JPS5811024B2 - 液体中のアンモニア測定方法 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は液体中のアンモニアを測定する方法に関する。

さらに詳しくはアンモニアとフェノールを次亜塩素酸塩
と処理し生成するインドフェノールを比色定量するいわ
ゆるバースロット法（Ｊ・Ｂｅｒｔｈｅｌｏｔ：Ｒｅｐ
ｏｒｔ ｃｈｅｍ、Ａｐｐｔ １，２８４゜１８５９）
の改良に関する。

従って液体中のアンモニアは排水中のものであれ、空気
中のアンモニアを希硫酸（０，０２Ｎ）に溶解させたも
のであれ、食品類から抽出したものであれ、また生体液
中のものであれ、いずれの場合にも適用することができ
る。

ただ本発明者等が生体液特に血清中の尿素窒素の新しい
安全な測定方法を研究する過程で到達した発明であるの
でこの分野では特にメリットが大きい。

アンモニアの測定方法は歴史的に数多くの開発、改良が
なされ検体の種類、性質等によっているいろ使い分けら
れて来た。

例えば滴定法は水蒸気蒸留あるいは微量拡散法により分
離するアンモニアに適用するが、いずれも操作が非常に
繁雑で蒸留装置や微量拡散装置などの特殊な装置が必要
でありまた測定に長時間を要しさらに再現性も悪い等の
欠点があるため現在では殆ど用いられていない。

これに対し比色法は比色計の普及に伴って容易に測定が
可能になったため現在広く行なわれている。

その中でネスラー法、バースロット法（インドフェノー
ル法）が一番広く行なわれている。

ネスラー法は試薬としてヨウ化水銀と臭化カリウムを用
いこれにアンモニアを作用させ黄赤色の錯化合物を生成
させこれを比色定量する方法である。

この方法は古くから用いられて来たが試薬が不安定とい
う欠陥がある上現在では水銀化合物の使用が公害の上か
ら欠点となっている。

インドフェノール法は前述の通りフェノールとアンモニ
アを酸化してインドフェノールを生成しこれを測定する
方法であるが本発明においてはフェノールの替りにサリ
チル酸ナトリウムを使用する場合も含む。

いずれにしても反応速度をはやめるため触媒としてニト
ロプルジッドナトリウムを加えインドフェノールの発色
を増大させている。

インドフェノール法は感度がネスラー法より１０倍も高
く現在微量のアンモニアの定量には最も適した方法とい
える。

しかしこの方法もネスラー法のヨウ化水銀（毒物）使用
と同様ニトロプルジッドナトリウムというシアン化合物
（毒物）を使用するところに欠点がある。

アンモニアは古くから飲料水の衛生学的安全度の指標物
質として重視されているほか最近では水中アンモニアの
多寡が水中微生物の発生に重大な影響を与えるため海水
中のアンモニアの調査、また排水基準、汚水処理の目安
などにアンモニアの測定の機会及び重要性は増加の一途
にある。

このような状況下で感度の高い公害のおそれのない安全
なアンモニア測定方法の確立が強く望まれている。

本発明者等は血清中の尿素窒素測定の分野で酵素ウレア
ーゼを用いて血清中の尿素を分解し生成するアンモニア
をインドフェノール法で測定し尿素窒素を定量する方法
において、ニトロプルジッドナトリウムが公害上問題が
あることからこれに替る新しい触媒を研究した結果、ピ
ラゾールが最適であることを発見し本発明を完成した。

本発明の方法はバースロット法（インドフェノール法）
において触媒として使用するニトロプルジッドナトリウ
ムに替えピラゾールを使用し生成するインドフェノール
を測定し検量線からアンモニアを定量する方法である。

