JP7842232B2

JP7842232B2 - 生物活性分子の活性放出制御及び活性徐放を達成する方法及びその薬物への応用

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Publication number: JP7842232B2
Application number: JP2024548399A
Authority: JP
Inventors: 永馬; 建花杭; 百学趙; 振許; 和王; 俊王; ▲ペー▼沛曹; 辰陽江; 宇庄
Original assignee: Zonhon Biopharma Institute Inc
Current assignee: Zonhon Biopharma Institute Inc
Priority date: 2022-02-18
Filing date: 2023-02-17
Publication date: 2026-04-07
Anticipated expiration: 2043-02-17
Also published as: US20250154217A1; CN118302435A; WO2023155872A1; JP2025506520A

Description

本発明は、生物活性分子の活性放出制御及び活性徐放を達成する方法及びその薬物への応用に関し、特にインターロイキン‐２などの高活性サイトカインの活性放出制御及び徐放のための方法に関する。

インターロイキン‐２（Ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ‐２，ＩＬ‐２）は、インターロイキン・ファミリーの一員である。多くの研究により示されているが、ＩＬ‐２はＴ細胞、ＮＫ細胞およびＢ細胞の分化・成熟を促進し、これら細胞の生物学的活性を活性化し、また、リンホカイン活性化キラー細胞（ＬＡＫ）の活性化を誘導し、インターフェロンと腫瘍壊死因子などのリンホカインの合成と放出、及び抗体の産生を促進することができる。体内のリンパ球集団を増加させ、これらの細胞のエフェクター機能を増強させるＩＬ‐２の機能は、その抗腫瘍効果に役立ち、高用量のＩＬ‐２は、１９８０年代初頭に既に転移性腎細胞癌と悪性黒色腫の治療に承認された。

しかし、ＩＬ‐２の体内での半減期が短く、バイオアベイラビリティも低いため、臨床応用では有効性を維持するためにしばしば複数回の頻繁な投与が必要となる。また、ヒトＩＬ‐２がヒトＩＬ‐２高親和性受容体（ＩＬ‐２Ｒαβγ）に結合すると、必然的に大量のＴｒｅｇ細胞が活性化される。これら２つの要因が相まって、異なる程度の副作用が引き起こされる。最も深刻なのは毛細血管漏出症候群（ＶａｓｃｕｌａｒＬｅａｋａｇｅＳｙｎｄｒｏｍｅ，ＶＬＳ）である。これは、血管内の液体が肝臓、肺、その他の臓器に蓄積し、その結果、肺水腫や肝細胞損傷が引き起こされるため、患者は治療を中止せざるを得なくなり、治療アドヒアランスが大幅に低下し、関連する治療法のさらなる臨床応用も制限されている。

従来技術では、研究者たちはよくポリエチレングリコールなどの水溶性ポリマーを用いて薬物を修飾することにより、薬物の生理学的半減期を延長し、薬物の免疫原性及び毒性を低下させる（NandiniV,Proc.Natl.Acad.Sci,1987;常遠,インターロイキン‐２のＰＥＧ化,1996）。王立夫らは、純度７５％、分子量５０００のモノメトキシポリエチレングリコール活性エステルで野生型ｒＩＬ‐２を修飾したが、得られたランダム修飾産物は６９．７％のｉｎｖｉｔｒｏ活性しか保持していなかった（王立夫ら．ｒＩＬ‐２のポリエチレングリコール修飾体の作製及びその体内外における抗肝がん細胞の作用，1997）。さらに、体内での薬物の徐放を実現し、バイオアベイラビリティを向上させるために、薬物をポリエチレングリコールに直接結合するという従来の修飾方法では理想的な効果が得られない。従来技術では、リンカー（ｌｉｎｋｅｒ）を介して水溶性ポリマーと薬物を結合させることによって、ポリマー‐薬物結合体を形成し、結合体から水溶性ポリマーが脱落することで、薬物活性の徐放及び放出制御の目的が達成できると報告されている。これにより、薬物が病変（がんなど）の部位により長く留まるため、投与頻度が減り、患者への不便が軽減される。例えば、特許文献ＣＮ２００６８００２９８４９．５は、フルオレンなどの電離可能な水素原子を含んだ芳香族部分、スペーサー部分と水溶性ポリマーを含む抱合体を開示しており、特許文献ＣＮ１０３５１７７１８Ａはさらに、前記のポリマーとｒＩＬ‐２で形成された複合体を開示している。この複合体は実際は、アメリカのＮｅｋｔａｒ社によって開発されたＮＫＴＲ‐２１４というＣＤ１２２（ＩＬ‐２Ｒβ）偏向アゴニストである。このＮＫＴＲ‐２１４複合体は、ＩＬ‐２（アミノ酸配列はａｌｄｅｓｌｅｕｋｉｎと同じ）に、フルオレン環構造を持つ分子量２０Ｋの分岐型ＰＥＧが６つ結合されている。穏やかなアルカリ性条件下では、β－脱離反応によってフルオレン・メトキシカルボニルが脱落し、これによって、ＮＫＴＲ‐２１４は生理的条件下（ｐＨ＝７．４、弱アルカリ性）でタンパク質表面の５つのＰＥＧが徐々に放出され、ＩＬ‐２Ｒβ受容体に優先的に結合してＴ細胞の活性化を増強させ、同時に体内で長時間的に循環する機能を持つようになる。ＮＫＴＲ‐２１４分子の開発は、ＩＬ‐２／ＩＬ‐２Ｒα界面に蓄積するリシン残基（Ｋ３１、Ｋ３４、Ｋ４２、Ｋ４７、Ｋ４８、Ｋ７５など）への部位特異的修飾を増加させるために、ＰＥＧ試薬のスクリーニング及びカップリング反応の最適化を行った。それによって、ＩＬ‐２／ＩＬ‐２Ｒαが相互作用する重要な疎水性結合部位の近くにＰＥＧが位置付けるようになったため、ＣＤ２５（ＩＬ‐２Ｒα）への結合が減少し、ＣＤ１２２（ＩＬ‐２Ｒβ）が優先的に活性化されるという目的を達成した（Charych D H,HochU,Langowski J L,et al.NKTR‐214,an engineered cytokine with biased IL2receptor binding,increasedtumor exposure,and marked efficacy in mouse tumormodels [J].ClinicalCancerResearch An Official Journal of the American Association for CancerResearch,2016,22(3):680‐690.）。Ｎｅｋｔａｒ社とＢＭＳの間はＮＫＴＲ２１４に関して３６億米ドルの提携を結んだが、実施した２つの第ＩＩＩ相臨床試験（ＰＩＶＯＴＩＯ００１とＰＩＶＯＴ‐０９）は、臨床治療データが主要なエンドポイントに達しておらず、２０２２年に相次いで失敗したと発表された（２０２２ＥＭＳＯ，ヨーロッパ腫瘍内科学会年会，要旨番号７８５Ｏ、ＬＢＡ６８）。

本発明の発明者は大量の実験と研究を通じて、既存の成熟したポリエチレングリコール修飾剤をスクリーニングし、ある構造のＰＥＧ修飾剤を選定した。当該ポリエチレングリコール修飾剤をＩＬ‐２又はその変異体の修飾に用いて、優れた活性放出制御及び活性徐放の効果が得られ、同類の薬剤と比較して、優れたバイオアベイラビリティを示し、薬物の投与頻度を減少させ、治療効果と患者のコンプライアンスの大幅な改善が期待される。なお本発明は、開発中のＰＥＧ‐ＩＬ２類薬物であるＮＫＴＲ‐２１４に比べて、分子設計の面において根本的に異なる。ＮＫＴＲ‐２１４は投与後、そのＰＥＧ分子の体内での分離プロセスが非常に複雑で、制御不可能であるため、ＣＤ１２２偏向アゴニストの特性を常に維持することは理論的に不可能である。これは薬物効果の安定的発現に影響を与えることになる。本発明の発明者は、原タンパク質の配列を部位特異的突然変異することで、ＣＤ１２２に対する偏向性及びＰＥＧ修飾部位の制御を達成し、安全性、有効性、品質管理性の３つの方面から、ＮＫＴＲ‐２１４薬物の持つ分子設計上の潜在的な欠点を解決した。さらに、動物体内における薬物動態、薬効などのデータにより、こういった差別化優位性を確認した。

ＣＮ２００６８００２９８４９．５ＣＮ１０３５１７７１８Ａ

NandiniV,Proc.Natl.Acad.Sci,1987;常遠,インターロイキン‐２のＰＥＧ化,1996 王立夫ら.ｒＩＬ‐２のポリエチレングリコール修飾体の作製及びその体内外における抗肝がん細胞の作用,1997 Charych D H,HochU,Langowski J L,et al.NKTR‐214,an engineered cytokine with biased IL2receptor binding,increasedtumor exposure,and marked efficacy in mouse tumormodels [J].ClinicalCancerResearch An Official Journal of the American Association for CancerResearch,2016,22(3):680‐690. ２０２２ＥＭＳＯ，ヨーロッパ腫瘍内科学会年会，要旨番号７８５Ｏ、ＬＢＡ６８

本発明が解決しようとする技術的課題は、ＩＬ‐２などの生物活性分子の利用率が低い及びそれらのポリエチレングリコール修飾体の活性が一般に低下している問題を克服することである。

本発明はまず、生物活性分子の活性放出制御及び活性徐放を達成する方法を提供する。本発明の発明者は、ＩＬ‐２などの生物活性分子をある特定の種類と特定の構造のポリエチレングリコールと反応させて結合体を形成することにより、一定のｉｎｖｉｔｒｏ条件又はｉｎｖｉｖｏの生理的条件下でＰＥＧが結合体の構造から徐々に脱落し、生物活性分子の活性が徐々に放出される効果を実現した。これによって、生物活性分子は安定した有効血中濃度を維持し、薬物の体内および体外での活性放出の制御と徐放ができ、比較的に優れた薬物バイオアベイラビリティの動的バランスが達成できる。また、投与頻度の低減、薬物バイオアベイラビリティの向上、患者のコンプライアンスの向上と安全性の向上など臨床応用におけるメリットも期待できる。一方、本発明は新型のＩＬ‐２突然変異タンパク質を提供する。この突然変異タンパク質は、ＩＬ‐２のポリエチレングリコール修飾部位が突然変異され、ＰＥＧ修飾の制御がより容易になった。さらに、この突然変異体はＩＬ‐２の受容体結合部位が突然変異され、野生型ＩＬ‐２と比較してより高い活性を有している。

本発明の目的の一つは、生物活性分子の活性放出制御及び活性徐放を達成する方法を提供することである。前記方法は、ポリエチレングリコール修飾剤で生物活性分子をアミノ基修飾する方法である。この方法で得られた修飾体は、ＰＥＧが逐次に脱落するにつれて、生物活性分子の活性が徐々に放出される。前記ポリエチレングリコール修飾剤はポリエチレングリコール・スクシンイミジルスクシネートである。

前記生物活性分子は、タンパク質またはペプチドであり、好ましくはインターロイキンであり、最も好ましくはＩＬ‐２である。

前記ＰＥＧ修飾剤は、好ましくは直鎖型ポリエチレングリコール・スクシンイミジルスクシネートである。

本発明のもう一つの目的は、ヒトＩＬ‐２のポリエチレングリコール修飾体を提供することである。前記修飾体は、ポリエチレングリコール・スクシンイミドスクシネートをＰＥＧ修飾剤として使用しており、一つ当たりのヒトＩＬ‐２には平均して４．５～８．５個のＰＥＧが結合されている。

好ましくは、前記ＰＥＧ修飾剤は直鎖型ポリエチレングリコール・スクシンイミジルスクシネートでである。

より好ましくは、前記ＰＥＧ修飾剤の分子量は５～２０ｋＤａである。前記分子量は表示値であり、実際の分子量は表示値の９０％～１１０％であってよい。ＰＥＧ修飾剤の分子量が５ｋＤａである場合、一つ当たりのヒトＩＬ‐２には平均して５．５～７．５個のＰＥＧが結合される。ＰＥＧ修飾剤の分子量が１０～２０ｋＤａである場合、一つ当たりのヒトＩＬ‐２には平均して６．５～８．５個のＰＥＧが結合される。

より好ましくは、ＰＥＧ修飾剤の構造は下図のとおりである。式中、ｎは９７～４９４の整数である。ｎが９７～４９４の整数である場合、ＰＥＧ修飾剤の実際の分子量は約４．５ｋ～２２ｋであり、対応する分子量の表示値は５～２０ｋＤａである。

より好ましくは、ヒトＩＬ‐２のポリエチレングリコール修飾体の構造は下図のとおりである。式中、ｎは９７～４９４の整数であり、ｍは４．５～８．５である。

本発明のもう一つの目的は、ヒトＩＬ‐２突然変異体を提供することである。前記突然変異体は、隣接するリシンを含まず、ＰＥＧで修飾したらより均一な修飾体が得られる。本発明の発明者は研究で下記のことを判明した。即ち、ＳＥＱＩＤＮＯ：１に示される野生型ヒトＩＬ‐２のＮ末端からの８位、９位、４８位、４９位のアミノ酸が全てリシンであり、全てＰＥＧに修飾される可能性があるが、隣接部位が同時にＰＥＧに修飾されることはほとんどない。飽和修飾の場合、ＩＬ‐２の８位か９位が修飾され、４８位か４９位が修飾される。即ち、修飾される部位が異なる４種類の異性体が生成され、得られたヒトＩＬ‐２ポリエチレングリコール修飾体が不均一である。本発明の発明者はそれで、８位および／または９位のアミノ酸、４８位および／または４９位のアミノ酸を突然変異することにした。これにより、ＰＥＧ修飾部位が異なる異性体の生成が大幅に減少し、ＰＥＧ修飾産物の均一性の制御が容易になった。本発明の出願前に、当業者は、ＩＬ‐２配列中の隣接するアミノ酸がともにリシンであることがＰＥＧ修飾に不良な影響を及ぼすことを意識していなかったため、ポリエチレングリコールでＩＬ‐２を修飾する際には対応する部位を突然変異する動機がない。

本発明によって提供されるヒトＩＬ‐２突然変異体は、野生型ヒトインターロイキン‐２を基に、Ｎ末端からの８位または／および９位のアミノ酸が置換されているか、または野生型ヒトインターロイキン‐２を基に、Ｎ末端からの４８位または／および４９位のアミノ酸が置換されている。前記野生型ヒトＩＬ－２のアミノ酸配列がＳＥＱＩＤＮＯ：１に示される通りである。

好ましくは、野生型ヒトＩＬ‐２を基に、Ｎ末端からの８位または／および９位のアミノ酸、および４８位または／および４９位のアミノ酸が置換されている。

具体的な実施例では、８位のリシンをアルギニンに、９位のリシンをアルギニンに、４８位のリシンをアルギニン、トリプトファン又はチロシンに、４９位のリシンをアスパラギン酸に突然変異するのを例として挙げられている。ただし、これらの実施例は例示するものであり、本発明の範囲を限定するものではない。８位、９位、４８位、および４９位のアミノ酸を突然変異させる目的は、野生型ＩＬ‐２配列中に隣接するリシンが存在するため、多様なポリエチレングリコール修飾体の異性体が生成され、ＰＥＧ修飾生成物の均一性に影響を与えるという問題を解決するためである。当業者は、上記アミノ酸部位を実施例で示したアミノ酸とは別に、ほかのリシンでないアミノ酸へ突然変異させても上記の目的が達成できることを理解している。

本発明はもう一方で、前記隣接するリシンを含まないヒトＩＬ‐２をもとに、さらに最適化を行ない、ｉｎｖｉｔｒｏでの活性が野生型ＩＬ‐２より顕著に優れたヒトＩＬ‐２突然変異体を開発した。前記突然変異体は、野生型ヒトＩＬ‐２を基に、Ｎ末端からの１位、８位、９位、１８位、１９位、４８位、４９位、７２位および／または８１位に対応する１個、２個またはそれ以上複数の部位のアミノ酸が置換された。前記野生型ヒトＩＬ‐２のアミノ酸配列は、ＳＥＱＩＤＮＯ：１に示される通りである。

好ましくは、これらの部位における突然変異は、以下の残基置換スキームから選択する。１位：Ａ１欠失；８位：Ｋ８Ｒ；９位：Ｋ９Ｒ；１８位：Ｌ１８Ｍ；１９位：Ｌ１９Ｓ；４８位：Ｋ４８Ｗ、Ｒ；４９位：Ｋ４９Ｒ；７２位：Ｌ７２Ｆ；８１位：Ｒ８１Ｄ。より好ましくは、前記突然変異体は以下の１個又は複数の突然変異を含む。８位：Ｋ８Ｒ；４８位：Ｋ４８Ｗ；７２位：Ｌ７２Ｆ；および／または８１位：Ｒ８１Ｄ。前記野生型ヒトＩＬ‐２のアミノ酸配列は、ＳＥＱＩＤＮＯ：１に示される通りである。

