JP7840866B2

JP7840866B2 - 植物調節エレメント及びその使用

Info

Publication number: JP7840866B2
Application number: JP2022564635A
Authority: JP
Inventors: チトゥール，ジャイシュリー・エム; フラシンスキー，スタニスラフ
Original assignee: Monsanto Technology LLC
Current assignee: Monsanto Technology LLC
Priority date: 2020-04-28
Filing date: 2021-04-23
Publication date: 2026-04-06
Anticipated expiration: 2041-04-23
Also published as: AU2021264422A1; US20210332378A1; US20240287537A1; CA3180659A1; US11970704B2; PE20230828A1; US20260028639A1; EP4143214A1; ECSP22084077A; CL2022002959A1; PY2132869A; WO2021222032A1; CO2022016083A2; UY39182A; KR20230004531A; EP4143214A4; CN115461359A; JP2023524658A; US12480136B2; AR122445A1

Description

関連出願の参照
本出願は、２０２０年４月２８日に出願された米国仮出願第６３／０１６，９０４号による利益を主張し、当該出願の全体が参照により本明細書に援用される。

配列表の援用
「ＭＯＮＳ４８１ＷＯ－ｓｅｑｕｅｎｃｅ＿ｌｉｓｔｉｎｇ．ｔｘｔ」という名称のファイルに含まれる配列表は、１３，５５０バイト（ＭｉｃｒｏｓｏｆｔＷｉｎｄｏｗｓ（登録商標）での計測）であり、２０２１年４月２２日に作成されたものであり、電子申請により本明細書と共に提出され、参照により本明細書に援用される。

本発明は、植物分子生物学及び植物遺伝子工学の分野に関する。より具体的には、本発明は、植物内の遺伝子発現を調整するのに有用なＤＮＡ分子に関する。

調節エレメントは、作動可能に連結された転写可能なＤＮＡ分子の転写を調整することによって遺伝子活性を調節する遺伝的要素である。このようなエレメントとしては、プロモーター、リーダー、イントロン、及び３´非翻訳領域を挙げることができ、これらは、植物分子生物学及び植物遺伝子工学の分野で有用である。

本発明は、植物で使用するための遺伝子調節エレメントを提供する。本発明はまた、調節エレメントを含む組換えＤＮＡ分子も提供する。本発明は、調節エレメントを含むトランスジェニック植物細胞、植物、及び種子も提供する。１つの実施形態において、調節エレメントは、転写可能なＤＮＡ分子と作動可能に連結されている。ある特定の実施形態において、転写可能なＤＮＡ分子は、調節配列に対し異種であってもよい。したがって、本発明によって提供される調節エレメント配列は、特定の実施形態においては、異種の転写可能なＤＮＡ分子と作動可能に連結されていると定義され得る。本発明はまた、調節エレメントを使用し、調節エレメントを含む組換えＤＮＡ分子、ならびに転写可能なＤＮＡ分子と作動可能に連結された調節エレメントを含むトランスジェニック植物細胞、植物、及び種子を作製及び使用する方法も提供する。

したがって、１つの態様において、本発明は、組換えＤＮＡ分子であって、（ａ）配列番号１～５のいずれかに対し少なくとも約８５パーセントの配列同一性を有する配列、（ｂ）配列番号１～５のいずれかを含む配列、ならびに（ｃ）遺伝子調節活性を有する、配列番号１～５のいずれかのフラグメントからなる群より選択されるＤＮＡ配列を含み、当該配列が、異種の転写可能なＤＮＡ分子と作動可能に連結されている、組換えＤＮＡ分子を提供する。「異種の転写可能なＤＮＡ分子」とは、転写可能なＤＮＡ分子が、作動可能に連結されたポリヌクレオチド配列に対し異種であることを意味する。特定の実施形態では、組換えＤＮＡ分子は、配列番号１～５のいずれかのＤＮＡ配列に対して少なくとも約８５パーセント、少なくとも約８６パーセント、少なくとも約８７パーセント、少なくとも約８８パーセント、少なくとも約８９パーセント、少なくとも約９０パーセント、少なくとも９１パーセント、少なくとも９２パーセント、少なくとも９３パーセント、少なくとも９４パーセント、少なくとも９５パーセント、少なくとも９６パーセント、少なくとも９７パーセント、少なくとも９８パーセント、または少なくとも９９パーセントの配列同一性を有するＤＮＡ配列を含む。

別の態様において、本明細書では、組換えＤＮＡ分子を含むトランスジェニック植物細胞であって、（ａ）配列番号１～５のいずれかに対し少なくとも約８５パーセントの配列同一性を有する配列、（ｂ）配列番号１～５のいずれかを含む配列、ならびに（ｃ）遺伝子調節活性を有する、配列番号１～５のいずれかのフラグメントからなる群より選択されるＤＮＡ配列を含み、当該ＤＮＡ配列が、異種の転写可能なＤＮＡ分子と作動可能に連結されている、組換えＤＮＡ分子を含むトランスジェニック植物細胞を提供する。ある特定の実施形態では、トランスジェニック植物細胞は、単子葉植物細胞である。他の実施形態において、トランスジェニック植物細胞は双子葉植物細胞である。

さらにまた別の態様において、本明細書ではさらに、組換えＤＮＡ分子を含むトランスジェニック植物またはその部位であって、ａ）配列番号１～５のいずれかに対し少なくとも８５パーセントの配列同一性を有する配列、ｂ）配列番号１～５のいずれかを含む配列、ならびにｃ）遺伝子調節活性を有する、配列番号１～５のいずれかのフラグメントからなる群より選択されるＤＮＡ配列を含み、当該配列が、異種の転写可能なＤＮＡ分子と作動可能に連結されている、組換えＤＮＡ分子を含むトランスジェニック植物またはその部位を提供する。特定の実施形態では、トランスジェニック植物は、組換えＤＮＡ分子を含む任意の世代の後代植物である。また、成長した際にかかるトランスジェニック植物を産生する、組換えＤＮＡ分子を含むトランスジェニック種子も提供される。

別の態様では、本発明は、本発明の組換えＤＮＡ分子を含有するトランスジェニック植物またはその部位を得ることと、それから商品生産物を生産することとを含む、商品生産物を生産する方法を提供する。１つの実施形態において、商品生産物は、種子、加工種子、タンパク質濃縮物、タンパク質単離物、デンプン、穀物、植物の部位、種子油、バイオマス、細粉、及び粗粉である。

さらにまた別の態様において、本発明は、本発明の組換えＤＮＡ分子で植物細胞を形質転換して形質転換植物細胞を産生することと、当該形質転換植物細胞からトランスジェニック植物を再生することとを含む、本発明の組換えＤＮＡ分子を含むトランスジェニック植物を産生する方法を提供する。

配列の簡単な説明
配列番号１はイントロン（Ｉ－ＡＮＤｇｅ．Ｕｂｑ：２）に対し５´側に作動可能に連結されたリーダー（Ｌ－ＡＮＤｇｅ．Ｕｂｑ：２）に対し、５´側に作動可能に連結されたプロモーター（Ｐ－ＡＮＤｇｅ．Ｕｂｑ：７）から構成される、Ａｎｄｒｏｐｏｇｏｎｇｅｒａｒｄｉｉ由来の調節発現エレメント群またはＥＸＰ（ＥＸＰ－ＡＮＤｇｅ．Ｕｂｑ：５）のＤＮＡ配列である。

配列番号２はＡｎｄｒｏｐｏｇｏｎｇｅｒａｒｄｉｉ由来のプロモーター（Ｐ－ＡＮＤｇｅ．Ｕｂｑ：７）のＤＮＡ配列である。

配列番号３はＡｎｄｒｏｐｏｇｏｎｇｅｒａｒｄｉｉ由来のリーダーまたは５´ＵＴＲ（Ｌ－ＡＮＤｇｅ．Ｕｂｑ：２）のＤＮＡ配列である。

配列番号４はＡｎｄｒｏｐｏｇｏｎｇｅｒａｒｄｉｉ由来のイントロン（Ｉ－ＡＮＤｇｅ．Ｕｂｑ：２）のＤＮＡ配列である。

配列番号５はＡｒｕｎｄｏｄｏｎａｘ由来の３´ＵＴＲ（Ｔ－ＡＲＵｄｏ．ＴｕｂＡ：１）のＤＮＡ配列である。

配列番号６はＥＸＰ（ＥＸＰ－ＣａＭＶ．３５Ｓ＋Ｚｍ．ＤｎａＫ：１２）のＤＮＡ配列である。

配列番号７はＳｏｒｇｕｍｂｉｃｏｌｏｒ由来の３´ＵＴＲ（Ｔ－Ｓｂ．Ｎｌｔｐ４－１：１：２）のＤＮＡ配列である。

配列番号８はジャガイモ光誘導性組織特異的Ｓｔ－ＬＳ１遺伝子（ＧｅｎｂａｎｋＡｃｃｅｓｓｉｏｎ：Ｘ０４７５３）由来のプロセシング可能なイントロンを有する、β－グルクロニダーゼ（ＧＵＳ、ＧＯＩ－Ｅｃ．ｕｉｄＡ＋Ｓｔ．ＬＳ１．ｎｎｏ：１）の植物発現用に最適化された合成コード配列である。

本発明は、植物における遺伝子調節活性を有する調節エレメントを提供する。これらの調節エレメントのヌクレオチド配列は、配列番号１～５として提供される。これらの調節エレメントは、植物組織内で、作動可能に連結された転写可能なＤＮＡ分子の発現に影響を及ぼし得、そのため、トランスジェニック植物内で、作動可能に連結された導入遺伝子の遺伝子発現を調節し得る。また、本発明は、提供される調節エレメントを含む組換えＤＮＡ分子を修飾、産生、及び使用する方法も提供する。また、本発明は、本発明の組換えＤＮＡ分子を含むトランスジェニック植物細胞、植物、植物の部位、及び種子を含む組成物、ならびにこれらを調製し使用するための方法も提供する。

以下の定義及び方法は、本発明をより良好に定義し、当業者が本発明を実施する指針とするために提供される。別途注記のない限り、用語は、関連技術分野の当業者により、従来の用法に従って理解されるものとする。

ＤＮＡ分子
本明細書で使用する場合、「ＤＮＡ」または「ＤＮＡ分子」という用語は、５´（上流）末端から３´（下流）末端へと読み取られる、ゲノム起源または合成起源の２本鎖ＤＮＡ分子（すなわち、デオキシリボヌクレオチド塩基またはＤＮＡ分子のポリマー）を指す。本明細書で使用する場合、「ＤＮＡ配列」という用語は、ＤＮＡ分子のヌクレオチド配列を指す。本明細書で使用される命名法は、米国連邦規則集３７編１．８２２条の命名法に対応し、ＷＩＰＯ標準ＳＴ．２５（１９９８）附属書２、表１及び３の表に定められる。

