局所的な再生に関与する。ＭＳＣは、古典的から非古典的へと単球の表現型を変更し得る。さらなる別のアッセイでは、上記ＭＳＣの存在下での単球の表現型の変化が測定され得る。上記ＭＳＣを伴う共培養物および上記ＭＳＣを伴わない共培養物における単球のＣＤ１６の増大する発現およびＣＤ１４＋＋ＣＤ１６－の減少するパーセンテージが比較され得る。ＣＤ１６発現の最も高い倍数誘導およびＣＤ１４＋＋ＣＤ１６－の最も高い抑制をもたらすＭＳＣ集団が、最も望ましいとみなされる。
よって、各個々のドナーに由来するＭＳＣ集団は、単球の表現型の移行に及ぼすその作用の観点から評価され得る。よって一実施形態では、上記少なくとも３つのアッセイは、たとえば上記ＭＳＣの存在下で、上記ＭＳＣに応答した古典的な単球の表現型から非古典的な単球の表現型（再生表現型とも呼ばれる）への移行を測定する少なくとも１つのアッセイをさらに含む。一実施形態では、上記少なくとも１つのアッセイは、再生表現型へ向かう単球の移行に及ぼす上記ＭＳＣの作用を測定する。一実施形態では、上記移行は、上記単球において、少なくともＣＤ１６発現、たとえばＣＤ１６およびＣＤ１４の発現をアッセイすることにより測定される。
たとえば、本明細書中開示される一部の実施形態では、上記少なくとも３つのアッセイは、
インドールアミン－２，３－ジオキシゲナーゼ（ｄｉｏｘｙｇｅｎｓａｓｅ）（ＩＤＯ）の活性を測定する１つのアッセイ；上記ＭＳＣにより分泌されるプロスタグランジンＥ２を測定する１つのアッセイ；および単球に及ぼす上記ＭＳＣの効果を測定する１つのアッセイ；
またはインドールアミン－２，３－ジオキシゲナーゼ（ｄｉｏｘｙｇｅｎｓａｓｅ）（ＩＤＯ）の活性を測定する１つのアッセイ；ＰＢＭＣの増殖に及ぼす上記ＭＳＣの効果を測定する１つのアッセイ；および単球に及ぼす上記ＭＳＣの効果を測定する１つのアッセイ；
または上記ＭＳＣにより分泌されるプロスタグランジンＥ２を測定する１つのアッセイ；ＰＢＭＣの増殖に及ぼす上記ＭＳＣの効果を測定する１つのアッセイ；および単球に及ぼす上記ＭＳＣの効果を測定する１つのアッセイ；
またはインドールアミン－２，３－ジオキシゲナーゼ（ｄｉｏｘｙｇｅｎｓａｓｅ）（ＩＤＯ）の活性を測定する１つのアッセイ；上記ＭＳＣにより分泌されるプロスタグランジンＥ２を測定する１つのアッセイ；および末梢血単核球（ＰＢＭＣ）の増殖に及ぼす上記ＭＳＣの効果を測定する１つのアッセイ；および単球に及ぼす上記ＭＳＣの効果を測定する１つのアッセイ
を含む。
さらなる別のアッセイでは、ＭＳＣにおけるＨＬＡ－Ｇ発現が測定され得る。ＨＬＡ－Ｇは、天然に存在する寛容性誘導分子として同定されている。これは、生理的条件下で発現が制限されているが、たとえばＩＦＮγ、ＩＬ－１０、およびＰＨＡに応答して、アップレギュレートされ得る。ＭＳＣは、低レベルの細胞内ＨＬＡ－Ｇを有し、低レベルの可溶性ＨＬＡ－Ｇ（ｓＨＬＡ－Ｇ）を発現するが、ＩＦＮγまたはＩＬ－１０での刺激は、高いレベルをもたらすことが予測される。ＰＨＡまたはＧＡＢＡでの刺激は、可溶性ＨＬＡ－Ｇレベルを増大させることが予測される。ＪＥＧ－３は、胎盤由来細胞株であり、ＨＬＡ－Ｇの高レベルの発現を有し、細胞内および可溶性の両方があり、アッセイにおいて陽性対照として使用され得る。この目的は、個々のドナーに由来するＭＳＣ集団の間の、たとえばフローサイトメトリー（ＦＡＣＳ）分析による細胞内ＨＬＡ－Ｇの発現およびたとえばＥＬＩＳＡによるｓＨＬＡ－Ｇの放出の両方を比較することであり得る。
よって、一実施形態では、上記少なくとも３つのアッセイは、上記ＭＳＣにおけるＨＬＡ－Ｇ発現を測定する少なくとも１つのアッセイをさらに含み、たとえば上記少なくとも１つのアッセイは、ＩＦＮγ、アラム、ＩＬ－１０、ＰＨＡ、および／またはＧＡＢＡに応答した、上記ＭＳＣにおけるＨＬＡ－Ｇ発現を測定し、たとえば上記少なくとも１つのアッセイは、ＩＦＮγ、ＩＬ－１０、および／またはＰＨＡに応答した、上記ＭＳＣにおけるＨＬＡ－Ｇ発現を測定する。一実施形態では、上記少なくとも１つのアッセイは、ＩＦＮγ、ＩＬ－１０、ＰＨＡ、およびＧＡＢＡからなる群から選択される１つまたはいくつかに応答した上記ＭＳＣにおけるＨＬＡ－Ｇ発現を測定する。上記ＨＬＡ－Ｇ発現は、可溶性ＨＬＡ－Ｇの発現であり得る。
さらに、個々のドナーに由来するＭＳＣ集団は、望ましい特徴を有する集団を選択するためにタンパク質発現および／またはサイトカイン発現の観点から評価され得る。たとえば、上記集団におけるインターロイキン、増殖因子、インターフェロン、腫瘍壊死因子、コロニー刺激因子、およびリポタンパク質の発現を評価することが興味深い場合がある。よって、一実施形態では、上記少なくとも３つのアッセイは、上記ＭＳＣによるタンパク質発現および／またはサイトカイン発現、たとえばインターロイキン、増殖因子、インターフェロン、腫瘍壊死因子、コロニー刺激因子、およびリポタンパク質からなる群から選択される１つまたはいくつかのタンパク質またはサイトカインの発現を測定する少なくとも１つのアッセイをさらに含む。別の実施形態では、上記タンパク質発現および／またはサイトカイン発現を測定する少なくとも１つのアッセイは、ＩＬ－２、ＩＬ－４、ＩＬ－６、ＩＬ－８、ＩＬ－１０、ＩＬ－１２、ＩＬ－１２／１３、ＩＬ－１７Ａ、ＩＬ－２１、ＩＬ－２２、ＩＬ－２９、ＩＬ－３１、ＴＧＦβ、ＶＥＧＦ、ＦＧＦ、ＧＭ－ＣＳＦ（顆粒球－マクロファージコロニー刺激因子）、ＩＦＮα、ＩＦＮγ、ａｐｏＥ、およびＴＮＦαからなる群、たとえばＩＬ－２、ＩＬ－４、ＩＬ－６、ＩＬ－８、ＩＬ－１２、ＩＬ－１２／１３、ＩＬ１７Ａ、ＩＬ－２１、ＩＬ－２２、ＩＬ－２９、ＩＬ－３１、ＴＧＦβ、ＶＥＧＦ、ＦＧＦ、ＧＭ－ＣＦＳ、ＩＦＮα、ＩＦＮγ、ａｐｏＥおよびＴＮＦαからなる群、たとえばＩＬ－６、ＩＬ－８、ＧＭ－ＣＳＦ、およびＴＧＦβからなる群、たとえば少なくともＩＬ－６からなる群から選択される１つまたはいくつかのタンパク質またはサイトカインの発現を測定する。
ＡＣＥ２受容体は、コロナウイルススパイクタンパク質による感染症の標的細胞の表面上の進入地点である。標的細胞によるセリンプロテアーゼＴＭＰＲＳＳ２の共発現は、コロナウイルススパイクタンパク質のプライミングを可能にする。一実施形態では、上記タンパク質発現および／またはサイトカイン発現を測定する少なくとも１つのアッセイは、ＩＬ－２、ＩＬ－４、ＩＬ－６、ＩＬ－８、ＩＬ－１２、ＩＬ－１２／１３、ＩＬ１７Ａ、ＩＬ－２１、ＩＬ－２２、ＩＬ－２９、ＩＬ－３１、ＴＧＦβ、ＶＥＧＦ、ＦＧＦ、ＧＭ－ＣＳＦ、ＩＦＮα、ＩＦＮγ、ａｐｏＥ、およびＴＮＦαおよびＡＣＥ２受容体およびＴＭＰＲＳＳ２からなる群、たとえばＩＬ－６、ＩＬ－８、ＧＭ－ＣＳＦ、ＴＧＦβ、ＡＣＥ２受容体、およびＴＭＰＲＳＳ２からなる群、たとえば少なくともＡＣＥ２受容体およびＴＭＰＲＳＳ２からなる群から選択される１つまたはいくつかのタンパク質またはサイトカインを測定する。一実施形態では、タンパク質発現を測定する少なくとも１つのアッセイは、ＡＣＥ２受容体の発現を測定する。一実施形態では、タンパク質発現を測定する少なくとも１つのアッセイは、ＴＭＰＲＳＳ２の発現を測定する。
また当業者は、同様にｍＲＮＡ発現が、所定のタンパク質が細胞で発現されるかどうかを評価するために測定され得ることを理解している。よって一実施形態では、上記少なくとも１つのアッセイは、ＩＬ－２、ＩＬ－４、ＩＬ－６、ＩＬ－８、ＩＬ－１２、ＩＬ－１２／１３、ＩＬ１７Ａ、ＩＬ－２１、ＩＬ－２２、ＩＬ－２９、ＩＬ－３１、ＴＧＦβ、ＶＥＧＦ、ＦＧＦ、ＧＭ－ＣＳＦ、ＩＦＮα、ＩＦＮγ、ａｐｏＥ、およびＴＮＦαおよびＡＣＥ２受容体およびＴＭＰＲＳＳ２からなる群、たとえばＩＬ－６、ＩＬ－８、ＧＭ－ＣＳＦ、ＴＧＦβ、ＡＣＥ２受容体、およびＴＭＰＲＳＳ２からなる群、たとえば少なくともＡＣＥ２受容体およびＴＭＰＲＳＳ２からなる群から選択される１つまたはいくつかのタンパク質またはサイトカインのｍＲＮＡ発現を測定する。一実施形態では、少なくとも１つのアッセイは、ＡＣＥ２受容体のｍＲＮＡ発現を測定する。一実施形態では、少なくとも１つのアッセイは、ＴＭＰＲＳＳ２のｍＲＮＡ発現を測定する。
一実施形態では、各個々のドナーに由来するＭＳＣ集団は、ＡＣＥ受容体およびＴＭＰＲＳＳ２の発現に対し陰性である。
一実施形態では、単離され、集められたアロジェニックなＭＳＣ集団は、ＡＣＥ受容体およびＴＭＰＲＳＳ２の発現に対し陰性である。
１つの特定の実施形態では、上記タンパク質および／またはサイトカインのうち少なくとも２、たとえば少なくとも３、たとえば少なくとも４、たとえば少なくとも５、たとえば少なくとも６、たとえば少なくとも７、たとえば少なくとも８、たとえば少なくとも９、たとえば少なくとも１０、たとえば少なくとも１１、たとえば少なくとも１２、たとえば少なくとも１３、たとえば少なくとも１４、たとえば少なくとも１５、たとえば少なくとも１６、たとえば少なくとも１７、たとえば少なくとも１８、たとえば１９全ての発現が測定される。さらに、当業者は、上記タンパク質および／またはサイトカインの発現が、いずれの刺激も存在しない中および／または少なくとも１つの刺激の存在下で測定され得ることを理解している。一実施形態では、上記タンパク質および／またはサイトカインの発現は、少なくとも１つの刺激またはいくつかの刺激、たとえば２、３、４、またはそれ以上の刺激の存在下で測定される。一実施形態では、上記刺激は、免疫応答を改変する刺激である。上記免疫応答を改変する刺激の非限定的な例として、ＰＢＭＣ；刺激されたＰＢＭＣ（たとえばＰＨＡ、ＩＬ１０、γ－アミノ酪酸（ＧＡＢＡ）、抗ＣＤ２、 抗－ＣＤ３、抗－ＣＤ２８、アラム、および／またはインターフェロンγ（ＩＦＮγ）で刺激したＰＢＭＣ）；ならびに／またはその他が挙げられる。免疫応答を改変する刺激の他の非限定的な例として、ＧＡＢＡ、Ｐｏｌｙ ＩＣ、レシキモド、およびＩＦＮγ（ＰＢＭＣの添加を伴わない）が挙げられる。よって、一実施形態では、上記免疫応答を改変する刺激は、ＰＢＭＣおよび刺激されたＰＢＭＣ、たとえばＰＨＡ、ＩＬ１０、γ－アミノ酪酸（ＧＡＢＡ）、抗ＣＤ２、抗－ＣＤ３、抗－ＣＤ２８、アラム、および／またはインターフェロンγ（ＩＦＮγ）で刺激したＰＢＭＣ、たとえばＰＨＡ、ＩＬ１０、ＧＡＢＡ、および／またはＩＦＮγで刺激したＰＢＭＣからなる群から選択される。
一実施形態では、上記免疫応答を改変する刺激は、ＧＡＢＡおよび／またはＩＮＦγである。一実施形態では、方法により入手可能な本明細書中開示される使用のための、単離され、集められたアロジェニックなＭＳＣ集団であって、刺激が、ポリイノシン／ポリシチジン酸（Ｐｏｌｙ Ｉ：Ｃ）、レシキモド（ｒ８４８）、ＧＡＢＡ、およびＩＦＮγからなる群、たとえばＰｏｌｙ Ｉ：ＣおよびＩＦＮγからなる群、またはＧＡＢＡおよびＩＦＮγからなる群から選択される、ＭＳＣ集団が提供される。一実施形態では、上記刺激は、ＰＢＭＣ、たとえば刺激されたＰＢＭＣまたは刺激されていないＰＢＭＣ、たとえばＰＨＡで刺激されたＰＢＭＣ、たとえばＰＨＡで刺激されたＴリンパ球である。一実施形態では、刺激は、ＰＨＡで刺激されたＴリンパ球および／またはＧＡＢＡである。
１つの特定の実施形態では、上記方法は、ＰＨＡで刺激されたＴリンパ球および／またはＧＡＢＡでの刺激に応答した上記ＭＳＣにおけるＩＬ－１０発現を測定するステップを含み得る。
１つの特定の実施形態では、上記方法は、上記ＭＳＣにおける腫瘍壊死因子α誘導性遺伝子／タンパク質６（ＴＳＧ－６）の発現を測定するステップを含み得る。ＴＳＧ－６は、グリア性瘢痕の低減に関与することが示されている。
当業者は、上記アッセイが、アッセイされるＭＳＣ集団の望ましい特性に応じて目的の特有のアッセイの組み合わせを得るために組み合わせられ得ることを理解している。アッセイは、互いに独立して選択され得る。
さらに、本明細書中開示される使用のためのものであり、上記方法により入手可能な単離され、集められたアロジェニックなＭＳＣ集団を得るために集められた全てのＭＳＣは、正常な細胞の細胞形態を有する細胞であることが重要である。ＭＳＣ培養物は、通常低い前方散乱および低い側方散乱としてフローサイトメトリーにより同定される、迅速に自己再生している小さな丸い細胞の下位集団を含むことが知られている。高いコロニー形成能を有するドナーから単離したＭＳＣは、小さな大きさの細胞の比率が有意に高いことが知られている。まとめると、データは、高い増殖能を有すると分類されたドナーＭＳＣは、自己再生する能力が高く、高いＣＦＵ－Ｆ効率を有し、小さな大きさの細胞を高い比率で有することを示している。細胞は、増殖（培養）の間および回収の直前または回収と併せて肉眼で観察されてもよく、たとえば細胞の大きさ；核の大きさ；細胞の形状；および細胞の大きさと核の大きさとの間の比率に基づき評価され得る。よって、一実施形態では、上記少なくとも３つのアッセイは、少なくとも１つの形態学的なアッセイを含む。一実施形態では、上記形態学的なアッセイは、細胞および／または細胞核の形態学的な特性をアッセイする。一実施形態では、細胞および／または細胞核の形態学的な特性は、細胞の大きさ、核の大きさ、細胞の形状、ならびに細胞および核の大きさの間の比率からなる群から選択される１つ以上の特性である。
本明細書中開示される使用のための、単離され、集められたアロジェニックなＭＳＣ集団が、健常かつ望ましい形態、言い換えると正常な形態を呈する細胞を可能な限り多く含むことが重要である。よって、一実施形態では、個々のドナーに由来するＭＳＣ集団は、少なくとも９０％、たとえば少なくとも９１％、たとえば少なくとも９２％、たとえば少なくとも９３％、たとえば少なくとも９４％、たとえば少なくとも９５％、たとえば少なくとも９６％、たとえば少なくとも９７％、たとえば少なくとも９８％、たとえば少なくとも９９％、正常な細胞および／または核を呈する場合のみ、集めることに適格である。よって、上記個々のドナーに由来するＭＳＣ集団が、９０％未満で正常な細胞を含む場合、上記集団は、集めることに不適格である。
上記少なくとも３つのアッセイを使用して各個々のドナーに由来するＭＳＣ集団をアッセイするステップは、継代０（ｐ０）～ｐ８のうちのいずれかで行われ得ることが理解されるであろう。たとえば、上記アッセイは、上記個々のドナーに由来するＭＳＣ集団がその後関連する時点で望ましい特性を呈することを確保するために集められる際と同じ継代にある際に行われ得る。また、アッセイを、集められた時点の継代よりも早い継代で行うことが可能である。また、異なるアッセイが、異なる継代で行われ得ることを理解されたい。ただし、特定のアッセイは、各個々のドナーに由来するＭＳＣ集団で得たアッセイ結果が比較され得ることを確保するために同じ継代において、個々のドナーに由来するＭＳＣ集団で行われる。
よって、一実施形態では、少なくとも３つのアッセイを使用して各個々のドナーに由来するＭＳＣ集団をアッセイするステップは、ＭＳＣ集団が、継代０（ｐ０）～継代８（ｐ８）、たとえばｐ１～ｐ５、たとえばｐ１～ｐ４、たとえばｐ２～ｐ４、またはｐ１～ｐ４、たとえばｐ１、ｐ２、および／またはｐ３、たとえばｐ２および／またはｐ３にある際に行われる。一実施形態では、少なくとも１つのアッセイ、たとえば少なくとも２つのアッセイ、たとえば少なくとも３つのアッセイ、たとえば全てのアッセイが、細胞が、集められた際と同じ継代にある場合に行われる。別の実施形態では、少なくとも２つのアッセイは、異なる継代で行われる。
一実施形態では、上記各個々のドナーに由来するＭＳＣ集団は、少なくとも１つの形態アッセイによりアッセイされる。一実施形態では、上記各個々のドナーに由来するＭＳＣ集団は、インドールアミン－２，３－ジオキシゲナーゼ（ｄｉｏｘｙｇｅｎｓａｓｅ）（ＩＤＯ）の活性を測定する少なくとも１つのアッセイによりアッセイされる。一実施形態では、上記各個々のドナーに由来するＭＳＣ集団は、ＰＢＭＣの増殖に及ぼす上記ＭＳＣの作用を測定する少なくとも１つのアッセイによりアッセイされる。一実施形態では、上記各個々のドナーに由来するＭＳＣ集団は、上記ＭＳＣにより分泌されるプロスタグランジンＥ２を測定する少なくとも１つのアッセイによりアッセイされる。
一実施形態では、上記各個々のドナーに由来するＭＳＣ集団は、少なくとも１つの形態アッセイ；ＩＤＯ活性を測定するアッセイ；およびＰＢＭＣの増殖に及ぼす上記ＭＳＣの作用を測定するアッセイによりアッセイされる。一実施形態では、上記各個々のドナーに由来するＭＳＣ集団は、少なくとも１つの形態アッセイ；ＩＤＯ活性を測定するアッセイ；ＰＢＭＣの増殖に及ぼす上記ＭＳＣの作用を測定するアッセイ；および上記ＭＳＣにより分泌されるプロスタグランジンＥ２を測定するアッセイによりアッセイされる。一実施形態では、上記各個々のドナーに由来するＭＳＣ集団は、上記ＭＳＣにおけるＨＬＡ－Ｇ発現を測定するアッセイによりさらにアッセイされる。一実施形態では、方法により入手可能な、本明細書中開示される使用のための、単離され、集められたアロジェニックなＭＳＣ集団であって、各個々のドナーに由来するＭＳＣ集団は、ＩＬ－６、ＩＬ－８、ＧＭ－ＣＳＦ、およびＴＧＦβから選択される少なくとも１つ、たとえば２つ、たとえば３つ、たとえば４つ全ての因子の発現を測定する、少なくとも１つのアッセイ、たとえば少なくとも２つのアッセイ、たとえば少なくとも３つのアッセイ、たとえば少なくとも４つのアッセイによりさらにアッセイされる、アロジェニックなＭＳＣ集団が提供される。各アッセイは、IL－６、IL－８、ＧＭ－ＣＳＦ、およびＴＧＦβのうちの１つの発現を測定することが理解されるであろう。一実施形態では、上記各個々のドナーに由来するＭＳＣ集団は、上記ＭＳＣにおけるＨＬＡ－Ｇ発現を測定するアッセイにより、ならびにＩＬ－６、ＩＬ－８、ＧＭ－ＣＳＦ、およびＴＧＦβから選択される少なくとも１つ、たとえば２つ、たとえば３つ、たとえば４つ全ての因子の発現を測定する、少なくとも１つのアッセイ、たとえば少なくとも２つのアッセイ、たとえば少なくとも３つのアッセイ、たとえば少なくとも４つのアッセイにより、さらにアッセイされる。各アッセイは、ＩＬ－６、ＩＬ－８、ＧＭ－ＣＳＦ、およびＴＧＦβのうちの１つの発現を測定し得ることが理解されるであろう。
本発明の、本明細書中開示される使用のための、単離され、集められたアロジェニックなＭＳＣ集団は、総スコアの値を、各個々のドナーに由来するＭＳＣ集団に割り当てるステップを含む方法により入手可能である。このステップにおいて、総スコアの値は、上記少なくとも３つの個々のランキングスコアの値に基づき、各個々のドナーに由来するＭＳＣ集団に割り当てられる。高いランキングスコアがより望ましいアッセイ結果を表す場合、高い総スコアの値は、より望ましい集団特性を表す。あるいは、低いランキングスコアの値がより望ましいアッセイ結果を表す場合、低い総スコアの値は、より望ましい集団特性を表す。当業者は、ランキングスコアの値のシステムおよび／または総スコアの値のシステムが、本開示の範囲から逸脱することなく改変され得ることを理解している。ただし、上記システムは、望ましい特性の観点から個々のドナーに由来するＭＳＣ集団の間の比較を可能にする。一実施形態では、少なくとも１つのアッセイの個々のランキングスコアの値は、上記各個々のドナーに由来するＭＳＣ集団のアッセイ結果の、残りの個々のドナーに由来するＭＳＣ集団の結果との比較に基づき、上記各個々のドナーに由来するＭＳＣ集団に割り当てられる。よって、個々のランキングスコアの値は、分析される個々のドナーに由来するＭＳＣ集団の間の比較に基づき割り当てられ得る。一実施形態では、少なくとも１つのアッセイの個々のランキングスコアの値は、上記個々のドナーに由来するＭＳＣ集団で得られた絶対的なアッセイ結果に基づき上記各個々のドナーに由来するＭＳＣ集団に割り当てられる。よって、アッセイの望ましい閾値の値が選択され得る。一実施形態では、上記絶対的な結果が少なくとも所定の値または最大でも所定の値に対応する場合、アッセイ結果は望ましいとみなされ、得られた望ましい結果を反映する個々のランキングスコアが割り当てられる。
個々のランキングスコアの値を、上記少なくとも３つのアッセイのうちの１、２、３、またはそれ以上からの結果に割り当てるステップは、個々のランキングスコアの値がノンバイナリーである個々のランキングスコアを割り当てることを含むことを理解されたい。ノンバイナリースコアの値は、少なくとも３つのレベルから選択されるスコア値、言い換えると少なくとも３つの異なるスコアである。ノンバイナリーなスコア値の非限定的な例は、１、２、および３；０、１、および２；ならびに１、３、および５である。ノンバイナリーなランキングスコアの値は任意の３つの数Ｘ、Ｙ、Ｚにより表され得る（上記Ｘ、Ｙ、およびＺは異なる数である）。ノンバイナリーなスコア値の割り当ては、バイナリースコアの値と比較してより高いアッセイ結果をランク付けする分解能を可能にする。よって、一実施形態では、アッセイ結果に基づく個々のランキングスコアの値の各個々のドナーに由来するＭＳＣ集団への割り当ては、少なくとも３つのランキングスコアの値、たとえば少なくとも４つのランキングスコアの値、たとえば少なくとも５つのランキングスコアの値から選択されるスコアの値を割り当てるステップを含む。たとえば、上記個々のランキングスコアの値は、５、６、７、８、９、１０、またはさらにはそれ以上の見込みのあるスコア値から選択され得る。当業者は、ランキングスコアの値が、数字または非数字であり得ることを理解している。
総スコアの値は、各個々のドナーに由来するＭＳＣ集団のランキングスコアの値の追加により得られる追加のスコア値であり得る。あるいは、総スコアの値は、１）重みを、各アッセイ結果のランキングスコアの値に割り得て、２）個々のドナーに由来するＭＳＣ集団の重み付けされたランキングスコアの値を加算することにより得られる、重み付けした総スコアの値であり得る。この方法において、残りのアッセイ結果と比較して比較高い重み（または重要性）を、選択した１つまたはいくつかのアッセイ結果に割り当てることが可能である。当業者は、１つまたはいくつかのアッセイ結果が重み付けされてもよく、各アッセイ結果に割り当てられた重みは、独立して選択され得ることを理解している。よって、一実施形態では、上記各個々のドナーに由来するＭＳＣ集団に割り当てられた総スコアの値は、各個々のドナーに由来するＭＳＣ集団のランキングスコアの値の加算により得られる追加の総スコアの値である。別の実施形態では、上記各個々のドナーに由来するＭＳＣ集団に割り当てられた総スコアの値は、１）重みを、各アッセイ結果のランキングスコアに割り当て、２）個々のドナーに由来するＭＳＣ集団の重み付けされたランキングスコアの値を加算することにより得られる、重み付けした総スコアの値である。
総スコアの値に基づき、望ましい集団特性を有する個々のドナーに由来するＭＳＣ集団のサブセットが選択される。このステップでは、少なくとも３、たとえば少なくとも４、たとえば少なくとも５、たとえば少なくとも６、たとえば少なくとも７、たとえば少なくとも８、たとえば少なくとも９、たとえば少なくとも１０名の個々のドナーに由来するＭＳＣ集団が選択されることが想定される。本明細書中使用される場合、用語「サブセット」は、アッセイされる個々のドナーに由来するＭＳＣ集団の全てまたは全てよりも少ないものを表す。
一実施形態では、望ましい集団特性を有する個々のドナーに由来するＭＳＣ集団のサブセットを選択するステップが、高い総スコアの値がより望ましい集団特性を表す場合に少なくとも１つの所定の総スコアの値に対応するか、または低い総スコアの値がより望ましい集団特性を表す場合に最大で所定のスコアに対応する総スコアの値を有する個々のドナーに由来するＭＳＣ集団を選択するステップを含む方法により入手可能な、本明細書中開示される使用のための、単離され、集められたアロジェニックなＭＳＣ集団が提供される。別の実施形態では、望ましい集団特性を有する個々のドナーに由来するＭＳＣ集団のサブセットを選択するステップは、所定の数の個々のドナーに由来するＭＳＣ集団を選択するステップを含み、ここで集団は、高い総スコアの値がより望ましい集団特性を表す場合に残りの個々のドナーに由来するＭＳＣ集団と比較して高い総スコアの値を呈し、または集団は、低い総スコアの値がより望ましい集団特性を表す場合に残りの個々のドナーに由来するＭＳＣ集団と比較して低い総スコアの値を呈する。
上記方法の次のステップでは、選択された個々のドナーに由来するＭＳＣ集団を集めて、単離され、集められたアロジェニックなＭＳＣ集団を得る。上記で説明されるように、単離され、集められたアロジェニックなＭＳＣ集団が、１名のドナーに由来する細胞が上記集められた集団において有意に優性ではないように、同様の数または同じ範囲の数の、各個々のドナーに由来する細胞を含むことが有用であるとみなされている。よって、本明細書中開示される使用のための、単離され、集められたアロジェニックなＭＳＣ集団の一実施形態では、いずれか１名のドナー由来の細胞の数は、上記単離され、集められたアロジェニックなＭＳＣ集団の総細胞数の約４５％以下、たとえば約４０％以下、たとえば約３５％以下であり、上記集団は、少なくとも３名のドナーに由来するＭＳＣを含み、
たとえば、いずれか１名のドナーに由来する細胞数は、上記単離され、集められたアロジェニックなＭＳＣ集団の総細胞数の、約４０％以下、たとえば約３５％以下、たとえば約３０％以下であり、上記集団は、少なくとも４名のドナーに由来するＭＳＣを含み；
たとえば、いずれか１名のドナー由来の細胞の数は、上記単離され、集められたアロジェニックなＭＳＣ集団の総細胞数の約３５％以下、たとえば約３０％以下、たとえば約２５％以下であり、上記集団は、少なくとも５名のドナーに由来するＭＳＣを含み；
たとえば、いずれか１名のドナーに由来する細胞数は、上記単離され、集められたアロジェニックなＭＳＣ集団の総細胞数の、約３０％以下、たとえば約２５％以下、たとえば約２０％以下であり、上記集団は、少なくとも６名のドナーに由来するＭＳＣを含み；
たとえば、いずれか１名のドナーに由来する細胞数は、上記単離され、集められたアロジェニックなＭＳＣ集団の総細胞数の、約２５％以下、たとえば約２２％以下、たとえば約２０％以下であり、上記集団は、少なくとも７名のドナーに由来するＭＳＣを含み；
たとえば、いずれか１名のドナーに由来する細胞数は、上記単離され、集められたアロジェニックなＭＳＣ集団の総細胞数の、約２０％以下、たとえば約１８％以下、たとえば約１６％以下であり、上記集団は、少なくとも８名のドナーに由来するＭＳＣを含み；
たとえば、いずれか１名のドナーに由来する細胞数は、上記単離され、集められたアロジェニックなＭＳＣ集団の総細胞数の、約１８％以下、たとえば約１５％以下、たとえば約１３％以下であり、上記集団は、少なくとも９名のドナーに由来するＭＳＣを含み；
たとえば、いずれか１名のドナーに由来する細胞数は、上記単離され、集められたアロジェニックなＭＳＣ集団の総細胞数の、約１６％以下、たとえば約１４％以下、たとえば約１２％以下であり、上記集団は、少なくとも１０名のドナーに由来するＭＳＣを含む。
１つの特定の実施形態では、いずれか１名の個々のドナーに由来するＭＳＣの数は、他のいずれかのドナーに由来する細胞数の約４倍以下、たとえば約３倍以下、たとえば約２倍以下である。
集団において個々のドナーに由来するＭＳＣの望ましい分布を維持するために、ＭＣＳのさらなる培養が、個々のドナーに由来するＭＳＣ集団の選択されたサブセットを集めた後に行われることを理解されたい、理論により拘束されるものではないが、集められた集団における個々のドナーに由来するＭＳＣの分布は、単離され、集められたアロジェニックなＭＳＣ集団を投与した患者においてＨＬＡ免疫がないかまたはこれが低いことを確実にすることが予測されるＨＬＡミスマッチを得るために重要であることが想定される。よって、本明細書中開示される単離され、集められたアロジェニックなＭＳＣ集団は、一実施形態により集められた後にさらに培養されない。本態様の一実施形態では、単離され、集められたアロジェニックなＭＳＣ（ａｌｌｏｇｅｎｅｉｎ ＭＳＣ）集団は、集めるステップの後にさらに培養されない。
上述のように、上記少なくとも３つのアッセイによりアッセイされる際に望ましい必要条件を満たす個々のドナーに由来するＭＳＣ集団のみが、集めるステップで集めることに適格がある。よって、適格のない細胞は廃棄される。個々のドナーに由来するＭＳＣ集団で得たアッセイ結果、よって上記細胞の特性を、本方法によってより早期の集団を得た早期に得た単離され、集められたアロジェニックなＭＳＣ集団で得たアッセイ結果と比較することが可能である。よって、早期の集団は、本方法において内部のクオリティコントロールとして機能する。よって、一実施形態では、本方法は、個々のドナーに由来するＭＳＣ集団のアッセイ結果が、同じ方法により以前に得た集められたアロジェニックなＭＳＣ集団の対応するアッセイ結果よりも望ましくない場合、集めるステップから上記個々のドナーに由来するＭＳＣ集団を廃棄するステップをさらに含む。
