JP7836583B2

JP7836583B2 - 視神経疾患治療用組成物、その調製方法およびその使用

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Publication number: JP7836583B2
Application number: JP2023544677A
Authority: JP
Inventors: 林雲鋒; 李佳杰; 蔡瀟瀟
Original assignee: 成都景潤沢基因科技有限公司
Priority date: 2021-03-18
Filing date: 2022-03-14
Publication date: 2026-03-27
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Also published as: EP4309659A4; EP4309659A1; CN112843085A; CN112843085B; WO2022194109A1; US20240052347A1; JP2024504413A

Description

本発明は、生物医学の分野に属する。本発明は、特に、視神経疾患の治療のための複合体、その調製方法および使用に関するものである。

緑内障は、視神経およびその視覚路を脅かし、傷つけることで視覚機能障害を引き起こす疾患群であり、世界の不可逆的な失明原因の第一位となっている。原発開放隅角緑内障は、網膜神経節細胞（ＲＧＣ）とその軸索の進行性の損傷を特徴とする特定のタイプの視神経疾患であり、特徴的な視神経萎縮および視野欠損を伴うものである。緑内障は潜行性の傾向があり、緩慢に進行し、初期には明らかな症状がなく、視野が徐々に狭くなって失明するまでに至る。中国には２１００万人近い緑内障患者がおり、６３０万人近い失明者と１０００万人以上の視覚障害者とを生み出すことになるであろう。

現在、緑内障の主な治療法は、内科的または外科的に眼圧（ＩＯＰ）を下げ、視神経の損傷を遅延させることである。しかしながら、眼圧を下げるだけでは、網膜神経節細胞死による視神経損傷を完全かつ効果的に予防または回復することはできない。緑内障の患者の中には、眼圧を制御しても網膜神経節細胞の損傷が進行し続け、有効な治療が行われないと完全に視野が失われる場合がある。

視神経保護は、緑内障の治療の難所であると同時に、近年の眼科研究の最先端の活発な分野でもある。現在、臨床で通常使用されているプロスタグランジン、β受容体遮断薬、アドレナリン作動薬、炭酸脱水酵素阻害薬、およびピロカルピンなどの縮瞳薬は、いずれも眼圧降下薬であり、神経保護薬は不足しているのが現状である。

四面体ＤＮＡ（ＴＤＮ）は、四面体フレームワーク核酸（ｔＦＮＡ）および四面体ＤＮＡナノ構造体とも呼ばれ、４つの一本鎖ＤＮＡが変性および再変性を経て、鎖間の塩基対が相補的に形成された四面体のナノ構造体である。これは、合成が容易で生体親和性が高く、通常、特定の薬物のキャリアーとして使用される。特許文献１は、神経幹細胞の増殖、分化および／または移動を促進するための四面体ＤＮＡの使用を開示するが、視神経の保護に対する四面体ＤＮＡの効果については開示していない。

特許文献２は、網膜神経節細胞の酸化ストレスを防止する薬剤の調製のための四面体ＤＮＡの使用を開示し、四面体ＤＮＡ単独またはｍｉＲ－１５５との複合体が湿性黄斑変性症（ＡＭＤ）の治療に利用できることを示している。

ｍｉＲ－２２は、最も頻繁に研究されているマイクロＲＮＡのうちの１つとして、心臓リモデリング、細胞周期制御、増殖、および分化などの様々な生物学的プロセスに関与し、神経細胞のアポトーシス抑制および脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）関連シグナル伝達経路の制御への関与、ならびに各種腫瘍細胞の増殖、侵入、および移動抑制などの様々な抗神経変性および抗腫瘍効果を有する。Ｒｏｍａｎｏ等は、ｍｉＲ－２２が緑内障を予測するための標的遺伝子であることを明らかにしたが、緑内障を治療するための標的遺伝子としてｍｉＲ－２２を使用することは開示されていない（非特許文献１）。

まとめると、緑内障の治療に四面体ＤＮＡやｍｉＲ－２２を使用した報告はまだなく、ましてや緑内障の治療に視神経保護薬として両者を併用した報告はない。緑内障の治療の困難さを克服するためには、視神経疾患を効果的に治療可能な神経保護薬のさらなる開発が急務となっている。

中国特許出願公開第１０９８０６２７５号明細書中国特許出願公開第１１２００７０４４号明細書

Romano GL, Platania CB, Forte S, Salomone S, Drago F, Bucolo C. MicroRNA target prediction in glaucoma. Prog Brain Res. 2015;220:217-40.

