JP7850416B2 - 細胞外小胞に含まれるｅｎａｍｐｔの産生および使用 - Google Patents

Description

連邦政府支援の研究または開発に関する声明
本発明は、米国国立衛生研究所によって授与されたＡＧ０３７４５７およびＡＧ０４７９０２の下で政府の支援を受けて作製された。政府は本発明に一定の権利を有する。
本発明は、ＮＡＭＰＴおよび／またはその変異体を含む様々な組成物、これらの組成物を調製するためのプロセス、ならびに対象における年齢関連状態を予防または治療するためにこれらの組成物を使用する様々な方法に関する。本発明はまた、対象または細胞におけるＮＭＮおよび／またはＮＡＤ＋生合成を増加させる方法に関する。

老化は組織機能障害および慢性疾患の重大な危険因子である。近年、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤ^＋）代謝は、多くの種にわたる全身性ＮＡＤ^＋利用可能性の明らかな年齢関連の低下により、老化および寿命研究の分野における中心的なトピックとして現れている（Ｃａｎｔｏ ｅｔ ａｌ．，２０１５、Ｒａｊｍａｎ ｅｔ ａｌ．，２０１８、Ｖｅｒｄｉｎ，２０１５、Ｙｏｓｈｉｎｏ ｅｔ ａｌ．，２０１８）。ＮＡＤ^＋利用可能性が全身レベルで年齢とともに低下し、多様なモデル生物における様々な年齢関連の病態生理学的変化を引き起こすことが現在確立されている。哺乳類では、ＮＡＤ^＋利用可能性の年齢関連の低下は、ＮＡＤ＋生合成の減少およびＮＡＤ^＋消費の増加という２つの主要な事象によって引き起こされるようである（Ｉｍａｉ，２０１６、Ｉｍａｉ ａｎｄ Ｇｕａｒｅｎｔｅ，２０１４）。前者は、酸化ストレスの増加および／または炎症性サイトカインの増加を伴う慢性炎症によって引き起こされ得るが、後者は、ＤＮＡ損傷の増加によって引き起こされ得る。結果として、脂肪組織、骨格筋、肝臓、膵臓、皮膚、神経感覚網膜、および脳を含む複数の組織において、ＮＡＤ^＋レベルが年齢とともに減少する（Ｃａｎｔｏ ｅｔ ａｌ．，２０１５、Ｌｉｎ ｅｔ ａｌ．，２０１８、Ｒａｊｍａｎ ｅｔ ａｌ．，２０１８、Ｖｅｒｄｉｎ，２０１５、Ｙｏｓｈｉｎｏ ｅｔ ａｌ．，２０１８）。年齢関連の病態生理学の基本的な事象としてのそのような全身性ＮＡＤ^＋低下の実現は、現在、ニコチンアミドモノヌクレオチド（ＮＭＮ）およびニコチンアミドリボシド（ＮＲ）などの主要なＮＡＤ^＋中間体を使用して効果的な老化防止介入を開発するための強力な根拠を提供している（Ｒａｊｍａｎ ｅｔ ａｌ．，２０１８、Ｙｏｓｈｉｎｏ ｅｔ ａｌ．，２０１８）。実際、多くの研究は、様々なマウスモデルにおいて、年齢関連の機能低下を緩和し、かつ年齢関連の疾患状態を治療するためのＮＭＮおよびＮＲの有効性を既に証明している（Ｒａｊｍａｎ ｅｔ ａｌ．，２０１８、Ｙｏｓｈｉｎｏ ｅｔ ａｌ．，２０１８）。

哺乳動物において、ニコチンアミドホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＮＡＭＰＴ）は、主要なＮＡＤ^＋生合成経路における速度制限酵素であり、ニコチンアミドおよび５’－ホスホリボシル－ピロリン酸（ＰＲＰＰ）をＮＭＮに変換する（Ｇａｒｔｅｎ ｅｔ ａｌ．，２０１５、Ｉｍａｉ，２００９）。興味深いことに、哺乳動物には、細胞内および細胞外ＮＡＭＰＴ（それぞれ、ｉＮＡＭＰＴおよびｅＮＡＭＰＴ）の２つの異なる形態が存在する（Ｒｅｖｏｌｌｏ ｅｔ ａｌ．，２００７）。重要なＮＡＤ^＋生合成酵素としてのｉＮＡＭＰＴの機能は完全に確立されているが、ｅＮＡＭＰＴの生理学的関連性および機能は、長い間議論の的となっている。ｅＮＡＭＰＴは、以前にプレ－Ｂ細胞コロニー増強因子（ＰＢＥＦ）およびインスリン模倣ビスファチンとして同定されていたが、いずれも現在まで再確認されていない（Ｆｕｋｕｈａｒａ ｅｔ ａｌ．，２００７、Ｇａｒｔｅｎ ｅｔ ａｌ．，２０１５、Ｉｍａｉ，２００９、Ｓａｍａｌ ｅｔ ａｌ．，１９９４）。加えて、ｅＮＡＭＰＴはまた、炎症促進性サイトカインとして機能することが報告されたが、この特定の機能は、機能喪失または機能獲得Ｎａｍｐｔ変異体においてまだ確認されていない（Ｄａｈｌ ｅｔ ａｌ．，２０１２）。以前に、Ｎａｍｐｔの脂肪組織特異的遺伝子操作によるインビボでのｅＮＡＭＰＴの生理学的関連性を実証した（Ｙｏｏｎ ｅｔ ａｌ．，２０１ Ｙｏｏｎ ｅｔ ａｌ．，題名“ＳＩＲＴ１－Ｍｅｄｉａｔｅｄ ｅＮＡＭＰＴ Ｓｅｃｒｅｔｉｏｎ ｆｒｏｍ Ａｄｉｐｏｓｅ Ｔｉｓｓｕｅ Ｒｅｇｕｌａｔｅｓ Ｈｙｐｏｔｈａｌａｍｉｃ ＮＡＤ（＋） ａｎｄ Ｆｕｎｃｔｉｏｎ ｉｎ Ｍｉｃｅ，”（２０１５）Ｃｅｌｌ Ｍｅｔａｂ ２１，７０６－７１７）。脂肪組織特異的Ｎａｍｐｔノックアウト（ＡＮＫＯ）マウス、特に雌は、循環ｅＮＡＭＰＴレベルにおいて著しい減少を示す。驚くべきことに、ＡＮＫＯマウスは、脂肪組織のみならず、視床下部などの他の遠隔組織においても、ＮＡＤ^＋レベルの著しい低減を呈する（Ｙｏｏｎ ｅｔ ａｌ．，２０１５）。その後の集中的な調査により、絶食に応答して視床下部におけるＮＡＤ^＋、ＳＩＲＴ１活性、および神経活性化を増強するｅＮＡＭＰＴの新規の機能が明らかになった。これらの所見は、ｅＮＡＭＰＴにより媒介される脂肪組織と視床下部との間に新規の組織間相互作用系の存在を示唆している（Ｉｍａｉ，２０１６）。

しかしながら、ｅＮＡＭＰＴが視床下部のＮＡＤ^＋レベルをどのように正確に調節するかは理解し難いままである。さらに、インビトロもしくはインビボでｅＮＡＭＰＴを効果的に送達するため、または任意の疾患もしくは状態を緩和するためにそれを適用するための方法は現在存在しない。

本発明は、脂質ならびにＮＡＭＰＴおよび／またはその変異体を含む様々な組成物、これらの組成物を調製するためのプロセス、ならびに対象における年齢関連状態を予防または治療するためにこれらの組成物を使用する様々な方法に関する。本発明はまた、対象または細胞におけるＮＭＮおよび／またはＮＡＤ＋生合成を増加させる方法に関する。