重要なことに、本方法は、単離され、集められたアロジェニックなＭＣＳ集団の総合的な評価の変分の低減をもたらす。明確にするため、バッチの中の変分は、全てのドナーから集められたＭＳＣを含むバッチと比較して低い。
例示するため、評価における変分は、以下の式：

により計算され得る（式中、最大値および最小値は、得られたアッセイ結果の最大値および最小値である）。
総合的な評価は、選択されたドナーのΔ選択アルゴリズムスコア、この例では６－３＝３を、評価された全てのドナーのΔ選択アルゴリズムスコア、この例では６－１＝５で除算することにより計算され得る。
よって、本明細書中開示される使用のための、単離され、集められたアロジェニックなＭＳＣ集団の一実施形態では、バッチの中の総合的な評価の変分は、アッセイした全ての個々のドナーに由来するＭＳＣ集団および選択された個々のドナーに由来するＭＳＣ集団のサブセットを比較する場合に、少なくとも３０％、たとえば少なくとも３５％、たとえば少なくとも４０％、たとえば少なくとも４５％、たとえば少なくとも５０％、たとえば少なくとも６０％低下している。
本開示で詳細に説明されるように、本明細書中開示される使用のための、単離され、集められたアロジェニックなＭＳＣ集団を入手可能な方法は、本明細書中開示される単離され、集められたアロジェニックなＭＳＣ集団を得ることを可能にする。ここでバッチは、統計的に有意なバッチ間のばらつきを示さない。
別の実施形態では、上記方法は、炎症誘発性化合物、たとえばＩＦＮγ、アラム、および／または腫瘍壊死因子αの存在下で、それを必要とする患者への投与の前の期間の間、たとえば少なくとも１２時間かつ７２時間以下、たとえば２４～７２時間、単離され、集められたアロジェニックなＭＳＣ集団を培養するステップをさらに含む。たとえば、上記培養ステップは、約１２～約７２時間の期間の間行われ得る。たとえば、上記期間は、約２４時間、３６時間、４８時間、６０時間、または約７２時間であり得る。上記期間は、約１２時間～約７２時間のいずれかの期間であり得る。一実施形態では、培養ステップは、投与の直前に行われる。一部の実施形態では、本明細書中開示されるように、上記培養期間は、投与の約１２時間前までに、たとえば１１、１０、９、８、７、６、５、４、３、２、または１時間前に終了する。
上記で説明されるように、ＭＳＣを集めることは、単離され、集められたアロジェニックなＭＳＣ集団を得る製剤化ステップに限定され、よって細胞は、集めた後にいずれかの培養またはさらなる増殖に供されない。これにより細胞はさらに増殖せず、よって、単離され、集められたアロジェニックなＭＳＣ集団の効力および機能性に及ぼす当該増殖の関連する負の影響はないことが確保される。集めた後の培養は、負の影響、たとえば限定するものではないが、免疫抑制および／または免疫調節の可能性の喪失、ならびに炎症性マーカーの増大のリスクを上げる。さらに、細胞が集めた後に培養／増殖される場合、免疫抑制および／または免疫調節の可能性の喪失ならびに／または炎症性マーカーの増大の負の影響は、集められたバッチを通して差次的であり得、よって、バッチ間のばらつきに関する負の影響が表される。本発明者からのデータは、細胞をさらに増殖することなく本開示によりＭＳＣを集めることは、集められた産物を構成する単一のドナー細胞と比較して、高い免疫抑制および／または免疫調節の可能性をもたらし得ることを示す。よって、本明細書中開示される使用のための、単離され、集められたアロジェニックなＭＳＣ集団は、望ましい特性を呈する。よって、一実施形態では、上記本明細書中開示される使用のための、単離され、集められたアロジェニックなＭＳＣ集団であって、上記集められた集団が、個々のドナーに由来するＭＳＣ集団と比較して高い免疫抑制および／または免疫調節の可能性を呈する、集団が提供される。上記比較は、本発明の方法で定義されるようにアッセイした少なくとも３名の個々のドナーに由来するＭＳＣ集団、たとえばアッセイされた各個々のドナーに由来するＭＳＣ集団となされ得る。よって、上記集められた集団は、アッセイされた個々のドナーに由来するＭＳＣ集団の少なくとも約５０％、たとえば約６０％、たとえば約７０％、たとえば約７５％、たとえば約８０％、たとえば約８５％、たとえば約９０％、たとえば約９５％、たとえば約１００％と比較して、高い免疫抑制および／または免疫調節の可能性を呈し得る。あるいは、上記比較は、本発明の方法で定義されるように集めるために選択された個々のドナーに由来するＭＳＣ集団となされ得る。よって、上記集められた集団は、集めるために選択された個々のドナーに由来するＭＳＣ集団の少なくとも約５０％、たとえば約６０％、たとえば約７０％、たとえば約７５％、たとえば約８０％、たとえば約８５％、たとえば約９０％、たとえば約９５％、たとえば約１００％と比較して、高い免疫抑制および／または免疫調節の可能性を呈し得る。
一実施形態では、本明細書中開示される使用のための集められた集団は、アッセイされた個々のドナーに由来するＭＳＣ集団と比較して高い免疫抑制および／または免疫調節の可能性を呈し、ここで上記亢進は、少なくとも約５％、たとえば少なくとも約７．５％、たとえば少なくとも約１０％、たとえば少なくとも約１２．５％、たとえば少なくとも約１５％、たとえば少なくとも約１７．５％、たとえば少なくとも約２０％、たとえば少なくとも約２２．５％、たとえば少なくとも約２５％、たとえば少なくとも約３０％、またはそれ以上である。
当業者は、上記に列挙した実施形態が任意の方法で組み合わせられ得ることを理解している。単に簡単にするため、ここでは様々な組み合わせを個別に列挙していないが、列Ａ、Ｂ、およびＣを有する表において本明細書中に表されている。列Ａおよび／またはＢのいずれかの値（行）は、本明細書中開示される一実施形態に到達するために、列Ｃのいずれかの値（行）と組み合わせられ得ることが理解される。列Ａ、Ｂ、およびＣからの値の選択は、無関係な選択である。よって、上記実施形態は、上記集められた集団が、アッセイした個々のドナーに由来するＭＳＣ集団の［列Ａからの値］および／または集めるために選択された個々のドナーに由来するＭＳＣ集団の［列Ｂからの値］と比較して高い免疫抑制および／または免疫調節の可能性を呈し得るように表すことができ、ここで上記亢進は、［列Ｃの値］である。非限定的な例示的な例として、上記集めた集団が、アッセイした個々のドナーに由来するＭＳＣ集団の少なくとも約５０％と比較して高い免疫抑制および／または免疫調節の可能性を呈し、ここで上記亢進は、少なくとも約１０％である一実施形態、ならびに上記集めた集団が、集めるために選択された個々のドナーに由来するＭＳＣ集団の少なくとも約７５％と比較して高い免疫抑制および／または免疫調節の可能性を呈し、上記亢進が少なくとも約５％である一実施形態が挙げられる。
表は、上述の実施形態の組み合わせを表している。
１つの特定の実施形態では、上記高い免疫抑制および／または免疫調節の可能性は、刺激されていないＭＳＣによるＩＤＯの発現として測定される。別の実施形態では、上記高い免疫抑制および／または免疫調節の可能性は、刺激されていないＭＳＣによるＰＧＥ２の発現として測定される。
一実施形態では、上記本明細書中開示される使用のための、単離され、集められたアロジェニックなＭＳＣ集団は、少なくとも３、たとえば少なくとも４、たとえば少なくとも５、たとえば少なくとも６、たとえば少なくとも７、たとえば少なくとも８、たとえば少なくとも９、たとえば少なくとも１０名の個々のドナーに由来するＭＳＣを含む。たとえば、上記集団は、３－１０、たとえば４－１０、たとえば５－１０、たとえば５－９、たとえば５－８、たとえば５、６、または７名の個々のドナーに由来するＭＳＣを含み得る。さらに、一実施形態では、上記本明細書中開示される使用のための、単離され、集められたアロジェニックなＭＳＣ集団は、統計上有意なバッチ間のばらつきを呈さない。本方法は、好適な特性を呈する単離され、集められたアロジェニックなＭＳＣ集団を得ることを可能にする。大きなバッチのＭＳＣが、細胞を集めるステップにより得られ得ることが好適であるとみなされ、さらにこれは、製造コストの低下を可能にする。個々のドナーに由来するＭＳＣ集団を集めることにより、上述のように低い継代数で細胞を維持することが可能であり、これにより得られた単離され、集められたアロジェニックなＭＳＣ集団は、効力が高く、遺伝子が不安定になるリスクが低い。よって、高い効力を有する大きなバッチの遺伝的に安定した細胞を得ることができる。さらに、本明細書中開示される方法により入手可能な単離され、集められたアロジェニックなＭＳＣ集団は、使用される本方法のステップにより、統計上有意なバッチ間のばらつきを呈さない。
本明細書中使用される場合、用語「バッチ」は、本明細書中開示される方法により得られる単離され、集められたアロジェニックなＭＳＣ集団を表す。
本明細書中使用される場合、用語「バッチ間のばらつき」は、本明細書中開示される方法により得られる単離され、集められたアロジェニックなＭＳＣ集団と、別の本明細書中開示される方法により得られる単離され、集められたアロジェニックなＭＳＣ集団との間の特性の差異を表す。
上記バッチ間のばらつきは、個々のドナーに由来するＭＳＣ集団をアッセイするために使用した上記少なくとも３つのアッセイのうちの１つまたはいくつかからの結果を比較することにより定量化され得る。あるいは、１つまたはいくつかの異なるアッセイが使用され得る。
本明細書中使用される場合、用語「統計上有意ではないバッチ間のばらつき」は、１つのバッチからのアッセイ結果と異なるバッチからのアッセイ結果との間の差異が統計上有意ではない（たとえばＰ＞０．０５の確率値を使用）と解釈される。上記統計上有意性は、バッチ間の分散の係数が、分散のアッセイ内および／またはアッセイ間の係数以下であると判断され得る。当業者は、適切な統計計算に精通している。
よって、一実施形態では、本明細書中開示される使用のための、単離され、集められたアロジェニックなＭＳＣ集団であって、集団が、統計上有意なバッチ間のばらつきを呈さない、ＭＳＣ集団が提供される。一実施形態では、統計上有意ではないバッチ間のばらつきは、２つの連続してもたらされるバッチ間のばらつきである。一実施形態では、上記統計上有意ではないバッチ間のばらつきは、任意の２つのバッチ間、たとえば、２つの連続してもたらされるバッチ間、またはたとえば１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、またはそれ以上のバッチだけ離れてもたらされるいずれか２つのバッチ間のばらつきである。一実施形態では、統計上有意ではないバッチ間のばらつきは、もたらされるバッチと参照バッチとの間のばらつきであり、ここで上記参照バッチは、本明細書中開示される方法により以前にもたらされる単離され、集められたアロジェニックなＭＳＣ集団である。
一実施形態では、統計上有意ではないバッチ間のばらつきは、確率値（Ｐ）＞０．０５、たとえばＰ＞０．０４、たとえばＰ＞０．０３、たとえばＰ＞０．０２、たとえばＰ＞０．０１、たとえばＰ＞０．００５、たとえばＰ＞０．００１に関連している。一実施形態では、上記バッチ間のばらつきは、本明細書中記載されるＩＤＯアッセイ、本明細書中記載されるＰＧＥアッセイ、および本明細書中記載される増殖アッセイからなる群から選択される上記３つのアッセイのうちの少なくとも２つからのアッセイ結果に基づき定量化され、少なくとも１つのアッセイは、本明細書中記載されるＴｒｅｇアッセイ、本明細書中記載されるＤＣアッセイ、本明細書中記載される単球アッセイ、および本明細書中記載されるミクログリアアッセイからなる群、たとえば、本明細書中記載されるＩＤＯアッセイ、本明細書中記載されるＰＧＥアッセイ、および本明細書中記載される増殖アッセイ、および本明細書中記載されるミクログリアアッセイのうち３つ全てから選択される。任意選択で、バッチ間のばらつきは、１つ以上のさらなるアッセイに基づき定量化され得る。
本明細書中説明されるように、本明細書中開示される使用のための、単離され、集められたアロジェニックなＭＳＣ集団が、たとえばエピジェネティックなメモリーのため、分化形質転換または脱分化したＭＳＣ供給源とは対照的なネイティブなＭＳＣ供給源に由来することが有用であり得る。さらに、ネイティブなＭＳＣ供給源に由来する本明細書中開示される単離され、集められたアロジェニックなＭＳＣ集団は、安全性、たとえば腫瘍形成能または異所性組織の形成のリスクが低いため、有用であり得る。最終的に分化しない限り、細胞は形質転換でき、ｉｎ ｖｉｖｏで、たとえば腫瘍または異所性組織の形成を介して悪性となり得ることが知られている。対照的に、ネイティブなヒトＭＳＣ供給源由来のＭＳＣでは、これは観察されなかった。よって、本発明の態様の一実施形態では、本明細書中開示される単離され、集められたアロジェニックなＭＳＣ集団のＭＳＣは、ネイティブなＭＳＣ供給源から得られる。このようなネイティブな供給源は、本明細書中開示される第１の態様に関連して開示されており、単に簡潔にするため反復されていない。
本明細書中開示される使用のための、単離され、集められたアロジェニックなＭＳＣ集団は、望ましい機能的および形態学的な特性、高い効力、統計上有意ではないバッチ間のばらつきを呈し、また、大きなバッチで入手可能である。これは、上記集団が医薬として使用される場合の予測可能性および低いばらつきを可能にする。よって、本発明の本明細書中開示される使用のための、単離され、集められたアロジェニックなＭＳＣ集団は、標準化された薬学的な処置手法で使用され得る。本明細書中開示される方法により入手可能な単離され、集められたアロジェニックなＭＳＣ集団は、上記集団が医薬として、特に製剤および投与レジメンに関連して使用される場合、ロジスティックかつ投与に好適であることが想定される。ロジスティクスチェーンは、上記単離され、集められたアロジェニックなＭＳＣ集団を低温で保存し続けなければならず、よって、単離され、集められたアロジェニックなＭＳＣ集団の特性を維持することを確実にし、従来技術により「本発明者らが何とか増殖させた細胞数を患者に提供すること」とは対照的に、医薬として所定の細胞数を患者に投与することを可能にしている。よって、本明細書中開示される単離され、集められたアロジェニックなＭＳＣ集団は、治療効果および安全性の観点から予測可能性を提供する、「すぐに購入可能な（ｏｆｆ ｔｈｅ ｓｈｅｌｆ）」標準化された医薬製品として適切である。
本明細書中開示される単離され、集められたアロジェニックなＭＳＣ集団は、炎症性疾患または病態、自己免疫疾患、移植拒絶反応、およびＣＮＳ障害からなる群から選択される疾患または病態の処置および／または予防に有用であることが想定されている。特に、上記本明細書中開示される単離され、集められたアロジェニックなＭＳＣ集団は、それを必要とする対象への投与の前に、１つまたは複数の刺激因子、たとえば炎症誘発性因子、および／または上記集団の免疫抑制能を刺激する因子へ曝露され得る。たとえば、上記刺激因子は、ＩＦＮγおよび／または腫瘍壊死因子α、および／またはアラムであり得る。
一実施形態では、上記本明細書中開示される使用のための、単離され、集められたアロジェニックなＭＳＣ集団は、投与の数時間前、たとえば投与の直前に、ＩＦＮγまたは／および腫瘍壊死因子α、および／またはアラムへ曝露される。たとえば、上記曝露は、投与前、たとえば投与の直前の約１～約２４時間の期間であり得る。たとえば、上記曝露期間は、最大約１時間、または約１、２、４、５、または２４時間であり得る。上記期間は、約２４時間以下のいずれかの期間であり得る。たとえば、一部の実施形態では、上記期間は、約１時間未満（言い換えると最大約１時間）であり得る。上記期間は、最大約１時間（言い換えると約１時間未満）～約２４時間、または約１時間～約２４時間のいずれかの期間であり得る。一部の実施形態では、上記曝露は、投与の約１２時間前までに、たとえば１１、１０、９、８、７、６、５、４、３、２、または１時間前に終了する。当業者は、上記曝露が、それを必要とする患者への細胞の投与の前に起こり、集めた後の、単離され、集められたアロジェニックなＭＳＣ集団のさらなる培養と同等ではないことを理解している。上記曝露の目的は、患者の障害の処置に有用な因子の発現を誘導することであり、より大きな細胞集団を得るために細胞を増殖するためではない。上記曝露は、バッチ間のばらつきに影響しないことが理解されるであろう。上記集めた後の、単離され、集められたアロジェニックなＭＳＣ集団を集めた後に凍結（たとえば集めるステップの後にさらなる培養を全くせずに集めた直後に凍結）する場合、本明細書中論述される曝露は、単離され、集められたアロジェニックなＭＳＣ集団を解凍した後であるが、患者へ投与する前である。当業者は、上記単離され、集められたアロジェニックなＭＳＣ集団を曝露するステップが、細胞集団の増殖のための細胞培養とは異なることを理解している。よって、この状況での曝露は、細胞の平均倍加時間よりも短い期間である。
理論により拘束されるものではないが、単離され、集められたアロジェニックなＭＳＣ集団は、自然免疫細胞および適応免疫細胞による応答を調節でき、未成熟な状態の樹状細胞を保持し、樹状細胞の分化およびそれらの炎症誘発性サイトカイン産生の抑制を阻害することが想定されている。よって、本発明の、単離され、集められたアロジェニックなＭＳＣ集団は、炎症および自己免疫疾患または病態、移植片拒絶、ならびにＣＮＳ障害、たとえば筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、原発性側索硬化症（ＰＬＳ）、進行性筋萎縮症（ＰＭＡ）、多発性硬化症（ＭＳ）、脳性麻痺（ＣＰ）、低酸素関連の脳損傷、びまん性硬化症、急性散在性脳脊髄炎、急性出血性白質脳炎、横断性脊髄炎および／または視神経脊髄炎、特にたとえば、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、原発性側索硬化症（ＰＬＳ）、進行性筋萎縮症（ＰＭＡ）、多発性硬化症（ＭＳ）、脳性麻痺（ＣＰ）および／または低酸素関連の脳損傷；たとえば筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、原発性側索硬化症（ＰＬＳ）、および／または進行性筋萎縮症（ＰＭＡ）の処置および／または予防に有用であると想定されている。
ＣＯＶＩＤ－１９感染症は、ある範囲の神経性の症状を誘導し得、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２およびコロナウイルス科の他のメンバーが中枢神経系を標的とする可能性を表している。コロナウイルス感染症に関するより徹底的な研究は、熱性けいれん、けいれん、および脳炎などの神経性の徴候を示している。現在の研究は、このウイルスが、嗅球を介してＣＮＳに入り、炎症および脱髄をもたらし得ることを表している。理論により拘束されるものではないが、本発明者らは、免疫細胞区画の調節および免疫寛容の誘導を介して炎症プロセスを標的とするＭＳＣ療法の特性が、ＣＯＶＩＤ－１９の処置、およびＣＯＶＩＤまたはコロナウイルスの感染症に関連する長期の神経性合併症の処置において有望な間質細胞療法の可能性を表していると想定している（Ｈｅｎｅｋａ ｅｔ ａｌ．， ２０２０）。同様に、多発性硬化症などの神経性障害におけるＭＳＣ療法の現在の使用は、ＣＯＶＩＤ－１９のなどの脱髄性病態の標的化における間質性の治療法の可能性を表している。
よって、本明細書中記載の使用のための、単離され、集められたアロジェニックなＭＳＣ集団の一実施形態では、ＣＯＶＩＤ－１９感染症の処置および／または予防は、ＣＯＶＩＤ－１９感染症に関連する神経性症状、たとえば、ＣＯＶＩＤ－１９感染症に関連する炎症または脱髄の処置および／または予防である。
ＣＯＶＩＤ－１９に関する処置選択肢は、デキサメタゾン、回復期血漿、免疫グロブリンベースの処置などの別の目的で使用される薬物を含む選択肢を伴い、常に進化している。増え続ける処置選択肢にもかかわらず、長期のＣＯＶＩＤの負荷、ウイルスが系を離れた後に続く疾患症状の兆候は広範囲にわたる。これら長期ＣＯＶＩＤ患者の多くは、記憶の喪失、集中および睡眠に関連する問題を含む神経性の症状を呈する。ＣＯＶＩＤ感染症の神経性の作用は、呼吸器関連の症状と同様に徹底的に調査されてはいない。しかしながら、多発性硬化症で見られる、せん妄、脳の腫脹および炎症、ならびにミエリンの変質を経た感染した患者が報告されている。以来、神経性作用は、脳卒中および脳出血、末梢神経の損傷、不安および外傷後ストレス障害を含み拡大している（Ｍａｒｓｈａｌｌ． ２０２０ Ｎａｔｕｒｅ． ５８５； ３４２－３４３）。一実施形態では、上記使用はＣＯＶＩＤ－１９感染症に関連する神経性症状の処置および／または予防における、ＣＯＶＩＤ－１９感染症に関連する炎症の処置および／または予防での使用である。一実施形態では、上記使用は、ＣＯＶＩＤ－１９感染症に関連する神経性症状の処置および／または予防における、ＣＯＶＩＤ－１９感染症に関連する脱髄の処置および／または予防における使用である。一実施形態では、長期ＣＯＶＩＤ－１９感染症に関連する症状の処置および／または予防での使用のため、たとえば長期ＣＯＶＩＤ－１９感染症に関連する神経性症状の処置および／または予防での使用のための、本明細書中開示される使用のための、単離され、集められたアロジェニックなＭＳＣ集団が提供される。
本明細書中使用される場合、「長期ＣＯＶＩＤ－１９」は、ウイルス感染症の回復後のＣＯＶＩＤ－１９感染症に関連する症状の持続を表す。本明細書中使用される倍、用語「長期ＣＯＶＩＤ－１９感染症に関連する神経性症状」は、ウイルス感染症の回復後のＣＯＶＩＤ－１９感染症に関連する神経性症状の持続を表す。
本明細書中使用される場合、用語「注入」は、注入および注射を包有すると解釈することを意味する。よって、たとえば、用語「髄腔内注入」は、「髄腔内注射」を包有する。
一実施形態では、上記使用は、それを必要とされる患者への注入としての、単離され、集められたアロジェニックなＭＳＣ集団の投与を含む。一実施形態では、上記注入／注射は、静脈内、腹腔内、またはリンパ内（ｉｎｔｒａｌｙｍｐｈａｔｉｃａｌｌｙ）、静脈内、髄腔内、脳内投与であるか、かつ／またはＯｍｍａｙａリザーバーを介してか、動脈内、もしくは皮下にて投与される。一実施形態では、上記注入／注射は、静脈内、腹腔内、リンパ内（ｉｎｔｒａｌｙｍｐｈａｔｉｃａｌｌｙ）、静脈内、髄腔内、脳内、Ｏｍｍａｙａリザーバーを介してか、動脈内、または皮下にて投与される。一実施形態では、上記注入／注射は、静脈内、腹腔内、またはリンパ内（ｉｎｔｒａｌｙｍｐｈａｔｉｃａｌｌｙ）、静脈内、髄腔内、脳内、Ｏｍｍａｙａリザーバーを介してか、動脈内、皮下、または筋肉内にて投与される。一実施形態では、上記注入または注射は、筋肉内に投与される。一実施形態では、上記注入は、静脈内、腹腔内、またはリンパ内（ｉｎｔｒａｌｙｍｐｈａｔｉｃａｌｌｙ）、たとえば静脈内にて投与される。一実施形態では、上記投与は、静脈内注入または静脈内注射である。
ＭＳＣを使用した神経性疾患に対して提案されている再生手法は、細胞が脳内または髄腔内注入／注射を介して送達される細胞療法を含む。よって、一実施形態では、上記使用は、髄腔内または脳内注入／注射、たとえば髄腔内注入／注射としての、上記単離され、集められたアロジェニックなＭＳＣ集団の投与を含む。ＭＳＣの脳への移植後の関連する作用機構は、主にパラクリンの作用を介して、ＭＳＣが神経発生を促進し、アポトーシスおよびネクローシスを減少させ、フリーラジカルのレベルを低減し、損傷したニューロンからのシナプス結合を奨励し、多様な神経栄養因子を放出し、炎症を制御し、血管損傷を低減することを含む（Ｊｏｙｃｅ， ２０１０， Ｒｅｇｅｎ Ｍｅｄ． Ｎｏｖ；５（６）：９３３－４６；Ｌｉｍａ ｅｔ ａｌ．， ２０２０， Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｒｅｓ Ｔｈｅｒ． １１：３６７）。
別の実施形態では、上記使用は、静脈内注入／注射としての、単離され、集められたアロジェニックなＭＳＣ集団の投与を含む。別の実施形態では、上記使用は、筋肉内注入／注射としての、単離され、集められたアロジェニックなＭＳＣ集団の投与を含む。
ＭＳＣの調節の性質およびＨＬＡ－ＤＲの低い発現は、ＭＳＣのアロジェニックな移植がドナーとレシピエントとの間でＨＬＡが一致することなく受け入れられ得ると想定するための２つの理由である。上記注入／注射が、患者の治療上の必要性に応じて、反復してまたは１回のみ行われ得ることが想定されている。理論により拘束されるものではないが、１回の注入／注射または反復した注入／注射による上記投与は、処置した患者に抗ＨＬＡ抗体の臨床的に関連するレベルをもたらさないことが想定されている。よって、上記患者は、本明細書中記載されるいくつかの注入／注射の処置に適格がある。よって、一実施形態では、上記注入／注射は、１回のみ行われる。別の実施形態では、上記注入／注射は、反復して行われる。たとえば、上記注入／注射は、２回、３回、４回、またはそれ以上行われ得る。上記注入／注射は、たとえば、１カ月ごと、２カ月ごと、３カ月ごと、４カ月ごと、５カ月ごと、または６カ月ごと、またはそれ以上の間隔で行われ得る。
特に、上記本明細書中開示される単離され、集められたアロジェニックなＭＳＣ集団が本明細書中開示されるＣＮＳ障害の処置および／または予防での使用のためのものである実施形態では、注入／注射は、１カ月ごと、２カ月ごと、２カ月ごと、３カ月ごと、４カ月ごと、５カ月ごと、または６カ月ごと、またはそれ以上の間隔で行われ得る。上記処置は、それを必要とする患者の寿命の間続行され得ることが想定され得る。
よって、一実施形態では、上記投与は、上記患者に抗ＨＬＡ抗体の力価を誘導しないか、低いレベルで誘導する。本明細書中使用される場合、「抗ＨＬＡ抗体力価が低いまたはない」との文言は、臨床上無関係であるとみなされる力価を表す。固相マルチプレックス技術による抗体分析は、より正確な、ＨＬＡ抗体の幅および強度の定義を可能にした。これら結果を、実際の細胞ベースのクロスマッチにより得た結果、および最終的なグラフトのアウトカムと相関させることにより、臨床上関連する抗体が、中心に特異的な方法（ｃｅｎｔｅｒ ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｍａｎｎｅｒ）で定義され得る（Ｚａｃｈａｒｙ ｅｔ ａｌ． Ｈｕｍ Ｉｍｍｕｎｏｌ ２００９； ７０： ５７４－５７９）。当業者は、臨床上無関係な抗ＨＬＡ抗体の力価が、１０００より高いドナーに特異的な抗体の平均蛍光強度（ＭＦＩ）（ＤＳＡ ＭＦＩ＞１０００）でのＬＡＢＳｃｒｅｅｎ ｓｉｎｇｌｅ ａｎｔｉｇｅｎビーズ試験により定義され得ることを理解している。
本明細書中記載される使用のための、単離され、集められたアロジェニックなＭＳＣ集団は、治療上有効用量で投与される。一実施形態では、本明細書中開示される使用のための、単離され、集められたアロジェニックなＭＳＣ集団であって、上記使用が、およそ少なくとも３×１０６個の細胞、たとえばおよそ少なくとも５×１０６個の細胞、たとえばおよそ少なくとも１０×１０６個の細胞、たとえばおよそ少なくとも１５×１０６個の細胞、たとえばおよそ少なくとも２０×１０６個の細胞、たとえばおよそ少なくとも２５×１０６個の細胞、たとえばおよそ少なくとも３０×１０６個の細胞、たとえばおよそ少なくとも５０×１０６個の細胞、たとえばおよそ少なくとも約６０×１０６個の細胞、たとえばおよそ少なくとも約７５×１０６個の細胞、たとえばおよそ少なくとも約１００×１０６個の細胞、たとえばおよそ少なくとも約１５０×１０６個の細胞、たとえばおよそ少なくとも約２００×１０６個の細胞の用量での上記患者への投与を含む、ＭＳＣ集団が提供される。一実施形態では、上記使用は、およそ少なくとも０．１×１０６個の細胞／ｋｇ体重、たとえばおよそ少なくとも０，３×１０６個の細胞／ｋｇ体重、たとえばおよそ少なくとも０，５×１０６個の細胞／ｋｇ体重、たとえばおよそ少なくとも０，７５×１０６個の細胞／ｋｇ体重、たとえばおよそ少なくとも１×１０６個の細胞／ｋｇ体重、たとえばおよそ少なくとも１，２×１０６個の細胞／ｋｇ体重の用量での上記患者への投与を含む。一実施形態では、上記使用は、約０．１×１０６個の細胞／ｋｇ体重～約１０×１０６個の細胞／ｋｇ体重、たとえば約０．１５×１０６個の細胞／ｋｇ体重～約４×１０６個の細胞／ｋｇ体重、たとえば約０．２０×１０６個の細胞／ｋｇ体重～約４×１０６個の細胞／ｋｇ体重、たとえば約０．２５×１０６個の細胞／ｋｇ体重～約４×１０６個の細胞／ｋｇ体重、たとえば約０．３×１０６個の細胞／ｋｇ体重～約４×１０６個の細胞／ｋｇ体重、たとえば約０．２５×１０６個の細胞／ｋｇ体重～約３×１０６個の細胞／ｋｇ体重、たとえば約０．２５×１０６個の細胞／ｋｇ体重～約２×１０６個の細胞／ｋｇ体重、または約０．３×１０６個の細胞／ｋｇ体重～約１．２×１０６個の細胞／ｋｇ体重の用量で上記患者へ投与するステップを含む。