本明細書で使用する場合、「組換えＤＮＡ分子」とは、人間の介入なしには天然に一緒に生じないであろうＤＮＡ分子の組合せを含むＤＮＡ分子である。例えば、組換えＤＮＡ分子とは、互いに対して異種である少なくとも２つのＤＮＡ分子から構成されているＤＮＡ分子、自然界に存在するＤＮＡ配列から逸脱するＤＮＡ配列を含むＤＮＡ分子、合成ＤＮＡ配列を含むＤＮＡ分子、または遺伝子形質転換もしくは遺伝子編集によって宿主細胞のＤＮＡに組み込まれたＤＮＡ分子であってもよい。

本出願における「単離されたＤＮＡ分子」、または等価の用語もしくは表現への言及は、ＤＮＡ分子が、単独で、または他の組成物と組合せて存在するが、その自然環境内には存在しないものであることを意味するように意図されている。例えば、コード配列、イントロン配列、非翻訳リーダー配列、プロモーター配列、転写終結配列等のような、生物のゲノムのＤＮＡ内で天然に見出される核酸エレメントは、当該エレメントが生物のゲノム内にあり、当該エレメントが天然に見出されるゲノム内の位置にある限りは、「単離された」とは見なされない。ただし、これらのエレメントの各々、及びこれらのエレメントの下位部分は、当該エレメントが生物のゲノム内になく、当該エレメントが天然に見出されるゲノム内の位置にない限り、本開示の範囲内で「単離されている」ものである。同様に、殺虫性タンパク質またはそのタンパク質の天然に生じる任意の殺虫性バリアントをコードするヌクレオチド配列は、当該ヌクレオチド配列が、当該タンパク質をコードする配列が天然に見出される細菌のＤＮＡ内にない限り、単離されたヌクレオチド配列と考えられる。天然に存在する殺虫性タンパク質のアミノ酸配列をコードする合成ヌクレオチド配列は、本開示の目的において単離されていると見なされると考えられる。本開示の目的において、任意のトランスジェニックヌクレオチド配列、すなわち、植物もしくは細菌の細胞のゲノム内に挿入されるか、または染色体外ベクター内に存在するＤＮＡのヌクレオチド配列は、それが、細胞の形質転換に使用されるプラスミドもしくは同様の構造内に存在しても、植物もしくは細菌のゲノム内に存在しても、または植物もしくは細菌に由来する組織、後代、生物学的試料、もしくは商品生産物の中に検出可能量で存在しても、単離されたヌクレオチド配列であると見なされると考えられる。

本明細書で使用する場合、「配列同一性」という用語は、２つの最適にアラインメントしたポリヌクレオチド配列または２つの最適にアラインメントしたポリペプチド配列が同一である程度を指す。最適な配列アラインメントは、２つの配列、例えば、参照配列ともう１つの配列とを手動でアラインメントして、適切な内部ヌクレオチド挿入、欠失、またはギャップを伴った配列アラインメント内のヌクレオチドマッチ数を最大化することによって作出される。本明細書で使用する場合、「参照配列」という用語は、配列番号１～５として提供されるＤＮＡ配列を指す。

本明細書で使用する場合、「配列同一性パーセント」または「同一性パーセント」または「同一性％」という用語は、同一性の割合に１００を掛けたものである。参照配列に対して最適にアラインメントした配列についての「同一性の割合」は、最適アラインメント内のヌクレオチドマッチ数を、参照配列内のヌクレオチド総数、例えば、全長の参照配列全体のヌクレオチド総数で割ったものである。故に、本発明の１つの実施形態は、本明細書で配列番号１～５として提供される参照配列に対して最適にアラインメントした場合に、参照配列に対して少なくとも約８５パーセントの同一性、少なくとも約８６パーセントの同一性、少なくとも約８７パーセントの同一性、少なくとも約８８パーセントの同一性、少なくとも約８９パーセントの同一性、少なくとも約９０パーセントの同一性、少なくとも約９１パーセントの同一性、少なくとも約９２パーセントの同一性、少なくとも約９３パーセントの同一性、少なくとも約９４パーセントの同一性、少なくとも約９５パーセントの同一性、少なくとも約９６パーセントの同一性、少なくとも約９７パーセントの同一性、少なくとも約９８パーセントの同一性、少なくとも約９９パーセントの同一性、または少なくとも約１００パーセントの同一性を有する配列を含む、ＤＮＡ分子を提供する。

調節エレメント
プロモーター、リーダー（別名、５´ＵＴＲ）、エンハンサー、イントロン、及び転写終結領域（または３´ＵＴＲ）等の調節エレメントは、生細胞内での遺伝子の全体的発現において不可欠な役割を果たす。本明細書で使用する場合、「調節エレメント」という用語は、遺伝子調節活性を有するＤＮＡ分子を指す。本明細書で使用する場合、「遺伝子調節活性」という用語は、例えば、作動可能に連結された転写可能なＤＮＡ分子の転写及び／または翻訳に影響を及ぼすことにより、作動可能に連結された転写可能なＤＮＡ分子の発現に影響を及ぼす能力を指す。植物において機能するプロモーター、リーダー、エンハンサー、イントロン、及び３´ＵＴＲ等の調節エレメントは、遺伝子工学による植物の表現型の修飾に有用である。

本明細書で使用する場合、「調節発現エレメント群」または「ＥＸＰ」配列とは、作動可能に連結された調節エレメント群、例えば、エンハンサー、プロモーター、リーダー、及びイントロンの群を指し得る。例えば、調節発現エレメント群は、例えば、イントロン配列に対して５´側に作動可能に連結されたリーダー配列に対して５´側に作動可能に連結されたプロモーターから構成され得る。本発明を実施するのに有用なＥＸＰは、配列番号１として提示されている。

調節エレメントは、それらの遺伝子発現パターン、例えば、正及び／または負の効果、例えば、恒常的発現または時間的、空間的、発達的、組織、環境的、生理学的、病理学的、細胞周期、及び／もしくは化学的応答性の発現、ならびにそれらの任意の組合せ、加えて定量的または定性的指標によって特徴付けられ得る。本明細書で使用する場合、「遺伝子発現パターン」とは、作動可能に連結されたＤＮＡ分子が転写ＲＮＡ分子へと転写される任意のパターンである。転写されたＲＮＡ分子は、翻訳されてタンパク質分子を生み出す場合もあれば、アンチセンスＲＮＡまたは他の調節ＲＮＡ分子、例えば、二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）、トランスファーＲＮＡ（ｔＲＮＡ）、リボソームＲＮＡ（ｒＲＮＡ）、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）等をもたらす場合もある。

本明細書で使用する場合、「タンパク質発現」という用語は、転写ＲＮＡ分子がタンパク質分子へと翻訳される任意のパターンである。タンパク質発現は、その時間的、空間的、発達的、または形態学的な性質によって、加えて定量的または定性的指標によって特徴付けられ得る。

プロモーターは、作動可能に連結された転写可能なＤＮＡ分子の発現を調整するための調節エレメントとして有用である。本明細書で使用する場合、「プロモーター」という用語は、一般に、転写を開始するためにＲＮＡポリメラーゼＩＩ及び他のタンパク質（例えば、トランス作用転写因子）の認識及び結合に関与するＤＮＡ分子を指す。プロモーターは、ゲノム遺伝子コピーの５´非翻訳領域（５´ＵＴＲ）から初期に単離され得るか、または本開示の目的において、本明細書で提供されるプロモーターは、リーダーに対して５´側に作動可能に連結されたプロモーターから構成される。代替的に、プロモーターは、合成的に生産または操作されたＤＮＡ分子であってもよい。また、プロモーターはキメラであってもよい。キメラプロモーターは、２つ以上の異種ＤＮＡ分子の融合により生産される。本発明を実施するのに有用なプロモーターは、配列番号２として提示されているか、またはそのフラグメントもしくはバリアントである。本発明の特定の実施形態において、本明細書で説明される、特許請求の範囲のＤＮＡ分子及びその任意のバリアントまたは誘導体はさらに、プロモーター活性を含むものとして定義され、すなわち、トランスジェニック植物などの宿主細胞内でプロモーターとして作用し得る。なおさらなる特定の実施形態において、フラグメントは、それが由来する開始プロモーター分子が有するプロモーター活性を示すものとして定義される場合もあれば、フラグメントは、基礎レベルの転写をもたらし、転写開始するためにＲＮＡポリメラーゼＩＩ複合体が認識及び結合するためのＴＡＴＡボックスまたは同等のＤＮＡ配列から構成された「最小プロモーター」を含む場合もある。

１つの実施形態において、本明細書で開示されるプロモーター配列のフラグメントが提供される。プロモーターフラグメントは、上記のようなプロモーター活性を含み得、また、単独で、または（例えば、キメラプロモーターを構築する際の）他のプロモーター及びプロモーターフラグメントとの組合せで、または他の発現エレメント及び発現エレメントのフラグメントとの組合せで有用であり得る。特定の実施形態において、少なくとも約５０、少なくとも約７５、少なくとも約９５、少なくとも約１００、少なくとも約１２５、少なくとも約１５０、少なくとも約１７５、少なくとも約２００、少なくとも約２２５、少なくとも約２５０、少なくとも約２７５、少なくとも約３００、少なくとも約５００、少なくとも約６００、少なくとも約７００、少なくとも約７５０、少なくとも約８００、少なくとも約９００、または少なくとも約１０００の連続したヌクレオチド、またはそれ以上の、本明細書で開示されるプロモーター活性を有するＤＮＡ分子を含む、プロモーターのフラグメントが提供される。開始プロモーター分子からこのようなフラグメントを産生するための方法は、当該技術分野で周知である。

配列番号２のプロモーターエレメント（例えば、内部もしくは５´欠失）に由来する組成物は、例えば、発現を改善または改変するために、発現に正もしくは負いずれかの効果を及ぼすエレメントの除去、発現に正もしくは負の効果を及ぼすエレメントの重複、及び／または発現に組織特異的もしくは細胞特異的な効果を及ぼすエレメントの重複もしくは除去を含む、当該技術分野で公知の方法を用いて産生され得る。配列番号２のプロモーターエレメント（ＴＡＴＡボックスエレメントもしくはその同等の配列及び下流配列が除去されている３´欠失から構成される）に由来する組成物を使用して、例えば、エンハンサーエレメントを作製し得る。さらなる欠失を行って、発現に正または負の組織特異的、細胞特異的、または時間特異的な（例えば、限定されるものではないが、概日リズム）効果を及ぼす任意のエレメントを除去することができる。配列番号２として提供されるプロモーターエレメント、ならびにそれに由来するフラグメントもしくはエンハンサーを使用して、キメラ転写調節エレメント組成物を作製し得る。

本発明によれば、プロモーターまたはプロモーターフラグメントは、公知のプロモーターエレメント、すなわち、ＴＡＴＡボックス及び他の公知の転写因子結合部位モチーフなどのＤＮＡ配列特性の存在について解析されることがある。このような公知のプロモーターエレメントの識別情報は、当業者により、元のプロモーターと同様の発現パターンを有するプロモーターのバリアントを設計するために使用され得る。

