JP7843717B2

JP7843717B2 - 局所免疫増感剤を付与するための皮膚パッチ及びガラススワブ

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Publication number: JP7843717B2
Application number: JP2022578881A
Authority: JP
Inventors: マクタビッシュ、ヒュー
Original assignee: スクエアエックスファーマシューティカルコーポレーション
Priority date: 2020-06-17
Filing date: 2021-06-14
Publication date: 2026-04-10
Anticipated expiration: 2041-06-14
Also published as: US20210393542A1; EP4167974A4; EP4167974A1; JP2023530503A; CN115955960A; AU2021294314A1; KR20230025860A; CA3180312A1; WO2021257479A1

Description

局所免疫増感剤は、ある程度少量を皮膚に局所的に付与しても、大部分の人において遅延型過敏（ＤＴＨ；delayed-type hypersensitivity）反応を誘発する化合物である。局所免疫増感剤の例としては、スクアリン酸ジブチルエステル（ＳＡＤＢＥ）、スクアリン酸エチルエステル、一般にモノエステル及びジエステルを含むスクアリン酸エステル、ジフェニルシクロプロペノン（ＤＰＣＰ）、１－クロロ－２，４－ジニトロベンゼン（ＤＮＣＢ）、及び１－クロロ－２，６－ジニトロベンゼンが挙げられる(Buckley et al., Lee et al.)。
ツタウルシ（poison ivy）とその有効成分であるウルシオールも局所免疫増感剤である。

ＳＡＤＢＥ、並びにその他の局所免疫増感剤であるジフェニルシクロプロペノン及びＤＮＣＢは、尋常性疣贅及び円形脱毛症の治療に成功裏に使用されている。これらの場合、０．０５％～２．０％（重量／体積）の溶液が使用される。ほとんどの場合、媒体（vehicle）はアセトンである。前記免疫増感剤はすべてこれらの用途に有効であることが示されている。尋常性疣贅の場合、免疫増感剤は通常約１週間間隔で疣贅が消失するまで繰り返し疣贅に付与される。円形脱毛症の場合、通常週に１回、消失するまで繰り返し頭皮の患部に付与される。

ＳＡＤＢＥは、頻繁に発症する人における口唇ヘルペス（herpes labialis；cold sores又はoral herpes）の発症予防にも有効であることが示されている(Palli et al., Chang et al.)。唇や病変ではなく、腕に単回投与すると、約４か月間、口唇ヘルペスの発生数が大幅に減少することがわかった（Palli et al., Chang et al.）。その機序は、インビトロで単純ヘルペスウイルス及び他の刺激に晒された末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）におけるインターフェロンガンマ（ＩＦＮＧ）の発現の増加やインターロイキン５（ＩＬ５）の発現の減少など、１回の投与が、その１回の投与の８週間後に免疫遺伝子の発現を全身的に変化させることであると考えられる（McTavish et al.）。

局所免疫増感剤の局所送達のための新たな単位剤形及びデバイスが求められる。利点の中でも、本開示に提示される単位剤形、デバイス、及びキットは、より一貫性のある制御された体積の薬液を送達し、過少投与及び過剰投与を防止し、反復投与を防止又は阻止し、薬液が付与されるより一貫性のある皮膚領域を提供する。前記単位剤形、デバイス、及びキットは、薬液用の容器であって、容器が空気から完全に密閉されており、特定の局所免疫増感剤と反応したり分解したりする水蒸気や酸素を排除するため、保管中に薬液を安定して変化させずに保つのに役立ち、溶液と反応せず溶液によって抽出されない不活性物質であるガラスのみと薬液を接触させる容器も提供する。

本発明の実施形態は、保存に対して安定であり、エンドユーザー患者によって便利、安全かつ正確に使用でき、局所薬剤が患者の意図しない皮膚と接触するのを回避し、一貫性のある皮膚領域への一貫性のある体積又は量の薬剤の投与を容易にする、局所免疫増感剤及び他の局所付与薬剤の単位剤形を提供する。

本発明の一実施形態は、（ａ）布地の領域の少なくとも一部の上に接着剤が重ねられた前記布地を含むバッキング層を含み、前記バッキング層には、その領域の一部の上に（ｂ）吸収性ガーゼ層が重ねられており、前記吸収性ガーゼ層は、媒体と前記媒体に溶解した局所免疫増感剤とを含む液体又は半液体の溶液を含む、皮膚パッチを提供する。

「半液体」との語は、クリーム、ローション、ジェルなど、粘性があるが完全に固体ではない組成物を意味する。

別の実施形態は、（ａ）液体媒体に溶解した局所免疫増感剤の溶液を含む密閉ガラスアンプルと、（ｂ）前記密閉ガラスアンプルに取り付けられたフォームアプリケーターチップ（foam applicator tip）と、を含み、前記密閉ガラスアンプルは、通常の力を有する人が手で絞る（squeeze）ことで破壊可能であり、前記ガラスアンプルが破壊されて逆さにされると、５分以内に前記溶液がフォームチップに浸透し、前記フォームチップが表面に接触すると前記表面を前記溶液で濡らすようになるように構成されている、ガラススワブを提供する。

特定の好ましい実施形態において、ガラススワブは、前記（ｃ）ガラスアンプルを取り囲み、前記フォームアプリケーターチップまでをシールするポリマーバリア層をさらに含み、前記ポリマーバリア層は、ガラスの破片及び前記溶液が前記ポリマーバリア層に浸透して前記ガラススワブを絞って破壊する人の指の皮膚に接触することを防ぐように構成されている。

別の実施形態は、ガラススワブの作製方法であって、前記ガラススワブは、（ａ）ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、メタノール、エタノール、プロパノール、ブタノール、イソプロパノール、イソブタノール、アセトン、又はこれらの組み合わせである媒体に溶解した、スクアリン酸エステルである局所免疫増感剤の溶液を含む密閉ガラスアンプル、及び（ｂ）前記密閉ガラスアンプルに取り付けられたフォームアプリケーターチップを含み、前記密閉ガラスアンプルは、通常の力を有する人が手で絞ることで破壊可能であり、前記ガラススワブは、ガラスアンプルが破壊されて逆さにされると、５分以内に前記溶液がフォームチップに浸透し、前記フォームチップが表面に接触すると前記表面を前記溶液で濡らすようになるように構成されている、ガラススワブの作製方法を提供する。前記方法は、（ａ）（１）前記媒体を分子ふるいで処理して（好ましくは乾燥雰囲気下）媒体から水を除去し、乾燥媒体を生産すること；及び、前記乾燥媒体にスクアリン酸エステルを溶解して（好ましくは乾燥雰囲気下）乾燥溶液を生産すること、又は（ａ）（２）前記媒体にスクアリン酸エステルを溶解して溶液を形成し、その後前記溶液を分子ふるいで処理して（好ましくは乾燥雰囲気下）前記媒体から水を除去し、乾燥溶液を生産すること、のいずれかを含む。前記方法はさらに、（ｂ）乾燥雰囲気下で前記乾燥溶液を前記ガラスアンプルに充填し、前記ガラスアンプルを密閉して気密シールを形成すること、を含み、前記アンプル中の前記乾燥溶液は、前記気密シールが破壊されるまではガラスとのみ接触する。

別の実施形態は、（ａ）：（ａ）（１）布地の領域の少なくとも一部の上に接着剤が重ねられた前記布地を含む接着性バッキング層であって、前記接着性バッキング層には、その領域の一部の上に（ａ）（２）吸収性ガーゼ層が重ねられている、前記接着性バッキング層、を含む皮膚パッチと、（ｂ）媒体に溶解した局所免疫増感剤を含む液体又は半液体の溶液を含む密閉容器と、を含むキットを提供する。

前記キットの好ましい実施形態において、前記（ｂ）密閉容器はガラススワブであり、前記ガラススワブが、（ｂ）（１）液体媒体に溶解した局所免疫増感剤の溶液を含む密閉ガラスアンプルと、（ｂ）（２）前記密閉ガラスアンプルに取り付けられたフォームアプリケーターチップと、を含み、前記密閉ガラスアンプルは、通常の力を有する人が手で絞ることで破壊可能であり、前記ガラススワブは、前記ガラスアンプルが破壊されて逆さにされると、５分以内に前記溶液がフォームチップに浸透し、前記フォームチップが表面に接触すると前記表面を前記溶液で濡らすようになるように構成されている。より好ましい実施形態において、前記ガラススワブは（ｂ）（３）前記ガラスアンプルを取り囲み、前記フォームアプリケーターチップまでをシールするポリマーバリア層をさらに含み、前記ポリマーバリア層は、ガラスの破片及び前記溶液が前記ポリマーバリア層に浸透して前記ガラススワブを絞って破壊する人の指の皮膚に接触することを防ぐように構成されている。

別の実施形態は、人の皮膚に接着性皮膚パッチを適用し接着させることを含み、前記接着性皮膚パッチは、布地の領域の少なくとも一部の上に接着剤が重ねられた前記布地を含むバッキング層を含み、前記バッキング層には、その領域の一部の上に吸収性ガーゼ層が重ねられており、前記吸収性ガーゼ層は、媒体と前記媒体に溶解した局所免疫増感剤とを含む液体又は半液体の溶液を含む、制御された用量の局所免疫増感剤を局所的に付与する方法を提供する。

図１は本発明の皮膚パッチの概要図を示す。図２は本発明のガラススワブの概要図を示す。感作投与後の、最初の新規口唇ヘルペス発症までの日数。このＫａｐｌａｎ－Ｍｅｉｅｒグラフは感作投与後の示された日数の間新規口唇ヘルペスの発症がなかった被験者の割合のイベント発生時間（time-to-event）曲線を示す。曲線に沿った丸印は打ち切られた観察を示す。すべてのモルモットの用量毎の一次刺激性指数（ｐＩＩ；Primary Irritation Index）の１日平均。ＳＡＤＢＥ皮膚パッチ適用後の平均±ＳＥＭ一次刺激性スコア。誘導時、動物に皮膚パッチを介して２％、６％、及び１８％のＳＡＤＢＥを投与し（０日目）、引き続く３０日間、投与部位の評価を実施した。モルモットの皮膚に再度チャレンジし、同じ濃度の２つ目のＳＡＤＢＥパッチ（３４日目）を別の場所に適用し、引き続く２８日間、投与部位の評価を実施した（用量レベルあたりｎ＝１０）。すべてのミニブタの用量毎の一次刺激性指数（ｐＩＩ）の１日平均。ＳＡＤＢＥ皮膚パッチ適用後の平均一次刺激性スコア。誘導時、動物に皮膚パッチを介して２％、６％、及び１８％のＳＡＤＢＥを投与し（０日目）、引き続く２５日間、投与部位の評価を実施した。ミニブタの皮膚に再度チャレンジし、同じ濃度の２つ目のＳＡＤＢＥパッチ（３２日目）を別の場所に適用し、引き続く３０日間、投与部位の評価を実施した。

本発明の一実施形態は、（ａ）布地の領域の少なくとも一部の上に接着剤が重ねられた前記布地を含むバッキング層を含み、前記バッキング層には、その領域の一部の上に（ｂ）吸収性ガーゼ層が重ねられており、前記吸収性ガーゼ層は、媒体と前記媒体に溶解した局所免疫増感剤とを含む液体又は半液体の溶液を含む、皮膚パッチを提供する。この例は図１に示される。

皮膚パッチ１はバッキング層２と前記バッキング層の少なくとも一部の上の接着剤３を含む。接着剤はパッチを患者の皮膚へ接着させるためのものである。図１はまた、バッキング層１と接着剤２に重ねられ、吸収性ガーゼ層５の下にあるバリア層４を示す。吸収性ガーゼ５は、任意に、媒体と前記媒体に溶解した局所免疫増感剤とを含む液体又は半液体の溶液６を含む。