最も好ましくは、前記突然変異は、下表に示されている突然変異スキームの中からいずれか１つを選択する。

第三の側面として、本発明の発明者は、ＩＬ‐２突然変異体のＩＬ‐２Ｒαへの偏向性を減少させ、ＩＬ‐２Ｒβ、ＩＬ‐２Ｒγへの偏向性を維持または増強する必要性も考慮に入れた。そのために、彼らは、野生型ヒトＩＬ‐２のＮ末端からの１位、１８位、１９位、２７位、３５位、３８位、４１位、４２位、４３位、４５位、５４位、６４位、６５位、７２位、７８位、７９位、８０位、８１位、８２位、８３位、８７位、９２位および／または９７位に対応する１個、２個またはそれ以上複数の部位のアミノ酸の置換を行ったうえで、効果的にスクリーニングを行った。Ｇ４３８Ｐ８がその一例である。

ＩＬ‐２は、ＩＬ‐２受容体（ＩＬ‐２Ｒ）を介して作用する。ＩＬ‐２Ｒ受容体はＩＬ‐２Ｒα（ＣＤ２５）、ＩＬ‐２Ｒβ（ＣＤ１２２）、およびＩＬ‐２Ｒγ（ＣＤ１３２）という３つのサブユニットを含み、この３つのサブユニットで、３つの異なる受容体形式が形成される。高結合力受容体には、ＩＬ‐２Ｒα、ＩＬ‐２Ｒβ、およびＩＬ‐２Ｒγの３つのサブユニットが全て含まれる。中結合力受容体には、ＩＬ‐２Ｒβ、ＩＬ‐２Ｒγが含まれる。低結合力受容体はＩＬ‐２Ｒαである。ＩＬ‐２ＲαはＴｒｅｇ細胞に高く発現し、ＩＬ‐２ＲβはＣＤ８＋Ｔ細胞、ＮＫ細胞、およびＴｒｅｇ細胞に全て発現し、ＩＬ‐２Ｒγは全ての免疫細胞に発現する。ＩＬ‐２は、様々な細胞上の受容体に結合して、免疫応答において複数の作用に関与している。一方では、ＩＬ‐２は免疫系の刺激因子として、Ｔ細胞の増殖と分化を刺激し、細胞傷害性Ｔリンパ球の生成を誘導し、Ｂ細胞の増殖・分化、及び免疫グロブリンの合成を促進し、ＮＫ細胞の生成と活性化を刺激する。これらの機能に基づいて、ＩＬ‐２は免疫治療剤としてがんや慢性ウイルス感染症の治療に承認されている。もう一方で、ＩＬ‐２は免疫抑制性のＣＤ４＋ＣＤ２５＋調節性Ｔ細胞（即ちＴｒｅｇ細胞）の活性化と増殖を促進し、免疫抑制を引き起こす。ＩＬ‐２のＩＬ‐２Ｒαへの偏向性を変えることで、免疫系刺激剤として使用されるＩＬ‐２の毒性や副作用を軽減させ、薬効を向上させることは、多くの研究が提案されてきた。部位突然変異によって、ＩＬ‐２受容体への偏向性を変更する研究は既に多数に報告されてきた。当業者は、上記具体的な部位を突然変異されたＩＬ‐２に限定されることなく、他の部位を突然変異されたＩＬ‐２を用いて、ポリエチレングリコール修飾を行ってもよい。

本発明のもう一つの目的は、ヒトＩＬ‐２突然変異体のポリエチレングリコール修飾体を提供することである。前記ポリエチレングリコール修飾体は、ポリエチレングリコール・スクシンイミジルスクシネートをＰＥＧ修飾剤として使用しており、一つ当たりのヒトＩＬ‐２には平均して５～８個のＰＥＧが結合される。前記ヒトＩＬ‐２突然変異体は、上記異なる突然変異体の中の一種である。

本発明のもう一つの目的は、腫瘍疾患を治療するための薬物の製造におけるヒトＩＬ‐２またはその突然変異体のポリエチレングリコール修飾体の応用を提供することである。前記腫瘍は、扁平上皮癌、黒色腫、結腸癌、乳癌、卵巣癌、前立腺癌、胃癌、肝臓癌、小細胞肺癌、非小細胞肺癌、甲状腺癌、腎臓癌、胆管癌、脳癌、子宮頸癌、上顎洞癌、膀胱癌、食道癌、ホジキン病、及び副腎皮質癌を含むが、これらに限定されない。

本発明のもう一つの目的は、腫瘍疾患を治療するための組成物を提供することである。前記組成物は、前記ヒトＩＬ‐２のポリエチレングリコール修飾体、ヒトＩＬ‐２の突然変異体、またはヒトＩＬ‐２突然変異体のポリエチレングリコール修飾体を含み、ＨＥＲ２抗体、ＰＤ‐１抗体、ＰＤ‐Ｌ１抗体、またはＣＤ２６抗体などをも含む。

前記ＨＥＲ２抗体は、ロシュ社のＨｅｒｃｅｐｔｉｎ、ＰｅｒｊｅｔａとＫａｄｃｙｌａなどを含む。

前記ＰＤ‐１抗体は、ブリストル・マイヤーズスクイブ社のＯｐｉｄｉｖｏ、メルク社のＫｅｙｔｒｕｄａ、君実生物のＴｏｒｉｐａｌｉｍａｂ、信達生物のＳｉｎｔｉｌｉｍａｂ、恒瑞医薬のＣａｍｒｅｌｉｚｕｍａｂ、百済神州のｔｉｓｌｅｌｉｚｕｍａｂなどを含む。

前記ＰＤ‐Ｌ１抗体は、ロシュ社のＴｅｃｅｎｔｒｉｑ、アストラゼネカ社のＩｍｆｉｎｚｉ、メルク社のＢａｖｅｎｃｉｏなどを含む。

前記ＣＤ２６抗体は、例えばＹＳ１１０（先願ＣＮ２００６８００３４９３７．４）、または先願ＣＮ２０２１１１２４５４８９．５などの抗ＣＤ２６抗体であってよい。

前記組成物によって治療される腫瘍疾患としては、扁平上皮癌、黒色腫、結腸癌、乳癌、卵巣癌、前立腺癌、胃癌、肝臓癌、小細胞肺癌、非小細胞肺癌、甲状腺癌、腎臓癌、胆管癌、脳癌、子宮頸癌、上顎洞癌、膀胱癌、食道癌、ホジキン病、副腎皮質癌などを含むが、これらに限定されない。

本発明の技術的解決策を通じて、主に以下の技術的効果を実現した。
１、ポリエチレングリコール・スクシンイミジルスクシネートを用いて、ＩＬ‐２またはその突然変異体のリシン側鎖ε‐アミノ基と反応させて、ポリエチレングリコールとＩＬ‐２の間はアミド結合で結合される。受容体結合部位が完全に覆われたため、修飾後のＰＥＧ‐ＩＬ‐２分子は活性を持たない。また、他の修飾剤とは異なり、ポリエチレングリコール・スクシンイミジルスクシネートはタンパク質またはペプチド薬物と結合した後の複合体中には一つのエステル結合が存在する。エステル結合はその固有な不安定性から、加水分解によるＰＥＧ鎖の脱落を起こしやすい。このような特性は従来、修飾剤が脱落しやすいため、修飾体分子の不安定性に繋がると見なされてきたため、このＰＥＧの応用は段々脱落しにくい他のＰＥＧ修飾剤（例えば、ポリエチレングリコール・スクシンイミジルプロピオネートなど）に取って代わった。しかし、本発明においては、この加水分解性質により、ＩＬ‐２は体内で徐々に薬物活性を放出することができ、特定の分子量と修飾数では極めて優れた薬効が得られる。

２、ＩＬ‐２中のリシン部位を突然変異させ、隣接するリシンを含まないようにすることで、ＰＥＧカップリングの位置が限定され、ＰＥＧ修飾部位が異なる異性体の生成が大幅に減少し、ＰＥＧ修飾産物の均一性の制御が容易になった。これに基づいて、さらなる突然変異部位の設計とスクリーニングを通じて、α受容体への親和性が大幅に低下し、β受容体への親和性が維持される受容体結合偏向性の突然変異体、およびＣＴＬＬ‐２細胞増殖活性が野生型ＩＬ‐２より顕著に優れた突然変異体を開発した。

３、実際に作用する際に、ＰＥＧ化ＩＬ‐２の活性はＰＥＧの徐々な脱落につれて、ゆっくりと放出され続ける。本発明は、異なる分子量のＰＥＧおよび異なるＰＥＧ修飾数の最適化とスクリーニングを通じて、高修飾度ＩＬ‐２の低いバイオアベイラビリティを回避するとともに、低修飾度ＩＬ‐２の高い毒性や副作用を避けることもできた。それによって、本発明のＰＥＧ化ＩＬ‐２はバイオアベイラビリティと安全性の動的なバランスを効果的に実現し、一方、投与量および投与頻度を調整することで、薬物の安定した血中濃度とより良い生体内での利用度を実現し、体内でより優れた薬効を達成した。

ＩＬ‐２突然変異体がＣＴＬＬ‐２細胞の増殖を刺激する曲線図である。ＩＬ‐２突然変異体がＣＴＬＬ‐２細胞の増殖を刺激する曲線図である。ＩＬ‐２突然変異体がＣＴＬＬ‐２細胞の増殖を刺激する曲線図である。ＩＬ‐２突然変異体がＣＴＬＬ‐２細胞の増殖を刺激する曲線図である。ＩＬ‐２突然変異体がＣＴＬＬ‐２細胞の増殖を刺激する曲線図である。アルカリ条件下で活性化した異なる突然変異体タンパク質のＰＥＧ‐ＳＳ修飾産物がＣＴＬＬ‐２細胞増殖を刺激する活性値を示す図である。アルカリ条件下で活性化した異なる突然変異体タンパク質のＰＥＧ‐ＳＳ修飾産物がＣＴＬＬ‐２細胞増殖を刺激する活性値を示す図である。アルカリ条件下で活性化した異なる突然変異体タンパク質のＰＥＧ‐ＳＳ修飾産物がＣＴＬＬ‐２細胞増殖を刺激する活性値を示す図である。構造と分子量の異なるＰＥＧ‐ＳＳで修飾されたＩＬ‐２突然変異体の修飾体産物によるＣＴＬＬ‐２リン酸化ＳＴＡＴ５レベルの測定曲線図である。ＰＥＧ‐ＳＳで修飾された異なるＩＬ‐２突然変異体の修飾体産物によるＣＴＬＬ‐２リン酸化ＳＴＡＴ５レベルの測定曲線図である。ｍＰＥＧ‐ＳＳ‐５ｋ‐ＧＰ８高修飾度と原タンパク質であるＧＰ８のｉｎｖｉｖｏでの薬物動態の比較を示す図である。ＣＴ２６．ＷＴネズミ由来結腸癌細胞ＢＡＬＢ／ｃマウス皮下移植モデルにおける、異なる構造のＰＥＧ‐ＳＳ（直鎖型または分岐型）で修飾されたＩＬ‐２の薬効評価の結果を示す図である。図６ａは各群の動物の腫瘍体積増加曲線を示し、図６ｂは各群の動物の腫瘍重量を示し、図６ｃは各群の動物の体重の変化を示す。ＣＴ２６．ＷＴネズミ由来結腸癌細胞ＢＡＬＢ／ｃマウス皮下移植モデルにおける、異なる構造のＰＥＧ‐ＳＳ（直鎖型または分岐型）で修飾されたＩＬ‐２の薬効評価の結果を示す図である。図６ａは各群の動物の腫瘍体積増加曲線を示し、図６ｂは各群の動物の腫瘍重量を示し、図６ｃは各群の動物の体重の変化を示す。ＣＴ２６．ＷＴネズミ由来結腸癌細胞ＢＡＬＢ／ｃマウス皮下移植モデルにおける、異なる構造のＰＥＧ‐ＳＳ（直鎖型または分岐型）で修飾されたＩＬ‐２の薬効評価の結果を示す図である。図６ａは各群の動物の腫瘍体積増加曲線を示し、図６ｂは各群の動物の腫瘍重量を示し、図６ｃは各群の動物の体重の変化を示す。Ｂ１６‐Ｆ１０ネズミ由来黒色腫細胞Ｃ５７ＢＬ／６マウス皮下移植モデルにおける、直鎖型ＰＥＧ‐ＳＳで修飾された異なるＩＬ‐２突然変異体の薬効評価の結果を示す図である。図７ａは各群の動物の腫瘍体積増加曲線を示し、図７ｂは各群の動物の腫瘍重量を示す。Ｂ１６‐Ｆ１０ネズミ由来黒色腫細胞Ｃ５７ＢＬ／６マウス皮下移植モデルにおける、直鎖型ＰＥＧ‐ＳＳで修飾された異なるＩＬ‐２突然変異体の薬効評価の結果を示す図である。図７ａは各群の動物の腫瘍体積増加曲線を示し、図７ｂは各群の動物の腫瘍重量を示す。Ｂ１６‐Ｆ１０ネズミ由来黒色腫腫瘍モデルにおける、分子量と修飾度の異なるＰＥＧ‐ＳＳ修飾ＩＬ‐２突然変異体の薬効評価を示す図である。図８ａは、各群の動物の腫瘍成長曲線を示し、図８ｂは、細胞接種後１７日目の各群の動物の腫瘍重量を示し、図８ｃは動物の体重増加率の変化を示す。Ｂ１６‐Ｆ１０ネズミ由来黒色腫腫瘍モデルにおける、分子量と修飾度の異なるＰＥＧ‐ＳＳ修飾ＩＬ‐２突然変異体の薬効評価を示す図である。図８ａは、各群の動物の腫瘍成長曲線を示し、図８ｂは、細胞接種後１７日目の各群の動物の腫瘍重量を示し、図８ｃは動物の体重増加率の変化を示す。Ｂ１６‐Ｆ１０ネズミ由来黒色腫腫瘍モデルにおける、分子量と修飾度の異なるＰＥＧ‐ＳＳ修飾ＩＬ‐２突然変異体の薬効評価を示す図である。図８ａは、各群の動物の腫瘍成長曲線を示し、図８ｂは、細胞接種後１７日目の各群の動物の腫瘍重量を示し、図８ｃは動物の体重増加率の変化を示す。ＣＴ２６．ＷＴネズミ由来結腸癌腫瘍モデルにおける、分子量と修飾度の異なるＰＥＧ‐ＳＳ修飾ＩＬ‐２突然変異体の薬効評価を示す図である。図９ａ各群の動物の腫瘍成長曲線を示し、図９ｂは細胞接種後２２日目の各群の動物の腫瘍重量を示し、図９ｃは動物の体重増加率の変化を示す。ＣＴ２６．ＷＴネズミ由来結腸癌腫瘍モデルにおける、分子量と修飾度の異なるＰＥＧ‐ＳＳ修飾ＩＬ‐２突然変異体の薬効評価を示す図である。図９ａ各群の動物の腫瘍成長曲線を示し、図９ｂは細胞接種後２２日目の各群の動物の腫瘍重量を示し、図９ｃは動物の体重増加率の変化を示す。ＣＴ２６．ＷＴネズミ由来結腸癌腫瘍モデルにおける、分子量と修飾度の異なるＰＥＧ‐ＳＳ修飾ＩＬ‐２突然変異体の薬効評価を示す図である。図９ａ各群の動物の腫瘍成長曲線を示し、図９ｂは細胞接種後２２日目の各群の動物の腫瘍重量を示し、図９ｃは動物の体重増加率の変化を示す。Ａ３７５ヒト由来黒色腫モデルにおける、分子量と修飾度の異なるＰＥＧ‐ＳＳ修飾ＩＬ‐２突然変異体の薬効評価を示す図である。図１０ａは動物腫瘍成長曲線を示し、図１０ｂは細胞接種後４５日目の各群の動物の腫瘍重量を示し、図１０ｃ動物体重増加率を示す。Ａ３７５ヒト由来黒色腫モデルにおける、分子量と修飾度の異なるＰＥＧ‐ＳＳ修飾ＩＬ‐２突然変異体の薬効評価を示す図である。図１０ａは動物腫瘍成長曲線を示し、図１０ｂは細胞接種後４５日目の各群の動物の腫瘍重量を示し、図１０ｃ動物体重増加率を示す。Ａ３７５ヒト由来黒色腫モデルにおける、分子量と修飾度の異なるＰＥＧ‐ＳＳ修飾ＩＬ‐２突然変異体の薬効評価を示す図である。図１０ａは動物腫瘍成長曲線を示し、図１０ｂは細胞接種後４５日目の各群の動物の腫瘍重量を示し、図１０ｃ動物体重増加率を示す。Ａ３７５ヒト黒色腫モデルにおける、異なる投与量のＰＥＧ修飾ＩＬ‐２突然変異体の薬効評価を示す図である。図１１ａは動物腫瘍成長曲線を示し、図１１ｂ各群の動物の腫瘍重量を示し、図１１ｃは各群の動物の体重増加率を示す。Ａ３７５ヒト黒色腫モデルにおける、異なる投与量のＰＥＧ修飾ＩＬ‐２突然変異体の薬効評価を示す図である。図１１ａは動物腫瘍成長曲線を示し、図１１ｂ各群の動物の腫瘍重量を示し、図１１ｃは各群の動物の体重増加率を示す。Ａ３７５ヒト黒色腫モデルにおける、異なる投与量のＰＥＧ修飾ＩＬ‐２突然変異体の薬効評価を示す図である。図１１ａは動物腫瘍成長曲線を示し、図１１ｂ各群の動物の腫瘍重量を示し、図１１ｃは各群の動物の体重増加率を示す。Ａ４９８ヒト腎臓癌モデルにおける、異なる投用量のＰＥＧ修飾ＩＬ‐２突然変異体の薬効評価を示す図である。図１２ａは各群の動物腫瘍の成長曲線を示し、図１２ｂは各群の動物の腫瘍重量を示し、図１２ｃは各群の動物の体重増加率を示す。Ａ４９８ヒト腎臓癌モデルにおける、異なる投用量のＰＥＧ修飾ＩＬ‐２突然変異体の薬効評価を示す図である。図１２ａは各群の動物腫瘍の成長曲線を示し、図１２ｂは各群の動物の腫瘍重量を示し、図１２ｃは各群の動物の体重増加率を示す。Ａ４９８ヒト腎臓癌モデルにおける、異なる投用量のＰＥＧ修飾ＩＬ‐２突然変異体の薬効評価を示す図である。図１２ａは各群の動物腫瘍の成長曲線を示し、図１２ｂは各群の動物の腫瘍重量を示し、図１２ｃは各群の動物の体重増加率を示す。