本明細書で使用する場合、「リーダー」という用語は、遺伝子の非翻訳５´領域（５´ＵＴＲ）から単離され、転写開始部位（ＴＳＳ）とタンパク質コード配列開始部位との間のヌクレオチドセグメントとして一般に定義される、ＤＮＡ分子を指す。代替的に、リーダーは、合成的に産生または操作されたＤＮＡエレメントであってもよい。リーダーは、作動可能に連結されている転写可能なＤＮＡ分子の発現を調整するための５´調節エレメントとして使用され得る。リーダー分子は、異種プロモーターまたはそれらのネイティブプロモーターと共に使用されてもよい。本発明を実施するのに有用なリーダーは、配列番号３として提示されているか、またはそのフラグメントもしくはバリアントである。特定の実施形態において、このようなＤＮＡ配列は、宿主細胞（例えば、トランスジェニック植物細胞を含む）内でリーダーとして作用し得ると定義され得る。１つの実施形態において、このような配列は、リーダー活性を含むものとしてデコードされる。

配列番号３のリーダー配列（５´ＵＴＲとも称される）は、調節エレメントから構成される場合もあれば、または作動可能に連結された転写可能なＤＮＡ分子の転写もしくは翻訳に効果を及ぼし得る二次構造を採用する場合もある。配列番号３のリーダー配列を本発明に従って使用して、作動可能に連結された転写可能なＤＮＡ分子の転写または翻訳に影響を与えるキメラ調節エレメントを作製し得る。

本明細書で使用する場合、「イントロン」という用語は、遺伝子から単離または同定され得、翻訳前のメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）プロセシング中にスプライシング除去される領域として一般に定義され得る、ＤＮＡ分子を指す。代替的に、イントロンは、合成的に生成または操作されたＤＮＡエレメントであってもよい。イントロンは、作動可能に連結された遺伝子の転写をもたらすエンハンサーエレメントを含んでもよい。イントロンは、作動可能に連結されている転写可能なＤＮＡ分子の発現を調整するための調節エレメントとして使用され得る。構築物はイントロンを含んでもよく、このイントロンは、転写可能なＤＮＡ分子に対して異種である場合もそうでない場合もある。当該技術分野におけるイントロンの例としては、イネのアクチンイントロン及びトウモロコシのＨＳＰ７０イントロンが挙げられる。

植物では、遺伝子構築物にいくつかのイントロンを含めると、イントロンを欠く構築物と比較して、ｍＲＮＡ及びタンパク質の蓄積が増加する。この効果は、遺伝子発現の「イントロン媒介増強」（ＩＭＥ）と称されている。植物での発現を刺激することが公知のイントロンは、トウモロコシ遺伝子（例えば、ｔｕｂＡ１、Ａｄｈ１、Ｓｈ１、及びＵｂｉ１）、イネ遺伝子（例えば、ｔｐｉ）、ならびにペチュニア（例えば、ｒｂｃＳ）、ジャガイモ（例えば、ｓｔ－ｌｓ１）由来、及びＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓｔｈａｌｉａｎａ（例えば、ｕｂｑ３及びｐａｔ１）由来の遺伝子のような双子葉植物遺伝子で同定されている。イントロンのスプライス部位内の欠失または変異によって遺伝子発現が低減することが示されており、このことは、ＩＭＥにはスプライシングが必要であり得ることを示すものである。ただし、双子葉植物でのＩＭＥは、Ａ．ｔｈａｌｉａｎａのｐａｔ１遺伝子のスプライス部位内における点変異によって示されている。１つの植物における同じイントロンの複数回使用は、デメリットを呈することが示されている。このような場合、適切な組換えＤＮＡエレメントを構築するために、基本的な制御エレメントを集めることが必要になる。本発明を実施するのに有用な例示的なイントロンは、配列番号４として提示されている。

本明細書で使用する場合、「３´転写終結分子」、「３´非翻訳領域」、または「３´ＵＴＲ」という用語は、ｍＲＮＡ分子の３´部分の非翻訳領域への転写中に使用されるＤＮＡ分子を指す。ｍＲＮＡ分子の３´非翻訳領域は、特異的切断及び３´ポリアデニル化（ポリＡテールとしても公知）によって生成され得る。３´ＵＴＲは、転写可能なＤＮＡ分子に作動可能に連結され、その下流に位置し得、転写、ｍＲＮＡプロセシング、または遺伝子発現に影響を及ぼし得るポリアデニル化シグナル及びその他の調節シグナルを含んでもよい。ポリＡテールは、ｍＲＮＡの安定性及び翻訳の開始において機能すると考えられている。当該技術分野における３´転写終結分子の例は、ノパリンシンターゼ３´領域、コムギｈｓｐ１７３´領域、エンドウルビスコ小サブユニット３´領域、ワタＥ６３´領域、及びコイクシン（ｃｏｉｘｉｎ）３´ＵＴＲである。

典型的には、３´ＵＴＲが特定のＤＮＡ分子の組換え発現に用いるのに有益であることが認められている。弱い３´ＵＴＲはリードスルーを生じる可能性を有し、このリードスルーにより、隣接する発現カセット内にあるＤＮＡ分子の発現に影響が及ぶ恐れがある。転写終結を適切に制御することで、下流に局在するＤＮＡ配列（例えば、他の発現カセット）へのリードスルーを防ぐことができ、さらにＲＮＡポリメラーゼを効率的にリサイクルして遺伝子発現を向上させることができる。転写の効率的な終結（ＤＮＡからのＲＮＡポリメラーゼＩＩの遊離）は転写の再開に必要な条件であり、そのため全体の転写レベルに直接影響する。転写終結に続いて、成熟ｍＲＮＡが合成部位から遊離され、鋳型が細胞質に輸送される。真核生物のｍＲＮＡは、ｉｎｖｉｖｏでポリ（Ａ）形態として蓄積され、従来の方法で転写終結部位を検出することが困難になる。もっとも、バイオインフォマティクス法による機能的かつ効率的な３´ＵＴＲの予測は、有効な３´ＵＴＲを容易に予測させるはずの保存されたＤＮＡ配列が存在しない点で困難である。

実際的な観点から、典型的には、発現カセットで使用される３´ＵＴＲが以下の特徴を有することは有益である。最初に、３´ＵＴＲは、導入遺伝子の転写を効率的かつ有効に終結できるべきであり、かつ、１つの転移ＤＮＡ（Ｔ－ＤＮＡ）内に存在する複数の発現カセットの場合のように別の発現カセットから構成され得る任意の隣接するＤＮＡ配列、またはＴ－ＤＮＡを挿入した隣接する染色体ＤＮＡへの転写物のリードスルーを防止できるべきである。次に、３´ＵＴＲは、ＤＮＡ分子の発現を促進するために使用されるプロモーター、リーダー、エンハンサー、及びイントロンが付与する転写活性の低減を引き起こすべきではない。最後に、植物のバイオテクノロジーにおいて、３´ＵＴＲは、形質転換植物から抽出された逆転写ＲＮＡの増幅反応のプライミングに使用されることが多く、そして、（１）植物染色体に一旦組み込まれた発現カセットの転写活性または発現を評価すること、（２）植物ＤＮＡ内の挿入物のコピー数を評価すること、及び（３）育種後に得られた種子の接合性を評価することに使用される。また、３´ＵＴＲは、挿入されたカセットのインタクト性を特徴付けるために、形質転換植物から抽出されたＤＮＡの増幅反応にも使用される。本発明を実施するのに有用な３´ＵＴＲは、配列番号５として提示されている。

本明細書で使用する場合、「エンハンサー」または「エンハンサーエレメント」という用語は、シス作用調節エレメント（別名、シスエレメント）を指し、これは、作動可能に連結された転写可能なＤＮＡ分子の全体的発現パターンの一側面（ただし通常、単独では転写の駆動に不十分である）を付与する。プロモーターとは異なり、通常、エンハンサーエレメントには、転写開始部位（ＴＳＳ）もしくはＴＡＴＡボックス、または同等のＤＮＡ配列は含まれていない。プロモーターまたはプロモーターフラグメントは、天然に、作動可能に連結されたＤＮＡ配列の転写に影響を及ぼす１つ以上のエンハンサーエレメントを含んでもよい。また、エンハンサーエレメントをプロモーターと融合させて、遺伝子発現の全体的調整の一側面を付与するキメラプロモーターシスエレメントを生み出してもよい。

多くのプロモーターエンハンサーエレメントは、ＤＮＡ結合タンパク質に結合するか、及び／またはＤＮＡトポロジーに影響を及ぼして、ＲＮＡポリメラーゼのＤＮＡ鋳型へのアクセスを選択的に許可もしくは制限する局所的立体構造、または転写開始部位での二重らせんの選択的開放を促進する局所的立体構造を生成すると考えられている。エンハンサーエレメントは、転写を調節する転写因子に結合するように機能し得る。いくつかのエンハンサーエレメントは２つ以上の転写因子に結合し、転写因子は、異なる親和性で２つ以上のエンハンサードメインと相互作用し得る。エンハンサーエレメントの同定は、欠失解析（すなわち、プロモーターに対する５´末端もしくは内部から１つ以上のヌクレオチドを欠失させる）や、ＤＮａｓｅＩフットプリント法を用いたＤＮＡ結合タンパク質解析、メチル化干渉、電気泳動移動度シフトアッセイ、ライゲーション媒介ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によるｉｎｖｉｖｏゲノムフットプリント法、及びその他の従来的なアッセイを含めた複数の技法によって行うか、または、ＢＬＡＳＴなどの従来のＤＮＡ配列比較法による、標的配列もしくは標的モチーフとして公知のシスエレメントモチーフもしくはエンハンサーエレメントを用いたＤＮＡ配列類似性解析によって行うことができる。エンハンサードメインの微細構造は、１つ以上のヌクレオチドの変異誘発（もしくは置換）により、または当該技術分野で公知の他の従来的な方法により、さらに研究され得る。エンハンサーエレメントは、化学合成により、またはこのようなエレメントを含む調節エレメントからの単離により得ることができ、これらは、部分配列の操作を容易にするための有用な制限酵素部位を含む追加の隣接ヌクレオチドと共に合成され得る。したがって、作動可能に連結された転写可能なＤＮＡ分子の発現を調整するための、本明細書で開示される方法に従ったエンハンサーエレメントの設計、構築、及び使用は、本発明に包含される。エンハンサーは、配列番号２として提示されているプロモーターに由来し得る。

本明細書で使用する場合、「キメラ」という用語は、第１のＤＮＡ分子を第２のＤＮＡ分子と融合させることによって産生される単一のＤＮＡ分子を指し、第１のＤＮＡ分子も第２のＤＮＡ分子も、通常はこの構成（すなわち、他方と融合した構成）では見出されない。したがって、キメラＤＮＡ分子は、他の方法では通常は自然界に見出されない新規のＤＮＡ分子である。本明細書で使用する場合、「キメラプロモーター」という用語は、このようなＤＮＡ分子の操作によって産生されたプロモーターを意味する。キメラプロモーターは、２つ以上のＤＮＡフラグメントを組合せる（例えば、プロモーターをエンハンサーエレメントと融合させる）ことができる。したがって、作動可能に結合した転写可能なＤＮＡ分子の発現を調整するための、本明細書で開示される方法に従ったキメラプロモーターの設計、構築、及び使用は、本発明に包含される。