バッキング層２及び接着剤３、並びにガーゼ５は、バンドエイド帯等の皮膚パッチに用いられる従来の材料であってよい。例えば、一実施形態における接着剤と合わせられたバッキング層は３ＭＭｅｄｉｃａｌＴａｐｅ９９１６（３Ｍ社、米国ミネソタ州セントポール）である。その場合、バッキング層は２．２ｏｚ／ｙｄ^２（６２ｇ／ｍ^２）の１００％ポリエステルタンスパンレース不織布で、接着剤は感圧性アクリレート接着剤である。バリア層４は任意である。一例では、それは、ポリエステルとエチレン酢酸ビニル共重合体ヒートシール層とのラミネートからなる３Ｍ９７３３ポリエステルフィルムラミネートである。これはジメチルスルホキシドやその他のほとんどの溶媒に対して不浸透性で耐性があるため、ガーゼ部分に追加されるＤＭＳＯがパッチから接着剤やその他の成分を抽出しないことを担保するためのバリアとして機能する。ガーゼ層５は、一実施形態では、Precision Fabrics PFG 0700-00000などのポリエステルであってもよい。ポリエステルもＤＭＳＯやその他の溶媒に耐性があり非反応性であるため、ガーゼにとって望ましい。いくつかの実施形態において、吸収性ガーゼ層は、例えば音波溶着によって、接着剤なしでバリア層に取り付けてもよい。

一実施形態では、ガーゼ層５中の液体又は半液体の溶液６は、媒体であるジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）に溶解した、局所免疫増感剤であるスクアリン酸ジブチルエステル（ＳＡＤＢＥ）の溶液である。

図２は、本発明のガラススワブ１を示す。ガラススワブ１は、媒体、好ましくは液体媒体に溶解した局所免疫増感剤の液体又は半液体の溶液３を含有する密閉ガラスアンプル２を含む。密閉ガラスアンプルは、通常、概ね大気圧の気体を含むヘッドスペース４も含む。前記気体は、空気であってもよく、窒素又はアルゴンなどの不活性ガスであってもよい。特定の実施形態では、前記気体は乾燥しており、これは、水蒸気がほとんど又は全く含まれないことを意味する。ＳＡＤＢＥのように免疫増感剤が水に不安定な場合は、乾燥気体が望ましい。空気を乾燥させることもできるが、より一般的には、乾燥気体は窒素やアルゴンなどの不活性ガスであろう。図２は、ガラスアンプル２を取り囲むバリア層５も示している。特定の実施形態におけるバリア層５は、局所免疫増感剤を溶解する媒体に対して不浸透性であり、免疫増感剤に対して不浸透性である。特定の実施形態では、バリア層５はポリマー、好ましくは半透明又はより好ましくは透明なポリマーである。一実施形態では、バリア層は酢酸酪酸セルロースである。ガラススワブはフォームチップ６も含む。一実施形態では、フォームチップはポリオレフィンから構成される。ポリオレフィンはＤＭＳＯやその他の溶媒に不溶で耐性があるため、ＤＭＳＯ－ＳＡＤＢＥ溶液は何も抽出せず、フォームチップとの接触によっても変化しない。フォームチップ６はバリア層５でシールされている。図２では、それらはカラー（collar）領域７に沿ってシールされている。前記シールは、接着剤によって、又はより好ましくは熱若しくは音波溶着、又はバリア層５を部分的に溶解してフォームチップ６に接着させてシールを形成する揮発溶剤の使用による直接的なシーリングによって行うことができる。

バリア層は、複数の材料を含んでもよい。例えば、バリア層は、バリア層の別の部分上のポリマーに連結された、バリア層の一部の上のポリマーブレンド又は厚紙層を含み得る。図２のように、ガラススワブの一端又は両端を覆う厚紙キャップ８が存在してもよい。図２では、ガラススワブの下端を覆う１つの厚紙キャップ８が示されている。厚紙キャップ８は、出荷時にフォームチップ６を覆うリバーシブルで取り外し可能な厚紙のキャップでもあり得、ユーザが厚紙とバリア層の両方を絞ってガラスを破壊する前に、ユーザが取り外してガラススワブの他端に再配置する。

ガラスアンプルが破壊されると、溶液３がガラスアンプルから漏出するが、バリア層により制限されるため、ガラス破片や溶液はユーザの指の皮膚に接触しない。続いてユーザはこれを破壊した後にガラススワブを逆さにして溶液３がフォームチップ６に浸透するようにしなければならない。ユーザはガラススワブを破壊した後にガラススワブを絞って溶液がフォームチップに浸透するプロセスを加速させてもよい。フォームチップに溶液が浸透すると、ユーザはフォームチップをユーザの皮膚に軽くたたいたり（dab）拭いたり（wipe）して溶液を皮膚に付与してもよく、皮膚パッチのガーゼ部の上にフォームチップを軽くたたいたり拭いたりして吸収性ガーゼ層に溶液を置いてもよく、その後に皮膚パッチをユーザの皮膚に適用して溶液をユーザの皮膚に投与してもよい。

皮膚パッチの有無にかかわらず、ガラススワブは免疫増感剤溶液のある程度決められた量の投与を容易にする。これはまた、過剰の溶液を送達するのを防ぎ、付与された部位から溶液が滴り落ちて指などの非標的領域に接触するのを防ぐ。加えて、これは１回の使用で視覚的に破壊されて損傷する単回使用の容器を提供するため、患者が経時的に複数回投与のために容器を再利用しようとし過剰投与となってしまう可能性が低減される。薬液がフォームチップに浸透してチップが他の表面を濡らすために使用できるようになるのに約３０～６０秒かかり、またフォームチップは最初及び数分間は飽和していないため、ユーザの皮膚又はパッチに溶液を滴下し難く、最初は不可能である。これらは意図するよりも多くの用量につながったり、非標的領域上に溶液が滴ってしまうことにつながったりするため避けるべきである。ガラススワブは１回の使用後、破壊されたガラスにより視覚的に破壊される。これにより自宅の患者が引き続く投与時に自己投与のために同じガラススワブを再度用いる可能性を低減できる。これは腕への単回投与が３か月以上の発症を予防すること（Palli et al., Chang et al.）、及び腕への単回投与が前記単回投与から８週間後に顕著な全身の免疫変化を引き起こすこと（McTavish et al.）が示された口唇ヘルペスの発症予防におけるＳＡＤＢＥ－ＤＭＳＯ溶液にとって意図されたものではない。また、ＳＡＤＢＥはＤＭＳＯ溶液中に少量の水が存在する場合でもかなり不安定であり、ＤＭＳＯは空気に晒されると空気中の水分を吸収するため、溶液内への水の取り込み及び加水分解によりＳＡＤＢＥ濃度が経時的に著しく低下してしまうことから、包装を破壊した後はユーザが容器を再利用することは好ましくない。ガラススワブの酢酸酪酸セルロースバリア層により、反復使用をさせないためのさらなる可視的な合図が提供される。ガラススワブが破壊されてＤＭＳＯ－ＳＡＤＢＥ溶液が酢酸酪酸セルロースに接触した後、酢酸酪酸セルロース層は約６０分で透明から白色に変わる。バリア層の他のポリマーは、ＤＭＳＯ又は免疫増感剤の他の媒体と接触した後、外観が変化して視覚的に損傷して見えるという同様の特性を有し得るだろう。

皮膚パッチは、個別であってもガラススワブと組み合わせても、ガラススワブと同じ利点を有する：これは付与される免疫増感剤溶液の体積及び薬剤が付与される皮膚領域の点で、一貫性のある投与を容易にする。これはまた、過剰の溶液を送達するのを防ぎ、付与された部位から溶液が滴り落ちて指などの非標的領域に接触するのを防ぐ。またこれは、基本的に２回目の投与に使用できない単回用量付与デバイスを提供することにより、同じパッチで、又は１つの皮膚パッチ及び液体又は半液体の局所免疫増感剤溶液を含む容器を含む同じキットで、前記容器がガラススワブであるか否かに関わらず、患者が複数用量を付与しようとする可能性が低減できる。

［実施形態］
皮膚パッチの一実施形態において、吸収性ガーゼはポリエステルを含む。

皮膚パッチ、ガラススワブ、キット、及び方法の特定の実施形態では、局所免疫増感剤は、スクアリン酸エステル、ジフェニルシクロプロペノン、１－クロロ－２，４－ジニトロベンゼン（ＤＮＣＢ）、１－クロロ－２，６－ジニトロベンゼン、又はウルシオールを含む。

特定の実施形態において、免疫増感剤はＳＡＤＢＥである。

特定の実施形態では、媒体は、クリーム、ローション、アセトン、鉱油、ワセリン、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、アセトン、プロパノール、イソプロパノール、ｎ－ブタノール、イソブタノール、エタノール、又はメタノールを含む。特定の実施形態では、媒体は、ＤＭＳＯ、アセトン、エタノール、又はイソプロパノールを含む。特定の実施形態では、媒体はＤＭＳＯを含む。他の特定の実施形態では、媒体は、ＤＭＳＯ、メタノール、アセトン、エタノール、プロパノール、イソプロパノール、ブタノール、イソブタノール、水、又はそれらの組み合わせを含む。

特定の実施形態では、媒体はＤＭＳＯであり、局所免疫増感剤はＤＭＳＯに０．１％～５％（ｗｔ／ｖｏｌ）で溶解したＳＡＤＢＥである。

皮膚パッチの特定の実施形態において、吸収性ガーゼ層は、（直接的に、又はバリア層を介して間接的に）接着性バッキング層に恒久的に取り付けられる。

他の特定の実施形態では、吸収性ガーゼ層は接着性バッキング層に取り付けられていない。

ガラススワブの特定の実施形態において、ガラススワブは、ガラスアンプルを部分的に又は完全に取り囲む１又は複数のバリア層であって、フォームチップを介した溶液以外のガラスの破片及び溶液が前記１又は複数のバリア層に浸透してガラススワブを保持する人の皮膚に接触するのを防ぐように構成された前記１又は複数のバリア層をさらに含む。

特定の実施形態では、バリア層はポリマーバリア層、例えば酢酸セルロース、酢酸酪酸セルロース、ポリエステル、又はポリエチレンを含む。

特定の実施形態では、ガラススワブは、ガラスアンプルを部分的又は完全に取り囲み、フォームアプリケーターチップまでをシールするポリマーバリア層を含み、前記ポリマーバリア層は、壊れたガラスの破片及び溶液がポリマーバリア層に浸透してガラススワブを絞って破壊する人の指の皮膚に接触することを防ぐように構成されている。

本発明の皮膚パッチ、ガラススワブ、方法、及びキットの特定の実施形態において、媒体は、ＤＭＳＯ、メタノール、アセトン、エタノール、プロパノール、イソプロパノール、ブタノール、イソブタノール、水、及びこれらの組み合わせから選択される。

本発明の皮膚パッチ、ガラススワブ、方法、及びキットの特定の実施形態において、局所免疫増感剤はスクアリン酸エステル（例えばＳＡＤＢＥ）であり、媒体はＤＭＳＯ、メタノール、エタノール、プロパノール、ブタノール、イソプロパノール、イソブタノール、アセトン、又はこれらの組み合わせである。

本発明の皮膚パッチ、ガラススワブ、方法、及びキットの特定の実施形態において、媒体はＤＭＳＯであり、局所免疫増感剤はＳＡＤＢＥである。密閉されたガラスアンプルは空気と水蒸気を排除する恒久的な気密シールを提供し、ガラスアンプルは窒素又は他の不活性ガス又は乾燥空気で満たして水蒸気を制限できるため、ガラススワブはこの組み合わせに特に有利である。これは、ＤＭＳＯが空気から水分を取り込みやすいところ、ＳＡＤＢＥは水によって容易に加水分解され、水分含有量の高いＤＭＳＯ溶液内では不安定であるため、水分の取り込みを避ける必要があることから、有利である。また、ＤＭＳＯは多くのポリマーなどの多くの物質を抽出又は溶解する優れた溶媒であるが、ガラスはＤＭＳＯに対して完全に耐性を有する。

ガラススワブの特定の実施形態において、１又は複数のバリア層は、セルロースポリマー層（例えば、酢酸セルロース又は酢酸酪酸セルロース）及び／又は厚紙層を含む。

ガラススワブの特定の実施形態、特に免疫増感剤がＳＡＤＢＥ又はスクアリン酸エステルである場合において、溶液中の水は、１００ｐｐｍ未満、又はより好ましくは５０ｐｐｍ未満、２０ｐｐｍ未満、若しくは１０ｐｐｍ未満である。

