JP7839309B2

JP7839309B2 - 筋肉損失阻害、及び筋肉量増進活性を有するペプチド、並びにその用途

Info

Publication number: JP7839309B2
Application number: JP2024572456A
Authority: JP
Inventors: ヨン・ジ・チュン; ウン・ミ・キム; ソン・ス・キム
Original assignee: Caregen Co Ltd
Current assignee: Caregen Co Ltd
Priority date: 2022-06-10
Filing date: 2023-05-12
Publication date: 2026-04-01
Anticipated expiration: 2043-05-12
Also published as: AU2023282713A1; CA3258791A1; KR20230170490A; ZA202500328B; JP2025524382A; KR102772405B1; JOP20240271A1; TWI856691B; AU2023282713B2; IL317462A; WO2023239069A1; MX2024015261A; EP4538281A1; CN119365480A; US20250361269A1; TW202400624A

Description

本発明は、筋肉損失阻害、及び筋肉量増進活性を有するペプチド、並びにその用途に関する。

本出願は、２０２２年６月１０日に出願された大韓民国特許出願第１０－２０２２－００７１０３３号を優先権として主張し、前記特許出願の開示事項は、本明細書に参照として挿入される。

最近、高齢者人口が全世界的に急増する趨勢にある中、国連（United Nations）の報告によれば、２０５０年には、６０歳以上の人口が２０億人を超えると予測されている。骨格筋は、全体体重の５０％に達する最大の器官であり、筋肉低減と筋力弱化は、老化によって起こる主要身体変化のうち一つである。それにより、骨格筋は、３０歳以後になれば、人体から、毎年約１％ずつ低減する傾向を示していて、６５歳以後からは、急激に低減する。そのような筋肉の急激な低減は、身体能力を低下させ、転倒及び骨折の危険性を高めるというような生活の質に大きい影響を及ぼし、そのような憂いを反映させ、２０１７年、世界保健機関（ＷＨＯ）は、正式疾病として、筋減少症（sarcopenia）を認めている。

筋肉疾患と関連する脊髄神経、運動神経または骨格筋線維の退行によって誘発される筋減少症は、いまだに発病原因が究明されていない代表的な難治性疾患のうち一つである。これまで研究されたところによれば、骨格筋の収縮を誘導する運動神経が退行され、骨格筋の収縮が進行されないか、骨格筋内において、筋肉の収縮に関与するタンパク質の発現が低減されるか、あるいは前記タンパク質が変形され、正常な骨格筋の収縮が進行されず、長期的には、前述の運動神経または骨格筋が、線維性組織に変形されると知られている。そのような筋減少症の根本的な発病原因がまだ究明されておらず、運動神経や骨格筋の退行を防止したり回復させたりしうる方法が開発されていないために、現在としては、前記筋減少症の進行を鈍化させる方法を開発するための研究が活発に進められている。現在、筋減少症には、運動、タンパク質及びカロリー補充が役に立つと知られているが、筋減少症患者のほとんどを占める高齢者においては、あまり役に立たず、筋減少症治療剤が切実に必要とされている。

なお、筋肉の大きさ、または筋肉量は、筋肉内で起こる同化作用や異化作用を誘導する細胞内信号伝逹過程によって調節される。具体的には、筋肉タンパク質の分解に比べ、筋肉タンパク質の合成を誘導する信号伝逹反応が優勢である場合、筋タンパク質合成が増大されるが、それは、筋肉サイズ増大（hypertrophy）や筋線維数増加（hyperplasia）として示される。また、筋肉細胞の分化と筋肉形成は、多様な筋肉調節因子（muscle regulatory factors）によって調節される。ＭｙｏＤは、筋肉特異遺伝子の発現を開始させ、筋肉衛星細胞（muscle satellite cells）が、筋芽細胞（myoblast）に分化されることを誘導し、ＭｙｏＤの活性によるmyogenin発現の誘導は、筋芽細胞の融合（fusion）に、最も重要な要素として、筋管細胞（myotube）の形成に関与する。そのような過程を介して形成された筋線維は、束をなし、最終的に筋肉を形成することになる。

そのような技術的背景下において、外部的または内因的な要因から引き起こされた筋肉の損失を阻害し、筋肉タンパク質の合成促進させるための多角的な研究が進められているが（韓国登録特許第１０－２０６４３８７号）、まだ十分ではない実情である。

一態様は、配列番号１のアミノ酸配列によってなるペプチドを提供することである。

他の態様は、配列番号１のアミノ酸配列によってなるペプチドを有効成分として含む筋肉損失阻害組成物及び筋肉量増進用組成物を提供することである。

本出願の他の目的及び利点は、添付された特許請求の範囲、及び図面と共に、下記の詳細な説明により、さらに明確になるであろう。本明細書に記載されていない内容は、本出願の技術分野内、または類似の技術分野内における熟練された者であるならば、十分に認識して類推しうるものであるので、その説明を省略する。

本出願で開示されたそれぞれの説明及び実施形態は、それぞれの他の説明及び実施形態にも適用されうる。すなわち、本出願で開示された多様な要素の全組み合わせが、本出願の範疇に属する。また、下記で記述された具体的な敍述により、本出願の範疇が制限されると見ることはできない。

一態様は、配列番号１のアミノ酸配列によってなるペプチドを提供する。

本明細書で使用される用語「ペプチド」は、ペプチド結合により、アミノ酸残基が互いに結合されて形成された線形の分子を意味しうる。前記ペプチドは、当業界に公知された化学的合成方法、特に、固相合成技術または液相合成技術（米国登録特許第５，５１６，８９１号）によって製造されうる。本発明者らは、生物学的に有効な活性を有するペプチドを開発すべく鋭意努力した結果、配列番号１のアミノ酸配列によってなるペプチドを究明した。ここで、前記生物学的に有効な活性は、（ａ）筋芽細胞の分化初期マーカーであるＭｙｏＧ（myogenin）及び（Ｍｙｆ５：myogenic factor 5）の発現増進、（ｂ）筋芽細胞の分化後期マーカー、または筋線維構成タンパク質であるＭｙＨＣ（Myosin heavy chain）、及びα－アクチニンの発現増進、並びに（ｃ）炎症性タンパク質であるα－ＳＭＡ（α－smooth muscle actin）、及びＩＬ－６（interleukin－6）の発現低減のような特性から選択されるいずれか１以上を示すものでもある。従って、前記ペプチドは、筋肉疾患の予防、改善または治療の用途に活用されうる。