キメラ調節エレメントは、当該技術分野で公知の様々な方法、例えば、制限酵素消化及びライゲーション、ライゲーション非依存的クローニング、増幅中のＰＣＲ産物のモジュラーアセンブリ、または調節エレメントの直接化学合成、ならびに当該技術分野で公知のその他の方法によって、作動可能に連結され得る様々な構成エレメントを含むように設計され得る。得られる様々なキメラ調節エレメントは、同じ構成エレメントまたは同じ構成エレメントのバリアントから構成されてもよいが、構成部分が作動可能に連結するのを可能にする連結ＤＮＡ配列（複数可）を含むＤＮＡ配列（複数可）が異なる。本発明において、配列番号１～５として提供されるＤＮＡ配列は、調節エレメント参照配列を提供する場合があり、このとき、参照配列を構成する構成エレメントは、当該技術分野で公知の方法によって連結されてもよく、また、細菌及び植物細胞の形質転換で天然に生じる１つ以上のヌクレオチドの置換、欠失、及び／または挿入、あるいは変異を含んでもよい。

本明細書で使用する場合、「バリアント」という用語は、組成が第１のＤＮＡ分子と類似しているが同一ではない第２のＤＮＡ分子、例えば、調節エレメントを指し、このとき、第２のＤＮＡ分子は、例えば、第１のＤＮＡ分子とおおよそ同等の転写活性によって、そのＤＮＡ分子の一般的な機能性、すなわち、同じまたは同様の発現パターンを依然として維持する。バリアントは、第１のＤＮＡ分子のより短いもしくは短縮バージョン、または第１のＤＮＡ分子の配列の改変バージョン、例えば、制限酵素部位が異なる、及び／または内部の欠失、置換、もしくは挿入を有するバージョンであり得る。また、「バリアント」は、参照配列の１つ以上のヌクレオチドの置換、欠失、または挿入を含むヌクレオチド配列を有する調節エレメントも包含し得、このとき、誘導体調節エレメントは、対応する親調節分子よりも大きいかもしくは小さいかまたは同等の転写もしくは翻訳活性を有する。また、調節エレメント「バリアント」は、細菌及び植物細胞の形質転換で天然に生じる変異から生じるバリアントも包含する。本発明において、配列番号１～５として提供されるポリヌクレオチド配列を使用して、元の調節エレメントのＤＮＡ配列と組成が類似するが同一ではなく、一方で元の調節エレメントの一般的な機能性、すなわち、同じまたは同様の発現パターンを依然として維持する、バリアントを創出し得る。本発明のかかるバリアントの生産は、本開示に照らして当業者の技能範囲内に十分にあり、本発明の範囲内に包含される。

特定の導入遺伝子の望ましい発現態様に対する、本明細書で説明される修飾、重複、または欠失の効力は、結果を検証するために本明細書の研究実施例において説明されるものなど、安定し、かつ一過性の植物アッセイにおいて実験により検査してもよく、当該効力は、出発ＤＮＡ分子においてなされた変更及び変更の目的に応じて変わり得る。

構築物
本明細書で使用する場合、「構築物」という用語は、少なくとも１つのＤＮＡ分子が別のＤＮＡ分子に機能的に作動可能な様式で連結されている、すなわち作動可能に連結されたＤＮＡ分子を含む、ゲノム組み込みまたは自己複製が可能な、任意の源に由来する、プラスミド、コスミド、ウイルス、ファージ、または直鎖もしくは環状ＤＮＡ分子もしくはＲＮＡ分子などの任意の組換えＤＮＡ分子を意味する。本明細書で使用する場合、「ベクター」という用語は、形質転換、すなわち、宿主細胞中に異種ＤＮＡまたはＲＮＡを導入する目的で使用され得る、任意の構築物を意味する。構築物は、典型的には、１つ以上の発現カセットを含む。本明細書で使用する場合、「発現カセット」とは、１つ以上の調節エレメント、典型的には少なくともプロモーター及び３´ＵＴＲと作動可能に連結された、少なくとも１つの転写可能なＤＮＡ分子を含む組換えＤＮＡ分子を指す。

本明細書で使用する場合、「作動可能に連結された」という用語は、第２のＤＮＡ分子に連結した第１のＤＮＡ分子を指し、ここで、第１及び第２のＤＮＡ分子は、第１のＤＮＡ分子が第２のＤＮＡ分子の機能に影響するよう配置される。２つのＤＮＡ分子は、単一の連続したＤＮＡ分子の一部である場合もそうでない場合もあり、隣接する場合もそうでない場合もある。例えば、プロモーターが細胞内の目的の転写可能なＤＮＡ分子の転写を調整する場合、このプロモーターは転写可能なＤＮＡ分子と作動可能に連結されている。例えば、リーダーは、ＤＮＡ配列の転写または翻訳に影響を及ぼすことができる場合、ＤＮＡ配列に作動可能に連結されている。

本発明の構築物は、１つの実施形態において、Ａ．ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ細胞がもたらす転移分子と共に、Ｔ－ＤＮＡの植物細胞ゲノム内への統合を可能にするＴ－ＤＮＡを含む、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓから単離されたＴｉプラスミドの右側境界（ＲＢまたはＡＧＲｔｕ．ＲＢ）及び左側境界（ＬＢまたはＡＧＲｔｕ．ＬＢ）領域を有する二重腫瘍誘導（Ｔｉ）プラスミド境界構築物として提供され得る（例えば、米国特許第６，６０３，０６１号を参照）。また、構築物は、細菌細胞における複製機能及び抗生物質選択をもたらすプラスミド骨格ＤＮＡセグメント、例えば、ｏｒｉ３２２などのＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉ複製開始点、ｏｒｉＶまたはｏｒｉＲｉなどの広宿主域複製開始点、及びスペクチノマイシンもしくはストレプトマイシンに対する抵抗性を付与するＴｎ７アミノグリコシドアデニルトランスフェラーゼ（ａａｄＡ）をコードするＳｐｅｃ／Ｓｔｒｐなどの選択マーカー、またはゲンタマイシン（Ｇｍ、Ｇｅｎｔ）選択マーカー遺伝子についてのコード領域も含んでもよい。植物形質転換については、宿主細菌株は、多くの場合Ａ．ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓＡＢＩ、Ｃ５８、またはＬＢＡ４４０４であるが、植物形質転換の技術分野において当業者に公知のその他の株も、本発明では機能し得る。

転写可能なＤＮＡ分子が、タンパク質として翻訳及び発現される機能的ｍＲＮＡ分子に転写されるような方式で、構築物を集成し細胞内に導入するための方法が、当該技術分野で公知である。本発明の実施に関して、構築物及び宿主細胞を調製及び使用するための従来的な組成物及び方法は、当業者に周知である。より高等な植物内での核酸の発現に有用である典型的なベクターは当該技術分野で周知であり、これにはＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓのＴｉプラスミドに由来するベクター及びｐＣａＭＶＣＮ導入制御ベクターが含まれる。

本明細書で提供される任意の調節エレメントを含めた様々な調節エレメントを構築物に含んでもよい。任意のこのような調節エレメントは、他の調節エレメントと組合せて提供され得る。このような組合せは、望ましい調節機能をもたらすように設計または修飾され得る。１つの実施形態において、本発明の構築物は、３´ＵＴＲと作動可能に連結された転写可能なＤＮＡ分子と作動可能に連結された、少なくとも１つの調節エレメントを含む。

本発明の構築物は、本明細書で提供されるか、または当該技術分野で公知である任意のプロモーターまたはリーダーを含んでもよい。例えば、本発明のプロモーターは、異種の非翻訳５´リーダー（例えば、熱ショックタンパク質遺伝子に由来するもの）と作動可能に連結されてもよい。代替的に、本発明のリーダーは、異種プロモーター、例えば、カリフラワーモザイクウイルス３５Ｓ転写物プロモーターに作動可能に連結されてもよい。

発現カセットはまた、作動可能に連結されたタンパク質が、特に葉緑体、白色体、もしくは他の色素体細胞小器官、ミトコンドリア、ペルオキシソーム、液胞、または細胞外の位置に対し、細胞レベル以下で標的化するのに有用なペプチドをコードする、輸送ペプチドコード配列も含んでもよい。多くの葉緑体局在化タンパク質は、核遺伝子から前駆体として発現され、葉緑体輸送ペプチド（ＣＴＰ）によって葉緑体に標的化される。このような単離された葉緑体タンパク質の例としては、限定されるものではないが、リブロース－１，５－ビスリン酸カルボキシラーゼの小サブユニット（ＳＳＵ）、フェレドキシン、フェレドキシンオキシドレダクターゼ、集光性複合タンパク質Ｉ及びタンパク質ＩＩ、チオレドキシンＦ、ならびにエノールピルビルシキミ酸リン酸シンターゼ（ＥＰＳＰＳ）に関連するものが挙げられる。葉緑体輸送ペプチドは、例えば、米国特許第７，１９３，１３３号で説明されている。非葉緑体タンパク質は、非葉緑体タンパク質をコードする導入遺伝子と作動可能に結合した異種ＣＴＰを発現させることにより、葉緑体を標的化させ得ることが実証されている。

転写可能なＤＮＡ分子
本明細書で使用する場合、「転写可能なＤＮＡ分子」という用語は、ＲＮＡ分子に転写されることができる任意のＤＮＡ分子を指し、これには、タンパク質コード配列を有するもの、ガイドＲＮＡをコードするもの、及び遺伝子抑制に有用な配列を有するＲＮＡ分子を生み出すものが含まれるが、これらに限定されない。ＤＮＡ分子の種類には、同じ植物からのＤＮＡ分子、別の植物からのＤＮＡ分子、異なる生物からのＤＮＡ分子、あるいは合成ＤＮＡ分子、例えば、遺伝子のアンチセンスメッセージを含むＤＮＡ分子、または導入遺伝子の人工、合成、もしくは別様の変更バージョンをコードするＤＮＡ分子が含まれ得るが、これらに限定されない。本発明の構築物に組み込むための例示的な転写可能なＤＮＡ分子としては、例えば、ＤＮＡ分子を組み込む種以外の種由来のＤＮＡ分子もしくは遺伝子、または同じ種から生じるか、もしくは同じ種に存在するが、古典的な育種技法ではなく遺伝子工学の方法によってレシピエント細胞に組み込まれる遺伝子が挙げられる。

「導入遺伝子」とは、少なくとも宿主細胞ゲノム内の位置に関して宿主細胞に対して異種である転写可能なＤＮＡ分子、及び／または細胞の現行世代もしくは任意の過去の世代に宿主細胞のゲノムに人工的に組み込まれた転写可能なＤＮＡ分子を指す。