ガラススワブの特定の実施形態において、ガラスアンプル内の溶液は、ガラスアンプルが破壊されるまではガラスとのみ接触する。

本発明の一実施形態は、（ａ）乾燥雰囲気下で媒体（例えば、ＤＭＳＯ又はアセトン）を分子ふるいで処理して媒体から水を除去し、乾燥媒体を生産すること、（ｂ）乾燥雰囲気下で局所免疫増感剤（例えば、ＳＡＤＢＥ）を前記乾燥媒体に溶解させて乾燥溶液を生産すること、及び（ｃ）前記乾燥溶液をガラスアンプルに充填してガラスアンプルを密閉し気密シールを形成すること、を含み、前記溶液は、前記気密シールが破壊されるまではガラスとのみ接触する、本発明のガラススワブを作製する方法である。好ましくは工程（ｃ）は乾燥雰囲気下（例えば、窒素、アルゴン、又は乾燥空気）で乾燥溶液をガラスアンプルに充填してガラスアンプルを密閉し気密シールを形成することである。

本発明の一実施形態は、（ａ）（１）媒体（例えば、ＤＭＳＯ又はアセトン）を分子ふるいで処理して（好ましくは乾燥雰囲気下）媒体から水を除去し、乾燥媒体を生産すること；及び、前記乾燥媒体にスクアリン酸エステルを溶解して（好ましくは乾燥雰囲気下で）乾燥溶液を生産すること、又は（ａ）（２）媒体（例えば、ＤＭＳＯ又はアセトン）にスクアリン酸エステルを溶解して溶液を形成し、その後前記溶液を分子ふるいで処理して（好ましくは乾燥雰囲気下）前記媒体から水を除去し、乾燥溶液を生産することを含む、請求項１５に記載のガラススワブを作製する方法を提供する。前記方法はさらに、（ｂ）乾燥雰囲気下（例えば、窒素、アルゴン、又は乾燥空気）で前記乾燥溶液を前記ガラスアンプルに充填し、前記ガラスアンプルを密閉して気密シールを形成すること、を含み、前記アンプル中の前記乾燥溶液は、前記気密シールが破壊されるまではガラスとのみ接触する。

別の実施形態は、（ａ）布地の領域の少なくとも一部の上に接着剤が重ねられた前記布地を含む接着性バッキング層であって、前記接着性バッキング層には、その領域の一部の上に吸収性ガーゼ層が重ねられている、前記接着性バッキング層、を含む皮膚パッチと、（ｂ）媒体に溶解した局所免疫増感剤を含む液体又は半液体の溶液を含む密閉容器と、を含むキットを提供する。

キットの特定の実施形態において、皮膚パッチは、ガーゼ層と接着性バッキング層との間にバリア層をさらに含み、バリア層は媒体及び局所免疫増感剤に対して不透過性である。

特定の実施形態において、密閉容器は本発明のガラススワブである。密閉容器は、スクリューキャップ付きプラスチックバイアル、スクリューキャップ付きガラスバイアル、又は手で壊すことのできるネック付き密閉プラスチックバイアル等、他のタイプの容器であってもよい。

キットの特定の実施形態において、密閉容器は、人が道具を使わずに手で開けるように構成されている。

本発明の別の実施形態は、人の皮膚に接着性皮膚パッチを適用し接着させることを含み、前記接着性皮膚パッチは、布地の領域の少なくとも一部の上に接着剤が重ねられた前記布地を含むバッキング層を含み、前記バッキング層には、その領域の一部の上に吸収性ガーゼ層が重ねられており、前記吸収性ガーゼ層は、媒体と前記媒体に溶解した局所免疫増感剤とを含む液体又は半液体の溶液を含む、制御された用量の局所免疫増感剤を局所的に付与する方法を提供する。

前記局所的に付与することは、通常、ヘルペスの発症を予防したり、尋常性疣贅を処置したりするなど、局所免疫増感剤で人を医学的に処置するためのものである．

制御された用量の局所免疫増感剤を局所的に付与する方法の特定の実施形態において、前記方法は、前記適用する工程の前に、媒体と前記媒体に溶解した局所免疫増感剤とを含む液体又は半液体の溶液を含む単位用量容器を開けることと、前記溶液を前記皮膚パッチの前記吸収性ガーゼ層に付与して、前記媒体と前記媒体に溶解した局所免疫増感剤とを含む液体又は半液体の溶液を含む吸収性ガーゼ層を形成することと、をさらに含む。この場合、皮膚パッチの吸収性ガーゼ層に溶液を付与する工程の前に吸収性ガーゼ層は局所免疫増感剤溶液を含まなかった。

＜実施例１＞
プラセボ対照第Ｉ相臨床試験では、口唇ヘルペスの発生頻度が高い患者においてＳＡＤＢＥが次の発症までの時間を延長させたことが示される。
〔方法〕
この探索的二重盲検無作為化プラセボ対照試験は、マサチューセッツ総合病院で２０１３年１１月から２０１５年９月の間に実施された。過去１２か月間に口唇ヘルペスを６回以上発症したと自己申告した１８歳から６９歳の健康成人は、最初の来院時に腕に局所感作用量投与を受け、その後、この感作投与後の少なくとも２週間後に起きた最初の２つの口唇ヘルペスのエピソードの間、病変に付与された局所治療用量投与を受けた。参加者は、ジメチルスルホキシド単独（プラセボ）、２．０％ＳＡＤＢＥ感作用量及び０．５％ＳＡＤＢＥ治療用量投与、又は２．０％ＳＡＤＢＥ感作用量、０．２％ＳＡＤＢＥ治療用量投与を受けるように１：１：１で無作為化された。試験はPartners Human Research Committeeの治験審査委員会で承認され、すべての参加者は書面によるインフォームドコンセントを提供した。（clinicaltrials.gov 識別番号ＮＣＴ０１９７１３８５）。

〔結果〕
５４名の患者が試験に登録された。４３名の患者が感作用量投与後に研究スタッフと少なくとも１つの形式で（直接又は電話で）コンタクトを取り、有効性データ分析に含まれた。分析されたデータには、９名の男性と３４名の女性が含まれる。

計画された主要エンドポイントの１つは、最後の治療用量投与から次の口唇ヘルペスの発症までの日数であった。しかしながら、感作のために２．０％ＳＡＤＢＥを投与された２８人の患者のうち１６人では新たな発症が見られず、引き続く治療用量投与を受けなかった。そのため、感作用量投与後の次の発症までの時間を分析した。感作後に最初の発症が起こらなかった患者からのデータは、入手可能であった最後の追跡日で打ち切り、Ｋａｐｌａｎ－Ｍｅｉｅｒのイベント発生時間（time-to-event）曲線を推測及びグラフ化した（図３）。プラセボ群のイベント発生時間の中央値は４０日であったのに対し、２．０％ＳＡＤＢＥ群では１２２日以上であり、この差は非常に有意であった（Ｐ＝０．００９）。ＳＡＤＢＥ感作用量投与に２４時間晒された後に１人の患者に発生した自己感作性皮膚炎を除いて、注目された唯一の他の有害事象は感作部位の掻痒と発赤であり、これは２．０％のＳＡＤＢＥの投与を受けた１３名の患者及びプラセボの投与を受けた２名の患者に見られた。

〔考察〕
本試験は、患者のＳＡＤＢＥによる感作が単純ヘルペスウイルスの発症予防に役立つ可能性があることを示唆している。我々の最初の仮説は、適切な免疫応答を達成するには活動性病変に対する治療が必要であるというものであったが、我々の結果は、この追加の工程は必要ない可能性があることを示唆している。全体として、ＳＡＤＢＥは患者の忍容性が良好であった（Palli et al.）。

＜実施例２＞
ＨＳＶ－１免疫コントロールと相関する免疫特性、及び口唇ヘルペスを頻繁に発症する被験者の免疫特性に対するスクアリン酸ジブチルエステルの効果
〔序論〕
口唇ヘルペス、及び単純ヘルペスウイルス１型（ＨＳＶ－１）の良好又は不良な免疫コントロール（すなわち、口唇ヘルペスのエピソード頻度）と相関する、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）による免疫遺伝子発現を含む免疫特性の差異、並びにこれらの特性がスクアリン酸ジブチルエステル（ＳＡＤＢＥ）の投与後にどのように変化するかを調査した。

〔方法〕
ＨＳＶ－１に対するＩｇＧが陽性で、頻繁に口唇ヘルペスを発症する人（過去１２か月間に６回以上のエピソードを自己申告）、まれに口唇ヘルペスを発症する人（過去１２か月間に１又は２回のエピソード）、又は過去１２か月間に口唇ヘルペスの発生がない人からＰＢＭＣを採取した。ＰＢＭＣを、ＨＳＶ－１及び真菌抗原（カンジダ）に対する増殖、並びにＨＳＶ－１及びカンジダの存在下での免疫遺伝子発現について試験した。採血後１日目に、頻繁に発症する被験者の腕にＤＭＳＯ中の２％ＳＡＤＢＥを１回局所投与し、２週間後と８週間後にＰＢＭＣを採取して検査した。

コットンスワブを１ｍｌバイアルの液体試験薬に浸し、次に上腕のワセリンで囲まれた直径約１０～１５ｍｍの領域の内側の部位に塗ることによって投与用量が付与された。付与後、当該部位をテガダーム（商標）ドレッシングで覆い、被験者は、３時間後にドレッシングを取り除き、湿った布で当該部位を拭き取るように伝えられた。試験薬のバイアルを立てた状態で、各被験者に投与する直前と直後に、バイアルの重量を測定した。その差は付与された薬剤の正味質量であった。ほとんどの場合、１０ｍｇから２０ｍｇの薬液が腕に塗布された。

〔結果〕
ＨＳＶ－１感染の免疫コントロールが良好な（発症が少ない）患者は、免疫コントロールがより不良な患者と比較して以下の点で異なっている。
（１）インビトロで、ＨＳＶ－１、ＨＳＶ－１感染細胞抽出物、及びカンジダの全体に対するＰＭＢＣ増殖が大きい（Ｐ＜０．０１）
（２）熱不活化ＨＳＶ－１ウイルスで刺激されたインビトロのＰＢＭＣにおいて、インターフェロンガンマ（ＩＦＮＧ）及び他の５つの免疫関連遺伝子の発現が高く（それぞれＰ＜０．０５）、インターロイキン５（ＩＬ５）及び他の２つの免疫関連遺伝子の発現が低い（それぞれＰ＜０．０５）。

頻繁に発症する被験者はＳＡＤＢＥで１回処置され、５６日後、これらの被験者のＰＢＭＣは、ＨＣＶ－１の免疫コントロールが良好な被験者と免疫コントロールが不良な被験者の差異として挙げたのとまったく同じように、同レベルの有意性で、１日目に処置前に採取された同じ被験者からのＰＢＭＣと異なっていた。しかしながら、前記１回の投与の２週間後には、これらの遺伝子発現又は増殖測定のほとんどすべてにおいて、ＰＢＭＣは１日目に回収されたＰＢＭＣと差がなかった。したがって、腕に局所的に付与されたＤＭＳＯ中の２％ＳＡＤＢＥの単回投与によって免疫系の変化が誘発されるまでに２週間以上８週間未満かかった。

〔結論〕
ＨＳＶ－１存在下でのＰＢＭＣによるインターフェロンガンマ（ＩＦＮＧ）の高発現とインターロイキン５（ＩＬ５）の低発現は、口唇ヘルペスの発症の減少と相関し、頻繁な口唇ヘルペスのエピソードを有する被験者の腕へのＤＭＳＯ中の２％ＳＡＤＢＥの単回局所投与は、特に、ＨＳＶ－１ウイルスの存在下でＰＢＭＣにおけるＩＦＮＧ発現を増加させＩＬ５発現を減少させることにより、ＨＳＶ－１に対する免疫応答を改善する（McTavish et al.）。

＜実施例３＞
反復性口唇ヘルペスの被験者の発症頻度を減少させるための単回投与スクアリン酸ジブチルエステル（ＳＡＤＢＥ）の第ＩＩ相多施設プラセボ対照試験
本試験は、治験審査委員会の承認と書面によるインフォームドコンセントの後、過去１２か月間に４回以上の口唇ヘルペスのエピソードを経験した被験者において５施設で実施された。被験者は、（１）１日目にＤＭＳＯ中の２％ＳＡＤＢＥの１回投与、（２）１日目に２％ＳＡＤＢＥ、及び２２日目に２回目の低用量投与（０．５％）の「ブースター」、又は（３）１日目と２２日目のジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）媒体のみのいずれかを受けるように無作為化された。すべての被験者は１年間追跡した。