定義：
インターロイキン‐２（Ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ‐２，ＩＬ‐２）は、組換えまたは非組換えの方法で得ることができ、野生型ＩＬ‐２またはその突然変異体であってよい。ＩＬ‐２は、細菌（例えば、大腸菌）、哺乳動物細胞（例えば、ＣＨＯ細胞）、酵母（例えば、ピキア酵母）の発現によって作製することができる。ＩＬ‐２は、ヒト由来または動物由来であってよい。ヒト由来のＩＬ－２であるのが好ましい。本発明の具体的な実施例では、ヒトＩＬ‐２のアミノ酸配列はＳＥＱＩＤＮＯ：１に示される通りである。前記突然変異体は、ＳＥＱＩＤＮＯ：１に示されるヒトＩＬ‐２を基に、一部のアミノ酸の置換、挿入または削除などを行って得られたものである。具体的な実施例では、ポリエチレングリコール修飾ＩＬ‐２はＳＥＱＩＤＮＯ：１に示されるＩＬ‐２およびその突然変異体を使用したが、具体的な実施例はあくまで例示を目的とするものであり、本発明の範囲を制限するものではないことは当業者が理解している。ポリエチレングリコール修飾ＩＬ‐２のＩＬ‐２は、配列が公開された他のヒトＩＬ‐２から選択することもでき、公開された他のヒトＩＬ‐２の配列を基にＳＥＱＩＤＮＯ：１に対応する位置のアミノ酸を突然変異（隣接するリシンを含まないようにする突然変異や、ＩＬ‐２Ｒαへの偏向性を弱め、ＩＬ‐２Ｒβ、ＩＬ‐２Ｒγへの偏向性を高める突然変異）させて得られた突然変異体から選択することもできる。

ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）は、通常、エチレンオキシドの重合により形成され、分岐型、直鎖型と多腕型がある。一般的に、分子量が２０，０００以下のものをＰＥＧと、分子量がより大きいものをＰＥＯと呼ぶ。通常のポリエチレングリコールは両末端に１個ずつヒドロキシ基があり、片末端をメチル基でブロックするとメトキシ・ポリエチレングリコール（ｍＰＥＧ）が得られる。

ポリエチレングリコール修飾剤（ＰＥＧ修飾剤）は、官能基を持つポリエチレングリコール誘導体のことを指し、タンパク質及びポリペプチドの薬物の修飾に用いられる活性化されたポリエチレングリコールである。本発明で使用されるポリエチレングリコール修飾剤は、江蘇衆紅生物工程創薬研究院有限公司、または北京鍵凱科技股分有限公司から購入する。特定の分子量のＰＥＧ修飾剤の実際の分子量は、表示値の９０％～１１０％であってよい。例えば、ＰＥＧ５Ｋの実際の分子量は４．５ｋＤａ～５．５ｋＤａであってよい。ＰＥＧ２０Ｋの実際の分子量は１８ｋＤａ～２２ｋＤａであってよい。ＰＥＧ修飾剤の分子量の表示値が５ｋＤａ～２０ｋＤａであれば、その実際の分子量は４．５ｋＤａ～２２ｋＤａである。

実施例で使用されるＶ‐ＰＥＧ‐ＳＣ‐２０ｋは、分子量２０ｋＤａの分岐型ポリエチレングリコール・スクシンイミジルカルボネート修飾剤を指す。これは、特許文献ＣＮ２００６８００２９８４９．５を参照して作製したＰＥＧ修飾剤である。特許文献によれば、このＰＥＧ修飾剤は、ＰＥＧがリンカー（ｌｉｎｋｅｒ）を介して薬物と反応して複合体を形成し、ＰＥＧが複合体から脱落することで薬物活性の徐放と放出制御の目的を達成する。これは報告されたＮＫＴＲ‐２１４の構造と一致している。出願人は、このＰＥＧ修飾剤で修飾したＩＬ‐２修飾体を陽性参照物とした。Ｖ‐ＰＥＧ‐ＳＣ‐２０ｋ修飾剤の構造式は以下に示される通りである。式中、ｎは１９９～２４４の整数である。

実施例で使用されるＶ‐ＰＥＧ‐ＳＳ‐２０ｋは、分子量２０ｋＤａの分岐型ポリエチレングリコール・スクシンイミジルスクシネート修飾剤を指す。Ｖ‐ＰＥＧ‐ＳＳ‐２０ｋ修飾剤の構造式は以下に示される通りである。式中、ｎは１９８～２４４の整数である。

実施例で使用されるｍＰＥＧ‐ＳＳ‐２０ｋ／１０ｋ／５ｋは、分子量２０ｋＤａ、１０ｋＤａ、５ｋＤａの直鎖型ポリエチレングリコール・スクシンイミジルスクシネート修飾剤を指す。ｍＰＥＧ‐ＳＳ‐２０ｋ／１０ｋ／５ｋ修飾剤の構造式は以下に示される通りである。ｍＰＥＧ‐ＳＳ‐２０ｋの場合、ｎは４０３～４９４の整数であり、ｍＰＥＧ‐ＳＳ‐１０ｋの場合、ｎは１９９～２４４の整数であり、ｍＰＥＧ‐ＳＳ‐５ｋの場合、ｎは９７～１１９の整数である。

実施例で使用されるｍＰＥＧ‐ＳＰＡ‐５ｋは、分子量５ｋＤａの直鎖型ポリエチレングリコール・スクシンイミジルプロピオネート修飾剤を指す。ｍＰＥＧ‐ＳＰＡ‐５ｋ修飾剤の構造式は以下に示される通りである。式中、ｎは９８～１２０の整数である。

実施例１：ＩＬ‐２突然変異体の設計と作製
１、ＩＬ‐２突然変異体の設計
下表に示されているＩＬ‐２は野生型ＩＬ‐２であり、アミノ酸配列がＳＥＱＩＤＮＯ：１に示される通りである。他の突然変異体は、この野生型ＩＬ‐２を基にアミノ酸の置換、挿入、または削除などの操作を行って得られた突然変異体である。例えば、Ｇ４３８の配列はＳＥＱＩＤＮＯ：１に示される配列の第８位および第４８位のアミノ酸を突然変異して得たのであり、Ｋ８Ｒは第８位のリシンをアルギニンに突然変異することを指す。

２、タンパク質の作製
実施例で挙げた方法に限定されず、通常の組換えタンパク質作製方法を採用してもよい。ＩＬ‐２の突然変異体であるＧ４３８を例として作製を説明する。

ステップ１：Ｇ４３８のアミノ酸配列（ＳＥＱＩＤＮＯ：１に示される野生型ＩＬ‐２を基にＫ８Ｒ／Ｋ４８Ｗ突然変異を行った配列）に基づいて、大腸菌用に最適化してＳＥＱＩＤＮＯ：２に示されるＤＮＡ配列を取得する。このＤＮＡ配列をｐＢＶ２２０ベクターにクローン化し、組換えプラスミドｐＢＶ２２０‐Ｇ４３８を形成する。その後、組換えプラスミドをＴｏｐ１０大腸菌宿主にトランスフォームし、発現宿主Ｔｏｐ１０‐ｐＢＶ２２０‐Ｇ４３８を構築する。

ステップ２：Ｔｏｐ１０‐ｐＢＶ２２０‐Ｇ４３８組換え発現株をＴＢ培地（５００ｍＬ培地、液量２０％）に接種し、３０℃、２２０ｒｐｍで培養液のＯＤ６００が１．０±０．１に達するまで振盪培養する。その後、振盪培養の回転数を維持したまま、振盪培養の温度を４２℃に昇温させ、菌株を誘導発現させる。誘導発現は４時間行う。誘導発現後、遠心分離して菌体沈殿を回収した。

ステップ３：発現後の菌体沈殿を１０ｍＭＰＢＳ、ｐＨ７．４で１００ｇ／Ｌに再懸濁し、プローブ式超音波破砕装置で超音波破砕を行う（作業出力２５０ｗ、３秒間作動して４秒間隔を置く、合計破砕時間３０ｍｉｎ）。その後、遠心分離して破砕産物を回収し、Ｇ４３８インクルージョンボディ沈殿を得る。

ステップ４：Ｇ４３８インクルージョンボディをＰＢＳ＋１％Ｔｒｉｔｏｎ（登録商標）Ｘ‐１００で５０ｇ／Ｌに再懸濁し、攪拌しながら２時間以上の洗浄を３回行い、遠心分離して、Ｇ４３８粗精製インクルージョンボディを収集する。

ステップ５：Ｇ４３８粗精製インクルージョンボディを変性液（２０ｍＭＴｒｉｓ、８Ｍ尿素、５ｍＭＤＴＴ、ｐＨ１０．５）で１ｇ／１００ｍＬに再懸濁し、２時間以上撹拌して変性させ、遠心分離して上清を収集する。上清はＳｕｐｅｒｄｅｘ７５を用いて精製する。

ステップ６：精製後のＧ４３８をリフォールディング緩衝液で希釈してリフォールディングする（リフォールディング溶液：２０ｍＭＴｒｉｓ、２Ｍ尿素、３ｍＭシステイン、１ｍＭシスチン、０．０１％ＳＤＳ、ｐＨ８．０）。リフォールディング系内のタンパク質の濃度は０．１ｍｇ／ｍＬを超えないようにし、リフォールディング時間は３６時間以上、リフォールディング温度は１５℃とする。

ステップ７：リフォールディング後のＧ４３８を超濾過法で濃縮し、濃縮後のサンプルをＰＢＳ（ｐＨ７．４）で透析し、それによって尿素などの試薬を除去してＧ４３８精製品とする。

各突然変異体のアミノ酸配列は、ＳＥＱＩＤＮＯ：１に示される配列をもとに、表１に示される突然変異スキームに基づいて突然変異して得られる。上記同じような方法で、各突然変異体を作製する。

実施例２：ＩＬ－２突然変異体の受容体への親和性の測定
一、実験方法
バイオレイヤー干渉法（ＢＬＩ）で、ＩＬ‐２突然変異体とその受容体との親和性を測定する。

１、サンプル調製
供試品溶液：それぞれのタンパク質サンプルを取り、１×Ｋｉｎｅｔｉｃｓｂｕｆｆｅｒで３００ｍＭに希釈し、均一に混合して、後で使うためにおいておく。
受容体溶液：受容体ＩＬ‐２Ｒα（ＣＤ２５）、受容体ＩＬ‐２Ｒβ（ＣＤ１２２）、受容体ＩＬ‐２Ｒβ／γのサンプルを取って、それぞれ１×Ｋｉｎｅｔｉｃｓｂｕｆｆｅｒで１５～２０μｇ／ｍＬに希釈し、均一に混合し遮光して保存し、後で使うようにおいておく。

２、サンプルを加える
プロトコール設計に従ってサンプルウェルにサンプルを加える。各ウェルに２００μＬの試薬またはサンプルを加える。

二、実験結果
プログラムを実行し、ソフトウェアＦｏｒｔｅｂｉｏＤａｔａＡｎａｌｙｓｉｓ８．０でデータ分析を行って、親和性結合値を計算する。結果は下表に示される通りである。

三、結果分析
受容体親和性測定の結果によると、突然変異体Ｇ４９３、Ｇ４９６、Ｇ４９８、Ｇ４９９、Ｇ５００、Ｇ４３８Ｐ４、Ｇ４３８Ｐ５は２種類の受容体との結合が顕著に低下するか、結合しないことが示されている。これは突然変異によってタンパク質の構造に大きな変化が生じた可能性があることを示している。Ｇ４９５、Ｇ４３８Ｐ６、Ｇ４３８Ｐ７、Ｇ４３８Ｐ８、Ｇ４３８Ｐ１４、Ｇ４３８Ｐ１５などの突然変異体は、ＩＬ‐２β受容体への結合偏向性を示している。Ｇ４９５、Ｇ４３８Ｐ７、Ｇ４３８Ｐ８、Ｇ４３８Ｐ１４などにある突然変異は、ＩＬ‐２とＩＬ‐２Ｒβ／γとの結合に大きな影響を与えなかった。Ｇ４３８Ｐ１５とＩＬ‐２Ｒβ／γとの結合が著しく低下した。受容体との結合を保持している突然変異体を選定し、その生物学的活性を評価するために、さらにｉｎｖｉｔｒｏでＣＴＬＬ‐２細胞の増殖活性実験を実施する。

実施例３：ＩＬ‐２およびその突然変異体がＣＴＬＬ‐２細胞の増殖を刺激する活性の測定
一、実験方法
ＣＴＬＬ‐２はマウス由来の細胞株であり、ＩＬ‐２およびその突然変異体や修飾体のｉｎｖｉｔｒｏでの生物学的活性を評価するために、その細胞依存株であるＣＴＬＬ‐２細胞の増殖速度を異なる濃度で測定する方法を用いた。本実験方法は２０２０年版中国薬典第四部通則３５２４『ヒトインターロイキン‐２生物学的活性測定法』（ＣＴＬＬ‐２／ＭＴＴ比色法）に基づいている。

１．試液の調製
ＲＰＭＩ１６４０培養液：ＲＰＭＩ１６４０培養基粉末を１袋（規格：ＩＬ）取り、水を加えて溶解し１０００ｍｌに希釈する。さらに、炭酸水素ナトリウムを２．１ｇ加え、溶解した後は均一に混合し、ろ過除菌して、４℃で保存する。
基礎培養液：新生ウシ血清（ＦＢＳ）を１０ｍｌ量り取り、ＲＰＭＩ１６４０培養液を９０ｍｌ加える。４℃で保存する。
完全培養液：基礎培養液を１００ｍｌ吸い取り、最終濃度が４００‐８００ＩＵ／ｍｌとなるようにヒトＩＬ‐２を加える。４℃で保存する。
ＰＢＳ：１０×ＰＢＳを１００ｍｌ吸いを取り、１２１℃で２０分間滅菌した水を加えて１０００ｍｌに希釈する。
チアゾールブルー（ＭＴＴ）溶液：ＭＴＴを０．１ｇ量り取り、ＰＢＳで溶解し２０ｍＬに希釈する。０．２２μｍろ過膜でろ過除菌する。４℃で遮光保存する。
ライセート液：１５％のラウリル硫酸ナトリウム溶液、使用期間は１２か月を超えてはならない。

２．サンプル作製
タンパク質含有量既知の供試品を取り、適切な初期濃度に希釈する。９６ウェル細胞培養プレートにおいて、２倍系列希釈を行い、合計８段階の希釈度を作成する。各希釈度のサンプルを２ウェルに添加する。各ウェルに５０μｌの溶液を残し、ウェル内の余分な溶液を廃棄する。これらの操作は無菌条件下で行う。

３．細胞培養
ＣＴＬＬ‐２細胞を完全培養液で３７℃、５％二酸化炭素条件下で十分な量にまで培養する。遠心分離してＣＴＬＬ‐２細胞を収集し、ＲＰＭＩ１６４０培養液で３回洗浄する。その後、基礎培地に再懸濁し、１ｍＬあたり６．０×１０^５個の細胞を含む細胞懸濁液を調製する。細胞懸濁液は後で使用するために３７℃、５％二酸化炭素条件下で保存する。野生型サンプルおよび突然変異体サンプルを加えた９６ウェル細胞培養プレートの各ウェルに、５０μｌの細胞懸濁液を加え、３７℃、５％二酸化炭素条件下で１８～２４時間培養する。その後、各ウェルに２０μｌのＭＴＴ溶液を加え、３７℃、５％二酸化炭素条件下で４～６時間培養する。次には、各ウェルに１５０μｌのライセート液を加え、３７℃、５％二酸化炭素条件下で１８～２４時間保温する。上記すべての操作は無菌条件下で行う。細胞プレート内の液体を均一に混合し、マイクロプレートリーダーにセットし、６３０ｎｍを参照波長として、５７０ｎｍの波長で吸光度を測定し、結果を記録する。サンプル濃度（ｎｇ／ｍｌ）を横軸、ＯＤ５７０測定値の平均値を縦軸として、ソフトウェアＥＬＩＳＡＣａｌｃを用いて四項パラメータフィッティングを行い、供試品反応曲線を作成する。
供試品比活性（ＩＵ／ｍｇ）＝供試品生物学的活性（ＩＵ／ｍｌ）／２０（ｎｇ／ｍｌ）×１０^６