本発明のプロモーター等の調節エレメントは、調節エレメントに対して異種である転写可能なＤＮＡ分子に作動可能に連結されてもよい。本明細書で使用する場合、「異種」という用語は、２つ以上のＤＮＡ分子の組合せにおいて、かかる組合せが自然界で通常は見出されない場合を指す。例えば、２つのＤＮＡ分子は異なる種に由来してもよく、及び／または２つのＤＮＡ分子は異なる遺伝子に由来してもよい（例えば、同じ種由来の異なる遺伝子、または異なる種由来の同じ遺伝子）。故に、調節エレメントは、作動可能に連結された転写可能なＤＮＡ分子に対して、かかる組合せが自然界で通常は見出されない場合、すなわち、転写可能なＤＮＡ分子が、調節エレメントに作動可能に連結されて天然に生じない場合、異種である。

転写可能なＤＮＡ分子は、概して、転写物の発現が所望される任意のＤＮＡ分子であり得る。このような転写物の発現により、結果として生じるｍＲＮＡ分子の翻訳、したがってタンパク質発現がもたらされ得る。代替的に、例えば、転写可能なＤＮＡ分子は、特定の遺伝子またはタンパク質の発現低下を最終的に引き起こすように設計され得る。１つの実施形態において、これは、アンチセンス方向に配向した転写可能なＤＮＡ分子を使用することによって達成され得る。当業者は、かかるアンチセンス技術の使用に精通している。この様態で任意の遺伝子を負に調節してもよく、１つの実施形態では、転写可能なＤＮＡ分子は、ｄｓＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、またはｍｉＲＮＡ分子の発現を介して特定の遺伝子を抑制するように設計されてもよい。

したがって、本発明の１つの実施形態は、構築物がトランスジェニック植物細胞のゲノムに統合されたときに、転写可能なＤＮＡ分子の転写を所望のレベルまたは所望のパターンで調整するように異種の転写可能なＤＮＡ分子と作動可能に連結されている、配列番号１～５として提供されるものなど、本発明の調節エレメントを含む組換えＤＮＡ分子である。１つの実施形態において、転写可能なＤＮＡ分子は遺伝子のタンパク質コード領域を含み、別の実施形態において、転写可能なＤＮＡ分子は遺伝子のアンチセンス領域を含む。

農学的目的の遺伝子
転写可能なＤＮＡ分子は、農学的目的の遺伝子であり得る。本明細書で使用する場合、「農学的目的の遺伝子」という用語は、特定の植物組織、細胞、または細胞タイプで発現したときに、望ましい特性を付与する転写可能なＤＮＡ分子を指す。農学的目的の遺伝子の産物は、植物の形態、生理学、成長、発達、収量、穀粒組成、栄養プロファイル、病害もしくは害虫抵抗性、及び／または環境的もしくは化学的耐性に対する効果を引き起こすために植物内で作用する場合もあれば、植物を常食とする害虫の餌で殺虫剤として作用する場合もある。本発明の１つの実施形態において、本発明の調節エレメントは、この調節エレメントが、農学的目的の遺伝子である転写可能なＤＮＡ分子と作動可能に連結するように、構築物内に組み込まれる。このような構築物を含むトランスジェニック植物において、農学的目的の遺伝子の発現は、有益な農学的形質を付与し得る。有益な農学的形質としては、例えば、限定されるものではないが、除草剤耐性、昆虫防除、改変された収量、疾患抵抗性、病原体抵抗性、改変された植物成長及び発達、改変されたデンプン含量、改変された油含量、改変された脂肪酸含量、改変されたタンパク質含量、改変された果実成熟、動物及びヒトの栄養強化、生体高分子産生、環境ストレス抵抗性、医薬品ペプチド、加工品質の改善、風味の改善、ハイブリッド種子産生有用性、繊維産生の改善、炭素隔離の増強、ならびに望ましいバイオ燃料産生を挙げることができる。

当該技術分野で公知である農学的目的の遺伝子の例としては、除草剤抵抗性（米国特許第６，８０３，５０１号；第６，４４８，４７６号；第６，２４８，８７６号；第６，２２５，１１４号；第６，１０７，５４９号；第５，８６６，７７５号；第５，８０４，４２５号；第５，６３３，４３５号；及び第５，４６３，１７５号）、収量増加（米国特許第ＵＳＲＥ３８，４４６号；第６，７１６，４７４号；第６，６６３，９０６号；第６，４７６，２９５号；第６，４４１，２７７号；第６，４２３，８２８号；第６，３９９，３３０号；第６，３７２，２１１号；第６，２３５，９７１号；第６，２２２，０９８号；及び第５，７１６，８３７号）、昆虫防除（米国特許第６，８０９，０７８号；第６，７１３，０６３号；第６，６８６，４５２号；第６，６５７，０４６号；第６，６４５，４９７号；第６，６４２，０３０号；第６，６３９，０５４号；第６，６２０，９８８号；第６，５９３，２９３号；第６，５５５，６５５号；第６，５３８，１０９号；第６，５３７，７５６号；第６，５２１，４４２号；第６，５０１，００９号；第６，４６８，５２３号；第６，３２６，３５１号；第６，３１３，３７８号；第６，２８４，９４９号；第６，２８１，０１６号；第６，２４８，５３６号；第６，２４２，２４１号；第６，２２１，６４９号；第６，１７７，６１５号；第６，１５６，５７３号；第６，１５３，８１４号；第６，１１０，４６４号；第６，０９３，６９５号；第６，０６３，７５６号；第６，０６３，５９７号；第６，０２３，０１３号；第５，９５９，０９１号；第５，９４２，６６４号；第５，９４２，６５８号；５，８８０，２７５号；第５，７６３，２４５号；及び第５，７６３，２４１号）、真菌病害抵抗性（米国特許第６，６５３，２８０号；第６，５７３，３６１号；第６，５０６，９６２号；第６，３１６，４０７号；第６，２１５，０４８号；第５，５１６，６７１号；第５，７７３，６９６号；第６，１２１，４３６号；第６，３１６，４０７号；及び第６，５０６，９６２号）、ウイルス抵抗性（米国特許第６，６１７，４９６号；第６，６０８，２４１号；第６，０１５，９４０号；第６，０１３，８６４号；第５，８５０，０２３号；及び第５，３０４，７３０号）、線虫抵抗性（米国特許第６，２２８，９９２号）、細菌病害抵抗性（米国特許第５，５１６，６７１号）、植物成長及び発達（米国特許第６，７２３，８９７及び第６，５１８，４８８号）、デンプン産生（米国特許第６，５３８，１８１号；第６，５３８，１７９号；第６，５３８，１７８号；第５，７５０，８７６号；及び第６，４７６，２９５号）、改変された油産生（米国特許第６，４４４，８７６号；第６，４２６，４４７号；第６，３８０，４６２号）、高い油産生（米国特許第６，４９５，７３９号；第５，６０８，１４９号；第６，４８３，００８号；第６，４７６，２９５号）、改変された脂肪酸含量（米国特許第６，８２８，４７５号；第６，８２２，１４１号；第６，７７０，４６５号；第６，７０６，９５０号；第６，６６０，８４９号；第６，５９６，５３８号；第６，５８９，７６７号；第６，５３７，７５０号；第６，４８９，４６１号；第６，４５９，０１８号）、高いタンパク質産生（米国特許第６，３８０，４６６号）、果実成熟（米国特許第５，５１２，４６６号）、動物及びヒトの栄養強化（米国特許第６，７２３，８３７号；第６，６５３，５３０号；第６，５４１２，５９号；第５，９８５，６０５号；第６，１７１，６４０号）、生体高分子（米国特許第ＵＳＲＥ３７，５４３号；第６，２２８，６２３号；第５，９５８，７４５号、及び第６，９４６，５８８号）、環境ストレス抵抗性（米国特許第６，０７２，１０３号）、医薬ペプチド及び分泌性ペプチド（米国特許第６，８１２，３７９号；第６，７７４，２８３号；第６，１４０，０７５号；及び第６，０８０，５６０号）、プロセシング形質の改善（米国特許第６，４７６，２９５号）、消化率の改善（米国特許第６，５３１，６４８号）、低いラフィノース（米国特許第６，１６６，２９２号）、工業用酵素産生（米国特許第５，５４３，５７６号）、風味の改善（米国特許第６，０１１，１９９号）、窒素固定（米国特許第５，２２９，１１４号）、ハイブリッド種子産生（米国特許第５，６８９，０４１号）、繊維産生（米国特許第６，５７６，８１８号；第６，２７１，４４３号；第５，９８１，８３４号；及び第５，８６９，７２０号）、ならびにバイオ燃料産生（米国特許第５，９９８，７００号）が挙げられる。

代替的に、農学的目的の遺伝子は、内在的遺伝子の遺伝子発現の標的化された調整を引き起こすＲＮＡ分子をコードすることにより、例えば、アンチセンス（例えば、米国特許５，１０７，０６５号を参照）、阻害ＲＮＡ（「ＲＮＡｉ」；例えば、米国出願公開第２００６／０２００８７８号及び同第２００８／００６６２０６号、ならびに米国特許出願第１１／９７４，４６９号で説明されているように、ｍｉＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、トランス作用ｓｉＲＮＡ、及びフェーズｓＲＮＡが媒介する機構による遺伝子発現の調整が含まれる）により、または共抑制が媒介する機構により、上記の植物の特性または表現型に影響を及ぼし得る。また、ＲＮＡは、所望の内在的ｍＲＮＡ産物を切断するように操作された触媒ＲＮＡ分子（例えば、リボザイムまたはリボスイッチ；例えば、米国第２００６／０２００８７８号を参照）であってもよいと考えられる。転写可能なＤＮＡ分子が遺伝子抑制を引き起こし得る分子に転写されるような方式で、構築物を構築し細胞内に導入するための方法が、当該技術分野で公知である。

選択マーカー
選択マーカー導入遺伝子も、本発明の調節エレメントと共に使用されることがある。本明細書で使用する場合、「選択マーカー導入遺伝子」という用語は、トランスジェニック植物、組織、もしくは細胞内の発現、または発現の欠如が何らかの方法でスクリーニングまたはスコアリングされ得る、任意の転写可能なＤＮＡ分子を指す。本発明の実施において使用するための選択可能マーカー遺伝子、ならびにそれらの関連する選択及びスクリーニング技法は、当該技術分野で既知であり、これには、β－グルクロニダーゼ（ＧＵＳ）、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、抗生物質抵抗性を付与するタンパク質、及び除草剤抵抗性を付与するタンパク質をコードする転写可能なＤＮＡ分子が含まれるが、これらに限定されない。選択マーカー導入遺伝子の例は、配列番号８として提供される。