本明細書中開示される使用のための、単離され、集められたアロジェニックなＭＳＣ集団が、医薬組成物として有用であることが想定されている。
よって、本開示の第２の態様では、本明細書中開示される単離され、集められたアロジェニックなＭＳＣ集団と、少なくとも薬学的に許容される賦形剤または担体とを含む医薬組成物が提供される。上記医薬組成物は、たとえばＣＯＶＩＤ－１９感染症、たとえばＣＯＶＩＤ－１９感染症に関連する神経性の症状、たとえばＣＯＶＩＤ－１９感染症に関連する炎症または脱髄の処置および／または予防のための、医薬として有用であり得る。
本医薬組成物は、本開示の第４の態様に関連して列挙された疾患または病態のいずれか１つの処置および／または予防に有用であり得ることが理解されるであろう。疾患または病態は、簡便性のためここでは反復していない。一実施形態では、上記医薬組成物は、およそ少なくとも３×１０６個の細胞、たとえばおよそ少なくとも５×１０６個の細胞、たとえばおよそ少なくとも１０×１０６個の細胞、たとえばおよそ少なくとも１５×１０６個の細胞、たとえばおよそ少なくとも２０×１０６個の細胞、たとえばおよそ少なくとも２５×１０６個の細胞、たとえばおよそ少なくとも３０×１０６個の細胞、たとえばおよそ少なくとも５０×１０６個の細胞、たとえばおよそ少なくとも約６０×１０６個の細胞、たとえばおよそ少なくとも約７５×１０６個の細胞、たとえばおよそ少なくとも約１００×１０６個の細胞、たとえばおよそ少なくとも約１５０×１０６個の細胞、たとえばおよそ少なくとも約２００×１０６個の細胞を含む。よって、上記組成物の１つの用量は、上述の数の細胞を含む。
一実施形態では、上記医薬組成物は、本明細書中開示される単離され、集められたアロジェニックなＭＳＣ集団であって、上記集団が、集められた後にさらなる培養に供されていない、ＭＳＣ集団を含む。
別の実施形態では、上記医薬組成物は、本明細書中開示される単離され、集められたアロジェニックなＭＳＣ集団であって、上記集団が、投与の前、たとえば投与の直前の期間の間、ＩＦＮ－γまたは／および腫瘍壊死因子α、および／またはアラムに曝露されている、ＭＳＣ集団を含む。上記集団は、約２４時間以下の期間の間、曝露され得る。たとえば、一部の実施形態では、上記期間は、約１時間未満（言い換えると最大約１時間）であり得る。たとえば、上記集団は、投与の前、たとえば投与の直前に、最大約１時間（言い換えると約１時間未満）～約２４時間、または約１～約２４時間、曝露され得る。たとえば、上記曝露期間は、最大約１時間、約１時間、４時間、６時間、１２時間、または約２４時間であり得る。上記期間は、約１２時間～約２４時間のうちのいずれかの期間であり得る。一部の実施形態では、上記培養は、投与の約１２時間前までに、たとえば約１１、１０、９、８、７、６、５、４、３、２、または１時間前に終了する。
一実施形態では、上記医薬組成物は、注入／注射；たとえば静脈内注入／注射、腹腔内注入／注射、リンパ内（ｉｎｔｒａｌｙｍｐｈａｔｉｃａｌ）注入／注射、静脈内注入／注射、脳内注入／注射、髄腔内注入／注射、脳内注入／注射、動脈内注入／注射、皮下注入／注射、Ｏｍｍａｙａリザーバーを介した注入／注射；たとえば脳内または髄腔内注入／注射のために製剤化されている。一実施形態では、上記医薬組成物は、静脈内注入／注射のために製剤化されている。一実施形態では、上記医薬組成物は、静脈内注入または静脈内注射のために製剤化されている。
本開示の第３の態様では、ＣＯＶＩＤ－１９感染症であるかまたはこれに関連する疾患または病態の処置および／または予防のための方法であって、
本明細書中定義される方法を使用して、単離され、集められたアロジェニックな間葉系幹細胞／間質細胞（ＭＳＣ）集団を得るステップと、
本明細書中開示される単離され、集められたアロジェニックなＭＳＣ集団または前記単離され、集められたアロジェニックなＭＳＣ集団を含む医薬組成物の治療上有効量を、それを必要とする患者に投与するステップと、
を含む、方法が提供される。
一実施形態では、上記疾患または病態は、ＣＯＶＩＤ－１９感染症であるかまたはＣＯＶＩＤ－１９感染症に関連している。一実施形態では、上記疾患または病態は、ＣＯＶＩＤ－１９感染症であるかまたはＣＯＶＩＤ－１９感染症に関連する炎症である。一実施形態では、上記疾患または病態は、ＣＯＶＩＤ－１９感染症であるかまたはＣＯＶＩＤ－１９感染症に関連する脱髄である。
当業者は、本開示の第１の態様に関連して言及された全ての実施形態が、等しく本発明の処置および／または予防の方法に適用可能であることを理解している。簡便性のため、上記実施形態は、ここでは反復されておらず、簡潔にのみ言及されている。上記方法の一実施形態では、上記ＭＳＣ集団の投与は、注入／注射、たとえば静脈内注入／注射、腹腔内注入／注射、リンパ内（ｉｎｔｒａｌｙｍｐｈａｔｉｃａｌ）注入／注射、静脈内注入／注射、髄腔内注入／注射、脳内注入／注射、動脈内注入／注射、皮下注入／注射、またはＯｍｍａｙａリザーバーを介した注入／注射によるものである。上記方法の一実施形態では、投与は、静脈内、腹腔内、またはリンパ内注入／注射によるものである。上記方法の一実施形態では、投与は、髄腔内注入／注射、または脳内注入／注射によるものである。上記方法の一実施形態では、投与は、静脈区内注入／注射によるものである。上記方法の一実施形態では、投与は、静脈内注入または静脈内注射によるものである。
一実施形態では、上記注入は、反復して行われる。別の実施形態では、上記注入／注射は、１回のみ行われる。本明細書中開示される処置および／または予防のための方法の一実施形態では、上記方法は、患者に抗ＨＬＡ抗体力価を誘導しないかまたは低いレベルで誘導する。一実施形態では、上記方法は、上記患者に、およそ少なくとも３×１０６個の細胞、たとえばおよそ少なくとも５×１０６個の細胞、たとえばおよそ少なくとも１０×１０６個の細胞、たとえばおよそ少なくとも１５×１０６個の細胞、たとえばおよそ少なくとも２０×１０６個の細胞、たとえばおよそ少なくとも２５×１０６個の細胞、たとえばおよそ少なくとも３０×１０６個の細胞、たとえばおよそ少なくとも５０×１０６個の細胞、たとえばおよそ少なくとも約６０×１０６個の細胞、たとえばおよそ少なくとも約７５×１０６個の細胞、たとえばおよそ少なくとも約１００×１０６個の細胞、たとえばおよそ少なくとも約１５０×１０６個の細胞、たとえばおよそ少なくとも約２００×１０６個の細胞の用量を投与するステップを含む。一実施形態では、上記方法は、上記患者に、およそ少なくとも０．１×１０６個の細胞／ｋｇ体重、たとえばおよそ少なくとも０，３×１０６個の細胞／ｋｇ体重、たとえばおよそ少なくとも０，５×１０６個の細胞／ｋｇ体重、たとえばおよそ少なくとも０，７５×１０６個の細胞／ｋｇ体重、たとえばおよそ少なくとも１×１０６個の細胞／ｋｇ体重、たとえばおよそ少なくとも１，２×１０６個の細胞／ｋｇ体重の用量を投与するステップを含む。一実施形態では、上記方法は、上記患者に、約０．１×１０６個の細胞／ｋｇ体重～約１０×１０６個の細胞／ｋｇ体重、たとえば約０．１５×１０６個の細胞／ｋｇ体重～約４×１０６個の細胞／ｋｇ体重、たとえば約０．２０×１０６個の細胞／ｋｇ体重～約４×１０６個の細胞／ｋｇ体重、たとえば約０．２５×１０６個の細胞／ｋｇ体重～約４×１０６個の細胞／ｋｇ体重、たとえば約０．３×１０６個の細胞／ｋｇ体重～約４×１０６個の細胞／ｋｇ体重、たとえば約０．２５×１０６個の細胞／ｋｇ体重～約３×１０６個の細胞／ｋｇ体重、たとえば約０．２５×１０６個の細胞／ｋｇ体重～約２×１０６個の細胞／ｋｇ体重、または約０．３×１０６個の細胞／ｋｇ体重～約１．２×１０６個の細胞／ｋｇ体重の用量を投与するステップを含む。
本開示のさらなる別の態様では、ＣＯＶＩＤ－１９感染症またはＣＯＶＩＤ－１９感染症に関連する症状の処置および／または予防のための医薬の製造における、本明細書中開示される単離され、集められたアロジェニックなＭＳＣ集団の使用が提供される。
この態様の一実施形態では、上記使用は、ＣＯＶＩＤ－１９感染症に関連する神経性症状の処置および／または予防のための医薬の製造における使用である。この態様の一実施形態では、上記使用は、ＣＯＶＩＤ－１９感染症に関連する炎症の処置および／または予防のための医薬の製造における使用である。この態様の一実施形態では、上記使用は、ＣＯＶＩＤ－１９感染症に関連する脱髄の処置および／または予防のための医薬の製造における使用である。この態様の一実施形態では、上記使用は、長期ＣＯＶＩＤ－１９感染症に関連する症状、たとえば長期ＣＯＶＩＤ－１９感染症に関連する神経性症状の処置および／または予防のための医薬の製造における使用である。本明細書中開示される第１の態様に関連して列挙される全ての実施形態は、等しく、この態様に関連しており、単に簡便性のためここで反復されていないことが理解されるであろう。
本開示の別の態様では、ＭＳＣ集団の効力を評価するための方法であって、
ＭＳＣ集団を培養または準備するステップと、
少なくとも３つのアッセイを使用して上記ＭＳＣ集団をアッセイして、上記少なくとも３つのアッセイの結果を得るステップと、
各アッセイで、前記アッセイ結果に基づき、スコアの値を上記ＭＳＣ集団に割り当てるステップであって、高いスコアの値が、より望ましいアッセイ結果を表すか、または低いスコアの値が、より望ましいアッセイ結果を表す、ステップと、
各アッセイに割り当てたスコアの値に基づき、総スコアの値を上記ＭＳＣ集団に割り当てるステップであって、高いスコアがより望ましいアッセイ結果を表す場合、高い総スコアの値がより望ましい集団特性を表し、または、低いスコアの値がより望ましいアッセイ結果を表す場合、低い総スコアの値がより望ましい集団特性を表す、ステップと、
上記総スコアの値が、高いスコアがより望ましい結果を表す場合に所定の値よりも高い場合ＭＳＣ集団を強力であるとみなすか、または上記総スコアの値が、低いスコアの値がより望ましいアッセイ結果をあらわす場合に所定の閾値未満である場合、ＭＳＣ集団を強力であるとみなすステップと
を含む方法が、提供される。一実施形態では、上記少なくとも３つのアッセイのうちの２つは、インドールアミン－２，３－ジオキシゲナーゼ（ｄｉｏｘｙｇｅｎｓａｓｅ）（ＩＤＯ）の活性を測定する１つのアッセイ；上記ＭＳＣにより分泌されるプロスタグランジンＥ２を測定する１つのアッセイ；および末梢血単核球（ＰＢＭＣ）の増殖に及ぼす上記ＭＳＣの効果を測定する１つのアッセイからなる群から選択され、
上記少なくとも３つのアッセイのうちの１つは、免疫応答を抑制するＴ細胞の特性に及ぼす上記ＭＳＣの効果を測定する１つのアッセイ；樹状細胞の増殖および／またはアポトーシスに及ぼす上記ＭＳＣの効果を測定する１つのアッセイ；単球に及ぼす上記ＭＳＣの効果を測定する１つのアッセイ、ならびにミクログリア細胞および／またはミクログリア様細胞に及ぼす上記ＭＳＣの効果を測定する１つのアッセイからなる群から選択される。一実施形態では、本方法は、本明細書中記載される第１の態様の文脈で開示されるアッセイを使用する。
単離され、集められたアロジェニックなＭＳＣ集団はさらに、ｅｘ ｖｉｖｏでの治療に使用される細胞の培養に有用であり得、たとえば、ＭＳＣ集団は、フィーダー細胞として、または目的の因子またはシグナルの提供に使用され得る。よって、本開示のさらなる別の態様では、免疫細胞の共培養のための本明細書中開示される単離され、集められたアロジェニックなＭＳＣ集団が提供される。たとえば、上記ＭＳＣ集団は、免疫細胞、たとえば限定するものではないが樹状細胞、ナチュラルキラー細胞、リンパ球（Ｂ細胞またはＴ細胞など）、単球、およびマスト細胞のｅｘ ｖｉｖｏでの増殖および／または刺激のための培養におけるフィーダー細胞として使用され得る。上記ＭＳＣ集団は、エキソソーム産生細胞および／またはパラクリン因子産生細胞として、ならびにまたは培養物におけるＭＳＣと免疫細胞との間の細胞間の刺激のために、使用され得る。一実施形態では、免疫細胞の共培養のためのフィーダー細胞としての本明細書中開示される単離され、集められたアロジェニックなＭＳＣ集団の使用が提供される。一実施形態では、上記集団と共培養した免疫細胞の刺激のための本明細書中開示される単離され、集められたアロジェニックなＭＳＣ集団の使用が提供される。本明細書中開示される単離され、集められたアロジェニックなＭＳＣ集団と共培養した免疫細胞が、治療に有用であることが想定されている。
試験の定義
本明細書中使用される場合、以下の試験は、開示される臨床試験で行われており、当業者は、上記試験に精通している。
ＭＡＳ（Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ａｓｈｗｏｒｔｈ Ｓｐａｓｔｉｃｉｔｙ ｓｃａｌｅ）は、受動的な軟組織の伸展の間の抵抗を測定し、痙縮の単純な測定値として使用される。両肘および両膝の筋緊張は、ＭＡＳを使用して定量化される（Ｂｏｈａｎｎｏｎ ａｎｄ Ｓｍｉｔｈ， １９８７， Ｐｈｙｓｉｃａｌ Ｔｈｅｒａｐｙ， ６７（２）， ２０６－２０７）；
クオリティオブライフ（ＱｏＬ）は、個体の福祉または欠陥の評価である。個体の日常生活で知覚する質を表す；
ＨＡＤ 不安および抑うつは、病院での不安および抑うつの尺度である。
ＦＶＣ（努力肺活量）は、可能な限り深く呼吸した後に肺から強制的に吐き出され得る空気の量を表す。
本発明を、様々な例示的な態様および実施形態を参照して記載してきたが、当業者は、本発明の範囲から逸脱することなく、様々な変更がなされ得ることおよび均等物がその要素と置換され得ることを理解している。さらに、本発明の本質的な範囲から逸脱することなく、特定の状況、ＭＳＣ集団、または組成物を、本発明の教示に適合するために、多くの修正がなされ得る。よって、本発明は、企図されるいずれの特定の実施形態にも限定されないが、本発明は、添付の特許請求の範囲内にある全ての実施形態を含むことが意図されている。以下の非限定的な実施例により、本発明をさらに例示する。
図１は、本開示に係る単離され、集められたアロジェニックなＭＳＣ集団の製造プロセスを示すフローチャートである。 図２は、実施例６に記載の（Ａ）希釈していない薬物物質および（Ｂ）希釈した薬物物質におけるアポトーシス性マーカー７ＡＡＤのＦＡＣＳ分析からの結果を示す。３つの別々の実験からのデータは、絶対的なバイアビリティとして提示されており、エラーバーは、標準偏差を表す。 図３Ａは、４８時間ＩＦＮγで処置したＨＭＣ３でのＣＤ２００Ｒの発現のオーバーレイを示し、図３Ｂは、４８時間ＩＦＮγおよびＭＳＣで処置したＨＭＣでのＣＤ２００Ｒ発現のオーバーレイを示す。両方のオーバーレイのプロットにおいて、薄灰色のヒストグラムは、染色していない細胞に由来し、濃灰色のヒストグラムは、抗ヒトＣＤ２００Ｒで染色した細胞に由来する。 図４のパネルＡは、４８時間ＩＦＮγで処置したＨＭＣ３でのＣＤ１８３発現のオーバーレイを示すが、パネルＢは、４８時間間ＩＦＮγおよびＭＳＣで処置したＨＭＣでのＣＤ１８３発現のオーバーレイを示す。両方のオーバーレイのプロットにおいて、薄灰色のヒストグラムは、染色していない細胞に由来し、濃灰色のヒストグラムは、抗ヒトＣＤ２００Ｒで染色した細胞に由来する。 図５は、ＰＢＭＣ増殖、プロスタグランジンＥ２の分泌、およびＩＤＯ活性の相対的な抑制の観点からＷＪ－ＭＳＣ産物のプールで、有意なバッチ間の変分がないことを示す箱ひげ図である。 図６は、ＷＪから得た本開示に係る単離され、集められたアロジェニックなＭＳＣ集団（ＴＢ１）が、単一のドナー由来のＷＪから得たＭＳＣ（ＴＳＴ－５０３；ＴＳＴ－５２６）、骨髄から得たＭＳＣ（ＢＭ－ＭＳＣ）、およびＪＥＧ－細胞株から得たＭＳＣと比較（図６Ａ）、ならびに単一のドナー由来のＷＪから得たＭＳＣ(TST-475; TST-503; TST-526)およびＪＥＧ－３細胞株（図６Ｂ）と比較して、高いレベルのベースライン（刺激なし）でのＩＤＯ－活性を呈することを示す棒グラフを示す。 図７は、ＷＪから得た本開示に係る単離され、集められたアロジェニックなＭＳＣ集団（ＣＢ１）が、単一のドナー由来のＷＪから得たＭＳＣ（０５－ＭＳＣ２；０７－ＭＳＣ３；０９－ＭＳＣ４および１１－ＭＳＣ５）と比較して、高いレベルのベースライン（刺激なし）でのＰＧＥ２を分泌することを示す棒グラフである。 図８は、本開示に係る単離され、集められたアロジェニックなＭＳＣ集団（ＣＢ１、ＣＢ２、およびＴＢ１）が、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルス進入受容体、ＡＣＥ２受容体、またはスパイクタンパク質プライミングセリンプロテアーゼＴＭＰＲＳＳ２を発現しないことを示す表である。ハウスキーピング遺伝子ＲＰＬ１３Ａが、相対的な発現レベルを確認するために使用され、単一のドナー由来の５９７のＷＪＭＳＣが、対照として提示されている。
実施例
本発明の非限定的な実施例は、ｉｎ ｖｉｔｒｏで増殖した間葉系幹細胞である本発明のアロジェニックなＭＳＣ組成物の作製であって、細胞の性質決定、適切なドナーに由来する細胞集団の選択、および上記ドナーに由来する細胞集団を集めて上記組成物を得ることを含む、作製を記載する。実施例１～５は、本発明の集めたアロジェニックなＭＳＣ組成物を得るプロセスを記載する。実施例６～９は、ＣＯＶＩＤ－１９および／またはＣＯＶＩＤ－１９に関連する症状の処置および／または予防に関する、上記集めたアロジェニックなＭＳＣ組成物を使用する臨床試験を記載する。
実施例のセクションで使用される場合、以下の用語は、以下で説明される意味を有する。
マスターセルストック（Ｍａｓｔｅｒ Ｃｅｌｌ Ｓｔｏｃｋ）－特定の継代の薬物物質中間体（Ｄｒｕｇ Ｓｕｂｓｔａｎｃｅ Ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａｔｅ）を定義するために使用される用語。本明細書中提示される実施例では、マスターセルストックは、継代０の薬物物質中間体である。当業者は、マスターセルストックが、継代１または２の薬物物質中間体であり得ることを理解している。
薬物物質中間体－産生中であり、よって増殖している単一のドナー由来のＭＳＣを定義するために使用される用語。プロセスにおいて質の基準を満たしているが、未だ選択アルゴリズムで評価されていない。薬物物質中間体は、本明細書中開示される個々のドナーに由来するＭＳＣ集団に対応しており、個々のドナーに由来するＭＳＣ集団は、未だ集めるために選択されていない。
薬物物質－製造における質の基準に一致しており、選択アルゴリズムにより望ましい特徴を有すると同定されている単一のドナー由来のＭＳＣを定義するために使用される用語。よって、さらなる培養または増殖に供されない。よって薬物物質は、本明細書中開示される個々のドナーに由来するＭＳＣ集団に対応し、個々のドナーに由来するＭＳＣ集団は、集めるために選択されている。
薬物産物－用語薬物産物は、選択アルゴリズムにより望ましい特徴を有すると同定された複数のドナーに由来するｅｘ ｖｉｖｏで増殖したホウォートンゼリー由来の間葉系幹細胞（ＷＪＭＳＣ）の細胞懸濁物を表す。薬物産物は、本明細書中開示される単離され、集められたアロジェニックなＭＳＣ集団に対応する。
最終産物－用語最終産物は、薬物産物と、少なくとも１つの薬学的に許容される賦形剤または担体とを含む医薬組成物を表す。
明確にするため、用語「抗原Ｘ－抗体」および「抗抗原Ｘ－抗体」は、本明細書中使用される場合、両方とも、抗原Ｘに対して親和性を有する抗体を表す。上記用語は、互換可能に使用される。
実施例１
本発明の実施例は、ホウォートンゼリーに由来するＭＳＣの回収、輸送、ｅｘ ｖｉｖｏでの増殖、および凍結保存のプロセスを記載する。さらに、感染病原体に関して母系の血液が試験される。さらに、培養条件が記載されている。
材料および方法
ホウォートンゼリー由来のＭＳＣのマスターセルストックのための製造は、ドナー認定からの連続的なプロセスおよびゼノフリー培養系でのその後の増殖である。
臍帯（ＵＣ）サンプルを、（感染病原体のスクリーニングのため）胎盤の娩出および臍帯血の回収の後に自然分娩の後および帝王切開の後に回収する。また、母体の末梢血サンプルを回収する。
コンタミネーションのリスクを最小限にするために、使い捨ての無菌のはさみおよび鉗子を使用し、臍帯のフラグメントを、１％の抗生剤／抗真菌剤溶液（Ｇｉｂｃｏ Ｃａｔ．ｎｏ：１５２４０－０６２）を補充した輸送液（９９％の塩化ナトリウム（０．９％ｓｏｌ．）（Ｆｒｅｓｅｎｉｕｓ Ｃａｔ．ｎｏ：ＰＫ０３ＸＥ０５０ＰＬ）で満たした無菌の輸送コンテナに入れる。サンプルは、保護ボックスの中に入れて製造社の研究室へ輸送する。輸送状態はモニタリングされ、ＵＣ組織は、小児分娩の７２時間以内に処理される。ホウォートンゼリー組織の単離および細胞単離のための外植片の培養は、ゼノフリー、血清フリーの培地および化合物を使用してＧＭＰラボで行う。
ＵＣ組織を供給源物質として認定することは、医学的なアンケートに対する完全な応答および感染病原体の試験のためＵＣ回収から７日以内に回収した母系の末梢血サンプルの提出を必要とする。ドナーのサンプリング、試験、およびスクリーニング（医学的な健康のアンケート）は、Ａｎｎｅｘ ＩＩ ｏｆ Ｄｉｒｅｃｔｉｖｅ ２００６／１７／ＥＣに従うものである。全てのドナーの試験キットは、意図した使用のためバリデートされている。臍帯の認定前に行う感染病原体の試験は、表１に列挙されている。回収したサンプルの約１０～２５％は、さらなる産生に関して認定される。
製造社の研究室に到着した後、ＵＣフラグメントを輸送容器から取り出し、無菌の輸送液で洗浄する。ＵＣを解剖し、血管を除去する。ホウォートンゼリー組織を、無菌のランセットで１～２ｍｍ３に細分化し、初代外植片培養のため接着用溶液（１％のＭＳＣ Ａｔｔａｃｈｍｅｎｔ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ Ｓｔｏｃｋ ９９％ Ｄ－ＰＢＳ）でコーティングした培養フラスコの中のゼノフリー血清フリー培地の中へ入れる。フラスコを、５％のＣＯ２において３７℃でインキュベートする。１～２週間後、培養物を、接着性線維芽細胞様細胞の存在に関して試験する。培養物における非接着性細胞の存在は全て洗い出される。細胞培養培地は、９４％のＮｕｔｒｉＳｔｅｍ（登録商標）ＸＦ（Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ， Ｃａｔ ｎｏ： ０５－２００－１Ａ）、５％のＮｕｔｒｉＳｔｅｍ（登録商標）ＸＦ Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ Ｍｉｘ（Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ， Ｃａｔ ｎｏ：０５－２０１－１Ｕ）、および１％の抗生剤／抗真菌剤溶液（Ｇｉｂｃｏ Ｃａｔ．ｎｏ：１５２４０－０６２）を含む。９０％のコンフルエンスに達した後、初代由来の接着性細胞を継代培養（培養物の酵素の消化を制御）し、Ｐ０のマスターセルストックを作製し、
（ｉ）液体窒素保存の気相で凍結保護物質溶液（７０－８０％のヒト血清アルブミン（５％ｓｏｌ．）（ＣＳＬ Ｂｅｈｒｉｎｇ Ｃａｔ．ｎｏ：Ａｌｂｕｒｅｘ ５）および２０－３０％のジメチルスルホキシド（ＷＡＫ Ｃｈｅｍｉｅ， Ｃａｔ．ｎｏ： ＷＡＫ－ＤＭＳＯ－５０））の存在下で凍結保存するか、または
（ｉｉ）さらなる増殖のためすぐに再播種する。
細胞を、継代１での増殖のため解凍する場合、マスターセルストックは、数時間のみ存在する。この短いマスターセルストックの寿命にかかわらず、図１に記載される全ての試験を行う。
臍帯組織の回収から薬物産物の放出までの製造プロセスで使用される動物起源の原材料は存在しない。
外植片の初代培養の間および各細胞継代のマスターセルストックの製造の終了時に、サンプルを採取して、細菌および真菌のコンタミネーション、マイコプラズマおよびエンドトキシンの存在を判定する。細胞の数およびバイアビリティを、マスターセルストックおよび薬物産物において評価する。微生物培養、マイコプラズマ、およびエンドトキシンは、最終産物から評価する。さらに、薬物産物の１つの参照産物を解凍することができ、試験する細胞培養物が確立される。この試験培養物は、産物の安全純度（微生物の培養およびマイコプラズマおよびエンドトキシンの試験、核型などによる）、効力（細胞数、接着効率、およびバイアビリティ）、ならびに同一性（サイトメトリーによる免疫表現型検査）のさらなる最終的な確認のための物質の供給源として機能する。表３に列挙される承認の基準を満たす培養物は、次のステップの処理または凍結保存に適切であり、培養物の評価のための分析手法は、実施例２に説明されている、不純物に関する質の基準は、全体で細胞の５％未満が陰性細胞表面マーカーのいずれかを発現し得（まとめて分析される）および細胞の少なくとも７０％が陽性細胞表面マーカーに対して陽性でなければならないこと（別々に分析される）である。
結果
製造社は、自然分娩の後に得た臍帯に由来するＷＪＭＳＣの微生物学的な安全性を示した。製造の次のステップの間の輸送液に対する抗生剤／抗真菌剤溶液の添加は、マスターセルストックおよび薬物産物における微生物（細菌および真菌）の不存在をもたらした。
異なるドナーから得た細胞の特徴のレトロスペクティブな分析は、表４に記載されるように、同等の薬物産物を製造するため全てのＭＳＣが一致する基準を得ることを可能にする。
本発明の手法は、必要とされる安全性の基準を満たす著しく均質なＭＳＣ集団を提供する。
実施例２
本発明の実施例は、ＩＳＣＴの基準に一致したＭＳＣに関する形態、増殖能、およびマーカーの発現に基づくドナー由来のＭＳＣの性質決定を記載する。さらに、細胞は、マイコプラズマ、エンドトキシン、細菌性混入物、真菌性混入物、ウイルス性混入物、および／またはエンドトキシンの存在に関してスクリーニングされ、核型の試験が行われる。記載される性質決定は、薬物物質中間体に由来するＭＳＣ集団の同定をもたらし、ＭＳＣは、集めるための質の基準を満たしている。
材料および物質
まず、ＭＳＣは、標準的な培養条件で維持される場合、プラスチックに接着していなければならない。プラスチック接着細胞は、以下に記載される分析手法に供される。培養物は、以下に提供される分析手法によりスクリーニングされる。
分析手法
感染病原体
サンプリング.ＷＪ－ＭＳＣの製造のための供給源の物質（臍帯の胎盤の一部）は、胎盤の娩出から数分以内に得られる。よって、感染病原体の感染の唯一の方法は、胎盤を介した母体血からである。ドナーの母親の末梢血の２つのサンプルは、分娩および供給源組織を回収した日に回収する。
分析.化学発光のイムノアッセイではＡＢＢＯＴＴ ＡＲＣＨＩＴＥＣＴ ２０００およびＮＡＴアッセイではＰｒｏｃｌｅｉｘ ＰＡＮＴＨＥＲ Ｓｙｓｔｅｍを、製造社の指示にしたがい使用する。化学発光のイムノアッセイのためＡＢＢＯＴＴ ＡＲＣＨＩＴＥＣＴ ２０００を使用して以下の試験を行う：ＨＩＶ Ａｇ／Ａｂ Ｃｏｍｂｏ；ＨＢｓＡｇ Ｑｕａｌｉｔａｔｉｖｅ ＩＩ；抗－ＨＢｃ ＩＩ；抗－ＨＣＶ；ＣＭＶ ＩｇＭ；ＣＭＶ ＩｇＧ；Ｔｏｘｏ ＩｇＭ；Ｔｏｘｏ ＩｇＧ；および梅毒 ＴＰ。さらに、Ｐｒｏｃｌｅｘ Ｕｔｒｉｏ Ｐｌｕｓ Ａｓｓａｙを使用して、ヒトドナーに由来する血漿および血清の検体におけるＨＩＶ－１ ＲＮＡ、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）ＲＮＡおよびＢ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）ＤＮＡのｉｎ ｖｉｔｒｏでの核酸の増幅を定性的にスクリーニングする。
受け入れ基準.試験の結果は、感染病原体に対して「陰性」、「反応なし」、または「検出せず」でなければならない（ＣＭＶ ＩｇＧを除く：この試験の正の結果を有する場合、製造社は、リアルタイムＰＣＲ試験により産物におけるＣＭＶ ＤＮＡの欠損の確認を行う）。
無菌性
サンプリング．酵素的回収の後の培養物に由来する細胞および上清のサンプル（１０ｍＬ）。
分析．サンプルを、嫌気性菌および好気性菌の増殖、ならびに真菌のコンタミネーションの検出を意図した２つのＢＡＣＴＥＣビンに播種する。ビンを、ＢＡＣＴＥＣ ＦＸ４００微生物分析器に１４日間置く。
受け入れ基準．試験の結果は、１４日間のインキュベーションの後に、好気性嫌気性菌および真菌性微生物に関して「陰性」または「検出せず」でなければならない。
マイコプラズマ
サンプリング．酵素的回収の後の培養物由来の細胞および上清のサンプル（０．１ｍＬ）。
分析．Ｖｅｎｏｒ（登録商標）ＧｅＭ Ｃｌａｓｓｉｃ Ａｓｓａｙ（Ｍｅｒｃｋ ＫＧａＡ， ｃａｔ ｎｏ ＭＰ００２５）は、ＰＣＲ増幅に基づくものであり、製造社の指示にしたがい使用する。