二、実験結果
測定結果は図１および下表に示される通りである。

三、結果分析
突然変異体の生物学的活性の測定結果から下記のことが分かる。新たに構築されたＩＬ‐２突然変異であるＧ４３８Ｐ１、Ｇ４３８Ｐ８、Ｇ４３８Ｐ１２、Ｇ４３８Ｐ２０、Ｇ４３８Ｐ２１、Ｇ４３８Ｐ２２は、野生型ＩＬ‐２に比べてＣＴＬＬ‐２細胞の増殖活性が顕著に優れており、臨床に応用する潜在力がある。

以下は簡略的に表記するために、Ｇ４３８を基にさらに改造を行って得た突然変異体、例えばＧ４３８Ｐ１、Ｇ４３８Ｐ８、Ｇ４３８Ｐ１２、Ｇ４３８Ｐ２０、Ｇ４３８Ｐ２１、Ｇ４３８Ｐ２２は、それぞれＧＰ１、ＧＰ８、ＧＰ１２、ＧＰ２０、ＧＰ２１、ＧＰ２２と略称する。

実施例４：ＰＥＧ修飾ＩＬ‐２の作製
実施例４ａ：陽性参照物Ｖ‐ＰＥＧ‐ＳＣ‐２０ｋ‐ｒｈＩＬ‐２の作製
一、修飾方法
特許文献ＣＮ２００６８００２９８４９．５に公開されている化合物Ｖ‐ＰＥＧ‐ＳＣ‐２０ｋ（厦門賽諾邦格から購入）を修飾剤として用いて、陽性対照品として同様に徐放効果を持つＰＥＧ‐ＩＬ‐２を作製した。

精製された野生型ＩＬ‐２タンパク質サンプルを濃縮し、修飾緩衝液（１００ｍＭリン酸水素二ナトリウム／リン酸二水素ナトリウム、ｐＨ８．０）に置換し、濃度を約２０ｍｇ／ｍＬにする。タンパク質とＰＥＧ修飾剤の質量比が１：２０であるようにＰＥＧを量り取り、常温で修飾反応を行う。２時間反応させた後、１Ｍのグリシンを加えて反応を停止させる。

二、精製方法
クロマトグラフィー条件：流動相Ａは２０ｍＭＰＢ＋２ＭＮａＣｌ（ｐＨ６．０）、流動相Ｂは２０ｍＭＰＢ（ｐＨ６．０）である。
サンプルローディング：前述の修飾サンプルを希釈した後、５ｍｌ／ｍｉｎでサンプルをロードし、疎水性クロマトグラフィーカラム（ＧＥ社製、ＰｈｅｎｙｌＰＨ）に結合させる。
平衡：サンプルローディングが終わった後、Ａ液で１５～２０カラム体積分洗浄する。
溶出：０～１００％Ｂ液で溶出し、溶出体積が１０カラム体積分で、メインピークのＶ‐ＰＥＧ‐ＳＣ‐２０ｋ‐ｒｈＩＬ‐２サンプルを収集する。
上記の条件で修飾サンプルを精製し、目的サンプルを作製した。

三、純度分析
上記のＰＥＧ化されたＩＬ‐２およびその変異体の修飾体に対するＳＥＣ‐ＨＰＬＣ測定の結果は下表に示される通りである。

ＳＥＣ（サイズ排除クロマトグラフィー）法は、試料分子のサイズに基づいて分子を分離するクロマトグラフィー技術である。本実施例で作製したＰＥＧ‐ＩＬ‐２サンプルは、ＳＥＣクロマトグラフィーで測定され、結果としてサンプルのメインピークが均一で、修飾程度が均一であることが示され、研究の需要を満たしている。

以降の各実施例において、特に説明がない限り、全て本実施例で作製したＶ‐ＰＥＧ‐ＳＣ‐２０ｋ‐ｒｈＩＬ‐２（または略してＰＥＧ‐ＳＣ‐２０ｋ‐ｒｈＩＬ‐２とする）を陽性対照として使用する。

実施例４ｂ：本発明が提供するほかのＰＥＧ修飾サンプルの作製
一、修飾方法
精製されたｒｈＩＬ‐２野生型／突然変異体タンパク質のサンプルを濃縮し、修飾緩衝液（１００ｍＭリン酸水素二ナトリウム／リン酸二水素ナトリウム、ｐＨ７．５）に置換し、濃度を約２～１５ｍｇ／ｍＬにする。下表に示される修飾反応比例に基づいてＰＥＧ（ＰＥＧの種類は、Ｖ‐ＰＥＧ‐ＳＳ‐２０ｋ、ｍＰＥＧ‐ＳＳ‐２０ｋ、ｍ‐ＰＥＧ‐ＳＳ‐１０ｋ、ｍＰＥＧ‐ＳＳ‐５ｋ、ｍＰＥＧ‐ＳＰＡ‐５Ｋを含むが、これらに限定されない）を量り取り、常温で修飾反応を行う。４時間反応させた後は、１Ｍのグリシンを加えて反応を停止させる。各修飾体の主要な反応パラメータは下表に示される通りである。

二、純化方法
クロマトグラフィー条件：流動相Ｂは２０ｍＭＮａＡｃ＋１ＭＮａＣｌ（ｐＨ４．０）、流動相Ａは２０ｍＭＮａＡｃ（ｐＨ４．０）である。
サンプルローディング：前述の修飾サンプルを希釈した後、５ｍｌ／ｍｉｎでサンプルをロードし、陽イオン交換クロマトグラフィーカラム（ＧＥ社製、ＨＰＳＰ）に結合させる。
平衡：サンプルローディングが終わった後、Ａ液で１５～２０カラム体積分洗浄する。
溶出：０～１００％Ｂ液で溶出し、溶出体積が１０カラム体積分で、メインピークのサンプルを収集する。
上記の条件で修飾サンプルを精製し、目的サンプルを作製した。

三、純度分析
各ＰＥＧ化されたＩＬ‐２およびその変異体の修飾体に対するＳＥＣ‐ＨＰＬＣ測定の結果は下表に示される通りである。

ＳＥＣ（サイズ排除クロマトグラフィー）法は、試料分子のサイズに基づいて分子を分離するクロマトグラフィー技術である。本実施例で作製した各ＰＥＧ‐ＩＬ‐２サンプルは、ＳＥＣクロマトグラフィーで測定され、結果としてサンプルのメインピークが均一で、修飾程度が均一であることが示され、研究の需要を満たしている。また、同種ＰＥＧの異なる修飾度のＰＥＧ‐ＩＬ‐２サンプル（例えば、ＧＰ８）は、保持時間に顕著な違いが見られる。本発明が確立したサンプル作製プロセスは、プロセス・パラメータの制御で修飾度の異なるサンプルを安定して作製できることを示した。具体的なサンプルのＰＥＧ結合数については、実施例５に示されている。

実施例５：ＰＥＧ修飾ＩＬ‐２のＰＥＧ結合数の測定（加水分解法）
一、実験方法
１．試液の調製
（１）ＰＥＧ標準グラデーション溶液：Ｖ‐ＰＥＧ‐ＳＣ‐２０ｋ、Ｖ‐ＰＥＧ‐ＳＳ‐２０ｋ、ｍＰＥＧ‐ＳＳ‐２０ｋ、ｍＰＥＧ‐ＳＳ‐１０ｋ、ｍＰＥＧ‐ＳＳ‐５ｋのＰＥＧ溶液（２．５ｍｇ／ｍＬ）をそれぞれ５μＬ、１０μＬ、２０μＬ、３０μＬ、４０μＬ、５０μＬ取って水に加え、最終体積が１００μＬのグラデーション溶液を調製し、均一に混合して、標準グラデーション溶液を得る。それぞれ２５μＬの５×非還元ＬｏｄｉｎｇＢｕｆｆｅｒを加え、均一に混合して、後で使用するためにおいておく。

（２）ヨウ素染色液：１７．５ｇのＢａＣｌ_２、６ｇのＫＩ、３．９ｇのＩ_２を正確に量り取り、５００ｍＬのダブル蒸留水に溶解し、光を避けて保存する。

（３）１０％過塩素酸溶液の調製：メスシリンダーで１００ｍＬの過塩素酸を量り取り、９００ｍＬの水に徐々に加え、均一に混合して、１０％過塩素酸溶液を得る。

２．ゲルの調製
１０％のポリアクリルアミド・ゲルの調製：１．６ｍＬのダブル蒸留水、１．８ｍＬの３０％ポリアクリルアミド溶液、１．３ｍＬの１．５ｍｏｌ／ＬＴｒｉｓ‐ＨＣｌｐＨ８．８、０．５３ｍＬの１％ＳＤＳ溶液、０．０３３ｍＬの１０％過硫酸アンモニウム溶液、および０．０３３ｍＬのＴＥＭＥＤをそれぞれ吸い取り、均一に混合して、分離ゲルとして作製する。
分離ゲルが凝固・成型した後、２．９ｍＬのダブル蒸留水、０．９ｍＬの３０％ポリアクリルアミド溶液、１．５ｍＬの１．５ｍｏｌ／ＬＴｒｉｓ‐ＨＣｌｐＨ６．８、０．６ｍＬの１％ＳＤＳ溶液、０．０４７ｍＬの１０％過硫酸アンモニウム溶液、および０．０４７ｍＬのＴＥＭＥＤをそれぞれ吸い取り、均一に混合して濃縮ゲルとして作製する。

３．サンプル作製
加水分解：タンパク質含有量既知の供試品溶液を１００μＬ取り、２００μＬの１００ｍＭＮａＨＣＯ₃ ｐＨ９．０の活性化緩衝液を加え、３７℃の水浴で２４時間加水分解する（その中で、ｍＰＥＧ‐ＳＰＡ‐５ｋ‐ｒｈＩＬ‐２は自発的に加水分解しないため、サンプルを高温処理後にトリプシンでインキュベートする）。その後、サンプルを取り出し、５×非還元ＬｏｄｉｎｇＢｕｆｆｅｒに加え、均一に混合して、後で使用するためにおいておく。

４．電気泳動による検出
動作電圧：８０Ｖで３０分間実行し、ブロモフェノール・ブルー・インジケーターが濃縮ゲルの下部に移行したら１２０Ｖに切り替え、ブロモフェノール・ブルー・インジケーターの移行が分離ゲルの底部の端に達すると終了する。
ヨウ素液による染色：電気泳動終了後、ガラスプレートをこじ開け、フィルムに印をつけて、染色ボックスに置き、まず１０％過塩素酸溶液で１０分間固定し、その後１０％過塩素酸を回収し、水で３回洗浄する。次に、ヨウ素染色液でフィルムを覆い、２～３分間染色する。１分間程度で発色する。発色すると、直ちに水で脱色する。

５．ゲル・イメージングとデータ処理
脱色してはっきりしているゲルをゲル・イメージング装置に置き、ゲル・イメージングを行う。ソフトウェアＱｕａｎｔｉｔｙＯｎｅ４．４．０を用いて定量処理機能を実行する。標準品のＰＥＧ含有量およびフィルムのスポットのグレースケールに対する線形回帰を行い、サンプル中の遊離ＰＥＧの総量を求める。結果は以下の式を用いて計算する。
ＰＥＧ結合数＝ＰＥＧモル数/タンパク質モル数

二、実験結果
各修飾産物のｉｎｖｉｔｒｏでのＰＥＧ結合数解析の結果を下表に示す。

実施例６：ＰＥＧ修飾ＩＬ‐２のｉｎｖｉｔｒｏでの徐放性能の測定
一、実験方法
１、前処理の方法は実施例５を参照する。その中で加水分解操作の具体的な手順は以下の通りである。タンパク質含有量既知の供試品溶液を１００μＬ取り、２００μＬの１００ｍＭＮａＨＣＯ_３ｐＨ９．０活性化緩衝液を加え、３７℃の水浴で加水分解を行う。異なる時点（例えば、加水分解開始後８時間、１６時間、２４時間）で、加水分解サンプルからそれぞれ１００μＬを取り、一定の倍率で希釈した後、５×非還元ＬｏｄｉｎｇＢｕｆｆｅｒを加え、均一に混合し、後で使用するためにおいておく。
２、サンプルの測定および計算方法は実施例５と同様である。

二、実験結果
各修飾産物のｉｎｖｉｔｒｏでのＰＥＧ徐放性能の分析結果を下表に示す。

三、結果分析
本実施例で示されたのは、ｉｎｖｉｔｒｏ３７℃で、活性化緩衝液（１００ｍＭＮａＨＣＯ_３ｐＨ９．０）における測定結果である。上記異なる構造（直鎖型または分岐型）、異なる分子量（５Ｋ、１０Ｋ、２０Ｋ）の複数種類のＰＥＧ‐ＳＳで修飾されたＩＬ‐２またはその突然変異体は、ｉｎｖｉｔｒｏですべて優れた徐放性能を示している。陽性参照品も理想的なｉｎｖｉｔｒｏ徐放性能を示している。しかし、他の非ＰＥＧ‐ＳＳ構造の通常のＰＥＧタイプ、例えばＳＰＡ‐ＰＥＧは、さらなる基団（例えば、陽性参照品のフルオレン環構造など）を導入しない限り、ＰＥＧの脱落が実現できないため、徐放という技術的効果が達成できない。異なる分子量、異なる修飾度の分子は、ｉｎｖｉｔｒｏで異なる放出速度を示したが、放出された活性タンパク質構造がなお薬効作用を発揮するかどうかは、体内外の活性評価によるさらなる検証が必要とする。

実施例７：ＰＥＧ修飾ＩＬ‐２がＣＴＬＬ‐２細胞増殖を刺激する活性の測定
一、実験方法
ＰＥＧ修飾によるタンパク質活性中心の遮蔽効果により、修飾後のタンパク質はｉｎｖｉｔｒｏでの生物学的活性がある程度低下する。そのため、サンプルを事前に活性化処理することが必要である。活性化処理後、活性化状態にある修飾物のｉｎｖｉｔｒｏでの生物学的活性を評価するために、その細胞依存株であるＣＴＬＬ‐２細胞の増殖速度を異なる濃度で測定する方法を用いた。

１．サンプル作製
サンプル活性化：タンパク質含有量既知の供試品溶液を１００μＬ取り、それぞれに２００μＬの１００ｍＭＮａＨＣＯ_３ｐＨ９．０または３００μＬの１００％ヒト血清を加え、３７℃の水浴で一定時間インキュベートする。定時的に加水分解サンプルからそれぞれ１００μＬを取り、均一に混合し、後で使用するためにおいておく。サンプルを適切な初期濃度に希釈し、９６ウェル細胞培養プレートにおいて、２倍系列希釈を行い、合計８段階の希釈度を作成する。各希釈度のサンプルを２ウェルに添加する。各ウェルに５０μＬの溶液を残し、余分な溶液を捨てる。以上の操作は無菌条件下で行う。
２．試験溶液の調製及び細胞培養は実施例３と同様である。

二、実験結果
１．１００ｍＭＮａＨＣＯ３ｐＨ９．０条件下で活性化した各ポリエチレングリコール修飾体の活性化産物がＣＴＬＬ‐２細胞の増殖を刺激する活性の結果は、図２および下表に示されている（相対生物学的活性の計算は、ＰＥＧ修飾に使用した原タンパク質の活性値を１００％の基準とする）。

三、結果分析
表９から下記のことが分かる。ＰＥＧ‐ＳＳ修飾体は、参照品であるＶ‐ＰＥＧ‐ＳＣ‐２０ｋ‐ｒｈＩＬ‐２と同様に、活性化されていない状態（活性化０ｈ）では、表面の受容体結合部位がＰＥＧに完全に遮蔽されるため、生物学的活性を示さない。つまり、ＰＥＧが脱落していない場合、生物学的活性がない（検出不可）。一方、Ｉｎｖｉｔｒｏのアルカリ条件下でそれぞれ異なる時間活性化された後は、すべてＣＴＬＬ‐２細胞の増殖を顕著に促進する生物学的活性を示した。さらに、ＰＥＧ‐ＳＳ修飾体は、活性化時間が長くなるにつれて生物学的活性が徐々に回復して向上する傾向を示した。特定の修飾度のｍＰＥＧ‐ＳＳ‐２０ｋ‐ＧＰ８およびｍＰＥＧ‐ＳＳ‐２０ｋ‐ＧＰ１２は、サンプリング時点での生物学的活性がともにＶ‐ＰＥＧ‐ＳＣ‐２０ｋ‐ｒｈＩＬ‐２より高く、ＰＥＧの脱落挙動が相似している場合、修飾度を調整することで、より優れた活性放出効果が得られる。