前記ペプチドは、化学的安定性、強化された薬理特性（半減期、吸水性、力価、効能など）、変更された特異性（例えば、広範囲な生物学的活性スペクトル）、低減された抗原性を獲得するために、ペプチドのＮ末端またはＣ末端に保護基が結合されてもいる。一具体例において、前記ペプチドのＮ末端は、アセチル基（acetyl group）、フルオレニルメトキシカルボニル基（fluoreonylmethoxycarbonyl group）、ホルミル基（formyl group）、パルミトイル基（palmitoyl group）、ミリスチル基（myristyl group）、ステアリル基（stearyl group）、ブトキシカルボニル基（butoxycarbonyl group）、アリルオキシカルボニル基（allyloxycarbonyl group）及びポリエチレングリコール（ＰＥＧ：polyethylene glycol）によってなる群のうちから選択されるいずれか１つの保護基と結合され、かつ／あるいは前記ペプチドのＣ末端は、アミノ基（amino group（－ＮＨ_２））、第三級アルキル基（tertiary alkyl group）及びアザイド（azide（－ＮＨＮＨ_２））によってなる群のうちから選択されるいずれか１つの保護基と結合されうる。また、前記ペプチドは、選択的に、標的化配列、タグ（tag）、標識された残基、半減期またはペプチド安定性を増大させるための特定目的に製造されたアミノ酸配列も追加して含まれるものでもある。

前記ペプチドは、人為的に合成されるか（artificially synthesized）、あるいは非天然発生または操作（non-naturally occurring or engineered）されたものであり、前記「非天然発生または操作」は、自然状態で起こる存在そのままの状態ではなく、人為的な変形を加えて生成された状態を意味する。ここで、前記人為的な変形は、複数個のアミノ酸構造を模倣し、人為的にアミノ酸配列を合成するもの、または前述のように、化学的安定性、強化された薬理特性、変更された特異性、または低減された抗原性を獲得するために操作されたものを含むものでもある。

本明細書で使用される用語「安定性」は、生体内タンパク質切断酵素の攻撃から前記ペプチドを保護するインビボ安定性だけではなく、保存安定性（例えば、常温保存安定性）も意味しうる。

他の態様は、配列番号１のアミノ酸配列によってなるペプチドを有効成分として含む、筋肉疾患の予防用または治療用の薬剤学的組成物を提供する。

前記ペプチドに係わる説明で言及された用語または要素のうち、すでに言及されたところと同一のものは、前述の通りである。

本明細書において用語「予防」は、前記組成物の投与により、疾病の発病を抑制または遅延させる全ての行為を意味する。

本明細書において用語「治療」は、疾病を病むか、あるいは疾病が発病する危険性がある個体に、前記個体の状態（例えば、１以上の症状）の改善、疾病進行の遅延、症状発生の遅延、または症状進行の鈍化などを含む効果を提供する任意の形態の治療を意味する。従って、前述の「治療」及び「予防」は、症状の治癒、または完全な除去を意味するように意図されるものではない。

本明細書において用語「筋肉疾患」は、筋芽細胞の増殖または分化の低減と関連する筋肉の疾患、疾病または状態であり、例えば、筋機能低下、筋肉消耗または筋肉退化による筋肉疾患を総称するものでもある。前記筋肉疾患は、例えば、筋減少症（sarcopenia）、緊張減退症（atony）、筋異栄養症（muscular dystrophy）、筋萎縮症（muscular atrophy）、筋肉退化、筋硬直症、筋委縮性側索硬化症、筋無力症及び悪液質（cachexia）でもあるが、それらに制限されるものではない。

一具体例において、一実施例による薬剤学的組成物は、筋芽細胞の増殖促進及び分化促進を介し、筋肉量または筋肉強度を増進させるか、あるいは筋機能を改善させうる。

なお、従来の機能性ペプチドは、有効な生物学的活性にもかかわらず、ペプチド自体の大きさにより、標的組織または標的細胞に効果的に流入されえないか、あるいは半減期が短く、短期間に体内で消滅するという短所を示している。一方、一実施例による薬剤学的組成物は、約１０個以下のアミノ酸によってなるペプチドを有効成分として含み、それにより、有効成分の細胞浸透率などに非常にすぐれ、例えば、局所的に投与する場合、有効な筋肉疾患の治療効果を得ることができる。

一実施例によれば、本願のペプチドは、筋芽細胞の分化初期マーカー（例えば、ＭｙｏＧ及びＭｙｆ５）及び分化後期マーカー、または筋線維構成タンパク質（例えば、ミオシン重鎖（myosin heavy chain）、α－アクチニン）の発現を有意的に増大させ、筋肉細胞または筋肉線維への分化を促進させうる。また、本願のペプチドは、外因性要因による筋肉損傷時、筋肉量回復／再生を向上させるだけではなく、損傷された筋肉組織内に免疫疫細胞を浸潤させ、コラーゲン組織の蓄積を低減させ、筋肉疾患の症状を緩和させ、疾病の進行を阻害させうるが、前記ペプチドは、筋肉疾患治療のための薬剤学的組成物の有効成分として活用されうる。

前記薬剤学的組成物は、前記ペプチドの薬剤学的有効量（pharmaceutically effective amount）、及び／または薬剤学的に許容される担体を含むものでもあるが、それに制限されるものではない。