ゲノム編集
いくつかの実施形態は、ゲノム改変を行うための部位特異的ゲノム修飾酵素及び／または任意の関連タンパク質（複数可）をコードする異種のＤＮＡ配列に作動可能に連結された、配列番号１～５のいずれかに対し少なくとも約８５％の配列同一性を有する配列またはその断片を含む発現カセット（複数可）を含む、組換えＤＮＡ構築物に関する。これらのヌクレアーゼ発現カセット（複数可）は、テンプレート編集用のドナーテンプレートと同じ分子もしくはベクター内に（シス）、または別個の分子もしくはベクター上に（トランス）存在してもよい。ゲノムＤＮＡを改変する、種々の配列特異的ゲノム修飾酵素（またはタンパク質及び／もしくはガイドＲＮＡの複合体）に関わるいくつかの編集方法が、当該技術分野で公知である。一部の実施形態では、部位特異的ゲノム修飾酵素は、所望のゲノム部位または遺伝子座において２本鎖切断（ＤＳＢ）またはニックを誘発することによりゲノムを改変する。一部の実施形態では、ゲノム修飾酵素によって導入されたＤＳＢまたはニックを修復するプロセス中に、ドナーテンプレートＤＮＡが、ＤＳＢ部位またはニック部位でゲノム内に組み込まれ得る。一部の実施形態では、ゲノム修飾酵素によって導入されたＤＳＢまたはニックを修復するプロセス中に、挿入変異または欠失変異（インデル）がゲノム内に導入されてもよい。一部の実施形態では、部位特異的ゲノム修飾酵素は、シチジンデアミナーゼを含む。一部の実施形態では、部位特異的ゲノム修飾酵素は、アデニンデアミナーゼを含む。本開示において、部位特異的ゲノム修飾酵素としては、エンドヌクレアーゼ、リコンビナーゼ、トランスポザーゼ、デアミナーゼ、ヘリカーゼ、リバーストランスクリプターゼ及びそれらの任意の組合せが挙げられる。

いくつかの実施形態は、ゲノム編集システムの１つ以上の構成要素をコードする、異種の転写可能なＤＮＡ分子に作動可能に連結された、本明細書に記載の遺伝子調節エレメントに関する。ゲノム編集システムは、宿主細胞のゲノムに、１つ以上の挿入、欠失、置換、塩基修飾、転座、または逆位を導入するために使用され得る。一部の実施形態では、本明細書に記載の遺伝子調節エレメントは、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓエフェクタータンパク質、ジンクフィンガータンパク質、または転写活性化（ＴＡＬ）タンパク質等の配列特異的ＤＮＡ結合ドメインをコードする、異種の転写可能なＤＮＡ分子に作動可能に連結される。一部の実施形態では、配列特異的ＤＮＡ結合ドメインは融合タンパク質であり得る。一部の実施形態では、本明細書に記載の遺伝子調節エレメントは、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓエフェクタータンパク質をコードする、異種の転写可能なＤＮＡ分子に作動可能に連結される。一部の実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓエフェクタータンパク質は、ＴｙｐｅＩＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステム、ＴｙｐｅＩＩＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステム、ＴｙｐｅＩＩＩＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステム、ＴｙｐｅＩＶＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステム、ＴｙｐｅＶＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステム、またはＴｙｐｅＶＩＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムから選択される。一部の実施形態では、本明細書に記載の遺伝子調節エレメントは、ガイドＲＮＡをコードする、異種の転写可能なＤＮＡ分子に作動可能に連結される。本明細書で使用する場合、「ガイドＲＮＡ」または「ｇＲＮＡ」は、標的ＤＮＡ配列を認識し、ＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質を標的ＤＮＡ配列に導く、または「ガイドする」ＲＮＡを指す。ガイドＲＮＡは、標的ＤＮＡと相補的である領域（ｃｒＲＮＡと称される）及びＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質と結合する領域（ｔｒａｃｒＲＮＡと称される）から構成される。ガイドＲＮＡは、単一のＲＮＡ分子（ｓｇＲＮＡ）または２種の別々のＲＮＡ分子（２種ｇＲＮＡ）であり得る。一部の実施形態では、ｇＲＮＡは、リバーストランスクリプターゼのためのＲＮＡテンプレート（ｐｅｇＲＮＡ）をさらに含んでいてもよい。

いくつかの実施形態は、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓエフェクタータンパク質及びガイドＲＮＡを含む、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓゲノム編集システムの１つ以上の構成要素をコードする、異種の転写可能なＤＮＡ分子に作動可能に連結された、本明細書に記載の遺伝子調節エレメントに関する。ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓエフェクタータンパク質の例としては、限定されるものではないが、Ｃａｓ９、Ｃ２ｃ１、Ｃ２ｃ３、Ｃ２ｃ４、Ｃ２ｃ５、Ｃ２ｃ８、Ｃ２ｃ９、Ｃ２ｃ１０、Ｃａｓ１２ａ（Ｃｐｆ１とも称される）、Ｃａｓ１２ｂ、Ｃａｓ１２ｃ、Ｃａｓ１２ｄ、Ｃａｓ１２ｅ、Ｃａｓ１２ｈ、Ｃａｓ１２ｉ、Ｃａｓ１２ｇ、Ｃａｓ１３ａ、Ｃａｓ１３ｂ、Ｃａｓ１３ｃ、Ｃａｓ１３ｄ、Ｃａｓｌ、ＣａｓｌＢ、Ｃａｓ２、Ｃａｓ３、Ｃａｓ３´、Ｃａｓ３”、Ｃａｓ４、Ｃａｓ５、Ｃａｓ６、Ｃａｓ７、Ｃａｓ８、Ｃａｓ９（Ｃｓｎｌ及びＣｓｘ１２としても公知である）、Ｃａｓ１０、Ｃｓｙｌ、Ｃｓｙ２、Ｃｓｙ３、Ｃｓｅｌ、Ｃｓｅ２、Ｃｓｃｌ、Ｃｓｃ２、Ｃｓａ５、Ｃｓｎ２、Ｃｓｍ２、Ｃｓｍ３、Ｃｓｍ４、Ｃｓｍ５、Ｃｓｍ６、Ｃｍｒｌ、Ｃｍｒ３、Ｃｍｒ４、Ｃｍｒ５、Ｃｍｒ６、Ｃｓｂｌ、Ｃｓｂ２、Ｃｓｂ３、Ｃｓｘｌ７、Ｃｓｘｌ４、Ｃｓｘ１０、Ｃｓｘ１６、ＣｓａＸ、Ｃｓｘ３、Ｃｓｘｌ、Ｃｓｘｌ５、Ｃｓｆｌ、Ｃｓｆ２、Ｃｓｆ３、Ｃｓｆ４（ｄｉｎＧ）、Ｃｓｆ５、Ｃａｓ１４ａ、Ｃａｓ１４ｂ、及びＣａｓ１４ｃエフェクタータンパク質が挙げられる。一部の実施形態では、本明細書に記載の遺伝子調節エレメントは、ヌクレアーゼ活性部位（例えば、ＲｕｖＣ、ＨＮＨ、例えば、Ｃａｓ１２ａヌクレアーゼドメインのＲｕｖＣ部位；例えば、Ｃａｓ９ヌクレアーゼドメインのＲｕｖＣ部位及び／またはＨＮＨ部位）に変異を含む、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓエフェクタータンパク質に作動可能に連結される。ヌクレアーゼ活性部位に変異を有し、したがって、もはやヌクレアーゼ活性を含まないＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓエフェクタータンパク質は、一般に、「ｄｅａｄ」、例えば、ｄＣａｓと称される。一部の実施形態では、ヌクレアーゼ活性部位に変異を有するＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓエフェクタータンパク質ドメインまたはポリペプチドは、変異のない同じＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓエフェクタータンパク質と比較して、活性が障害されているか、または活性が低減していることがある。一部の実施形態では、本明細書に記載の遺伝子調節エレメントは、ヌクレアーゼ活性部位に変異を有するＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓエフェクタータンパク質に作動可能に連結されて、リバーストランスクリプターゼ酵素に作動可能に連結されたニッカーゼ活性を生成する。

細胞形質転換
本発明はまた、転写可能なＤＮＡ分子に作動可能に連結された１つ以上の調節エレメントを含む、形質転換された細胞及び植物を産生する方法にも向けられている。

「形質転換」という用語は、レシピエント宿主へのＤＮＡ分子の導入を指す。本明細書で使用する場合、「宿主」という用語は細菌、真菌、または植物を意味し、これには、任意の細胞、組織、器官、または細菌、真菌、もしくは植物の後代が含まれる。特に目的となる植物組織及び細胞には、プロトプラスト、カルス、根、塊茎、種子、茎、葉、実生、胚、及び花粉が含まれる。

本明細書で使用する場合、「形質転換された」という用語は、外来ＤＮＡ分子（例えば、構築物）が導入された細胞、組織、器官、または生物を指す。導入されたＤＮＡ分子をレシピエント細胞、組織、器官、または生物のゲノムＤＮＡに組み込んで、導入されたＤＮＡ分子が次の後代に受け継がれるようにしてもよい。「トランスジェニック」または「形質転換された」細胞または生物にはまた、細胞または生物の後代、及び交配でかかるトランスジェニック生物を親として用いた育種プログラムから生産され、外来ＤＮＡ分子の存在からもたらされる変化した表現型を示す後代も含まれ得る。また、導入されるＤＮＡ分子をレシピエント細胞内に一過性に導入して、導入されたＤＮＡ分子が次の後代に受け継がれないようにしてもよい。「トランスジェニック」という用語は、１つ以上の異種のＤＮＡ分子を含む細菌、真菌、または植物を指す。

ＤＮＡ分子を植物細胞に導入するための、当業者に周知の方法が多数存在する。このプロセスは、概して、好適な宿主細胞を選択するステップと、宿主細胞をベクターで形質転換するステップと、形質転換宿主細胞を得るステップとを含む。本発明の実施において植物構築物を植物ゲノムに導入することによって植物細胞を形質転換するための方法及び材料には、周知でありかつ実証された方法のうちのいずれも含まれ得る。好適な方法としては、限定されるものではないが、中でも細菌感染（例えば、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、バイナリーＢＡＣベクター、ＤＮＡの直接送達（例えば、ＰＥＧ媒介の形質転換、乾燥／阻害媒介のＤＮＡ取込み、エレクトロポレーション、炭化ケイ素繊維による撹拌、及びＤＮＡコーティング粒子の加速）、遺伝子編集（例えば、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステム）が挙げられる。

宿主細胞は、任意の細胞または生物、例えば、植物細胞、藻類細胞、藻類、真菌細胞、真菌、細菌細胞、または昆虫細胞であってもよい。特定の実施形態において、宿主細胞及び形質転換細胞としては、作物植物からの細胞が含まれ得る。

トランスジェニック植物は、その後、本発明のトランスジェニック植物細胞から再生され得る。従来の育種技法または自家受粉を用いて、このトランスジェニック植物から種子が産生され得る。このような種子、及びこのような種子から成長した結果生じる後代植物は、本発明の組換えＤＮＡ分子を含み、そのためトランスジェニックとなる。