受け入れ基準．試験の結果は、ゲルスロットにおける増幅で「検出せず」でなければならない。
エンドトキシン
サンプリング．酵素的回収の後の培養物由来の細胞および上清のサンプル（０．５ｍＬ）。
分析．Ｅｎｄｏｓａｆｅ（登録商標）－ＰＴＳ（商標），（Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ， ｃａｔ ｎｏ ＰＴＳ２００５Ｆ）のリアルタイムのエンドトキシン試験システムを、製造社の推奨にしたがい使用する。
受け入れ基準．試験結果は、「検出せず」でなければならない。
細胞計数
サンプリング．酵素的回収後の培養物由来の細胞のサンプル（０．５ｍＬ）。
分析．Ｍａｌａｓｓｅｚチャンバーを用いた細胞数の光学顕微鏡での分析
受け入れ基準．必要とされる細胞数の９８％以下。
細胞のバイアビリティ
サンプリング．酵素的回収の後の培養物由来の細胞のサンプル（０．５ｍＬ）。
分析．７－ＡＡＤ（Ｂｅｃｔｏｎ， Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ ａｎｄ Ｃｏｍｐａｎｙ， Ｃａｔ．ｎｏ． ５５９９２５）で染色した細胞懸濁物のフローサイトメトリーによる分析を、ＦＡＣＳ Ｃａｌｉｂｕｒフローサイトメーターを使用して行う。
受け入れ基準．８０％超の生細胞
免疫表現型検査
サンプリング．酵素的回収後の培養物由来の細胞のサンプル（０．５ｍＬ）
分析．モノクローナル抗体で以前に標識した細胞のフローサイトメトリーによる分析を、ＦＡＣＳ Ｃａｌｉｂｕｒフローサイトメーターを使用して行う。試験される抗体は、表４に列挙されている。
受け入れ基準－細胞の７０％超でのＣＤ７３、ＣＤ９０、およびＣＤ１０５の発現。系列抗原（ＣＤ４５、ＣＤ３４、ＣＤ１４、またはＣＤ１１ｂ、ＣＤ７９α、またはＣＤ１９、およびＨＬＡ－ＤＲ表面分子）の発現の欠如。
核学
サンプリング．このアッセイで特に行われる細胞培養物
分析．培養物を、コルセミドでブロッキングし、ギムザ染色する。染色体および構造異常の数を評価する。
受け入れ基準．４６の染色体、ＸＹ、またはＸＸ；目に見える異常なし。
分化アッセイ
細胞を、分化に供する。
分析．分化アッセイを、製造社の指示にしたがい使用する。Ｈｕｍａｎ Ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ、Ｃａｔａｌｏｇ Ｎｕｍｂｅｒ ＳＣ００６， Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ， Ｉｎｃ（複数の間葉系統へと分化するそれらの特性に基づくヒトＭＳＣの同定のため設計）。このキットは、脂肪生成系統、軟骨形成系統、または骨形成系統へとＭＳＣを効率的に分化するために使用できる、特に製剤化された脂肪生成、および軟骨形成、および骨形成の培地のサプリメントを含む。抗－ｍＦＡＢＰ４、抗－ｈＡｇｇｒｅｃａｎ、および抗－ｈＯｓｔｅｏｃａｌｃｉｎからなる抗体のパネルは、脂肪細胞、軟骨細胞、および骨細胞のそれぞれの成熟した表現型を定義するために含まれる。ＳｔｅｍＰｒｏ（登録商標）Ｃｈｏｎｄｒｏｇｅｎｅｓｉｓ Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ Ｋｉｔ， Ｃａｔａｌｏｇｕｅ ｎｕｍｂｅｒ： Ａ１００７１０１， Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｉｎｃ．（組織－培養物の血管における間葉系幹細胞（ＭＳＣ）の軟骨形成の分化のために開発）。このキットは、軟骨形成経路に専心しており、軟骨細胞を作製するＭＳＣを誘導するために必要な全ての試薬を含む。
受け入れ基準.ｉｎ ｖｉｔｒｏでの骨芽細胞、脂肪細胞、および軟骨眼細胞へ分化する特性。
結果
得られたＭＳＣ集団は、標準的な培養条件で維持される場合プラスチックに接着性である。ＭＳＣは、実施例３に提供されるように、ＣＤ１０５、ＣＤ７３、およびＣＤ９０を発現し、ＣＤ４５、ＣＤ３４、ＣＤ１４、またはＣＤ１１ｂ、ＣＤ７９α、またはＣＤ１９およびＨＬＡ－ＤＲの表面分子の発現を欠いており、ｉｎ ｖｉｔｒｏで骨芽細胞、脂肪細胞、および軟骨眼細胞へ分化できる。よって、集めることに適格のあるＭＳＣ集団が同定される。
これら基準が現在使用されているが、これらは、たとえばＩＳＣＴの基準によりＭＳＣの定義の変更をもたらす新規の知識が明らかとなる場合、修正を必要とし得、本発明者らは、上記の標準的な基準の最小限のセットがＭＳＣのより均一な性質決定を提供すると信じている。本明細書中使用される場合、ＭＳＣは、ＩＳＣＴ由来の基準により定義される。
実施例３
本実施例は、集められるＭＳＣ集団を選択するための形態、増殖、および機能の特徴に関して薬物物質中間体由来のＭＳＣ集団を性質決定するために使用されるスクリーニングアッセイを記載する。
材料および方法
以下は、ＭＳＣ集団を性質決定するために使用される６つのアッセイの記載をたどる。
アッセイ１－ＩＤＯ：ＩＤＯアッセイは、薬物物質中間体または薬物物質、すなわち間葉系幹細胞／間質細胞（ＭＳＣ）の免疫抑制能を分析するために使用される。
ＵＣ－ＭＳＣの免疫調節の可能性は、培養物の上清におけるトリプトファンおよびキヌレニンを測定することにより決定されるインドールアミン ２，３－ジオキシゲナーゼ（ＩＤＯ）の活性の測定値として報告される。インドールアミン－ピロール２，３－ジオキシゲナーゼ（ＩＤＯまたはＩＮＤＯ ＥＣ １．１３．１１．５２）は、ヒトにおいてＩＤＯ１遺伝子によりコードされるヘム含有酵素である。ＩＤＯ酵素は、Ｌ－トリプトファンを、Ｔ細胞を含む免疫細胞の増殖の阻害剤として作用し、抗細菌性および抗ウイルス性の機能を呈する免疫抑制分子である、Ｎ－ホルミルキヌレニン（またはキヌレニン）に変換する。ＩＤＯ活性は、キヌレニン／トリプトファンの比率であり、ＥＬＩＳＡキットを使用して細胞培養物の上清に存在するトリプトファンおよびキヌレニンの量を計算することにより決定され得る。腫瘍壊死因子αの存在下または不存在下にてインターフェロンγ（ＩＦＮγ）で刺激した場合、間葉系幹細胞／間質細胞（ＭＳＣ）は、刺激しない場合よりも多くのＩＤＯを分泌する。
誘導性ＩＤＯ活性は、放出される細胞が、免疫調節に関連した機能的な効力を有することを表す。
ＭＳＣの培養：１００μｌのアッセイ培地（ＤＭＥＭ、低グルコース、ＧｌｕｔａＭＡＸ（商標）補助剤、ピルビン酸塩（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ， ｃａｔ ｎｏ． ２１８８５０２５）＋１０％のウシ胎仔血清、適格、熱不活性化（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ， ｃａｔ ｎｏ． １６１４００７１））において４８ウェル培養プレートに１０ ０００ ＭＳＣ／ウェルを播種する。ストックからＩＦＮγを１ｍｇ／ｍｌに希釈する（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ， ｃａｔ ｎｏ． ＰＨＣ４０３３）。ＩＦＮγ／ウェルの最終濃度は、１００ｎｇ／ｍｌである。２００ｎｇ／ｍｌのＩＦＮγ１００μｌをウェルに添加する。１００μｌのアッセイ培地を刺激していない細胞（ＩＦＮγなし）に添加する。細胞培養プレートを、３７℃、５％のＣＯ２にて７２時間インキュベートする。各ウェルから上清を除去し、ＥＬＩＳＡ分析のためのさらなる処理まで、－２０℃でマイクロチューブに保存する。
トリプトファンおよびキヌレニンの測定は、ＥＬＩＳＡキットの製造社により提供されるマニュアル（Ｉｍｍｕｎｄｉａｇｎｏｓｔｉｋ ＡＧ， ｃａｔ ｎｏ． Ｋ ３７３０およびＫ ３７２８）により行われる。トリプトファンおよびキヌレニンのＥＬＩＳＡは両方とも、同日ではあるが別の状況で行われる。２つのＥＬＩＳＡは、製造社の指示にしたがい行われる；各ＥＬＩＳＡのマニュアルを参照されたい。
６２０ｎｍでのバックグラウンド減算を伴う４５０ｎｍでの吸収を、Ｓｐｅｃｔｒａｍａｘ マイクロプレートリーダー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ， Ｓｐｅｃｔｒａｍａｘ １９０）で測定する。
分析結果：測定した吸光度の量は、サンプルに存在するアミノ酸の量に逆比例しており、すなわちＯＤ４５０が低いほど、キヌレニンまたはトリプトファンが多い。４ＰＬ－アルゴリズム（Ｆｏｕｒ Ｐａｒａｍｅｔｅｒ Ｌｏｇｉｓｔｉｃ Ｒｅｇｒｅｓｓｉｏｎ）が、結果を計算するためキットの製造社により推奨されるように使用される（ｓｏｆｔｗａｒｅ ＳｏｆｔＭａｘ Ｐｒｏ ７．０．２， Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ）。濃度は、標準曲線から直接決定される。キットと共に提供される対照サンプルは、認容性に関して評価される。キットの製造社により許容可能な範囲の外にある場合、サンプルは再度アッセイする必要がある。
結果
薬物物質中間体由来のＩＦＮγで処置した細胞の相対的なＩＤＯ生体活性は、選択アルゴリズムによるサンプルのランク付けのために使用される（実施例４）。生体活性が最も高いドナーは、最も高いランキングスコアを得る。ランキングスコア（表５）は、後に、ドナーの最終的な選択で使用される（実施例４参照）。
アッセイ２：増殖アッセイ
この方法は、薬物物質中間体および／または薬物物質の免疫抑制作用、すなわち臍帯由来のＭＳＣが、末梢血単核球（ＰＢＭＣ）の増殖に及ぼす免疫抑制作用を定量的に測定するために使用される。ＭＳＣは、Ｔリンパ球の増殖を抑制することが示されている。ＭＳＣと混合リンパ球の反応は、ＭＳＣの免疫抑制活性を示すために高頻度で使用される。
フィトヘマグルチニン（ＰＨＡ）は、Ｔリンパ球の増殖を活性化するマイトジェンとして使用される。薬物物質中間体および／または薬物物質の免疫抑制活性は、ＰＨＡで刺激したＴリンパ球の増殖の減少として定量化される。
培養およびＣＦＳＥのプライミング：ＭＳＣ（２×１０５個の細胞／ウェル）を含む５００μｌの作業培地（ＲＰＭＩ１６４０（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ， ｃａｔ ｎｏ． １２６３３０１２）＋２ｍＭのＧｌｕｔａｍａｘ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ， ｃａｔ ｎｏ． ３５０５００６１）＋１００Ｕ／ｍｌのＰｅｓｔ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ， ｃａｔ ｎｏ． １５１４０１２２）＋１０％のＦＢＳ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ， ｃａｔ ｎｏ． １６１４００７１）を、１２ウェルの細胞培養プレートに播種する。プレートは、細胞のプラスチック接着のため、３７℃、５％のＣＯ２で２時間インキュベートする。Ｌｙｍｐｈｏｐｒｅｐ（商標）キットは、製造社の指示（Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ， ｃａｔ ｎｏ． ０７８０１）にしたがい、中心の血液（ｂｌｏｏｄ ｃｅｎｔｒａｌ）から回収した提供された末梢血由来の単核細胞の単離のために使用する。ＰＢＭＣは、ＲＰＭＩ １６４０に２２×１０６個の細胞／ｍｌで懸濁される。ＣｅｌｌＴｒａｃｅ（商標）ＣＦＳＥ Ｃｅｌｌ Ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ， ｃａｔ ｎｏ． Ｃ３４５５４）は、増殖を分析するために製造社の指示にしたがい使用される。ＣＦＳＥでプライミングしたＰＢＭＣ（１×１０６個の細胞／ウェル）を、１２ウェル細胞培養プレートに播種し、ＰＨＡを、マイトジェンとして添加する。
分析：ＣＦＳＥ陽性細胞を、Ａｃｃｕｒｉ Ｃ６ ｐｌｕｓフローサイトメーターにより分析する。ＣＦＳＥヒストグラムは、３または４つのピークを含み、右から１番目の上部は、分割していない細胞（Ｇ０）を表す。以下の上部は、異なる世代（Ｇ１～Ｇ４）を示す。
増殖指数（ＰＩ）は、細胞分裂に入った親細胞の数で除算した全世代の全細胞数として計算される。
結果
各薬物物質中間体の平均増殖指数は、ドナーの相対的な比較に使用される。最も小さなＰＩを有するドナーは、最も高いランキングスコアを得る。ランキングスコア（表６）は、後に、ドナーの最終的な選択に使用される（実施例４参照）。
アッセイ３：プロスタグランジンＥ２
プロスタグランジンＥ２（ＰＧＥ２）アッセイは、フィトヘマグルチニン（ＰＨＡ）で活性化した末梢血単核球（ＰＢＭＣ）と共培養した場合の薬物物質および／または薬物物質のＰＧＥ２の分泌を評価する。
細胞培養：細胞は、ＰＨＡ（Ｍｅｒｃｋ， ｃａｔ ｎｏ． １１０８２１３２００１）の存在下および不存在下にて、ＭＳＣ－ＰＢＭＣ １：５の共培養細胞比率にて、アッセイ培地（ＤＭＥＭ、低グルコース、ＧｌｕｔａＭＡＸ（商標）補助剤、ピルビン酸塩（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ， ｃａｔ ｎｏ． ２１８８５０２５）＋１０％のウシ胎仔血清、適格、熱不活性化（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ， ｃａｔ ｎｏ． １６１４００７１））において３日間培養する。１２ウェル細胞培養プレートにおいてウェルあたり４０００個のＭＳＣを播種する。細胞培養プレートは、３７℃、５％のＣＯ２にて２時間インキュベートして細胞を接着させる。
Ｌｙｍｐｈｏｐｒｅｐ（商標）キットは、製造社の指示（Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ， ｃａｔ ｎｏ． ０７８０１）にしたがい、中心の血液から回収した提供された末梢血由来の単核細胞の単離のために使用する。ＰＢＭＣは、０．５×１０６個の細胞／ｍｌにてアッセイ培地に懸濁し、４００μｌを、ＰＢＭＣのため意図されたウェルへ播種する。５００μｌのアッセイ培地を、ＰＢＭＣを含まないウェルに添加する。１００μｇ／ｍｌの１００μｌ／ウェルを、ＰＨＡ～ＰＢＭＣ含有ウェルに添加し、細胞培養プレートを、３７℃、５％のＣＯ２にて７２時間インキュベートする。上清を各ウェルから除去し、５００ｇで５分間遠心分離して微粒子を除去する。上清を凍結し、ＥＬＩＳＡ分析のためのさらなる処理まで－２０℃で保存する。
Ｐａｒａｍｅｔｅｒ（商標）プロスタグランジンＥ２イムノアッセイキットは、製造社の指示（Ｂｉｏ－Ｔｅｃｈｎｅ， ｃａｔ ｎｏ． ＫＧＥ００４Ｂ）に従い、ＰＧＥ２発現の検出のために使用され、Ｓｐｅｃｔｒａｍａｘマイクロプレートリーダー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ， Ｓｐｅｃｔｒａｍａｘ １９０）で分析される。結果を計算するために、４ＰＬ－アルゴリズム（Ｆｏｕｒ Ｐａｒａｍｅｔｅｒ Ｌｏｇｉｓｔｉｃ Ｒｅｇｒｅｓｓｉｏｎ）が使用される（ｓｏｆｔｗａｒｅ ＳｏｆｔＭａｘ Ｐｒｏ ７．０．２， Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ）。
結果
各薬物物質中間体のｐｇ／ｍｌでのＰＧＥ２の発現の平均は、ドナーの相対的な比較のために使用される。最も高い発現レベルを有するドナーは、最も高いランキングスコアを得る。ランキングスコア（表７）は、後に、ドナーの最終的な選択で使用される（実施例４参照）。
アッセイ４：ＨＬＡ－Ｇ
ＨＬＡ－Ｇアッセイは、薬物物質中間体および／または薬物物質の、ＩＦＮγ、ＩＬ－１０、および／またはＰＨＡに応答した可溶性および／または細胞内ＨＬＡ－Ｇの発現を評価する。
細胞培養：ウェルあたり５００００個のＭＳＣおよび２５０００個のＪＥＧ－３細胞（陽性対照細胞、ＡＴＣＣ， ｃａｔ ｎｏ． ＡＴＣＣ（登録商標）ＨＴＢ－３６（商標））を、１２ウェル細胞培養プレートの中の、最終濃度１０～５０ｎｇ／ｍｌのＩＬ－１０（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ， ｃａｔ ｎｏ． １３０－１０８－９８５）または２５～１００ｎｇ／ｍｌのＩＦＮγ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ， ｃａｔ ｎｏ． ＰＨＣ４０３３）を伴うかまたは刺激を伴わない、１ｍｌのアッセイ培地（ＤＭＥＭ、低グルコース、ＧｌｕｔａＭＡＸ（商標）補助剤、ピルビン酸塩（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ， ｃａｔ ｎｏ． ２１８８５０２５）＋１０％のウシ胎仔血清、適格、熱不活性化（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ， ｃａｔ ｎｏ． １６１４００７１））に播種する。細胞を、３７℃、５％のＣＯ２で４８～７２時間インキュベートする。この上清を各ウェルから除去し、可溶性ＨＬＡ－ＧのＥＬＩＳＡ分析のため－２０℃に保存する。
細胞内ＨＬＡ－Ｇ：接着細胞を、ＤＰＢＳで２回洗浄し、ＴｒｙｐＬＥ Ｅｘｐｒｅｓｓ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ， ｃａｔ ｎｏ． １２６０４０２１）で細胞を解離する。ＢＤ Ｃｙｔｏｆｉｘ／Ｃｙｔｏｐｅｒｍ（商標）は、細胞の固定および透過処理のために、製造社の指示（Ｂｅｃｔｏｎ， Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ ａｎｄ Ｃｏｍｐａｎｙ， ｃａｔ ｎｏ． ５５４７１４）にしたがい使用される。細胞を、ＨＬＡ－Ｇ（ＰＥ）抗体（ＥＸＢＩＯ Ｐｒａｈａ， ｃａｔ ｎｏ． １Ｐ－４３１－Ｃ１００）を用いて製造社の指示にしたがい染色し、フローサイトメトリー（Ｍｅｒｃｋ， Ｇｕａｖａ ｅａｓｙＣｙｔｅ ５ＨＴ）により分析する。
可溶性ＨＬＡ－Ｇ：上清におけるＨＬＡ－Ｇの濃度を、ｓＨＬＡ－Ｇ ＥＬＩＳＡ ｋｉｔ（Ｅｎｚｏ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ， ｃａｔ ｎｏ． ＡＬＸ－８５０－３０９－ＫＩ０１）を用いて製造社の指示にしたがい分析する。
結果
薬物物質中間体および／または薬物物質は、細胞内ＨＬＡ－Ｇおよび可溶性ＨＬＡ－Ｇの発現の両方に関して分析され、分析された他のサンプルと比較した相対的な発現に基づくスコアを受領する。細胞内ＨＬＡ－Ｇおよび可溶性ＨＬＡ－Ｇの発現からの総スコアがまとめられており、薬物物質中間体は、ドナーの最終的な選択で使用されるランキングスコア（表８）を受領する（実施例４参照）。
アッセイ５：形態
薬物物質中間体および／または薬物物質の培養物の細胞の形態を、継続的に調査する。細胞を、増殖の間および回収の前に目視検査し、
細胞の大きさ 正常／大きい
核の大きさ 正常／大きい
細胞の形状 正常／異常
細胞の大きさと核の大きさとの間の比率 正常／異常
に基づき評価する。
結果
薬物物質中間体細胞を、上記の基準に基づき目視で評価する。９０％超の正常細胞を含むサンプルのみを認容する。異常な細胞の出現頻度は、薬物中間体のランキング（表９）で使用される（実施例４参照）。
アッセイ６：Ｆｌｕｏｒｏｓｐｏｔ
薬物物質中間体および／または薬物物質を、抗体で予めコーティングしたＦｌｕｏｒｏｓｐｏｔに特異的な９６ウェルプレート（ＭａｂＴｅｃｈにより提供されるサービス）で培養する。ウェルあたり１０００～３０００個の細胞を、１００μｌのアッセイ培地（ＤＭＥＭ、低グルコース、ＧｌｕｔａＭＡＸ（商標）補助剤、ピルビン酸塩（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ， ｃａｔ ｎｏ． ２１８８５０２５）＋１０％のウシ胎仔血清、適格、熱不活性化（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ， ｃａｔ ｎｏ． １６１４００７１））に播種し、刺激の存在下または不存在下で４８時間インキュベートする。使用される刺激は、Ｐｏｌｙ Ｉ：Ｃ（Ｉｎｖｉｖｏｇｅｎ， ｃａｔ ｎｏ． ｔｌｒｌ－ｐｉｃ）、ｒ８４８（Ｉｎｖｉｖｏｇｅｎ， ｃａｔ ｎｏ． ｔｌｒｌ－ｒ８４８）、ＧＡＢＡ（Ｄｉａｍｙｄ Ｍｅｄｉｃａｌ）、およびＩＦＮγ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ， ｃａｔ ｎｏ． ＰＨＣ４０３３）である。ＩＬ－２、ＩＬ－４、ＩＬ－６、ＩＬ－８、ＩＬ－１２、ＩＬ－１２／１３、ＩＬ１７Ａ、ＩＬ－２１、ＩＬ－２２、ＩＬ－２９、ＩＬ－３１、ＴＧＦβ１、ＧＭ－ＣＦＳ、ＩＦＮα、ＩＦＮγ、ａｐｏＥ、およびＴＮＦαの発現は、Ｆｌｕｏｒｏｓｐｏｔ（ＭａｂＴｅｃｈ）により分析される。集められたアロジェニックＭＳＣ組成物、すなわち薬物産物の早期のバッチは、参照として使用する。このアッセイは、望ましいとされるタンパク質およびサイトカインならびに望ましくないとされるタンパク質およびサイトカインの両方を含む。たとえば、細胞が、ＩＬ－６を発現する場合は陽性とされ、これらがＩＦＮγを発現する場合は陰性とされる。
結果
結果は、Ｆｌｕｏｒｓｐｏｔリーダーと共に提供されるソフトウェアで分析する。このプログラムは、視覚的な出力および数値の出力の両方を作製する（図３参照）。
薬物物質中間体サンプルは、参照サンプルに関連してスコア付けされる（数値）。陽性対陰性の閾値は、各マーカーで予め定義されており、薬物物質中間体は、表１２に従ってスコア付けされる。
薬物物質中間体の最終的なランキングは、刺激を伴いかつ／または伴わないで分析される全てのマーカーからまとめられたスコアに基づく（表１２）。
薬物物質中間体のランキングは、Ｆｌｕｏｒｏｓｐｏｔアッセイのランキングスコアであるスコアに基づく。後に、このランキングスコアは、実施例４に記載されるドナーの総合的な選択で使用される。最も高いスコアを有する薬物物質中間体サンプルはまた、最も高いランキングスコアを得る（表１３参照）。さらにまた、選択アルゴリズムにおける入力、すなわち選択アルゴリズムにおける別々の要素としてそれぞれ分析されるタンパク質由来のデータとしての、Ｆｌｕｏｒｏｓｐｏｔの結果の一部または全てを使用することが可能である。
アッセイ７：ミクログリア増殖アッセイ
本方法は、ミクログリア細胞の増殖に及ぼす、薬物物質中間体および／または薬物物質、すなわち本明細書中記載のＭＳＣの免疫抑制効果を定量的に測定するために使用される。ＭＳＣは、ミクログリアの増殖を抑制することが示されている。ミクログリアおよびＭＳＣの共培養は、ＭＳＣの免疫抑制活性を示すために使用される。リポ多糖（ＬＰＳ）は、ミクログリアの増殖を活性化するマイトジェンとして使用される。薬物物質中間体および／または薬物物質の免疫抑制活性は、ＬＰＳで刺激されたミクログリア細胞の増殖の減少として定量化される。
ＭＳＣとＣＦＳＥでプライミングしたミクログリアの共培養：ミクログリア細胞（１×１０６個の細胞／ｍｌ）を、ＤＰＢＳ＋２％のＦＢＳに懸濁し、ＣｅｌｌＴｒａｃｅ（商標）ＣＦＳＥ Ｃｅｌｌ Ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ， ｃａｔ ｎｏ． Ｃ３４５５４）を用いて製造社の指示にしたがい染色する。ＭＳＣ（５０００個の細胞／ウェル）を含む１００μｌの作業培地（ＤＭＥＭ、低グルコース、ＧｌｕｔａＭＡＸ（商標）補助剤、ピルビン酸塩（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ， ｃａｔ ｎｏ． ２１８８５０２５）＋１０％のウシ胎仔血清、適格、熱不活性化（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ， ｃａｔ ｎｏ． １６１４００７１））を、４８ウェル細胞培養プレートに播種する。同時に、２００μｌのＣＦＳＥでプライミングしたミクログリア細胞（２５０００個の細胞／ウェル）を含むＤＭＥＭ＋１０％のＦＢＳを、４８ウェル細胞培養プレートに播種する。２４時間後に、３７℃、５％のＣＯ２において、最終濃度１μｇ／ｍｌのＬＰＳ（Ｅ．ｃｏｌｉ由来、Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ Ｃａｔ Ｎｏ；１０９０００１０Ｌ４３９１）を添加し、４８ウェル細胞培養プレートをさらに４８時間インキュベートし、次に培地を除去し、接着細胞をＤＰＢＳで２回洗浄し、２５μｌのＴｒｙｐＬＥ Ｅｘｐｒｅｓｓ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ， ｃａｔ ｎｏ． １２６０４０２１）で脱離させる。１ｍｌの作業培地をウェルに添加し、細胞をチューブに移し、３００ｇで５分間遠心分離する。この上清を除去し、細胞を、２００μｌのＤＰＢＳ＋２％のＦＢＳに再懸濁し、Ａｃｃｕｒｉ Ｃ６ Ｐｌｕｓフローサイトメーターにかける。
分析：各サンプルの総細胞数は、細胞／μｌのＣＦＳＥで染色した細胞した細胞×２００μｌを乗算することにより計算する。増殖指標は、アッセイの染色時の細胞量に対し７２時間後の総細胞を除算することにより計算する。
結果
各薬物物質中間体の平均増殖指標は、ドナーの相対比較のために使用される。最小のＧＩを有するドナーは、最も高いランキングスコアを得る。後に、このランキングスコアは、ドナーの最終的な選択で使用される（実施例５参照）。
アッセイ８：ミクログリアのＣＤ１８３発現
ケモカイン受容体ＣＸＣＲ３は、ＣＸＣケモカイン受容体ファミリーの受容体である。ＣＸＣＲ３の他の名称は、Ｇタンパク質共役型受容体９（ＧＰＲ９）およびＣＤ１８３である。ＣＸＣＲ３は、活性化したＴリンパ球およびＮ細胞および一部の上皮細胞、ならびにミクログリア細胞で主に発現する。
ＭＳＣとミクログリア細胞の共培養：ミクログリア細胞を、血清フリー培地に再懸濁し、ＣｅｌｌＢＩＮＤ培養フラスコに播種する（１×１０６個の細胞／Ｔ７５）。２時間後３７℃、５％のＣＯ２において、ＭＳＣ（０．２×１０６個の細胞／Ｔ７５）およびＩＦＮγ（１０ｎｇ／ｍｌ）をミクログリア細胞に添加する。この比率は、５：１のミクログリア細胞：ＭＳＣである。細胞を、４８時間インキュベートした後、ＤＰＢＳで洗浄し、５００μｌのＴｒｙｐＬＥ Ｅｘｐｒｅｓｓ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ， ｃａｔ ｎｏ． １２６０４０２１）で細胞を脱離する。血清フリー培地を添加し、細胞をチューブに移し、２００ｇで５分間遠心分離する。この上清を除去し、３ｍｌの作業培地（ＤＭＥＭ、低グルコース、ＧｌｕｔａＭＡＸ（商標）補助剤、ピルビン酸塩（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ， ｃａｔ ｎｏ． ２１８８５０２５）＋１０％のウシ胎仔血清、適格、熱不活性化（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ， ｃａｔ ｎｏ． １６１４００７１））を添加する。細胞を計測し、フローサイトメトリー染色チューブに等しく分ける。細胞を、ＢＤ Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ製の抗ヒトＣＤ１８３１６μｌ（Ｐｒｏｄｕｃｔ ｎｏ； ５５７１８５； ＰＥ ｍｏｕｓｅ Ａｎｔｉ ｈｕｍａｎ ＣＤ１８３）を用いて、光から保護しながらＲＴで３０分間染色する。染色は、２ｍｌのＤＰＢＳ＋２％のＦＢＳを各チューブに添加することにより停止させる。細胞を、２００ｇで５分間遠心分離し、上清を廃棄し、細胞ペレットを、２００μｌのＤＰＢＳ＋２％のＦＢＳに再懸濁する。各サンプル１５０μｌを、フローサイトメトリーにかけるために使用する。最小３００００のイベントが記録される。
結果：
ＦＡＣＳの結果は、Ｆｌｏｗ－Ｊｏソフトウェアで分析される。ミクログリアの不活性化は、

として計算される、薬物物質中間体によりもたらされるＣＤ１８３陽性ミクログリア細胞の減少として計算される。
最も高い抑制パーセントを有するドナーは、最も高いランキングスコアを得る。後に、このランキングスコアは、ドナーの最終的な選択で使用される。
アッセイ９：ミクログリアのＣＤ２００Ｒ発現
ＣＤ２００膜貫通型糖タンパク質は、ほとんどがニューロンで発現し、その受容体であるＣＤ２００Ｒと相互作用する。これは、ミクログリアのプライミングを阻害するために、ミクログリアおよび他のＣＮＳマクロファージにおいてほぼ独占的に発現され、ミクログリアを無活動状態に保持する。ＭＳＣによるミクログリア細胞でのＣＤ２００Ｒの倍数増加を分析して、免疫抑制またはＭ２表現型への移行を測定する。