盲検化された液体試験薬の１ｍｌバイアルにコットンスワブを浸し、次に上腕のワセリンで囲まれた直径約１０～１５ｍｍの領域の内側の部位に塗ることによって投与用量が付与された。付与後、当該部位をテガダーム（商標）ドレッシングで覆い、被験者は、３時間後にドレッシングを取り除き、湿った布で当該部位を拭き取るように伝えられた。試験薬のバイアルを立てた状態で、各被験者に投与する直前と直後に、そのバイアルの重量を測定した。その差は付与された薬剤の正味質量であった。ほとんどの場合、１０ｍｇから２０ｍｇの薬液が腕に付与された。

適格な被験者（ｎ＝１４０）が登録され、過去１２か月の発症数の中央値は６（平均＝７．８）であった。１回投与群は、４３日目から１２１日目まで、次の発症までの時間においてプラセボ群より優れていた（ｐ＝０．０２４）（図１）。４３日目～１２１日目の平均発生数：１回投与（０．２３１±０．１２５標準誤差）ｖｓ．プラセボ（０．６１０±０．０６８）（ｐ＝０．０１１）。４３日目～１２１日目に発症した被験者の割合：１回投与（９／３９＝２３％）ｖｓ．プラセボ（１９／４１＝４６％）（ｐ＝０．０３６）。１回投与のＳＡＤＢＥを投与した被験者では、４３日目～１２１日目の中等度又は重度の発症の平均数も減少した（（０．１２８±０．３３９）ｖｓ．プラセボ（０．３９０±０．７０３）（ｐ＝０．０４）。１日目～３６５日目の間でも同様であった（１回投与（０．６４１±０．９３１）ｖｓ．プラセボ（１．３４１±１．７６）（ｐ＝０．０４））。

特に、２回投与群はこれらの同じ測定項目においてプラセボよりも優れていたが有意ではなかった。１回投与が２回投与レジメンよりも優れている可能性がある理由については未調査であるが、低濃度での２回目の投与が１回目の投与の２％ＳＡＤＢＥを「寛容化」または下方制御すると仮説を立てている。

ＳＡＤＢＥ処置群で観察された最大の改善は、試験の４３日目～１２１日目の間に起こった。考えられる理由の１つは、ＳＡＤＢＥが免疫系に最大の効果を発揮するまでに約６週間かかり、１回目の投与後約３～４か月で効果が徐々に消失し始めることである。

最も一般的な有害事象の種類は投与部位反応で、いずれも軽度又は中等度であり、いずれも３か月以内に消失した。これは、高頻度の口唇ヘルペスにおける局所２％ＳＡＤＢＥの好ましいリスク－ベネフィットプロファイルを示唆している。

＜実施例４＞
ブタモデルへのＳＡＤＢＥ皮膚パッチの適用後の皮膚刺激性と残留薬剤レベルを評価するための非ＧＬＰ試験
American Preclinical Services試験番号：ＪＬＭ００１－ＰＨ５０
〔序論〕
ＳＡＤＢＥの経皮投与のため、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）中の２％（ｗ／ｖ）濃度のスクアリン酸ジブチルエステル（ＳＡＤＢＥ）を皮膚パッチに添加して、遅延型過敏反応又はその他の皮膚刺激性を試験し、異なる体積と曝露時間でＳＡＤＢＥがどの程度パッチから消失し、したがってどの程度皮膚に浸入すると推測されるか試験した。

この試験の目的の１つは、皮膚パッチから皮膚への薬剤溶出の時間経過を決定することであった。このために、パッチをブタの皮膚に適用し、１、３、６、又は２４時間後に除去し、抽出して、パッチに残っている残留ＳＡＤＢＥ薬剤の量を決定した。パッチに最初にロードされた量から減少しているＳＡＤＢＥは、ブタの皮膚に移行したと推測される。

さらなる目的は、投与後４週間にわたるブタの皮膚の紅斑及び浮腫を含む、即時及び遅延性の皮膚刺激性を評価することであった。

〔材料及び方法〕
皮膚パッチは、接着剤付きの３Ｍ９９１６ポリエステル不織布バッキング層と同様のポリマーバッキング層、３Ｍ９７３３ポリエステルフィルムラミネートバリア層、及びPrecision Fabrics Group 0700-00010ポリエステルガーゼ層で構成されていた。ガーゼをバリア層にヒートシールした。ガーゼパッチ面積は約３ｃｍ^２であった。

指定した時間にパッチをブタから取り外し、すぐにパッチのリザーバ部分を切り取り、１０ｍｌのＤＭＳＯを含む５０ｍｌチューブに入れた。
パッチを取り除いた直後に、キムワイプを使用してブタのパッチがあった場所をスワブで拭き、皮膚の表面上にあり皮膚に吸収されなかったＳＡＤＢＥの回収を試みた。キムワイプで拭いた後、キムワイプを１０ｍｌのＤＭＳＯを含む別の５０ｍｌチューブに入れた。

パッチ又はキムワイプを入れたＤＭＳＯのチューブを研究所に運び、２００ｒｐｍで１０分間振とうした後、各チューブからのＤＭＳＯを注射用バイアルに入れ、プログラムＳＡＤＢＥ３－５０μｌを使用したＣ１８カラムでのＨＰＬＣによってＳＡＤＢＥ含有量を分析した。このプログラムでは、ＳＡＤＢＥは約２４．０分で溶出し、２５５ｎｍで吸収されるため、２５５ｎｍでの２４．０分のピークの面積を使用してＳＡＤＢＥを定量化した。

ＨＰＬＣプログラムの詳細は次のとおりである。
このプログラムは、ＨＰＬＣではＳＡＤＢＥ３－５０μｌと呼ばれ、５０μｌが注入される。
カラム：ＵＳＰＬ１（ＯＤＳ）、２５０ｍｍ×４．６ｍｍ、５μｍ（Ｃ１８）
アジレント部品番号８８０９９５－９０２
移動相：Ａ：２５ｍＭＫＨ_２ＰＯ_４（ｐＨ５）（ｐＨ調整なし）
Ｂ：メタノール
流量：１．０ｍＬ／分
波長：２５５ｎｍ、２１５ｎｍ
温度：室温
注入量：５０μｌ
グラジエント溶出（表１）：

〔結果〕
２０１８年８月６日、パッチの最初のセットを３頭のブタに適用した。パッチはすべて、パッチ上で各ブタの胴体に巻かれた弾性包帯によってブタの所定の位置に保持された。結果を表２に示す。減少して皮膚内にあると推測されるＳＡＤＢＥの正味のＨＰＬＣ面積は、２０μｌ及び５０μｌのコントロールから予測される面積から、皮膚に適用された試験パッチから抽出されたＳＡＤＢＥの観察されたＨＰＬＣ面積を差し引いて計算される。

コントロールは、パッチのリザーバを１０ｍｌのＤＭＳＯに抽出するこの手順で、パッチからのＳＡＤＢＥの回収が完全であることを示している。

２週目：
ブタ４及び５のＳＡＤＢＥパッチテストを２０１８年８月１３日に行った。この場合、いずれのブタのパッチもテガダーム（商標）で覆い、一方のブタでは８月６日と同様にテガダーム（商標）をさらに弾性包帯で覆った。

パッチからの薬剤溶出のまとめと結論：
パッチから失われたＳＡＤＢＥの割合（％）、すなわち皮膚に移行したと推測されるＳＡＤＢＥの割合（％）をパッチごとに計算し、所定の体積（パッチにロードされた２％ＳＡＤＢＥ溶液の体積）及び時点（ブタにパッチが載せられていた時点）における結果を平均し、弾性包帯によってパッチがブタの所定の位置に保持されていたかどうかにより分類した。結果を以下の表４に示す。

パッチから皮膚へのＳＡＤＢＥ移行の結論：
弾性包帯は、皮膚への薬剤吸収を増加させた。
１～６時間の時点で、体積が多いほど薬剤移行の割合（％）が幾分又はわずかに低かった。しかしながら、ロードされた薬剤の皮膚への移行割合（％）は、皮膚へ移行した薬剤の絶対量よりも一貫していた。すなわち、体積が２０μｌから８０μｌへ４倍増加しても、移行した薬剤の割合（％）は４倍低くはならなかった。
６時間までに、弾性包帯ありで試験したすべてのロード体積において、ロードされた薬剤の８０％超が皮膚に移行した。２４時間までに、９５％超が皮膚に移行した。

皮膚刺激性
皮膚刺激性は、表５のようにスコア化された。

これは、各パッチ適用部位で４週間、週３回スコアリングされた。
パッチの適用後及び除去後のいずれの時点においても、いずれの薬剤適用部位にも浮腫がみられたブタはいなかった。したがって、以下のスコアは紅斑のみのものである。
個々のパッチ適用ごとの紅斑スコアを表６に示す。示されているスコアは、パッチ除去時の紅斑スコアであり、そして各パッチ部位について各週に取得した３つのスコアの最高値である。

表６に全体的に見られるように、紅斑スコアは２週目にピークに達し、４週目にはゼロとなった。これは表７に示されており、１、２、及び３週間における、すべてのパッチ、用量、及びパッチ除去時の曝露時間にわたる平均スコアを示している（これらの３週間の各週における各個体の最高スコアの平均）。この遅延型紅斑は遅延型過敏反応の特徴であり、ＳＡＤＢＥはヒトにおいて遅延型過敏反応を引き起こすことが知られている。

表８に示すように、投与体積が多く、パッチの着用時間が長いほど、紅斑スコアは高かった。紅斑スコアは、２０μｌから５０μｌにかけて大きく増加したが、５０μｌと比較して８０μｌの投与量ではさらなる増加はなかった。紅斑スコアの増加は、１時間曝露と比較して３時間曝露で劇的であったが、３時間と比較して６時間及び２４時間ではそれほど劇的ではなかった。

皮膚刺激性データのまとめ：
ブタは、紅斑が時間の経過とともに増加し、２週目にピークに達し、４週目までに消失するという遅延型過敏症反応の特徴を有する皮膚刺激性を示した。パッチ適用部位に浮腫を有するブタはいなかった。紅斑は用量及び曝露時間に依存していた。

＜実施例５＞
モルモットモデルにおける非ＧＬＰのＳＡＤＢＥ皮膚パッチの用量範囲、皮膚刺激性及び毒性評価
〔目的／目標〕
この非ＧＬＰ試験の目的は、投与部位刺激性、並びに、体重、群の食物消費量、臨床観察、終了前の臨床病理、肉眼的及び組織病理などの毒性エンドポイントについて、皮膚パッチを介して送達された様々な濃度のＳＡＤＢＥの効果を評価することであった。

〔試験物質〕
・スクアリン酸ジブチルエステル（ＳＡＤＢＥ）（２％、６％、１８％、皮膚パッチ）
・皮膚パッチ（正方形４．５×４．５ｃｍ）は以下からなる：
－ 3M Medical Tape 9916（３Ｍ社、米国ミネソタ州セントポール）（２．２ｏｚ／ｙｄ^２（６２ｇ／ｍ^２）１００％ポリエステルタンスパンレース不織布、感圧性アクリレート接着剤付き）のバッキング層
－３Ｍ９７３３ポリエステルフィルムのバリア層
－ Precision Fabrics PFG 0700-00010ポリエステルのガーゼパッチ、面積約３ｃｍ^２。ガーゼパッチ領域は直径０．６７インチ（１．７ｃｍ）（面積２．２７ｃｍ^２）の円形で、外周が下のバリア層に音波溶着されているため、音波溶着されていないガーゼ領域のより吸収性の高い中央部分は直径０．５５インチ（１．４ｃｍ）（面積１．５３ｃｍ^２）である。
－４０ｌｂのペーパーシリコーンライナー（スプリットライナー）