本発明の課題は、視神経疾患の治療薬を提供することにある。

本発明は、四面体ＤＮＡとｍｉＲ－２２とを１：（１乃至４）のモル比で含む視神経疾患治療用複合体を提供する。

本発明の四面体ＤＮＡは、ＤＮＡ塩基配列設計、相補的対合原理、および各鎖の自動ハイブリダイゼーション組み合わせによって形成される四面体形状の３次元ＤＮＡナノ構造体である。本発明において、４つの一本鎖のＤＮＡは、ＳＥＱＩＤＮＯ．１乃至ＳＥＱＩＤＮＯ．４に示すヌクレオチド配列を有する。四面体ＤＮＡの一本鎖の末端にマイクロＲＮＡを連結することで、四面体ＤＮＡとマイクロＲＮＡとの複合体を形成する。本発明において、特定のマイクロＲＮＡは、ｍｉＲ－２２である。

さらに、四面体ＤＮＡは、相補的塩基対形成を介して４つの一本鎖ＤＮＡにより形成され；４つの一本鎖ＤＮＡは、それぞれＳＥＱＩＤＮＯ．１乃至４に示す配列から１対１で選択される配列を有し；一本鎖ＤＮＡのうちの１つまたは２つまたは３つまたはそれぞれの末端はｍｉＲ－２２に連結され；ｍｉＲ－２２はＳＥＱＩＤＮＯ．５に示す配列を有する。

さらに、上記ｍｉＲ－２２は、四面体ＤＮＡ構造体を形成する４つの一本鎖ＤＮＡのうちの１乃至４つの一本鎖ＤＮＡに対して１つ以上の化学結合で連結されている。

さらに、ｍｉＲ－２２と一本鎖ＤＮＡ（複数可）との間にはリンカー配列が存在する。リンカー配列は、ヌクレオチド配列、好ましくはデオキシリボヌクレオチド配列、より好ましくは－ＴＴＴＴＴ－であり、これは５個の連続したチミン・デオキシヌクレオチドからなる配列である。

また、本発明は、上記複合体の調製方法であって、四面体ＤＮＡの４つの一本鎖ＤＮＡを変性させるのに十分な温度で１０分よりも長く維持した後に、２乃至８℃に温度を下げ、２０分よりも長く維持し；上記した４つの一本鎖ＤＮＡのうちの１つ以上をｍｉＲ－２２に連結する方法を提供する。

さらに、４つの一本鎖の四面体ＤＮＡを９５℃で１０分間維持した後に、４℃に温度を下げ、２０分間維持する。

また、本発明は、視神経疾患を治療するための医薬品の調製において上記複合体を使用する。さらに、前記視神経疾患治療薬は、視神経保護薬であり；好ましくは、視神経疾患は、網膜神経節細胞損傷、および／または網膜神経節細胞アポトーシスに関連付けられる。本薬剤は、網膜神経節細胞の損傷を遅延させ、網膜神経節細胞のアポトーシスを抑え、網膜神経節細胞の生存を促進することができ；より好ましくは、前記網膜神経疾患は脳由来神経因子（ＢＮＤＦ）関連シグナル伝達経路と関連付けられており、本薬剤はＢＤＮＦの放出を促進できる。

さらに、視神経疾患は緑内障であり、特に、原発性開放隅角緑内障である。

また、本発明は、上記の視神経疾患治療用複合体および薬学的に許容される賦形剤を含有する、視神経疾患治療用医薬組成物を提供する。

また、本発明は、本発明の四面体ＤＮＡおよびｍｉＲ－２２の複合体または本発明の医薬組成物の有効量を、それを必要とする患者に投与することを含む、視神経疾患の治療および／または予防のための方法を提供する。視神経疾患は、好ましくは緑内障である。

実験の結果、本発明の四面体ＤＮＡとｍｉＲ－２２との複合体であるｔＦＮＡ－ｍｉＲ２２は、Ｎ－メチル－Ｄ－アスパラギン酸（ＮＭＤＡ）によって誘導される網膜神経節細胞のアポトーシスを効果的に抑制し、脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）の放出を促進し、網膜神経節細胞の保護作用を十分に発揮できることが分かった。ｔＦＮＡ－ｍｉＲ２２を視神経保護薬の調製に応用することで、緑内障を含む神経変性視神経疾患の治療に役立つと考えられ、相当高い応用性が期待される。

もちろん、本発明の上記内容によれば、本発明の上記基本的な技術的思想を逸脱することなく、当該分野における一般的な技術常識および慣用手段に従って、他の様々な形態の修正、置換、あるいは改変を行うことができることは明らかである。

以下、本発明の上記内容について、実施例による具体的な実施形態によりさらに詳細に説明する。しかしながら、本発明の上記課題の範囲を以下の実施例に限定するものと解釈されるべきではない。上記発明の内容に基づいて実施される全ての技術は、本発明の範囲に属するものである。