ＭＳＣとミクログリア細胞の共培養：ミクログリア細胞を、血清フリー培地に再懸濁し、ＣｅｌｌＢＩＮＤ培養フラスコ（０．６×１０６個の細胞／Ｔ７５）に播種する。２時間後に、３７℃、５％のＣＯ２にて、ＭＳＣ（０．６×１０６個の細胞／Ｔ７５）およびＩＦＮγ（１０ｎｇ／ｍｌ）をミクログリアに添加する。この比率は、１：１のミクログリア細胞：ＭＳＣである。細胞を４８時間培養した後、ＤＰＢＳで洗浄し、５００μｌのＴｒｙｐＬＥ Ｅｘｐｒｅｓｓ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ， ｃａｔ ｎｏ． １２６０４０２１）で細胞を脱離させる。血清フリー培地を添加し、細胞をチューブに移し、２００ｇで５分間遠心分離する。この上清を除去し、３ｍｌの作業培地（ＤＭＥＭ、低グルコース、ＧｌｕｔａＭＡＸ（商標）補助剤、ピルビン酸塩（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ， ｃａｔ ｎｏ． ２１８８５０２５）＋１０％のウシ胎仔血清、適格、熱不活性化（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ， ｃａｔ ｎｏ． １６１４００７１））を添加する。細胞を計測し、フローサイトメトリー染色チューブへと均等に分ける。細胞を、Ａｂｃａｍ製の１０μｌの抗ヒトＣＤ２００Ｒ（Ｐｒｏｄｕｃｔ ｎｏ；ａｂ３３３６６；ＰＥマウス抗ヒトＣＤ２００Ｒ）を用いて、光から保護しながらＲＴで３０分間染色する。染色は、２ｍｌのＤＰＢＳ＋２％のＦＢＳを各チューブに添加することにより停止させる。細胞を、２００ｇで５分間遠心分離し、上清を廃棄し、細胞ペレットを、ＤＰＢＳ＋２％のＦＢＳに再懸濁する。各サンプル１５０μｌを、フローサイトメトリーにかけるために使用する。最小３００００のイベントが記録される。
結果
ＦＡＣＳの結果は、Ｆｌｏｗ－Ｊｏソフトウェアで分析される。ミクログリアの不活性化は、
として計算される、薬物物質中間体によりもたらされるＣＤ２００Ｒ陽性ミクログリア細胞の倍数増加として計算される（図３）。
最も高いＣＤ２００Ｒの倍数増加を有するドナーは、最も高いランキングスコアを得る。後に、このランキングスコアは、ドナーの最終的な選択で使用される。
アッセイ１０：Ｍ１からＭ２へのミクログリアの表現型の移行
アッセイ８および９は、それぞれＭ１表現型を失い、Ｍ２表現型を得たミクログリア細胞のフラクションを測定している。このアッセイは、Ｍ１からＭ２への移行を反映するため、Ｍ１表現型のマーカーの喪失およびＭ２表現型のマーカーの獲得を組み合わせる。これは、同じアッセイで組み合わせられ、相乗的な値、たとえばＣＤ２００Ｒの増加およびＣＤ１８３の減少を得る。この実施例では、同じ条件が、アッセイ８および９で使用されるが、ＨＭＣ３：ＭＳＣの比率は、ＣＤ２００ＲおよびＣＤ１８３の両方での比率である。
結果
Ｍ１からＭ２への移行は、
として計算される。
最も高い移行スコアを有するドナーは、最も高いランキングスコアを得る。後に、このランキングスコアは、ドナーの最終的な選択で使用される。
Ｍ１からＭ２への表現型の移行に関する代替的なマーカーは、以下である：
Ｂ７－２／ＣＤ８６、インテグリンα Ｖ β ３、ＭＦＧ－Ｅ８、ＮＯ、ＲＯＳ、ＲＮＳ、ＣＣＬ２／ＭＣＰ－１、ＣＣＬ３／ＭＩＰ－１α、ＣＣＬ４／ＭＩＰ－１β、ＣＣＬ５／ＲＡＮＴＥＳ、ＣＣＬ８／ＭＣＰ－２、ＣＣＬ１１／エオタキシン、ＣＣＬ１２／ＭＣＰ－５、ＣＣＬ１５／ＭＩＰ－１δ、ＣＣＬ１９／ＭＩＰ－３β、ＣＣＬ２０／ＭＩＰ－３α、ＣＸＣＬ１／ＧＲＯα／ＫＣ／ＣＩＮＣ－１、ＣＸＣＬ９／ＭＩＧ、ＣＸＣＬ１０／ＩＰ－１０、ＣＸＣＬ１１／Ｉ－ＴＡＣ、ＣＸＣＬ１３／ＢＬＣ／ＢＣＡ－１、ＣＸ３ＣＬ１／フラクタルカイン、ＭＭＰ－３、ＭＭＰ－９、グルタメート、ＩＬ－１β／ＩＬ－１Ｆ２、ＩＬ－２、ＩＬ－６、ＩＬ－１２、ＩＬ－１５、ＩＬ－１７／ＩＬ－１７Ａ、ＩＬ－１８／ＩＬ－１Ｆ４、ＩＬ－２３、ＩＦＮγ、ＴＮＦ－α、ＦｃγＲＩＩＩ／ＣＤ１６、ＦｃγＲＩＩ／ＣＤ３２、ＣＤ３６／ＳＲ－Ｂ３、ＣＤ４０、ＣＤ６８／ＳＲ－Ｄ１、Ｂ７－１／ＣＤ８０、ＭＨＣＩＩ、ｉＮＯＳ、ＣＯＸ－２を減少させるＭ１マーカー；
Ｌ－１Ｒａ／ＩＬ－１Ｆ３、ＩＬ－４、ＩＬ－１０、ＩＬ－１３、ＴＧＦ－β、ＣＣＬ１３／ＭＣＰ－４、ＣＣＬ１４、ＣＣＬ１７／ＴＡＲＣ、ＣＣＬ１８／ＰＡＲＣ、ＣＣＬ２２／ＭＤＣ、ＣＣＬ２３／ＭＰＩＦ－１、ＣＣＬ２４／エオタキシン－２／ＭＰＩＦ－２、ＣＣＬ２６／エオタキシン－３、ＦＩＺＺ１／ＲＥＬＭα、ＹＭ１／キチナーゼ３－－様３、ＣＬＥＣ１０Ａ／ＣＤ３０１、ＭＭＲ／ＣＤ２０６、ＳＲ－ＡＩ／ＭＳＲ、ＣＤ１６３、アルギナーゼ１／ＡＲＧ１、トランスグルタミナーゼ２／ＴＧＭ２、ＰＰＡＲ γ／ＮＲ１Ｃ３を増大させるＭ２マーカー。
アッセイ１１：樹状細胞
Ｆｍｓ関連チロシンキナーゼ３リガンド（ＦＬＴ３Ｌ）は、造血におけるＤＣの関与の鍵となる調節因子であり、ＦＬＴ３への結合を介して造血性細胞の増殖、分化およびアポトーシスを制御する。ＭＳＣは、免疫寛容原性ＣＤ１ｃ＋ＤＣの増殖を促進しアポトーシスを阻害するために、ＣＤ１ｃ＋ＤＣ上のＦＬＴ３に結合するＦＬＴ３Ｌを発現する。刺激、たとえばＰＨＡまたはＬＰＳでの刺激を伴うかまたは伴わない、アッセイ２による、ＰＢＭＣと共培養物におけるＥＬＩＳＡにより測定したＦＬＴ３ＬのＭＳＣ発現。
ＣＤ１ｃ＋である細胞のフラクションは、薬物物質中間体および／または薬物物質として増大し、すなわち本明細書中記載されるＭＳＣはフローサイトメトリーにより分析され得る寛容性を誘導する。
ＰＢＭＣとＭＳＣの共培養：ＭＳＣ（２×１０５個の細胞／ウェル）を含む５００μｌの作業培地（ＲＰＭＩ１６４０（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ， ｃａｔ ｎｏ． １２６３３０１２）＋２ｍＭのＧｌｕｔａｍａｘ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ， ｃａｔ ｎｏ． ３５０５００６１）＋１００Ｕ／ｍｌのＰｅｓｔ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ， ｃａｔ ｎｏ． １５１４０１２２）＋１０％のＦＢＳ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ， ｃａｔ ｎｏ． １６１４００７１）を、１２ウェル細胞培養プレートに播種する。細胞のプラスチックへの接着のため、プレートを、３７℃、５％のＣＯ２で２時間インキュベートする。Ｌｙｍｐｈｏｐｒｅｐ（商標）キットは、製造社の指示（Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ， ｃａｔ ｎｏ． ０７８０１）にしたがい、中心の血液から回収した、提供された末梢血由来の単核細胞の単離のために使用する。ＰＢＭＣ（１×１０６個の細胞／ウェル）＋マイトジェンとして添加されるＰＨＡまたはＬＰＳを、１２ウェル細胞培養プレートに播種し、この共培養物を、３７℃、５％のＣＯ２で７２時間インキュベートする。
分析：上清を、ＥＬＩＳＡのため抗ＦＬＴ３Ｌ抗体（ＭｙＢｉｏＳｏｕｒｃｅ， Ｉｎｃ． ｃａｔ ｎｏ ＭＢＳ２０３５７０９）を用いて製造社の指示にしたがい標識し、可溶性ＦＬＴ３Ｌの存在を、Ｓｐｅｃｔｒａｍａｘ マイクロプレートリーダー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ， Ｓｐｅｃｔｒａｍａｘ １９０）で定量化する。
樹状細胞のＣＤ１ｃ＋フラクションは、ＰＢＭＣのＣＤ１１ｃ＋およびＣＤ１ｃ＋として定義され、これはフローサイトメトリー（Ｂｅｃｔｏｎ， Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ ａｎｄ Ｃｏｍｐａｎｙ， Ａｃｃｕｒｉ Ｃ６ ｐｌｕｓ）により分析される。懸濁物中の細胞を、抗ＣＤ１１ｃ抗体および抗ＣＤ１ｃ抗体（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ それぞれｃａｔ ｎｏ １２－０１１６－４２および１２－００１５－４２）を用いて製造社の指示にしたがい標識する。
結果：
薬物物質中間体および／または薬物物質を、ＦＬＴ３Ｌ発現に関して分析し、分析した他のサンプルと比較した相対発現に基づくスコアを受領する。薬物物質中間体および／または薬物物質との共培養の後の上清由来のＣＤ１ｃ＋細胞のフラクションおよびＣＤ１１ｃ＋細胞のフラクションを分析し、分析した他のサンプルと比較した相対発現に基づくスコアを受領する。
後にドナーの最終的な選択に使用されるスコアは、ＦＬＴ３Ｌおよび／またはＣＤ１ｃ＋、またはＤＣスコアとして提示される組み合わせたスコアであり得る。
アッセイ１１：ＦＬＴ３Ｌ
Ｆｍｓ関連チロシンキナーゼ３リガンド（ＦＬＴ３Ｌ）は、造血におけるＤＣの関与の鍵となる調節因子であり、ＦＬＴ３への結合を介して造血性細胞の増殖、分化およびアポトーシスを制御する。ＭＳＣは、免疫寛容原性ＣＤ１ｃ＋ＤＣの増殖を促進しアポトーシスを阻害するために、ＣＤ１ｃ＋ＤＣ上のＦＬＴ３に結合するＦＬＴ３Ｌを発現する。刺激、たとえばＰＨＡまたはＬＰＳでの刺激を伴うかまたは伴わない、アッセイ２による、ＰＢＭＣと共培養物におけるＥＬＩＳＡにより測定したＦＬＴ３ＬのＭＳＣ発現。
ＰＢＭＣとＭＳＣの共培養：ＰＢＭＣ：ＭＳＣ（２×１０５個の細胞／ウェル）を含む５００μｌの作業培地（ＲＰＭＩ１６４０（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ， ｃａｔ ｎｏ． １２６３３０１２）＋２ｍＭのＧｌｕｔａｍａｘ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ， ｃａｔ ｎｏ． ３５０５００６１）＋１００Ｕ／ｍｌのＰｅｓｔ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ， ｃａｔ ｎｏ． １５１４０１２２）＋１０％のＦＢＳ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ， ｃａｔ ｎｏ． １６１４００７１）を、１２ウェル細胞培養プレートに播種する。細胞のプラスチックへの接着のため、このプレートを、３７℃、５％のＣＯ２にて２時間インキュベートする。Ｌｙｍｐｈｏｐｒｅｐ（商標）キットは、製造社の指示（Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ， ｃａｔ ｎｏ． ０７８０１）にしたがい、中心の血液から回収した提供された末梢血由来の単核細胞の単離のために使用する。ＰＢＭＣ（１×１０６個の細胞／ウェル）＋マイトジェンとして添加されるＰＨＡまたはＬＰＳを、１２ウェル細胞培養プレートに播種し、共培養物を、３７℃、５％のＣＯ２で７２時間インキュベートする。
分析：上清を、抗ＦＬＴ３Ｌ抗体（ＭｙＢｉｏＳｏｕｒｃｅ， Ｉｎｃ． ｃａｔ ｎｏ ＭＢＳ２０３５７０９）をＥＬＩＳＡのため製造社の指示にしたがい用いて標識し、可溶性ＦＬＴ３の存在を、Ｓｐｅｃｔｒａｍａｘ マイクロプレートリーダー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ， Ｓｐｅｃｔｒａｍａｘ １９０）で定量化する。
結果：
薬物物質中間体および／または薬物物質は、ＦＬＴ３発現に関して分析され、分析した他のサンプルと比較した相対発現に基づくスコアを受領する。このスコアは、後にドナーの最終的な選択で使用される。
アッセイ１２：ＣＤ１ｃ
樹状細胞に及ぼすＭＳＣの免疫抑制作用は、ＭＳＣが免疫寛容原性ＣＤ１ｃ＋ＤＣの増殖を促進し、アポトーシスを阻害するため、ＣＤ１ｃ陽性細胞へと向けた表現型の移行として分析され得る。
ＣＤ１ｃ＋である細胞のフラクションは、薬物物質中間体および／または薬物物質として増大し、すなわち臍帯由来のＭＳＣは、フローサイトメトリーにより分析され得る寛容性を誘導する。
ＰＢＭＣとＭＳＣの共培養：ＭＳＣ（２×１０５個の細胞／ウェル）を含む５００μｌの作業培地（ＲＰＭＩ１６４０（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ， ｃａｔ ｎｏ． １２６３３０１２）＋２ｍＭのＧｌｕｔａｍａｘ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ， ｃａｔ ｎｏ． ３５０５００６１）＋１００Ｕ／ｍｌのＰｅｓｔ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ， ｃａｔ ｎｏ． １５１４０１２２）＋１０％のＦＢＳ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ， ｃａｔ ｎｏ． １６１４００７１）を、１２ウェル細胞培養プレートに播種する。細胞のプラスチックへの接着のため、このプレートを、３７℃、５％のＣＯ２にて２時間インキュベートする。Ｌｙｍｐｈｏｐｒｅｐ（商標）キットは、製造社の指示（Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ， ｃａｔ ｎｏ． ０７８０１）にしたがい、中心の血液から回収した提供された末梢血由来の単核細胞の単離のために使用する。ＰＢＭＣ（１×１０６個の細胞／ウェル）＋マイトジェンとして添加されるＰＨＡまたはＬＰＳを、１２ウェル細胞培養プレートに播種し、共培養物を、３７℃、５％のＣＯ２で４８時間インキュベートする。
分析：
樹状細胞のＣＤ１ｃ＋フラクションは、ＰＢＭＣのＣＤ１１ｃ＋およびＣＤ１ｃ＋として定義され、これは、フローサイトメトリー（Ｂｅｃｔｏｎ， Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ ａｎｄ Ｃｏｍｐａｎｙ， Ａｃｃｕｒｉ Ｃ６ ｐｌｕｓ）により分析される。懸濁物中の細胞は、抗ＣＤ１１ｃ抗体および抗ＣＤ１ｃ抗体（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ それぞれｃａｔ ｎｏ １２－０１１６－４２および１２－００１５－４２）を用いて製造社の指示にしたがい標識する。
結果
樹状細胞に及ぼす薬物物質中間体および／または薬物物質の作用を、共培養後の上清由来のＣＤ１ｃ＋細胞およびＣＤ１１ｃ＋細胞のフラクションとして定量化する。薬物物質中間体および／または薬物物質と培養した樹状細胞が分析され、分析した他のサンプルと比較したＣＤ１ｃ＋発現の相対的な誘導に基づくスコアを受領する。後にドナーの最終的な選択に使用されるスコアは、ＦＬＴ３Ｌおよび／またはＣＤ１ｃ＋またはＤＣスコアとして提示される組み合わせたスコアであり得る。
アッセイ１３：樹状細胞
薬物物質中間体および／または薬物物質のＦｍｓ関連チロシンキナーゼ３リガンド（ＦＬＴ３Ｌ）の発現（アッセイ１３）、ならびに薬物物質中間体および／または薬物物質との共培養後のＣＤ１ｃ＋樹状細胞のフラクション（アッセイ１２）の組み合わせた結果を組み合わせて、樹状細胞スコアを提供する。
結果
薬物物質中間体および／または薬物物質は、ＦＬＴ３Ｌ発現に関して分析され、分析した他のサンプルと比較した相対発現に基づくスコアを受領する。薬物物質中間体および／または薬物物質との共培養後の上清由来のＣＤ１１ｃ＋細胞のＣＤ１ｃ＋細胞のフラクションが分析され、分析した他のサンプルと比較した相対発現に基づくスコアを受領する。
後にドナーの最終的な選択に使用されるスコアは、ＦＬＴ３Ｌおよび／またはＣＤ１ｃ＋、またはＤＣスコアとして提示される組み合わせたスコアであり得る。
アッセイ１４：制御性Ｔ細胞
Ｔ制御性細胞は、免疫応答を抑制する特性を有するＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｔ細胞集団の下位集団として同定されている。この下位集団は、ＣＤ１２７の発現の欠損またはＦｏｘＰ３の陽性発現によりさらに特徴づけられ得る。この細胞のフラクションは、薬物物質中間体および／または薬物物質、すなわち臍帯由来のＭＳＣに曝露される場合に増大し、これはフローサイトメトリーにより分析され得る。
ＰＢＭＣとＭＳＣの共培養：ＭＳＣ（２×１０５個の細胞／ウェル）を含む５００μｌの作業培地（ＲＰＭＩ１６４０（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ， ｃａｔ ｎｏ． １２６３３０１２）＋２ｍＭのＧｌｕｔａｍａｘ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ， ｃａｔ ｎｏ． ３５０５００６１）＋１００Ｕ／ｍｌのＰｅｓｔ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ， ｃａｔ ｎｏ． １５１４０１２２）＋１０％のＦＢＳ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ， ｃａｔ ｎｏ． １６１４００７１）を、１２ウェル細胞培養プレートに播種する。細胞のプラスチックへの接着のため、このプレートを、３７℃、５％のＣＯ２にて２時間インキュベートする。Ｌｙｍｐｈｏｐｒｅｐ（商標）キットは、製造社の指示（Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ， ｃａｔ ｎｏ． ０７８０１）にしたがい、中心の血液から回収した提供された末梢血由来の単核細胞の単離のために使用する。ＰＢＭＣ（１×１０６個の細胞／ウェル＝５００μｌ）を、作業培地に懸濁し、１２ウェルプレートに添加し、共培養を、３７℃、５％のＣＯ２にて２４時間続行する。
分析：
懸濁物中の細胞を、ＣＤ４抗体およびＣＤ２５抗体（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ それぞれｃａｔ ｎｏ １５－００４１－８２および４８－０２５９－４２）を用いて製造社の指示にしたがい標識する。この細胞は、ＣＤ１２７の発現の欠損またはＦｏｘＰ３の陽性発現によりさらに特徴づけられ得る。
結果：
薬物物質中間体および／または薬物物質との共培養後の上清由来のＣＤ２５陽性（任意選択でＣＤ１２７陰性またはＦｏｘＰ３陽性）ＣＤ４＋細胞のフラクションが分析され、分析した他のサンプルと比較したＣＤ２５＋細胞のフラクションに基づく相対的なスコアを受領する。このスコアは、後にドナーの最終的な選択に使用される。
アッセイ１５：単球表現型の変更
単球は、骨髄において骨髄前駆体から生じ、これらは炎症の間ＣＮＳに入り得る。従来より、単球は、ＣＤ１４＋＋ＣＤ１６－である。これらの古典的な単球は、著しく可塑性であり、炎症性組織への動員の後、これらはマクロファージまたは樹状細胞へと変化し得る。非古典的な単球は、ＣＤ１４＋ＣＤ１６＋＋であり、組織のホメオスタシスおよび局所的な再生に関与する。ＭＳＣは、古典的から非古典的への単球の表現型を変更し得る。
ＰＢＭＣとＭＳＣの共培養：ＭＳＣ（５×１０４個の細胞／チューブ）を含む５００μｌの作業培地（ＲＰＭＩ１６４０（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ， ｃａｔ ｎｏ． １２６３３０１２）＋２ｍＭのＧｌｕｔａｍａｘ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ， ｃａｔ ｎｏ． ３５０５００６１）＋１００Ｕ／ｍｌのＰｅｓｔ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ， ｃａｔ ｎｏ． １５１４０１２２）＋１０％のＦＢＳ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ， ｃａｔ ｎｏ． １６１４００７１）を、ポリプロピレン培養チューブに播種する。Ｌｙｍｐｈｏｐｒｅｐ（商標）キットは、製造社の指示（Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ， ｃａｔ ｎｏ． ０７８０１）にしたがい、中心の血液から回収した提供された末梢血由来の単核細胞の単離のために使用する。Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ製のモノクローナル抗ヒトＣＤ１４抗体に結合した磁性ビーズ（Ｇｅｒｍａｎｙ ＃ １３０－０５０－２０１）で正に選択した、単核細胞由来の単球を、製造社の指示にしたがい単離する。２×１０５個の単球を含む５００μｌの作業培地を、ＭＳＣ含有ポリプロピレンチューブに播種する。この共培養物を、３７℃、５％のＣＯ２にて２４時間インキュベートする。
分析：
細胞を回収し、ＤＰＢＳ＋２％のＦＢＳ＋２μＭのＥＤＴＡで２回洗浄し、抗ＣＤ１４ＰＥ（Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ， Ｃａｔａｌｏｇ ＃ １２－０１４９－４２）および抗ＣＤ１６ ＦＩＴＣ（Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ Ｃａｔａｌｏｇ ＃ １１－０１６８－４２）で標識する。薬物物質中間体および／または薬物物質を伴う共培養物ならびに伴わない共培養物において、ＣＤ１６の増大する発現およびＣＤ１４＋＋ＣＤ１６－の減少するパーセンテージを、比較する。最も高いＣＤ１６発現の倍数誘導および最も高いＣＤ１４＋＋ＣＤ１６－の抑制を有するドナーは、最終的なドナーの選択で最も高いスコアを得る。

ドナーの最終的な選択で後に使用されるスコアは、ＣＤ１６＋＋および／またはＣＤ１４＋＋抑制のパーセンテージ、または単球ランキングスコアとして提示される組み合わせたスコアであり得る。
アッセイ１６：ＷＪＭＳＣおよびＰｒｏＴｒａｎｓにおけるＡＣＥ２受容体およびＴＭＰＲＳＳ２のｍＲＮＡの発現
ＡＣＥ２受容体は、コロナウイルススパイクタンパク質による感染症の標的細胞の表面上の進入点である。標的細胞によるセリンプロテアーゼＴＭＰＲＳＳ２の共発現は、コロナウイルススパイクタンパク質のプライミングを可能にする。
ＡＣＥ２受容体およびＴＭＰＲＳＳ２のｍＲＮＡ発現の評価
総ＲＮＡを、ＲＮｅａｓｙ ｍｉｎｉ ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ）を使用して対照ＷＪＭＳＣおよびＰｒｏＴｒａｎｓ産物（ＣＢ１、ＣＢ２、およびＴＢ１）から単離した。ｃＤＮＡを、高容量ｃＤＮＡ逆転写酵素キットを使用して各サンプルから作製した。ＲＴサンプルを、各実験サンプルの対照として作製した。定量ＰＣＲ（ＱＰＣＲ）を、ヒトＡＣＥ２受容体（Ｆ ５’ＴＴＣＴＧＴＣＡＣＣＣＧＡＴＴＴＴＣＡＡ ３’（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１；Ｒ ５’ＴＣＣＣＡＡＣＡＡＴＣＧＴＧＡＧＴＧＣ ３’（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２））、ヒトＴＭＰＲＳＳ２（Ｆ ５’ＣＧＣＴＧＧＣＣＴＡＣＴＣＴＧＧＡＡ ３’（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３）；Ｒ ５’ＣＴＧＡＧＧＡＧＴＣＧＣＡＣＴＣＴＡＴＣＣ ３’（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４））およびヒトＲＰＬ１３Ａ（ハウスキーピング遺伝子；Ｆ ５’ＣＣＴＧＧＡＧＧＡＧＡＡＧＡＧＧＡＡＡＧＡＧＡ ３’（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５）；Ｒ ５’ＴＴＧＡＧＧＡＣＣＴＣＴＧＴＧＴＡＴＴＴＧＴＣＡＡ ３’（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６））を標的とするように設計されたプライマーを用いてＦａｓｔ ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を使用して行った。Ｆａｓｔ Ｓｙｂｒ Ｇｒｅｅｎ増幅のためサイクリングを、製造社の指示の通りにおこなった。合計４０サイクルを行った。
分析：３回の実行の技術的な反復からの平均Ｃｑ値を、同等の逆転写（ＲＴ）陰性対照の平均Ｃｑ値と比較した。値が各ＲＴ－サンプルよりも高い場合、遺伝子は、発現していないとみなされた。値が各ＲＴサンプルよりも低い場合、遺伝子は、発現しているとみなされた。全ての試験したサンプルは、ＡＣＥ２受容体およびＴＭＰＲＳＳ２に対し陰性であった。全てのサンプルは、ハウスキーピング遺伝子ＲＰＬ１３Ａに対し陽性であった。
結果：図８は、ＷＪ－ＭＳＣ対照細胞およびＰｒｏＴｒａｎｓ産物（ＣＢ１、ＣＢ２、およびＴＢ１）におけるＡＣＥ２受容体、ＴＭＰＲＳＳ２、およびハウスキーピング遺伝子ＲＰＬ１３ＡのｍＲＮＡ発現に関する分析からの結果を示す。
実施例４
本実施例は、本発明の集められたアロジェニックな組成物を得るために集めるための細胞集団のサブセットをもたらす実施例４に記載の特徴に基づくドナーに由来するＭＳＣ集団の選択のプロセスを記載する。
材料および方法：
分析およびランク付け：薬物物質中間体を、上述のアッセイ（ＩＤＯ、増殖、ＰＧＥ２、ＨＬＡ－Ｇ、形態、およびＦｌｕｏｒｏｓｐｏｔ）で分析する。サンプルのランク付けを、後述のように行う。
１．上述のＩＤＯアッセイは、二連の細胞培養サンプルで２回行い、各サンプルを、ＥＬＩＳＡにて３連で分析する。アロジェニックなＭＳＣを集めた早期のバッチを、参照サンプルとして使用する。ＩＤＯアッセイは、対照サンプルを含み、各実験で分析し、対照サンプルの分析から作製した結果は、適切な統計的方法を使用して認容性に関して評価する。認容可能な２つの対照の範囲は、製造社の仕様によるものである。認容可能な範囲の一例は、キヌレニン（μｍｏｌ／Ｌ）対照１：０．５３－１，３３および対照２：１．７８－４．１５；トリプトファン（μｍｏｌ／Ｌ）対照１：１５．０－３５．０および対照２：３１．２－７２．８である。アッセイで使用される質の基準は、以下の通りである：ＩＤＯ対照は、明記された範囲内にあり、ＩＤＯ活性（参照サンプル）＞６０倍、すなわち、刺激していない参照サンプルと比較したインターフェロンγ（ＩＦＮγ）参照サンプルの間のＩＤＯ活性の倍数誘導。
薬物物質中間体は、これらの相対的なＩＤＯ発現に基づきランク付けされる。
２．上述の増殖アッセイは、二連の細胞培養サンプルで２回行い、各サンプルを、ＦＡＣＳにて３連で分析する。ＰＢＭＣ増殖に及ぼすサンプルの影響は、増殖指数として提示される。アロジェニックなＭＳＣを集めた早期のバッチを、参照サンプルとして使用し、ＭＳＣの不存在下にてＰＨＡで刺激したＰＢＭＣを、陽性対照として使用する。アッセイで使用される質の基準は、以下の通りである：増殖指数（陽性対照）＞１．５および増殖指数（参照）０．９～１．３。
薬物物質中間体は、これらの相対的な増殖指数に基づきランク付けされる。
３．ＰＧＥアッセイは、二連の細胞培養サンプルで２回行い、各サンプルを、ＥＬＩＳＡにて３連で分析する。このキットは、各実験で標準曲線を確立するための標準物質を含む。アロジェニックなＭＳＣを集めた早期のバッチを、参照サンプルとして使用し、サンプルを、ＰＨＡにより活性化したＰＢＭＣの存在下でのＰＧＥ２発現のレベルに基づき比較する。アッセイで使用される質の基準は、以下の通りである：ＰＧＥ２発現（参照）５～１５ｎｇ／ｍｌおよび標準曲線Ｒ２＞０．９５。
薬物物質中間体は、これらの相対的なＰＧＥ２発現に基づきランク付けされる。
４．ＨＬＡ－Ｇアッセイは、二連の細胞培養サンプルで２回行い、各サンプルを、ＥＬＩＳＡまたはＦＡＣＳにて３連で分析する。アロジェニックなＭＳＣを集めた早期のバッチを、参照サンプルとして使用し、サンプルを、ＰＨＡにより活性化したＰＢＭＣの存在下でのＨＬＡ－Ｇ発現のレベルに基づき比較する。ＥＬＩＳＡキットは、各実験で標準曲線を確立するための標準物質を含む。アッセイで使用される質の基準は、以下の通りである：可溶性ＨＬＡ－Ｇ発現（参照）＞３Ｕ／ｍｌ、標準曲線Ｒ２＞０．９５、および細胞内ＨＬＡ－Ｇ発現（参照）＞５％、薬物物質中間体は、ＨＬＡ－Ｇの相対的な細胞内および／または可溶性の発現に基づきランク付けされる。
５．形態評価は、ＭＳＣ培養の経験が長い研究の専門家により行われる。アロジェニックなＭＳＣを集めた早期のバッチを、参照サンプルとして使用し、サンプルを、細胞の大きさ（正常または大きい）；核の大きさ（正常または大きい）；細胞の形状（正常または異常）；および細胞の大きさと核の大きさとの間の比率（正常または異常）に基づき評価する。アッセイで使用される質の基準は、以下の通りである：４つ全ての基準により９０％超の正常な細胞。参照サンプルは、９０％超の正常な細胞を有する。１０％超の異常な細胞を有する薬物物質中間体は、失格となる。薬物物質中間体は、異常な細胞の出現頻度に基づきランク付けされる。