本明細書で使用される用語「薬剤学的有効量」は、前記薬剤学的組成物の骨疾患の治療効能を達成するのに十分な量を意味しうる。

前記ペプチドと、薬剤学的に許容される担体との重量比は、例えば、５００：１ないし１：５００でもあり、一例として、前記重量比は、４５０：１ないし１：４５０、４００：１ないし１：４００、３５０：１ないし１：３５０、３００：１ないし１：３００、２５０：１ないし１：２５０、２００：１ないし１：２００、１５０：１ないし１：１５０、１００：１ないし１：１００、８０：１ないし１：８０、６０：１ないし１：６０、４０：１ないし１：４０、２０：１ないし１：２０、１０：１ないし１：１０、８：１ないし１：８、６：１ないし１：６、４：１ないし１：４、または２：１ないし１：２でもあるが、それらに制限されるものではない。

前記薬剤学的に許容される担体は、製剤製造時、一般的に利用されるものであり、ラクトース、デキストロース、スクロース、ソルビトール、マンニトール、澱粉、アカシアゴム、リン酸カルシウム、アルジネート、ゼラチン、ケイ酸カルシウム、微細結晶性セルロース、ポリビニルピロリドン、セルロース、水、シロップ、メチルセルロース、メチルヒドロキシベンゾエート、プロピルヒドロキシベンゾエート、滑石、ステアリン酸マグネシウム及びミネラルオイルなどを含むが、それらに限定されるものではない。適する薬剤学的に許容される担体及び製剤は、Remington's Pharmaceutical Sciences (19th ed., 1995)に詳細に記載されている。

前記薬剤学的組成物は、前記成分以外に、潤滑剤、湿潤剤、甘味剤、香味剤、乳化剤、懸濁液剤、保存剤などを追加して含むものでもあるが、それらに制限されるものではない。

前記薬剤学的組成物は、経口または非経口で投与されもし、非経口投与の場合には、筋肉注入、静脈内注入、皮下注入、腹腔注入、局所投与、経皮投与などで投与しうるが、それらに限定されるものではない。

前記薬剤学的組成物の投与量は、１日当たり、０．０００１ないし１，０００μｇ、０．００１ないし１，０００μｇ、０．０１ないし１，０００μｇ、０．１ないし１，０００μｇ、または１．０ないし１，０００μｇでもあるが、それらに制限されるものではなく、製剤化方法、投与方式、患者の年齢・体重・性・病的状態・食物、投与時間、投与経路、排泄速度及び反応感応性のような要因により、多様に投与されうる。

前記薬剤学的組成物は、当該発明が属する技術分野において通常の知識を有する者が容易に実施しうる方法により、薬剤学的に許容される担体及び／または賦形剤を利用して製剤化することにより、単位用量形態に製造されるか、あるいは多用量容器内に内入させて製造されうる。

前記剤形は、オイル中または水性媒質中の溶液、懸濁液形態または乳化液形態であるか、あるいは軟膏、クリーム、ゲル、経皮吸収剤、カタプラズマ剤、貼付剤、ペースト剤、エキス剤、粉末剤、顆粒剤、錠剤またはカプセル剤の形態でもあり、分散剤及び／または安定化剤を追加して含むものでもある。

前記ペプチドは、例えば、細胞の透過問題または安定性問題をさらに改善させるために、ナノソームまたはナノパーティクルに含有されうる。例えば、前記ナノソームは、レシチンを原料として使用し、マイクロフルイダイザによって製造され、例えば、レシチン粒子内に含有されうる。前記ナノソームの製造方法は、公知のものであるならば、いかなる方法でも使用されうる。前記ナノソーム粒子の大きさは、１０ないし２００ｎｍでもあり、例えば、１０ないし１８０ｎｍ、１０ないし１６０ｎｍ、１０ないし１４０ｎｍ、１０ないし１２０ｎｍ、１０ないし１００ｎｍ、１０ないし８０ｎｍ、１０ないし６０ｎｍ、１０ないし４０ｎｍ、１０ないし２０ｎｍ、５０ないし２００ｎｍ、５０ないし１８０ｎｍ、５０ないし１６０ｎｍ、５０ないし１４０ｎｍ、５０ないし１２０ｎｍ、５０ないし１００ｎｍ、５０ないし８０ｎｍ、または５０ないし６０ｎｍでもある。

前記薬学的組成物は、筋肉疾患の予防または治療に有益な成分を追加して含むものでもあり、前記成分は、例えば、ビタミンＣ、ビタミンＢ１、ビタミンＢ２、ビタミンＢ６、ビタミンＨ、ビタミンＰＰ、プロビタミンＢ５、ビタミンＡ、ビタミンＤ、ビタミンＥ、ビタミンＫ１またはカロチン、あるいはそれらの混合物のうちから選択されたいずれか１つの成分でもあるが、それらに制限されるものではない。

他の態様は、配列番号１のアミノ酸配列によってなるペプチドを有効成分として含む、筋肉疾患の予防用または改善用の食品組成物を提供する。

前述のペプチド及び薬剤学的組成物に係わる説明で言及された用語または要素のうち、すでに言及されたところと同一のものは、前述の通りである。

本明細書において用語「改善」は、状態の緩和または治療と係わるパラメータ、例えば、症状の程度を、少なくとも低減させる全ての行為を意味しうる。

一具体例において、一実施例による食品組成物は、筋芽細胞の増殖促進及び分化促進を介し、筋肉量または筋肉強度を増進させるか、あるいは筋機能を改善させうる。

前記食品組成物は、前記ペプチドをそのまま添加するか、あるいは他の食品または食品成分と共に使用することができ、通常の方法によって適切に使用しうる。前記食品組成物は、有効成分以外に、食品学的に許容可能な食品補助添加剤を含むものでもあり、有効成分の混合量は、使用目的（予防的、健康的または治療的な処置）によって適切に決定されうる。