他の対象および特徴は、以下に一部が明らかであり、一部が指摘されるであろう。

６ヶ月および１８ヶ月齢の雌および雄マウス（ｎ＝５）の血漿ｅＮＡＭＰＴレベル。 ２４時間の期間にわたる６ヶ月および１８ヶ月齢の雌および雄マウス（年齢ごとに時点につきｎ＝５）の血漿ｅＮＡＭＰＴ濃度。６ヶ月および１８ヶ月齢での血漿ｅＮＡＭＰＴレベル間の差は、二元配置反復測定分散分析によって評価され、年齢の影響は、雄および雌の両方で有意であった（ｐ＜０．０５）。 異なる年齢群にわたるマウスおよびヒト（マウスの場合ｎ＝９、ヒトの場合ｎ＝１３）の血漿ｅＮＡＭＰＴレベル。 血漿ｅＮＡＭＰＴレベルと個々のマウス（ｎ＝８）の残存寿命との関係。ｅＮＡＭＰＴレベルを２６～２８ヶ月齢で測定した。 ４ヶ月齢の対照（左のバー）およびＡＮＫＩマウス（右のバー）（性別ごとに群当たりｎ＝３～４）の血漿ｅＮＡＭＰＴレベル。 ２４ヶ月齢の対照（左のバー）およびＡＮＫＩマウス（右のバー）（性別ごとに群当たりｎ＝３～４）の血漿ｅＮＡＭＰＴレベル。 ２０ヶ月齢の対照およびＡＮＫＩマウス（性別ごとに群当たりｎ＝３）の組織ＮＡＤ^＋レベル。 ４ヶ月および１８ヶ月齢の対照（ＣＴＲＬ）およびＡＮＫＩ雌マウス（群当たり、４ヶ月齢、ｎ＝３；１８ヶ月齢、ｎ＝１０～１３）の輪走活動。 １８ヶ月齢の対照およびＡＮＫＩ雌マウス（群当たりｎ＝４～５）の総歩行活動（上のパネル）および立ち上がり活動（下のパネル）。 ４ヶ月および２０ヶ月の雄マウス（群あたりｎ＝６）、ならびに２０ヶ月齢の対照（左のバー）およびＡＮＫＩマウス（右のバー）（群あたりｎ＝７～８；雄および雌マウスを合わせて）の睡眠断片化のレベル。ＮＲＥＭ睡眠（ＮＲ）サイクルと覚醒（Ｗ）サイクルとの間の移行の数が示される。 ２０ヶ月齢の対照およびＡＮＫＩ雌マウス（群当たりｎ＝３～６）の視床下部におけるＯｘ２ｒおよびＰｒｄｍ１３のｍＲＮＡ発現レベル。 血中グルコース（ｎ＝８～１３）およびインスリン（ｎ＝８～９）。 １７～２０ヶ月齢の対照（左のバー）およびＡＮＫＩ雄マウス（右のバー）におけるＩＰＧＴＴ中の血中グルコース（ｎ＝８～１３）レベル。 ２０ヶ月齢の対照（左のバー）およびＡＮＫＩ雄マウス（右のバー）（群当たりｎ＝３）の脾臓における膵島の総数。 ２０ヶ月齢の対照およびＡＮＫＩ雄マウス（群当たりｎ＝３）の脾臓における膵島の代表的な画像。 ２０ヶ月齢の対照（左のバー）およびＡＮＫＩ雄マウス（右のバー）（群当たりｎ＝３）の脾臓における膵島のサイズ分布。 １８～２０ヶ月齢の対照およびＡＮＫＩマウス（群当たりｎ＝６～７；雄および雌を合わせて）のＥＲＧ分析からの暗順応ａ波、暗順応ｂ波、および明順応ｂ波。 雌および雄ＡＮＫＩマウス（雌、対照３９、ＡＮＫＩ４０；雄、対照３９、ＡＮＫＩ３９）のカプラン・マイヤー曲線。 対照ならびにＡＮＫＩ雌および雄マウスの年齢関連の死亡率。 超遠心分離および全エクソソーム単離（ＴＥＩ）キットによって単離された、全血漿、ＥＶ画分、および上清中のｅＮＡＭＰＴ、細胞外小胞（ＥＶ）マーカータンパク質（ＴＳＧ１０１、ＣＤ６３、ＣＤ８１、およびＣＤ９）および非ＥＶタンパク質（トランスフェリンおよびアルブミン）の比較。ＥＶを血漿の開始体積に等しい体積のＰＢＳで再構成した場合、タンパク質濃度は、典型的には、それぞれ超遠心分離およびＴＥＩキットによって精製されたＥＶについて、約０．４および約１μｇ／μｌであった。各画分からの４０μｇのタンパク質を充填した。 スクロース密度勾配遠心分離から単離された６つの画分（Ｆ１～６）におけるｅＮＡＭＰＴおよびＥＶマーカータンパク質の比較。２ｍＬの血漿をこの分画に使用した。 ４ヶ月齢の３匹の雄マウス、ならびに３７、４１、および４５歳の男性ヒトドナーから単離された全血漿（Ｐ）、ＥＶ画分（Ｅ）、および上清（Ｓ）におけるｅＮＡＭＰＴの比較。各画分はそれらを等量に調整した後に充填された。 プロテイナーゼＫおよび／またはＴｒｉｔｏｎ Ｘ－１００によるマウス血漿の治療におけるｅＮＡＭＰＴ、ＴＳＧ１０１、トランスフェリン、および免疫グロブリン軽鎖（Ｉｇ ＬＣ）の比較。 ６および２２ヶ月齢のマウス（群当たりｎ＝４）からの血漿中のＥＶ含有ｅＮＡＭＰＴ（ＥＶ－ｅＮＡＭＰＴ）およびＣＤ６３のレベル。 ２４ヶ月齢の対照（ＣＴＲＬ）およびＡＮＫＩマウス（群当たりｎ＝４）の血漿中のＥＶ含有ｅＮＡＭＰＴ（ＥＶ－ｅＮＡＭＰＴ）およびＣＤ６３のレベル。 ＢＯＤＩＰＹ標識ＥＶとのインキュベーション後の一次視床下部ニューロンの蛍光画像。４００μｌのマウス血漿から精製されたＥＶを、２００μｌの培養培地に添加した。矢印は、ＢＯＤＩＰＹ標識ＥＶを内在化したニューロンを示す。 ｒｅｃＮＡＭＰＴ単独またはＥＶ含有ｒｅｃＮＡＭＰＴとともにインキュベートした後の、一次視床下部ニューロンにおけるＦＬＡＧタグ付き組換えＮＡＭＰＴ（ｒｅｃＮＡＭＰＴ）および細胞ＮＡＤ^＋レベルの細胞質レベル（ｎ＝３）。 超遠心分離およびＴＥＩキットにより血漿から単離されたＥＶとともにインキュベートした後の、一次視床下部ニューロンにおけるＮＡＤ^＋生合成の相対速度（ｎ＝４）。 ＯＰ９脂肪細胞から生成された対照（ＣＴＲＬ）およびＮａｍｐｔノックダウン（ＮＡＭＰＴ－ＫＤ）ＥＶとともにインキュベートした後の、一次視床下部ニューロンにおける相対細胞ＮＡＭＰＴ活性（ｎ＝３～６）。 ６および１８ヶ月齢のマウス（ｎ＝４）から単離されたＥＶとともにインキュベートした後の、一次視床下部ニューロンにおける細胞質ＮＡＭＰＴおよびＮＡＤ^＋のレベル。 ６および２０～２２ヶ月齢のマウス（ｎ＝９～１３）から単離されたＥＶとともにインキュベートした後のＮＡＤ^＋レベルの変化。 ２０ヶ月齢の対照（左のバー）およびＡＮＫＩマウス（右のバー）から単離されたＥＶとともにインキュベートした後の、一次視床下部ニューロンにおけるＮＡＤ^＋レベル。 ４～６ヶ月齢のマウス（ｎ＝５）から精製されたＥＶを１日４回連続で注射する前後の、暗闇および光時間中の２０ヶ月齢の雌マウスの総輪走活動数。 ＯＰ９脂肪細胞から精製された対照（ＣＴＲＬ）およびＮａｍｐｔノックダウン（ＮＡＭＰＴ－ＫＤ）ＥＶを１日４回連続で注射する前後の、暗闇時間中の２５ヶ月齢の雌マウス（ｎ＝６）の総輪走活動数。 カプラン・マイヤー曲線および代表的な画像。 ４～１２ヶ月齢のマウス（ｎ＝１１～１２）から単離されたビヒクルまたはＥＶを注射した加齢雌マウスのカプラン・マイヤー曲線。マウスの画像は、３ヶ月の治療後に撮影された。 ８ヶ月齢の雄マウス（ｎ＝５）から単離された原発性脂肪細胞におけるＮＡＭＰＴレベル。 ６ヶ月および１８ヶ月齢の雌マウス（年齢ごとの時点ごとにｎ＝５）における２４時間の経過にわたる血漿ｅＮＡＭＰＴレベルについてのウェスタンブロット。６－１～５および１８－１～５は、それぞれ６ヶ月および１８ヶ月齢での個々の血漿試料である。シグナル定量におけるバイアスを回避するために、各ブロットの試料の順序を意図的にランダム化した。 ６ヶ月および１８ヶ月齢の雄マウス（年齢ごとの時点ごとにｎ＝５）における２４時間の経過にわたる血漿ｅＮＡＭＰＴレベルについてのウェスタンブロット。６－１～５および１８－１～５は、それぞれ６ヶ月および１８ヶ月齢での個々の血漿試料である。シグナル定量におけるバイアスを回避するために、各ブロットの試料の順序を意図的にランダム化した。 ６ヶ月齢の対照、１８ヶ月齢のＡＮＫＩ、および１８ヶ月齢の対照マウス（ｎ＝３）の血漿ｅＮＡＭＰＴレベル。血漿ｅＮＡＭＰＴは、二重の帯（右パネル）を示し、その両方を定量した（左パネル）。 ２０ヶ月齢の対照およびＡＮＫＩ雌マウス（群当たりｎ＝５）の血漿ｅＮＡＭＰＴレベルおよび視床下部ＮＡＤ＋レベルの関係。 ６および１８ヶ月齢の野生型マウス（ｎ＝３～９）の輪走活動。差異を、ウィルコクソンの符号付順位和検定によって評価した。 １８ヶ月齢の対照（ＣＴＲＬ）およびＡＮＫＩ雄マウス（ｎ＝４～７）の歩行活動（上）および立ち上がり活動（下）。 インスリン負荷試験中の１７～２０ヶ月齢の対照ならびにＡＮＫＩ雄マウス（右のバー）（群当たりｎ＝８）の相対血中グルコースレベル。各時点でのグルコースレベルは、０分の時点でのグルコースレベルに正規化される。 １８～２０ヶ月齢の対照（左のバー）ならびにＡＮＫＩ雌および雄マウス（右のバー）（雄、ｎ＝２０～３６；雌、ｎ＝１９～２３）の体重。 １７～２０ヶ月齢の対照（左のバー）ならびにＡＮＫＩ雄および雌マウス（右のバー）の体組成。 ２３ヶ月齢の対照（左のバー）ならびにＡＮＫＩ雄および雌マウス（右のバー）（ｎ＝６～９）の１日食物摂取量。 ２３ヶ月齢の対照（左のバー）ならびにＡＮＫＩ雄および雌マウス（右のバー）（ｎ＝３）の相対血漿サイトカインレベル。 ２０ヶ月齢の対照およびＡＮＫＩ雌マウスの文脈的恐怖条件付け試験。第１のグラフ：ベースラインおよびショックトーントレーニング中の対照およびＡＮＫＩマウスのすくみ行動時間パーセント；第２のグラフ：２日目の文脈的恐怖反応；第３のグラフ：３日目のベースラインおよび聴覚キュー応答（ｎ＝５）。 超遠心分離で精製されたＥＶのスクロース密度勾配への浮遊により単離された６つの画分におけるｅＮＡＭＰＴおよびＥＶマーカータンパク質。 １２画分の密度、ならびにＴｏｔａｌ Ｅｘｏｓｏｍｅ Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ（ＴＥＩ）キットによって精製されたＥＶのスクロース密度勾配分離から単離された各画分におけるｅＮＡＭＰＴおよびＥＶマーカーＡｌｉｘの比較。画分＃１１で共分画されたｅＮＡＭＰＴおよびＡｌｉｘのごくわずかな画分は、タンパク質凝集体の汚染に起因する可能性が最も高い。 マウスおよびヒト血漿から単離されたＥＶの電子顕微鏡画像および粒径分布。 マウス（各分析についてｎ＝１００）から単離されたＥＶの電子顕微鏡画像および粒径分布。 ＯＰ９脂肪細胞の馴化培地中のｅＮＡＭＰＴ、ＥＶマーカータンパク質（ＣＤ９、Ｃ８１、Ｈｓｐ７０、およびＴＳＧ１０１）、および非ＥＶタンパク質（アディポネクチンおよびアディプシン）の比較。ＥＶ画分および上清を超遠心分離により分離した。各画分からの４０μｇのタンパク質を充填した。 ＯＰ９脂肪細胞からのＢＯＤＩＰＹ標識ＥＶとのインキュベーション後の一次視床下部ニューロンの蛍光画像。 ＯＰ９脂肪細胞の馴化培地から単離された各画分（培地、ＥＶ、および上清）とともにインキュベートした後の、一次視床下部ニューロンにおける相対ＮＡＭＰＴ酵素活性。Ｄ－４－ＮＡＭを用いた質量分析によって測定された各ＮＭＮ生合成レベルを、未処理細胞におけるものに対して正規化した。 対照およびＮａｍｐｔノックダウン（ＮＡＭＰＴ－ＫＤ）ＯＰ９脂肪細胞から単離されたＥＶにおけるｅＮＡＭＰＴレベル。両方の馴化培地から精製されたＥＶのタンパク質濃度は非常に類似しており、両方の細胞株から放出されたＥＶの量に差がなかったことを示唆した。 ６および１８ヶ月齢のマウスからの血漿とともにインキュベートした後の、一次視床下部ニューロンにおける細胞質ＮＡＭＰＴのレベル。 ４～６ヶ月齢のマウス（ｎ＝５）から単離されたＥＶを１日４回連続で注射する前後の、２０ヶ月齢の雌マウスの２４時間にわたる総輪走活動数。 対照（ＣＴＲＬ）およびＮＡＭＰＴ－ＫＤ ＯＰ９脂肪細胞から精製されたＥＶを１日４回連続で注射する前後の、光時間中の２５ヶ月齢の雌マウス（ｎ＝５～６）の総輪走活動数。 ４～６ヶ月齢のマウス（ｎ＝５）から精製されたＥＶを１日４回連続で注射する前後の、暗闇および光時間中の２０ヶ月齢の雄マウスの総輪走活動数。 マウス血漿由来ＥＶで処置した培養原発マウス海馬ニューロン（＊＊＊＊ｐ＜０．０００１、多重比較のためのシダック補正を伴う一元配置分散分析）。 Ｂｏｄｉｐｙ－ＴＲ－セラミド標識ＥＶで処理したアストロサイト濃縮培養物。 Ｂｏｄｉｐｙ－ＴＲ－セラミド標識ＥＶで処理したミクログリア培養物。

本発明は、ニコチンアミドホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＮＡＭＰＴ）および／またはその変異体を含む様々な組成物、これらの組成物を調製するためのプロセス、ならびに対象における年齢関連状態を予防または治療するためにこれらの組成物を使用する様々な方法に関する。本発明はまた、細胞におけるＮＭＮおよび／またはＮＡＤ＋生合成を増加させる方法に関する。方法および組成物は、ＮＡＭＰＴおよび／またはその変異体の、細胞および生物への改善された送達系を可能にし、そこでＮＡＭＰＴおよび／またはその変異体を利用することができ、老化防止修飾因子として作用し得る。

本発明は、マウスおよびヒトにおける細胞外ニコチンアミドホスホリボシルトランスフェラーゼ（ｅＮＡＭＰＴ）の循環レベルが、年齢とともに著しく低下するという発見に基づく。ＮＡＭＰＴの脂肪組織特異的過剰発現によって、加齢マウスにおける循環ｅＮＡＭＰＴレベルを増加させることは、複数の組織におけるＮＡＤ^＋レベルを増加させ、それによって、それらの機能を増強し、雌マウスにおける健康寿命を延長する。しかしながら、本発明に先立って、ｅＮＡＭＰＴがインビボでどのように送達されるか、または加齢個体においてＮＡＭＰＴのレベルがどのように増加され得るかは不明であった。

ＮＡＭＰＴの細胞外小胞（ＥＶ）送達は、細胞系または個体においてＮＡＭＰＴを補充する有効な方法を提供することが発見されている。ｅＮＡＭＰＴは、マウスおよびヒトにおける全身循環を通じて細胞外小胞（ＥＶ）において担持される。ＥＶを介したｅＮＡＭＰＴの送達は、細胞内在化およびＮＡＤ^＋生合成をもたらす。若年マウスから単離されたｅＮＡＭＰＴ含有ＥＶを補充することは、輪走活動を著しく向上させ、加齢マウスでの寿命を延長する。したがって、本発明者らは、全身性ＮＡＤ^＋生合成を促進し、かつ老化に対抗する、ｅＮＡＭＰＴの新規のＥＶ媒介性送達機構を明らかにし、ヒトにおける老化防止介入の潜在的な手段を示唆している。

近年、多くの研究が、タンパク質およびマイクロＲＮＡを輸送するための新しい細胞間または組織間相互作用ツールとしてのＥＶの重要な役割を報告している（Ｗｈｉｔｈａｍ ｅｔ ａｌ．，２０１８、Ｙｉｎｇ ｅｔ ａｌ．，２０１７、Ｚｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．，２０１７）。実際、脂肪組織は、遠隔組織における遺伝子発現を調節する循環ＥＶ含有マイクロＲＮＡの主要な供給源であることが最近実証されている（Ｔｈｏｍｏｕ ｅｔ ａｌ．，２０１７）。これに関しては、血液循環におけるｅＮＡＭＰＴがほぼＥＶのみに含まれていることが興味深い。脂肪組織において、ｉＮＡＭＰＴ上のリジン５３のＳＩＲＴ１依存性脱アセチル化は、タンパク質を分泌しやすくし、この脱アセチル化がＮＡＭＰＴタンパク質をＥＶに組み込むプロセスに関与し得ることを暗示する（Ｙｏｏｎ ｅｔ ａｌ．，２０１５）。しかしながら、ｅＮＡＭＰＴ含有ＥＶが、視床下部、海馬、膵臓、および網膜などのある特定の組織に特異的にどのように標的化されるかは未知のままである。ＥＶ媒介性送達は、ｅＮＡＭＰＴが細胞内に適切に内在化され、ＮＭＮ／ＮＡＤ^＋細胞内生合成を増強するために重要であることが見出されている。ｅＮＡＭＰＴタンパク質を単独で与える場合、タンパク質は適切に内在化されない。

さらに、ｅＮＡＭＰＴ含有ＥＶは、ある個体から別の個体に移送され得ることが見出されている。特に、若年マウスから精製されたｅＮＡＭＰＴ含有ＥＶを補充することは、輪走活動を著しく増強し、加齢マウスにおいて寿命を延長することが発見されている。ヒトの血液中では、ｅＮＡＭＰＴはまたＥＶのみに含まれている。したがって、このモデルは、ヒトにおける老化防止生物学的薬剤としてのＥＶ含有ｅＮＡＭＰＴの使用を支持する。これらの所見は、効果的な老化防止介入のための生物学的薬剤としてｅＮＡＭＰＴのＥＶ媒介性全身送達を使用する新しい可能性をもたらす。

したがって、本発明の様々な組成物は、ニコチンアミドホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＮＡＭＰＴ）および／またはその変異体ならびに脂質を含み、脂質は、ＮＡＭＰＴおよび／またはその変異体を少なくとも部分的に封入する層を形成する。例えば、脂質は、ＮＡＭＰＴおよび／またはその変異体を封入するミセルまたはリポソームを形成するために凝集することができる。いくつかの実施形態では、組成物は、ＮＡＭＰＴおよび／またはその変異体を含むエクソソームを含む。いくつかの実施形態では、組成物は、ＮＡＭＰＴおよび／またはその変異体を含むエクソソームを含む。

いくつかの実施形態では、脂質は、リン脂質を含む。例えば、リン脂質は、ホスファチジン酸、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルコリン、ホスファチジルセリン、ホスファチジルイノシトール、ホスファチジルイノシトールリン酸、ホスファチジルイノシトール二リン酸、ホスファチジルイノシトール三リン酸、ジホスファチジルグリセロール、およびそれらの組み合わせからなる群から選択され得る。様々な実施形態では、脂質は、スフィンゴ脂質を含む。例えば、スフィンゴ脂質は、セラミドホスホリルコリン、セラミドホスホリルエタノールアミン、セラミドホスホリル脂質、およびそれらの組み合わせからなる群から選択され得る。