本発明のトランスジェニック植物を自家受粉させて、本発明のホモ接合性トランスジェニック植物（組換えＤＮＡ分子についてホモ接合性）の種子を得ることができるか、または非トランスジェニック植物もしくは異なるトランスジェニック植物と交配させて、本発明のヘテロ接合性トランスジェニック植物（組換えＤＮＡ分子についてヘテロ接合性）の種子を得ることができる。このようなホモ接合性及びヘテロ接合性のトランスジェニック植物は共に、本明細書では「後代植物」と称される。後代植物とは、元のトランスジェニック植物に由来し本発明の組換えＤＮＡ分子を含むトランスジェニック植物である。本発明のトランスジェニック植物を用いて産生した種子を、収穫し、本発明の組換えＤＮＡ分子を含みかつ農学的目的の遺伝子を発現するトランスジェニック植物、すなわち本発明の後代植物の世代を成長させるために使用し得る。種々の作物に一般に使用されている育種の方法についての説明は、いくつかの参考文献の１つから見出すことができる。例えば、Ａｌｌａｒｄ，ＰｒｉｎｃｉｐｌｅｓｏｆＰｌａｎｔＢｒｅｅｄｉｎｇ，ＪｏｈｎＷｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，ＮＹ，Ｕ．ｏｆＣＡ，Ｄａｖｉｓ，ＣＡ，５０－９８（１９６０）；Ｓｉｍｍｏｎｄｓ，ＰｒｉｎｃｉｐｌｅｓｏｆＣｒｏｐＩｍｐｒｏｖｅｍｅｎｔ，Ｌｏｎｇｍａｎ，Ｉｎｃ．，ＮＹ，３６９－３９９（１９７９）；ＳｎｅｅｐａｎｄＨｅｎｄｒｉｋｓｅｎ，ＰｌａｎｔｂｒｅｅｄｉｎｇＰｅｒｓｐｅｃｔｉｖｅｓ，Ｗａｇｅｎｉｎｇｅｎ（ｅｄ），ＣｅｎｔｅｒｆｏｒＡｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌＰｕｂｌｉｓｈｉｎｇａｎｄＤｏｃｕｍｅｎｔａｔｉｏｎ（１９７９）；Ｆｅｈｒ，Ｓｏｙｂｅａｎｓ：Ｉｍｐｒｏｖｅｍｅｎｔ，ＰｒｏｄｕｃｔｉｏｎａｎｄＵｓｅｓ，２ｎｄＥｄｉｔｉｏｎ，Ｍｏｎｏｇｒａｐｈ，１６：２４９（１９８７）；Ｆｅｈｒ，ＰｒｉｎｃｉｐｌｅｓｏｆＶａｒｉｅｔｙＤｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ，ＴｈｅｏｒｙａｎｄＴｅｃｈｎｉｑｕｅ，（Ｖｏｌ．１）ａｎｄＣｒｏｐＳｐｅｃｉｅｓＳｏｙｂｅａｎ（Ｖｏｌ．２），ＩｏｗａＳｔａｔｅＵｎｉｖ．，ＭａｃｍｉｌｌａｎＰｕｂ．Ｃｏ．，ＮＹ，３６０－３７６（１９８７）を参照のこと。

形質転換植物は、目的の遺伝子（複数可）の存在、ならびに本発明の調節エレメントが付与する発現レベル及び／またはプロファイルについて解析され得る。当業者は、形質転換植物の解析に利用できる多数の方法を認識している。例えば、植物解析の方法としては、限定されるものではないが、サザンブロットまたはノーザンブロット、ＰＣＲベースのアプローチ、生化学的解析、表現型スクリーニング法、現地評価、及び免疫診断アッセイが挙げられる。転写可能なＤＮＡ分子の発現は、ＴａｑＭａｎ（登録商標）（ＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ（ＦｏｓｔｅｒＣｉｔｙ，ＣＡ））の試薬及び製造業者が説明する方法、ならびにＴａｑＭａｎ（登録商標）ＴｅｓｔｉｎｇＭａｔｒｉｘを用いて決定したＰＣＲサイクル時間を用いて測定され得る。代替的に、Ｉｎｖａｄｅｒ（登録商標）（ＴｈｉｒｄＷａｖｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ））の試薬及び製造業者が説明する方法を使用して、導入遺伝子の発現を評価することができる。

本発明はまた、本発明の植物の部位も提供する。植物の部位としては、限定されるものではないが、葉、茎、根、塊茎、種子、胚乳、胚珠、及び花粉が挙げられる。本発明の植物の部位は、生育可能、生育不可能、再生可能、及び／または再生不可能であってもよい。また、本発明は、本発明のＤＮＡ分子を含む形質転換植物細胞も含み、これを提供する。本発明の形質転換またはトランスジェニック植物細胞としては、再生可能及び／または再生不可能な植物細胞が含まれる。

本発明はまた、本発明の組換えＤＮＡ分子を含むトランスジェニック植物またはその部位から生産される商品生産物も提供する。本発明の商品生産物は、配列番号１～５からなる群より選択されるＤＮＡ配列を含む、検出可能量のＤＮＡを含む。本明細書で使用する場合、「商品生産物」とは、本発明の組換えＤＮＡ分子を含むトランスジェニック植物、種子、植物細胞、または植物の部位に由来する材料から構成される任意の組成物または生産物を指す。商品生産物としては、限定されるものではないが、加工された種子、穀物、植物の部位、及び粗粉が挙げられる。本発明の商品生産物は、本発明の組換えＤＮＡ分子に対応する、検出可能量のＤＮＡを含むことになる。商品生産物の内容または供給源を決定するために、試料におけるこのＤＮＡのうちの１つ以上の検出が用いられ得る。本明細書で開示される検出方法を含めて、任意の標準的なＤＮＡ分子の検出方法を使用してもよい。

本発明は、以下の実施例を参照することによってより容易に理解され得、これらの実施例は、明記されない限り、例示説明として提供されるものであり、本発明を限定することは意図されない。当業者は、以下の実施例で開示される技法が、本発明の実施において良好に機能することが本発明者らによって発見された技法を代表するものであることを理解するはずである。しかしながら、当業者は、本開示に照らして、本発明の趣旨及び範囲から逸脱することなく、開示される特定の実施形態において多くの変更を行い、それでもなお同様のまたは類似の結果を得ることができることを理解するはずである。したがって、添付図面に記載または示される全ての事柄は、限定的な意味ではなく、例示説明として解釈されるものとする。

実施例１
調節エレメントの同定及びクローニング
本実施例は、Ａｎｄｒｏｐｏｇｏｎｇｅｒａｒｄｉｉ（Ｂｉｇｂｌｕｅｓｔｅｍ）及びＡｒｕｎｄｏｄｏｎａｘ（Ｇｉａｎｔｒｅｅｄ）由来の調節発現エレメントの同定、合成、及びクローニングを説明するものである。

単子葉植物種であるＡｎｄｒｏｐｏｇｏｎｇｅｒａｒｄｉｉ（Ｂｉｇｂｌｕｅｓｔｅｍ）のゲノムＤＮＡから新規ユビキチン調節エレメントを同定し、単離した。ユビキチン１転写物のそれぞれの５´非翻訳領域（５´ＵＴＲ）を用いて、作動可能に連結されたプロモーター、リーダー（５´ＵＴＲ）、及び第１のイントロンを含む、同定したユビキチン遺伝子の対応する調節エレメントを増幅するためのプライマーを設計した。プライマーを製造業者のプロトコルに従って構築したＧｅｎｏｍｅＷａｌｋｅｒ（商標）（ＣｌｏｎｔｅｃｈＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ（ＭｏｕｎｔａｉｎＶｉｅｗ，ＣＡ））ライブラリーと共に使用して、対応するゲノムＤＮＡ配列の５´領域をクローニングした。

加えて、単子葉植物種であるＡｒｕｎｄｏｄｏｎａｘ（Ｇｉａｎｔｒｅｅｄ）のゲノムＤＮＡから新規３´ＵＴＲを同定し、単離した。Ａｎｄｒｏｐｏｇｏｎｇｅｒａｒｄｉｉの同定したＥＸＰならびにそれに対応するプロモーター、リーダー、及びイントロンと、Ａｒｕｎｄｏｄｏｎａｘの３´ＵＴＲを表１に提示する。

β－グルクロニダーゼ（ＧＵＳ）の発現を駆動するために用いられる発現カセットにおいて、同定したＥＸＰ及び３´ＵＴＲを、当該技術分野で公知の方法を用いてバイナリー植物形質転換ベクター構築物内に合成及びクローニングして、実施例２及び３に記載したように、安定して形質転換されたトウモロコシ植物におけるそれらの活性を評価した。

実施例２
安定して形質転換されたトウモロコシ植物におけるＧＵＳ発現を駆動するＥＸＰ－ＡＮＤｇｅ．Ｕｂｑ：５の解析
トウモロコシ植物をベクター、具体的には、β－グルクロニダーゼ（ＧＵＳ）導入遺伝子の発現を駆動するＥＸＰ（ＥＸＰ－ＡＮＤｇｅ．Ｕｂｑ：５）を含む植物発現ベクターで形質転換した。得られた植物をＧＵＳタンパク質発現について解析して、発現に対する調節エレメント群（ＥＸＰ）の効果を評価し、標準対照のＥＸＰと比較した。

トウモロコシ植物を植物ＧＵＳ発現構築物で形質転換した。当該技術分野で公知の標準的な方法を用いて、ＥＸＰ（ＥＸＰ－ＡＮＤｇｅ．Ｕｂｑ：５、配列番号１）をベースとなる植物発現ベクター内にクローニングした。得られた植物発現ベクターは、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓの左側境界領域（Ｂ－ＡＧＲｔｕ．ｌｅｆｔｂｏｒｄｅｒ）と、除草剤グリホサートに対する抵抗性を付与する形質転換植物細胞の選択に使用する第１の導入遺伝子選択カセットと、ＥＸＰ－ＡＮＤｇｅ．Ｕｂｑ：５の活性を評価するための第２の導入遺伝子カセットであって、３´ＵＴＲ（Ｔ－Ｓｂ．Ｎｌｔｐ４－１：１：２、配列番号７）に作動可能に連結された、プロセシング可能なイントロン（配列番号８）から構成されるＧＵＳコード配列に対し、５´側に作動可能に連結された、ＥＸＰ－ＡＮＤｇｅ．Ｕｂｑ：５（配列番号１）を含む導入遺伝子カセットから構成される、第２の導入遺伝子カセットと、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓの右側境界領域（Ｂ－ＡＧＲｔｕ．ｒｉｇｈｔｂｏｒｄｅｒ）とを含むものであった。ＥＸＰ－ＡＮＤｇｅ．Ｕｂｑ：５によって駆動されるＧＵＳ発現を、３´ＵＴＲ（Ｔ－Ｓｂ．Ｎｌｔｐ４－１：１：２）に作動可能に連結されたＧＵＳコード配列に対し５´側に作動可能に連結された、ＥＸＰ（ＥＸＰ－ＣａＭＶ．３５Ｓ＋Ｚｍ．ＤｎａＫ：１２、配列番号６）から構成されるＧＵＳ導入遺伝子発現カセットを含む、上記のものと類似した対照構築物の発現と比較した。