前記食品組成物は、筋肉疾患の予防または改善に有益な成分を追加して含むものでもあり、前記成分は、例えば、ビタミンＣ、ビタミンＢ１、ビタミンＢ２、ビタミンＢ６、ビタミンＨ、ビタミンＰＰ、プロビタミンＢ５、ビタミンＡ、ビタミンＤ、ビタミンＥ、ビタミンＫ１またはカロチン、あるいはそれらの混合物のうちから選択されたいずれか１つの成分でもあるが、それらに制限されるものではない。

本明細書において用語「食品補助添加剤」は、食品に補助的に添加されうる構成要素を意味し、各剤形の健康機能食品を製造するのに添加されるものであり、当業者が適切に選択して使用しうる。該食品補助添加剤の例としては、さまざまな栄養剤剤、ビタミン、鉱物（電解質）、合成風味剤及び天然風味剤のような風味剤、着色剤及び充填剤、ペクチン酸及びその塩、アルギン酸及びその塩、有機酸、保護性コロイド増粘剤、ｐＨ調節剤、安定化剤、防腐剤、グリセリン、アルコール、炭酸飲料に使用される炭酸化剤などが含まれるが、前述の例により、前記食品補助添加剤の種類が制限されるものではない。

前記食品組成物には、健康機能食品が含まれるものでもある。本明細書において用語「健康機能食品」は、人体に有用な機能性を有する原料や成分を使用し、錠剤、カプセル、粉末、顆粒、液状及び丸剤のような形態に製造及び加工した食品を言う。ここで、「機能性」というのは、人体の構造及び機能につき、栄養素を調節するか、あるいは生理学的作用のような保健用途に有用な効果を得ることを意味する。前記健康機能食品は、通常の技術分野において、一般的に使用される方法によって製造可能であり、前述の製造時には、通常の技術分野において一般的に添加する原料及び成分を添加して製造しうる。また、前記健康機能食品の剤形も、健康機能食品と認められる剤形であるならば、制限なしに製造されうる。前記食品組成物は、多様な形態の剤形に製造され、一般薬品とは異なり、食品を原料にし、薬品の長期服用時に生じうる副作用などがないという長所があり、携帯性にすぐれ、一実施例による健康機能食品は、筋肉疾患の治療効果を増進させるための補助剤として摂取が可能である。

また、一実施例による組成物が使用／適用されうる健康食品の種類には、制限がない。前記ペプチドを有効成分として含む食品組成物は、当業者の選択により、健康機能食品に含有されうる適切なその他補助成分と、公知の添加剤とを混合して製造しうる。添加しうる食品の例としては、肉類、ソーセージ、パン、チョコレート、キャンデー類、スナック類、菓子類、ピザ、ラーメン、その他麺類、ガム類、アイスクリーム類を含む酪農製品、各種スープ、飲料水、茶、ドリンク剤、アルコール飲料、及びビタミン複合剤などがあり、それ以外にも、汁、茶、ゼリー及びジュースなどに添加して製造しうる。

さらに他の態様は、配列番号１のアミノ酸配列によってなるペプチドを有効成分として含む組成物を個体に投与する段階を含む、筋肉疾患を予防または治療する方法を提供する

前述のペプチド、薬剤学的組成物、食品組成物などに係わる説明で言及された用語または要素のうち、すでに言及されたところと同一のものは、前述の通りである。

本明細書において、用語「投与する」または「適用する」は、相互交換的に使用され、それらは、任意の適切な方法により、個体または患者に、所定物質を提供することを意味しうる。また、前記用語は、一実施例による組成物を、所望する部位への少なくとも部分的局所化をもたらすこと、または投与経路により、個体内に、一実施例による組成物を配置することを意味しうる。

本明細書において用語「個体」は、皮膚状態改善を必要とする対象を意味し、さらに具体的には、ヒトまたは非ヒトである霊長類、マウス（mouse）・犬・猫・馬及び牛のような哺乳類を意味する。

前記組成物は、例えば、前記配列番号１のアミノ酸配列によってなるペプチドを有効成分として含む薬剤学的組成物または食品組成物でもある。

前記組成物に含有された有効成分としてのペプチドの含量は、食品／薬品の形態、所望する用途などにより、適切に非制限的に選択され、例えば、全体組成物重量の０．０１ないし１５重量％に添加しうる。また、例えば、健康飲料組成物は、１００ｍｌを基準に、０．０２ないし１０ｇ、望ましくは、０．３ないし１ｇの比率で添加しうるが、それらに制限されるものではない。

一態様によるペプチドによれば、筋芽細胞の分化に関与する因子の発現を向上させ、筋肉細胞または筋肉線維への分化を促進させうる。

一態様によるペプチドによれば、外因性要因による筋肉損傷時、筋肉量回復／再生を向上させるだけではなく、損傷された筋肉組織内に免疫疫細胞を浸潤させ、コラーゲン組織の蓄積を低減させ、筋肉疾患の症状を緩和させ、疾病の進行を阻害させうる。