様々な実施形態では、組成物中のＮＡＭＰＴおよび／またはその変異体の濃度は、約１重量％～約２０重量％である。いくつかの実施形態では、組成物は、約１：１～約１００：１であるＮＡＭＰＴおよび／またはその変異体の重量比を有する。

典型的には、組成物は、複数の小胞を含む。様々な実施形態では、小胞は、約１０ｎｍ～約２００ｎｍ、約１０ｎｍ～約１００ｎｍ、または約２０ｎｍ～約１００ｎｍの平均粒径を有することを特徴とする。いくつかの実施形態では、小胞は、水をさらに含む。

様々な実施形態では、組成物は、ある特定の生物学的構成成分を含まないか、または本質的に含まない（例えば、１重量％未満またはさらには０．１重量％未満）。例えば、いくつかの実施形態では、脂肪細胞、血液、および／または血漿を含まないか、または本質的に含まない（例えば、１重量％未満またはさらには０．１重量％未満）。

本明細書に記載される組成物は、これらに限定されないが、経口、静脈内、筋肉内、動脈内、髄内、くも膜下腔内、脳室内、経皮、皮下、腹腔内、鼻腔内、非経口、局所、舌下、または直腸手段を含む経路によって投与され得る。様々な実施形態では、投与は、経口、鼻腔内、腹腔内、静脈内、筋肉内、直腸、および経皮からなる群から選択される。いくつかの実施形態では、組成物は、経口的に投与され得る。様々な実施形態では、組成物は、非経口的に投与される。

経口投与のための組成物は、経口投与に好適な投与量で、当該技術分野で既知の薬学的に許容される担体および賦形剤を使用して製剤化され得る。そのような担体は、対象による消化のために、組成物を錠剤、丸剤、糖衣錠、カプセル、液体、ゲル、シロップ、スラリー、懸濁液などとして製剤化することを可能にする。ある特定の実施形態では、組成物は、非経口投与のために製剤化される。製剤化および投与のための技術のさらなる詳細は、ＲＥＭＩＮＧＴＯＮ’Ｓ ＰＨＡＲＭＡＣＥＵＴＩＣＡＬ ＳＣＩＥＮＣＥＳの最新版（Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．、Ｅａｓｔｏｎ，Ｐａ．、これは参照により本明細書に組み込まれる）に見出され得る。組成物が調製された後、それらを適切な容器に入れ、示された状態の治療のために標識することができる。そのような標識は、投与の量、頻度、および方法を含むであろう。

活性成分（例えば、阻害剤化合物）に加えて、組成物は、好適な薬学的に許容される担体および賦形剤を含み得る。いくつかの実施形態では、組成物は、担体をさらに含む。担体には、例えば、水が含まれる。また、様々な実施形態では、組成物は、賦形剤をさらに含む。様々な賦形剤には、例えば、様々な非毒性、不活性固体、半固体、もしくは液体の充填剤、希釈剤、封入材料、または任意の種類の製剤補助剤が含まれる。薬学的に許容される賦形剤として機能し得る材料のいくつかの例は、ラクトース、グルコース、およびスクロースなどの糖類；トウモロコシデンプンおよびジャガイモデンプンなどのデンプン；カルボキシメチルセルロースナトリウム、エチルセルロース、および酢酸セルロースなどのセルロースおよびその誘導体；粉末トラガント；麦芽；ゼラチン；タルク；ココアバターおよび座薬ワックスなどの賦形剤；ピーナッツ油、綿実油、紅花油、ゴマ油、オリーブ油、トウモロコシ油、および大豆油などの油；プロピレングリコールなどのグリコール；オレイン酸エチルおよびラウリン酸エチルなどのエステル；寒天；Ｔｗｅｅｎ ８０などの洗剤；水酸マグネシウムおよび水酸化アルミニウムなどの緩衝剤；アルギン酸；発熱性物質除去水；等張食塩水；リンガー溶液；エチルアルコール；人工脳脊髄液（ＣＳＦ）、およびリン酸緩衝液、ならびにラウリル硫酸ナトリウムおよびステアリン酸マグネシウムなどの他の非毒性適合性潤滑剤、ならびに着色剤、放出剤、コーティング剤、甘味料、香味剤、および芳香剤であり、防腐剤および抗酸化剤もまた組成物中に存在し得る。

上述したように、本発明はまた、本明細書に記載されるＮＡＭＰＴ含有組成物またはＮＡＭＰＴ変異体含有組成物を使用する様々な方法に関する。１つの方法は、細胞におけるＮＭＮおよび／またはＮＡＤ＋生合成を増加させることを対象とする。この方法は、本明細書に記載される組成物を細胞に適用することを含む。理論に拘束されることなく、組成物の小胞の脂質膜は、細胞の形質膜と融合し得るため、小胞内容物（すなわち、ＮＡＭＰＴ）の細胞への移行を促進すると考えられる。内在化すると、ＮＡＭＰＴおよび／またはその変異体は、細胞生合成経路で使用して、例えば、ＮＭＮおよび／またはＮＡＤ＋を産生することができる。他の方法は、対象においてＮＭＮおよび／またはＮＡＤ＋生合成を増加させることを含む。これらの方法は、本明細書に記載される組成物を対象に投与することを含む。

別の方法は、対象（例えば、予防または治療を必要とする対象）における年齢関連状態を予防または治療することを対象とする。方法は、対象に有効量の本明細書に記載される組成物を対象に投与することを含む。本明細書に記載される方法は、生理学的レベルを上回るＮＭＮおよび／またはＮＡＤ＋生合成を増加させることができる。生理学的レベルは、ある特定の時点で細胞または生物によって産生されると予想される生成物の量に対応する。産生は、生物の生涯にわたって自然に変化し得る。したがって、様々な実施形態では、ＮＭＮおよび／またはＮＡＤ＋の増加は、その時点で対象により合理的に合成される量に対して決定され得る。

様々な実施形態では、年齢関連状態は、身体活動の低下、睡眠の質の低下、認知機能の低下、グルコース代謝の低下、視力の低下、およびそれらの組み合わせからなる群から選択される生理学的状態を含む。様々な実施形態では、本明細書に開示される方法は、これらに限定されないが、ＩＩ型糖尿病、肥満、年齢関連の肥満、年齢関連の血中脂質レベルの増加、年齢関連のインスリン感受性の低下、年齢関連の記憶機能の喪失もしくは低下、年齢関連の眼機能の喪失もしくは低下、年齢関連の生理学的低下、グルコース刺激インスリン分泌の障害、糖尿病、ミトコンドリア機能の改善、神経死亡、ならびに／またはアルツハイマー病における認知機能、虚血／再灌流傷害からの心臓の保護、神経幹細胞／前駆細胞集団の維持、傷害後の骨格筋ミトコンドリア機能および動脈機能の回復、ならびに年齢関連の機能の低下などの、ＮＭＮ代謝を伴う任意の年齢関連疾患または状態の治療、改善、緩和、または逆転のために使用され得る。

様々な実施形態では、年齢関連状態は、それを必要とする対象におけるインスリン感受性および／またはインスリン分泌の年齢関連の喪失を含み得る。いくつかの実施形態では、年齢関連状態は、年齢関連の記憶機能障害を含む。様々な実施形態では、年齢関連状態は、眼機能の低下を含む。いくつかの実施形態では、眼機能の低下は、年齢関連の網膜変性を含む。

いくつかの実施形態では、年齢関連状態は、筋肉疾患を含み得、本発明は、当該筋肉疾患を治療することを必要とする対象においてそれを治療する方法を含む。様々な構成では、本教示に従って治療され得る筋肉疾患には、筋肉の衰弱、筋肉の萎縮、筋肉消耗、筋力の低下が含まれるが、これらに限定されない。様々な構成では、本教示に従って治療され得る筋肉疾患には、サルコペニア、ダイナペニア、悪液質、筋ジストロフィー、筋緊張障害、脊髄性筋萎縮症、およびミオパチーが含まれるが、これらに限定されない。筋ジストロフィーは、例えば、デュシェンヌ型筋ジストロフィー、ベッカー型筋ジストロフィー、先天性筋ジストロフィー、遠位型筋ジストロフィー、エメリー・ドレイフス型筋ジストロフィー、顔面肩甲上腕型筋ジストロフィー、肢帯型筋ジストロフィー、または眼咽頭型筋ジストロフィーであり得る。いくつかの構成では、筋緊張障害は、筋緊張性ジストロフィー、先天性筋緊張症、または先天性パラミオトニアであり得る。いくつかの構成では、ミオパチーは、ベスレムミオパチー、先天性筋線維タイプ不均等症、進行性骨化性線維異形成症、甲状腺機能亢進ミオパチー、甲状腺機能低下ミオパチー、ミニコアミオパチー、多核ミオパチー、筋細管ミオパチー、ネマリンミオパチー、周期性四肢麻痺、低カリウム性ミオパチー、または高カリウム性ミオパチーであり得る。いくつかの構成では、筋肉疾患は、酸マルターゼ欠乏症、カルニチン欠乏症、カルニチンパルミチルトランスフェラーゼ欠乏症、デブランシャー酵素欠乏症、乳酸脱水素酵素欠乏症、ミトコンドリアミオパチー、ミオアデニル酸デアミナーゼ欠乏症、ホスホリラーゼ欠乏症、ホスホフルクトキナーゼ欠乏症、またはホスホグリセリン酸キナーゼ欠乏症であり得る。いくつかの構成では、筋肉疾患は、サルコペニア、ダイナペニア、または悪液質であり得る。いくつかの構成では、筋肉疾患は、サルコペニアであり得る。

年齢関連状態を予防および治療する実施形態は、それを必要とする対象において年齢関連の機能低下を予防することを含み得る。様々な構成では、年齢関連の機能低下は、非限定的な例では、食欲不振、低グルコースレベル、筋力低下、栄養失調、または加齢による食欲不振からもたらされ得るか、またはそれに関連し得る。本明細書に記載される組成物によって治療され得る他の非限定的な年齢関連状態には、糖尿病（例えば、ＩＩ型糖尿病）および肥満が含まれ得る。

様々な実施形態では、本発明は、対象におけるＮＭＮ／ＮＡＤ＋の産生を促進するために、本明細書に記載される組成物を投与することを含む。

治療有効用量は、所望の結果を提供する活性成分の量を指す。正確な投与量は、治療を必要とする対象に関連する要因に照らして、開業医によって決定される。十分なレベルの活性成分を提供するため、または所望の効果を維持するために、投与量および投与を調整する。考慮され得る因子には、疾患状態の重症度、対象の全般的な健康、対象の年齢、体重、および性別、食事、投与時間および頻度、薬物の組み合わせ、反応感受性、ならびに療法に対する耐容性／応答が含まれる。いくつかの実施形態では、組成物は、１日当たり約１０ｍｇ～約５００ｍｇ、または約５０ｍｇ～約５００ｍｇのＮＡＭＰＴおよび／またはその変異体を提供する用量で対象に投与される。いくつかの実施形態では、対象は、ヒトである。様々な実施形態では、対象は、ヒトである。

本発明はまた、本明細書に記載される様々な組成物を調製するためのプロセスを対象とする。様々な実施形態では、方法は、脂肪細胞、血液、および血漿を含む培養物からなる群から選択される構成成分を含む培地から小胞を分離することを含む。

様々な実施形態では、培地は、脂肪細胞を含む培養物である。脂肪細胞は、ＮＡＭＰＴ（例えば、Ｎａｍｐｔ）または生合成前駆体をコードする遺伝子を過剰発現し得る。

様々な実施形態では、培地は、血液または血漿を含む培養培地である。

様々な実施形態では、分離プロセスは、遠心分離（例えば、超遠心分離）を含む。いくつかの実施形態では、分離プロセスは、エクソソーム単離技術を含む。

様々な実施形態では、本明細書に記載される組成物の小胞は、合成または半合成的に誘導される。例えば、ＮＡＭＰＴおよび／またはその変異体は、組換え技術によって産生され得る。続いて、ＮＡＭＰＴおよび／またはその変異体および脂質は、例えば、水性溶媒中で合わされ得る。

ＮＡＭＰＴおよびＮＡＭＰＴの変異体
様々な実施形態では、組成物は、ＮＡＭＰＴを含む。いくつかの実施形態では、ＮＡＭＰＴは、配列番号１の野生型ＮＡＭＰＴを含む。いくつかの実施形態では、ＮＡＭＰＴは、配列番号２の野生型ＮＡＭＰＴを含む。

様々な実施形態では、組成物は、ＮＡＭＰＴの変異体を含む。例えば、ＮＡＭＰＴタンパク質の２つの単一アミノ酸変異体、Ｋ５３ＲおよびＫ５３Ｑが報告されている。Ｋ５３はｉＮＡＭＰＴ上でアセチル化され、ＳＩＲＴ１はこのリジンを脱アセチル化し、ＮＡＭＰＴが分泌されやすくなる。Ｋ５３Ｒ変異体は、野生型ＮＡＭＰＴタンパク質よりも約３倍高く分泌されるが、一方で、Ｋ５３Ｑ変異体は、分泌の著しい減少を示す。Ｋ５３ＲはＮＡＭＰＴの酵素活性を変化させないため、Ｋ５３Ｒ変異体は、エクソソームにパッケージングされ、かつ標的組織に送達されるより良好な効率を呈し得る。

したがって、ＮＡＭＰＴの変異体は、配列番号１の野生型ＮＡＭＰＴの５３位に対応する位置にアルギニンまたはグルタミン残基（特に、アルギニン残基）を有するアミノ酸配列を含むことができ、変異体の残りのアミノ酸配列は、配列番号１と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９９％、少なくとも９９．９％、または少なくとも９９．９９％の配列同一性を含む。いくつかの実施形態では、ＮＡＭＰＴの変異体は、配列番号２の野生型ＮＡＭＰＴの５３位に対応する位置にアルギニンまたはグルタミン残基（特に、アルギニン残基）を有するアミノ酸配列を含み、変異体の残りのアミノ酸配列は、配列番号２と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９９％、少なくとも９９．９％、または少なくとも９９．９９％の配列同一性を含む。