〔方法〕
この非ＧＬＰ試験では３０匹のモルモット（雌１５匹及び雄１５匹）を使用した。投与前及び投与後（２、６、又は１８％のＳＡＤＢＥ薬液２０μｌをロードした皮膚パッチ）の体重、群の食物消費量、並びに投与部位の紅斑、痂皮形成、及び浮腫のＤｒａｉｚｅスコアを記録した。ＳＡＤＢＥをロードした皮膚パッチを動物に適用し、約１２時間±１時間放置した。約１２時間の投与期間の後、Ｄｒａｉｚｅスコアリングによってパッチ部位を評価した。この期間中、毎週の体重と毎週の群の食物消費量を介して、投与後及び試験期間中毎日、毒性の徴候について動物を観察した。２８日間の評価期間の後、再チャレンジを実施し、２つ目のパッチ（誘導段階では処置されなかった）を適用し、Ｄｒａｉｚｅスコアリングによって評価した。

生存期間の終わりに、標準的な血液学及び血清化学分析のために血液を採取し、動物を人道的に安楽死させた。さらなる組織病理学的評価のために、２回目の投与部位及び頸部リンパ節を剖検で採取した。投与部位を外植し、固定し、埋設した。投与部位を組織学的に調べ、細胞型の存在及び組織反応の評価を行った。

〔結果〕
モルモットの皮膚への皮膚パッチによるＳＡＤＢＥの皮膚適用は、試験したいずれの用量でも体重や食物消費量に有意な影響を与えなかった。

２％ＳＡＤＢＥの１回目の皮膚ＳＡＤＢＥパッチ適用はわずかな刺激性を示した。２％での再チャレンジは中等度の刺激性を示した。６％ＳＡＤＢＥの１回目の皮膚ＳＡＤＢＥパッチの適用は中等度の刺激性を示した。６％での再チャレンジは中等度の刺激性を示した。１８％ＳＡＤＢＥの１回目の皮膚ＳＡＤＢＥパッチの適用は重度の刺激性を示した。１８％での再チャレンジは中等度の刺激性を示した。

すべての用量で、主にリンパ球、形質細胞、及びマクロファージで構成される炎症細胞の、多発性のまれ～軽度の浸潤の存在が観察され、投与部位内に蓄積されていた。さらに、軽度～中等度の角化症、最小の多発性壊死、及び脂肪浸潤がすべてのＳＡＤＢＥ処置部位で観察された。２～６％とは異なり、１８％のＳＡＤＢＥでは、最小の多発性壊死、中程度に厚い線維性結合組織の束、及び多発性の軽度の血管新生が処置部位で観察され、これは毒性効果である可能性がある。すべてのＳＡＤＢＥ処置群の両方の動物の頸部及び鼠径部のリンパ節切片は、正常範囲内であった。

ＳＡＤＢＥをロードしたパッチの生物学的分析では、ＳＡＤＢＥが動物の皮膚に晒されていない場合、ＳＡＤＢＥがパッチ内で１２時間を超えて安定であり、明らかなＳＡＤＢＥの損失やＳＡＤＢＥの分解生成物であるＳＡＭＢＥへの変換がないことが示された。動物の皮膚に１２時間晒した後のパッチの分析では、ＳＡＤＢＥの大部分がパッチから失われ、モルモットの皮膚に入ったと推測された。

皮膚刺激性及び遅延型過敏反応
試験部位での皮膚刺激性を観察し、紅斑及び痂皮、並びに浮腫の両方について、Ｄｒａｉｚｅスケールで試験中毎日スコアリングした。それぞれのスケールは表９及び表１０に示され、それぞれ０～４のスケールである。紅斑及び痂皮、並びに浮腫の累積スコアが一次刺激性指数スコアであり、したがって０～８のスケールとなる。

試験物質ＳＡＤＢＥ（ＤＭＳＯ中２％、６％、及び１８％）がモルモットにおいて皮膚刺激性及び感受性に及ぼす影響を評価するために、Ｄｒａｉｚｅスコアリングシステムを使用して、紅斑反応及び痂皮反応並びに浮腫の投与部位評価を行った。試験物質（２０μｌ）を皮膚パッチにロードし、剃毛したモルモットの皮膚に１２時間適用した（誘導段階）。１回目の投与部位の評価は適用後３０日間行った。２回目の用量を適用し、投与部位の評価も約５週間行った（チャレンジ段階）。

各試験物質用量の一次刺激性指数（ｐＩＩ）を計算し、刺激性を評価した。一次刺激性指数（ｐＩＩ）は、一次刺激性スコアの平均である。一次刺激性スコアは、紅斑／痂皮スコアと浮腫スコアの合計であり、最大の刺激性は８となる。試験期間中の各試験物質用量の毎日の一次刺激性指数（ｐＩＩ）を算出した（図４）。ｐＩＩを使用して、試験物質による処置を、無視できる～刺激性なし（０～０．９）、わずか（０．９～１．９）、中等度（２～４．９）、又は重度（５～８）の刺激性に分類する。このスケールでは、２％ＳＡＤＢＥは１回目の投与後にわずかに刺激性を示し、２回目の投与後に中等度の刺激性を示した。６％ＳＡＤＢＥはいずれの投与後も中等度の刺激性を示した。１８％では１回目の投与で重度の刺激性を示し、２回目の投与では中等度の刺激性を示した（図４）。

誘導時、２８日間の観察期間中、試験したＳＡＤＢＥの最低用量である２％ＳＡＤＢＥは、剃毛したモルモットの皮膚に、約１７日間持続するわずかな皮膚刺激性を示した。同じモルモットの未投与部位に２％ＳＡＤＢＥを再チャレンジすると、皮膚刺激性は軽度～中等度のレベルに達し、約５日間持続し、皮膚適用後約９日で刺激性なしのレベルに戻った。

誘導時、２８日間の観察期間中、６％ＳＡＤＢＥは、約１８日間持続する中等度の皮膚刺激性を示し、約２３日までにはわずかな刺激性～刺激性なしのレベルに戻った。同じモルモットの未投与部位に６％ＳＡＤＢＥを再チャレンジすると、皮膚刺激性は中等度のレベルに達し、約５日でピークに達し、皮膚適用後約１４日で刺激性なしのレベルに戻った。

誘導時、２８日間の観察期間中、試験されたＳＡＤＢＥの最高濃度である１８％ＳＡＤＢＥは、剃毛したモルモットの皮膚に、約２１日間持続する中等度～重度の皮膚刺激性を示し、投与後約２７日までにはわずかな刺激性及び刺激性なしのレベルに戻った。同じモルモットの未投与部位に１８％ＳＡＤＢＥを再チャレンジすると、皮膚刺激性は中等度のレベルに達し、約８日でピークに達し、皮膚適用後約１９日で刺激性なしのレベルに戻った。

（動物の健康に関する結果）
要約すると、体重、食物消費量、臨床モニタリング、及び臨床病理を評価した。試験中、試験物質の皮膚適用後のいずれの時点においても、いずれの用量でも、モルモットの体重は影響を受けなかった。食物消費量も、試験中、試験物質の皮膚適用後のいずれの時点においても影響を受けなかった。臨床モニタリング観察においても顕著な以上は観察されなかった。

（組織病理結果）
試験病理学者により、光学顕微鏡を用いてすべての組織サンプルの組織学スライドを調べた。

雌の処置皮膚部位（群１；２％ＳＡＤＢＥパッチ）：
５つの処置皮膚部位をスコアリングした。主に真皮のリンパ球及びマクロファージで構成された炎症細胞の多発性のまれ～軽度の浸潤がみられた。壊死、血管新生、線維症及び脂肪浸潤は認められなかった。
すべての動物の腋窩及び鼠径リンパ節切片は、正常範囲内であった。
動物番号１１８０３７では、斑状の暗赤色変色の肉眼的剖検所見と相関する、腸間膜リンパ節の皮髄領域における軽度の多発性出血がみられた。

雄の処置皮膚部位（群１；２％ＳＡＤＢＥパッチ）：
５つの処置皮膚部位をスコアリングした。主に真皮のマクロファージで構成された炎症細胞の多発性のまれな浸潤がみられた。壊死、血管新生、線維症及び脂肪浸潤は認められなかった。
動物番号１１６０５０の右腋窩リンパ節の皮質に、暗赤色変色の肉眼的剖検所見と相関する軽度の多発性出血があった。残りの動物の腋窩及び鼠径リンパ節切片は正常範囲内であった。

雌の処置皮膚部位（群２；６％ＳＡＤＢＥパッチ）：
５つの処置皮膚部位をスコアリングした。主に真皮のリンパ球、形質細胞、及びマクロファージから構成される炎症細胞の多発性のまれ～軽度の浸潤がみられた。動物番号１１７３５６、１１７３５３、及び１１７３６７では、狭い線維性結合の束が認められた。壊死、血管新生及び脂肪浸潤は認められなかった。
動物番号１１７３５６の右腋窩リンパ節の髄質に、暗赤色変色の肉眼的剖検所見と相関する軽度の多発性出血があった。残りの動物の腋窩及び鼠径リンパ節切片は正常範囲内であった。動物番号１１８８４９では、腸間膜リンパ節の皮質髄質領域に、斑状の暗赤色変色の肉眼的剖検所見と相関する軽度の多発性出血があった。

雄の処置皮膚部位（群２；６％ＳＡＤＢＥパッチ）：
５つの処置皮膚部位をスコアリングした。主に真皮の形質細胞とマクロファージから構成される炎症細胞の多発性のまれ～軽度の浸潤がみられた。壊死、血管新生、線維症及び脂肪浸潤は認められなかった。
動物番号１１６１０５の右鼠径リンパ節の皮質に、暗赤色変色の肉眼的剖検所見と相関する軽度の多発性出血があった。残りの動物の腋窩及び鼠径リンパ節切片は正常範囲内であった。

雌の処置皮膚部位（群３；１８％ＳＡＤＢＥパッチ）：
５つの処置皮膚部位をスコアリングした。主に真皮のリンパ球、形質細胞、及びマクロファージから構成される炎症細胞の多発性のまれ～軽度の浸潤がみられた。動物番号１１９０６９では、中程度に厚い線維性結合の束が認められた。最小の多発性壊死及び血管新生が認められた。脂肪浸潤は認められなかった。
すべての動物の腋窩及び鼠径リンパ節切片は、正常範囲内であった。

雄の処置皮膚部位（群３；１８％ＳＡＤＢＥパッチ）：
５つの処置皮膚部位をスコアリングした。主に真皮のリンパ球、形質細胞、及びマクロファージからなる炎症細胞のまれ～重度の浸潤がみられた。動物番号１１６１０２、１１６０４８及び１１７９０６では、狭い～中程度に太い線維性結合の束が認められた。最小の多発性壊死及び軽度の多発性血管新生が認められた。脂肪浸潤は認められなかった。
動物番号１１６０４８の右及び左腋窩リンパ節の皮質に、暗赤色変色の肉眼的剖検所見と相関する軽度の多発性出血がみられた。残りの動物の腋窩及び鼠径リンパ節切片は正常範囲内であった。

＜生物分析結果＞
American Preclinical Services試験番号：ＪＬＭ００２－ＰＨ００
〔序論〕
ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）中の２％（ｗ／ｖ）濃度のスクアリン酸ジブチルエステル（ＳＡＤＢＥ）を、ＳＡＤＢＥの皮膚投与のための皮膚パッチに添加し、遅延型過敏反応又はその他の皮膚刺激性を試験した。Ｓｑｕａｒｅｘの研究所で、ＳＡＤＢＥ含有量の分析、ＡＰＳにより調製された投与製剤の分析、適用期間中の皮膚パッチ中の試験物質の安定性の決定、及び動物に１２時間適用した後の皮膚パッチ中の残留ＳＡＤＢＥの試験のため、ＨＰＬＣ分析を実施した。

〔材料及び方法〕
皮膚パッチは、接着剤付きの３Ｍ９９１６ポリエステル不織布バッキング層と同様のポリマーバッキング層、３Ｍ９７３３ポリエステルフィルムラミネートバリア層、及びPrecision Fabrics Group 0700-00010ポリエステルガーゼ層で構成されていた。ガーゼをバリア層にヒートシールした。ガーゼパッチ面積は１．５３ｃｍ^２であった。