従って、一態様によるペプチドは、筋肉疾患の予防用、改善用または治療用の組成物有効成分として活用されうる。

配列番号１のアミノ酸配列によってなるペプチドをＣ２Ｃ１２細胞に添加した後、筋芽細胞の初期分化マーカーであるmyogenin及びＭｙｆ５の発現増大を、ウェスタンブロットを介して確認した結果である。配列番号１のアミノ酸配列によってなるペプチドをＣ２Ｃ１２細胞に添加した後、筋芽細胞の初期分化マーカーの発現変化を定量的に評価したものであり、（ａ）は、myogeninの発現レベルを確認した結果であり、（ｂ）は、Ｍｙｆ５の発現レベルを確認した結果である。配列番号１のアミノ酸配列によってなるペプチドをＣ２Ｃ１２細胞に添加した後、筋芽細胞の初期分化マーカーであるＭｙｏＧ（myogenin）の発現様相を、免疫蛍光法を介して確認した結果である。配列番号１のアミノ酸配列によってなるペプチドをＣ２Ｃ１２細胞に添加した後、ＭｙｏＧ（myogenin）の発現レベルを定量的に評価した結果である。配列番号１のアミノ酸配列によってなるペプチドをＣ２Ｃ１２細胞に添加した後、筋芽細胞の後期分化マーカーであるＭｙＨＣの発現増大を、ウェスタンブロットを介して確認した結果である。配列番号１のアミノ酸配列によってなるペプチドをＣ２Ｃ１２細胞に添加した後、筋芽細胞の後期分化マーカーの発現変化を定量的に評価したものであり、ＭｙＨＣの発現レベルを確認した結果である。配列番号１のアミノ酸配列によってなるペプチドをＣ２Ｃ１２細胞に添加した後、筋芽細胞の後期分化マーカーであるα－アクチニンの発現様相を、免疫蛍光法を介して確認した結果である。配列番号１のアミノ酸配列によってなるペプチドをＣ２Ｃ１２細胞に添加した後、α－アクチニンの発現レベルを定量的に評価した結果である。ＢａＣｌ_２によって筋肉損傷が誘導された動物モデルにおいて、配列番号１のアミノ酸配列によってなるペプチドの処理によるＴＡ筋肉の変化を肉眼で確認した結果である。ＢａＣｌ_２によって筋肉損傷が誘導された動物モデルにおいて、配列番号１のアミノ酸配列によってなるペプチドの処理によるＴＡ筋肉の筋肉量変化を定量的に評価したものであり、（ａ）は、ＴＡ筋肉の重量（ｇ）を確認した結果であり、（ｂ）は、ＴＡ筋肉（％）を確認した結果である。ＢａＣｌ_２によって筋肉損傷が誘導された動物モデルに由来する筋肉組織において、配列番号１のアミノ酸配列によってなるペプチドの処理による免疫細胞浸潤領域の変化をＨ＆Ｅ染色を介して確認した結果である。ＢａＣｌ_２によって筋肉損傷が誘導された動物モデルに由来する筋肉組織において、配列番号１のアミノ酸配列によってなるペプチドの処理による免疫細胞浸潤領域の変化を定量的に評価した結果である。ＢａＣｌ_２によって筋肉損傷が誘導された動物モデルに由来する筋肉組織において、配列番号１のアミノ酸配列によってなるペプチドの処理によるコラーゲン蓄積レベルの変化をシリウスレッド染色を介して確認した結果である。ＢａＣｌ_２によって筋肉損傷が誘導された動物モデルに由来する筋肉組織において、配列番号１のアミノ酸配列によってなるペプチドの処理によるコラーゲン蓄積レベルの変化を定量的に評価した結果である。ＢａＣｌ_２によって筋肉損傷が誘導された動物モデルに由来する筋肉組織において、配列番号１のアミノ酸配列によってなるペプチドの処理による筋線維構成タンパク質であるＭｙＨＣ及びα－アクチニンの発現増大を、ウェスタンブロットを介して確認した結果である。ＢａＣｌ_２によって筋肉損傷が誘導された動物モデルに由来する筋肉組織において、配列番号１のアミノ酸配列によってなるペプチドの処理による筋線維構成タンパク質であるＭｙＨＣ及びα－アクチニンの発現レベルを、定量的に評価した結果である。ＢａＣｌ_２によって筋肉損傷が誘導された動物モデルに由来する筋肉組織において、配列番号１のアミノ酸配列によってなるペプチドの処理による炎症性タンパク質であるα－ＳＭＡ及びＩＬ－６の発現低減を、ウェスタンブロットを介して確認した結果である。ＢａＣｌ_２によって筋肉損傷が誘導された動物モデルに由来する筋肉組織において、配列番号１のアミノ酸配列によってなるペプチドの処理による炎症性タンパク質であるα－ＳＭＡ及びＩＬ－６の発現レベルを、定量的に評価した結果である。

以下、本発明について、実施例を介し、さらに詳細に説明する。しかし、それら実施例は、本発明について例示的に説明するためのものであり、本発明の範囲は、それら実施例に限定されるものではない。

実施例１．ペプチドの合成
自動ペプチド合成器（Milligen 9050（Millipore（米国）））を利用し、下記表１に記載された配列番号１のアミノ酸配列を有するペプチドを合成し、Ｃ１８逆相高性能液体クロマトグラフィ（ＨＰＬＣ）（Waters Associates（米国））を利用し、それら合成されたペプチドを純粋分離した。カラムは、ACQUITY UPLC BEH300 C18（２．１ｍｍＸ１００ｍｍ，１．７μｍ（Waters Co（米国））を利用した。

実施例２．初期分化段階における筋芽細胞の分化促進効果の確認
本実施例においては、マウス筋芽細胞であるＣ２Ｃ１２細胞の初期分化マーカータンパク質の発現変化を評価することにより、初期分化段階における、筋芽細胞から筋肉細胞／筋肉線維への分化に、一実施例によるペプチドが及ぼす影響を確認するものである。