図１は、四面体ＤＮＡとｍｉＲ－２２との合成を示す概略図である。図２は、キャピラリー電気泳動による検知結果を示す。図３は、ｔＦＮＡ－ｍｉＲ２２、四面体ＤＮＡおよびその複数の一本鎖（１：Ｓ１、２：Ｓ２、３：Ｓ３、４：Ｓ３－ｍｉＲ２２、５：Ｓ４、６：ｔＦＮＡ、７：ｔＦＮＡ－ｍｉＲ２２）のＰＡＧＥ電気泳動による検知結果を示す。図４Ａは、透過型電子顕微鏡による四面体ＤＮＡの画像を示す。図４Ｂは、原子間力顕微鏡による四面体ＤＮＡの画像を示す。図４Ｃは、四面体ＤＮＡのゼータ電位の検知結果を示す。図４Ｄは、四面体ＤＮＡの粒子径の検知結果を示す。図５Ａは、透過型電子顕微鏡によるｔＦＮＡ－ｍｉＲ２２の画像を示す。図５Ｂは、原子間力顕微鏡によるｔＦＮＡ－ｍｉＲ２２の画像を示す。図５Ｃは、ｔＦＮＡ－ｍｉＲ２２のゼータ電位の検知結果を示す。図５Ｄは、ｔＦＮＡ－ｍｉＲ２２の粒子径の検知結果を示す。図６Ａ乃至６Ｅは、ＮＭＤＡによる視神経損傷の生体内および生体外モデルの確立、ならびに異なる濃度のｔＦＮＡ－ｍｉＲ２２でＮＭＤＡ処理した網膜神経節細胞の細胞活性の検知結果を示し、図６Ａ乃至６Ｄのデータは、平均値プラスマイナス標準偏差（各群のサンプルサイズ≧３）を示す。図６Ａは、異なる濃度のＮＭＤＡで１時間刺激し、完全培地で３、６、１２および２４時間培養した細胞のＣＣＫ－８活性検知および薬剤阻害率を示す。図６Ｂは、異なる濃度のＮＭＤＡで１時間刺激し、完全培地で３、６、１２および２４時間培養した細胞のＣＣＫ－８活性検知および薬剤阻害率を示す。図６Ｃは、ｔＦＮＡ－ｍｉＲ２２のバイオセーフティー検知を示す。図６Ｄは、４ｎＭのＮＭＤＡで処理した後に、異なる濃度のｔＦＮＡ－ｍｉＲ２２、四面体ＤＮＡ、および一本鎖ｍｉＲ－２２で２４時間処理した細胞のＣＣＫ－８活性検知を示す。図６Ｅは、通常の光学顕微鏡で観察した上記処理後の各群の細胞の形態を示す。図７は、生体内モデルの確立を示す概略図である。図８は、ヘマトキシリン・エオシン染色結果を示す図である。図９は、網膜フラットマウントの免疫蛍光染色およびデータ解析の画像を示す図であり、データは平均値プラスマイナス標準偏差を示す（各群のサンプルサイズ≧３）。図１０ＡＢは、フローサイトメトリーで検知した３、６、１２、および２４時間以内のｔＦＮＡ－ｍｉＲ２２および一本鎖ｍｉＲ－２２（Ｃｙ５蛍光標識）の細胞浸透率の結果を示すグラフである。図１１は、免疫蛍光法で検知したｔＦＮＡ－ｍｉＲ２２および一本鎖ｍｉＲ－２２（Ｃｙ５蛍光標識）の６時間の取り込み結果を示す図である。図１２は、フローサイトメトリーによって検知された細胞周期に対する６２．５ｎＭのｔＦＮＡ－ｍｉＲ２２、四面体ＤＮＡ、および一本鎖ｍｉ－Ｒ２２の効果およびデータ解析を示し、統計データは平均プラスマイナス標準偏差を示す（各群のサンプルサイズは≧３以上）。図１３は、フローサイトメトリーにより検知された各群の細胞のアポトーシスおよび統計データ解析を示し、統計データは平均値プラスマイナス標準偏差を示す（各群のサンプルサイズ≧３）。図１４Ａは、ウェスタンブロットにより検知されたアポトーシス関連タンパク質の発現を示す。図１４Ｂは、抗アポトーシスタンパク質Ｂｃｌ－２の統計解析を示す。図１４Ｃは、アポトーシスタンパク質Ｂａｘの統計解析を示す。図１４Ｄは、アポトーシスタンパク質カスパーゼ３の統計解析を示す。図１５は、抗アポトーシスタンパク質Ｂｃｌ－２の免疫蛍光染色および統計解析を示す。図１６は、アポトーシスタンパク質Ｂａｘの免疫蛍光染色および統計解析を示す。図１７は、アポトーシスタンパク質カスパーゼ３の免疫蛍光染色および統計解析を示す。図１８Ａ乃至１８Ｅは、ＴｒＫｂ－Ｃｒｅｂ－ＢＤＮＦシグナル伝達経路の関連検知を示す図であり、図１８Ａは、ウェスタンブロットで解析したＴｒｋＢ／ＢＤＮＦタンパク質の発現を示す（内部基準としてＧＡＰＤＨ）。図１８Ｂは、ＴｒｋＢタンパク質の相対発現量を示す。図１８Ｃは、ＢＤＮＦタンパク質の相対発現量を示す。図１８Ｄは、Ｎｔｒｋ２遺伝子の発現量を示す。図１８Ｅは、ＢＤＮＦ遺伝子の発現量を示す。図１９Ａは、ウェスタンブロットで解析したＥＲＫ１／２－ＣＲＥＢタンパク質の発現を示す。図１９Ｂは、ＥＲＫ１／２およびリン酸化ＥＲＫ１／２タンパク質の相対発現量を示す。図１９Ｃは、ＣＲＥＢおよびリン酸化ＣＲＥＢタンパク質の相対発現量を示す。図２０は、免疫蛍光法で検知されたｔＦＮＡ－ｍｉＲ２２によって選択的に活性化されたＴｒｋＢの発現および統計解析結果を示す。図２１は、免疫蛍光法で検知されたＢＤＮＦの発現および統計解析結果を示す。図２２は、免疫蛍光法で検知されたｐ－ＥＲＫ１／２の発現および統計解析結果を示す。図２３は、免疫蛍光法で検知されたｐ－ＣＲＥＢの発現および統計解析を示す。図２４は、免疫組織化学染色によるＴｒｋＢタンパク質およびＢＤＮＦタンパク質の発現結果を示す。