様々な実施形態では、ＮＡＭＰＴの変異体は、配列番号１または配列番号２の野生型ＮＡＭＰＴと少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９９％、少なくとも９９．９％、または少なくとも９９．９９％の配列同一性を含み、野生型ＮＡＭＰＴと比較して、アセチル化部位を除去する少なくとも１つのアミノ酸置換をさらに含む。いくつかの実施形態では、ＮＡＭＰＴの変異体は、野生型ＮＡＭＰＴよりも効率的に細胞から分泌されるか、または野生型ＮＡＭＰＴよりも効率的にエクソソームにパッケージングされる。

ＮＡＭＰＴの変異体には、以下の配列を有するものも含まれ得る。

本発明を詳細に説明した後、添付の特許請求の範囲で定義された本発明の範囲から逸脱することなく、修正および変形が可能であることは明らかであろう。

以下の非限定的な例は、本発明をさらに例示するために提供される。

材料および方法
以下の実施例における実験を実施するために、以下の材料（表１）および方法を使用した。

動物モデル
Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓから購入したマウス、またはＮＩＨ加齢げっ歯類コロニーから入手したマウスを使用して、Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウスを本研究室で繁殖させた。各実験で使用した若年（４～６ヶ月齢）および加齢（１８～２６ヶ月齢）マウスは、年齢および供給源が一致していた。Ｃｒｅ誘導性ＳＴＯＰ－Ｎａｍｐｔマウスおよびアディポネクチン－Ｃｒｅマウスは、それぞれ、ペンシルベニア大学のＪｏｓｅｐｈ Ｂａｕｒおよびベス・イスラエル・ディーコネス医療センターのＥｖａｎ Ｒｏｓｅｎによって提供された。すべての株をＣ５７ＢＬ／６Ｊバックグラウンドに戻し交配させた。研究全体について、ヘテロ接合型ＡＮＫＩマウスは、ヘテロ接合型アディポネクチン－Ｃｒｅマウスとホモ接合型ＳＴＯＰ－Ｎａｍｐｔマウスとの交配によって生み出された。雄および雌ＡＮＫＩマウスの両方を、ｅＮＡＭＰＴおよび組織ＮＡＤ^＋定量化、輪走分析、睡眠断片化計数、ＥＲＧ分析、ならびに寿命を含むそれらの特徴付けに使用した。雄ＡＮＫＩマウスのみが、それらのより堅牢な表現型のために、グルコ代謝および膵島形態計測解析に使用された。特に指定のない限り、すべてのマウスに、標準的な飼料食（ＬａｂＤｉｅｔ５０５３；ＬａｂＤｉｅｔ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）を自由に摂食させ、４～５の群において、１２／１２時間の明暗サイクルで、２２℃で収容した。ケージと寝床は週に１回交換された。マウスは健康状態を定期的にモニタリングされ、本研究中にウイルス感染および寄生虫感染はなかった。

ヒト対象
ｅＮＡＭＰＴ定量化に使用したヒト血漿試料は、３７～８０歳の範囲の男性対象から得た。

細胞培養物
ＨＥＫ２９３を、ＡＴＣＣ（Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ）から入手し、１０％ＦＢＳ、１００Ｕ／ｍＬのペニシリン、および１００μｇ／ｍｌのストレプトマイシンを補充したＤＭＥＭ（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）中で維持した。ＯＰ９前脂肪細胞を、２０％ＦＢＳおよびペニシリン－ストレプトマイシンを補充したα－ＭＥＭ（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）中で維持した。すべての細胞を、３７℃および５％ＣＯ_２で維持した。ＯＰ９前脂肪細胞を、０．２％ＦＢＳ、１７５ｎＭインスリン、アルブミンに結合した９００μＭオレイン酸とともにα－ＭＥＭ中で４８時間培養することにより、完全に分化した脂肪細胞に分化させた。一次視床下部ニューロンをＥ１４胚から単離し、１０％ＦＢＳ、２ｍＭ Ｌ－グルタミン酸、およびＢ２７を補充した神経基底培地（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）中で培養した。ＨＥＫ２９３は雌胎児に由来した。ＯＰ９前脂肪細胞が由来したマウスの性別は不明である。一次視床下部ニューロンは、両性の胚から単離した。

寿命およびハザード比の分析
すべての動物を、標準的な実験室の食事および水への無制限のアクセスとともに、本研究の動物施設に保持した。生存研究のために用意したマウスは、任意の他の生化学的、生理学的、または代謝分析には使用しなかった。加齢コホート内のすべてのマウスを毎日注意深く検査した。寿命のエンドポイントは、各マウスが死亡しているか、またはＩＡＣＵＣガイドラインに従って安楽死されたかのいずれかであるときに決定された。剖検は、ワシントン大学マウス病理コアによる死亡または安楽死の直後に実施した。年齢関連死亡率（ｑ_ｘ）は、各間隔の終了時に生存している動物の数を、間隔の開始時に生存している動物の数で割ることによって計算した。ハザード比（ｈｚ）を、ｈｚ＝２ｑ_ｘ／（２－ｑ_ｘ）によって計算し、ｈｚの自然対数を時間に対してプロットした。

身体活動
ワシントン大学動物行動コアで自発運動活動の評価を行った。簡単に述べると、個々のマウスを、歩行の総数を定量化した４×８マトリックスのフォトセルの対に囲まれた透明なポリスチレン容器に入れた。垂直な立ち上がり運動を定量化するために、フォトセルの別のセットを床から７ｃｍ上に配置した。走輪を有する個々のケージにマウスを配置し、１２：１２の明暗サイクル下で概日キャビネット内に収容することによって、輪走活動の評価を行った。マウスを、輪走活動測定の前に２週間慣らした。

睡眠分析
マウスをイソフルオランで麻酔し、脳波検査（ＥＥＧ）のために頭蓋骨にスクリュー電極、および筋電図（ＥＭＧ）のために項部筋にステンレス針金電極を外科的に埋め込んだ。マウスを３日間手術から回復させ、続いて記録ケージ内で２週間慣らした。ＥＥＧ／ＥＭＧ記録を２日連続で、連続して行った。１０秒間のＥＥＧ／ＥＭＧシグナルのエポックは、覚醒［ＥＭＧ活性が高い低振幅デルタ（１～４Ｈｚ）およびシータ（４～８Ｈｚ）周波数］、ＮＲＥＭ睡眠［ＥＭＧ活性がない場合の高振幅デルタ］、およびＲＥＭ睡眠［ＥＭＧ活性がない場合の低振幅リズムシータ活性］として視覚的にスコア付けされた。スコアラーは、定量化中に遺伝子型について盲検化された。

代謝評価
グルコース負荷試験では、アスペン寝床での一晩の絶食後、マウスに１回の用量のデキストロース（１ｇ／ｋｇ体重）を腹腔内注射した。グルコースおよびインスリンレベルの測定のために、各時点で尾静脈から血液を収集した。インスリン負荷試験では、マウスにインスリン（０．７０単位／ｋｇ体重）を腹腔内注射し、血中グルコースの測定のために尾静脈から血液を収集した。ワシントン大学の臨床研究のためのコアラボラトリーでＳｉｎｇｕｌｅｘアッセイを用いて、血漿インスリンレベルの定量化を行った。ＥｃｈｏＭＲＩは、ワシントン大学糖尿病研究センターの糖尿病モデル表現型コアで実施した。

網膜電図
ケタミンおよびキシラジンの混合物で麻酔したマウスを、ＵＴＡＳ－Ｅ３０００ Ｖｉｓｕａｌ Ｅｌｅｃｔｒｏｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ Ｓｙｓｔｅｍを使用してＥＲＧに供した。ＥＲＧ波形の定量化は、ａ波振幅を平均ベースラインと平均トレースの最も負の点との間の差として定義し、かつｂ波振幅を最も負の点と波ピークの最も高い正の点との間の差としても定義する、既存のＭｉｃｒｏｓｏｆｔ Ｅｘｃｅｌマクロを使用して行った。

小規模コホート前向き寿命分析
２６～２８ヶ月齢の雌Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウスは、ＮＩＡ老化コロニーから入手した。血漿を尾静脈血液から収集し、ｅＮＡＭＰＴレベルを定量化した。続いて、マウスをケージ当たり４匹のマウスの群で収容し、毎日の検査を除いて触れなかった。採血から死亡までの日数を残存寿命として計算した。

ｅＮＡＭＰＴのウェスタンブロット分析
ケタミン－キシラジン麻酔下で、硫酸ヘパリンで前処理したシリンジを用いたキャピラリーまたは心臓穿刺によって尾静脈から血漿を収集した。血液を３０００×ｇでスピンダウンした。２μｌの新たに収集した血漿を、２００μｌの１倍試料緩衝液とともに９５℃で１０分間インキュベートした後、その使用まで－３０℃で保存した。分析の直前に、５μｌの各試料を、４５μｌの１倍試料緩衝液に添加し、９５℃で３０分間さらにインキュベートした。この３０分間の沸騰は、ｅＮＡＭＰＴ帯を個別的かつ定量化可能にするために必要であった。血漿ｅＮＡＭＰＴは、ＳＤＳ－ＰＡＧＥの稼働時間が十分に長かったときに、二重として検出された。１０μｌの最終混合物を、４～１５％ＳＤＳ－ＰＡＧＥ上で分離し、マウスの場合は抗ＮＡＭＰＴポリクローナル抗体（Ｂｅｔｈｙｌ）およびヒトの場合は抗ＮＡＭＰＴモノクローナル抗体（Ａｄｉｐｏｇｅｎ）を用いたウェスタンブロットによって分析した。ＮＡＭＰＴ抗体を１：１０００希釈で使用した。他のすべての抗体を１：１００希釈で使用した。

遺伝子発現分析
ＲＮＡをＲＮｅａｓｙミニキット（ＱＩＡＧＥＮ）によって抽出し、Ｈｉｇｈ－Ｃａｐａｃｉｔｙ ｃＤＮＡ逆転写キット（Ｔｈｅｒｍｏ）によってｃＤＮＡに変換した。定量的リアルタイムＲＴ－ＰＣＲを、ＳｔｅｐＯｎｅＰｌｕｓシステム（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）で実施し、Ｇａｐｄｈレベル、および次に対照マウスの平均に正規化することにより、各遺伝子について相対発現レベルを計算した。

ＥＶの精製および特徴付け
この研究で使用したＥＶを、製造業者の指示に従って、超遠心分離または血漿からの全エクソソーム単離キット（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用して単離した。１０００×ｇで１０分間血液を遠心分離することによってマウス血漿を単離した。また、完全に分化したＯＰ９脂肪細胞で４８時間、血清を含まないα－ＭＥＭを調節することによってインビトロでＥＶを収集した。単離した血漿およびＯＰ９馴化培地を１０００×ｇで１０分間遠心分離した。上清を２０００×ｇで２０分間再び遠心分離した。得られた上清を、ＥＶ単離前に１０，０００×ｇで３０分間さらに遠心分離した。

超遠心分離による血漿からのＥＶ単離のために、血漿を、ＰＢＳ中で１：１に希釈し、１００，０００×ｇで２時間遠心分離した。得られた上清をウェスタンブロット分析のために収集し、残りのペレットを出発血漿体積に等しい体積のＰＢＳに再懸濁し、１，０００，０００ｘｇで２時間再び遠心分離した。超遠心分離によるＯＰ９馴化培地からのＥＶ単離のために、培地を１００，０００×ｇで２時間遠心分離した。再び、得られた上清をウェスタンブロット分析のために収集し、残りのペレットを、培地の出発体積に等しい体積のＰＢＳに再懸濁した。再懸濁したＥＶを、１００，０００×ｇで２時間再度遠心分離した。血漿およびＯＰ９の両方からのＥＶの最終的な得られたペレットを、５０μｌのＰＢＳ中に再懸濁した。

全エクソソーム単離（ＴＥＩ）キットによるＥＶ単離のために、別段の記載がない限り、ＥＶを単離するために使用する血漿の体積と同じ体積のＰＢＳ中にＥＶを再懸濁した。ＥＶ単離後の得られた上清を、可溶性タンパク質画分として収集した。単離されたＥＶの質は、ＥＶマーカータンパク質［Ａｌｉｘ（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）、ＴＳＧ１０１（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）、ＣＤ６３（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）、ＣＤ８１（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）、およびＣＤ９（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）］、および非ＥＶタンパク質［トランスフェリン（ａｂｃａｍ）、アルブミン（ａｂｃａｍ）、アディポネクチン（ａｂｃａｍ）、およびアディプシン（Ｒ＆Ｄ）］のレベルを測定することによって確認した。全血漿からの４０μｇのタンパク質、単離したＥＶ画分、および上清／可溶性タンパク質画分を、ＳＤＳ－ＰＡＧＥゲルに充填し、ウェスタンブロットにより評価した。

ＥＶのスクロース勾配分画分析
ＥＶは、１００，０００×ｇで２時間の超遠心分離、またはＴＥＩキットのいずれかによって調製した。単離されたＥＶを９０％スクロース溶液で希釈して、最終濃度８２％にした。次いで、ＥＶを底部に層状にし、続いて、８２％～１０％の範囲のスクロース溶液を上に層状にした。試料を１００，０００×ｇで２０時間遠心分離し、６個の画分を収集した。各画分をＰＢＳ中１：１００に希釈し、１００，０００×ｇで２時間遠心分離してＥＶをペレット化した。次いで、各画分からのペレットを、等しい体積のＰＢＳ中に再懸濁し、ウェスタンブロットによる分析に供した。

プロテイナーゼＫ消化アッセイ
プロテイナーゼＫを１μｇ／μｌの最終濃度で５０μｌ血漿に添加し、３７℃で１０分間インキュベートした。続いて、２５μｌのＰＢＳおよび１５μｌのエクソソーム沈殿試薬（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を添加し、混合物を氷上で３０分間インキュベートした。混合物を１０００×ｇで遠心分離し、沈殿したＥＶをウェスタンブロッティングによって分析した。

血漿ＥＶのプロテオーム分析
６および２４ヶ月齢の野生型Ｂ６雌マウスならびに２４ヶ月齢の対照およびＡＮＫＩ雌マウスから単離したＥＤＴＡ補充血液から血漿を単離した。ＥＶを、４００μｌの血漿から超遠心分離によって単離し、水中で再構成した。タンパク質を抽出し、Ｐｒｏｇｅｎｅｓｉｓ ＬＣ－ＭＳ（ＮｏｎＬｉｎｅａｒ Ｄｙｎａｍｉｃｓ）によって分析した。タンパク質の同定をＭａｓｃｏｔ Ｓｅｒｖｅｒ ｖ２．４（Ｍａｔｒｉｃ Ｓｃｉｅｎｃｅ）で行った。同定されたタンパク質のリストを、最小９５％のペプチド閾値、最小９５％のタンパク質閾値、および最小２個のペプチドで生成し、タンパク質偽発見率を０．５％とした。閾値を超えて同定された２４８個のタンパク質のうち、１８１個のタンパク質は、ＥＶｐｅｄｉ．ｏｒｇに基づいて、ＥＶ／エクソソームの過去のプロテオミクス研究において同定された。