２－１．タンパク質発現分析を介する評価
Ｃ２Ｃ１２細胞を、１％Ｐ／Ｓ及び２％ＢＣＳを含むＤＭＥＭ培地で培養した後、細胞占有面積率（cell confluency）が７０～８０％ほどになったとき、それを６－ウェル培養プレートにシーディングした。その後、６－ウェル培養プレート内細胞の細胞占有面積率（cell confluency）が１００％になったとき、培養培地を分化培地（１％Ｐ／Ｓ、２％ horse serum）で代替しながら、そこに、５，５０または１００μｇ／ｍｌの配列番号１のペプチドを添加した。その後、２日に１回ずつ、分化培地と同量の配列番号１のペプチドを交替させて添加した。培地交替を初めて行った日から３日経過後、培養物に溶解バッファを添加し、培養物を溶解させた後、４℃、１２，０００ｒｐｍで３０分間遠心分離し、タンパク質を得て、それを、ＢＣＡキットを使用し、定量した。前記タンパク質を含むサンプルを対象にＳＤＳ－ＰＡＧＥを実施し、それぞれのタンパク質を分離した後、それをメンブレンに電気泳動転写（electrotransfer）した。前記タンパク質が付着されたメンブレンを、５％脱脂粉乳で処理してブロッキングした後、一次抗体を４℃で一晩反応させた。ＰＢＳ－Ｔで洗浄した後、二次抗体を常温で１時間反応させ、さらにＰＢＳ－Ｔで洗浄した後、それをＧｅｌＤｏｃ（Bio-Rad（Hercules（CA，米国）））及びWestern検出試薬（Elpis Biotech（大田（韓国）））を介して検出した。なお、一次抗体としては、anti－ＭｙｏＧ（Santa Cruz（ＵＳＡ））を使用し、anti－Ｍｙｆ５（Abcam（ＵＫ））及びanti－ＧＡＰＤＨ（Santa Cruz（ＵＳＡ））を使用し、対照群として、非処理群（Ｎｏｎ）を使用し、比較群として、分化培地のみを処理した群（ＣＭ）を使用した。

その結果、図１及び図２に示されているように、配列番号１のペプチド処理により、筋芽細胞の分化初期マーカーであるＭｙｏＧ（myogenin）及びＭｙｆ５の発現が増大されることを確認した。

２－２．免疫蛍光法を介する評価
Ｃ２Ｃ１２細胞を、１％Ｐ／Ｓ及び２％ＢＣＳを含むＤＭＥＭ培地で培養した後、細胞占有面積率（cell confluency）が７０～８０％ほどになったとき、それを６－ウェル培養プレートにシーディングした。その後、６－ウェル培養プレート内細胞の細胞占有面積率（cell confluency）が１００％になったとき、培養培地を分化培地（１％Ｐ／Ｓ、２％ horse serum）で代替しながら、そこに、１００μｇ／ｍｌの配列番号１のペプチドを添加した。その後、２日に１回ずつ、分化培地と１００μｇ／ｍｌの配列番号１のペプチドを交替して添加した。培地交替を初めて行った日から３日経過後、前記培養された細胞を、室温で１０分間、４％パラホルムアルデヒド（ＰＦＡ）で固定させ、０．１％ Triton X-100において、５分間透過過程（permeabilization）を実施した。その後、前記固定された細胞に、ＰＢＳ、１０％ＦＢＳ及び０．１％ Triton X-100を添加し、室温で１時間ブロッキングした後、一次抗体であるＭｙｏＧ（Santa Cruz（米国））を処理し、それを室温で１時間インキュベーションした。その後、前記細胞を洗浄し、さらに二次抗体（goat anti-mouse IgG-TR（Santa Cruz（米国））と共に、室温で３０分間インキュベーションした。その後、細胞の核をＤＡＰＩ（Santa Cruz（米国））で染色し、それを。ＬＥＩＣＡ蛍光顕微鏡（ＴＣＳＳＰ８（LEICA（ドイツ））で観察した。

その結果、図３及び図４に示されているように、配列番号１のペプチド処理により、筋芽細胞の分化初期マーカーであるＭｙｏＧ（myogenin）の発現が増大されただけではなく、筋芽細胞の核領域における発現が増大されることを確認した。

前記実験結果を総合すれば、一実施例によるペプチドは、筋芽細胞から筋肉細胞への初期分化を促進させるのに寄与するということを知ることができた。

実施例３．後期分化段階における筋芽細胞の分化促進効果の確認
本実施例においては、マウス筋芽細胞であるＣ２Ｃ１２細胞の初期分化マーカータンパク質の発現変化を評価することにより、後期分化段階における、筋芽細胞から筋肉細胞／筋肉線維への分化に、一実施例によるペプチドが及ぼす影響を確認するものである。

３－１．タンパク質発現分析を介する評価
溶解バッファ添加時点（培地交替を初めて遂行した日から７日経過時点）を除いては、前記実施例２－１と同一方式で遂行し、筋芽細胞の後期分化マーカーであるＭｙＨＣ（Myosin heavy chain）タンパク質の発現レベルを確認した。なお、一次抗体として、anti－ＭｙＨＣ（Santa Cruz（米国））及びanti－ＧＡＰＤＨ（Santa Cruz（米国））を使用し、対照群として、非処理群（Ｎｏｎ）を使用し、比較群として、分化培地のみを処理した群（ＣＭ）を使用した。

その結果、図５及び図６に示されているように、配列番号１のペプチド処理により、筋芽細胞の分化後期マーカーであるＭｙＨＣ（Myosin heavy chain）の発現が増大されることを確認した。

３－２．免疫蛍光法を介する評価
固定化時点（培地交替を初めて遂行した日から７日経過時点）を除いては、前記実施例３－１と同一方式で遂行し、筋芽細胞の後期分化マーカーであるＭｙＨＣ（Myosin heavy chain）タンパク質の発現レベルを確認した。なお、一次抗体としては、anti－α－アクチニン（Santa Cruz（米国））を使用し、二次抗体としては、goat anti-mouse IgG-TR（Santa Cruz（米国））を使用し、比較群として、分化培地のみを処理した群（ＣＭ）を使用した。