本発明で使用する原料および装置は、周知の製品であり、市販されているものである。

実施例１．ｔＦＮＡとｍｉＲ－２２との複合体（ｔＦＮＡ－ｍｉＲ２２）の合成
４つのＤＮＡ一本鎖（うち１つは末端がｍｉＲ２２に接続されている）（Ｓ１、Ｓ２、Ｓ３－ｍｉＲ２２、Ｓ４）を、ＴＭＢｕｆｆｅｒ（１０ｍＭのＴｒｉｓ－ＨＣｌ，５０ＭｍのＭｇＣｌ_２，ｐＨ＝８．０）に、４つのＤＮＡ一本鎖それぞれについて最終濃度が１０００ｎＭになるように溶解し、十分に混合し、９５℃まで急速加熱して１０分間維持し、その後４℃に急速冷却して２０分間以上維持し、ｔＦＮＡ－ｍｉＲ２２を得た。
４つの一本鎖（５’→３’）の配列は以下の通りであった：

Ｓ１：
ＡＴＴＴＡＴＣＡＣＣＣＧＣＣＡＴＡＧＴＡＧＡＣＧＴＡＴＣＡＣＣＡＧＧＣＡＧＴＴＧＡＧＡＣＧＡＡＣＡＴＴＣＣＴＡＡＧＴＣＴＧＡ
（ＳＥＱＩＤＮＯ．１）

Ｓ２：
ＡＣＡＴＧＣＧＡＧＧＧＴＣＣＡＡＴＡＣＣＧＡＣＧＡＴＴＡＣＡＧＣＴＴＧＣＴＡＣＡＣＧＡＴＴＣＡＧＡＣＴＴＡＧＧＡＡＴＧＴＴＣ
（ＳＥＱＩＤＮＯ．２）

Ｓ３：
ＡＣＴＡＣＴＡＴＧＧＣＧＧＧＴＧＡＴＡＡＡＡＣＧＴＧＴＡＧＣＡＡＧＣＴＧＴＡＡＴＣＧＡＣＧＧＧＡＡＧＡＧＣＡＴＧＣＣＣＡＴＣ
（ＳＥＱＩＤＮＯ．２）

Ｓ３：
ＡＣＴＡＣＴＡＴＧＧＣＧＧＧＴＧＡＴＡＡＡＡＣＧＴＧＴＡＧＣＡＡＧＣＴＧＴＡＡＴＣＧＡＣＧＧＧＡＡＧＡＧＣＡＴＧＣＣＣＡＴＣ
（ＳＥＱＩＤＮＯ．３）

Ｓ４：
ＡＣＧＧＴＡＴＴＧＧＡＣＣＣＴＣＧＣＡＴＧＡＣＴＣＡＡＣＴＧＣＣＴＧＧＴＧＡＴＡＣＧＡＧＧＡＴＧＧＧＣＡＴＧＣＴＣＴＴＣＣＣ
（ＳＥＱＩＤＮＯ．４）

ｍｉＲ－２２：
ＡＡＧＣＵＧＣＣＡＧＵＵＧＡＡＧＡＡＣＵＧ
（ＳＥＱＩＤＮＯ．５）

Ｓ３－ｍｉＲ２２－３ｐ：
ＡＡＧＣＵＧＣＣＡＧＵＵＧＡＡＧＡＡＣＵＧＵ－ＴＴＴＴＴ－ＡＣＴＡＣＴＡＴＧＧＣＧＧＧＴＧＡＴＡＡＡＡＣＧＴＧＴＡＧＣＡＡＧＣＴＧＴＡＡＴＣＧＡＣＧＧＧＡＡＧＡＧＣＡＴＧＣＣＣＡＴＣ
（ＳＥＱＩＤＮＯ．６）

ここで、Ｓ１の５’末端には、ｔＦＮＡ－２２を追跡するためのＣｙ５蛍光標識基が任意に連結されていた。

２．識別
キャピラリー電気泳動およびＰＡＧＥ電気泳動により、複数のＤＮＡ一本鎖、および合成ｔＦＮＡ－ｍｉＲ２２が検知された。ｔＦＮＡおよびｔＦＮＡ－ｍｉＲ２２の形態は、透過型電子顕微鏡で検知した。ｔＦＮＡおよびｔＦＮＡ－ｍｉＲ２２のゼータ電位および粒子径は、動的光散乱法により検知した。

３．識別結果
図１乃至３に示すように、電気泳動の結果、ｔＦＮＡ－ｍｉＲ２２バンドの分子量は、一本鎖ＤＮＡおよび四面体ＤＮＡの分子量よりも相当高く、一本鎖ＤＮＡが一体的に集合していることが示された。

図４Ａ乃至図５Ｄに示すように、透過型電子顕微鏡で四面体構造粒子を検知した。動的光散乱法により、ｔＦＮＡのゼータ電位は５．６、粒子径は１７．９６ｎｍ、ｔＦＮＡ－ｍｉＲ２２のゼータ電位は８．２３ｍＶ、粒子径は１７．１８ｎｍであり、ｔＦＮＡ－ｍｉＲ２２は正常に合成され安定していたことが分かった。