一次視床下部ニューロンの単離
Ｅ１６～Ｅ１８胚からの視床下部を解剖し、Ｈｉｂｅｒｎａｔｅ Ｅ培地中の氷上に置いた。視床下部を、ＤＮａｓｅ Ｉ（Ｓｉｇｍａ）を補充した０．２５％トリプシン－ＥＤＴＡ（Ｓｉｇｍａ）中で、３７℃で１５分間消化した。１０％ＦＢＳを補充した等量のＤＭＥＭを添加した後、塊が残らなくまるまでピペッティングによって細胞を穏やかに解離した。細胞を、室温で５分間、４５０×ｇで遠心分離することによって収集した。細胞を洗浄し、１０％ＦＢＳ、２％Ｂ２７、２Ｍ Ｌ－グルタミン、および抗生物質を含む神経基底培地に再懸濁した。細胞を、ウェル上に直接、またはポリ－ｌ－リジン（Ｓｉｇｍａ）で予めコーティングされたカバースリップ上に配置した。単離の２日後、細胞を１０μＭのＡｒａ－Ｃ（Ｓｉｇｍａ）で少なくとも４日間、または非神経細胞が除去されるまで処理した。

ＥＶ内在化アッセイ
単離されたＥＶをＰＢＳ中に再懸濁した。ＤＭＳＯ中のＢＯＤＩＰＹ ＴＲセラミドを、１００μＭの最終濃度でＥＶまたはＰＢＳに添加し、３７℃で１時間インキュベートした。標識したＥＶからの未組み込みの染料を、製造業者の指示に従ってエクソソームスピンカラム（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）によって除去した。精製したＥＶまたはＰＢＳ溶液を、カバースリップ上で成長する一次視床下部ニューロンに直接添加し、３０分間インキュベートした。インキュベーション後、細胞をＰＢＳ中で洗浄し、４％パラホルムアルデヒド中で固定した。

組換えＮＡＭＰＴ含有ＥＶの生成およびそれらの内在化アッセイ
単離したＥＶを１μｇ／μｌのＦＬＡＧタグ付き組換えＮＡＭＰＴタンパク質（ｒｅｃＮＡＭＰＴ）中に再懸濁し、３７℃で一晩インキュベートした。０．２体積のエクソソーム沈殿試薬（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を添加することによって、ｒｅｃＮＡＭＰＴ含有ＥＶを混合物から単離した。ｒｅｃＮＡＭＰＴ含有ＥＶを、出発血漿と同じ体積のＰＢＳに再構成した。

ＥＶ注射後の輪走アッセイ
ＥＶ注射実験では、２０ヶ月齢の雄および雌マウスを６日間の模擬注射により慣らした。輪走活動の処置前測定のために、マウスに１００μｌのＰＢＳを４日間腹腔内注射した。続いて、同じマウスに、４～６ヶ月齢のマウスから収集した２００μｌの血漿から精製された１００μｌの再懸濁ＥＶを注射し、ＰＢＳに再懸濁した。すべての注射を、午後５時３０分頃に行った。

ＥＶ注射されたマウスの寿命研究
２５ヶ月齢の雌Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウスを、米国国立老化研究所（ＮＩＡ）から入手した。マウスをその体重によって選別し、同様の体重を有するマウスのペアを各群に割り当てた。ケージ当たり４匹のマウスを収容した。ＥＶを、ＴＥＩキットによって４～１２ヶ月齢の野生型マウスの血漿から単離した。この寿命研究では、利用可能な限られた数のマウスからのＥＶの最高収率を達成するために、ＴＥＩキットの使用が必要であった。５００μｌの血漿から単離したＥＶを、１００μｌのＰＢＳ中に再懸濁し、２６ヶ月齢から開始して、腹腔内注射により週１回マウスに投与した。

データ解析
結果を平均値±ＳＥＭとして表す。すべての統計学的検定は、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ５を使用して行った。２つの群間の有意性は、スチューデントｔ検定によって評価した。データの正規性をグラフで評価した。複数群間の比較は、テューキー事後検定を用いた一元配置分散分析を用いて実施した。６～１８ヶ月齢のマウスの２４時間にわたる血漿ｅＮＡＭＰＴレベルの分析を、二元配置反復測定分散分析を使用して行った。線形回帰分析を用いて、異なる年齢群にわたるマウスおよびヒトの血漿ｅＮＡＭＰＴレベルを分析した。自発運動活動と輪走活動との比較は、ウィルコクソンの符号付順位和検定によって行った。ＥＲＧシグナルを、ボンフェローニ事後検定を用いた二元配置反復測定分散分析によって分析した。寿命の統計学的分析には、ゲーハン－ブレスロー－ウィルコクソン検定を用いた。フィッシャーの正確検定を使用して、死因の割合を比較した。ＥＶ注射による処置前および処置後の輪走活動の統計的比較を、対応のあるｔ検定によって行った。試料サイズおよび他の統計パラメータは、図および文章に示される。^＊ｐ＜０．０５、^＊＊ｐ＜０．０１、^＊＊＊ｐ＜０．００１。有意性はｐ＜０．０５で結論付けた。

実施例１：マウスおよびヒトの両方において、血漿ｅＮＡＭＰＴレベルは年齢とともに低下する。
以前の研究では、脂肪ＮＡＭＰＴの発現が年齢とともに減少することが示されている（Ｙｏｓｈｉｎｏ ｅｔ ａｌ．，２０１１）。一貫して、単離された脂肪細胞におけるｉＮＡＭＰＴのタンパク質発現レベルが、６ヶ月齢～１８ヶ月齢まで減少したことを見出した（図８Ａ）。脂肪組織が循環ｅＮＡＭＰＴの主要な供給源であることを考慮し（Ｙｏｏｎ ｅｔ ａｌ．，２０１５）、循環ｅＮＡＭＰＴレベルがマウスの老化中に変化したかどうかを調べた。血漿ｅＮＡＭＰＴレベルは、６ヶ月齢～１８ヶ月齢まで、雌マウスおよび雄マウスの両方でそれぞれ３３％および７４％有意に低下した（図１Ａ）。若年（６ヶ月齢）マウスでは、計算された血漿ｅＮＡＭＰＴ濃度は、雄（２９～５２ｎｇ／μｌ）におけるものよりも雌（５５～１２３ｎｇ／μｌ）の方が高かった。しかしながら、加齢（１８ヶ月齢）マウスにおいて、雄および雌の両方が、１日を通じて循環ｅＮＡＭＰＴレベルの有意な低下を示した（図１Ｂおよび８Ｂ）。

血漿ｅＮＡＭＰＴの年齢関連の低下は、血漿ｅＮＡＭＰＴレベルが、老化のための貴重な代用バイオマーカーであり得る可能性を提起した。したがって、マウスおよびヒトのいくつかの異なる年齢群にわたる血漿ｅＮＡＭＰＴレベルを測定した。マウスおよびヒトの両方において、血漿ｅＮＡＭＰＴレベルが年齢とともに直線的に低下することを見出し（図１Ｃ）、これは、ｅＮＡＭＰＴ分泌の基底となるプロセスおよび老化中のその潜在的意義が両方の種において保存され得ることを示唆する。血漿ｅＮＡＭＰＴレベルと加齢との間の潜在的な関連性をさらに評価するために、血漿ｅＮＡＭＰＴレベルの低下は、小規模前向き研究において、マウスのより高い死亡リスクおよび残存寿命を予測することができるかどうかを問うた。興味深いことに、ｅＮＡＭＰＴ測定日以降の個々のマウスが生存した日数は、その血漿ｅＮＡＭＰＴレベルと高度に相関していた（図１Ｄ）。血漿ｅＮＡＭＰＴのレベルが高いほど、残存寿命が長くなる。これらの結果は、循環ｅＮＡＭＰＴが、老化のプロセスだけでなく、哺乳動物の寿命も調節する上で重要な役割を果たし得るという興味深い仮説をもたらした。

実施例２：Ｎａｍｐｔの脂肪組織特異的過剰発現は、老化中に複数の組織で血漿ｅＮＡＭＰＴレベルおよびＮＡＤ^＋生合成を維持する。
老化および寿命制御におけるｅＮＡＭＰＴの役割を調査するために、脂肪組織特異的Ｎａｍｐｔノックイン（ＡＮＫＩ）マウスの加齢コホートを調べた（Ｙｏｏｎ ｅｔ ａｌ．，２０１５）。４ヶ月齢では、血漿ｅＮＡＭＰＴレベルは、ＡＮＫＩマウスと対照マウスとの間で、自由摂食条件下で異なっていなかった（図２Ａ）。若年ＡＮＫＩマウスは、絶食に応答してのみ著しく高いレベルの血漿ｅＮＡＭＰＴを示した（Ｙｏｏｎ ｅｔ ａｌ．，２０１５）。それらが２４ヶ月齢に達したとき、血漿ｅＮＡＭＰＴレベルは、年齢が一致した対照マウスのものと比較して、それぞれＡＮＫＩ雌および雄マウスにおいて３．３倍および３．６倍高いレベルで維持された（図２Ｂ）。１８ヶ月齢のＡＮＫＩマウスにおける血漿ｅＮＡＭＰＴレベルは、６ヶ月齢の対照マウスのものと同等であった（図９Ａ）。脂肪組織Ｎａｍｐｔ過剰発現は、対照マウスのものと比較して、加齢ＡＮＫＩマウスにおいて約１．５倍高く維持され、Ｎａｍｐｔ過剰発現が生理学的範囲内であることを確認し、ＡＮＫＩモデルが生理学的に有効であることを示唆した（データには示さず）。

自由に摂食させた２０ヶ月齢のＡＮＫＩマウスにおいて、雌では視床下部、海馬、膵臓、および網膜においてＮＡＤ^＋レベルの増加が観察されたが、雄では膵臓および網膜のみにおいてＮＡＤ^＋レベルの増加が示された（図２Ｃおよび９Ｂ）。加齢ＡＮＫＩマウスにおけるＮＡＤ^＋レベルの増加を示した組織は、ｉＮＡＭＰＴのレベルが比較的非常に低い組織であることに留意されたい（Ｒｅｖｏｌｌｏ ｅｔ ａｌ．，２００７、Ｓｔｅｉｎ ｅｔ ａｌ．，２０１４、Ｙｏｏｎ ｅｔ ａｌ．，２０１５）。これらの結果は、Ｎａｍｐｔの脂肪組織特異的過剰発現が、視床下部、海馬、膵臓、および網膜を含む複数の組織における循環ｅＮＡＭＰＴレベルおよび組織ＮＡＤ^＋レベルの年齢依存的低下を緩和することを示唆する。

実施例３：加齢ＡＮＫＩマウスは、身体活動および睡眠の質の著しい向上を示す。
加齢ＡＮＫＩ雌マウスにおいて視床下部ＮＡＤ^＋レベルが増加し、また、老化中の身体活動および睡眠の質を調節するために視床下部ＳＩＲＴ１活性が重要であることを考慮して（Ｓａｔｏｈ ｅｔ ａｌ．，２０１３、Ｓａｔｏｈ ｅｔ ａｌ．，２０１５）、加齢ＡＮＫＩ雌マウスにおけるこれらの年齢関連の生理学的特性を調べた。年齢に伴う循環ｅＮＡＭＰＴレベルの低下と一致して、６ヶ月齢の野生型マウスと比較して、１８ヶ月齢の野生型マウスでは暗闇時間中の輪走活動が有意に低下した（図１０Ａ）。４ヶ月齢のＡＮＫＩ雌マウスは、年齢が一致した対照マウスのものと同等レベルの暗闇時間中の輪走活動を呈したが、１８ヶ月齢のＡＮＫＩ雌マウスは、６ヶ月齢の野生型マウスの活性レベルと同様に、年齢が一致した対照マウスのものと比較して有意に強化された輪走活動を示した（図３Ａおよび１０Ａ）。加えて、これらのマウスのオープンフィールドにおける自発運動活動を評価した。暗闇時間中の輪走活動と一致して、加齢ＡＮＫＩ雌マウスは、年齢が一致した対照マウスと比較して、有意により高い総歩行活動および立ち上がり活動を示した（図３Ｂ）。しかしながら、加齢ＡＮＫＩ雄マウスは、視床下部におけるＮＡＤ^＋増加の欠如と一致して、年齢が一致した対照マウス（図１０Ｂ）と比較して、総歩行活動および立ち上がり活動においていかなる有意差も示さなかった（図２Ｃ）。

ヒトでは、睡眠覚醒の移行の数が年齢とともに増加することがよく記録されており、睡眠断片化と呼ばれる現象である（Ｍａｎｄｅｒ ｅｔ ａｌ．，２０１７）。老齢のヒトにおけるそのような変化と一致して、２０ヶ月齢の野生型マウスはまた、４ヶ月齢の野生型マウスのものと比較して、非ＲＥＭ（ＮＲＥＭ）睡眠サイクルと覚醒サイクルとの間の移行の数の増加を示し（図３Ｃ、左パネル）、マウスにおいて年齢とともに睡眠断片化が著しく増加することを示した。ＲＥＭ睡眠サイクルと覚醒またはＮＲＥＭ睡眠サイクルとの間の移行の数に差異はなかった（データには示さず）。興味深いことに、年齢が一致した対照マウスと比較して、加齢ＡＮＫＩマウスは、ＮＲＥＭ睡眠と覚醒サイクルとの間の移行の数において著しい低下を示し、これは、４ヶ月齢の野生型マウスで見られたものと同様のレベルを維持し（図３Ｃ、右パネル）、加齢ＡＮＫＩマウスがより良好な睡眠の質を維持することを暗示した。