次に実施例により本発明の詳細な説明する。

実施例 １ 血清中の尿素窒素の測定： （１）原理 血清中の尿素に酵素ウレアーゼを作用させ分解し生成し
たアンモニアを本発明方法で測定する。

（２）試薬 （■） Ａ液 ピラゾール ５１．０６ｇ（０，７５Ｍ）サ
リチル酸ナトリウム ６４．０ ｇ （０，４Ｍ）Ｎａ
２ＨＰＯ４１，６１ｇ ＫＨ２ＰＯ４１，１８ｇ ＥＤＴＡ・２Ｎａ ２．０ｇ水に溶解全量
を１１とする （■）Ｂ液 Ｎａ０Ｃｌ 有効塩素量０．２％水溶液１Ｏ−５ＮＮ
ａＯＨでｐＨ１１，０に調製（■）ウレアーゼ液 ウレアーゼ ２８００ｕ ＮａＣｌ １．９５ｇ リン酸緩衝液（ｐＨ７，０）１ｄｌに溶解（■） 標準
液 尿素 ６４．３ｍｇ／ｄｌ（尿素窒素３０ｍｇ／ｄｌ
）水に溶解 水は全てイオン交換純水を使用する。

（３）操作 試料血清０．０２ｍ１を試験管にとりウレアーゼ液０．
０５ｍ１及びＡ液１．０ｍｌを加え３７℃で１０分間イ
ンキュベートし酵素反応を行なわせアンモニアを遊離す
る。

次にＢ液２．０ｍｌを加え再び３７℃で１５分間インキ
ュベートし発色させて続いて５分間流水で冷却すること
によって反応を停止する。

波長６５５ｎｍを用い試薬ブランクを対照とし吸光度を
測定し次の計算式から尿素窒素量を求めるか、別に常法
により作製した検量線（第２図参照）から濃度を求める
。

計算式 本発明方法を血清中の成分特に尿素窒素測定に適用した
場合の効果について説明すると次の通りである。

本発明方法の発色の波長吸収曲線は第１図に示す通りで
標準液血清共に６５５ｎｍに最大吸収を示している。

試薬にブランクに発色が見られないことは試薬の安定性
の良いことを示している。

反応後の呈色の安定性は第３図に示す通りで反応終了後
１時間は安定であることが明らかである。

次に本発明方法において血清中に共存する尿素窒素以外
の窒素成分及びその他の共存物質の影響を調べた結果は
表１に示す通りであり、かなり多量を添加した場合でも
全く影響のないことが分った。

本発明方法の吸光度と尿素窒素濃度との関係は直線性を
示し検量線を求めてみると第２図に示す通り２００ｍｇ
／ｄｌまでの直線性が得られかなり高濃度まで直接測定
が可能であることが判明した。

従来のウレアーゼ−インドフェノール法のように最大吸
収波長をずらせて測定したり、試料の血清を前もって希
釈して測定し直す必要などはない。

また本発明方法の同時再現性試験結果は表２に示す通り
で変動係数ＣＶ：２．４９％、標準偏差５Ｄ＝０．３７
と極めて高い再現性を示した。

行なった正確度試験の結果は表３に示す通りで正常域、
異常域とも良好な結果を得た。

次に従来広く使用されているウレアーゼ−インドフェノ
ール法とウレアーゼ一本発明方法との相関を求めた結果
は第４図に示す通りで相関係数σ＝０．９９と極めて高
い相関を示した。

以上説明した通り本発明の方法を利用する血清中の尿素
窒素測定方法は従来量も優れているとされているウレア
ーゼ−インドフェノール法（触媒としてニトロプルジッ
ドを使用）に比較して優るとも劣らない効果を有するば
かりでなくピラゾールの使用によりニトロプルジッドナ
トリウムを排除することができ公害防止の見地からより
優れた測定方法といえる。

なお血清中の遊離アンモニアの測定を必要とするときは
上記実施例１から容易に実施することができる。

一般の水溶液中のアンモニアの測定においてもインドフ
ェノール法が利用できる場合は殆ど本発明方法が使用で
きその効果もまた同様である。

実施例によって説明する。

実施例 ２ （１） 試薬 Ａ液： ピラゾール ２５５．３ｇ（３，７５Ｍ）Ｎａ２ＨＰ
Ｏ４１，６１ｇ ＫＨ２ＰＯ４１，１８ｇ ＥＤＴＡ−２Ｎａ １０．０ ｇ 水に溶解し全量を１１とする。