本発明の有益な効果について、実験例により以下にさらに説明する。実験例に関与するｔＦＮＡは、実施例１の方法で調製した。

実験例１：損傷を受けた網膜神経節細胞によるｔＦＮＡ－ｍｉＲ２２の取り込み

１．実験方法
１．１最適なモデル化濃度の検証（視神経節細胞損傷の生体外シミュレーション）
ＲＧＣ－５細胞（マウス網膜神経節細胞の一種）を９６ウェルプレートで、ウェル当たり１＊１０^４個で群培養した。各群を異なる濃度のＮ－メチル－Ｄ－アスパラギン酸（ＮＭＤＡ）で１時間処理した後に、完全培地で２４時間培養し、ＣＣＫ－８アッセイにより細胞活性を検知した。その結果，４ｍＭのＮＭＤＡの薬物阻害率は約４０％であることがわかり、よって、４ｍＭを最適なモデリング濃度として選択した（図６Ａおよび図６Ｂ）。
１．２薬剤の最適な抗細胞損傷濃度の試験（細胞増殖実験）
ＲＧＣ－５細胞を９６ウェルプレートで、ウェル当たり１＊１０^４個で群培養した。ブランク群を除く各実験群は、４ｎＭのＮＭＤＡで１時間処理した後に、０ｎＭ、６２．５ｎＭ、１２５ｎＭ、および２５０ｎＭのｔＦＮＡおよび実施例１で調製したｔＦＮＡ－ｍｉＲ２２、ならびに一本鎖ｍｉＲ－２２をそれぞれ含む培養液でさらに２４時間培養された。サンプルを採取し、ＣＣＫ－８アッセイで細胞活性を検知した。その結果、ｔＦＮＡを６２．５ｎＭでは明らかな増殖効果はなかったが、この濃度のｔＦＮＡ－ｍｉＲ２２はＲＧＣ－５細胞の増殖を有意に促進した。さらに、ＮＭＤＡ対照群の細胞生存率と比較してｔＦＮＡ－ｍｉＲ２２で処理した細胞生存率の増殖比は、ＮＭＤＡ対照群の細胞生存率と比較してｍｉＲ２２またはｔＦＮＡ単独の細胞生存率の増殖比の合計よりもさらに高く、これは、ｍｉＲ２２とｔＦＮＡとを組み合わせたｔＦＮＡ－ｍｉＲ２２が、ＮＭＤＡ損傷神経節細胞の増殖を促進する相乗的な役割を担っていることを示している。したがって、この実験では６２．５ｎＭが最適な薬物濃度として選択された（図６Ｄ）。
１．３損傷した細胞への物質取り込み試験
４ｍＭのＮＭＤＡで１時間処理したＲＧＣ－５細胞をグループ分けし、続いてＣｙ５標識した一本鎖ｍｉＲ－２２（６２．５ｎＭ）およびｔＦＮＡ－ｍｉＲ２２（６２．５ｎＭ）にそれぞれ３時間、６時間、１２時間、２４時間曝露および処理し、損傷群（すなわちｔＦＮＡおよびｔＦＮＡ－ｍｉＲ２２で未処理）と比較検討した。全群をリン酸緩衝液で３回洗浄し、フローサイトメトリーで検知した。その結果、ｔＦＮＡ－ｍｉＲ２２の蛍光強度は６時間後にピークに達することが分かった（図１１）。そこで、上記の方法で６時間処理したＲＧＣ－５細胞を選択して細胞スライドを作成し、一本鎖ｍｉＲ－２２およびｔＦＮＡ－ｍｉＲ２２の取り込みを免疫蛍光染色で観察した。