指定した時間にパッチをブタから取り外し、すぐにパッチのリザーバ部分を切り取り、１０ｍｌのＤＭＳＯを含む５０ｍｌチューブに入れた。

パッチを入れたＤＭＳＯのチューブをＳｑｕａｒｅｘ研究所に運び、２００ｒｐｍで１時間以上振とうした後、各チューブからのＤＭＳＯを注射用バイアルに入れ、プログラムＳＡＤＢＥ３－５０μｌを使用したＣ１８カラムでのＨＰＬＣによってＳＡＤＢＥ含有量を分析した。このプログラムでは、ＳＡＤＢＥは約２４．０分で溶出し、２５５ｎｍで吸収されるため、２５５ｎｍでの２４．０分のピークの面積を使用してＳＡＤＢＥを定量化した。ＳＡＤＢＥ分解生成物であるスクアリン酸モノブチルエステル（ＳＡＭＢＥ）も、１２．７分の溶出時間における２５５ｎｍの曲線下面積によって定量化した。

ＨＰＬＣプログラムの詳細は次のとおりである。
このプログラムは、ＨＰＬＣではＳＡＤＢＥ３－５０μｌと呼ばれ、５０μｌが注入される。
カラム：ＵＳＰＬ１（ＯＤＳ）、２５０ｍｍ×４．６ｍｍ、５μｍ（Ｃ１８）
アジレント部品番号８８０９９５－９０２
移動相：Ａ：２５ｍＭＫＨ_２ＰＯ_４（ｐＨ５）（ｐＨ調整なし）
Ｂ：メタノール
流量：１．０ｍＬ／分
波長：２５５ｎｍ、２１５ｎｍ
温度：室温
注入量：５０μｌ
グラジエント溶出（表１１）：

〔結果〕
表１２は、ＡＰＳにより調製されたバイアルの試験物質分析を示す。ＤＭＳＯに溶解した２％、６％、及び１８％のＳＡＤＢＥの試験物質バイアルは仕様に適合しており、調製後２４時間においてＳＡＤＢＥの予測された濃度を示した。

表１３は、２％、６％、又は１８％のＳＡＤＢＥを２０μｌロードし、ガーゼ側を上にして空気中に１２～２４時間放置したパッチの分析を示す。結果は、動物の皮膚に晒されていない場合、ＳＡＤＢＥがパッチ内で１２時間超安定していることを示した。明らかなＳＡＤＢＥの損失又はＳＡＤＢＥのＳＡＭＢＥへの変換はなかった。

表１４は、付与された各ＳＡＤＢＥ割合（％）について１０匹の動物の１０個のパッチの平均として、モルモットの上で１２時間後に回収されたパッチ中の残留ＳＡＤＢＥ及びＳＡＭＢＥ分解産物の量を示す。

結果は、２％パッチでは当初のＳＡＤＢＥの２％未満がパッチに残存し、失われたＳＡＤＢＥのうち１２％のみがパッチに残存したＳＡＭＢＥ分解産物として検出されたことを示した。そのため、ほぼすべてのＳＡＤＢＥがモルモットの皮膚に移行したようである。

６％のパッチでは、平均してＳＡＤＢＥの１１％がパッチに残存し、１８％のパッチでは、平均してＳＡＤＢＥの３４％がパッチに残存した。そのため、ＳＡＤＢＥ濃度が増加するにつれて、皮膚への移行効率は低下したが、それでもほとんどのＳＡＤＢＥはパッチから失われ、１８％ＳＡＤＢＥパッチを使用した場合でも皮膚に移行したと推測される。

〔結論〕
いずれの用量でも、投与後及び試験期間を通して毎日、全身毒性の徴候は観察されなかったが、ある程度の皮膚毒性が観察された。皮膚刺激性の一次刺激性指数（ｐＩＩ）によりスコアリングされたように、試験されたＳＡＤＢＥの最低濃度（２％）は、１回目の投与後（数日遅れて）わずかな刺激性を示し、再チャレンジ時に中等度の刺激性を示した。試験された最高濃度（１８％）は、１回目の投与後に重度の刺激性を示し、再チャレンジ後に中等度の刺激性を示した。ＳＡＤＢＥは２～１８％でモルモットの皮膚刺激性を示したため、皮膚刺激性物質かつ皮膚感作性物質である。

＜実施例６＞
ゲッティンゲンミニブタモデルにおける非ＧＬＰのＳＡＤＢＥ皮膚パッチの用量範囲、皮膚刺激性及び毒性評価
〔目的／目標〕
この非ＧＬＰ試験の目的は、投与部位刺激性、並びに、体重、群の食物消費量、臨床観察、終了前の臨床病理、肉眼的及び組織病理などの毒性エンドポイントについて、皮膚パッチを介して送達された様々な濃度のＳＡＤＢＥの効果を評価することであった。

〔試験物質〕
・スクアリン酸ジブチルエステル（ＳＡＤＢＥ）（ＤＭＳＯ中の２％、６％、１８％溶液、皮膚パッチ）
・皮膚パッチ（正方形４．５×４．５ｃｍ）は以下からなる：
－ 3M Medical Tape 9916（３Ｍ社、米国ミネソタ州セントポール）（２．２ｏｚ／ｙｄ^２（６２ｇ／ｍ^２）１００％ポリエステルタンスパンレース不織布、感圧性アクリレート接着剤付き）のバッキング層
－３Ｍ９７３３ポリエステルフィルムのバリア層
－ Precision Fabrics PFG 0700-00010ポリエステルのガーゼパッチ、面積約３ｃｍ^２。ガーゼパッチ領域は直径０．６７インチ（１．７ｃｍ）（面積２．２７ｃｍ^２）の円形で、外周が下のバリア層に音波溶着されているため、音波溶着されていないガーゼ領域のより吸収性の高い中央部分は直径０．５５インチ（１．４ｃｍ）（面積１．５３ｃｍ^２）である。
－４０ｌｂのペーパーシリコーンライナー（スプリットライナー）

〔方法〕
この非ＧＬＰ試験では合計６匹のゲッティンゲンミニブタ（雌３匹及び雄３匹）を使用した。投与前に、ベースライン体重、群の食物消費量、並びに、将来の投与部位での紅斑及び痂皮形成並びに浮腫のＤｒａｉｚｅスコアリング（表１及び表２を参照）を記録した。２、６、又は１８％ＳＡＤＢＥ薬液２０μｌをロードした皮膚パッチ（動物１匹あたり１パッチ）を動物に適用し、約１２時間そのまま放置した。約１２時間の投薬期間の後、実施例５と同様に、週５回、２１日間、Ｄｒａｉｚｅスコアリングによってパッチ部位を評価した。この期間中、毎週の体重と毎週の群の食物消費量を介して、投与後及び試験期間中毎日、毒性の徴候について動物を観察した。２５日間の評価期間の後、動物に再チャレンジを実施し、２回目の投与及び評価段階を３０日間行った。生存期間の終わりに、動物を人道的に安楽死させ、完全な剖検を行った。適用後に、パッチ調製に用いられた試験物質バイアル及びミニブタに晒したパッチを回収し、Ｓｑｕａｒｅｘ研究所でＨＰＬＣを使用してＳＡＤＢＥ含有量及びＳＡＤＢＥ分解生成物のスクアリン酸モノブチルエステル（ＳＡＭＢＥ）を測定した。
投与部位を外植し、固定し、埋設した。投与部位を組織学的に調べ、細胞型の存在及び組織反応の評価を行った。

〔結果〕
ミニブタ皮膚への皮膚パッチを介したＳＡＤＢＥの付与は、いずれの用量でも体重や食物消費量に有意な影響を及ぼさず、このことは試験物質が重大な全身毒性を誘発しなかったことを示唆している。動物は、投与後及び試験期間を通して毎日、顕著な毒性の徴候を示さなかった。

皮膚パッチを介してミニブタの皮膚に付与された２％ＳＡＤＢＥの１回目のパッチ適用は、中等度の刺激性を示した。２％での再チャレンジは中等度～重度の刺激性を示した。

皮膚パッチを介してミニブタの皮膚に適用された６％ＳＡＤＢＥの１回目のパッチ適用は、中等度の刺激性を示した。６％での再チャレンジは中等度～重度の刺激性を示した。

皮膚パッチを介してミニブタの皮膚に適用された１８％ＳＡＤＢＥの１回目のパッチ適用は、中等度～重度の刺激性を示した。１８％での再チャレンジは、重度の刺激性を示した。

試験したすべての用量（２～１８％）で、ＳＡＤＢＥは１回目の投与で中等度の刺激性を示し、ミニブタの皮膚で皮膚刺激性を示した。試験されたＳＡＤＢＥの最高濃度（１８％）は、２回目の投与による再チャレンジで重度の刺激性を示した。したがって、ＳＡＤＢＥは皮膚刺激性物質かつ感作物質である。

すべての用量で、主にリンパ球、形質細胞、及びマクロファージで構成される炎症細胞の多発性でまれ～軽度の浸潤が、投与部位の真皮に観察された。さらに、軽度～中等度の角化症、最小の多発性壊死、及び脂肪浸潤がすべてのＳＡＤＢＥ処置部位で観察された。血管新生及び線維症は、検査したいずれの組織切片にも認められなかった。

すべてのＳＡＤＢＥ処置群の両方の動物の頸部及び鼠径部のリンパ節切片は、正常範囲内であった。

ＳＡＤＢＥをロードしたパッチの生物分析は、ＳＡＤＢＥが動物の皮膚に晒されていない場合、ＳＡＤＢＥがパッチ内で１２時間を超えて安定であり、明らかなＳＡＤＢＥの損失やＳＡＤＢＥの分解生成物であるＳＡＭＢＥへの変換がないことを示した。ＳＡＤＢＥはミニブタに適用されたパッチから失われたため、ミニブタの皮膚に入ったと推測される。

皮膚刺激性及び遅延型過敏反応
試験部位での皮膚刺激性を観察し、紅斑及び痂皮、並びに浮腫の両方について、Ｄｒａｉｚｅスケールで試験中毎日スコアリングした。それぞれのスケールは実施例５の表９及び表１０に示され、それぞれ０～４のスケールである。紅斑及び痂皮、並びに浮腫の累積スコアが一次刺激性指数スコアであり、したがって０～８のスケールとなる。

試験期間中の各試験物質用量の一次刺激性指数（ｐＩＩ）を計算した（図５）。ｐＩＩは、試験物質による処置を、無視できる～刺激性なし（０～０．９）、わずか（０．９～１．９）、中等度（２～４．９）、又は重度（５～８）の刺激性に分類する。このスケールでは、２％ＳＡＤＢＥは１回目の投与後に中等度の刺激性を示し（ｐＩＩ：約３．５）、２回目の投与後に中等度～重度の刺激性を示した（ｐＩＩ：一時的に５でピークに達した）。６％ＳＡＤＢＥでは１回目の投与後に中等度の刺激性レベルに達し（ｐＩＩ：約３．０～４．０）、２回目の投与後に中等度～重度の刺激性を示した（ｐＩＩ：一時的に５．５でピークに達した）。１８％のＳＡＤＢＥは、１回目の投与では中等度～重度の刺激性を示し（ｐＩＩ：約５．０）で、２回目の投与では重度の刺激性を示した（ｐＩＩ：約６）。

誘導時、２５日間の観察期間中、試験したＳＡＤＢＥの最低用量である２％ＳＡＤＢＥは、剃毛したミニブタの皮膚に、約１５日間持続する中等度の皮膚刺激性を示した。同じミニブタの未投与部位に２％ＳＡＤＢＥで再チャレンジすると、重度の皮膚刺激性が観察され、約１～２日持続して中等度のレベルに戻り、これは約１７日間持続し、皮膚適用後約２２日後に刺激性なしのレベルに戻った。

誘導時、２８日間の観察期間中、６％ＳＡＤＢＥも、剃毛したミニブタの皮膚に、約２１日間持続する中等度の皮膚刺激性を示した。同じミニブタの未投与部位に６％ＳＡＤＢＥで再チャレンジすると、重度の皮膚刺激性が観察され、１日持続して中等度に戻り、これは約１９日間持続し、皮膚適用後約２２日後に刺激性なしのレベルに戻った。

誘導時、２８日間の観察期間中、試験されたＳＡＤＢＥの最高濃度である１８％ＳＡＤＢＥは、剃毛したミニブタの皮膚に、約２２日間持続する中等度～重度の皮膚刺激性を示した。同じミニブタの未投与部位に１８％ＳＡＤＢＥで再チャレンジすると、重度の皮膚刺激性が観察され、５日間持続して中等度に戻り、これは約２４日間持続し、皮膚適用後約２６日後に刺激性なしのレベルに戻った。