Ｂ液： ＮａＣ１０有効塩素量０．２％水溶液 アンモニア標準液： （ＮＨ４）２ＳＯ４０，６８３ｍｇ／ｄｌ水溶液（ＮＨ
４＋：０．５ｍｇ／ｄｌ、５．０ｐｐｍ）水は全てイオ
ン交換純水を使用する。

（２）操作法 試料検水５．０ｍｌを試験管にとり、Ａ液０．５ｍｌを
加えよく混和した後Ｂ液１．０ｍｌを加え３７℃で１５
分インキュベートして反応を行なわせる。

次に流水で５分間冷却し反応を停止させた後波長６５５
ｎｍを用い試薬ブランクを対照として吸光度を測定し次
の計算式からアンモニア量を求めるか、別に常法により
作製した検量線（第５図参照）から濃度を求める。

計算式 一般に試料が検水の場合は試料が汚濁、着色または高濃
度の塩類を含む場合があるが、このような場合には凝集
沈澱法等によって前処理をする必要がある。

１例を示せば、参考例 前処理としての凝集沈澱法 検水１００ｍ１を三角フラスコにとり、ＺｎＳＯ４・７
Ｈ２Ｏ水溶液（１０ｇ／ｄｌ） １．０ｍｌを加えよく
混和した後、アルカリ溶液（ＮａＯＨ１５ｇ／ｄｌ。

Ｎａ２ＣＯ３１２，５ｇ／ｄｌ）及び酸溶液（１１５Ｏ
ＮＨ２ＳＯ４）を使ってｐＨ７，０に調製し、しばらく
静置後３０００ｒｐｍ、１０分遠心分離するか、または
濾過により透明な液とし測定に用いる。

また検水中のアンモニアが特に高い場合は予めイオン交
換純水で５．０ｐｐｍ付近になるように希釈倍率をかけ
て補正する。

検水中のアンモニア濃度と吸光度の関係は直線性を示し
検量線を求めて見ると第５図に示す通りで０．ｌｐｐｍ
から１０．０ｐｐｍまで直線性が得られ、感度も良好で
０．ｌｐｐｍから１０．０ｐｐｍまでの測定が可能であ
る。

波長吸収曲線、呈色安定性は実施例１の場合と同様であ
る。

検水中には種々の金属塩やその他組成不明の妨害物質が
含まれている場合がある。

鉄、銅等の金属イオンはＥＤＴＡ・２Ｎａによりその作
用をマスクしその妨害を除くことができる。

アミノ酸、脂肪族アミンには影響を受けないが芳香族ア
ミンの一部例えば表４に示す通りＯ−トリイジン、エチ
ルアニリンには妨害を受ける。

このような場合には例えば蒸留、凝集沈澱等の前処理を
行なわなければならないときもある。

試験方法は（ＮＨ４）２ＳＯ４（濃度４．０ｐｐｍ）を
含む検水を用い芳香族アミンの添加以外は実施例２に準
じて行なった。

上述の通り本発明方法が液体中のアンモニア測定に広く
用いられ特に血清中の尿素窒素あるいは遊離アンモニア
の測定に欠くことのできないインドフェノール法の公害
防止を達成したことは産業上極めて有用なことである。

【図面の簡単な説明】

第１図は本発明方法の発色の波長吸収曲線を示す。 第２図は本発明方法による血清中の尿素窒素の検量線を
示す。 第３図は本発明方法の発色後の呈色の安定性を示すグラ
フである。 第４図は従来法と本発明方法との血清中の尿素窒素測定
における相関を示すグラフである。 第５図は本発明方法による検水中のアンモニアの検量線
を示す。

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. １ 液体中のアンモニア測定法の一つバースロット法に
   おいて触媒として使用するニトロプルジッドナトリウム
   の替りにピラゾールを使用することを特徴とする液体中
   のアンモニアの測定方法。