２．結果
図１０Ａ乃至１１に示すように、細胞フローサイトメトリーの結果、２４時間以内に、ｔＦＮＡ－ｍｉＲ２２の蛍光強度は６時間で５５．３％のピークに達し、処理時間の増加とともに４０．４％まで徐々に減少し、一本鎖ｍｉＲ－２２の蛍光強度は処理時間とともに徐々に増加し、２４時間で３３．５％のピークに達することが確認された。図１１の免疫蛍光染色の結果、６時間後のＲＧＣ－５の細胞質および核周囲にｔＦＮＡ－ｍｉＲ２２が広く集積し、一本鎖ｍｉＲ－２２は主に細胞膜の表面に付着していることが確認された。

以上の結果から、ｔＦＮＡ－ｍｉＲ２２は損傷を受けたＲＧＣ－５細胞により迅速かつ効率的に取り込まれる一方、ｔＦＮＡに結合していないｍｉＲ－２２はＲＧＣ－５細胞には取り込まれにくいことが分かった。

実験例２：ｔＦＮＡ－ｍｉＲ２２によるＮＭＤＡ誘発細胞傷害の抑制

１．実験方法
ＲＧＣ－５細胞を４ｍＭのＮＭＤＡで１時間処理した後に、６２．５ｎＭの一本鎖ｍｉＲ－２２、ｔＦＮＡまたはｔＦＮＡ－ｍｉＲ２２で２４時間処理し、以下のように検知した：
１）細胞の形態は位相差顕微鏡で観察した；
２）細胞周期はフローサイトメトリーで検知した；
３）細胞アポトーシス率は、フローサイトメトリーで検知した；
４）Ｂａｘ、カスパーゼ３、Ｂｃｌ－２の発現を免疫蛍光法およびウェスタンブロットで検知した。

２．結果
１）図６Ｃにより、ｔＦＮＡ－ｍｉＲ２２は顕著な細胞毒性を示さず、ｔＦＮＡ－ｍｉＲ２２の生物学的安全性が良好であることが示された。
２）図６Ｅは、ｔＦＮＡおよび一本鎖ｍｉＲ－２２と比較して、ｔＦＮＡ－ｍｉＲ２２は網膜神経節細胞の形態を有意に保護できることを示す。
３）図１２は、ｔＦＮＡおよび一本鎖ｍｉＲ－２２と比較して、ｔＦＮＡ－ｍｉＲ２２は細胞の分裂を制御することにより、細胞の自己再生を有意に促進できることを示している。また、ＮＭＤＡ処理細胞の分裂が影響を受け、対照群と比較して、ＮＭＤＡ群ではＧ２－Ｍ期の細胞の割合が相当減少し、ｔＦＮＡまたはｍｉＲ２２単独処理後に、Ｇ２－Ｍ期の細胞の割合がさらに減少したことが明確に分かる。しかしながら、ｔＦＮＡ－ｍｉＲ２２で処理すると、Ｇ２－Ｍ期の細胞の割合が有意に増加し、ＮＭＤＡ干渉のない対照群に匹敵するほどであった。ｔＦＮＡとｍｉＲ－２２との併用は、これらを単独で使用する場合と比較して、逆の効果があることがわかる。これらは互いに相乗効果を発揮し、細胞の分裂および自己再生を相当促進することができる。
４）図１３乃至１７は、ｔＦＮＡ－ｍｉＲ２２が、ｔＦＮＡや一本鎖ｍｉＲ－２２と比較して、ＮＭＤＡ誘発アポトーシスを抑制できること、すなわち、ｔＦＮＡ－ｍｉＲ２２がＮＭＤＡ誘発のアポトーシスタンパク質カスパーゼおよびＢａｘの発現量上昇を抑え、ＮＭＤＡ誘発の抗アポトーシスタンパク質ＢＣＬ－２の発現量下降を抑えることを示した。

以上の結果から、ｔＦＮＡ－ｍｉＲ２２は、網膜神経節細胞に対して良好な生体安全性および保護効果を有することが示された。ｔＦＮＡ－ｍｉＲ２２は、細胞の分裂を制御し、細胞の自己再生を促進し、抗アポトーシスタンパク質ＢＣＬ－２の発現を増加させてプロアポトーシスタンパク質カスパーゼ３およびＢａｘの発現を低減できることからＮＭＤＡによる細胞損傷を低減し、細胞保護の役割をさらに果たすようになり、ｔＦＮＡまたは一本鎖ｍｉＲ－２２単独よりも相当優れた効果を有している。