（動物の健康に関する結果）
要約すると、体重、食物消費量、臨床モニタリング、及び臨床病理が評価された。いずれの評価でも、動物はＳＡＤＢＥの付与による重大な毒性を経験していないことが示唆された。

（肉眼的剖検結果）
剖検では異常は認められなかった。

（組織病理結果）
すべての動物からの頚部及び鼠径リンパ節切片は正常範囲内であった。
対照（未処置）部位がないものについては試験物質の相対スコアは計算しなかった。
研究病理学者により、光学顕微鏡を用いて組織サンプルの組織学スライド（Ｈ＆Ｅ）を検査した。２％及び６％のＳＡＤＢＥを投与した動物の処置された皮膚部位では、主に真皮のリンパ球、形質細胞、及びマクロファージで構成される炎症細胞の多発性のまれ～軽度の浸潤が明らかになった。しかしながら、１８％ＳＡＤＢＥでは、処理された皮膚部位は、主に真皮のリンパ球、形質細胞、及びマクロファージで構成される炎症細胞の軽度～重度の多発性浸潤が明らかになった。検査したすべての切片に軽度～中等度の角化症がみられた。すべての動物の頸部及び鼠径部のリンパ節切片は、いずれの用量でも正常範囲内であった。

＜分析結果＞
American Preclinical Services試験番号：ＪＬＭ００３－ＰＨ００
〔序論〕
ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）中の２％（ｗ／ｖ）濃度のスクアリン酸ジブチルエステル（ＳＡＤＢＥ）を、ＳＡＤＢＥの皮膚投与のための皮膚パッチに添加し、遅延型過敏反応又はその他の皮膚刺激性を試験した。Ｓｑｕａｒｅｘ研究所で、ＳＡＤＢＥ含有量の分析、ＡＰＳにより調製された投与製剤の分析、適用期間中の皮膚パッチ中の試験物質の安定性の決定、及び動物に１２時間適用した後の皮膚パッチ中の残留ＳＡＤＢＥの試験のため、ＨＰＬＣ分析を実施した。

パッチを入れたＤＭＳＯのチューブをＳｑｕａｒｅｘ研究所に運び、２００ｒｐｍで３０分間～一晩振とうした後、各チューブからのＤＭＳＯを注射用バイアルに入れ、プログラムＳＡＤＢＥ３－５０μｌを使用したＣ１８カラムでのＨＰＬＣによってＳＡＤＢＥ含有量を分析した。このプログラムでは、ＳＡＤＢＥは約２４．０分で溶出し、２５５ｎｍで吸収されるため、２５５ｎｍでの２４．０分のピークの面積を使用してＳＡＤＢＥを定量化した。ＳＡＤＢＥ分解生成物であるスクアリン酸モノブチルエステル（ＳＡＭＢＥ）も、１２．７分の溶出時間における２５５ｎｍの曲線下面積によって定量化した。

ＨＰＬＣプログラムの詳細は次のとおりである。
このプログラムは、ＨＰＬＣではＳＡＤＢＥ３－５０μｌと呼ばれ、５０μｌが注入される。
カラム：ＵＳＰＬ１（ＯＤＳ）、２５０ｍｍ×４．６ｍｍ、５μｍ（Ｃ１８）
アジレント部品番号８８０９９５－９０２
移動相：Ａ：２５ｍＭＫＨ_２ＰＯ_４（ｐＨ５）（ｐＨ調整なし）
Ｂ：メタノール
流量：１．０ｍＬ／分
波長：２５５ｎｍ、２１５ｎｍ
温度：室温
注入量：５０μｌ
グラジエント溶出（表１５）：

〔結果〕
表１６は、ＡＰＳにより調製されたバイアルの試験物質分析を示す。ＤＭＳＯに溶解した２％、６％、及び１８％のＳＡＤＢＥの試験物質バイアルは仕様に適合しており、調製後２４時間においてＳＡＤＢＥの予測された濃度を示した。

表１７は、２％又は６％のＳＡＤＢＥを２０μｌロードし、ガーゼ側を上にして空気中に１２～２４時間放置したパッチの分析を示す。結果は、動物の皮膚に晒されていない場合、ＳＡＤＢＥがパッチ内で１２時間超安定していることを示した。明らかなＳＡＤＢＥの損失又はＳＡＤＢＥのＳＡＭＢＥへの変換はなかった。

表１８は、ミニブタで１２時間後に回集されたパッチ中の残存ＳＡＤＢＥ及びＳＡＭＢＥ分解生成物の量を示す。

結果は、２％パッチでは当初のＳＡＤＢＥの約１１％がパッチに残存し、当初のＳＡＤＢＥの１％未満がパッチ上に残存するＳＡＭＢＥ分解生成物として検出されたことを示している。したがって、ＳＡＤＢＥの約８９％がミニブタの皮膚に移行したようである。
６％及び１８％のパッチでは、当初のＳＡＤＢＥ量に対するパッチに残存する割合が増加していた。６％のパッチでは、当初のＳＡＤＢＥの３５％がパッチに残存した。１８％のパッチでは、当初のＳＡＤＢＥの６５％がパッチに残存していた。したがって、６％パッチではＳＡＤＢＥの大部分がパッチから離れ、１８％パッチではパッチから離れたのは約１／３であったが、それでもパッチから失われたＳＡＤＢＥの絶対量は増加していたため、失われて皮膚に移行したと推測される量はパッチにロードされた濃度に比例する程度を下回っていたものの、パッチにロードされたＳＡＤＢＥの皮膚に入った濃度は増加していたと推測される。

〔結論〕
いずれの用量でも、投与後及び試験期間を通して毎日、全身毒性の徴候は観察されなかったが、皮膚毒性が観察された。

皮膚刺激性の一次刺激性指数（ｐＩＩ）によりスコアリングされたように、試験されたＳＡＤＢＥのすべての濃度（２～１８％）で、１回目の投与後に（数日遅れて）中等度の刺激性がみられ、再チャレンジ時に中等度～重度の刺激性がみられた。試験された最高濃度（１８％）では、１回目の投与後に中等度の刺激性がみられ、再チャレンジ後に重度の刺激性がみられた。ＳＡＤＢＥは２～１８％でミニブタの皮膚刺激性を示したため、皮膚刺激性物質かつ皮膚感作性物質である。

＜実施例７＞
ＤＭＳＯを充填した皮膚パッチとガラススワブのキット
James Alexander社（米国ニュージャージー州ブレアーズタウン）より０．６ｍｌのＤＭＳＯが充填された０．６ｍｌのガラススワブを購入した。ガラススワブは、図２に示されるように、密閉ガラスアンプル（長さ４５ｍｍ、内径５ｍｍ）、上部が平らなポリオレフィン製スワブ（高さ１０ｍｍ）が付属したものであり、酢酸酪酸セルロースバリア層で包まれ、取り外し可能な厚紙スリーブが付属したものであった。

Ｉｎｎｏｖｉｚｅ社（米国ミネソタ州バドネハイツ）から２つのデザインのカスタムメイドの皮膚パッチを購入した。皮膚パッチは図１に示されるように以下の要素が付属したものであった。
・皮膚パッチ（４．５×４．５ｃｍの四角）は以下からなる：
－ 3M Medical Tape 9916（３Ｍ社、米国ミネソタ州セントポール）（２．２ｏｚ／ｙｄ^２（６２ｇ／ｍ^２）１００％ポリエステルタンスパンレース不織布、感圧性アクリレート接着剤付き）のバッキング層
－３Ｍ９７３３ポリエステルフィルムのバリア層
－ Precision Fabrics PFG 0700-00010ポリエステルのガーゼパッチ、面積約３ｃｍ^２。ガーゼパッチ領域は直径０．６７インチ（１．７ｃｍ）（面積２．２７ｃｍ^２）の円形で、外周が下のバリア層に音波溶着されているため、音波溶着されていないガーゼ領域のより吸収性の高い中央部分は直径０．５５インチ（１．４ｃｍ)（面積１．５３ｃｍ^２）である。
－４０ｌｂのペーパーシリコーンライナー（スプリットライナー）

２つ目のオプションの皮膚パッチは、ガーゼがPrecision Fabrics Group PFG 0700-00010からなるものである以外は同じである。

発明者はバイアルを手で押しつぶし、傾けて軽く１回絞った後、重力にまかせた。１分も経たないうちにフォームチップが湿り、チップで皮膚パッチのガーゼに軽くたたいたり拭いたりすると、パッチを濡らし始めうる状態となった。発明者は、ガーゼの面積の約９０％超が視覚的に濡れるまで、フォームチップをガーゼに軽くたたいた。ＤＭＳＯを添加する直前とＤＭＳＯを添加した直後にパッチの重量を量り、付与されたＤＭＳＯの正味重量を得た。

ガーゼ０７００－０００１０。９０％濡らすために３８．６ｍｇ（１０％程度はまだ乾燥スポット）。１００％濡らすために４１．４ｍｇ。軽くたたく方法でできるだけ濡らすためには５２ｍｇ。

別の０７００－０００１０パッチで２回目の実施。完全に濡らすために４１．６ｍｇ。軽くたたく方法でできるだけ濡らすためには４８．７ｍｇ。液滴を添加し、重量は８５ｍｇになった。液滴は吸収され、滴り落ちなかった。

０７００－０００００布地のパッチ。完全に濡らすために３４．４ｍｇ（すなわち視覚的に１００％濡れており、０７００－０００１０パッチを使用した４１．４ｍｇ及び４１．６ｍｇの測定値と比較される）。さらに濡らすと３５．２ｍｇ（これは、０７００－０００１０パッチを使用した５２ｍｇ及び４８．７ｍｇの測定値と比較される）。液滴を添加するとガーゼから流れ落ちる。これをキムワイプで拭くと、パッチに残る質量は４３．５ｍｇである。

別の０．７００－０００００パッチで２回目の実施。軽くたたく方法で視覚的に１００％濡らすために３１ｍｇ。

新規の０００００材料は、０００１０材料よりも湿った境界がシャープであったため、湿った領域が見えやすかった。０００１０材料はより吸湿性が高く、境界線がシャープでクリアに見えなかったのはおそらくそのためである。０００１０ガーゼは完全に液滴を吸収できたが、０００００ガーゼは、パッチを垂直方向に置くと滴り落ちずには完全に液滴を吸収することはできなかった。

〔参照文献〕
Palli MA, McTavish H, Kimball A, Horn TD. Immunotherapy of Recurrent Herpes Labialis With Squaric Acid. JAMA Dermatol. 2017;153:828-829.
McTavish H, Zerebiec KW, Zeller JC, Shekels LL, Matson MA, Kren BT. Immune characteristics correlating with HSV-1 immune control and effect of squaric acid dibutyl ester on immune characteristics of subjects with frequent herpes labialis episodes. Immun. Inflamm. Dis. 2019;7(1):22-40.
Chang ALS, Honari G, Guan L, Zhao L, Palli MA, Horn TD, Dudek AZ, McTavish H. A phase 2, multi-center, placebo-controlled study of single dose squaric acid dibutyl ester (SADBE) to reduce frequency of outbreaks in subjects with recurrent herpes labialis. J Am Acad Dermatol. 2020 Apr 11:S0190-9622(20)30561-2. doi: 10.1016/j.jaad.2020.04.021.
Buckley DA, Du Vivier AWP. The therapeutic use of topical contact sensitizers in benign dermatoses. British Journal of Dermatology 2001; 145: 385-405.
Lee AN, Mallory SB. Contact immunotherapy with squaric acid dibutylester for the treatment of recalcitrant warts. J Am Acad Dermatol 1999;41:595-599.