６．Ｆｌｕｏｒｏｓｐｏｔアッセイは、三連の細胞培養サンプルで２回行う。アロジェニックなＭＳＣを集めた早期のバッチを、参照サンプルとして使用する。薬物物質中間体は、特異的なタンパク質の相対的な発現または抑制に基づきランク付けされる。
７．ミクログリア増殖アッセイは、少なくとも二連の細胞培養サンプルで二回行う。アロジェニックなＭＳＣを集めた早期のバッチを、参照サンプルとして使用し、マイトジェンの存在下およびＭＳＣの不存在下でのミクログリアの増殖を、陰性対照として使用する。薬物物質中間体は、増殖指標、増殖指数、または増殖パーセンテージにより測定される、ミクログリア増殖を抑制するそれらの相対的な特性に基づきランク付けされる。
８－１０．ミクログリア発現アッセイを、少なくとも二連の細胞培養サンプルで二回行う。アロジェニックなＭＳＣを集めた早期のバッチを、参照サンプルとして使用する。ＭＳＣを伴わず培養した、マイトジェンで刺激したミクログリアを陰性対照として使用する。薬物物質中間体は、Ｍ２マーカーの相対的な増加および／またはＭ１マーカーの発現の減少、および／またはＭ１からＭ２へのコンビナトリアルな移行に基づきランク付けされる。
１１．樹状細胞アッセイは、少なくとも二連の細胞培養サンプルで二回行う。アロジェニックなＭＳＣを集めた早期のバッチを、参照サンプルとして使用する。
サンプルの外れ値および失格：ＥＬＩＳＡおよびＦＡＣＳを、各細胞培養物のウェルから３連で分析する。３つの３連のうちの１つのみが、外れ値とみなされ得る。細胞培養物のウェルからの測定値は、分散の係数（ＣＶ）が１０％超である場合外れ値に関して分析される。平均値からほとんど逸脱している反復は、分析から除かれる場合に、反復の排除が３％超でＣＶを減少する場合、外れ値とみなされる。このような外れ値は、さらに判断することなく分析から除外される。
単一細胞培養物のウェルの分析は、外れ値の分析を行った後にＣＶ＞２０％である場合、失格となる。同じ実験において３回以上の失格となった細胞培養物のウェルは、実験を不適格とする。
総合的な評価：薬物物質中間体の選択は、以下の表２１に提示されるポイントシステムによるアッセイの総合的な評価である。各アッセイは、ランキングスコアを作製し、この最終的なセクションで、全てのアッセイのランキングスコアは、追加によりまとめられる。
１０名のドナーから５名のドナーを選択することは、実施例３に記載される、ＩＤＯ、ＰＧＥ２、および増殖アッセイのうちの少なくとも２つ、ならびにミクログリア増殖、ミクログリアＭ１抑制、ミクログリアＭ２倍数増加、樹状細胞の免疫寛容原性、または制御性Ｔ細胞のアッセイのうちの少なくとも１つを行うことにより達成され得る。追加された値の選択を伴う例示的な最小限の選択アルゴリズムを、表２１および２２に提示する。ここで、各アッセイのランキングの値は、追加の総スコアを得るために、追加されている。
あるいは、１０名のドナーのうち５名を選択することは、重みをアッセイに割り当てることにより行われ、よって、分析が多かれ少なかれドナーの選択に影響することを可能にする。表２１のミクログリアアッセイに係数２を適用し、末梢血リンパ球の増殖の重要性を半分に減少させる例がある。重み付けされたランキングスコアは、重み付けした総スコアを得るために追加される。重み付けされた総スコアに基づく表２１からの結果を、表２３に示す。
あるいは、１０名のドナーのうち５名を選択することは、重みをアッセイに割り当てることにより行われ、よって、分析が多かれ少なかれドナーの選択に影響することを可能にする。表１５のＩＤＯアッセイに係数３を適用し、係数２により単球アッセイの重要性を増加させる一例がある。重み付けされたランキングスコアは、重み付けした総スコアを得るために追加される。重み付けされた総スコアに基づく表２２からの結果を、表２４に示す。
１１のアッセイに基づく選択アルゴリズムの一例を、表２５に提示する。
結果
最も高い総スコア（追加／単純または重み付けされた）を有する５つの薬物物質中間体（ＤＸ）が、本明細書中開示される単離され、集められたアロジェニックなＭＳＣ集団、すなわち薬物産物の製造のため選択される。よって、単離され、集められたアロジェニックな集団は、５名の異なるドナー由来のＭＳＣを含み、ＭＳＣは、本明細書中開示される、機能、形態、および安全性の基準を満たす。
実施例５
本実施例は、以下に記載の賦形剤を含む単一細胞懸濁物である、最終産物を製造するプロセスを記載する。上記最終産物は、凍結保存に適した移送バッグに充填され、以下に記載の所定の温度曲線により凍結される。
材料および方法
ドナーを集める
全ての受け入れ基準を通過したドナーサンプルのみを、集める対象とみなす。使用される薬物物質は、実施例４および５により選択される。継代２または３の薬物物質を、集めた直後に、凍結保存する。このようにして薬物産物が得られる。重要なことに、薬物産物は、さらなる培養または増殖に全く供されない。
薬物産物の製剤化およびパッケージング
最終産物は、５ｍｌの細胞懸濁物であり、ｃｒｙｏｂａｇの中に提示される。薬物産物を含む凍結保存した最終産物の組成は、表２６に示されている。
結果
よって、得られた最終産物は、本明細書中開示されるように得られる。
実施例６
本実施例は、凍結保存後の最終産物の安定性の評価を記載する。これは、最終産物が解凍後少なくとも２時間安定していることを示す。
材料および方法
バッグあたり３０００万、５０００万、６００００万、または１億個の細胞を含む５ｍｌの細胞懸濁物を含む本発明の組成物を、ｃｒｙｏｂａｇの中の液体窒素またはドライアイス上に輸送する。ｃｒｙｏｂａｇを、ウォーターバス（３７℃）で解凍し、通常１０ｍｌの自家脊髄液またはラクトリンゲル液で直接希釈する。次に、１５ｍｌの注射溶液を、注入のため準備する。この細胞のバイアビリティを、サンプルを異なる時点で注入バッグから採取することにより分析する。
薬物産物の安定性を、アポトーシス性マーカー７ＡＡＤに対するフローサイトメトリー分析により調査する。薬物産物は、希釈しない場合解凍から２時間超安定している（図２ａ）。薬物産物をＣｒｙｏｂａｇから生理食塩水注入バッグ（Ｂａｘｔｅｒ）へ移すことにより塩化ナトリウム注入溶液に希釈する。アリコートを、室温に保ちながら異なる時点で採取する（図２ｂ）。
結果
バイアビリティ：薬物産物は、バイアビリティが解凍の直後に測定されるバイアビリティの８０％に減少した際の時点まで、安定しているとみなされている。薬物産物は、ＭＳＣに特異的な細胞表面マーカーおよび培養効力に関して、２時間の安定性の制限時間で試験されている。薬物産物は、希釈した場合および希釈してない場合の両方で、２時間後に特徴を継続していることならびに認容可能なバイアビリティを示している。
結論：分析された本発明の組成物のバッチは、細胞のバイアビリティの質の基準を満たす。
実施例７：
本実施例は、本発明の集められたアロジェニックなＭＳＣ組成物のＣＯＶＩＤ－１９と診断された患者への静脈内投与の臨床試験設計の概略を提供する。２４カ月にわたりＣＯＶＩＤ－１９と診断された成年患者への本発明の集められたアロジェニックなＭＳＣ組成物の静脈内注入の安全性および寛容性。全ての有害事象は記録され、最終産物との潜在的な因果関係が調査される。
試験目的：この試験の主目的は、成年のＣＯＶＩＤ－１９患者における本発明の集められたアロジェニックなＭＳＣ組成物の静脈内注入の安全性および寛容性を調査することである。副次的目的は、９ポイントの順序尺度（０．臨床症状なしまたは感染のウイルス学的エビデンスなし、１．活動の制限なし。２．歩行可能、活動の制限。３．入院、酸素補給の必要なし。４．入院、酸素補給を必要とする。５．入院、非侵襲的換気または高流量酸素装置を使用。６．入院、挿管、機械的人工呼吸を使用。７．入院、換気＋さらなる酸素の支援－昇圧薬、ＲＲＴ、ＥＣＭＯ、８．死亡）で評価される、７、１５、および３０日までの死亡率；９ポイントの順序尺度に関する１つのカテゴリーの入院からの臨床上の改善までの時間；イメージング技術を使用した肺損傷に及ぼす最終産物の効果；入院および集中治療室にとどまる期間；最終産物の注入後のＣＯＶＩＤ－１９のウイルス量の動態；最終産物を注入した後の、肝臓、心筋、および炎症の生体マーカーの発展；重篤なＣＯＶＩＤ－１９呼吸系病態に関する最終産物の寛容性を含む患者の臨床状態に及ぼす最終産物の効果を評価することを含む。
試験設計：これは、オープンな用量漸増するフェーズＩＢ臨床試験である。３名の患者の第１のコホートに、患者あたり２５００万個のＭＳＣの用量を投与する。第１のコホートにおいて毒性がない場合、３名の患者の第２のコホートに、患者あたり１億個のＭＳＣを投与する。第１の患者が、試験薬物に関連するグレード３または４の１つの毒性を経る場合、試験のＤＳＭＢは、スポンサーに、進行方法に関する勧告を提供する。次に、スポンサーは、試験を中止する決定をとる。ＡＥグレード３または４が、第１の患者の投与後に観察される場合、次の患者は、計画通りに投与される。合計３名の患者が、２５００万個のＭＳＣで処置される。第１のコホートで重篤なＡＥが観察されない場合、試験は進行し、３名の患者の第２のコホートの投与が、患者あたり１億個のＭＳＣの用量で続行される。第３のコホートの規則は、同じである。第１のコホートおよび第２のコホートならびに各コホートの中の個体の中で試験薬物に関連するグレード３または４の毒性がない場合、３名の患者の第３のコホートに、患者あたり２億個のＭＳＣの用量を投与する。
スクリーニングおよびインフォームドコンセント：インフォームドコンセントへの署名の後、以下の評価を行い、包含基準および除外基準に明記されるように適格性の必要条件を決定する。これは、試験への患者の包含の前に予定が決定されている。
・人口統計、病歴（処置、併存症、およびアレルギー）
・包含前の全ての検体のＰＣＲによる陽性ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２試験結果の確認
・ＳｐＯ２測定および酸素補給の必要性により評価される肺炎の分類
・最後の結果が包含日から７２時間超である場合、研究評価をスクリーニングするための血液検査：
血液学（ＷＢＣ、ヘモグロビン、血小板の計測）
生化学（ＡＳＴ、ＡＬＴ総ビリルビン、血清クレアチニン、血中電解質（カリウム血を含む）、ＣＰＫ、ＮＴ－ｐｒｏＢＮＰ、ＣＫ－Ｍｂ、ハプトグロビン、トロポニンＩ、プロカルシトニン、ＬＤＨ、フェリチン血症、ＣＲＰ）
止血マーカー（Ｄ－ダイマーのレベル、ＩＮＲ、フィブリノーゲン、抗トロンビン、および抗Ｘａ活性）
ＨＩＶ、梅毒、ＨＥＰ Ｂ、ＨＥＰ Ｃの血清学的なプロファイル
・結核感染または以前の曝露の調査
・最後の結果が包含日から７２時間超である場合、サイトバクテリアの評価に関する尿検査
・尿または血清妊娠検査（妊娠する可能性のある女性）
処置－ＷＪＭＳＣの静脈内投与および急性モニタリング：スクリーニングおよび試験包含の後に、対象に、ＷＪＭＳＣの静脈内注射を行う。
本発明の集められたアロジェニックなＭＳＣ組成物は、液体窒素において試験クリニックへ送達される。薬物産物をウォーターバスで３～５分間解凍する。最終産物を１００ｍｌの生理食塩水に希釈した後に投与する。
入院の間、対象を、本発明の集められたアロジェニックなＭＳＣ組成物の静脈内注射の間および直後の全ての有害事象に関して、治験コーディネーター（ｒｅｓｅａｒｃｈ ｎｕｒｓｅ）により観察する。
経過観察：患者を、表２７に従い処置後に評価する。
最終的な経過観察訪問：全ての試験対象は、ＭＳＣ組成物の処置から２４カ月後に最終的な経過観察訪問を行う。この訪問時に、患者は、表２７に示される以下の手法を経る。

１．インフォームドコンセントは、全ての試験手法の前に署名されなければならない
２．全ての手法は、最大Ｄ８までに表にしたがい行われる必要がある。このプロトコルは、３０日目まで患者を経過観察するように設計されている。しかしながら、患者がＤ３０より前に退院する場合、有害事象を除き、３０日目の経過観察の訪問に関連する実験は、退院時に行われる。これは、患者が、Ｄ１５までまたは（退院がＤ１５より後に行われる場合は）退院時点まで経過観察されることを意味する。有害事象は、患者がこの時点より前に退院した場合、週に１度の患者への電話の呼び出しで３０日目まで経過観察される。
３．２回の毎日の測定のうち最も悪い値／必要条件が保存される。
４．これらの検査は、試験により必要とされないが、臨床上の必要性のためＭＳＣ注入の前および後に行われる場合利用され得る。
５．ＭＳＣ注入の直前
試験の終了：試験の終了は、最後の患者の最後の経過観察として定義される。主任研究者は、臨床的または投与上の理由のため試験をいずれの時点でも終了する権利を有する。この試験は、ＡＴＭＰに関連する多くの深刻な有害事象のため、または登録プロセスが合理的な時間枠の中で完了できない場合、通常より早く終了し得る。
通常より早い試験の終了に関する決定は、スポンサー／主任研究者によりなされる。試験の終了は、９０日内または試験が通常より早く終了する場合は１５日以内にＭＰＡに報告される。研究者は、参加者に通知し、関与した全てに適切な経過観察が配置されることを確約する。試験の概要報告は、試験終了から１年以内に、ＭＰＡ（Ｍｅｄｉｃａｌ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ Ａｇｅｎｃｙ）に提出される。全ての患者は、試験処置後２週間経過観察される。患者は、全ての経過観察訪問にて、試験研究者により評価される安全性の態様に関して経過観察される。
あるいは、髄腔内送達が、臨床試験で使用される。この臨床試験の設計は、最終産物が１０～５０ｍｌの容量で送達されることを除き、髄腔内投与を含む試験と同じである。
あるいは、最終産物の静脈内注入は、以下に定義されるように最終産物：プラセボの１：１の無作為化の戦略を使用したフェーズＩＩの無作為化二重盲検試験を続行し得る。
試験目的：４Ｌ／分のＯ２にて９６％超を飽和できず、「非侵襲的」換気も侵襲的人工呼吸もＥＣＭＯも使用していない患者として定義される「重篤な」ＣＯＶＩＤ－１９肺炎の処置における一定用量の最終産物（患者あたり１億個のＭＳＣ）の単回注入の効力を評価すること。複合的なプリマリーエンドポイントは、包含から１５日後の人工呼吸の使用（すなわち挿管の必要性）または死亡の比率である。試験のセカンダリーエンドポイントは、
９ポイントの順序尺度により評価される７、１５、および３０日目での臨床状態の発展
７、１５、および３０日目での生存率
無作為化から９ポイントの順序尺度に関する１ポイントの改善または病院からの退院のいずれかまでの時間として定義される、臨床的な改善までの時間
入院およびＩＣＵ入室の期間
である。
探索的（研究）エンドポイント：
定量ＰＣＲ 鼻咽頭サンプルにおけるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルス（時間枠：Ｄ０のＭＳＣ注入前および臨床適応によりＭＳＣ注入後）
末梢血で評価した白血球、ヘモグロビン、血小板の計数、および標準的な止血マーカー（Ｄ－ダイマーのレベル、プロトロンビン時間、国際標準化比（ＩＮＲ）、フィブリノーゲン、および抗Ｘａ活性）（時間枠、０日目のＭＳＣ注入前ならびに１、３、５、８、１５、および３０日目のＭＳＣ注入後またはそれ以前の場合は退院日のＭＳＣ注入後）
炎症および心筋の損傷の標準的な生体マーカー：
末梢血で評価した、グルタミン酸オキサロ酢酸トランスアミナーゼ（ｇｌｕｔａｍｉｃ ｏｘａｌｏａｃｅｔｉｃ）およびアラニンアミノトランスフェラーゼ、総ビリルビン、血清クレアチニン、血中電解質、クレアチンホスホキナーゼ、ＮＴ－ｐｒｏＢＮＰ、ミオグロビン、ハプトグロビン、トロポニンＴ、プロカルシトニン、ＬＤＨ、フェリチン、ＣＲＰ（時間枠、０日目のＭＳＣ注入前ならびに１、３、５、８、１５、および３０日目のＭＳＣ注入後またはそれ以前の場合は退院日のＭＳＣ注入後）
臨床的に必要である場合、イメージング技術（胸部Ｘ線／ＣＴスキャン／またはドプラ超音波検査）により評価される肺損傷
ＭＥＣＬ（ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ ｅｌｅｃｔｒｏｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ）ベースの技術を使用して評価される、アンジオポエチン２、ＩＬ－１β、ＩＬ－６、ＩＬ－８、ＩＬ－１０、ＴＮＦα、ＶＥＧＦ、ＲＡＧＥ、および抗ＳＡＲＳ－ＣｏＶ２ ＩｇＧおよびＩｇＡを含む研究バイオマーカー。ベースラインからの変化（時間枠：０日目のＭＳＣ注入の直前、ならびに３時間目、および１、８、１５、および３０日目でのＭＳＣ注入後またはそれ以前の場合は退院日のＭＳＣ注入後）
単一細胞のＲＮＡシーケンシングおよび／またはフローサイトメトリーのための末梢血単核球（時間枠：０日目のＭＳＣ注入の直前、ならびに３時間目、および１、８、および３０日目でのＭＳＣ注入後またはそれ以前の場合は退院日のＭＳＣ注入後）
試験設計
これは、無作為化二重盲検プラセボ対照のフェーズＩＩの臨床試験である。合計４８名の患者を、最終産物：使用するプラセボの１：１の無作為化にて、登録する。試験集団の各処置アームへの階層化は、年齢および性別に基づく。登録された各患者に、最終産物またはプラセボを静脈内注入し、処置後１２か月間評価する。
スクリーニングおよびインフォームドコンセント：インフォームドコンセントの署名の後、以下の評価を行い、包含に明記される適格性の必要条件および除外基準を判定する。これは、試験へ患者を包含する前にスケジュール化されている。
・人口統計、病歴（処置、併存症、およびアレルギー）
・無作為化前の全ての検体のＰＣＲによる陽性ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２試験結果の確認
・ＳｐＯ２の測定および酸素補給の必要性により評価される肺炎の分類
・最後の結果が無作為化からから７２時間未満である場合、研究評価をスクリーニングするための血液検査：
絶対好中球数
血小板
ＡＬＴまたはＡＳＴ
クレアチニン
ＨＩＶ、梅毒、ＨＥＰ Ｂ、ＨＥＰ Ｃの血清学的なプロファイル
・進行中の結核感染症の調査
・最後の結果が包含日から７２時間未満である場合、尿検査
・尿または血清妊娠検査（妊娠する可能性のある女性）
以下の評価は、すでに得られたスクリーニングの測定値に加え、ベースラインのデータで必要に応じて行われる：
０日目、ＭＳＣ注入の前：
９ポイントの順序尺度（０．臨床症状なしまたは感染のウイルス学的エビデンスなし、１．活動の制限なし。２．歩行可能、活動の制限。３．入院、酸素補給の必要なし。４．入院、酸素補給を必要とする。５．入院、非侵襲的換気または高流量酸素装置を使用。６．入院、挿管、機械的人工呼吸を使用。７．入院、換気＋さらなる酸素の支援－昇圧薬、ＲＲＴ、ＥＣＭＯ、８．死亡）
定量ＰＣＲ 鼻咽頭スワブにおけるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルス
Ｏ２飽和度およびＯ２要求量
末梢血における白血球、ヘモグロビン、血小板の計数、および標準的な止血マーカー（Ｄ－ダイマーのレベル、プロトロンビン時間、ＩＮＲ、フィブリノーゲン、および抗Ｘａ活性）
末梢血の中の炎症および心筋の損傷に関する標準的な生体マーカー：ＡＬＴ、ＡＳＴ、総ビリルビン、血清クレアチニン、血中電解質、クレアチンホスホキナーゼ、ＮＴ－ｐｒｏＢＮＰ、ミオグロビン、ハプトグロビン、トロポニンＴ、プロカルシトニン、ＬＤＨ、フェリチン、ＣＲＰ
血漿および末梢血単核球（ＰＢＭＣ）のバイオバンキング
ＣＯＶＩＤ－１９の評価のための、ＭＳＣ注入前のいずれかの時間
臨床目的で行われる場合胸部Ｘ線／ＣＴスキャン／またはドプラ超音波検査
ＭＳＣ注入：Ｃｒｙｏｂａｇをベッドサイドで解凍し、１００ｍｌの生理食塩水に希釈した後に投与する。細胞は、合計２０分間にわたり５００万個の細胞／分の速度で送達される。注入プロセスの前または間に、視認可能なクランプまたは細胞のデブリがないことを確保するために、産物は視覚的に評価される。
実験処置グループ：合計２０分にわたり５００万個の細胞／分の速度でのゆっくりとした静脈内注入により、単回用量１００×１０６個のＷＪ－ＭＳＣ／患者が投与される。
プラセボグループ：５％のヒト血清アルブミン（ＨＡＳ）および１０％のジメチルスルホキシド（ＤＭＳ）を補充した塩化ナトリウムバッファーが、実験処置グループと同じ容量および投与形式で投与される。
経過観察訪問：以下の評価を、介入後毎日行う。
９ポイントの順序尺度で評価される臨床状態
１日２回のＯ２飽和度およびＯ２要求量。最も悪い値がとられる。
ＣＴＣＡＥ（Ｃｏｍｍｏｎ Ｔｅｒｍｉｎｏｌｏｇｙ Ｃｒｉｔｅｒｉａ ｆｏｒ Ａｄｖｅｒｓｅ Ｅｖｅｎｔｓ）バージョン５の基準による安全性の評価
以下の評価を、１、３、５、８、１５、および３０日目（またはそれ以前の場合は退院日）に行う。臨床ケアの一部として行われる場合、このデータは、試験に含まれ、他方でサンプルが、診査の一部として入手、保存、および試験される。
生物学的な試験は、
血液学：白血球、ヘモグロビン、血小板の計数
生化学：ＡＬＴ、ＡＳＴ、総ビリルビン、血清クレアチニン、血中電解質、ＣＰＫ、ＮＴ－ｐｒｏＢＮＰ、ミオグロビン、ハプトグロビン、トロポニンＴ、プロカルシトニン、ＬＤＨ、フェリチン、ＣＲＰ
止血マーカー：Ｄ－ダイマーのレベル、プロトロンビン時間、ＩＮＲ、フィブリノーゲン、および抗Ｘａ活性
血漿およびＰＢＭＣのバイオバンキングを、０日目、ＭＳＣ注入から３時間後、１、８、および３０日目（またはそれ以前の場合は退院日）に行う
生存率の評価を、７、１５、および３０日目に評価する。
臨床的に必要である場合、胸部Ｘ線／ＣＴスキャンまたはドプラ超音波検査
を含む。
最終的な試験訪問
試験の終了は、全ての包含および全ての患者がそれらの経過観察を完了した際である。この試験の最後の訪問は、３０日目である。患者が３０日目より前に病院から退院する場合、患者は、退院日に最後の生体評価を経るが、退院後の臨床状態および有害事象は、週間隔での患者への電話の呼び出しにより評価される。
実施例８
本実施例は、試験集団の選択基準を記載する。この試験に登録された各患者は、全ての包含基準を満たし、除外基準を満たさない必要がある。
包含基準および除外基準：対象は、ＣＯＶＩＤ－１９と診断された集団から動員される。
包含基準は、以下の通りである：
・１８歳以上の男性または女性
包含前のいずれかの検体において逆転写ＰＣＲ（ＲＴ－ＰＣＲ）により決定される研究室により確認されたＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２を有する。
・入院患者
・５Ｌ／分の継続的な酸素補給または高流量の酸素、３５％のＦｉＯ２＞３０ｌ／分により定義される重篤な肺炎と分類され、「非侵襲的」換気でも侵襲的人工呼吸でもＥＣＭＯの下でも９６％超を飽和できない患者。
・妊娠の可能性のある女性は、試験期間の間避妊薬または許容可能な受胎調節を使用することに同意しなければならない。
除外基準は、以下の通りである：
・インフォームドコンセントを提供することができない
・２４時間の生存が予測されない患者、または包含時もしくはこの入院の間に以前に人工呼吸をしている患者
・妊娠中または育児（授乳）中の女性（妊娠は、陽性のヒト絨毛性ゴナドトロピン（ｈＣＧ）臨床検査により確認される、受胎後かつ妊娠の終了までの女性の状態として定義される）
・ＢＭＩ３０以上の患者
・既知の悪性腫瘍または以前に悪性腫瘍であった患者
・医師により禁忌とみなされる他の重篤な全身性疾患を有する患者
・スクリーニング時に後述される範囲外の以下の臨床結果のいずれかを有する患者：絶対好中球数（ＡＮＣ）≦１．０×１０９／Ｌ、血小板（ＰＬＴ）＜５０ １０９／Ｌ、ＡＳＡＴまたはＡＬＡＴ＞５Ｎ、ｅＧＦＲ＜３０ｍＬ／ｍ分
・現在論述されている細菌性感染症
・ヒト免疫不全ウイルス、梅毒トレポネーマ、Ｂ型肝炎抗原（以前のワクチン接種およびワクチン接種の履歴と一致する血清学が許容可能である）、またはＣ型肝炎を伴う感染症の血清学的なエビデンス
・結核に対し不顕性または以前に罹患したことがあること、および現在治療中であること、または、結核に曝露したか、または過去３カ月以内に結核もしくは真菌症のリスクが高い領域を旅行したことがある
・ＰｒｏＴｒａｎｓ（登録商標）製品の成分に対する既知のアレルギーを有する患者
・レムデシビルで現在処置中であること、
・長期間の酸素療法を必要とする既存の慢性呼吸器疾患
・Ｃの基底のＣｈｉｌｄ ａｎｄ Ｐｕｇｈを有する既存の肝硬変
・血栓塞栓症および／または血栓塞栓性の併存症のリスクが高い病歴を有する患者
・心筋梗塞の病歴を有する患者
・心機能障害の病歴１
結果
９名の個体の試験集団を、上述の基準に基づき選択する。対象は、試験介入を行う前または後に試験への関与に関する同意書を撤回してもよい。対象の中断の理由は、ＣＲＦ（Ｃａｓｅ Ｒｅｐｏｒｔ Ｆｏｒｍ）で文書化される。対象がＡＥにより中断する場合、イベントの性質およびその臨床過程は、完全に文書化されなければならない。
実施例９
本実施例は、どのように臨床試験を行うかを記載する。本明細書において、本発明の集められたアロジェニックなＭＳＣ組成物は、薬物産物と呼ばれ、本医薬組成物は、最終産物と呼ばれる。よって最終産物は、薬物産物を含む。
材料および方法
薬物産物は、複数のドナー由来のアロジェニックな細胞懸濁物として定義されている。ＭＳＣは、ホウォートンゼリーから外植片を介して単離され、継代２または３まで増殖される。薬物産物は、５名のドナーから集められ、ｅｘ ｖｉｖｏで増殖された細胞を含む。各バッチの産生は、約２０名の適格なドナー由来の組織の外植片で開始し、このうち五名のドナーを、本明細書中記載の薬物産物ドナーとして最終的に選択する。ＭＳＣの性質決定に加え、細胞を、形態、増殖能、ならびに免疫抑制および免疫調節能に関連する機能的なアッセイに基づき選択する。
細胞は、５ｍｌの５％のＨＳＡおよび１０％のＤＭＳＯにおいて３０、６０、または１００×１０６個の細胞の濃度でｃｒｙｏ ｂａｇに凍結する。１つのｃｒｙｏ ｂａｇは、１つの用量を含む。バッグを、コントロールレートフリーザーで凍結し、注入の時間まで保存のため－１９０℃に直接移す。凍結保存されたバッグは、製造社により液体窒素において研究者の場所へ輸送され、これをベッドの側で解凍し、薬物産物の即時希釈および髄腔内注射のため腰椎穿刺を介して吸引される自家性脊髄液に希釈する。あるいは、静脈内または動脈内注入が利用され、薬物産物は、１００ｍｌの生理食塩水に希釈した後に投与される。注射の最低２４時間前に、研究者は、ＩＰの送達のため製造社に要求書を送付する。注入日に、適用可能な最終産物が、製造社により研究者の場所へ輸送される。
最終産物は、製造社が液体窒素の輸送キャニスター中のｃｒｙｏｂａｇを手渡した際に送達されたとみなされる。患者への注入の準備ができている場合、細胞を、ウォーターバスにおいてベッドサイドで解凍する。解凍された最終産物を、髄腔内送達のため合計１５ｍｌの注入容量を提供する１０ｍｌの脊髄液または静脈内もしくは動脈内送達のため１００ｍｌの生理食塩水に希釈する。最終産物は、調製から３０分後以内（しかしながら調製から２時間後以下）に患者に投与すべきである。
細胞は、１００ｍｌの生理食塩水の用量で静脈内投与される。プラセボは、静脈内または動脈内試験では、同等の容量のＤＭＳＯである。フェーズＩＩの試験では、これは、二重盲検試験であり、ここで、安全性および効力の評価を注射後に行う試験対象および試験員の両者は、どの対象がＷＪＭＳＣまたはプラセボを投与されたかを知らされていない。対象は、薬物産物またはプラセボの処置のいずれかを投与するように無作為化される。
全患者は、標準的なＣＯＶＩＤ－１９の処置を受ける。試験処置を妨げ得る併用医療を受けている試験患者は、この試験から除かれる。研究者は、試験処置が開始した際に受けている新規の全ての薬剤投与について試験場所に通知するように患者に指示する。患者が試験薬物での処置を開始する後に行われる全ての薬剤投与および有意な非薬物療法（物理的療法および輸血を含む）は、ＣＲＦおよび診療録に列挙されなければならない。
結果
試験は、薬物産物／最終産物の注入後２年間の経過観察で完了する。
上述の手法は、産物の適切な適用を保証し、産物の安全性および効力の試験を可能にする。
有害事象の回数および頻度は、登録の時間から経過観察期間の終了まで、または早期に離脱する場合は、試験の離脱の時間まで、記録される。有害事象（ＡＥおよびＳＡＥ）は、患者の医学的な記録に書き留められ、各ＡＥ／ＳＡＥで別々のＡＥ／ＳＡＥレポートが作製される。患者は、スクリーニング訪問による各訪問で全ての有害事象を報告するように尋ねられる。バイタルサイン、身体検査、神経試験（研究者による）、血液および尿のサンプルが、安全性のため試験を通して特定の時間に分析される。