実験例３：ＴｒｋＢ／ＢＤＮＦシグナル伝達経路に対するｔＦＮＡ－ｍｉＲ２２の影響

１．実験方法
ＲＧＣ－５細胞を実験例２の方法に従って処理し、以下のように検知した：
１）ＢＤＮＦおよびＴｒｋｂタンパク質は、ウェスタンブロットおよび免疫蛍光法により検知した；
２）ＢＤＮＦおよびＮｔｒｋ２の発現量をＲＴ－ＰＣＲで検知した；
３）ＥＲＫ１／２、ｐ－ＥＲＫ１／２、ＣＲＥＢおよびｐ－ＣＲＥＢタンパク質は、ウェスタンブロットおよび免疫蛍光法により検知した。

２．結果
１）図１８Ａ乃至１８Ｃのウェスタンブロットの検知により、ｔＦＮＡ－ｍｉＲ２２処理細胞ではＢＤＮＦおよびＴｒｋＢの量が有意に上昇することが示された。図１８Ｄおよび図１８Ｅのリアルタイム定量ＰＣＲの結果から、ｔＦＮＡ－ｍｉＲ２２処理細胞では、Ｎｔｒｋ２およびＢＤＮＦの遺伝子発現が他の群と比較して有意に増加したことが示された。
２）図１９Ａ乃至１９Ｃのウェスタンブロットの検知により、ｔＦＮＡ－ｍｉＲ２２処理細胞ではＥＲＫおよびＣＲＥＢの総タンパク質がある程度増加し、ＥＲＫ１／２およびＣＲＥＢのリン酸化を促進できることが示された。
３）図２０乃至２３に示した上記タンパク質の免疫蛍光法による検知結果は、ウェスタンブロットによる検知結果と一致した。

本実験例の目的は、ｔＦＮＡ－ｍｉＲ２２が視神経保護作用を発揮するメカニズムをさらに確認することにある。

脳由来成長因子（ＢＤＮＦ）は、特に網膜神経節細胞に対して強力な神経保護作用を発揮する物質である。ＢＤＮＦは緑内障の重要な神経栄養因子のうちの１つである。ＢＤＮＦは、その受容体であるＴｒｋＢに結合することで、細胞外シグナル制御キナーゼ（ＥＲＫ）を活性化し、ｃＡＭＰ応答要素結合タンパク質（ＣＲＥＢ）のリン酸化につながり、これにより神経細胞の生存に関連付けられる様々な遺伝子の転写を誘導し、細胞の生存を促進し得る。

以上の結果から、ｔＦＮＡ－ｍｉＲ２２はＴｒｋＢを選択的に活性化し、下流のシグナル伝達経路（ＥＲＫ－ＣＲＥＢ）を活性化することで、ＢＤＮＦの放出を促進し、細胞損傷を低減し細胞の生存を促進することが分かった。

実験例４：ＮＭＤＡ誘発視神経損傷モデルマウスのｔＦＮＡ－ｍｉＲ２２による治療

１．実験方法：
ＮＭＤＡ誘発視神経損傷モデルの確立
１）実験動物の選択およびグループ分け：実験対象は、６週齢の健康なオスのＣ５７ＢＬ／６Ｊマウスで、体重は１８乃至２０ｇであった。診察の結果、明らかな頚部の曲がりはなく、角膜は透明で、虹彩の血管は明瞭で、瞳孔は大きく丸く、光の反射に敏感であった。実験動物を乱数表法によりＡＢＣＤＥ５群にランダムに分け、それぞれブランク対照群、ＮＭＤＡ損傷群、ｔＦＮＡ単独処理群（６２．５ｎＭ）、ｍｉＲ－２２単独処理群、ｔＦＮＡ－ｍｉＲ２２処理群（６２．５ｎＭ）とした。
２）集団治療：マウスを十分に麻酔した後に、各群のマウスの両目を実験眼とし、眼球表面を１０％ヨウ素チンキで消毒した。手術用顕微鏡下で、３２Ｇ針を角膜側縁から１ｍｍの位置に穿刺し、１０μＬマイクロシリンジで硝子体腔内に２μＬの薬剤を注射した。Ａ群：手術なしの正常マウス；Ｂ群：最終濃度２０μＭの生理食塩水で調製したＮＭＤＡを２μＬ注射；Ｃ群：ＮＭＤＡ（２０μＭ）１μＬ＋ｔＦＮＡｓ（６２．５ｎＭ）１μＬを注射；Ｄ群：ＮＭＤＡ（２０μＭ）１μＬ＋ｍｉＲ－２２（６２．５ｎＭ）１μＬを注射；Ｅ群：ＮＭＤＡ（２０μＭ）＋ｔＦＮＡｓ－ｍｉＲ２２（６２．５ｎＭ）１μＬを注射。術後、結膜嚢にエリスロマイシン眼軟膏を塗布した。視神経の一部を残したまま眼球を摘出する手術の７日後に動物を犠牲にした。以下の形態学的検査を実施した：
Ａ）網膜の組織変化をＨＥ染色で観察した；
Ｂ）全網膜フラットマウントの免疫蛍光染色：ＲＧＣのカウント；
Ｃ）ＢＤＮＦおよびＴｋｒｂの発現は、ルーチン網膜切片の免疫組織化学的ＩＨＣ染色により観察した。