これらの年齢関連の活動および睡眠特性は、その下流標的遺伝子であるオレキシン２受容体（Ｏｘ２ｒ）およびＰＲドメイン１３（Ｐｒｄｍ１３）の調節を通じて、視床下部ＳＩＲＴ１によって調節される（Ｓａｔｏｈ ｅｔ ａｌ．，２０１３、Ｓａｔｏｈ ｅｔ ａｌ．，２０１５）。Ｏｘ２ｒ発現は、暗闇時間における輪走活動の制御に重要である（Ｓａｔｏｈ ｅｔ ａｌ．，２０１３）が、一方、Ｐｒｄｍ１３発現は、睡眠の質の維持に重要である（Ｓａｔｏｈ ｅｔ ａｌ．，２０１５）。したがって、年齢が一致した対照およびＡＮＫＩ雌マウスの視床下部におけるＯｘ２ｒおよびＰｒｄｍ１３のｍＲＮＡ発現レベルを調べた。身体活動および睡眠の質の観察された向上と一致して、視床下部Ｏｘ２ｒおよびＰｒｄｍ１３発現レベルは、年齢が一致した対照マウスと比較して、加齢ＡＮＫＩ雌マウスで有意に増加された（図３Ｄ）。これらの結果は、循環ｅＮＡＭＰＴレベルの年齢関連の低下が、視床下部ＮＡＤ^＋レベルおよびＳＩＲＴ１活性の低下に寄与し、身体活動および睡眠の質の年齢関連の低下をもたらすことを示し、これらの機能低下は、循環ｅＮＡＭＰＴを増加させることによって改善することができることを示す。

実施例４：加齢ＡＮＫＩマウスは、グルコース刺激インスリン分泌、光受容体機能、および認知機能の著しい改善を示す。
膵臓、網膜、および海馬のＮＡＤ^＋レベルは、加齢ＡＮＫＩマウスで増加されたため（図２Ｃ）、それらはまた、グルコース代謝、網膜機能、および認知機能の改善を呈し得ると疑った。まず、加齢ＡＮＫＩマウスおよび対照マウスで腹腔内グルコース負荷試験（ＩＰＧＴＴ）を行った。加齢ＡＮＫＩ雄マウスにおいて、グルコース耐性の中等度であるが有意な改善が観察された（図４Ａ）。ＩＰＧＴＴの間、３０分の時点でのグルコース刺激インスリン分泌の有意な増加も検出した（図４Ｂ）。インスリン負荷試験の結果は、加齢ＡＮＫＩマウスと対照マウスとの間で異なっておらず、両方とも重篤なインスリン抵抗性を示し（図１１Ａ）、加齢ＡＮＫＩマウスにおけるグルコース耐性の改善は、主にインスリン分泌の増加に起因することを示唆している。興味深いことに、加齢ＡＮＫＩマウスは、年齢が一致した対照と比較して、より高い総数の膵島を保有していた（図４ＣおよびＤ）。加えて、加齢ＡＮＫＩ雄で観察されたこれらの膵島は、年齢が一致した対照で観察された膵島よりも小さく維持された（図４Ｅ）。これらの結果は、膵臓β細胞におけるグルコース刺激インスリン分泌の促進およびストレスからのそれらの保護におけるＮＡＤ^＋生合成およびＳＩＲＴ１の役割と一致している（Ｋｉｔａｍｕｒａ ｅｔ ａｌ．，２００５、Ｍｏｙｎｉｈａｎ ｅｔ ａｌ．，２００５、Ｒａｍｓｅｙ ｅｔ ａｌ．，２００８、Ｒｅｖｏｌｌｏ ｅｔ ａｌ．，２００７）。加齢ＡＮＫＩ雌マウスはまた、より高い総数の膵島を維持したが、膵臓ＮＡＤ^＋レベルにおけるはるかに大きな変動と一致して（図２Ｃ）、グルコース耐性の改善を示さなかった（データには示さず）。加齢ＡＮＫＩ雌マウスは、体重および脂肪質量の中等度の増加を示したが、加齢ＡＮＫＩ雄マウスは、差異を示さなかった（図１１Ｂおよび１１Ｃ）。さらに、それらの食物摂取量は、それらの年齢が一致した対照と比較して、全く有意差を示さなかった（図１１Ｄ）。また、加齢ＡＮＫＩマウスにおける炎症促進性サイトカインの循環レベルを調べた。加齢ＡＮＫＩ雌におけるＩＬ－２のわずかな増加およびＧ－ＣＳＦの中等度の減少を除いて、加齢ＡＮＫＩ雄および雌の両方において、循環炎症促進性サイトカインレベルに著しい変化はなかった（図１１Ｅ）。したがって、グルコース代謝において観察されるＡＮＫＩ表現型は、体重、脂肪、または炎症促進性サイトカインレベルとは無関係である。

次に、桿体および錐体を主体とした試験条件下で網膜機能を調べるために、網膜電図を行った。年齢が一致した対照マウスと比較して、加齢ＡＮＫＩマウスは、５ｄｂで著しく高い暗順応ａ波振幅を示し、－４および０ｄｂでより高い暗順応ａ波振幅の傾向を示したことを見出した。（図４Ｆ、左パネル）、桿体光受容体機能の改善を示す。同様に、桿体光受容体機能の改善はまた、強化された暗順応ｂ波の傾向にもつながった（図４Ｆ、中央パネル）。また、加齢ＡＮＫＩマウスでは、強化された明順応ｂ波振幅の傾向が観察され、これは、強化された錐体機能を示唆した（図４Ｆ、右パネル）。興味深いことに、これらの変化は、長期的なＮＭＮ投与で観察されるものと著しく類似している（Ｍｉｌｌｓ ｅｔ ａｌ．，２０１６）。

また、加齢ＡＮＫＩマウスおよび年齢が一致した対照マウスに対して文脈的恐怖条件付け試験を行い、それらの非空間的海馬依存性学習および記憶能力を評価した。両方のマウスは、ベースラインおよび１日目のトレーニング試験中に同等の応答を示した（図１１Ｆ、第１のグラフ）。しかしながら、２日目の文脈的恐怖条件付け試験の最初の１分間に、加齢ＡＮＫＩマウスは、年齢が一致した対照と比較して著しく高いレベルのすくみ行動を示した（図１１Ｆ、第２のグラフ）。同様の傾向は、この試験中に２分および３分の時点でも観察された。ベースラインおよび３日目の聴覚キュー試験を通じて、加齢ＡＮＫＩマウスおよび年齢が一致した対照マウスは、いかなる有意差も示さなかった（図１１Ｆ、第３のグラフ）。それらの海馬ＮＡＤ^＋増加と一致して、これらの結果は、加齢ＡＮＫＩマウスが、それらの年齢が一致した対照と比較して、より良好な海馬依存性認知機能を維持することを示唆する。したがって、まとめると、これらの所見は、全身性ＮＡＤ^＋生合成を増強することによって、老化中の視床下部、海馬、膵臓、および網膜などの組織機能の維持におけるｅＮＡＭＰＴの生理学的意義へのさらなる支持を提供する。

実施例５：ＡＮＫＩ雌マウスは、寿命の中央値の有意な延長および老化の遅延を呈する。
より高いｅＮＡＭＰＴレベルを維持することは、加齢ＡＮＫＩマウスにおける年齢関連の機能低下を有意に緩和するため、ＡＮＫＩマウスおよび対照マウスのコホートを設定して、それらの寿命を調べる。標準的な飼料を自由に摂食させたとき、ＡＮＫＩ雌マウスは、寿命の中央値の統計的に有意な延長（１３．４％）を示した（対照６９３日対ＡＮＫＩ ７８６日、ゲーハン－ブレスロー－ウィルコクソン検定、χ^２＝６．０４３、ｄｆ＝１、ｐ＝０．０１４）（図５Ａ表２）。

それらの最大寿命は、対照マウスの寿命と変わらなかった（表２）。興味深いことに、ＡＮＫＩ雌マウスは、約２年齢までの年齢関連の死亡率において有意な遅延を呈した（図５Ｂ）。しかしながら、寿命の終わりに近づいて、年齢関連の死亡率の差はもはや存在せず、これが最大寿命の延長の欠如を説明し得る。新生物は死亡の主要な原因であるが、ＡＮＫＩマウスと対照マウスとの間で、新生物の発生率および種類は変わらなかった（表３）。

雌とは対照的に、最高齢の１０％ＡＮＫＩ雄は、対照マウスと比較して有意により長い最大寿命を示したが、ＡＮＫＩ雄マウスは、寿命延長は呈さず（図５Ａおよび表２）、ほとんどの寿命を通じて年齢関連の死亡率に差はなかった（図５Ｂ）。これらの結果は、著しい性差があるが、若年レベルの循環ｅＮＡＭＰＴを維持することが、老化を遅らせ、かつマウスにおける健康寿命を延長するために重要であることを実証する。

実施例６：血漿ｅＮＡＭＰＴは細胞外小胞のみに局在している。
循環ｅＮＡＭＰＴが組織ＮＡＤ^＋生合成をどのように増強するかは、現在のところ理解し難いままである。ｅＮＡＭＰＴが組織特異的な方法でＮＡＤ^＋生合成を増強するという所見は、循環ｅＮＡＭＰＴが、その標的組織におけるＮＡＤ^＋生合成に直接寄与し得ることを示唆した。近年、ある組織から別の組織へのＥＶによるマイクロＲＮＡの輸送機構は、組織間相互作用の重要な機構として多くの注目を集めている（Ｗｈｉｔｈａｍ ｅｔ ａｌ．，２０１８、Ｙｉｎｇ ｅｔ ａｌ．，２０１７、Ｚｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．，２０１７）。このため、ｅＮＡＭＰＴも全身循環でＥＶによって輸送され得るかどうかを問うた。従来の超遠心分離によって、またはポリマーベースの全エクソソーム単離（ＴＥＩ）キットを使用して、マウス血漿からＥＶを精製した。ＴＥＩ法からのＥＶの収率は超遠心分離よりもはるかに高かったが、両方の方法は、全血漿または残りの非ＥＶ画分と比較して、ｅＮＡＭＰＴがＥＶ画分において高度に濃縮されていることを明確に示した（図６Ａ）。ＥＶにおけるｅＮＡＭＰＴの局在化は、ＴＧ１０１、ＣＤ６３、ＣＤ８１、およびＣＤ９を含むいくつかのＥＶマーカーの濃縮、ならびにトランスフェリンおよびアルブミンの枯渇によっても確認された。また、ＴＥＩまたは超遠心分離からのＥＶ画分を、スクロース密度勾配に浮遊させることによってさらに精製した。両方のＥＶ画分において、ｅＮＡＭＰＴは、スクロース密度勾配からの第３の画分において、Ａｌｉｘ、ＴＳＧ１０１、ＣＤ６３、ＣＤ８１、およびＣＤ９を含む他のいくつかのＥＶマーカーで明確に検出された（図６Ｂおよび１２Ａ）。さらに、ＴＥＩ法によって単離されたｅＮＡＭＰＴ含有ＥＶを担持する画分の密度を測定した。ｅＮＡＭＰＴは、１．１０～１．１５の範囲のＥＶについて以前に報告された密度画分において、ＥＶマーカーの１つであるＡｌｉｘで共精製された（図１２Ｂ）（Ｙｉｎｇ ｅｔ ａｌ．，２０１７）。ヒト血漿中のｅＮＡＭＰＴがＥＶに含まれているかどうかも調べた。マウスｅＮＡＭＰＴと一致して、ヒト血漿ｅＮＡＭＰＴは主にＥＶ画分に含まれていた（図６Ｃ）。マウスおよびヒト血漿からのＥＶの適切な濃縮は、電子顕微鏡法によってさらに確認され（図１２Ｃおよび１２Ｄ）、これは、マウスおよびヒト血漿から精製されたＥＶの種類が、小さなＥＶとして特徴付けられるものと一致することを示す（Ｄｕｒｃｉｎ ｅｔ ａｌ．，２０１７）。残念ながら、ＥＶに含まれるｅＮＡＭＰＴの免疫ゴールド標識の試みは、この目的に適切な抗体が利用できないために失敗した。したがって、血漿中のｅＮＡＭＰＴが、そのＥＶ内の局在化によりプロテアーゼ処置から保護されるかどうかを調べた。プロテイナーゼＫによる血漿の処理が、トランスフェリンおよび免疫グロブリン軽鎖などの循環血漿タンパク質をほぼ完全に消化したのに対し、ｅＮＡＭＰＴおよびＥＶマーカーＴＳＧ１０１は、プロテイナーゼＫの消化に対する耐性を呈した（図６Ｄ）。さらに、洗剤（Ｔｒｉｔｏｎ－Ｘ）を添加してＥＶの脂質二重層を溶解させると、プロテイナーゼＫ処理はｅＮＡＭＰＴおよびＴＳＧ１０１を排除することができた。これらの所見はさらに、血液循環に分泌されたｅＮＡＭＰＴがＥＶに封入されたことを確認した。培養したＯＰ９脂肪細胞を用いることにより、完全に分化した脂肪細胞は、ｅＮＡＭＰＴおよび他のＥＶマーカータンパク質を含むが、アディポネクチンおよびアディプシンなどの他の分泌タンパク質を含まないＥＶを分泌することも確認した（図１２Ｅ）。

ＥＶにおけるｅＮＡＭＰＴ含有量が６～２２ヶ月齢のマウスで劇的に減少したことを見出した（図６Ｅ）。また、２４ヶ月齢のＡＮＫＩマウスからのＥＶにおけるｅＮＡＭＰＴの含有量は、年齢が一致した対照マウスよりも有意に高かったことを見出した（図６Ｆ）。これらの観察されたＥＶに含まれるｅＮＡＭＰＴレベルの変化は、若年（６ヶ月齢）マウスと加齢（２４ヶ月齢）マウスとの間、および加齢ＡＮＫＩマウスと対照マウスとの間のＥＶ含有タンパク質のプロテオミクス比較が、ＥＶ含有タンパク質（同定された１８１タンパク質）のわずかな画分（２～３％）のみが、これらの条件において有意な変化を呈し、これらのタンパク質のいずれもＮＡＤ^＋代謝に関連しないことを示したため、生理学的に重要であった（図１２Ｆ）。まとめると、この結果は、マウスおよびヒトの循環におけるｅＮＡＭＰＴがＥＶによって担持されること、ならびに老化中またはＡＮＫＩマウスにおいて観察される血漿ｅＮＡＭＰＴレベルの変化が、ＥＶに含まれるｅＮＡＭＰＴに特異的な変化に起因することを示す。