その結果、図７及び図８に示されているように、配列番号１のペプチド処理により、筋芽細胞の分化後期マーカーであるα－アクチニンの発現が増大されることを確認した。

前記実験結果を総合すれば、一実施例によるペプチドは、筋芽細胞から筋細胞への後期分化を促進させるのに寄与するということを知ることができた。

実施例４．動物モデルを利用した筋肉損失阻害効果確認
本実施例においては、ＢａＣｌ_２により、筋肉損傷が誘導された動物モデルを対象に、筋肉量変化、筋肉組織内免疫疫細胞の浸潤領域、蓄積されたコラーゲンのレベル、並びに筋線維構成タンパク質及び炎症性タンパク質の発現レベルを評価することにより、筋肉損失阻害に、一実施例によるペプチドが及ぼす影響を確認するものである。

４－１．筋肉量評価
８週齢雄Ｃ５７ＢＬ／６マウスの全脛骨（ＴＡ：tibialis anterior）筋肉に、１．２％（ｗ／ｖ）５０μｌのＢａＣｌ_２水溶液を注射し、１日の間、マウスの筋肉損傷を誘導した。その後、前記筋肉損傷が誘導されたマウスに、２０ｍｇの配列番号１のペプチドを、０．１ｍｇ／μｌの濃度で、１日間隔で総６回経口投与した。陽性対照群については、０．５μｇのＩＧＦ－Ｉを、０．０１μｇ／μｌの濃度で筋肉注射した。筋肉損傷を誘導した日から７日目、マウスを犠牲にし、全脛骨（ＴＡ）筋肉の変化を肉眼で確認し、その重量を測定した。対照群としては、非処理群（Ｎｏｎ）を使用し、陰性対照群としては、ＢａＣｌ_２による筋肉損傷だけ誘導された群（Ｎ．Ｃ）を使用し、陽性対照群としては、ＢａＣｌ_２による筋肉損傷が誘導された群にＩＧＦ－Ｉを処理した群（Ｐ．Ｃ）を使用した。

その結果、図９及び図１０に示されているように、配列番号１のペプチド処理により、ＢａＣｌ_２による筋肉損傷が誘導されたマウスの全脛骨（ＴＡ）筋肉の筋肉量が増大されることを確認し、それにより、損傷された筋肉の再生を促進させうることを知ることができた。

４－２．筋肉組織染色を介する評価
前記実施例４－１の筋肉損傷が誘導されたマウスから得られた筋肉組織を、室温でＰＢＳで洗浄した後、４％パラホルムアルデヒド（ＰＦＡ）で固定させた。その後、固定化された筋肉組織をＰＢＳで３回洗浄し、それに対し、gradient ethanol series（７０％から１００％）で脱水（dehydration）させた。前記筋肉組織サンプルを、４μｍの大きさに切片化した。前記切片化された標本を含む組織スライドは、gradient ethanol seriesを介し、脱蝋（dewaxing）及び脱水（hydration）され、順次にヘマトキシリン溶液で１分間染色され、エオシン溶液で１０秒間染色された。染色を終えた後、組織スライドを、順次に９０％，１００％エタノールに浸漬させ、最後にキシレンに５分間、２回浸漬させた後、組織スライドに対するマウンティングを進めた（Ｈ＆Ｅ染色）。

また、前述の切片化された標本を含む組織スライドを、前述のように、脱蝋（dewaxing）及び脱水（hydration）させた後、Picro-Sirius Red Solutionで６０分染色した後、１％酢酸溶液に２分間２回浸漬させ、それをＤ．Ｗで洗浄した。その後、組織スライドをエタノールに浸漬させ、最後にキシレンに５分間、２回浸漬させた後、組織スライドに対するマウンティングを進めた（シリウスレッド染色）。
その結果、図１１及び図１２に示されているように、配列番号１のペプチド処理により、ＢａＣｌ_２による筋肉損傷が誘導された組織内免疫疫細胞の浸潤領域が低減されることを確認した。また、図１３及び図１４に示されているように、配列番号１のペプチド処理により、ＢａＣｌ_２による筋肉損傷が誘導された組織内コラーゲンの蓄積が低減されたことを確認した。

４－３．筋肉組織内タンパク質発現分析を介する評価
前記実施例４－１の筋肉損傷が誘導されたマウスから修得した筋肉組織をｈｏｍｏｇｅｎｉｚｅｒを利用し、破鎖して、ここに溶解バッファを添加して破鎖物を溶解させた後４℃、１２，０００ｒｐｍで３０分間遠心分離してタンパク質を修得して、それをＢＣＡキットを使用して定量した。前記タンパク質を含むサンプルを対象でＳＤＳ－ＰＡＧＥを実施してそれぞれのタンパク質を分離した後、それをメンブレンに電気泳動転写（electrotransfer）した。前記タンパク質が付着したメンブレンを５％脱脂粉乳で処理してブロッキングした後、一次抗体を４℃で一晩反応させた。ＰＢＳ－Ｔに洗浄した後二次抗体を常温で１時間反応させてまたＰＢＳ－Ｔで洗浄した後、それをＧｅｌＤｏｃ（Ｂｉｏ－Ｒａｄ、Ｈｅｒｃｕｌｅｓ、ＣＡ（米国））、及びＷｅｓｔｅｒｎ検出試薬（ＥｌｐｉｓＢｉｏｔｅｃｈ、Ｄａｅｊｅｏｎ、Ｋｏｒｅａ）を介して検出した。一方、一次抗体としては、anti－ＭｙＨＣ（Santa Cruz（米国））を使用し、anti－α－アクチニン（Santa Cruz（米国））、anti－α－ＳＭＡ（Ａｂｃａｍ、ＵＫ）、anti－ＩＬ－６（Santa Cruz（米国））、anti－α－ｔｕｂｕｌｉｎ（Santa Cruz（米国））を使用した。
その結果、図１５及び図１６に示されているように、配列番号１のペプチド処理により、ＢａＣｌ_２による筋肉損傷が誘導された組織内筋線維構成タンパク質であるＭｙＨＣ及びα－アクチニンの発現が増大されることを確認した。また、図１７及び図１８に示されているように、配列番号１のペプチド処理により、ＢａＣｌ_２による筋肉損傷が誘導された組織内炎症性タンパク質であるα－ＳＭＡ及びＩＬ－６の発現が低減されることを確認した。