２．結果
１）図８のＨＥ染色の結果、ｔＦＮＡｓ－ｍｉＲ２２処理後に、網膜の厚みが有意に増加し、神経節細胞の数が有意に増加したことが確認された。
２）図９にフラットマウントの免疫蛍光染色結果を示す。ｔＦＮＡｓ－ｍｉＲ２２処理後に、神経節細胞数は統計的有意差をもって有意に増加した。ｔＦＮＡ－ｍｉＲ２２処理群の神経節細胞数はＮＭＤＡ対照群に比べ有意に増加し、ｔＦＮＡまたはｍｉＲ２２単独処理後の神経節細胞数はＮＭＤＡ処理群に比べほぼ変化が無かった。
３）図２４にＩＨＣ染色結果を示す：ｔＦＮＡｓ－ｍｉＲ２２処理後に、網膜におけるＢＤＮＦおよびＴｋｒｂの発現が有意に増加した。

このことから、ｔＦＮＡ－ｍｉＲ２２群は、他の群と比較して視神経節細胞の生存率を有意に増加させたことが分かり、本発明のｔＦＮＡ－ｍｉＲ２２複合体は視神経保護作用を有し、緑内障を含む神経変性視神経疾患の治療に使用することができ、ｔＦＮＡおよびｍｉＲ－２２単独よりも有意に優れた効果を示し、両者が相乗的な効果を有することが示された。

以上のことから、本発明は、緑内障を含む神経変性視神経疾患の治療に使用可能な神経保護薬であって、四面体ＤＮＡとｍｉＲ－２２を１：（１乃至４）のモル比で含むｔＦＮＡ－ｍｉＲ２２からなる神経保護薬を提供する。ｔＦＮＡ－ｍｉＲ２２は、損傷を受けたＲＧＣ－５細胞に有効に取り込まれるのみならず、網膜神経節細胞のアポトーシスを効果的に抑制し、脳由来神経因子（ＢＤＮＦ）の放出を促進し、網膜神経節細胞に良好な保護作用を発揮することができる。

Claims

視神経損傷治療用組成物であって、四面体ＤＮＡとｍｉＲ－２２とを１：（１乃至４）のモル比で含み、
前記四面体ＤＮＡが、相補的塩基対形成を介して４つの一本鎖ＤＮＡから形成され；前記４つの一本鎖ＤＮＡの配列が、ＳＥＱＩＤＮＯ．１乃至４に示される配列からそれぞれ選択され；前記ｍｉＲ－２２がＳＥＱＩＤＮＯ．５に示される配列を有し、
前記ｍｉＲ－２２が、一本鎖末端に化学結合で連結されており；連結された前記一本鎖は、ＳＥＱＩＤＮＯ．３に示される配列を有し；前記ｍｉＲ－２２と連結された前記一本鎖ＤＮＡとの間にリンカー配列が存在し；前記リンカー配列が－ＴＴＴＴＴ－であることを特徴とする組成物。
前記四面体ＤＮＡを形成する４つの一本鎖ＤＮＡを変性させるために十分な温度に１０分よりも長く置いた後に、２乃至８℃に温度を下げて２０分よりも長く置くことを特徴とする請求項１に記載の組成物の調製方法であって、前記４つの一本鎖ＤＮＡのうちの１つ以上が前記ｍｉＲ－２２と連結していることを特徴とする組成物の調製方法。
前記四面体ＤＮＡを形成する前記４つの一本鎖ＤＮＡを９５℃で１０分間置いた後に、４℃まで２０分間かけて温度を下げることを特徴とする請求項２に記載の調製方法。
視神経損傷の治療のための薬剤の調製における、請求項１に記載の前記組成物の使用。
前記視神経損傷の前記治療のための前記薬剤は、視神経保護薬であることを特徴とする請求項４に記載の使用。
前記視神経損傷は緑内障において生じる視神経損傷であることを特徴とする請求項４に記載の使用。
請求項１に記載の前記組成物および薬学的に許容される賦形剤を含有することを特徴とする視神経損傷治療用医薬組成物。