実施例７：ＥＶに含まれるｅＮＡＭＰＴは細胞内に内在化され、ＮＡＤ^＋生合成を直接増強する。
ＥＶ内のｅＮＡＭＰＴ局在化を実証した後、ＥＶに含まれるｅＮＡＭＰＴが細胞内に内在化され、細胞内でＮＡＤ^＋生合成を増強できるかどうかを調べた。まず、ＥＶの脂質二重層を標識することができる赤色蛍光色素であるＢＯＤＩＰＹ ＴＲセラミドを用いて単離されたＥＶを標識し、次に、これらのＢＯＤＩＰＹ標識ＥＶとともに一次視床下部ニューロンをインキュベートした。一次視床下部ニューロンは、ＢＯＤＩＰＹ標識ＥＶを添加するときのみ標識したが、対照ＢＯＤＩＰＹ処置培地を添加するときは標識せず、ＥＶが一次視床下部ニューロンに組み込まれたことを示唆した（図７Ａ）。図７．ＥＶに含まれるｅＮＡＭＰＴは、一次視床下部ニューロンにおけるＮＡＤ＋生合成を直接増強し、マウスにおける年齢関連の身体活動の低下を改善し、寿命を延長する。

次に、細菌産生ＦＬＡＧタグ付き組換えＮＡＭＰＴ単独またはＥＶに封入されたＦＬＡＧタグ付き組換えＮＡＭＰＴを一次視床下部ニューロンに添加した。興味深いことに、ＥＶに含まれるＦＬＡＧタグ付きＮＡＭＰＴのみが、一次視床下部ニューロンの細胞質画分に内在化された（図７Ｂ）。ＦＬＡＧタグ付き組換えＮＡＭＰＴを精製されたＥＶに組み込むとき、追加の量のＮＡＭＰＴを有するこれらのＥＶは、一次視床下部ニューロンにおける細胞内ＮＡＤ^＋レベルを増加させることができた（図７Ｂ、右のパネル）。細胞ＮＡＤ^＋生合成に対するＥＶに含まれるｅＮＡＭＰＴの効果をさらに確認するために、一次視床下部ニューロンにおける同位体標識ニコチンアミド（Ｄ－４－ＮＡＭ）を使用してＮＡＤ^＋生合成速度を測定した。超遠心分離およびＴＥＩ法によりマウス血漿から精製された両方のＥＶ（タンパク質濃度として１μｇ／μｌ）は、対照と比較して、ＮＡＤ^＋生合成において同等の増加を示した（図７Ｃ）。ＮＡＤ^＋生合成に対する観察された効果が、ＥＶに含まれるｅＮＡＭＰＴの酵素活性に起因するかどうかを調べるために、超遠心分離によってＯＰ９脂肪細胞の培養培地から精製されたＥＶを使用した。ＯＰ９脂肪細胞からの超遠心分離により精製されたＥＶが、一次視床下部ニューロンに適切に内在化されたことを確認した（図１３Ａ）。このＯＰ９脂肪細胞系を使用して、ＥＶ枯渇上清ではないが、ＯＰ９培養培地からの濃縮されたＥＶは、一次視床下部ニューロンにおけるＮＭＮ生合成の有意な増強を示したことを実証した（図１３Ｂ）。次いで、対照およびＮａｍｐｔノックダウン（Ｎａｍｐｔ－ＫＤ）ＯＰ９脂肪細胞の培地から精製されたＥＶの、一次視床下部ニューロンにおけるＮＭＮ生合成に対する効果を比較した。ＮＡＭＰＴ発現は、Ｎａｍｐｔ－ＫＤ ＯＰ９脂肪細胞から分泌されるＥＶで８０％低減された（図１３Ｃ）。対照ＯＰ９脂肪細胞の培養培地から精製されたＥＶが、ＮＭＮ生合成の増強を明らかに示したのに対し、Ｎａｍｐｔ－ＫＤ ＯＰ９脂肪細胞の培養培地から精製されたＥＶは、一次視床下部ニューロンにおけるＮＭＮ生合成の増強を示さず（図７Ｄ）、細胞ＮＭＮ／ＮＡＤ^＋生合成を刺激するＥＶのこれらの効果が、主にＥＶに含まれるｅＮＡＭＰＴに起因することを実証した。

ＥＶに含まれるｅＮＡＭＰＴの一次視床下部ニューロンの細胞質への内在化もまた、マウス血漿ならびに６および１８ヶ月齢のマウスから精製されたＥＶを使用することによって調べた（図１３Ｄおよび７Ｅ）。細胞質中の内在化ＮＡＭＰＴの量は、元の血漿または精製されたＥＶに含まれるｅＮＡＭＰＴの量を反映しており、若年マウスからのＥＶが、加齢マウスからのものと比較して、より多くの量のｅＮＡＭＰＴを細胞に送達することができることを示す。次に、一次視床下部ニューロンにおけるＮＡＤ^＋生合成を刺激する、若年および加齢マウス血漿から精製されたＥＶの能力を比較した。細胞内ＮＡＤ^＋レベルの増加は、６ヶ月齢のマウスからのＥＶでは、２０～２２ヶ月齢のマウスからのものと比較して有意により高かった（図７Ｆ）。さらに、ＡＮＫＩ雄および雌マウスからのＥＶは、年齢が一致した対照マウスからのものと比較して、一次視床下部ニューロンにおける細胞内ＮＡＤ^＋レベルを増加させることができた（図７Ｇ）。これらの結果は、標的細胞内に内在化されるＥＶに含まれるｅＮＡＭＰＴが、その標的細胞内のＮＭＮ／ＮＡＤ^＋生合成の増強に寄与し得るという説得力のある証拠を提供する。

実施例８：ＥＶに含まれるｅＮＡＭＰＴの補充は、加齢マウスにおける輪走活動を強化し、寿命を延長する。
ＥＶに含まれるｅＮＡＭＰＴは、一次視床下部ニューロンにおける細胞内ＮＡＤ^＋レベルを増強することができたことを考慮して、ｅＮＡＭＰＴ含有ＥＶの補充は、加齢ＡＮＫＩマウスで観察されるように、加齢野生型マウスに同様の老化防止効果を伝達することができると推論した。この可能性を検証するため、４～６ヶ月齢のマウスの血漿から精製されたＥＶを、２０ヶ月齢の野生型雌マウスに４日間連続で腹腔内注射した。注目すべきことには、若年マウスの血漿から精製されたＥＶの補充は、ＰＢＳ注射された年齢が一致した対照マウスと比較して、暗闇時間中の加齢マウスにおける輪走活動を有意に強化した（図１３Ｅおよび７Ｈ）。興味深いことに、暗闇時間中の輪走活動が明らかに増加したが、光時間中の活動は有意に減少し、それらのＥＶ注射された加齢マウスがより良好に眠り得ることを暗示する。この効果がＥＶに含まれるｅＮＡＭＰＴに起因するかどうかをさらに確認するために、対照およびＮａｍｐｔ－ＫＤ ＯＰ９脂肪細胞の培養培地から精製されたＥＶを注射することにより、加齢野生型雌マウスの輪走活動を比較した。対照ＯＰ９培地から精製されたＥＶが、暗闇時間および光時間中に輪走活動の有意な増加および減少を再び呈したのに対し、Ｎａｍｐｔ－ＫＤ ＯＰ９培地から精製されたＥＶは、これらの効果を示すことができず（図７Ｉおよび１３Ｆ）、この効果がＥＶに含まれるｅＮＡＭＰＴによって媒介されることを実証した。加齢雄マウスにおいても、輪走活動の軽度の強化が観察され（図１３Ｇ）、雄マウスは、高レベルのＥＶに含まれるｅＮＡＭＰＴの補充にも応答することができることを示唆した。

次いで、若年マウスの血漿から精製されたｅＮＡＭＰＴ含有ＥＶが、加齢マウスの寿命を延長することができるかどうかを試験した。若年～中年（４～１２ヶ月齢）のマウスから精製されたＥＶを、２６ヶ月齢の雌マウスに週１回注射し始めた。注目すべきことには、若年～中年マウスから精製されたＥＶの補充により、加齢マウスの寿命が有意に延長した（図７Ｊ）。寿命の中央値は１０．２％延長され（ビヒクル注射マウスの場合８４０日、ＥＶ注射マウスの場合９２６日、ゲーハン－ブレスロー－ウィルコクソン検定、χ^２＝１１．１０、ｄｆ＝１、ｐ＝０．０００９）、結果が記録された時点で２匹のマウスはまだ生存していた。各群における４匹の最も長く生きたマウスの平均最大寿命は、ビヒクル注射されたマウスおよびＥＶ注射されたマウスでそれぞれ８８１±６３．６および９９９±４７日であった（スチューデントｔ検定、ｐ＝０．００１６、１３．３％延長）。ＥＶ注射された加齢マウスは、ビヒクル注射された年齢が一致した対照マウスと比較して、概して、はるかに健康的な外観およびより高い活動を維持した（図７Ｋ）。まとめると、これらの知見は、ＥＶに含まれるｅＮＡＭＰＴの補充が、マウスにおける年齢関連の機能低下を緩和し、かつ寿命を延長するための効果的な老化防止介入であることを示す。

実施例１～８の結果は、マウスにおける老化のプロセスを制御し、かつ健康寿命および寿命を決定する上で、重要なＮＡＤ^＋生合成酵素であるｅＮＡＭＰＴを特定の組織に送達する新規のＥＶ媒介性組織間相互作用機構の重要性を示す。年齢関連の、循環するＥＶに含まれるｅＮＡＭＰＴのレベルの低下は、視床下部、海馬、膵臓、および網膜を含む、これらの標的組織におけるＮＡＤ^＋利用可能性および組織機能を制限する。さらに、ＥＶに含まれるｅＮＡＭＰＴを加齢マウスに補充することは、遺伝的または薬理学的に、老化中の年齢関連の生理学的低下を緩和し、マウスの寿命を延長することが示された。

視床下部は、哺乳動物における高次の老化制御センターとして機能することが示唆されているため（Ｓａｔｏｈ ｅｔ ａｌ．，２０１３、Ｚｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．，２０１３、Ｚｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．，２０１７）、脂肪組織から分泌されるｅＮＡＭＰＴが、老化のプロセスおよび最終的な寿命に影響を与える重要な役割を果たしていると仮定された。この仮説に対処するために、脂肪組織特異的Ｎａｍｐｔノックイン（ＡＮＫＩ）マウスを生み出し（Ｙｏｏｎ ｅｔ ａｌ．，２０１５）、それらの老化表現型を特徴付けた。興味深いことに、加齢ＡＮＫＩマウスは、視床下部、海馬、膵臓、および網膜を含む複数の組織において、若年レベルの循環ｅＮＡＭＰＴおよび増加したＮＡＤ^＋レベルを維持し、身体活動、睡眠の質、認知機能、グルコース代謝、および光受容体機能において有意な改善を呈した。老化に対するこれらの有益な効果により、ＡＮＫＩマウス、特に雌は、健康寿命の有意な延長を示した。驚くべきことに、ｅＮＡＭＰＴが、マウスおよびヒトにおいて血液循環を介して細胞外小胞（ＥＶ）において担持されたことを見出した。ＥＶに含まれるｅＮＡＭＰＴは一次視床下部ニューロンに内在化され、細胞内でＮＡＤ^＋生合成を増強した。Ｎａｍｐｔノックダウン脂肪細胞からではないが、若年マウスまたは培養脂肪細胞から精製されたｅＮＡＭＰＴ含有ＥＶを注射により、加齢マウスにおける輪走活動を強化し、寿命を延長することができた。これらの所見は、ｅＮＡＭＰＴのＥＶ媒介性送達によって駆動される新規の組織間相互作用機構を示す。ＥＶに含まれるｅＮＡＭＰＴによって媒介されるこの新しい生理学的系は、全身性ＮＡＤ^＋生合成の維持および年齢関連の生理学的低下への対抗に重要な役割を果たし、ヒトにおける潜在的な老化防止生物学的薬剤としてのＥＶに含まれるｅＮＡＭＰＴを暗示する。

本明細書の実施例１～８は、ｅＮＡＭＰＴのＥＶ媒介性全身送達が、マウスにおける視床下部、海馬、膵臓、および網膜を含む特定の標的組織における年齢関連の機能低下を緩和し、年齢関連の死亡率を遅延させ、健康寿命および寿命を延長することを示す。この研究における驚くべき所見は、ＥＶに含まれるｅＮＡＭＰＴが標的細胞に内在化され、細胞内でＮＭＮ／ＮＡＤ^＋生合成を増強する一方で、ＮＡＭＰＴタンパク質単独ではそれ自体で内在化することができないことである。これは、哺乳動物におけるｅＮＡＭＰＴの生理学的重要性および機能に関する長年にわたる議論の重要な解決策を提供する。ｅＮＡＭＰＴが全身性ＮＡＤ^＋生合成酵素として機能し、視床下部におけるＮＡＤ^＋、ＳＩＲＴ１活性、および神経活性を増強させることができる一方で（Ｒｅｖｏｌｌｏ ｅｔ ａｌ．，２００７、Ｙｏｏｎ ｅｔ ａｌ．，２０１５）、ｅＮＡＭＰＴは炎症促進性サイトカインとしても機能することが報告されている（Ｄａｈｌ ｅｔ ａｌ．，２０１２）。循環中のｅＮＡＭＰＴは、生理的条件下ではほぼ完全にＥＶのみに含まれ、またＥＶに含まれるｅＮＡＭＰＴのみが細胞の細胞質画分に適切に内在化されることを考慮すると、ｅＮＡＭＰＴの生理学的関連性および機能は、全身的に、特に視床下部、海馬、膵臓、および網膜などの比較的低レベルのｉＮＡＭＰＴを有する組織において、ＮＭＮ／ＮＡＤ^＋生合成を維持することであることが示唆される。ｅＮＡＭＰＴ含有ＥＶがこれらの組織に特異的に標的化される正確な機構は解明される必要があるが、ｅＮＡＭＰＴのこのＥＶ媒介性全身送達は、哺乳動物における全身にわたるＮＡＤ^＋恒常性を維持し、かつ老化のプロセスおよび寿命を調節する新規の組織間相互作用機構である。