なお、異なる分子量のＰＥＧで異なる修飾度に修飾することによって、異なる活性放出効果が得られる。これのことはまた、ＰＥＧ‐ＳＳ分子で修飾されたＩＬ‐２の持つ制御可能な徐放性能の基礎となる。即ち、修飾するＰＥＧ‐ＳＳの分子量を調整し、修飾するＰＥＧの数を制御し、ＰＥＧ‐ＩＬ２の体内での至適な放出曲線を追い求めることによって、エフェクター分子の体内でのバイオアベイラビリティを最適化させることができる。それによって、従来技術よりも優れた薬効を持つ候補分子を得ることができる。

実施例８：構造の異なるＰＥＧで修飾されたＩＬ‐２によるＣＴＬＬ‐２細胞のｐＳＴＡＴ５活性の測定
一、実験方法
ＣＴＬＬ‐２細胞を完全培地（ＲＰＭＩ１６４０培地＋２ｍＭＬ‐グルタミン＋１ｍＭピルビン酸ナトリウム＋１０％ウシ胎児血清＋１０％Ｔ‐ＳＴＩＭ、培養物にコンカナバリンＡを添加）で、３７℃、５％ＣＯ_２条件下で、２×１０^５個／ｍＬの密度になるまで培養する。その後、ＰＢＳＡ（ＰＢＳ、ｐＨ７．２、１％ＢＳＡ）で１回洗浄し、細胞密度を１×１０^６個／ｍＬに調整する。５００μＬ／チューブの体積でフローサイトメトリー・チューブに分注し、基礎培養液（ＲＰＭＩ１６４０＋２ｍＭＬ‐グルタミン＋１ｍＭピルビン酸ナトリウム＋１０％ウシ胎児血清）で調製した異なる濃度のＰＥＧ修飾ＩＬ‐２を加える。室温で２０分間インキュベート後、直ちに最終濃度が１．５％となるようにパラフォルムアルデヒドを加え、均一にボルテックス・ミキシングして、室温で１０分間インキュベートする。その後、１ｍＬのＰＢＳを加え、４℃、１４００ｒｐｍで５分間遠心分離してパラフォルムアルデヒドを除去する。細胞を再懸濁し、４℃で予め冷却した１００％メタノールを１ｍＬ加え、均一にボルテックス・ミキシングして、４℃で２０分間インキュベートする。次に、３ｍＬのＰＢＳＡ緩衝液を加え、４℃、１４００ｒｐｍで５分間遠心分離して、細胞を２回洗浄する。その後、Ａｎｔｉ‐Ｓｔａｔ５（ｐＹ６９４）‐Ａｌｅｘａ６４７（ＢＤ，Ｃａｔ＃６１２５９９）を加え、室温で遮光して３０分間インキュベートする。最後に、３ｍＬのＰＢＳＡを加え２回洗浄し、ＢＤＡｃｃｕｒｉＴＭＣ６にて測定する。

二、実験結果
測定結果は図３に示されており、結果は以下のことを示している。ｉｎｖｉｔｒｏでのｐＳＴＡＴ５活性化レベルの測定結果において、Ｖ‐ＰＥＧ‐ＳＣ‐２０ｋ‐ｒｈＩＬ‐２およびｍＰＥＧ‐ＳＳ‐２０ｋ‐ＧＰ８（本実施例では上述のｍＰＥＧ‐ＳＳ‐２０ｋ‐ＧＰ８‐中修飾度を指す）と比較して、ｍＰＥＧ‐ＳＳ‐１０ｋ‐ＧＰ８は血清中で活性化後、リン酸化活性化レベルの増加曲線に顕著な差異が見られ、リン酸化レベルの上昇は相対的に緩やかで、徐々に増加する傾向を示した。７２時間後には、３つのサンプルによるリン酸化活性化レベルはほぼ同等になった。これは、ｉｎｖｉｔｒｏでＰＥＧの脱落による活性タンパク質の放出の傾向と非常に一致している。

三、結果分析
ＩＬ‐２は、どの種類の細胞上のＩＬ‐２Ｒと結合しても、ＪＡＫ‐ＳＴＡＴ経路を介して生物学的機能を発揮する。ＩＬ‐２Ｒβの結合によるＪＡＫ１経路と、ＩＬ‐２Ｒγの結合によるＪＡＫ３経路はそれぞれ、ＩＬ‐２Ｒのβおよびγサブユニット上の重要なチロシン残基のリン酸化を引き起こし、これによって他のシグナル分子のアンカー部位が生成される。したがって、ＣＴＬＬ‐２細胞のリン酸化レベルの変動を異なる濃度のＰＥＧ修飾ＩＬ‐２の作用下で測定することによって、ＩＬ‐２およびその修飾体のｉｎｖｉｔｒｏでの生物学的活性を評価することができる。

したがって、上記の実験結果から、血清中におけるＰＥＧ‐ＳＳの放出速度がｐＳＴＡＴ５の活性化およびＣＴＬＬ‐２増殖促進活性の放出速度に直接影響することが分かった。この構造のＰＥＧは、ＩＬ‐２突然変異体を体内で徐々に放出させる。それによって免疫活性化の程度を調節する性能をもたらす。

実施例９：ＰＥＧで修飾されたＩＬ－２の異なる変異体によるＣＴＬＬ‐２細胞のｐＳＴＡＴ５活性の測定
一、実験方法
実施例８と同じである。

二、実験結果
測定結果は図４に示されており、結果は以下のことを示している。ｉｎｖｉｔｒｏでのｐＳＴＡＴ５活性化レベルの測定結果において、ｍＰＥＧ‐ＳＳ‐２０ｋ‐ＧＰ１とｍＰＥＧ‐ＳＳ‐２０ｋ‐ＧＰ８（本実施例では上述のｍＰＥＧ‐ＳＳ‐２０ｋ‐ＧＰ８‐中修飾度を指す）が緩衝液中で活性化後に、そのリン酸化活性化レベルの傾向が似ており、時間が経過するにつれて徐々に活性化する特徴を呈し、ピークに達した後も持続的に活性を維持していた。

三、結果分析
上記の実験結果から、本発明のＰＥＧ‐ＳＳ修飾ＩＬ‐２の異なる突然変異体（例えば、ＧＰ１、ＧＰ８など）は、体内において傾向の同じようなリン酸化活性化レベルを有することが分かる。

実施例１０：ＰＥＧ修飾ＩＬ‐２突然変異体のｉｎｖｉｖｏでの半減期延長効果と修飾産物の活性放出の比較
一、実験方法
実験一：０．５ｍｇ／ｋｇ、０．１ｍｇ／ｋｇ、および０．０４ｍｇ／ｋｇのｍＰＥＧ‐ＳＳ‐５ｋ‐ＧＰ８‐高修飾度と１ｍｇ／ｋｇの突然変異体ＧＰ８を、それぞれＳＤラットの体内に静脈注射で投与する。投与前および投与後０．２５時間、１時間、２時間、４時間、８時間、２４時間、４８時間、７２時間、９６時間に血清を採取し、２種類のＥＬＩＳＡ測定法でそれぞれの血清中のｍＰＥＧ‐ＳＳ‐５ｋ‐ＧＰ８‐高修飾度および突然変異体ＧＰ８の含有量を測定する。

実験二：１ｍｇ／ｋｇのｍＰＥＧ‐ＳＳ‐５ｋ‐ＧＰ８‐高修飾度と陽性参照品Ｖ‐ＰＥＧ‐ＳＣ‐２０ｋ‐ｒｈＩＬ‐２を、それぞれＳＤラットの体内に静脈注射で投与する。投与前および投与後０．２５時間、１時間、２時間、４時間、８時間、２４時間、４８時間、７２時間、９６時間に血清を採取し、ＣＴＬＬ‐２細胞／ＭＴＴ比色法で各時間点の活性を測定した。単位はＩＵ／ｍｌである。

二、実験結果
実験一：測定結果は図５に示されている。測定結果は、突然変異体ＧＰ８の原タンパク質に比べて、ｍＰＥＧ‐ＳＳ‐５ｋ‐ＧＰ８‐高修飾度は薬物の半減期を著しく延長できることを示している。

実験二：測定結果に基づいて薬物濃度－時間曲線を描いた。同じ投与量と同じ投与方法では、ｍＰＥＧ‐ＳＳ‐５ｋ‐ＧＰ８‐高修飾度は、陽性参照品であるＶ‐ＰＥＧ‐ＳＣ‐２０ｋ‐ｒｈＩＬ‐２よりも高いＡＵＣ（５６８３８０９ｈ．ＩＵ／ｍｌｖｓ２３４４７３０ｈ．ＩＵ／ｍｌ）を示したこと（ＧｒａｐｈＰａｄＰｒｉｓｍ７．００で計算）が、研究を通して示された。したがって、ｍＰＥＧ‐ＳＳ‐５ｋ‐ＧＰ８‐高修飾度は陽性参照品（Ｖ‐ＰＥＧ‐ＳＣ‐２０ｋ‐ｒｈＩＬ‐２）よりも高いバイオアベイラビリティを有することが分かった。

実施例１１：ＣＴ２６．ＷＴネズミ由来結腸癌細胞ＢＡＬＢ／ｃマウス皮下移植モデルにおける、異なる構造のＰＥＧ－ＳＳ（直鎖型または分岐型）で修飾されたＩＬ－２の薬効評価
一、実験方法
ＣＴ２６．ＷＴ細胞は、１０％ウシ胎児血清を含む１６４０培養液中で培養する。指数増殖期にあるＣＴ２６．ＷＴ細胞を収集し、ＰＢＳで適切な濃度に再懸濁する。５×１０^５ｃｅｌｌｓ／０．１ｍＬのＣＴ２６．ＷＴ細胞懸濁液を十分に混合した後、ＢＡＬＢ／ｃマウスの右背中の皮下に接種する。各マウスには０．１ｍＬを接種する。腫瘍の体積が平均で約１００ｍｍ^３に達した後、腫瘍体積に基づいて群分けを行う。群分けの当日に初回の投薬を開始する（本実験では腫瘍細胞接種後９日目と１６日目にそれぞれ一回の投薬を行う）。詳細な投与プロトコルと投与経路は下表に示される。

一般的臨床観察：検疫期間及び実験期間中は、腫瘍の成長及び治療が動物の正常行動に及ぼした影響の観察を含み、少なくとも一日一回観察する。具体的には、動物（担癌）の死亡あるいは瀕死、精神状態、行為活動及びその他の異常状況などの内容が含まれる。
体重：毎週２～３回測定する。

腫瘍体積：毎週２～３回測定する。ノギスで腫瘍の長径と短径をそれぞれ量る。

腫瘍体積（ｍｍ^３）＝長径＊短径^２／２。相対的腫瘍抑制率：ＴＧＩ（％）＝（１‐Ｔ／Ｃ）×１００％。一般に、Ｔは投与群のある時点での相対的腫瘍体積（その時点で測定した腫瘍体積と群分け時の腫瘍体積の比の値）を表し、Ｃはモデル群のある時点での相対的腫瘍体積（その時点で測定した腫瘍体積と群分け時の腫瘍体積の比の値）を表す。ところが、本発明は実験の接種当日に体重に基づいて群分けを行うので、ＴＧＩの計算において、Ｔ、Ｃはそれぞれその時点で実際に測定した投与群、モデル群の腫瘍体積を表す。

腫瘍重量：最終回の測定終了後、実験動物を安楽死させ、腫瘍塊を剥離し、生理食塩水で洗い流して、濾紙で水分を吸って乾かし、腫瘍塊の重量を量り、写真を撮る。
相対的腫瘍抑制率ＴＧＩ（％）＝（１－Ｔ_ＴＷ／Ｃ_ＴＷ）×１００％、Ｔ_ＴＷは実験終了時の治療群の平均腫瘍重量を表し、Ｃ_ＴＷは実験終了時のモデル群の平均腫瘍重量を表す。

二、実験結果
１、薬効
細胞接種後２０日目のモデル群の動物の平均腫瘍体積は１３９７．４８±２８９．６７ｍｍ^３であった。

細胞接種後２０日目のｍＰＥＧ‐ＳＳ‐２０ｋ‐ＧＰ１（２ｍｇ／ｋｇ）群およびｍＰＥＧ‐ＳＳ‐２０ｋ‐ＧＰ８（２ｍｇ／ｋｇ）群（本実施例では上述のｍＰＥＧ‐ＳＳ‐２０ｋ‐ＧＰ８‐中修飾度を指す）の平均腫瘍体積は、それぞれ２８２．３１±１０３．０２ｍｍ^３、１３３．９３±１０５．６９ｍｍ^３であり、モデル群と比較して有意な差があった（Ｐ＜０．０１）。相対的腫瘍抑制率ＴＧＩ（％）はそれぞれ７９％、９２％であった。

細胞接種後２０日目のＶ‐ＰＥＧ‐ＳＳ‐２０ｋ‐ＧＰ１（２ｍｇ／ｋｇ）群およびＶ‐ＰＥＧ‐ＳＳ‐２０ｋ‐ＧＰ８（２ｍｇ／ｋｇ）群の平均腫瘍体積は、それぞれ９４２．４４±２０９．６６ｍｍ^３、１０３７．６７±３３２．９７ｍｍ^３であり、モデル群と比較して有意な差がなかった。相対的腫瘍抑制率ＴＧＩ（％）はそれぞれ２６％、２９％であった。

細胞接種後２０日目の陽性参照であるＶ‐ＰＥＧ‐ＳＣ‐２０ｋ‐ｒｈＩＬ‐２群（２ｍｇ／ｋｇ）（後の実施例で特に明記しない限り、陽性参照は全てＶ‐ＰＥＧ‐ＳＣ‐２０ｋ‐ｒｈＩＬ‐２を使用し、略称はＰＥＧ‐ＳＣ‐２０ｋ‐ｒｈＩＬ‐２である）の平均腫瘍体積は、２１１．２３±８６．０２ｍｍ^３であり、モデル群と比較して有意な差があった（Ｐ＜０．０１）。相対的腫瘍抑制率ＴＧＩ（％）は８４％であった。

腫瘍重量の分析結果は腫瘍体積の分析結果とほぼ合致している。具体的な実験結果は下表および図６に示されている。

２、安全性
ＰＥＧ‐ＳＳ修飾体群の動物は、投与期間中における体重減少が１０％未満であり、実験後期には体重が若干回復したが、モデル群と比較して有意な差がなかった（Ｄ１３、Ｄ１６、Ｄ１８、Ｄ２０）。

陽性参照群では、２回目の投与後２日目（Ｄ１８）に６匹中１匹の動物が中等度の体重減少（１０％＜体重減少≦２０％）を示した。また、陽性参照群の動物は実験後期に体重が若干回復したが、モデル群と比較して有意な差があった。

三、結果分析
直鎖型ＰＥＧの修飾産物であるｍＰＥＧ‐ＳＳ‐２０ｋ‐ＧＰ１およびｍＰＥＧ‐ＳＳ‐２０ｋ‐ＧＰ８は、２ｍｇ／ｋｇの投与量で、ＣＴ２６．ＷＴネズミ由来結腸癌モデルに対して顕著な腫瘍成長抑制効果を示し、その抑制率は陽性参照品と同等かそれ以上であった。一方、分岐型ＰＥＧの修飾産物であるＶ‐ＰＥＧ‐ＳＳ‐２０ｋ‐ＧＰ１およびＶ‐ＰＥＧ‐ＳＳ‐２０ｋ‐ＧＰ８は、２ｍｇ／ｋｇの投与量でＣＴ２６．ＷＴネズミ由来結腸癌モデルに対して腫瘍成長抑制効果を示さなかった。

今回の薬効評価期間中、各群の動物は２ｍｇ／ｋｇの投与量で良好な忍容性を示した。治療効果を示した群において、直鎖型ＰＥＧ‐ＳＳの修飾産物群および陽性参照群は投与中期にすべて体重減少があったが、２回目投与後および回復期には、直鎖型ＰＥＧ‐ＳＳ修飾産物群の動物は陽性参照群より状態回復および体重回復が顕著に良好であった。

本実施例において、研究者を驚かせたのは、同じ分子量でありながら、直鎖型ｍＰＥＧ‐ＳＳ‐２０ｋの修飾産物と分岐型Ｖ‐ＰＥＧ‐ＳＳ‐２０ｋの修飾産物がｉｎｖｉｖｏ実験でかなりの差異を示した。つまり、分岐型ＰＥＧ‐ＳＳ修飾産物のｉｎｖｉｖｏでの薬効は直鎖型ＰＥＧ‐ＳＳ修飾産物に比べて、はるかに低かったのでる。したがって、発明者は、ＩＬ‐２類のタンパク質薬物を腫瘍免疫アゴニストとして開発するに当たって直鎖型ｍＰＥＧ‐ＳＳを使用することを確認した。