前記実験結果を総合すれば、一実施例によるペプチドは、損傷された筋肉の再生または回復を行わせるだけではなく、筋肉損傷を引き起こす炎症反応のような筋肉損傷の進行を抑制するのに寄与しうるということを知ることができた。

剤形例１．ペプチドナノソームの製造
前記実施例１のペプチド５０ｍｇを、蒸溜水５００ｍｌで十分に撹拌して溶解した。配合体溶液を、レシチン５ｇ、オレイン酸ナトリウム（sodium oleate）０．３ｍｌ、エタノール５０ｍｌ、そして若干の油状と共に混合した後、総量が１Ｌになるように蒸溜水で量を合わせ後、マイクロフルイダイザでもって、高圧を利用して乳化させ、サイズ１００ｎｍほどのペプチドナノソームを製造した。

剤形例２．薬学的製剤
２－１．散剤の製造
下記成分を混合し、気密分包に充填して散剤を製造する。
本発明のペプチド２０ｍｇ
乳糖１００ｍｇ
タルク１０ｍｇ

２－２．錠剤の製造
下記成分を混合した後、通常の錠剤の製造方法によって打錠し、錠剤を製造する。
本発明のペプチド１０ｍｇ
とうもろこし澱粉１００ｍｇ
乳糖１００ｍｇ
ステアリン酸マグネシウム２ｍｇ

２－３．カプセル剤の製造
通常のカプセル剤製造方法によって下記成分を混合し、ゼラチンカプセルに充填し、カプセル剤を製造する。
本発明のペプチド１０ｍｇ
結晶性セルロース３ｍｇ
ラクトース１４．８ｍｇ
ステアリン酸マグネシウム０．２ｍｇ

２－４．注射剤の製造
通常の注射剤の製造方法により、１アンプル当たり（２ｍｌ）下記成分含量で製造する。
本発明のペプチド１０ｍｇ
マンニトール１８０ｍｇ
注射用滅菌蒸溜水２，９７４ｍｇ
Ｎａ_２ＨＰＯ_４・２Ｈ_２Ｏ２６ｍｇ
２－５．液剤の製造

通常の液剤の製造方法により、精製水にそれぞれの成分を加えて溶解させ、下記成分を混合した後、精製水を加え、全体を１００ｍｌに調節した後、褐色ビンに充填して滅菌させ、液剤を製造する。
本発明のペプチド１０ｍｇ
異性化糖１０ｇ
マンニトール５ｇ
精製水（適量）

前述の本発明の説明は、例示のためのものであり、本発明が属する技術分野の通常の知識を有する者であるならば、本発明の技術的思想や、必須な特徴を変更せずとも、他の具体的な形態に容易に変形が可能であるということを理解しうるであろう。従って、以上で記述した実施例は、全ての面において例示的なものであり、限定的ではないと理解しなければならない。

Claims

配列番号１のアミノ酸配列によってなる、ペプチド。
前記ペプチドのＮ末端は、アセチル基（acetyl group）、フルオレニルメトキシカルボニル基（fluorenylmethoxycarbonyl group）、ホルミル基（formyl group）、パルミトイル基（palmitoyl group）、ミリスチル基（myristyl group）、ステアリル基（stearyl group）、ブトキシカルボニル基（butoxycarbonyl group）、アリルオキシカルボニル基（allyloxycarbonyl group）及びポリエチレングリコール（ＰＥＧ：polyethylene glycol）によってなる群のうちから選択されるいずれか１つの保護基と結合されたものである、請求項１に記載のペプチド。
前記ペプチドのＣ末端は、アミノ基（amino group（－ＮＨ_２））、第三級アルキル基（tertiary alkyl group）及びヒドラジノ（hydrazino（－ＮＨＮＨ_２））によってなる群のうちから選択されるいずれか１つの保護基と結合されたものである、請求項１に記載のペプチド。
前記ペプチドは、下記のような特性から選択されるいずれか１以上を示すものである、請求項１に記載のペプチド：
（ａ）myogenin及びmyogenic factor 5の発現増進、
（ｂ）ミオシン重鎖（myosin heavy chain）及びα－アクチニンの発現増進、並びに
（ｃ）α－smooth muscle actin及びインターロイキン－６の発現低減。
請求項１ないし４のうちいずれか１項に記載のペプチドを有効成分として含む、筋肉疾患の予防用または治療用の薬剤学的組成物。
前記筋肉疾患は、筋機能低下、筋肉消耗または筋肉退化による筋肉疾患である、請求項５に記載の薬剤学的組成物。
前記筋肉疾患は、筋減少症（sarcopenia）、緊張減退症（atony）、筋異栄養症（muscular dystrophy）、筋萎縮症（muscular atrophy）、筋肉退化、筋硬直症、筋委縮性側索硬化症、筋無力症及び悪液質（cachexia）のうちいずれか一つである、請求項６に記載の薬剤学的組成物。
請求項１ないし４のうちいずれか１項に記載のペプチドを有効成分として含む、筋肉疾患の予防用または改善用の食品組成物。
前記筋肉疾患は、筋機能低下、筋肉消耗または筋肉退化による筋肉疾患である、請求項８に記載の食品組成物。
前記食品組成物は、ビタミンＣ、ビタミンＢ１、ビタミンＢ２、ビタミンＢ６、ビタミンＨ、ビタミンＰＰ、プロビタミンＢ５、ビタミンＡ、ビタミンＤ、ビタミンＥ、ビタミンＫ１またはカロチン、あるいはそれらの混合物から選択されたいずれか１つの成分を追加して含む、請求項８に記載の食品組成物。