ＮＡＭＰＴ媒介性ＮＡＤ^＋生合成の全身的な低下は、老化中の組織機能を制限する。
哺乳動物において、ＮＡＭＰＴは、ビタミンＢ_３の形態であるニコチンアミドから始まる主要なＮＡＤ^＋生合成経路における速度制限酵素である。現在では、全身性ＮＡＤ^＋利用可能性が年齢にわたり劇的に低下し、ｉＮＡＭＰＴレベルの年齢関連の低下が多くの組織におけるＮＡＤ^＋利用可能性の制限に寄与することが十分に確立されている（Ｙｏｓｈｉｎｏ ｅｔ ａｌ．，２０１８）。ここで、循環ｅＮＡＭＰＴレベルが、マウスおよびヒトの年齢とともに低下し、ｅＮＡＭＰＴ媒介性ＮＡＤ^＋生合成に依存する特定の組織におけるＮＡＤ^＋利用可能性を制限することを示す。Ｎａｍｐｔの脂肪組織特異的過剰発現は、循環ｅＮＡＭＰＴレベルを維持し、加齢マウスにおける身体活動、睡眠の質、グルコース刺激インスリン分泌、網膜光受容体機能、および認知機能の顕著な増強をもたらす。ｅＮＡＭＰＴのこれらの顕著な老化防止効果は、マウスにおける寿命の中央値の延長にも寄与する。加齢ＡＮＫＩマウスにおいて、炎症および癌リスクを含むｅＮＡＭＰＴのいかなる有意な副作用も観察されず、炎症促進性サイトカインとしてのｅＮＡＭＰＴの提案された主要機能に反論した。

循環ｅＮＡＭＰＴレベルは年齢とともに低下するため、時間の経過とともに組織の機能的恒常性を維持するためには、高レベルの循環ｅＮＡＭＰＴを維持する個体の能力が重要でなければならず、これが各個体の健康寿命を決定する可能性が高い。小規模前向き研究の結果は、この概念に対する説得力のある支持を提供し、循環ｅＮＡＭＰＴレベルと残存寿命との間に有意な相関関係を示す。脂肪組織からのｅＮＡＭＰＴ分泌がＮＡＤ^＋／ＳＩＲＴ１依存的様式で調節されることを考えると（Ｙｏｏｎ ｅｔ ａｌ．，２０１５）、脂肪ＮＡＤ^＋のリザーバーおよび／またはターンオーバーは、ｅＮＡＭＰＴレベルを循環させ、それによって寿命のための重要な決定因子であり得る。興味深いことに、食事制限による寿命延長の効果は、中間年齢および後期年齢で測定された脂肪の低減と逆相関していることが報告されており、脂肪に関連するある特定の因子が、食事制限下での生存および寿命延長に重要であることを示唆する（Ｌｉａｏ ｅｔ ａｌ．，２０１１）。この結果に基づいて、脂肪組織から分泌されるｅＮＡＭＰＴが、食事制限の遅延した老化および寿命延長効果の顕著な要因であるかどうかを調べることが非常に興味深いであろう。

ｅＮＡＭＰＴの遺伝子補充は、老化を遅延させ、マウスにおける健康寿命を延長する。
加齢ＡＮＫＩマウスは、視床下部、海馬、膵臓、および網膜におけるＮＡＤ^＋レベルおよび組織機能の顕著な増強を示す。以前に、ＮＡＭＰＴ媒介性ＮＡＤ^＋生合成およびＮＡＤ^＋依存性サーチュインが、これらの組織機能の調節において重要な役割を果たすことを示した。視床下部において、ＮＡＤ^＋／ＳＩＲＴ１シグナル伝達は、老化のプロセスを制御し、寿命を決定するのに重要である（Ｓａｔｏｈ ｅｔ ａｌ．，２０１３）。海馬において、ＮＡＭＰＴは、興奮性ニューロン（Ｓｔｅｉｎ ｅｔ ａｌ．，２０１４）、特にＣＡ１領域のニューロン（Ｊｏｈｎｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，２０１８）の機能において重要な役割を果たす。膵臓β細胞において、ＮＡＭＰＴおよびＳＩＲＴ１は、グルコース刺激インスリン分泌を調節するために重要である（Ｍｏｙｎｉｈａｎ ｅｔ ａｌ．，２００５、Ｒｅｖｏｌｌｏ ｅｔ ａｌ．，２００７）。網膜において、ＮＡＭＰＴおよびミトコンドリアサーチュインＳＩＲＴ３／５は、桿体および錐体光受容体ニューロンの機能に不可欠である（Ｌｉｎ ｅｔ ａｌ．，２０１６、Ｍｉｌｌｓ ｅｔ ａｌ．，２０１６）。これらの組織は、ＮＡＤ^＋低下に対して最も脆弱な組織のグループを表す可能性が最も高い。ｅＮＡＭＰＴもまた、適切なＮＡＤ^＋生合成を維持するために標的化される他の組織が存在し得る。脂肪組織が循環ｅＮＡＭＰＴの主要な供給源であることを考慮すると（Ｙｏｏｎ ｅｔ ａｌ．，２０１５）、ＥＶ媒介性ｅＮＡＭＰＴ送達を通じて脂肪組織と他の組織との間の組織間相互作用をさらに解明することが重要であろう。

興味深いことに、加齢ＡＮＫＩマウスの表現型は、加齢ＢＲＡＳＴＯマウスの表現型と重複する（Ｓａｔｏｈ ｅｔ ａｌ．，２０１３）。特に、ＡＮＫＩ加齢およびＢＲＡＳＴＯマウスの両方において、輪走活動および睡眠の質の強化が観察される。これらの表現型と一致して、これらの表現型を担う２つのＳＩＲＴ１標的遺伝子であるＯｘ２ｒおよびＰｒｄｍ１３の視床下部発現レベル（Ｓａｔｏｈ ｅｔ ａｌ．，２０１３、Ｓａｔｏｈ ｅｔ ａｌ．，２０１５）は、両方のマウスモデルにおいて著しく増加される。それにもかかわらず、ＢＲＡＳＴＯマウスは、寿命の中央値および最大寿命の延長の両方を呈するが、ＡＮＫＩマウスは、寿命の中央値の延長のみを示す。ＢＲＡＳＴＯマウスとＡＮＫＩマウスとの間のこの不一致は、視床下部ニューロンにおけるＳＩＲＴ１のレベルが、主にそれらの機能の最大レベルを決定し、それによって最大寿命を制限する一方で、循環ｅＮＡＭＰＴのレベルが視床下部ニューロン機能の程度を調節し、それによって寿命の中央値を変化させるという興味深い可能性を示唆する。ｅＮＡＭＰＴ含有ＥＶの連続補充が、加齢マウスの寿命の中央値および最大寿命を延長することを考えると、ＡＮＫＩマウスにおけるｅＮＡＭＰＴの効果は、脂肪組織質量の低減によって老化の非常に後期の段階で阻害され得る。

実施例９
一次ニューロンをＥ１６でマウス胚から単離し、以下の添加剤の示される組み合わせを含む神経基底培地（ＮＢ）で、インビトロで７日後に処理した。未処理－ニューロンを、Ｂ２７、Ｎ２、およびグルタミン補充を含む標準的な神経基底培養培地に残した；ＮＢ－添加剤なしの神経基底；２００μｌ ＥＶ－２００μｌのマウス血漿から抽出したＥＶ、ＦＫ８６６（１０ｎＭ）－ＮＡＭＰＴ阻害剤；ＮＭＮ－２５０μＭのニコチンアミドモノヌクレオチド（ＮＡＤ＋前駆体）；ＳＮ－ＥＶ抽出後に血漿から回収した上清血清、１／２の比率でＮＢと組み合わせた。ＮＡＤ／ＮＡＤＨ－Ｇｌｏ蛍光キットにより、３０分間の適用可能な処置の後にＮＡＤ＋レベルを測定した。図１４は、細胞外小胞（ＥＶ）に含まれるｅＮＡＭＰＴの処置による、培養した初代マウス海馬ニューロンにおけるＮＡＤ＋生合成の誘導を示す。栄養枯渇したＮＢのみの培地で培養されたニューロンではＮＡＤ＋レベルが減少し、ＥＶの補充によって部分的に救済された効果がある。これらのデータは、ＥＶがニューロンＮＡＤ＋含有量を増加させるのに十分であることを示す。この増加は、ＦＫ８６６処置で遮断され、ＥＶ処置によって誘導されるＮＡＤ＋の増加がＮＡＭＰＴに依存することを示唆する。

初代海馬グリア培養物をｐ２仔から単離し、振盪して接着性の低いミクログリアを除去した。マウス血漿から単離したＥＶを、スフィンゴ脂質色素Ｂｏｄｉｐｙ－ＴＲ－セラミドで標識した。アストロサイト濃縮培養物を、これらの標識されたＥＶで３０分間処理し、続いて、アストロサイトマーカーＧＦＡＰの固定および免疫蛍光染色を行う。図１５は、初代マウスＧＦＡＰ＋アストロサイトにおける低レベルのＥＶ取り込み、およびＧＦＡＰ細胞におけるより実質的なＥＶ取り込みを示す。低レベルのＢｏｄｉｐｙ色素は、ＧＦＡＰ＋アストロサイト（白色の矢印）において観察することができ、アストロサイトによるある程度のＥＶの取り込みを示す。しかしながら、より実質的な染色は、ＧＦＡＰ細胞において明らかに見られ、そのいくつかは明らかなミクログリア形態を示す（白色の矢印）。これらのデータは、アストロサイトがＥＶを取り込むことができるが、ＥＶに対するアストロサイトの親和性が他の細胞型よりも低い場合があることを示す。

図１６は、ミクログリアによる顕著なＥＶの取り込みを示す。アストロサイト濃縮培養物から振盪した原発性マウス海馬ミクログリア細胞（図１５を参照されたい）を再播種し、同様にＢｏｄｉｐｙ標識ＥＶで処理した。ミクログリアマーカーＩＢＡ１の免疫蛍光標識でのＢｏｄｉｐｙシグナルの一貫した共局在化は、原発性ミクログリアによるかなりのＥＶの取り込みを示す。これらのデータは、少なくとも培養物において、ミクログリアがＥＶ取り込みに対する高い親和性を有することを示唆する。

本発明の要素またはその好ましい実施形態を紹介する場合、冠詞「ａ」、「ａｎ」、「ｔｈｅ」、および「ｓａｉｄ」は、要素のうちの１つ以上が存在することを意味することが意図される。「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」、および「有する（ｈａｖｉｎｇ）」という用語は、包括的であることが意図されており、列挙されている要素以外の追加の要素が存在し得ることを意味する。

以上のことから、本発明のいくつかの目的が達成され、他の有利な結果が達成されることが分かるであろう。本発明の範囲から逸脱することなく、上記の方法、プロセス、および組成物において様々な変更を行うことができるため、上記の説明に含まれ、かつ添付の図面に示されるすべての主題は、例示として解釈されるべきであり、限定的な意味で解釈されるべきではないことが意図される。

Claims (11)

1. 細胞外ニコチンアミドホスホリボシルトランスフェラーゼ（ｅＮＡＭＰＴ）および／またはその変異体ならびに細胞外小胞を含む、対象においてＮＭＮまたはＮＡＤ＋生合成を増加させるための組成物であって、前記細胞外小胞が、前記ｅＮＡＭＰＴおよび／またはその変異体を封入し、前記ｅＮＡＭＰＴの変異体が、配列番号１または配列番号２の野生型ＮＡＭＰＴと少なくとも９９％の配列同一性を含み、配列番号１の野生型ＮＡＭＰＴの５３位に対応する位置にアルギニン残基を有するアミノ酸配列、または、配列番号２の野生型ＮＡＭＰＴの５３位に対応する位置にアルギニン残基を有するアミノ酸配列をさらに含む、組成物。
2. 前記組成物が、前記ｅＮＡＭＰＴを含む複数の前記細胞外小胞を含み、前記小胞が、約１０ｎｍ～約２００ｎｍ、約１０ｎｍ～約１００ｎｍ、または約２０ｎｍ～約１００ｎｍの平均粒径を有することを特徴とする、請求項１に記載の組成物。
3. 前記組成物中のｅＮＡＭＰＴおよび／またはその変異体の濃度が、約１重量％～約２０重量％である、請求項１または２に記載の組成物。
4. 前記組成物が、ｅＮＡＭＰＴを含む、請求項１～３のいずれか一項に記載の組成物。
5. 前記ｅＮＡＭＰＴの変異体が、配列番号１の野生型ＮＡＭＰＴの５３位に対応する位置にアルギニン残基を有するアミノ酸配列を含み、前記変異体の残りのアミノ酸配列が、配列番号１と少なくとも９９％の配列同一性を含む、請求項１～３のいずれか一項に記載の組成物。
6. 前記ｅＮＡＭＰＴの変異体が、配列番号２の野生型ＮＡＭＰＴの５３位に対応する位置にアルギニン残基を有するアミノ酸配列を含み、前記変異体の残りのアミノ酸配列が、配列番号２と少なくとも９９％の配列同一性を含む、請求項１～３のいずれか一項に記載の組成物。
7. 前記ｅＮＡＭＰＴの変異体が、配列番号１または配列番号２の前記野生型ＮＡＭＰＴと少なくとも９９．９％の配列同一性を含む、請求項１～３のいずれか一項に記載の組成物。
8. 前記組成物が、脂肪細胞、血液、および／または血漿を含まないか、または本質的に含まない、請求項１～７のいずれか一項に記載の組成物。
9. 対象または細胞においてＮＭＮおよび／またはＮＡＤ＋生合成を増加させるための、請求項１～８のいずれか一項に記載の組成物を有効成分とする、医薬組成物。
10. 対象における年齢関連状態を予防または治療する医薬組成物であって、
    前記年齢関連状態が、身体活動の低下、睡眠の質の低下、認知機能の低下、グルコース代謝の低下、視力の低下、およびそれらの組み合わせからなる群から選択される生理学的状態を含む、請求項９に記載の医薬組成物。
11. 請求項１～８のいずれか一項に記載の組成物または請求項９または１０のいずれか一項に記載の医薬組成物を調製するためのプロセスであって、
    前記脂質ならびにｅＮＡＭＰＴおよび／またはその変異体を含む小胞を含む培地を分離プロセスに晒し、濃縮された小胞画分を得ることを含み、前記濃縮された小胞画分中の前記小胞の濃度が、前記培地中の前記小胞の濃度よりも高い、プロセス。