実施例１２：Ｂ１６‐Ｆ１０ネズミ由来黒色腫細胞Ｃ５７ＢＬ／６マウス皮下移植モデルにおける、直鎖型ＰＥＧ－ＳＳで修飾されたＩＬ－２の異なる突然変異体の薬効評価
一、実験方法
Ｂ１６‐Ｆ１０細胞は、１０％ウシ胎児血清を含むＤＭＥＭ培養液中で培養する。指数増殖期にあるＢ１６‐Ｆ１０細胞を収集し、ＰＢＳで適切な濃度に再懸濁する。５×１０^５ｃｅｌｌｓ／０．１ｍＬのＢ１６‐Ｆ１０細胞懸濁液を十分に混合した後、Ｃ５７ＢＬ／６マウスの右背中の皮下に接種する。各マウスには０．１ｍＬを接種する。腫瘍の体積が平均で約１００ｍｍ^３に達した後、腫瘍体積に基づいて群分けを行う。群分けの当日に初回の投薬を開始する（Ｄ７に一回の投薬を行う）。詳細な投与プロトコルと投与経路は下表に示される。一般的臨床観察などは実施例１１と同じである。

二、実験結果
１、薬効
実験結果は下表および図７に示されている。

２、安全性
Ｖ‐ＰＥＧ‐ＳＣ‐２０ｋ‐ｒｈＩＬ‐２群の動物の体重変化率はＤ１１時点で（Ｄ１１時点で各群の動物は全て生存している）モデル群と比較して有意に低下した。直鎖型ＰＥＧ‐ＳＳで修飾された異なる変異体の産物であるｍＰＥＧ‐ＳＳ‐２０ｋ‐ＧＰ１、ｍＰＥＧ‐ＳＳ‐２０ｋ‐ＧＰ１３、ｍＰＥＧ‐ＳＳ‐２０ｋ‐ＧＰ２１、ｍＰＥＧ‐ＳＳ‐２０ｋ‐ＧＰ２２の各群の動物はＤ１１時点で、体重減少がモデル群と比較して統計的な差がなかったが、Ｖ‐ＰＥＧ‐ＳＣ‐２０ｋ‐ｒｈＩＬ‐２群と比較して統計的な差があった。このことは、直鎖型ＰＥＧ‐ＳＳで修飾された異なる突然変異体の産物（例えば、ｍＰＥＧ‐ＳＳ‐２０ｋ‐ＧＰ１、ｍＰＥＧ‐ＳＳ‐２０ｋ‐ＧＰ１３、ｍＰＥＧ‐ＳＳ‐２０ｋ‐ＧＰ２１、ｍＰＥＧ‐ＳＳ‐２０ｋ‐ＧＰ２２など）が動物の体重に対する影響がＶ‐ＰＥＧ‐ＳＣ‐２０ｋ‐ｒｈＩＬ‐２よりも小さいことを示している。

三、結果分析
直鎖型ＰＥＧで修飾された異なる突然変異体の産物であるｍＰＥＧ‐ＳＳ‐２０ｋ‐ＧＰ１、ｍＰＥＧ‐ＳＳ‐２０ｋ‐ＧＰ１３、ｍＰＥＧ‐ＳＳ‐２０ｋ‐ＧＰ２１、ｍＰＥＧ‐ＳＳ‐２０ｋ‐ＧＰ２２は、１ｍｇ／ｋｇの投与量でＢ１６‐Ｆ１０ネズミ由来黒色腫モデルに対して顕著な腫瘍成長抑制効果を示し、その抑制率は陽性参照品に近いのであった。また、上記の供試品は動物の体重に対する影響がＶ‐ＰＥＧ‐ＳＣ‐２０ｋ‐ｒｈＩＬ‐２よりも小さいのであった。

実施例１３：Ｂ１６‐Ｆ１０ネズミ由来黒色腫腫瘍モデルにおける、直鎖型ＰＥＧ－ＳＳで修飾されたＩＬ－２突然変異体の異なる修飾度の産物の薬効評価
一、実験方法
実験方法、一般的臨床観察などは実施例１１と同じである。詳細な投与プロトコルと投与経路は下表に示される。

二、実験結果
１、薬効
細胞接種後１７日目のモデル群の動物の平均腫瘍体積は２６１４．９７±３７２．７７ｍｍ^３であった。

細胞接種後１７日目のｍＰＥＧ‐ＳＳ‐２０ｋ‐ＧＰ８（高修飾度）群、ｍＰＥＧ‐ＳＳ‐２０ｋ‐ＧＰ８（中修飾度）群、ｍＰＥＧ‐ＳＳ‐５ｋ‐ＧＰ８（高修飾度）群、ｍＰＥＧ‐ＳＳ‐５ｋ‐ＧＰ８（中修飾度）群、ｍＰＥＧ‐ＳＳ‐５ｋ‐ＧＰ８（低修飾度）群の平均腫瘍体積はそれぞれ、５５０．２５±１００．２３ｍｍ^３、５４４．９０±８９．１２ｍｍ^３、５７４．０２±１０８．１５ｍｍ^３、６７６．１７±１２８．２３ｍｍ^３、５７０．４５±１０７．２５ｍｍ^３であり、モデル群と比較して有意な差があった（Ｐ＜０．０１またはＰ＜０．０５）。相対的腫瘍抑制率ＴＧＩ（％）はそれぞれ７７％、８０％、７９％、７５％、７９％であった。

細胞接種後１７日目のＰＥＧ‐ＳＣ‐２０ｋ‐ｒｈＩＬ‐２群の平均腫瘍体積は１２１５．１９±１８４．７０ｍｍ^３であり、モデル群と比較して有意な差があった（Ｐ＜０．０５）。相対的腫瘍抑制率ＴＧＩ（％）は５７％であった。

腫瘍重量の分析結果は腫瘍体積の分析結果とほぼ合致している。具体的な実験結果は下表および図８に示されている。

２、安全性
ｍＰＥＧ‐ＳＳ‐２０ｋ‐ＧＰ８（高修飾度）群では、初回投与後４日目（細胞接種後１１日目）に６匹中１匹の動物が中等度の体重減少（１０％＜体重減少≦２０％）を示した。初回投与後７日目（細胞接種後１４日目）には、６匹中２匹の動物が中等度の体重減少（１０％＜体重減少≦２０％）を示し、６匹中３匹の動物が死亡した。初回投与後９日目（細胞接種後１６日目）には、なお６匹中１匹の動物が中等度の体重減少（１０％＜体重減少≦２０％）を示し、６匹中１匹の動物が死亡した。実験終了の際には、生き残りの６匹中２匹の動物に体重の回復傾向が見られた。この群では半数以上の動物が死亡し、その死亡原因は供試品に関連していると推測される。

ｍＰＥＧ‐ＳＳ‐２０ｋ‐ＧＰ８（中修飾度）群では、初回投与後４日目（細胞接種後１１日目）に６匹中２匹の動物が中等度の体重減少（１０％＜体重減少≦２０％）を示した。初回投与後７日目（細胞接種後１４日目）には、６匹中４匹の動物が中等度の体重減少（１０％＜体重減少≦２０％）を示し、６匹中２匹の動物が重度の体重減少（体重減少＞２０％）を示した。初回投与後９日目（細胞接種後第１６日目）には、なお６匹中１匹の動物が中等度の体重減少（１０％＜体重減少≦２０％）を示し、６匹中１匹の動物が重度の体重減少（体重減少＞２０％）を示し、６匹中１匹の動物が死亡した。実験終了の際には、生き残りの６匹中５匹の動物のうち、４匹の動物に体重の回復傾向が見られ、１匹の動物は体重が回復しなかった。この群では中等度から重度の体重減少および１匹の動物の死亡が発生した。これは供試品に関連していると推測される。

ｍＰＥＧ‐ＳＳ‐５ｋ‐ＧＰ８（高修飾度）群では、初回投与後４日目（細胞接種後１１日目）に６匹中１匹の動物が中等度の体重減少（１０％＜体重減少≦２０％）を示した。初回投与後７日目（細胞接種後１４日目）には、６匹中１匹の動物が中等度の体重減少（１０％＜体重減少≦２０％）を示した。実験終了の際には、動物に体重回復の傾向が見られた。

ｍＰＥＧ‐ＳＳ‐５ｋ‐ＧＰ８（中修飾度）群では、投与期間中の体重に顕著な変化がなかった。

ｍＰＥＧ‐ＳＳ‐５ｋ‐ＧＰ８（低修飾度）群では、初回投与後４日目（細胞接種後１１日目）に６匹中１匹の動物が中等度の体重減少（１０％＜体重減少≦２０％）を示した。実験終了の際には、動物に体重回復の傾向が見られた。

ＰＥＧ‐ＳＣ‐２０ｋ‐ｒｈＩＬ‐２群では、初回投与後４日目（細胞接種後第１１日目）に６匹中１匹の動物が中等度の体重減少（１０％＜体重減少≦２０％）を示し、実験終了の際に、動物に体重回復の傾向が見られた。初回投与後７日目（細胞接種後１４日目）には、６匹中３匹の動物が死亡した。この群では動物の半数が死亡し、死亡原因は供試品に関連していると推測される。

モデル群では、初回投与後７日目（細胞接種後第１４日目）に６匹中１匹の動物が中等度の体重減少（１０％＜体重減少≦２０％）を示し、実験終了の際に、体重回復の傾向が見られた。具体的な結果は下表および図８ｃに示されている。

三、結果分析
供試品ｍＰＥＧ‐ＳＳ‐２０ｋ‐ＧＰ８（高修飾度）、ｍＰＥＧ‐ＳＳ‐２０ｋ‐ＧＰ８（中修飾度）、ｍＰＥＧ‐ＳＳ‐５ｋ‐ＧＰ８（高修飾度）、ｍＰＥＧ‐ＳＳ‐５ｋ‐ＧＰ８（中修飾度）、ｍＰＥＧ‐ＳＳ‐５ｋ‐ＧＰ８（低修飾度）は、２ｍｇ／ｋｇの投与量でＢ１６‐Ｆ１０ネズミ由来黒色腫モデルに対してすべて腫瘍成長を抑制する効果があり、その効果はＶ‐ＰＥＧ‐ＳＣ‐２０ｋ‐ｒｈＩＬ‐２より優れている。
治療期間中、ｍＰＥＧ‐ＳＳ‐２０ｋ‐ＧＰ８（高修飾度）およびｍＰＥＧ‐ＳＳ‐２０ｋ‐ＧＰ８（中修飾度）群の動物は、２ｍｇ／ｋｇの投与量に対して忍容性がよくなかった。一方、ｍＰＥＧ‐ＳＳ‐５ｋ‐ＧＰ８（高修飾度）群およびｍＰＥＧ‐ＳＳ‐５ｋ‐ＧＰ８（低修飾度）群の動物は２ｍｇ／ｋｇの投与量に対しておおむね忍容であった。ｍＰＥＧ‐ＳＳ‐５ｋ‐ＧＰ８（中修飾度）群の動物は２ｍｇ／ｋｇの投与量に対して良好な忍容性を示した。
本実施例により、異なる修飾度の産物が体内で異なる薬効と安全性を示すことが初歩的に証明された。この結果は、実施例７でｉｎｖｉｔｒｏ実験に基づいた「異なる修飾度の産物が異なる性能を持つ」という予測と合致している。したがって、発明者はさらに他の異なるモデルにおける薬効の比較研究を進めた

実施例１４：ＣＴ２６．ＷＴネズミ由来結腸癌腫瘍モデルにおける、直鎖型ＰＥＧ－ＳＳで修飾されたＩＬ－２突然変異体の異なる修飾度の産物の薬効評価
一、実験方法
実験方法、一般的臨床観察などは実施例１１と同じである。詳細な投与プロトコルと投与経路は下表に示される。

二、実験結果
１、薬効
細胞接種後２２日目のモデル群の動物の平均腫瘍体積は１，８８６．６７±３４１．３３ｍｍ^３であった。

細胞接種後２２日目のｍＰＥＧ‐ＳＳ‐２０ｋ‐ＧＰ８（高修飾度）群、ｍＰＥＧ‐ＳＳ‐２０ｋ‐ＧＰ８（中修飾度）群、ｍＰＥＧ‐ＳＳ‐５ｋ‐ＧＰ８（高修飾度）群、ｍＰＥＧ‐ＳＳ‐５ｋ‐ＧＰ８（中修飾度）群、ｍＰＥＧ‐ＳＳ‐５ｋ‐ＧＰ８（低修飾度）群の平均腫瘍体積はそれぞれ、２６８．１５±１６３．５４ｍｍ^３、１３２．０７±１３２．０７ｍｍ^３、５６．９０±３６．２１ｍｍ^３、４２９．１２±２６１．８８ｍｍ^３、８７．７８±８７．７８ｍｍ^３であり、モデル群と比較して有意な差があった（Ｐ＜０．０１）。相対的腫瘍抑制率ＴＧＩ（％）はそれぞれ８８％、９０％、９７％、８０％、９５％であった。

細胞接種後２２日目のＰＥＧ‐ＳＣ‐２０ｋ‐ｒｈＩＬ‐２群の平均腫瘍体積は１６３．１３±７３．０３ｍｍ^３であり、モデル群と比較して有意な差があった（Ｐ＜０．０１）。相対的腫瘍抑制率ＴＧＩ（％）は９２％であった。

腫瘍重量の分析結果は腫瘍体積の分析結果とほぼ合致している。具体的な実験結果は下表および図９に示されている。

２、安全性
ｍＰＥＧ‐ＳＳ‐２０ｋ‐ＧＰ８（高修飾度）群では、初回投与後５日目に６匹中３匹の動物が中等度の体重減少（１０％＜体重減少≦２０％）を示し、６匹中１匹の動物が死亡した。２回目の投与後２日目には、６匹中２匹の動物が中等度の体重減少（１０％＜体重減少≦２０％）を示し、実験終了の際には、体重回復の傾向が見られた。

ｍＰＥＧ‐ＳＳ‐２０ｋ‐ＧＰ８（中修飾度）群では、初回投与後５日目に６匹中３匹の動物が中等度の体重減少（１０％＜体重減少≦２０％）を示し、６匹中１匹の動物が死亡した。初回投与後７日目に６匹中１匹の動物が中等度の体重減少（１０％＜体重減少≦２０％）を示した。２回目投与後２日目には、６匹中１匹の動物が中等度の体重減少（１０％＜体重減少≦２０％）を示し、実験終了までも回復していなかった。

ｍＰＥＧ‐ＳＳ‐５ｋ‐ＧＰ８（高修飾度）群では、初回投与後５日目に６匹中１匹の動物が中等度の体重減少（１０％＜体重減少≦２０％）を示した。２回目の投与後２日目には、６匹中１匹の動物が中等度の体重減少（１０％＜体重減少≦２０％）を示し、実験終了の際には、体重回復の傾向が見られた。

ｍＰＥＧ‐ＳＳ‐５ｋ‐ＧＰ８（中修飾度）群では、投与期間中に動物の体重が減少することはなく、または体重減少が１０％未満であり、体重が減少した動物は実験後期に体重回復を示した。

ｍＰＥＧ‐ＳＳ‐５ｋ‐ＧＰ８（低修飾度）群では、二回目投与後２日目に６匹中１匹の動物が中等度の体重減少（１０％＜体重減少≦２０％）を示し、実験終了の際には、体重回復の傾向が見られた。。

ＰＥＧ‐ＳＣ‐２０ｋ‐ｒｈＩＬ‐２群では、初回投与後５日目に６匹中４匹の動物が中等度の体重減少（１０％＜体重減少≦２０％）を示した。２回目投与後２日目には、６匹中２匹の動物が中等度の体重減少（１０％＜体重減少≦２０％）を示した。２回目投与後７日目には、なお６匹中１匹の動物が中等度の体重減少（１０％＜体重減少≦２０％）を示し、残りの動物は実験終了の際に、体重回復の傾向が見られた。

三、結果分析
供試品ｍＰＥＧ‐ＳＳ‐２０ｋ‐ＧＰ８（高修飾度）、ｍＰＥＧ‐ＳＳ‐２０ｋ‐ＧＰ８（中修飾度）、ｍＰＥＧ‐ＳＳ‐５ｋ‐ＧＰ８（高修飾度）、ｍＰＥＧ‐ＳＳ‐５ｋ‐ＧＰ８（中修飾度）、ｍＰＥＧ‐ＳＳ‐５ｋ‐ＧＰ８（低修飾度）は、２ｍｇ／ｋｇの投与量でＣＴ２６．ＷＴネズミ由来結腸癌モデルに対して腫瘍成長を抑制する効果があった。