すべての参照文献は参照により本明細書に取り込まれる。
（付記）
本開示は以下の態様を含む。
項目１：
布地の領域の少なくとも一部の上に接着剤が重ねられた前記布地を含むバッキング層を含み、
前記バッキング層には、その領域の一部の上に吸収性ガーゼ層が重ねられており、
前記吸収性ガーゼ層は、媒体（vehicle）と前記媒体に溶解した局所免疫増感剤とを含む液体又は半液体の溶液を含む、皮膚パッチ。
項目２：
前記吸収性ガーゼ層と前記バッキング層との間にバリア層をさらに含み、前記バリア層が前記媒体及び前記局所免疫増感剤に対して不透過性である、項目１に記載の皮膚パッチ。
項目３：
前記吸収性ガーゼがポリエステルを含む、項目１に記載の皮膚パッチ。
項目４：
前記局所免疫増感剤が、スクアリン酸エステル、ジフェニルシクロプロペノン、１－クロロ－２，４－ジニトロベンゼン（ＤＮＣＢ）、１－クロロ－２，６－ジニトロベンゼン、又はウルシオールを含む、項目１に記載の皮膚パッチ。
項目５：
前記媒体が、クリーム、ローション、鉱油、ワセリン、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、アセトン、イソプロパノール、ブタノール、又はエタノールを含む、項目１に記載の皮膚パッチ。
項目６：
前記免疫増感剤がスクアリン酸ジブチルエステル（ＳＡＤＢＥ）である、項目４に記載の皮膚パッチ。
項目７：
前記媒体がＤＭＳＯを含む、項目１に記載の皮膚パッチ。
項目８：
前記媒体がＤＭＳＯであり、
前記局所免疫増感剤が、前記ＤＭＳＯ中に０．１％～５％（ｗｔ／ｖｏｌ）で溶解したＳＡＤＢＥである、
項目６に記載の皮膚パッチ。
項目９：
前記吸収性ガーゼ層が前記バッキング層に恒久的に取り付けられている、項目１に記載の皮膚パッチ。
項目１０：
前記吸収性ガーゼ層が前記バッキング層に取り付けられていない、項目１に記載の皮膚パッチ。
項目１１：
液体媒体に溶解した局所免疫増感剤の溶液を含む密閉ガラスアンプルと、
前記密閉ガラスアンプルに取り付けられたフォームアプリケーターチップ（foam applicator tip）と、を含み、
前記密閉ガラスアンプルは、通常の力を有する人が手で絞る（squeeze）ことで破壊可能であり、前記ガラスアンプルが破壊されて逆さにされると、５分以内に前記溶液がフォームチップに浸透し、前記フォームチップが表面に接触すると前記表面を前記溶液で濡らすようになる、ガラススワブ。
項目１２：
前記ガラスアンプルを部分的に又は完全に取り囲む１又は複数のバリア層をさらに含み、前記１又は複数のバリア層は、前記フォームチップを介した前記溶液以外のガラスの破片及び前記溶液が前記１又は複数のバリア層に浸透して前記ガラススワブを保持する人の皮膚に接触するのを防ぐ、項目１１に記載のガラススワブ。
項目１３：
前記ガラスアンプルを取り囲み、前記フォームアプリケーターチップまでをシールするポリマーバリア層をさらに含み、
前記ポリマーバリア層は、ガラスの破片及び前記溶液が前記ポリマーバリア層に浸透して前記ガラススワブを絞って破壊する人の指の皮膚に接触することを防ぐように構成されている、項目１１に記載のガラススワブ。
項目１４：
前記媒体が、ＤＭＳＯ、メタノール、アセトン、エタノール、プロパノール、イソプロパノール、ブタノール、イソブタノール、水、及びこれらの組み合わせから選択される、項目１１に記載のガラススワブ。
項目１５：
前記局所免疫増感剤がスクアリン酸エステルであり、
前記媒体が、ＤＭＳＯ、メタノール、エタノール、プロパノール、ブタノール、イソプロパノール、イソブタノール、アセトン、又はこれらの組み合わせである、
項目１１に記載のガラススワブ。
項目１６：
前記スクアリン酸エステルがＳＡＤＢＥである、項目１５に記載のガラススワブ。
項目１７：
前記媒体がＤＭＳＯであり、前記局所免疫増感剤がＳＡＤＢＥである、項目１１に記載のガラススワブ。
項目１８：
前記１又は複数のバリア層が、ポリマー層及び／又は厚紙層を含む、項目１２に記載のガラススワブ。
項目１９：
前記溶液中の水が１００ｐｐｍ未満である、項目１４に記載のガラススワブ。
項目２０：
前記溶液中の水が５０ｐｐｍ未満である、項目１９に記載のガラススワブ。
項目２１：
前記ガラスアンプル中の前記溶液は、前記ガラスアンプルが破壊されるまではガラスとのみ接触する、項目１１に記載のガラススワブ。
項目２２：
（ａ）（１）前記媒体を分子ふるいで処理して媒体から水を除去し、乾燥媒体を生産すること；及び、前記乾燥媒体にスクアリン酸エステルを溶解して乾燥溶液を生産すること、又は
（ａ）（２）前記媒体にスクアリン酸エステルを溶解して溶液を形成し、その後前記溶液を分子ふるいで処理して前記媒体から水を除去し、乾燥溶液を生産すること；及び
（ｂ）乾燥雰囲気下で前記乾燥溶液を前記ガラスアンプルに充填し、前記ガラスアンプルを密閉して気密シールを形成すること、を含み、
前記アンプル中の前記乾燥溶液は、前記気密シールが破壊されるまではガラスとのみ接触する、項目１１に記載のガラススワブの作製方法。
項目２３：
前記媒体がＤＭＳＯである、項目２２に記載の方法。
項目２４：
前記局所免疫増感剤がＳＡＤＢＥである、項目２２に記載の方法。
項目２５：
（ａ）布地の領域の少なくとも一部の上に接着剤が重ねられた前記布地を含む接着性バッキング層であって、前記接着性バッキング層には、その領域の一部の上に吸収性ガーゼ層が重ねられている、前記接着性バッキング層、を含む皮膚パッチと、
（ｂ）媒体に溶解した局所免疫増感剤を含む液体又は半液体の溶液を含む密閉容器と、
を含むキット。
項目２６：
前記皮膚パッチが、前記ガーゼ層と前記接着性バッキング層との間にバリア層をさらに含み、前記バリア層は前記媒体及び前記局所免疫増感剤に対して不透過性である、項目２５に記載のキット。
項目２７：
前記密閉容器が、人が道具を使わずに手で開けるように構成されている、項目２５に記載のキット。
項目２８：
前記密閉容器がガラススワブであり、前記ガラススワブが、
液体媒体に溶解した局所免疫増感剤の溶液を含む密閉ガラスアンプルと、
前記密閉ガラスアンプルに取り付けられたフォームアプリケーターチップと、を含み、
前記密閉ガラスアンプルは、通常の力を有する人が手で絞ることで破壊可能であり、
前記ガラスアンプルが破壊されて逆さにされると、５分以内に前記溶液がフォームチップに浸透し、前記フォームチップが表面に接触すると前記表面を前記溶液で濡らすようになる、
項目２５に記載のキット。
項目２９：
人の皮膚に接着性皮膚パッチを適用し接着させることを含み、
前記接着性皮膚パッチは、布地の領域の少なくとも一部の上に接着剤が重ねられた前記布地を含むバッキング層を含み、
前記バッキング層には、その領域の一部の上に吸収性ガーゼ層が重ねられており、
前記吸収性ガーゼ層は、媒体と前記媒体に溶解した局所免疫増感剤とを含む液体又は半液体の溶液を含む、
制御された用量の局所免疫増感剤を局所的に付与する方法。
項目３０：
前記適用する工程の前に、
媒体と前記媒体に溶解した局所免疫増感剤とを含む液体又は半液体の溶液を含む単位用量容器を開けることと、
前記溶液を前記皮膚パッチの前記吸収性ガーゼ層に付与して、前記媒体と前記媒体に溶解した局所免疫増感剤とを含む液体又は半液体の溶液を含む吸収性ガーゼ層を形成することと、
をさらに含む、項目２９に記載の方法。
項目３１：
前記媒体がＤＭＳＯであり、前記局所免疫増感剤がＳＡＤＢＥである、項目２９に記載の方法。

Claims

布地の領域の少なくとも一部の上に接着剤が重ねられた前記布地を含むバッキング層と、
前記バッキング層の領域の一部の上に重ねられた吸収性ガーゼ層であって、媒体（vehicle）と前記媒体に溶解した局所免疫増感剤とを含む液体の溶液を含む吸収性ガーゼ層と
、
前記吸収性ガーゼ層と前記バッキング層との間の、前記媒体及び前記局所免疫増感剤に対して不透過性のバリア層と、
を含み、
前記吸収性ガーゼ層は、制御された体積の前記溶液と制御された用量の前記局所免疫増感剤とを含み、
前記局所免疫増感剤はスクアリン酸ジブチルエステル（ＳＡＤＢＥ）を含み、前記媒体はジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）を含む、
皮膚パッチ。
前記媒体がＤＭＳＯであり、前記局所免疫増感剤が、前記ＤＭＳＯ中に０．１％～５％（ｗｔ／ｖｏｌ）で溶解したＳＡＤＢＥである、請求項１に記載の皮膚パッチ。
前記制御された体積の溶液の質量が３１ｍｇ～５２ｍｇである、請求項１に記載の皮膚パッチ。
（ａ）布地の領域の少なくとも一部の上に接着剤が重ねられた前記布地を含む接着性バッキング層と、
前記接着性バッキング層の領域の一部の上に重ねられた吸収性ガーゼ層と、
前記吸収性ガーゼ層と前記接着性バッキング層との間の、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）及びスクアリン酸ジブチルエステル（ＳＡＤＢＥ）に対して不透過性である、バリア層と、
を含む、皮膚パッチと、
（ｂ）媒体に溶解した局所免疫増感剤を含む液体又は半液体の溶液を含む密閉容器と、
を含み、
前記媒体はＤＭＳＯを含み、前記局所免疫増感剤はＳＡＤＢＥを含み、
前記液体又は半液体の溶液中の水は５０ｐｐｍ未満である、キット。
布地の領域の少なくとも一部の上に接着剤が重ねられた前記布地を含むバッキング層と、
前記バッキング層の領域の一部の上に重ねられた吸収性ガーゼ層であって、媒体と前記媒体に溶解した局所免疫増感剤とを含む液体又は半液体の溶液を含む吸収性ガーゼ層と、
前記吸収性ガーゼ層と前記バッキング層との間の、前記媒体及び前記局所免疫増感剤に対して不透過性のバリア層と、を含む接着性皮膚パッチであって、
前記媒体はジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）を含み、前記局所免疫増感剤はスクアリン酸ジブチルエステル（ＳＡＤＢＥ）を含み、
前記液体又は半液体の溶液中の水が５０ｐｐｍ未満である、接着性皮膚パッチ。
前記媒体が、分子ふるいと接触させて水を除去することにより調製されるか、
前記溶液が、分子ふるいと接触させて水を除去することにより調製される、
請求項５に記載の接着性皮膚パッチ。
局所免疫増感剤の単位剤形の医薬であって、
前記単位剤形は、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）を含む液体媒体に溶解している局所免疫増感剤の液体の溶液を含む密閉容器を含み、
前記局所免疫増感剤はスクアリン酸エステルであり、
前記液体の溶液は、水が５０ｐｐｍ未満である乾燥溶液である、医薬。
前記密閉容器がガラスアンプルであり、
前記ガラスアンプル中の前記乾燥溶液は、前記ガラスアンプルが破壊されるまではガラスとのみ接触する、
請求項７に記載の医薬。
前記媒体がＤＭＳＯからなり、前記局所免疫増感剤がＳＡＤＢＥである、請求項７又は８に記載の医薬。
局所免疫増感剤の単位剤形を作製する方法であって、
前記単位剤形は、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）を含む液体の媒体に溶解した局所免疫増感剤の液体の溶液を含む密閉容器を含み、
前記局所免疫増感剤は、スクアリン酸ジブチルエステル（ＳＡＤＢＥ）であり、
前記方法は、
（ａ）（１）前記媒体を分子ふるいで処理して前記媒体から水を除去し、乾燥媒体を生産すること；及び、前記乾燥媒体にスクアリン酸エステルを溶解して乾燥溶液を生産すること、又は
（ａ）（２）前記媒体にＳＡＤＢＥを溶解して溶液を形成し、その後前記溶液を分子ふるいで処理して前記媒体から水を除去し、乾燥溶液を生産すること；及び
（ｂ）乾燥雰囲気下で前記乾燥溶液を容器に充填し、前記容器を密閉して気密シールを有する密閉容器を形成すること、
を含む、方法。
前記密閉容器がガラスアンプルであり、前記ガラスアンプル中の前記乾燥溶液は、前記気密シールが破壊されるまではガラスとのみ接触する、請求項１０に記載の方法。
前記媒体がジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）である、請求項１０に記載の方法。