２名の患者は、臨床試験ＥｕｄｒａＣＴ ｎｕｍｂｅｒ：２０２０－００２０７８－２９（Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ Ｃｏｍｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｗｉｔｈ ＣＯＶＩＤ－１９ Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ Ｕｓｉｎｇ Ｗｈａｒｔｏｎ’ｓ Ｊｅｌｌｙ （ＷＪ）－Ｕｍｂｉｌｉｃａｌ Ｃｏｒｄ （ＵＣ） Ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ Ｓｔｒｏｍａｌ Ｃｅｌｌｓ（ＰｒｏＴｒａｎｓ（登録商標））：非盲検フェーズＩＢ臨床試験）において治験産物ＩＭＰ（言い換えると最終産物）として製剤化された２５００万個の細胞を注入される。重篤な有害な反応は登録されておらず、患者は、それぞれ注入から１日後および５日後に、退院した。１名の患者は、カナダの臨床試験プロジェクトコード番号：２０２１－６９５４（Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ Ｃｏｍｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｗｉｔｈ ＣＯＶＩＤ－１９ Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ Ｕｓｉｎｇ Ｗｈａｒｔｏｎ’ｓ Ｊｅｌｌｙ （ＷＪ）－Ｕｍｂｉｌｉｃａｌ Ｃｏｒｄ （ＵＣ） Ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ Ｓｔｒｏｍａｌ Ｃｅｌｌｓ（ＰｒｏＴｒａｎｓ（登録商標））：無作為化フェーズＩＩ対照臨床試験においてＩＭＰとして製剤化された１億個の細胞またはプラセボを投与される。重篤で有害な反応は登録されていない。
本実施例は、本明細書中開示される薬物産物での処置が、以下の結果：入院時間の減少、酸素補給または高流量酸素補給の必要性の減少、医療介入の必要性（たとえば人工呼吸、たとえばＥＣＭＯの必要性）の減少、酸素支援の必要性の減少、および生存率の増大のうちの１つ以上を示すことが予想される。
さらに、本発明の処置は、患者において抗ＨＬＡ抗体の臨床上関連する誘導を全くもたらさないことが予想される。
実施例１０
本実施例は、本開示に係る、単離され、集められたアロジェニックなＭＳＣ集団が、集めた後に培養することを必要とせずに、単一のドナーまたは骨髄ＭＳＣなどの他のＭＳＣの供給源に由来するＭＳＣと比較して高い、高い免疫調節分子のベースライン分泌を呈することを示す。
材料および方法
アッセイ１：ＩＤＯアッセイ．ＩＤＯアッセイを使用して、薬物中間体または薬物物質、すなわち間葉系幹細胞／間質細胞（ＭＳＣ）の免疫抑制能を分析する。
ＷＪ－ＭＳＣの免疫調節の可能性は、インドールアミン ２，３－ジオキシゲナーゼ（ＩＤＯ）の活性の測定値として報告され、培養物の上清におけるトリプトファンおよびキヌレニンを測定することにより決定される。ＩＤＯ活性は、キヌレニン／トリプトファンの比率であり、ＥＬＩＳＡキットを使用して細胞培養物の上清に存在するトリプトファンおよびキヌレニンの量を計算することにより決定され得る。本発明者らは、ＷＪ－ＭＳＣを集めることが単一のＷＪ－ＭＳＣドナーまたは骨髄由来のＭＳＣと比較して高いベースライン（非刺激の）レベルのＩＤＯ活性をもたらすことを示すデータを提示する。
ＭＳＣ培養：４８ウェル細胞培養プレートの中の１００μｌのアッセイ培地（ＤＭＥＭ、低グルコース、ＧｌｕｔａＭＡＸ（商標）補助剤、ピルビン酸塩（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ， ｃａｔ ｎｏ． ２１８８５０２５）＋１０％のウシ胎仔血清、適格、熱不活性化（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ， ｃａｔ ｎｏ． １６１４００７１））に１０００個のＭＳＣ／ウェルを播種する。１００μｌのアッセイ培地を細胞に添加する。細胞培養プレートを、３７℃、５％のＣＯ２にて７２時間インキュベートする。各ウェルから上清を除去し、ＥＬＩＳＡ分析でのさらなる処理まで－２０℃でマイクロチューブに保存する。トリプトファンおよびキヌレニンの測定を、ＥＬＩＳＡキットの製造社により提供されるマニュアル（Ｉｍｍｕｎｄｉａｇｎｏｓｔｉｋ ＡＧ， ｃａｔ ｎｏ． Ｋ ３７３０および Ｋ ３７２８）にしたがい行う。トリプトファンおよびキヌレニンのＥＬＩＳＡの両方を、同日に別々の状況で行う。２つのＥＬＩＳＡは、製造社の指示にしたがい行う。各ＥＬＩＳＡのマニュアルを参照されたい。
６２０ｎｍでのバックグラウンド減算を伴う４５０ｎｍでの吸収を、Ｓｐｅｃｔｒａｍａｘ マイクロプレートリーダー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ， Ｓｐｅｃｔｒａｍａｘ １９０）で測定する。
結果の分析：測定した吸光度の量は、サンプルに存在するアミノ酸の量に逆比例しており、すなわちＯＤ４５０が低いほど、キヌレニンまたはトリプトファンが多い。４ＰＬ－アルゴリズム（Ｆｏｕｒ Ｐａｒａｍｅｔｅｒ Ｌｏｇｉｓｔｉｃ Ｒｅｇｒｅｓｓｉｏｎ）が、結果を計算するためキットの製造社により推奨されるように使用される（ｓｏｆｔｗａｒｅ ＳｏｆｔＭａｘ Ｐｒｏ ７．０．２， Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ）。濃度は、標準曲線から直接決定される。キットと共に提供される対照サンプルは、認容性に関して評価される。キットの製造社により許容される範囲外にある場合、サンプルは再度アッセイする必要がある。
結果
キヌレニン／トリプトファンの比率を、集められたＷＪ－ＭＳＣ（ＴＢ１）において、単一の細胞のＷＪ－ＭＳＣドナー、骨髄由来のＭＳＣ、およびヒト胎盤絨毛癌由来のＪＥＧ－３対照細胞株と比較して評価した。評価した他の全ての細胞供給源と比較して高いベースラインのＩＤＯ活性が、ＴＢ１の集められたＷＪ－ＭＳＣで見られた。
材料および方法
アッセイ２：プロスタグランジンＥ２（ＰＧＥ２）アッセイは、培養培地の上清における薬物物質中間体および／または薬物物質のＰＧＥ２の分泌を評価する。
細胞培養：細胞を、アッセイ培地（ＤＭＥＭ、低グルコース、ＧｌｕｔａＭＡＸ（商標）補助剤、ピルビン酸塩（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ， ｃａｔ ｎｏ． ２１８８５０２５）＋１０％のウシ胎仔血清、適格、熱不活性化（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ， ｃａｔ ｎｏ． １６１４００７１））で３日間培養する。ウェルあたり４００００個のＭＳＣを、１２ウェル細胞培養プレートに播種する。細胞培養プレートを、３７℃、５％のＣＯ２にてインキュベートする。５００μｌのアッセイ培地。細胞培養プレートを、３７℃、５％のＣＯ２にて７２時間インキュベートする。上清を各ウェルから除去し、５００ｇで５分間遠心分離して微粒子を除去する。この上清を凍結して、ＥＬＩＳＡ分析のさらなる処理のため－２０℃で保存する。
Ｐａｒａｍｅｔｅｒ（商標）プロスタグランジン Ｅ２イムノアッセイキットを、ＰＧＥ２発現検出のため製造社の指示にしたがい使用し（Ｂｉｏ－Ｔｅｃｈｎｅ， ｃａｔ ｎｏ． ＫＧＥ００４Ｂ）、Ｓｐｅｃｔｒａｍａｘ マイクロプレートリーダー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ， Ｓｐｅｃｔｒａｍａｘ １９０）で分析する。
結果を計算するために、４ＰＬ－アルゴリズム（Ｆｏｕｒ Ｐａｒａｍｅｔｅｒ Ｌｏｇｉｓｔｉｃ Ｒｅｇｒｅｓｓｉｏｎ）が使用される（ｓｏｆｔｗａｒｅ ＳｏｆｔＭａｘ Ｐｒｏ ７．０．２， Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ）。
結果
集められたＷＪ－ＭＳＣ（ＴＢ１）および単一のドナーによるＰＧＥ２の分泌のレベルを、７２時間にわたり評価した。集められた細胞におけるＰＧＥ２の分泌のベースラインレベルは、単一のドナーと比較して高かった（図７）。
実施形態の列挙されたリスト
１．ＣＯＶＩＤ－１９感染症の処置および／もしくは予防に使用するため、またはＣＯＶＩＤ－１９感染症に関連する症状の処置および／もしくは予防に使用するための、単離され、集められたアロジェニックな間葉系幹細胞（ＭＳＣ）集団であって、前記単離され、集められたアロジェニックな間葉系幹細胞が、少なくとも３名の個々のドナーに由来するＭＳＣを含み、いずれか１名のドナーに由来する細胞の数が、総細胞数の５０％を超えず、ＭＳＣが、最大１０回の継代に供されており、前記単離され、集められたアロジェニックなＭＳＣ集団が、
前記少なくとも３名超の個々のドナーからＭＳＣを培養または準備して、少なくとも３名超の個々のドナーに由来するＭＳＣ集団を得るステップと、
少なくとも３つのアッセイを使用して各個々のドナーに由来するＭＳＣ集団をアッセイして、前記各個々のドナーに由来するＭＳＣ集団の少なくとも３つのアッセイの結果を得るステップと、
各アッセイで、前記アッセイ結果に基づき個々のランキングスコアの値を前記各個々のドナー由来のＭＳＣ集団に割り当て、よって各個々のドナー由来のＭＳＣ集団の少なくとも３つの個々のランキングスコアの値を得るステップであって、高いランキングスコアの値が、より望ましいアッセイ結果を表すか、または低いランキングスコアの値が、より望ましいアッセイ結果を表す、ステップと、
前記少なくとも３つの個々のランキングスコアの値に基づき各個々のドナーに由来するＭＳＣ集団に総スコアの値を割り当てるステップであって、高いランキングスコアの値がより望ましいアッセイ結果を表す場合、高い総スコアの値がより望ましい集団特性を表すか、または低いランキングスコアの値がより望ましいアッセイ結果を表す場合、低い総スコアの値がより望ましい集団特性を表す、ステップと、
それらの総スコアの値に基づき望ましい集団特性を有する個々のドナーに由来するＭＳＣ集団のサブセットを選択するステップと、
前記選択された個々のドナーに由来するＭＳＣ集団を集めて、単離され、集められたアロジェニックなＭＳＣ集団を得るステップと
を含み、
前記少なくとも３つのアッセイのうちの少なくとも２つが、インドールアミン－２，３－ジオキシゲナーゼ（ｄｉｏｘｙｇｅｎｓａｓｅ）（ＩＤＯ）の活性を測定する１つのアッセイ；前記ＭＳＣにより分泌されるプロスタグランジンＥ２を測定する１つのアッセイ、および末梢血単核球（ＰＢＭＣ）の増殖に及ぼす前記ＭＳＣの効果を測定する１つのアッセイからなる群から選択され、
前記少なくとも３つのアッセイのうちの少なくとも１つが、免疫応答を抑制するＴ細胞の特性に及ぼす前記ＭＳＣの効果を測定する１つのアッセイ、樹状細胞の増殖および／またはアポトーシスに及ぼす前記ＭＳＣの効果を測定する１つのアッセイ、単球に及ぼす前記ＭＳＣの効果を測定する１つのアッセイ、ならびにミクログリア細胞および／またはミクログリア様細胞に及ぼす前記ＭＳＣの効果を測定する１つのアッセイからなる群から選択される、
方法により、入手可能である、単離され、集められたアロジェニックな間葉系幹細胞（ＭＳＣ）集団。
２．前記単離され、集められたアロジェニックなＭＳＣ集団が、集めるステップの後にさらに培養されていない、請求項１に記載の使用のための、単離され、集められたアロジェニックなＭＳＣ集団。
３．前記少なくとも１つのアッセイの個々のランキングスコアの値が、前記各個々のドナーに由来するＭＳＣ集団のアッセイ結果の残りの個々のドナーに由来するＭＳＣ集団の結果との比較に基づき、前記各個々のドナーに由来するＭＳＣ集団に割り当てられている、付記項１または２に記載の使用のための、単離され、集められたアロジェニックなＭＳＣ集団。
４．前記少なくとも１つのアッセイの個々のランキングスコアの値が、前記個々のドナーに由来するＭＳＣ集団で得られた絶対的なアッセイ結果に基づき、前記各個々のドナーに由来するＭＳＣ集団に割り当てられている、付記項１～３のいずれか１項に記載の使用のための、単離され、集められたアロジェニックなＭＳＣ集団。
５．前記アッセイ結果が望ましいとみなされ、前記得られた望ましいアッセイ結果を反映する個々のランキングスコアが、前記絶対的な結果が少なくとも１つの所定の値または最大で所定の値に対応する場合に、割り当てられる、付記項４に記載の使用のための、単離され、集められたアロジェニックなＭＳＣ集団。
６．望ましい集団特性を有する個々のドナーに由来するＭＳＣ集団のサブセットを選択するステップが、高い総スコアの値がより望ましい集団特性を表す場合の少なくとも１つの所定の値に対応するか、または低い総スコアの値がより望ましい集団特性を表す場合の最大での所定の値に対応する総スコアの値を有する個々のドナーに由来するＭＳＣ集団を選択するステップを含む、付記項１～５のいずれか１項に記載の使用のための、単離され、集められたアロジェニックなＭＳＣ集団。
７．前記望ましい集団特性を有する個々のドナーに由来するＭＳＣ集団のサブセットを選択するステップが、所定の数の個々のドナーに由来するＭＳＣ集団を選択するステップを含み、ここで集団は、高い総スコアの値がより望ましい集団特性を表す場合に残りの個々のドナーに由来するＭＳＣ集団と比較して高い総スコアの値を呈し、または集団は、低い総スコアの値がより望ましい集団特性を表す場合に残りの個々のドナーに由来するＭＳＣ集団と比較して低い総スコアの値を呈する、付記項１～５のいずれか１項に記載の使用のための、単離され、集められたアロジェニックなＭＳＣ集団。
８．前記ＭＳＣが、最大で７回の継代、たとえば最大で６回の継代、たとえば最大５回の継代、たとえば最大４回の継代、たとえば最大３回の継代、たとえば１、２、または３回の継代、たとえば２または３回の継代に供されている、付記項１～７のいずれか１項に記載の使用のための、単離され、集められたアロジェニックなＭＳＣ集団。
９．前記ＭＳＣが、ネイティブなＭＳＣ供給源に由来する、付記項１～８のいずれか１項に記載の使用のための、単離され、集められたアロジェニックなＭＳＣ集団。
１０．前記ＭＳＣが、骨髄由来のＭＳＣ、末梢血由来のＭＳＣ、脂肪組織由来のＭＳＣ、歯組織由来のＭＳＣ、口腔由来のＭＳＣ、胎盤由来のＭＳＣ、臍帯由来のＭＳＣ、羊水由来のＭＳＣ、臍帯血由来のＭＳＣ、ホウォートンゼリー由来のＭＳＣ、脱落膜由来のＭＳＣ、類軟骨膜（ｃｈｏｎｄｒｉｏｎ ｍｅｍｂｒａｎｅ）由来のＭＳＣ、および羊膜由来のＭＳＣからなる群；たとえば胎盤由来のＭＳＣ、臍帯由来のＭＳＣ、羊水由来のＭＳＣ、臍帯血由来のＭＳＣ、ホウォートンゼリー由来のＭＳＣ、脱落膜由来のＭＳＣ、類軟骨膜由来のＭＳＣ、歯髄由来のＭＳＣ、および羊膜由来のＭＳＣからなる群から選択される、付記項１～９のいずれか１項に記載の使用のための、単離され、集められたアロジェニックなＭＳＣ集団。
１１．前記ＭＳＣが、臍帯由来のＭＳＣおよびホウォートンゼリー由来のＭＳＣからなる群から選択され、たとえば前記ＭＳＣが、ホウォートンゼリー由来のＭＳＣである、付記項１０に記載の使用のための、単離され、集められたアロジェニックなＭＳＣ集団。
１２．前記集団が、少なくとも４名の個々のドナー、たとえば少なくとも５名の個々のドナー、たとえば少なくとも６名の個々のドナー、たとえば少なくとも７名の個々のドナー、たとえば少なくとも８名の個々のドナー、たとえば少なくとも９名の個々のドナー、たとえば少なくとも１０名の個々のドナーに由来するＭＳＣを含む、付記項１～１１のいずれか１項に記載の使用のための、単離され、集められたアロジェニックなＭＳＣ集団。
１３．前記集団が、３－２０名の個々のドナー、たとえば３－１５名の個々のドナー、たとえば３－１０名の個々のドナー、たとえば４－８名の個々のドナー、たとえば５－７名の個々のドナー、たとえば５、６、または７名の個々のドナーに由来するＭＳＣを含む、付記項１～１２のいずれか１項に記載の使用のための、単離され、集められたアロジェニックなＭＳＣ集団。
１４．前記個々のドナーに由来するＭＳＣ集団をアッセイするステップが、集めるステップで集めた個々のドナーに由来するＭＳＣ集団の数よりも少なくとも１～４倍、たとえば２～４倍、たとえば２～３または３～４倍多い個々のドナーに由来するＭＳＣ集団をアッセイするステップを含む、付記項１～１３のいずれか１項に記載の使用のための、単離され、集められたアロジェニックなＭＳＣ集団。
１５．前記個々のドナーに由来するＭＳＣ集団をアッセイするステップが、少なくとも３、たとえば少なくとも４、たとえば少なくとも５、たとえば少なくとも６、たとえば少なくとも７、たとえば少なくとも８、たとえば少なくとも９、たとえば少なくとも１０、たとえば少なくとも１１、たとえば少なくとも１２、たとえば少なくとも１３、たとえば少なくとも１４、たとえば少なくとも１５、たとえば少なくとも１６、たとえば少なくとも１７、たとえば少なくとも１８、たとえば少なくとも１９、たとえば少なくとも２０名の個々のドナーに由来するＭＳＣ集団をアッセイするステップを含む、付記項１～１４のいずれか１項に記載の使用のための、単離され、集められたアロジェニックなＭＳＣ集団。
１６．前記個々のドナーに由来するＭＳＣ集団をアッセイするステップが、約３～５０名の個々のドナーに由来するＭＳＣ集団、たとえば約４～約５０、たとえば約５～約５０、たとえば約６～約５０、たとえば約６～約３０、たとえば約６～約２０、たとえば約６～約１５、たとえば約８～約１２名の個々のドナーに由来するＭＳＣ集団をアッセイするステップを含む、付記項１～１４のいずれか１項に記載の使用のための、単離され、集められたアロジェニックなＭＳＣ集団。
１７．前記少なくとも３つのアッセイを使用して各個々のドナーに由来するＭＳＣ集団をアッセイするステップが、少なくとも１つの機能的なアッセイ、たとえば少なくとも２つの機能的なアッセイ、たとえば少なくとも３つの機能的なアッセイ、たとえば少なくとも４つの機能的なアッセイ、たとえば少なくとも５つの機能的なアッセイを使用するステップを含む、付記項１～１６のいずれか１項に記載の使用のための、単離され、集められたアロジェニックなＭＳＣ集団。
１８．前記ＩＤＯ活性を測定する少なくとも１つのアッセイが、刺激されたＰＢＭＣまたは精製されたＴ細胞または活性化された単球／マクロファージもしくはミクログリアと共培養したＭＳＣの培養物の上清の中でＩＤＯ活性を測定するステップを含む、付記項１～１７のいずれか１項に記載の使用のための、単離され、集められたアロジェニックなＭＳＣ集団。
１９．前記ＭＳＣにより分泌されるプロスタグランジンＥ２を測定する少なくとも１つのアッセイが、ＰＢＭＣ、たとえばフィトヘマグルチニン（ＰＨＡ）で刺激したＰＢＭＣ、たとえばＰＨＡで刺激したＴリンパ球と共培養、またはインターフェロンγおよび／もしくは腫瘍壊死因子αと共培養した際の、上記ＭＳＣにより分泌されるプロスタグランジンＥ２を測定するステップを含む、付記項１～１８のいずれか１項に記載の使用のための、単離され、集められたアロジェニックなＭＳＣ集団。
２０．前記ＰＢＭＣの増殖が、Ｔリンパ球の増殖、たとえばフィトヘマグルチニン（ＰＨＡ）で刺激したＴリンパ球の増殖である、付記項１～１９のいずれか１項に記載の使用のための、単離され、集められたアロジェニックなＭＳＣ集団。
２１．前記少なくとも３つのアッセイのうちの少なくとも１つが、免疫応答を抑制するＴ細胞の特性に及ぼす前記ＭＳＣの効果を測定する１つのアッセイである、付記項１～２０のいずれか１項に記載の使用のための、単離され、集められたアロジェニックなＭＳＣ集団。
２２．前記少なくとも３つのアッセイのうちの少なくとも１つが、樹状細胞の増殖および／またはアポトーシスに及ぼす前記ＭＳＣの効果を測定する１つのアッセイ、または免疫寛容原性樹状細胞に及ぼす前記ＭＳＣの効果を測定する１つのアッセイである、付記項１～２１のいずれか１項に記載の使用のための、単離され、集められたアロジェニックなＭＳＣ集団。
２３．前記少なくとも３つのアッセイのうちの少なくとも１つが、ミクログリア細胞またはミクログリア様細胞に及ぼす前記ＭＳＣの効果を測定する１つのアッセイ、ミクログリアの増殖を測定する１つのアッセイ；ミクログリアにおけるＭ１表現型に特有のマーカーの発現を測定する１つのアッセイ；ミクログリアにおけるＭ２表現型に特有のマーカーの発現を測定する１つのアッセイ；ならびにＭ１ミクログリア表現型からＭ２ミクログリア表現型への移行を測定するアッセイからなる群から選択される、付記項１～２２のいずれか１項に記載の使用のための、単離され、集められたアロジェニックなＭＳＣ集団。
２４．前記ミクログリアの増殖を測定する１つのアッセイが、ミクログリア細胞および／またはミクログリア様細胞と前記個々のドナーに由来するＭＳＣ集団の共培養を含む、付記項２３に記載の使用のための、単離され、集められたアロジェニックなＭＳＣ集団。
２５．前記ミクログリア細胞またはミクログリア様細胞が、不死化細胞株、たとえばヒトミクログリアＨＭＣ３細胞株またはＣＨＭＥ－５細胞株；生検から得た初代ミクログリア；臍帯血から培養した初代ミクログリア様細胞；および臍帯血由来の不死化したミクログリア様細胞、たとえばＤＵＯＣ－０１細胞株からなる群から選択され；たとえば不死化細胞株からなる群から選択され、たとえばＨＭＣ３細胞株、ＣＨＭＥ－５細胞株、およびＤＵＯＣ－０１細胞株からなる群から選択される、付記項２３または２４に記載の使用のための、単離され、集められたアロジェニックなＭＳＣ集団。
２６．前記ミクログリアの増殖を測定する１つのアッセイが、ミクログリア細胞の増殖の減少が、マイトジェンでの刺激、たとえばリポ多糖での刺激後に起こるかどうかをアッセイするステップ、またはリポ多糖での刺激の後にミクログリア細胞の増殖の減少を定量化するステップを含む、付記項２３～２５のいずれか１項に記載の使用のための、単離され、集められたアロジェニックなＭＳＣ集団。
２７．前記増殖が、増殖のパーセンテージとして測定されるか、増殖指数として測定されるか、または増殖指標として測定され、たとえば増殖指標として測定される、付記項２３～２６のいずれか１項に記載の使用のための、単離され、集められたアロジェニックなＭＳＣ集団。
２８．前記ミクログリアおよび／またはミクログリア様細胞におけるＭ１表現型に特有のマーカーの発現を測定する１つのアッセイが、ＣＤ１８３、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ１４、Ｂ７－２／ＣＤ８６、インテグリンαＶβ３、ＭＦＧ－Ｅ８、ＮＯ、ＲＯＳ、ＲＮＳ、ＣＣＬ２／ＭＣＰ－１、ＣＣＬ３／ＭＩＰ－１α、ＣＣＬ４／ＭＩＰ－１β、ＣＣＬ５／ＲＡＮＴＥＳ、ＣＣＬ８／ＭＣＰ－２、ＣＣＬ１１／エオタキシン、ＣＣＬ１２／ＭＣＰ－５、ＣＣＬ１５／ＭＩＰ－１δ、ＣＣＬ１９／ＭＩＰ－３β、ＣＣＬ２０／ＭＩＰ－３α、ＣＸＣＬ１／ＧＲＯα／ＫＣ／ＣＩＮＣ－１、ＣＸＣＬ９／ＭＩＧ、ＣＸＣＬ１０／ＩＰ－－１０、ＣＸＣＬ１１／Ｉ－ＴＡＣ、ＣＸＣＬ１３／ＢＬＣ／ＢＣＡ－１、ＣＸ３ＣＬ１／フラクタルカイン、ＭＭＰ－３、ＭＭＰ－９、グルタメート、ＩＬ－１β／ＩＬ－１Ｆ２、ＩＬ－２、ＩＬ－６、ＩＬ－１２、ＩＬ－１５、ＩＬ－１７／ＩＬ－１７Ａ、ＩＬ－１８／ＩＬ－１Ｆ４、ＩＬ－２３、ＩＦＮγ、ＴＮＦ－α、ＦｃγＲＩＩＩ／ＣＤ１６、ＦｃγＲＩＩ／ＣＤ３２、ＣＤ３６／ＳＲ－Ｂ３、ＣＤ４０、ＣＤ６８／ＳＲ－Ｄ１、Ｂ７－１／ＣＤ８０、ＭＨＣＩＩ、ｉＮＯＳ、およびＣＯＸ－２からなる群から選択される少なくとも１つのマーカー；たとえばＣＤ１８３、ＣＤ１１ｂ、およびＣＤ１４からなる群から選択される少なくとも１つのマーカーの発現を測定するステップを含む、付記項２３～２７のいずれか１項に記載の使用のための、単離され、集められたアロジェニックなＭＳＣ集団。
２９．前記ミクログリアおよび／またはミクログリア様細胞におけるＭ１表現型に特有のマーカーの発現を測定する１つのアッセイが、少なくともＣＤ１８３の発現を測定するステップを含む、付記項２８に記載の使用のための、単離され、集められたアロジェニックなＭＳＣ集団。
３０．発現が前記ミクログリアおよび／またはミクログリア様細胞におけるＭ１表現型に特有のマーカーの発現を測定する１つのアッセイにより測定されるマーカーの少なくとも１つの発現の減少が、望ましい結果を表す、付記項２８～２９のいずれか１項に記載の使用のための、単離され、集められたアロジェニックなＭＳＣ集団。
３１．前記ミクログリアおよび／またはミクログリア様細胞におけるＭ２表現型に特有のマーカーの発現を測定する１つのアッセイが、ＣＸ３ＣＲ１、ＣＤ２００Ｒ、ＣＤ２０６、ＩＬ－１Ｒａ／ＩＬ－１Ｆ３、ＩＬ－４、ＩＬ－１０、ＩＬ－１３、ＴＧＦ－β、ＣＣＬ１３／ＭＣＰ－４、ＣＣＬ１４、ＣＣＬ１７／ＴＡＲＣ、ＣＣＬ１８／ＰＡＲＣ、ＣＣＬ２２／ＭＤＣ、ＣＣＬ２３／ＭＰＩＦ－１、ＣＣＬ２４／エオタキシン－２／ＭＰＩＦ－２、ＣＣＬ２６／エオタキシン－３、ＦＩＺＺ１／ＲＥＬＭα、ＹＭ１／キチナーゼ３－様３、ＣＬＥＣ１０Ａ／ＣＤ３０１、ＭＭＲ／ＣＤ２０６、ＳＲ－ＡＩ／ＭＳＲ、ＣＤ１６３、アルギナーゼ１／ＡＲＧ１、トランスグルタミナーゼ２／ＴＧＭ２、ＰＰＡＲ、およびγ／ＮＲ１Ｃ３からなる群から選択される少なくとも１つのマーカー；たとえばＣＸ３ＣＲ１、ＣＤ２００Ｒ、およびＣＤ２０６からなる群から選択される少なくとも１つのマーカーの発現を測定するステップを含む、付記項２３～２７のいずれか１項に記載の使用のための、単離され、集められたアロジェニックなＭＳＣ集団。
３２．前記ミクログリアおよび／またはミクログリア様細胞におけるＭ２表現型に特有のマーカーの発現を測定する１つのアッセイが、少なくともＣＤ２００Ｒの発現を測定するステップを含む、付記項３１に記載の使用のための、単離され、集められたアロジェニックなＭＳＣ集団。
３３．発現が前記ミクログリアおよび／またはミクログリア様細胞におけるＭ２表現型に特有のマーカーの発現を測定する１つのアッセイにより測定されるマーカーの少なくとも１つの発現の増大が、望ましい結果を表す、付記項３１～３２のいずれか１項に記載の使用のための、単離され、集められたアロジェニックなＭＳＣ集団。
３４．前記Ｍ１ミクログリア表現型からＭ２ミクログリア表現型への移行が、付記項２８～２９のいずれか１項に定義されるマーカーのうちのいずれか１つ以上の発現の減少、および付記項３１～３２のいずれか１項に定義されるマーカーのうちのいずれか１つ以上の発現の増大として測定される、付記項２８～３３のいずれか１項に記載の使用のための、単離され、集められたアロジェニックなＭＳＣ集団。
３５．前記Ｍ１ミクログリア表現型からＭ２ミクログリア表現型への移行が、ＣＤ１８３、ＣＤ１１ｂ、およびＣＤ１４から選択されるマーカーのいずれか１つ以上の発現の減少、ならびにＣＸ３ＣＲ１、ＣＤ２００Ｒ、およびＣＤ２０６から選択されるマーカーのいずれか１つ以上の発現の増大として測定され、たとえば前記Ｍ１ミクログリア表現型からＭ２ミクログリア表現型への移行が、ＣＤ１８３の発現の減少およびＣＤ２００Ｒの発現の増大として測定される、付記項３４に記載の使用のための、単離され、集められたアロジェニックなＭＳＣ集団。
３６．前記Ｍ１ミクログリア表現型からＭ２ミクログリア表現型への移行が、望ましい結果を表す、付記項３４～３５のいずれか１項に記載の使用のための、単離され、集められたアロジェニックなＭＳＣ集団。
３７．前記単球に及ぼす前記ＭＳＣの効果を測定する１つのアッセイが、前記ＭＳＣに応答した古典的な単球から非古典的な単球への移行を測定するステップを含み、たとえば再生表現型へ向かう単球の移行に及ぼす前記ＭＳＣの作用を測定する、付記項１～３６のいずれか１項に記載の使用のための、単離され、集められたアロジェニックなＭＳＣ集団。
３８．前記少なくとも３つのアッセイが、ＩＦＮγ、腫瘍壊死因子α、アラム、ＩＬ－１０、ＰＨＡ、および／またはＧＡＢＡに応答、たとえばＩＦＮγ、ＩＬ－１０、および／またはＰＨＡに応答した前記ＭＳＣのＨＬＡ－Ｇ発現を測定する少なくとも１つのアッセイをさらに含む、付記項１～３７のいずれか１項に記載の使用のための、単離され、集められたアロジェニックなＭＳＣ集団。
３９．前記少なくとも３つのアッセイが、タンパク質の発現および／またはサイトカインの発現を測定する少なくとも１つのアッセイをさらに含む、付記項１～３８のいずれか１項に記載の使用のための、単離され、集められたアロジェニックなＭＳＣ集団。