治療期間中、ｍＰＥＧ‐ＳＳ‐５ｋ‐ＧＰ８（高修飾度）、ｍＰＥＧ‐ＳＳ‐５ｋ‐ＧＰ８（中修飾度）、ｍＰＥＧ‐ＳＳ‐５ｋ‐ＧＰ８（低修飾度）群の動物は、２ｍｇ／ｋｇの投与量に対して忍容性が良好であった。ｍＰＥＧ‐ＳＳ‐２０ｋ‐ＧＰ８（高修飾度）、ｍＰＥＧ‐ＳＳ‐２０ｋ‐ＧＰ８（中修飾度）群の動物は２ｍｇ／ｋｇの投与量に対しておおむね忍容であり、体重の回復状況はＶ‐ＰＥＧ‐ＳＣ‐２０ｋ‐ｒｈＩＬ‐２群よりもよかった。

実施例１５：Ａ３７５ヒト黒色腫腫瘍モデルにおける、直鎖型ＰＥＧ－ＳＳで修飾されたＩＬ－２突然変異体の異なる修飾度の産物の薬効評価
Ａ３７５細胞は、１０％ウシ胎児血清を含むＤＭＥＭ培養液中で培養する。指数増殖期にあるＡ３７５細胞を収集し、ＰＢＳを加えて再懸濁する。ｈｕ‐ＰＢＭＣ（ヒト末梢血単核球）を１０％ウシ胎児血清を含む１６４０培養液中で培養し、ＯＫＴ－３とＩＬ－２薬物で３日間刺激された後のＰＢＭＣを収集し、ＰＢＳを加えて重懸濁する。５×１０^５ｃｅｌｌｓ／０．１ｍＬのＡ３７５細胞と５×１０^５ｃｅｌｌｓ／０．１ｍＬのＰＢＭＣ細胞懸濁液を１：１の割合（細胞接種量）で十分に混合した後、ＮＯＤ／ＳＣＩＤマウスの皮下に接種する。各マウスには０．２ｍＬを接種する。細胞接種後当日、体重に基づいて群分けを行う。群分けの当日に初回の投薬を開始する。詳細な投与プロトコルと投与経路は下表に示される。

実験方法、一般的臨床観察、体重・腫瘍体積・腫瘍重量の測定は実施例１１と同じである。

二、実験結果
１、薬効
細胞接種後４５日目のモデル群の動物の平均腫瘍体積は１，９７０．９７±２９８．６５ｍｍ^３であった。

細胞接種後４５日目のｍＰＥＧ‐ＳＳ‐２０ｋ‐ＧＰ８（高修飾度）群、ｍＰＥＧ‐ＳＳ‐２０ｋ‐ＧＰ８（中修飾度）群、ｍＰＥＧ‐ＳＳ‐５ｋ‐ＧＰ８（中修飾度）群の動物は腫瘍の成長を示さなかった。モデル群と比較して全て有意な差があった（Ｐ＜０．０１）。ＰＥＧ‐ＳＣ‐２０ｋ‐ｒｈＩＬ‐２群、ｍＰＥＧ‐ＳＳ‐５ｋ‐ＧＰ８（高修飾度）群、ｍＰＥＧ‐ＳＳ‐５ｋ‐ＧＰ８（低修飾度）群の動物の平均腫瘍体積はそれぞれ、１３６．５９±１３４．８４ｍｍ^３、８３．３４±８３．３４ｍｍ^３、９６．６２±６４．９２ｍｍ^３であり、モデル群と比較して全て有意な差があった（Ｐ＜０．０１）。

腫瘍重量の分析結果は腫瘍体積の分析結果と近かった。腫瘍重量に基づいて計算したｍＰＥＧ‐ＳＳ‐２０ｋ‐ＧＰ８（高修飾度）群、ｍＰＥＧ‐ＳＳ‐２０ｋ‐ＧＰ８（中修飾度）群、ｍＰＥＧ‐ＳＳ‐５ｋ‐ＧＰ８（高修飾度）群、ｍＰＥＧ‐ＳＳ‐５ｋ‐ＧＰ８（中修飾度）群、ｍＰＥＧ‐ＳＳ‐５ｋ‐ＧＰ８（低修飾度）群、ＰＥＧ‐ＳＣ‐２０ｋ‐ｒｈＩＬ‐２群のＴＧＩはそれぞれ、１００％、１００％、９５％、１００％、９５％、９１％であった。
具体的な実験結果は下表および図１０に示されている。

２、安全性
ｍＰＥＧ‐ＳＳ‐２０ｋ‐ＧＰ８（高修飾度）群では、４回目投与後３日目に６匹中１匹の動物が中等度の体重減少（１０％＜体重減少≦２０％）を示した。この動物は、４回目投与後６日目に中等度の体重減少（１０％＜体重減少≦２０％）が続いており、最終回投与後１日目に死亡した。さらに、最終回投与後９日目から最終回投与後１３日目までに、６匹中１匹の動物が中等度の体重減少（１０％＜体重減少≦２０％）を示し、実験終了の際には、この動物に体重回復の傾向が見られた。

ｍＰＥＧ‐ＳＳ‐２０ｋ‐ＧＰ８（中修飾度）群では、２回目投与後３日目に６匹中１匹の動物が重度の体重減少（体重減少＞２０％）を示した。この動物は、２回目投与後６日目に死亡した。最終回投与後３日目から実験終了時にかけて、６匹中１匹の動物が中等度の体重減少（１０％＜体重減少≦２０％）を示した。さらに、最終回投与後４日目に６匹中１匹の動物が死亡した。

ｍＰＥＧ‐ＳＳ‐５ｋ‐ＧＰ８（中修飾度）群では、最終回投与後６日目から最終回投与後９日目にかけて、６匹中１匹の動物が中度の体重減少（１０％＜体重減少≦２０％）を示した。実験終了の際に、この動物に体重回復の傾向が見られた。

ｍＰＥＧ‐ＳＳ‐５ｋ‐ＧＰ８（高修飾度）、ｍＰＥＧ‐ＳＳ‐５ｋ‐ＧＰ８（低修飾度）群では、投与期間中に動物の体重が減少することはなく、または体重減少が１０％未満であり、体重が減少した動物は実験後期に体重回復を示した。

ＰＥＧ‐ＳＣ‐２０ｋ‐ｒｈＩＬ‐２群では、最終回投与後６日目に６匹中１匹の動物が中等度の体重減少（１０％＜体重減少≦２０％）を示した。最終回投与後９日目には、６匹中２匹の動物が中等度の体重減少（１０％＜体重減少≦２０％）を示した。最終回投与後１３日目には、６匹中２匹の動物が中等度の体重減少（１０％＜体重減少≦２０％）を示し、６匹中１匹の動物が死亡した。

三、結果分析
供試品ｍＰＥＧ‐ＳＳ‐２０ｋ‐ＧＰ８（高修飾度）、ｍＰＥＧ‐ＳＳ‐２０ｋ‐ＧＰ８（中修飾度）、ｍＰＥＧ‐ＳＳ‐５ｋ‐ＧＰ８（高修飾度）、ｍＰＥＧ‐ＳＳ‐５ｋ‐ＧＰ８（中修飾度）、ｍＰＥＧ‐ＳＳ‐５ｋ‐ＧＰ８（低修飾度）は、０．５ｍｇ／ｋｇ（１回／週×５週）の投与量でＡ３５７ヒト黒色腫モデルに対して全て腫瘍成長を抑制する効果がある。薬効の観点から、供試品（ｍＰＥＧ‐ＳＳ‐２０ｋ‐ＧＰ８（高修飾度）、ｍＰＥＧ‐ＳＳ‐２０ｋ‐ＧＰ８（中修飾度）、ｍＰＥＧ‐ＳＳ‐５ｋ‐ＧＰ８（高修飾度）、ｍＰＥＧ‐ＳＳ‐５ｋ‐ＧＰ８（中修飾度）、ｍＰＥＧ‐ＳＳ‐５ｋ‐ＧＰ８（低修飾度））の作用はＰＥＧ‐ＳＣ‐２０ｋ‐ｒｈＩＬ‐２よりやや優れていた。

治療期間中、ｍＰＥＧ‐ＳＳ‐２０ｋ‐ＧＰ８（高修飾度）群、ｍＰＥＧ‐ＳＳ‐２０ｋ‐ＧＰ８（中修飾度）群、Ｖ‐ＰＥＧ‐ＳＣ‐２０ｋ‐ｒｈＩＬ‐２群の動物は、０．５ｍｇ／ｋｇの投与量では忍容性がよくなかった。一方、ｍＰＥＧ‐ＳＳ‐５ｋ‐ＧＰ８（高修飾度）、ｍＰＥＧ‐ＳＳ‐５ｋ‐ＧＰ８（低修飾度）群の動物は０．５ｍｇ／ｋｇ（１回／週×５週）の投与量に対して良好な忍容性を示した。ｍＰＥＧ‐ＳＳ‐５ｋ‐ＧＰ８（中修飾度）群の動物は０．５ｍｇ／ｋｇ（１回／週×５週）の投与量に対しておおむね忍容であった。安全性の観点（体重、死亡）から、供試品ｍＰＥＧ‐ＳＳ‐５ｋ‐ＧＰ８（高修飾度）、ｍＰＥＧ‐ＳＳ‐５ｋ‐ＧＰ８（中修飾度）、ｍＰＥＧ‐ＳＳ‐５ｋ‐ＧＰ８（低修飾度）の忍容性はＰＥＧ‐ＳＣ‐２０ｋ‐ｒｈＩＬ‐２より優れていた。

実施例１６：Ａ３７５ヒト黒色腫モデルにおける、ＰＥＧ修飾ＩＬ－２突然変異体の薬効評価
一、実験方法
Ａ３７５細胞は、１０％ウシ胎児血清を含むＤＭＥＭ培養液中で培養する。指数増殖期にあるＡ３７５細胞を収集し、ＰＢＳを加えて再懸濁する。ｈｕ‐ＰＢＭＣ（ヒト末梢血単核球）を１０％ウシ胎児血清を含む１６４０培養液中で培養し、ＯＫＴ－３とＩＬ－２薬物で３日間刺激された後のＰＢＭＣを収集し、ＰＢＳを加えて重懸濁する。１×１０^６ｃｅｌｌｓ／０．１ｍＬのＡ３７５細胞と１×１０^６ｃｅｌｌｓ／０．１ｍＬのＰＢＭＣ細胞懸濁液を１：１の割合（細胞接種量）で十分に混合した後、ＮＯＤ／ＳＣＩＤマウスの皮下に接種する。各マウスには０．２ｍＬを接種する。細胞接種後当日、体重に基づいて群分けを行う。群分けの当日に初回の投薬を開始する。詳細な投与プロトコルと投与経路は下表に示される。

一般的臨床観察、体重・腫瘍体積・腫瘍重量の測定は実施例１１と同じである。

二、実験結果
１、薬効
細胞接種後４５日目の陰性対照群の動物の平均腫瘍体積は１，１９７．６４±１４３．７９ｍｍ^３であった。

細胞接種後４５日目のｍＰＥＧ‐ＳＳ‐５Ｋ‐ＧＰ８‐高修飾度の高・中・低投与量群（２５０μｇ／ｋｇ、１２５μｇ／ｋｇ、６２．５μｇ／ｋｇ）の動物の平均腫瘍体積はそれぞれ、１４４．８７±３５．１１ｍｍ^３、２９６．０４±６１．１０ｍｍ^３、６４３．８８±１５３．０５ｍｍ^３であり、陰性対照群と比較して全て有意な差があった（Ｐ＜０．０１、またはＰ＜０．０５）。

細胞接種後４５日目の陽性対照群（泉奇，１００万ＩＵ／ｋｇ）の動物の平均腫瘍体積は５５７．５４±１０４．８２ｍｍ^３であり、陰性対照群と比較して有意な差があった（Ｐ＜０．０１）。ｍＰＥＧ‐ＳＳ‐５Ｋ‐ＧＰ８‐高修飾度高投与量群は陽性対照群（泉奇）と比較して、腫瘍体積に有意な差があった（Ｐ＜０．０１）。陽性対照群（泉奇）の投与総量がｍＰＥＧ‐ＳＳ‐５Ｋ‐ＧＰ８‐高修飾度高投与量群より高かったが、ｍＰＥＧ‐ＳＳ‐５Ｋ‐ＧＰ８‐高修飾度のほうはより薬効が優れたことが実験の結果によって示された。

細胞接種後４５日目の陽性参照薬（Ｖ－ＰＥＧ－ＳＣ－２０ｋ－ｒｈＩＬ－２，擬ＮＫＴＲ２１４）群の動物の平均腫瘍体積は２２４．３７±３３．２８ｍｍ^３であり、陰性対照群と比較して有意な差があった（Ｐ＜０．０１）。ｍＰＥＧ‐ＳＳ‐５Ｋ‐ＧＰ８‐高修飾度中投与量群は陽性参照群と比較して、腫瘍体積に有意な差がなかった（Ｐ＞０．０５）。ｍＰＥＧ‐ＳＳ‐５Ｋ‐ＧＰ８‐高修飾度の薬効は同じ投与量の陽性参照薬（Ｖ‐ＰＥＧ‐ＳＣ‐２０ｋ‐ｒｈＩＬ‐２、擬ＮＫＴＲ２１４）と近いことが実験の結果によって示された。

腫瘍重量の分析結果は腫瘍体積の分析結果とほぼ合致しており、腫瘍重量に基づいて計算したｍＰＥＧ‐ＳＳ‐５Ｋ‐ＧＰ８‐高修飾度高・中・低投与量群のＴＧＩはそれぞれ、８７％、７５％、４６％であり、腫瘍重量に基づいて計算した陽性対照群（泉奇）、陽性参照群（Ｖ‐ＰＥＧ‐ＳＣ‐２０ｋ‐ｒｈＩＬ‐２、擬ＮＫＴＲ２１４）のＴＧＩはそれぞれ５６％、８１％であった。
具体的な実験結果は下表及び図１１に示されている。

２、安全性
ｍＰＥＧ‐ＳＳ‐５ｋ‐ＧＰ８‐高修飾度高投与量群（２５０μｇ／ｋｇ）では、静脈注射による投与治療期間中に８匹中３匹の動物が中等度の体重減少を示し、動物は治療におおむね忍容であった。ｍＰＥＧ‐ＳＳ‐５Ｋ‐ＧＰ８‐高修飾度中・低投与量群（１２５μｇ／ｋｇ、６２．５μｇ／ｋｇ）の動物において、静脈注射による投与治療期間中に明らかな薬物毒性を示さず、治療期間中の忍容性が良好であった。

陽性対照群（泉奇、１００万ＩＵ／ｋｇ）の動物において、静脈注射による投与治療期間中に明らかな薬物毒性を示さず、治療期間中の忍容性が良好であった。最終回の投与後３日目（Ｄ３２）、最終回の投与後１６日目（Ｄ４５）に、ｍＰＥＧ‐ＳＳ‐５Ｋ‐ＧＰ８‐高修飾度高投与量群（２５０μｇ／ｋｇ）の体重は、陽性対照群（泉奇、１００万ＩＵ／ｋｇ）と比較して統計学的差はなかった（Ｐ＞０．０５）。

Ｖ‐ＰＥＧ‐ＳＣ‐２０ｋ‐ｒｈＩＬ‐２群（１２５μｇ／ｋｇ）の動物は、静脈注射による投与治療期間中に８匹中３匹の動物が中等度の体重減少を示し、８匹中１匹の動物が中等度から重度の体重減少を示したが、動物は治療におおむね忍容であった。最終回投与後３日目（Ｄ３２）、最終回投与後１６日目（Ｄ４５）に、ｍＰＥＧ‐ＳＳ‐５Ｋ‐ＧＰ８‐高修飾度中投与量群（１２５μｇ／ｋｇ）の体重は、陽性参照群（Ｖ‐ＰＥＧ‐ＳＣ‐２０ｋ‐ｒｈＩＬ‐２、１２５μｇ／ｋｇ）と比較して統計学的差があった（Ｐ＜０．０１またはＰ＜０．０５）。結果として、ｍＰＥＧ‐ＳＳ‐５Ｋ‐ＧＰ８‐高修飾度は、同じ投与量の陽性参照群（擬ＮＫＴＲ２１４）よりも安全性が優れている。

三、結果分析
ｍＰＥＧ‐ＳＳ‐５Ｋ‐ＧＰ８‐高修飾度は、高投与量（２５０μｇ／ｋｇ）および中投与量（１２５μｇ／ｋｇ）でＡ３７５ヒト黒色腫モデルに対して顕著な腫瘍抑制効果を示した。ｍＰＥＧ‐ＳＳ‐５Ｋ‐ＧＰ８‐高修飾度は低用量（６２．５μｇ／ｋｇ）でも腫瘍抑制の傾向を示した。ｍＰＥＧ‐ＳＳ‐５Ｋ‐ＧＰ８‐高修飾度は高、中、低投与量で良好な用量効果関係を示している。陽性参照群（Ｖ‐ＰＥＧ‐ＳＣ‐２０ｋ‐ｒｈＩＬ‐２、擬ＮＫＴＲ２１４）は１２５μｇ／ｋｇの投与量でＡ３７５ヒト黒色腫モデルに対して顕著な腫瘍抑制効果を示し、陽性対照群（泉奇）は１００万ＩＵ／ｋｇの投与量で腫瘍抑制の傾向を示した。