トウモロコシ植物細胞を、当該技術分野で周知されているように、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ媒介の形質転換により、上記のバイナリー形質転換ベクター構築物を用いて形質転換した。得られた形質転換植物細胞を、全トウモロコシ植物を形成するように誘導した。

定性的及び定量的ＧＵＳ解析を使用して、形質転換植物の選択した植物器官及び組織内での発現エレメントの活性を評価した。組織化学的染色によるＧＵＳ発現の定性的解析については、ホールマウント組織または切片化した組織を、１ｍｇ／ｍＬのＸ－Ｇｌｕｃ（５－ブロモ－４－クロロ－３－インドリル－ｂ－グルクロニド）を含有するＧＵＳ染色液と共に３７℃で５時間インキュベートし、３５％ＥｔＯＨ及び５０％酢酸で脱染した。ＧＵＳ発現は、解剖顕微鏡または複合顕微鏡で、選択した植物器官または組織の青色発色を目視検査することにより定性的に判断した。

酵素アッセイによるＧＵＳ発現の定量的解析については、形質転換されたトウモロコシ植物の選択された組織から全タンパク質を抽出した。１～２マイクログラムの全タンパク質を、５０マイクロリットルの総反応体積中の１ｍＭ濃度の蛍光発生基質４－メチルウンベリフェリル－β－Ｄ－グルクロニド（ＭＵＧ）と共にインキュベートした。３７℃で１時間インキュベートした後、３５０マイクロリットルの２００ｍＭ重炭酸ナトリウム溶液を添加することにより反応を停止させた。反応生成物４－メチルウンベリフェロン（４－ＭＵ）は高ｐＨで最大限に蛍光性となり、このときヒドロキシル基がイオン化される。塩基性の炭酸ナトリウム溶液の添加により、アッセイを停止させると同時に、蛍光生成物４－ＭＵの定量のためにｐＨを調整する。ＦＬＵＯｓｔａｒＯｍｅｇａＭｉｃｒｏｐｌａｔｅＲｅａｄｅｒ（ＢＭＧＬＡＢＴＥＣＨ）（励起：３５５ｎｍ、発光：４６０ｎｍ）を用いて、生成した４－ＭＵの蛍光を測定し、その量を推定した。ＧＵＳ活性値は、ナノモル単位の４－ＭＵ／時間／ｍｇ全タンパク質で提供される。

以下の組織を、Ｒ_０世代におけるＧＵＳ発現のために試料採取した：Ｖ４段階の葉及び根；Ｖ７段階の葉及び根；ＶＴ段階の葉、花／葯、及び花粉；Ｒ１段階の穂軸／毛；受粉から（ＤＡＰ）２１日後のＲ３段階の種子胚及び種子胚乳。表２は、試料採取した組織の平均定量的ＧＵＳ発現を示している。

表２から理解できるように、ＥＸＰ（ＥＸＰ－ＡＮＤｇｅ．Ｕｂｑ：５、配列番号１）により、対照（ＥＸＰ－ＣａＭＶ．３５Ｓ＋Ｚｍ．ＤｎａＫ：１２、配列番号６）のものとは全く異なる発現プロファイルが得られた。例えば、ＶＴの葯及び花粉における、ＥＸＰ－ＡＮＤｇｅ．Ｕｂｑ：５によって駆動される発現量は、ＥＸＰ－ＣａＭＶ．３５Ｓ＋Ｚｍ．ＤｎａＫ：１２によって駆動される発現量より多い。ＥＸＰ－ＣａＭＶ．３５Ｓ＋Ｚｍ．ＤｎａＫ：１２によって駆動される葉での発現が、Ｖ４からＶ７段階まで増加し、次いで、ＶＴ段階までには減少するように見えた一方で、ＥＸＰ－ＡＮＤｇｅ．Ｕｂｑ：５によって駆動される葉での発現は、全３段階を通して一定のままであった。Ｒ１の穂軸／毛において、ＥＸＰ－ＡＮＤｇｅ．Ｕｂｑ：５によって駆動される発現は、対照と比較して多かった。ＥＸＰ－ＡＮＤｇｅ．Ｕｂｑ：５（配列番号１）は、特有の発現特性を示し、選択した導入遺伝子の発現に向けた新規のツールを提供するものである。

実施例３
安定して形質転換されたトウモロコシ植物における３´ＵＴＲ（Ｔ－ＡＲＵｄｏ．ＴｕｂＡ：１）のＧＵＳ発現調整
トウモロコシ植物をベクター、具体的には、β－グルクロニダーゼ（ＧＵＳ）導入遺伝子の発現を調整する３´ＵＴＲ（Ｔ－ＡＲＵｄｏ．ＴｕｂＡ：１）を含む植物発現ベクターで形質転換した。得られた植物をＧＵＳタンパク質発現について解析して、発現に対する３´ＵＴＲ調節エレメントの効果を評価した。

トウモロコシ植物を、植物ＧＵＳ発現構築物及び対照構築物で形質転換した。構築物は、実施例２において上述したものと類似したものとした。どちらの構築物も、プロセシング可能なイントロン（配列番号８）から構成されるＧＵＳコード配列に対し、５´側に作動可能に連結された、ＥＸＰ（ＥＸＰ－ＣａＭＶ．３５Ｓ＋Ｚｍ．ＤｎａＫ：１２、配列番号６）を含むものであった。対照構築物は、実施例２において上述した通りであって、ＧＵＳコード配列が３´ＵＴＲ（Ｔ－Ｓｂ．Ｎｌｔｐ４－１：１：２）に作動可能に連結されたものとした。もう一方の構築物には３´ＵＴＲ（Ｔ－ＡＲＵｄｏ．ＴｕｂＡ：１、配列番号５）を使用して、ＧＵＳ導入遺伝子の転写を終結させた。

実施例２に記載したように、トウモロコシ植物を形質転換し、ＧＵＳ発現をアッセイした。以下の組織を、Ｒ_０世代におけるＧＵＳ発現のために試料採取した：Ｖ４段階の葉及び根；Ｖ７段階の葉及び根；ＶＴ段階の葉、花／葯、及び花粉；Ｒ１段階の穂軸／毛；受粉から（ＤＡＰ）２１日後のＲ３段階の種子胚及び種子胚乳。表３は、試料採取した組織の平均定量的ＧＵＳ発現及びＴ－ＡＲＵｄｏ．ＴｕｂＡ：１によりもたらされるＧＵＳ増強倍率を示している。

表３から理解できるように、３´ＵＴＲ（Ｔ－ＡＲＵｄｏ．ＴｕｂＡ：１、配列番号５）は、３´ＵＴＲ（Ｔ－Ｓｂ．Ｎｌｔｐ４－１：１：２）と比較したとき、アッセイした全組織において、ＧＵＳ導入遺伝子の発現量を増強させた。転写解析により、ＧＵＳｍＲＮＡの適切な終結及びポリアデニル化が示された。一部の例では、導入遺伝子の発現量の増強は相当大きいものであった。例えば、ＶＴの葉での発現量は、対照における発現量よりも１７６．８倍多かった。Ｖ７の根での発現量は、対照における発現量よりも９３．７倍多かった。したがって、３´ＵＴＲ（Ｔ－ＡＲＵｄｏ．ＴｕｂＡ：１、配列番号５）は、対照と比較して、導入遺伝子の発現を増強させる。

本発明の原理を例示及び説明したが、かかる原理から逸脱することなく、本発明の配置及び詳細を変更することができることが、当業者には明らかであるはずである。発明者らは、特許請求の範囲の趣旨及び範囲内にある全ての変更を特許請求する。本明細書で引用される全ての刊行物及び公開された特許文献は、あたかも個々の刊行物または特許出願の各々が参照により援用されることが明確かつ個別に示されているのと同じ程度まで、これにより本明細書に援用される。

Claims

組換えＤＮＡ分子であって、
ａ）配列番号１に対し少なくとも９０パーセントの配列同一性を有する配列であって、遺伝子調節活性を有する配列、及び
ｂ）配列番号１を含む配列、
からなる群より選択されるＤＮＡ配列を含み、
前記配列が、異種の転写可能なＤＮＡ分子と作動可能に連結されている、前記組換えＤＮＡ分子。
前記配列が、配列番号１のＤＮＡ配列に対し少なくとも９５パーセントの配列同一性を有し、遺伝子調節活性を有する、請求項１に記載の組換えＤＮＡ分子。
前記配列が、配列番号１のＤＮＡ配列に対し少なくとも９７パーセントの配列同一性を有し、遺伝子調節活性を有する、請求項１に記載の組換えＤＮＡ分子。
前記異種の転写可能なＤＮＡ分子が農学的目的の遺伝子を含む、請求項１に記載の組換えＤＮＡ分子。
前記農学的目的の遺伝子が、植物における除草剤耐性を付与する、請求項４に記載の組換えＤＮＡ分子。
前記農学的目的の遺伝子が、植物における害虫抵抗性を付与する、請求項４に記載の組換えＤＮＡ分子。
前記異種の転写可能なＤＮＡ分子が、ｄｓＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、またはｓｉＲＮＡをコードする、請求項１に記載の組換えＤＮＡ分子。
トランスジェニック植物細胞であって、
ａ）配列番号１に対し少なくとも９０パーセントの配列同一性を有する配列であって、遺伝子調節活性を有する配列、及び
ｂ）配列番号１を含む配列、
からなる群より選択される配列を含む組換えＤＮＡ分子を含み、
前記配列が、異種の転写可能なＤＮＡ分子と作動可能に連結されている、前記トランスジェニック植物細胞。
前記トランスジェニック植物細胞が、単子葉植物細胞である、請求項８に記載のトランスジェニック植物細胞。
前記トランスジェニック植物細胞が、双子葉植物細胞である、請求項８に記載のトランスジェニック植物細胞。
請求項１に記載の組換えＤＮＡ分子を含む、トランスジェニック植物またはその部位。
請求項１１に記載のトランスジェニック植物の後代植物、またはその部位であって、前記後代植物またはその部位が、前記組換えＤＮＡ分子を含む、前記後代植物、またはその部位。
トランスジェニック種子であって、前記種子が、請求項１に記載の組換えＤＮＡ分子を含む、前記トランスジェニック種子。
請求項１１に記載のトランスジェニック植物またはその部位を得ることと、それから商品生産物を生産することとを含む、前記商品生産物を生産する方法。
前記商品生産物が、種子、加工種子、タンパク質濃縮物、タンパク質単離物、デンプン、穀物、植物の部位、種子油、バイオマス、細粉及び粗粉から成る群から選択される、請求項１４に記載の方法。
転写可能なＤＮＡ分子を発現させる方法であって、請求項１１に記載のトランスジェニック植物を得ることと、前記植物を栽培することとを含み、前記転写可能なＤＮＡが発現する、前記方法。