４０．前記タンパク質発現および／またはサイトカイン発現を測定する少なくとも１つのアッセイが、ＩＬ－２、ＩＬ－４、ＩＬ－６、ＩＬ－８、ＩＬ－１２、ＩＬ－１２／１３、ＩＬ１７Ａ、ＩＬ－２１、ＩＬ－２２、ＩＬ－２９、ＩＬ－３１、ＴＧＦβ、ＶＥＧＦ、ＦＧＦ、ＧＭ－ＣＳＦ、ＩＦＮα、ＩＦＮΓ、ａｐｏＥ、およびＴＮＦαからなる群、たとえばＩＬ－６、ＩＬ－８、ＧＭ－ＣＳＦ、およびＴＧＦβからなる群、たとえば少なくともＩＬ－６からなる群から選択される１つまたはいくつかのタンパク質またはサイトカインの発現を測定し、前記タンパク質発現および／またはサイトカイン発現を測定する少なくとも１つのアッセイが、ＩＬ－２、ＩＬ－４、ＩＬ－６、ＩＬ－８、ＩＬ－１２、ＩＬ－１２／１３、ＩＬ１７Ａ、ＩＬ－２１、ＩＬ－２２、ＩＬ－２９、ＩＬ－３１、ＴＧＦβ、ＶＥＧＦ、ＦＧＦ、ＧＭ－ＣＳＦ、ＩＦＮα、ＩＦＮγ、ａｐｏＥ、およびＴＮＦα、およびＡＣＥ２受容体およびＴＭＰＲＳＳ２からなる群、たとえばＩＬ－６、ＩＬ－８、ＧＭ－ＣＳＦ、ＴＧＦβ、ＡＣＥ２受容体、およびＴＭＰＲＳＳ２からなる群、たとえば少なくともＡＣＥ２受容体およびＴＭＰＲＳＳ２からなる群から選択される１つまたはいくつかのタンパク質またはサイトカインを測定する、付記項３９に記載の使用のための、単離され、集められたアロジェニックなＭＳＣ集団。
４１．前記タンパク質および／またはサイトカインの少なくとも２、たとえば少なくとも３、たとえば少なくとも４、たとえば少なくとも５、たとえば少なくとも６、たとえば少なくとも７、たとえば少なくとも８、たとえば少なくとも９、たとえば少なくとも１０、たとえば少なくとも１１、たとえば少なくとも１２、たとえば少なくとも１３、たとえば少なくとも１４、たとえば少なくとも１５、たとえば少なくとも１６、たとえば少なくとも１７、たとえば少なくとも１８、たとえば１９全ての発現が測定される、付記項４０に記載の使用のための、単離され、集められたアロジェニックなＭＳＣ集団。
４２．前記発現が、少なくとも１つの刺激の非存在下および／または存在下で測定される、付記項３９～４１のいずれか１項に記載の使用のための、単離され、集められたアロジェニックなＭＳＣ集団。
４３．前記刺激が、免疫応答を改変する刺激である、付記項４２に記載の使用のための、単離され、集められたアロジェニックなＭＳＣ集団。
４４．前記免疫応答を改変する刺激が、ＰＢＭＣ；刺激されたＰＢＭＣ、たとえばＰＨＡ、ＩＬ１０、γ－アミノ酪酸（ＧＡＢＡ）、抗ＣＤ２、 抗－ＣＤ３、抗－ＣＤ２８、アラム、および／またはインターフェロンγ（ＩＦＮγ）で刺激したＰＢＭＣからなる群から選択される、付記項４３に記載の使用のための、単離され、集められたアロジェニックなＭＳＣ集団。
４５．前記免疫応答を改変する刺激が、γ－アミノ酪酸（ＧＡＢＡ）であるか、または前記免疫応答を改変する刺激が、γ－アミノ酪酸（ＧＡＢＡ）で刺激されたＰＢＭＣである、付記項４３または４４に記載の使用のための、単離され、集められたアロジェニックなＭＳＣ集団。
４６．前記刺激が、サイトカイン、たとえばインターフェロンγ（ＩＦＮγ）である、付記項４２～４４に記載の使用のための、単離され、集められたアロジェニックなＭＳＣ集団。
４７．刺激が、ポリイノシン／ポリシチジン酸（Ｐｏｌｙ Ｉ：Ｃ）、レシキモド（ｒ８４８）、γ－アミノ酪酸（ＧＡＢＡ）、およびＩＦＮγからなる群、たとえばＰｏｌｙ Ｉ：ＣおよびＩＦＮγからなる群から選択される、付記項４２～４６のいずれか１項に記載の使用のための、単離され、集められたアロジェニックなＭＳＣ集団。
４８．刺激が、ＰＢＭＣ、たとえば刺激されたかまたは刺激されていないＰＢＭＣ、たとえばＰＨＡで刺激されたＰＢＭＣ、たとえばＰＨＡで刺激されたＴリンパ球である、付記項４２～４４のいずれか１項に記載の使用のための、単離され、集められたアロジェニックなＭＳＣ集団。
４９．前記少なくとも３つのアッセイが、少なくとも１つの形態学的なアッセイを含む、付記項１～４８のいずれか１項に記載の使用のための、単離され、集められたアロジェニックなＭＳＣ集団。
５０．前記形態学的なアッセイが、細胞および／または細胞の核の形態学的な特性をアッセイする、付記項４９に記載の使用のための、単離され、集められたアロジェニックなＭＳＣ集団。
５１．前記細胞および／または細胞の核の形態学的な特性が、細胞の大きさ、核の大きさ、細胞の形状、ならびに細胞および核の大きさの間の比率からなる群から選択される１つ以上の特性である、付記項５０に記載の使用のための、単離され、集められたアロジェニックなＭＳＣ集団。
５２．個々のドナーに由来するＭＳＣ集団が、９０％以上、たとえば少なくとも９１％、たとえば少なくとも９２％、たとえば少なくとも９３％、たとえば少なくとも９４％、たとえば少なくとも９５％、たとえば少なくとも９６％、たとえば少なくとも９７％、たとえば少なくとも９８％、たとえば少なくとも９９％の正常な細胞および／または核を呈する場合のみ、集めることに適格がある、付記項４９～５１のいずれか１項に記載の使用のための、単離され、集められたアロジェニックなＭＳＣ集団。
５３．前記少なくとも３つのアッセイを使用して各個々のドナーに由来するＭＳＣ集団をアッセイするステップが、ＭＳＣ集団が、継代０（ｐ０）～継代８（ｐ８）、たとえばｐ１～ｐ５、たとえばｐ１～ｐ４、たとえばｐ２～ｐ４、またはｐ１～ｐ４、たとえばｐ１、ｐ２、および／またはｐ３、たとえばｐ２および／またはｐ３にある際に行われる、付記項１～５２のいずれか１項に記載の使用のための、単離され、集められたアロジェニックなＭＳＣ集団。
５４．少なくとも１つのアッセイ、たとえば少なくとも２つのアッセイ、たとえば少なくとも３つのアッセイ、たとえば全てのアッセイが、細胞が集められる際と同じ継代にある際に行われる、付記項１～５３のいずれか１項に記載の使用のための、単離され、集められたアロジェニックなＭＳＣ集団。
５５．少なくとも２つのアッセイが、異なる継代で行われる、付記項１～５３のいずれか１項に記載の使用のための、単離され、集められたアロジェニックなＭＳＣ集団。
５６．前記各個々のドナーに由来するＭＳＣ集団に割り当てられた総スコアの値が、各個々のドナーに由来するＭＳＣ集団のランキングスコアの値の加算により得られる追加の総スコアの値である、付記項１～５５のいずれか１項に記載の使用のための、単離され、集められたアロジェニックなＭＳＣ集団。
５７．前記各個々のドナーに由来するＭＳＣ集団に割り当てられた総スコアの値が、１）重みを、各アッセイのランキングスコアの値に割り当て、２）個々のドナーに由来するＭＳＣ集団の重み付けされたランキングスコアの値を加算することにより得られる、重み付けした総スコアの値である、付記項１～５５のいずれか１項に記載の使用のための、単離され、集められたアロジェニックなＭＳＣ集団。
５８．前記望ましい集団特性を有する個々のドナーに由来するＭＳＣ集団のサブセットを選択するステップが、少なくとも３、たとえば少なくとも４、たとえば少なくとも４、たとえば少なくとも５、たとえば少なくとも６、たとえば少なくとも７、たとえば少なくとも８、たとえば少なくとも９、たとえば少なくとも１０名の個々のドナーに由来するＭＳＣ集団を選択するステップを含む、付記項１～５７のいずれか１項に記載の使用のための、単離され、集められたアロジェニックなＭＳＣ集団。
５９．集団において、いずれか１名のドナーに由来する細胞数が、総細胞数の４５％未満、たとえば４０％未満、たとえば３５％未満であり、前記集団が、少なくとも３名のドナーに由来するＭＳＣを含み；たとえば集団において、いずれか１名のドナーに由来する細胞数が、総細胞数の４０％未満、たとえば３５％未満、たとえば３０％未満であり、前記集団が、少なくとも４名のドナーに由来するＭＳＣを含み；たとえば集団において、いずれか１名のドナーに由来する細胞数が、総細胞数の３５％未満、たとえば３０％未満、たとえば２５％未満であり、前記集団が、少なくとも５名のドナーに由来するＭＳＣを含み；たとえば集団において、いずれか１名のドナーに由来する細胞数が、総細胞数の３０％未満、たとえば２５％未満、たとえば２０％未満であり、前記集団が、少なくとも６名のドナーに由来するＭＳＣを含み；たとえば集団において、いずれか１名のドナーに由来する細胞数が、総細胞数の２５％未満、たとえば２２％未満、たとえば２０％未満であり、前記集団が、少なくとも７名のドナーに由来するＭＳＣを含む、付記項１～５８のいずれか１項に記載の使用のための、単離され、集められたアロジェニックなＭＳＣ集団。
６０．集団において、いずれか１名のドナーに由来する細胞数が、他のいずれかのドナーに由来する細胞数の４倍、たとえば３倍、たとえば２倍未満である、付記項１～５９のいずれか１項に記載の使用のための、単離され、集められたアロジェニックなＭＳＣ集団。
６１．前記方法が、前記個々のドナーに由来するＭＳＣ集団のアッセイ結果が、付記項１～６０のいずれか１項に定義される方法により以前に得られた集められたアロジェニックなＭＳＣ集団の対応するアッセイ結果より望ましくない場合、集めるステップから、個々のドナーに由来するＭＳＣ集団を廃棄するステップをさらに含む、付記項１～６０のいずれか１項に記載の使用のための、単離され、集められたアロジェニックなＭＳＣ集団。
６２．前記ＭＳＣが、ネイティブなＭＳＣ供給源から得られている、付記項１～６１のいずれか１項に記載の使用のための、単離され、集められたアロジェニックなＭＳＣ集団。
６３．前記集められた集団が、個々のドナーに由来するＭＳＣ集団、たとえばアッセイした各個々のドナーに由来するＭＳＣ集団、たとえば集めるため選択された各個々のドナーに由来するＭＳＣ集団と比較して、高い免疫抑制および／または免疫調節の可能性を呈する、付記項１～６２のいずれか１項に記載の使用のための、単離され、集められたアロジェニックなＭＳＣ集団。
６４．前記高い免疫抑制および／または免疫調節の可能性が、刺激されていないＭＳＣによるＩＤＯの発現として測定される、付記項６３に記載の使用のための、単離され、集められたアロジェニックなＭＳＣ集団。
６５．前記高い免疫抑制および／または免疫調節の可能性が、刺激されていないＭＳＣによるＰＧＥ２の発現として測定される、付記項６３または６４に記載の使用のための、単離され、集められたアロジェニックなＭＳＣ集団。
６６．前記集団が、統計上有意なバッチ間のばらつきを呈さない、付記項１または６５に記載の使用のための、単離され、集められたアロジェニックなＭＳＣ集団。
６７．前記ＣＯＶＩＤ－１９感染症に関連する症状の処置および／または予防が、ＣＯＶＩＤ－１９感染症に関連する神経性症状の処置および／または予防である、付記項１～６６のいずれか１項に記載の使用のための、単離され、集められたアロジェニックなＭＳＣ集団。
６８．前記長期のＣＯＶＩＤ－１９感染症に関連する症状の処置および／または予防が、長期のＣＯＶＩＤ－１９感染症に関連する神経性症状の処置および／または予防、たとえば長期のＣＯＶＩＤ－１９感染症に関連する炎症および／または脱髄の処置および／または予防である、付記項１～６６のいずれか１項に記載の使用のための、単離され、集められたアロジェニックなＭＳＣ集団。
６９．前記ＣＯＶＩＤ－１９感染症に関連する神経性症状の処置および／または予防が、ＣＯＶＩＤ－１９感染症に関連する炎症および／または脱髄の処置および／または予防である、付記項１～６７のいずれか１項に記載の使用のための、単離され、集められたアロジェニックなＭＳＣ集団。
７０．前記使用が、それを必要とする患者への注入または注射としての前記ＭＳＣ集団の投与を含む、付記項１～６９のいずれか１項に記載の使用のための、単離され、集められたアロジェニックなＭＳＣ集団。
７１．前記注入または注射が、静脈内、腹腔内、リンパ内、静脈内、髄腔内、脳内、動脈内、皮下、またはＯｍｍａｙａリザーバーを介して；たとえば静脈内、腹腔内、またはリンパ内、たとえば静脈内にて投与される、付記項７０に記載の使用のための、単離され、集められたアロジェニックなＭＳＣ集団。
７２．前記注入または注射が、髄腔内または脳内または静脈内にて投与される、付記項７０または７１に記載の使用のための、単離され、集められたアロジェニックなＭＳＣ集団。
７３．前記注入が、反復して行われる、付記項７０～７２のいずれか１項に記載の使用のための、単離され、集められたアロジェニックなＭＳＣ集団。
７４．前記注入が、１回のみ行われる、付記項７０～７２のいずれか１項に記載の使用のための、単離され、集められたアロジェニックなＭＳＣ集団。
７５．前記集めた後の集団が、炎症誘発性化合物、たとえばＩＦＮγ、腫瘍壊死因子α、および／またはアラムに、投与前最大約１時間または投与前の約１～約２４時間、曝露されている、付記項１～７４のいずれか１項に記載の使用のための、単離され、集められたアロジェニックなＭＳＣ集団。
７６．前記ＭＳＣ集団の投与が、患者において抗ＨＬＡ抗体を誘導しないかまたは抗ＨＬＡ抗体の誘導が少ない、付記項１～７５のいずれか１項に記載の使用のための、単離され、集められたアロジェニックなＭＳＣ集団。
７７．前記使用が、およそ少なくとも３×１０６個の細胞、たとえばおよそ少なくとも５×１０６個の細胞、たとえばおよそ少なくとも１０×１０６個の細胞、たとえばおよそ少なくとも１５×１０６個の細胞、たとえばおよそ少なくとも２０×１０６個の細胞、たとえばおよそ少なくとも２５×１０６個の細胞、たとえばおよそ少なくとも３０×１０６個の細胞、たとえばおよそ少なくとも５０×１０６個の細胞、たとえばおよそ少なくとも約６０×１０６個の細胞、たとえばおよそ少なくとも約７５×１０６個の細胞、たとえばおよそ少なくとも約１００×１０６個の細胞、たとえばおよそ少なくとも約１５０×１０６個の細胞、たとえばおよそ少なくとも約２００×１０６個の細胞の用量の前記患者への投与を含む、付記項１～７６のいずれか１項に記載の使用のための、単離され、集められたアロジェニックなＭＳＣ集団。
７８．前記使用が、およそ少なくとも０．１×１０６個の細胞／ｋｇ体重、たとえばおよそ少なくとも０，３×１０６個の細胞／ｋｇ体重、たとえばおよそ少なくとも０，５×１０６個の細胞／ｋｇ体重、たとえばおよそ少なくとも０，７５×１０６個の細胞／ｋｇ体重、たとえばおよそ少なくとも１×１０６個の細胞／ｋｇ体重、たとえばおよそ少なくとも１，２×１０６個の細胞／ｋｇ体重の用量の前記患者への投与を含む、付記項１～７７のいずれか１項に記載の使用のための、単離され、集められたアロジェニックなＭＳＣ集団。
７９．前記使用が、約０．１×１０６個の細胞／ｋｇ体重～約１０×１０６個の細胞／ｋｇ体重、たとえば約０．１５×１０６個の細胞／ｋｇ体重～約４×１０６個の細胞／ｋｇ体重、たとえば約０．２０×１０６個の細胞／ｋｇ体重～約４×１０６個の細胞／ｋｇ体重、たとえば約０．２５×１０６個の細胞／ｋｇ体重～約４×１０６個の細胞／ｋｇ体重、たとえば約０．３×１０６個の細胞／ｋｇ体重～約４×１０６個の細胞／ｋｇ体重、たとえば約０．２５×１０６個の細胞／ｋｇ体重～約３×１０６個の細胞／ｋｇ体重、たとえば約０．２５×１０６個の細胞／ｋｇ体重～約２×１０６個の細胞／ｋｇ体重、または約０．３×１０６個の細胞／ｋｇ体重～約１．２×１０６個の細胞／ｋｇ体重の用量の前記患者への投与を含む、付記項１～７８のいずれか１項に記載の使用のための、単離され、集められたアロジェニックなＭＳＣ集団。
８０．付記項１～７９のいずれか１項に記載の使用のための、単離され、集められたアロジェニックなＭＳＣ集団と、少なくとも１つの薬学的に許容される賦形剤または担体とを含む、医薬組成物。
８１．およそ少なくとも３×１０６個の細胞、たとえばおよそ少なくとも５×１０６個の細胞、たとえばおよそ少なくとも１０×１０６個の細胞、たとえばおよそ少なくとも１５×１０６個の細胞、たとえばおよそ少なくとも２０×１０６個の細胞、たとえばおよそ少なくとも２５×１０６個の細胞、たとえばおよそ少なくとも３０×１０６個の細胞、たとえばおよそ少なくとも５０×１０６個の細胞、たとえばおよそ少なくとも約６０×１０６個の細胞、たとえばおよそ少なくとも約７５×１０６個の細胞、たとえばおよそ少なくとも約１００×１０６個の細胞、たとえばおよそ少なくとも約１５０×１０６個の細胞、たとえばおよそ少なくとも約２００×１０６個の細胞を含む、付記項８０に記載の医薬組成物。
８２．注入のため、たとえば静脈内注入、腹腔内注入、リンパ内（ｉｎｔｒａｌｙｍｐｈａｔｉｃａｌ）注入、静脈内注入、脳内注入、髄腔内注入、脳内注入、動脈内注入、皮下注入またはＯｍｍａｙａリザーバーを介した注入；たとえば脳内または髄腔内注入、たとえば静脈内注入のために製剤化された、付記項７９～８０のいずれか１項に記載の医薬組成物。
８３．ＣＯＶＩＤ－１９感染症であるかまたはＣＯＶＩＤ－１９感染症に関連する疾患または病態の処置および／または予防のための方法であって、付記項１～７９のいずれか１項に記載の単離され、集められたアロジェニックなＭＳＣ集団または付記項８０～８２のいずれか１項に記載の医薬組成物の治療上有効量を、それを必要とする患者に投与するステップを含む、方法。
８４．前記疾患または病態が、ＣＯＶＩＤ－１９感染症に関連する神経性症状である、付記項８３に記載の疾患または病態の処置および／または予防のための方法。
８５．前記疾患または病態が、ＣＯＶＩＤ－１９感染症に関連する炎症および／または脱髄である、付記項８３～８４のいずれか１項に記載の疾患または病態の処置および／または予防のための方法。
８６．前記ＭＳＣ集団の投与が、注入、たとえば静脈内注入、腹腔内注入、リンパ内（ｉｎｔｒａｌｙｍｐｈａｔｉｃａｌ）注入、静脈内注入、髄腔内注入、脳内注入、動脈内注入、皮下注入またはＯｍｍａｙａリザーバーを介した注入；たとえば髄腔内注入または脳内注入、たとえば静脈内注入によるものである、付記項８３～８５のいずれか１項に記載の処置および／または予防のための方法。
８７．前記注入が、反復して行われる、付記項８６に記載の処置および／または予防のための方法。
８８．前記注入が、１回のみ行われる、付記項８６に記載の処置および／または予防のための方法。
８９．前記集めた後の集団が、炎症誘発性化合物、たとえばＩＦＮγ、腫瘍壊死因子α、および／またはアラムに、投与前最大約１時間または投与前の約１～約２４時間、曝露されている、付記項８３～８８のいずれか１項に記載の処置および／または予防のための方法。
９０．前記投与が、患者において抗ＨＬＡ抗体を誘導しないかまたは抗ＨＬＡ抗体の誘導が少ない、付記項８３～８９のいずれか１項に記載の処置および／または予防のための方法。
９１．前記方法が、およそ少なくとも３×１０６個の細胞、たとえばおよそ少なくとも５×１０６個の細胞、たとえばおよそ少なくとも１０×１０６個の細胞、たとえばおよそ少なくとも１５×１０６個の細胞、たとえばおよそ少なくとも２０×１０６個の細胞、たとえばおよそ少なくとも２５×１０６個の細胞、たとえばおよそ少なくとも３０×１０６個の細胞、たとえばおよそ少なくとも５０×１０６個の細胞、たとえばおよそ少なくとも約６０×１０６個の細胞、たとえばおよそ少なくとも約７５×１０６個の細胞、たとえばおよそ少なくとも約１００×１０６個の細胞、たとえばおよそ少なくとも約１５０×１０６個の細胞、たとえばおよそ少なくとも約２００×１０６個の細胞の用量を前記患者に投与するステップを含む、付記項８３～９０のいずれか１項に記載の処置および／または予防のための方法。
９２．前記方法が、およそ少なくとも０．１×１０６個の細胞／ｋｇ体重、たとえばおよそ少なくとも０，３×１０６個の細胞／ｋｇ体重、たとえばおよそ少なくとも０，５×１０６個の細胞／ｋｇ体重、たとえばおよそ少なくとも０，７５×１０６個の細胞／ｋｇ体重、たとえばおよそ少なくとも１×１０６個の細胞／ｋｇ体重、たとえばおよそ少なくとも１，２×１０６個の細胞／ｋｇ体重の用量を前記患者に投与するステップを含む、付記項８３～９１のいずれか１項に記載の処置および／または予防のための方法。
９３．前記方法が、約０．１×１０６個の細胞／ｋｇ体重～約１０×１０６個の細胞／ｋｇ体重、たとえば約０．１５×１０６個の細胞／ｋｇ体重～約４×１０６個の細胞／ｋｇ体重、たとえば約０．２０×１０６個の細胞／ｋｇ体重～約４×１０６個の細胞／ｋｇ体重、たとえば約０．２５×１０６個の細胞／ｋｇ体重～約４×１０６個の細胞／ｋｇ体重、たとえば約０．３×１０６個の細胞／ｋｇ体重～約４×１０６個の細胞／ｋｇ体重、たとえば約０．２５×１０６個の細胞／ｋｇ体重～約３×１０６個の細胞／ｋｇ体重、たとえば約０．２５×１０６個の細胞／ｋｇ体重～約２×１０６個の細胞／ｋｇ体重、または約０．３×１０６個の細胞／ｋｇ体重～約１．２×１０６個の細胞／ｋｇ体重の用量を前記患者に投与するステップを含む、付記項８３～９２のいずれか１項に記載の処置および／または予防のための方法。
９４．ＣＯＶＩＤ－１９感染症およびＣＯＶＩＤ－１９感染症に関連する病態、たとえばＣＯＶＩＤ－１９感染症に関連する神経性症状、ＣＯＶＩＤ－１９感染症に関連する炎症および／またはＣＯＶＩＤ－１９感染症に関連する脱髄からなる群から選択される疾患または病態の処置のための医薬の製造における、付記項１～７９のいずれか１項に定義される単離され、集められたアロジェニックなＭＳＣ集団の使用。
９５．ＣＯＶＩＤ－１９感染症およびＣＯＶＩＤ－１９感染症に関連する病態、たとえばＣＯＶＩＤ－１９感染症に関連する神経性症状、ＣＯＶＩＤ－１９感染症に関連する炎症および／またはＣＯＶＩＤ－１９感染症に関連する脱髄からなる群から選択される疾患または病態の処置のための方法であって、
本明細書中定義される方法を使用して単離され、集められたアロジェニックなＭＳＣ集団を得るステップと、
前記単離され、集められたアロジェニックなＭＳＣ集団または前記単離され、集められたアロジェニックなＭＳＣ集団を含む医薬組成物の治療上有効量を、それを必要とする患者に投与するステップと
を含む、方法。

Claims (17)

  1. ＣＯＶＩＤ－１９感染症の処置および／もしくは予防に使用するため、またはＣＯＶＩＤ－１９感染症に関連する症状の処置および／もしくは予防に使用するための、単離され、集められたアロジェニックな間葉系幹細胞（ＭＳＣ）集団であって、前記単離され、集められたアロジェニックなＭＳＣ集団が、少なくとも３名の個々のドナーに由来するＭＳＣを含み、いずれか１名のドナーに由来する細胞の数が、総細胞数の５０％を超えず、ＭＳＣが、最大１０回の継代に供されており、前記単離され、集められたアロジェニックなＭＳＣ集団が、
    前記少なくとも３名超の個々のドナーからのＭＳＣを培養または準備して、少なくとも３名超の個々のドナーに由来するＭＳＣ集団を得るステップと、
    少なくとも３つのアッセイを使用して各個々のドナーに由来するＭＳＣ集団をアッセイして、前記各個々のドナーに由来するＭＳＣ集団の少なくとも３つのアッセイの結果を得るステップと、
    各アッセイで、前記アッセイ結果に基づき個々のランキングスコアの値を前記各個々のドナー由来のＭＳＣ集団に割り当て、よって各個々のドナー由来のＭＳＣ集団の少なくとも３つの個々のランキングスコアの値を得るステップであって、高いランキングスコアの値が、より望ましいアッセイ結果を表すか、または低いランキングスコアの値が、より望ましいアッセイ結果を表す、ステップと、
    前記少なくとも３つの個々のランキングスコアの値に基づき各個々のドナーに由来するＭＳＣ集団に総スコアの値を割り当てるステップであって、高いランキングスコアの値がより望ましいアッセイ結果を表す場合、高い総スコアの値がより望ましい集団特性を表すか、または低いランキングスコアの値がより望ましいアッセイ結果を表す場合、低い総スコアの値がより望ましい集団特性を表す、ステップと、
    それらの総スコアの値に基づき望ましい集団特性を有する個々のドナーに由来するＭＳＣ集団のサブセットを選択するステップと、
    前記選択された個々のドナーに由来するＭＳＣ集団を集めて、単離され、集められたアロジェニックなＭＳＣ集団を得るステップと
    を含み、
    前記少なくとも３つのアッセイのうちの少なくとも２つが、インドールアミン－２，３－ジオキシゲナーゼ（ｄｉｏｘｙｇｅｎｓａｓｅ）（ＩＤＯ）の活性を測定する１つのアッセイ、前記ＭＳＣにより分泌されるプロスタグランジンＥ２を測定する１つのアッセイ、および末梢血単核球（ＰＢＭＣ）の増殖に及ぼす前記ＭＳＣの効果を測定する１つのアッセイからなる群から選択され、
    前記少なくとも３つのアッセイのうちの少なくとも１つが、単球に及ぼす前記ＭＳＣの効果を測定する１つのアッセイであり、
    前記単離され、集められたアロジェニックなＭＳＣ集団が、集めるステップの後にさらに培養されない、
    方法により、入手可能である、
    単離され、集められたアロジェニックな間葉系幹細胞（ＭＳＣ）集団。
  2. 前記方法が、たとえばＩＦＮγ、腫瘍壊死因子α、および／またはアラムの存在下といった、炎症誘発性因子の存在に、前記単離され、集められたアロジェニックなＭＳＣ集団を曝露するステップをさらに含む、請求項１記載の使用のための、単離され、集められたアロジェニックなＭＳＣ集団。
  3. 前記曝露が、投与の前の最大約１時間または投与前の約１～約２４時間の期間の間にある、請求項２に記載の使用のための、単離され、集められたアロジェニックなＭＳＣ集団。
  4. 前記ＭＳＣが、ネイティブなＭＳＣ供給源に由来する、請求項１～３のいずれか１項に記載の使用のための、単離され、集められたアロジェニックなＭＳＣ集団。
  5. 前記ＭＳＣが、臍帯由来のＭＳＣおよびホウォートンゼリー由来のＭＳＣからなる群から選択される、請求項１～４のいずれか１項に記載の使用のための、単離され、集められたアロジェニックなＭＳＣ集団。
  6. 前記ＭＳＣが、ホウォートンゼリー由来のＭＳＣである、請求項１～５のいずれか１項に記載の使用のための、単離され、集められたアロジェニックなＭＳＣ集団。
  7. 前記集団が、少なくとも４名の個々のドナー、たとえば少なくとも５名の個々のドナー、たとえば少なくとも６名の個々のドナー、たとえば少なくとも７名の個々のドナー、たとえば少なくとも８名の個々のドナー、たとえば少なくとも９名の個々のドナー、たとえば少なくとも１０名の個々のドナーに由来するＭＳＣを含む、請求項１～６のいずれか１項に記載の使用のための、単離され、集められたアロジェニックなＭＳＣ集団。
  8. 前記集められた集団が、個々のドナーに由来するＭＳＣ集団、たとえばアッセイされた各個々のドナーに由来するＭＳＣ集団、またはたとえば集めるために選択された各個々のドナーに由来するＭＳＣ集団と比較して、高い免疫抑制および／または免疫調節の可能性を呈する、請求項１～７のいずれか１項に記載の使用のための、単離され、集められたアロジェニックなＭＳＣ集団。
  9. 前記免疫抑制および／または免疫調節の可能性が、刺激されていないＭＳＣによるＩＤＯの発現として測定される、請求項８に記載の使用のための、単離され、集められたアロジェニックなＭＳＣ集団。
  10. 前記免疫抑制および／または免疫調節の可能性が、刺激されていないＭＳＣによるＰＧＥ２の発現として測定される、請求項８～９のいずれか１項に記載の使用のための、単離され、集められたアロジェニックなＭＳＣ集団。
  11. 前記免疫抑制および／または免疫調節の可能性の亢進が、個々のドナーに由来するＭＳＣ集団と比較して、少なくとも約５％、たとえば少なくとも１０％、たとえば少なくとも１５％である、請求項８～１０のいずれか１項に記載の使用のための、単離され、集められたアロジェニックなＭＳＣ集団。
  12. 前記ＣＯＶＩＤ－１９感染症に関連する症状の処置および／または予防が、ＣＯＶＩＤ－１９感染症に関連する神経性の症状の処置および／または予防である、請求項１～１１のいずれか１項に記載の使用のための、単離され、集められたアロジェニックなＭＳＣ集団。
  13. 前記ＣＯＶＩＤ－１９感染症に関連する神経性の症状の処置および／または予防が、ＣＯＶＩＤ－１９感染症に関連する炎症および／または脱髄の処置および／または予防である、請求項１２に記載の使用のための、単離され、集められたアロジェニックなＭＳＣ集団。
  14. 前記ＣＯＶＩＤ－１９感染症に関連する症状の処置および／または予防が、長期のＣＯＶＩＤ－１９感染症に関連する症状、たとえば長期のＣＯＶＩＤ－１９感染症に関連する神経性の症状の処置および／または予防である、請求項１～１１のいずれか１項に記載の使用のための、単離され、集められたアロジェニックなＭＳＣ集団。
  15. 前記使用が、前記単離され、集められたアロジェニックなＭＳＣ集団を、投与前に炎症性誘発性因子の存在に曝露するステップ、たとえば前記単離され、集められたアロジェニックなＭＳＣ集団を、投与前に、投与の前の最大約１時間または投与前の約１～約２４時間の期間の間、炎症誘発性因子の存在に曝露するステップを含む、請求項１～１４のいずれか１項に記載の使用のための、単離され、集められたアロジェニックなＭＳＣ集団。
  16. 前記使用が、静脈内注入または静脈内投与による投与を含む、請求項１～１５のいずれか１項に記載の使用のための、単離され、集められたアロジェニックなＭＳＣ集団。
  17. 請求項１～１６のいずれか１項に記載の使用のための、請求項１～１６のいずれか１項に定義される単離され、集められたアロジェニックなＭＳＣ集団と、少なくとも１つの薬学的に許容される賦形剤または担体とを含む医薬組成物。
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