ｍＰＥＧ‐ＳＳ‐５Ｋ‐ＧＰ８‐高修飾度高投与量群（２５０μｇ／ｋｇ）およびＶ‐ＰＥＧ‐ＳＣ‐２０ｋ‐ｒｈＩＬ‐２群（１２５μｇ／ｋｇ）の動物は治療におおむね忍容であり、ｍＰＥＧ‐ＳＳ‐５Ｋ‐ＧＰ８‐高修飾度中・低投与量群（１２５μｇ／ｋｇ、６２．５μｇ／ｋｇ）および陽性対照群（泉奇、１００万ＩＵ／ｋｇ）の動物は治療に対する忍容性が良好であった。各投与群の動物に死亡は見られなかった。

上記のことは、同等の腫瘍抑制効果では、Ｖ‐ＰＥＧ‐ＳＣ‐２０ｋ‐ｒｈＩＬ‐２に比べて、動物がｍＰＥＧ‐ＳＳ‐５Ｋ‐ＧＰ８‐高修飾度の方に対してより忍容性が良好であることを示している。また、同等の安全性では、陽性対照群（泉奇）はｍＰＥＧ‐ＳＳ‐５Ｋ‐ＧＰ８‐高修飾度高投与量群よりも投与総量が高いのであるが、ｍＰＥＧ‐ＳＳ‐５Ｋ‐ＧＰ８‐高修飾度の方はより薬効が優れていることが示された。

実施例１７：Ａ４９８ヒト腎臓癌モデルにおける、ＰＥＧ修飾ＩＬ－２突然変異体の薬効評価
一、実験方法
Ａ４９８細胞は、１０％ウシ胎児血清を含むＤＭＥＭ培養液中で培養する。指数増殖期にあるＡ４９８細胞を収集し、ＰＢＳを加えて再懸濁する。ｈｕ‐ＰＢＭＣ（ヒト末梢血単核球）を１０％ウシ胎児血清を含む１６４０培養液中で培養し、ＯＫＴ－３とＩＬ－２薬物で３日間刺激された後のＰＢＭＣを収集し、ＰＢＳを加えて重懸濁する。５×１０^６ｃｅｌｌｓ／０．１ｍＬのＡ４９８細胞と５×１０^６ｃｅｌｌｓ／０．１ｍＬのＰＢＭＣ細胞懸濁液を１：１の割合（細胞接種量）で十分に混合した後、ＮＯＤ／ＳＣＩＤマウスの皮下に接種する。各マウスには０．２ｍＬを接種する。細胞接種後当日、体重に基づいて群分けを行う。群分けの当日に初回の投薬を開始する。詳細な投与プロトコルと投与経路は下表に示される。

二、実験結果
１、薬効
細胞接種後６１日目の陰性対照群の動物の平均腫瘍体積は１，９６０．６８±３９８．２８ｍｍ^３であった。

細胞接種後６１日目のｍＰＥＧ‐ＳＳ‐５Ｋ‐ＧＰ８‐高修飾度の中・低投与量群（１２５μｇ／ｋｇ、６２．５μｇ／ｋｇ）の動物の平均腫瘍体積はそれぞれ、１８．９９±１８．９９ｍｍ^３、２４８．１９±２０９．８６ｍｍ^３であり、陰性対照群と比較して有意な差があった（Ｐ＜０．０１）。

細胞接種後６１日目の陽性対照群（泉奇，７１．２５万ＩＵ／ｋｇ）の動物の平均腫瘍体積は２９０．８５±１４５．９６ｍｍ^３であり、陰性対照群と比較して有意な差があった（Ｐ＜０．０１）。ｍＰＥＧ‐ＳＳ‐５Ｋ‐ＧＰ８‐高修飾度中投与量群の投与量が陽性対照群（泉奇）の１／２しかなかったが、その薬効は陽性対照群（泉奇）群よりも優れていることが実験の結果によって示された。

細胞接種後６１日目のＶ－ＰＥＧ－ＳＣ－２０ｋ－ｒｈＩＬ－２群の動物の平均腫瘍体積は１１０．２２±６３．１５ｍｍ^３であり、陰性対照群と比較して有意な差があった（Ｐ＜０．０１）。ｍＰＥＧ‐ＳＳ‐５Ｋ‐ＧＰ８‐高修飾度中投与量群は陽性参照群と比較して、腫瘍体積に有意な差がなかった（Ｐ＞０．０５）。ｍＰＥＧ‐ＳＳ‐５Ｋ‐ＧＰ８‐高修飾度の薬効が、同じ投与量の陽性参照薬（Ｖ‐ＰＥＧ‐ＳＣ‐２０ｋ‐ｒｈＩＬ‐２、擬ＮＫＴＲ２１４）より優れていることは実験の結果によって示された。

腫瘍重量の分析結果は腫瘍体積の分析結果とほぼ合致しており、腫瘍重量に基づいて計算したｍＰＥＧ‐ＳＳ‐５Ｋ‐ＧＰ８中・低投与量群のＴＧＩはそれぞれ、９９％、８５％であり、腫瘍重量に基づいて計算した陽性対照群（泉奇）、陽性参照群（Ｖ‐ＰＥＧ‐ＳＣ‐２０ｋ‐ｒｈＩＬ‐２、擬ＮＫＴＲ２１４）のＴＧＩはそれぞれ８３％、９３％であった。
具体的な実験結果は下表及び図１２に示されている。

２、安全性
ｍＰＥＧ‐ＳＳ‐５ｋ‐ＧＰ８‐中投与量群（１２５μｇ／ｋｇ）では、静脈注射による投与治療期間中に８匹中１匹の動物が中等度の体重減少を示し、動物は治療におおむね忍容であった。ｍＰＥＧ‐ＳＳ‐５Ｋ‐ＧＰ８‐高修飾度低投与量群（６２．５μｇ／ｋｇ）の動物において、静脈注射による投与治療期間中に明らかな薬物毒性を示さず、治療期間中の忍容性が良好であった。

陽性対照群（泉奇、７１．２５万ＩＵ／ｋｇ）の動物において、静脈注射による投与治療期間中に明らかな薬物毒性を示さず、治療期間中の忍容性が良好であった。

Ｖ‐ＰＥＧ‐ＳＣ‐２０ｋ‐ｒｈＩＬ‐２群（１２５μｇ／ｋｇ）の動物は、静脈注射による投与治療期間中に８匹中３匹の動物が中等度の体重減少を示し、８匹中１匹の動物が中等度から重度の体重減少を示したが、動物は治療におおむね忍容であった。最終回投与後４日目（Ｄ３３）に、ｍＰＥＧ‐ＳＳ‐５Ｋ‐ＧＰ８‐高修飾度中投与量群（１２５μｇ／ｋｇ）の体重は、Ｖ‐ＰＥＧ‐ＳＣ‐２０ｋ‐ｒｈＩＬ‐２群（１２５μｇ／ｋｇ）と比較して統計学的差があった（Ｐ＜０．０１）。結果として、ｍＰＥＧ‐ＳＳ‐５Ｋ‐ＧＰ８‐高修飾度は、同じ投与量の陽性参照群（擬ＮＫＴＲ２１４）よりも安全性が優れている。

三、結果分析
ｍＰＥＧ‐ＳＳ‐５Ｋ‐ＧＰ８‐高修飾度は、中投与量（１２５μｇ／ｋｇ）および低投与量（６２．５μｇ／ｋｇ）でＡ４９８ヒト腎臓癌皮下移植腫瘍モデルに対して顕著な腫瘍抑制効果を示した。ｍＰＥＧ‐ＳＳ‐５Ｋ‐ＧＰ８‐高修飾は中、低投与量で一定の用量効果関係を示している。Ｖ‐ＰＥＧ‐ＳＣ‐２０ｋ‐ｒｈＩＬ‐２群は１２５μｇ／ｋｇの投与量で、陽性対照群（泉奇）は７１．２５万ＩＵ／ｋｇの投与量で、Ａ４９８ヒト腎臓癌皮下移植腫瘍モデルに対して顕著な腫瘍抑制効果を示した。

ｍＰＥＧ‐ＳＳ‐５Ｋ‐ＧＰ８‐高修飾度中投与量群（１２５μｇ／ｋｇ）およびＶ‐ＰＥＧ‐ＳＣ‐２０ｋ‐ｒｈＩＬ‐２群（１２５μｇ／ｋｇ）の動物は治療におおむね忍容であり、ｍＰＥＧ‐ＳＳ‐５Ｋ‐ＧＰ８‐高修飾度低投与量群（６２．５μｇ／ｋｇ）および陽性対照群（泉奇、７１．２５万ＩＵ／ｋｇ）の動物は治療に対する忍容性が良好であった。各投与群の動物に死亡は見られなかった。

上記のことは、同等の腫瘍抑制効果では、Ｖ‐ＰＥＧ‐ＳＣ‐２０ｋ‐ｒｈＩＬ‐２に比べて、動物はｍＰＥＧ‐ＳＳ‐５Ｋ‐ＧＰ８‐高修飾度の方に対する忍容性がより良好であることを示している。

実施例１８：ＰＥＧ修飾ＩＬ－２がカニクイザルＰＢＭＣ細胞の活性化に対する影響
１群に３匹のカニクイザルを設定し、静脈注射により異なる量のｍＰＥＧ‐ＳＳ‐５Ｋ‐ＧＰ８‐高修飾度（０．０１ｍｇ／ｋｇ群、０．０３ｍｇ／ｋｇ群）を投与する。空白対照群には対照として溶媒を投与する。毎週１回の投与で、合計５回の投与（Ｄ１、Ｄ８、Ｄ１５、Ｄ２２、Ｄ２９）を行う。初回投与（Ｄ１）から３０日後、末梢血を採取し、末梢血単核球ＰＢＭＣを分離し、ａｎｔｉ‐ＣＤ２５‐ＡＰＣ蛍光抗体（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ、貨物番号１３０‐１１３‐８４２）で標識して、ＦＡＣＳ測定を行う。

上記のデータから、０．０３ｍｇ／ｋｇ群のＣＤ２５発現量は空白対照群と比較して有意な差があることが分かった。ＣＤ２５はＰＢＭＣ細胞中のＴ細胞活性化のマーカーであり、本実験の結果は、０．０３ｍｇ／ｋｇ投与群がＴ細胞の活性化を効果的に刺激したことを証明した。

実施例１９：カニクイザルにおける４週間反復静脈注射投与の用量探索実験
カニクイザルを実験動物として用い、静脈注射により異なる量のｍＰＥＧ‐ＳＳ‐５Ｋ‐ＧＰ８‐高修飾度を複数回投与し、投与期間中に発生する可能性のある毒性反応を観察する。０．０３、０．１、０．３、０．５ｍｇ／ｋｇなどの４つの投与量群を設定する。そのうち、０．０３ｍｇ／ｋｇ投与量群の動物における３回の投与を完了した後、投与量を０．３ｍｇ／ｋｇに増やし、０．３ｍｇ／ｋｇ投与量群とし、合計で６回の投与を行う。

一、群分けと実験設計
下表に従い、体重に基づいて６匹の動物を性別別にランダムに４群に分ける。

実験期間中は毎日動物に対して臨床観察して、体重・摂食量・体温・血圧の変化を監視する。また、臨床病理学検査、免疫細胞表現型分析、サイトカイン測定、肉眼的観察などを行う。

二、結果
０．０３、０．１、０．３、０．５ｍｇ／ｋｇなどの４つの投与量群では、カニクイザルの死亡が発生しなかった。
０．０３ｍｇ／ｋｇの投与量では、カニクイザルは異常状況を示さず、体重増加の傾向を示した。
０．１ｍｇ／ｋｇの投与量では、雄性動物は脾臓の肥大を示し、ＣＤ５６＋細胞の割合が低下し、体重増加の傾向を示した。
０．３ｍｇ／ｋｇの投与量では、動物の摂食量が減少したが、体重は増加傾向にあった。肉眼解剖では脾臓の肥大が見られ、臨床病理学検査では白血球数の増加、赤血球数の減少、赤血球容積比の減少、血小板数の減少、総タンパクの減少が確認された。

０．５ｍｇ／ｋｇの投与量では、動物は初回投与後に倦怠感、自発的な活動の減少、大量の軟便、可視的粘膜の蒼白さなどの不良反応を示し、投与を１回中止し、計４回の投与を行った。動物の摂食量と体重が減少し、肉眼解剖では脾臓の肥大、胸腺の縮小、腹部の膨張、全身皮膚の弛みなどの症状が見られた。臨床病理学検査では、白血球数、単核球（絶対値）、好中球（絶対値）、好酸球（絶対値）、好塩基球（絶対値）、尿素、クレアチンキナーゼ、フィブリノーゲンが増加し、赤血球数、赤血球容積比、血小板数、総タンパクが減少した。また、ＣＤ５６＋細胞の割合が低下した。

初歩的研究の結果により、上記の実験条件下で０．５ｍｇ／ｋｇの投与量では、カニクイザルが重度の不良反応を示したが、死亡がまだ発生しなかった。

また、ＮＫＴＡ‐２１４に関する文献（NKTA-214, an Engineered Cytokine with Biased IL2 Receptor Binding, Increaesd Tumor Exposure, and Marked Efficacy in Mouse Tumor Models）によると、カニクイザルにおける１４日間隔の４回投与実験では、ＮＫＴＡ‐２１４の最大耐量（ＭＴＤ）が０．１ｍｇ／ｋｇである。この投与量ではＣＤ２５＋が２４倍増加し、総リンパ球が４倍増加した。ＮＫＴＡ‐２１４と比較して、ｍＰＥＧ‐ＳＳ‐５Ｋ‐ＧＰ８‐高修飾度はより短い投与間隔（７日ごと）で、より多くの投与回数（５回）で、かつより高い投与量（０．３ｍｇ／ｋｇ）では重度の不良反応がなく、安全性と忍容性における優位性が示唆される。

Claims

隣接するリジンを含まないことを特徴とするヒトインターロイキン－２突然変異体であって、前記突然変異体は、以下の表：
の突然変異スキームから選択される変異を有することを特徴とし、そして前記突然変異部位は野生型ヒトＩＬ－２に基づく、ヒトインターロイキン－２突然変異体。
前記突然変異は、以下の表：
の突然変異スキームから選択されることを特徴とする、
請求項１に記載のヒトインターロイキン－２突然変異体。
ヒトインターロイキン－２のポリエチレングリコール修飾体であって、
ＰＥＧ修飾剤としてポリエチレングリコールスクシンイミジルスクシネートを使用し、一つ当たりのヒトインターロイキン－２には、平均４．５～８．５個のＰＥＧ分子が結合され、前記ヒトインターロイキン－２は、請求項１に記載のヒトインターロイキン－２突然変異体であることを特徴とする、ヒトインターロイキン－２のポリエチレングリコール修飾体。
前記ＰＥＧ修飾剤は、直鎖ポリエチレングリコールスクシンイミジルスクシネート修飾剤であることを特徴とする、
請求項３に記載のポリエチレングリコール修飾体。
前記ＰＥＧ修飾剤の分子量は、５～２０ｋＤａであることを特徴とする、
請求項３に記載のポリエチレングリコール修飾体。
前記ＰＥＧ修飾剤の分子量が５ｋＤａである場合、一つ当たりのヒトインターロイキン－２には、平均５．５～７．５個のＰＥＧが結合され、前記ＰＥＧ修飾剤の分子量が１０～２０ｋＤａである場合、一つ当たりのヒトインターロイキン－２には、平均６．５～８．５個のＰＥＧ分子が結合されていることを特徴とする、
請求項３に記載のポリエチレングリコール修飾体。
前記ＰＥＧ修飾剤の構造は、以下の図に示されたとおりであり、
式中、ｎは、９７～４９４の整数であることを特徴とする、請求項３に記載のポリエチレングリコール修飾体。
ヒトインターロイキン－２の前記ポリエチレングリコール修飾体の構造は、以下に示されたとおりであり、
式中、ｎは、９７～４９４の整数であり、ｍは、４．５～８．５であることを特徴とする、
請求項３に記載のポリエチレングリコール修飾体。
腫瘍疾患を治療するための薬物の製造における、請求項３に記載のヒトインターロイキン－２のポリエチレングリコール修飾体の使用。
前記腫瘍は、扁平上皮がん、黒色腫、結腸がん、乳がん、卵巣がん、前立腺がん、胃がん、肝臓がん、小細胞肺がん、非小細胞肺がん、甲状腺がん、腎臓がん、胆管がん、脳腫瘍、子宮頸がん、上顎洞がん、膀胱がん、食道がん、ホジキン病および副腎皮質がんを含むことを特徴とする、
請求項９に記載の使用。
腫瘍疾患を治療するための組成物であって、
前記組成物は、請求項１に記載のヒトインターロイキン－２突然変異体、又は請求項３に記載のヒトインターロイキン－２のポリエチレングリコール修飾体を含み、ＨＥＲ２抗体、ＰＤ－１抗体、ＰＤ－Ｌ１抗体またはＣＤ２６抗体をさらに含むことを特徴とする、腫瘍疾患を治療するための組成物。