JPS5813151B2 - 発酵法によるｌ−ノルロイシンの製法 - Google Patents
発酵法によるｌ−ノルロイシンの製法Info
- Publication number
- JPS5813151B2 JPS5813151B2 JP4051076A JP4051076A JPS5813151B2 JP S5813151 B2 JPS5813151 B2 JP S5813151B2 JP 4051076 A JP4051076 A JP 4051076A JP 4051076 A JP4051076 A JP 4051076A JP S5813151 B2 JPS5813151 B2 JP S5813151B2
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- JP
- Japan
- Prior art keywords
- norleucine
- isoleucine
- valine
- production method
- serratia
- Prior art date
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- Expired
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- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
Description
【発明の詳細な説明】
本発明は発酵法によるＬ−ノルロイシンの製法に関する
。
。
ノルロイシンはメチオニンの代謝拮抗体としてよく知ら
れたアミノ酸であり〔ジュネテイツクス、５８，４７３
〜４９２（１９６８）参照〕、またイソロイシン、パリ
ン、ロイシンなどの分岐鎖アミノ酸のアナログとしても
有用なアミノ酸である〔バイオテクノロジー・バイオエ
ンジニアリング、７，２４５〜２６８（１９６５）参照
〕。
れたアミノ酸であり〔ジュネテイツクス、５８，４７３
〜４９２（１９６８）参照〕、またイソロイシン、パリ
ン、ロイシンなどの分岐鎖アミノ酸のアナログとしても
有用なアミノ酸である〔バイオテクノロジー・バイオエ
ンジニアリング、７，２４５〜２６８（１９６５）参照
〕。
本発明者らは先に、セラチア・マルセツセンスのイソロ
イシン、バリン要求性でかつロイシンによる代謝調節機
構が解除された変異株がノルバリンからＬ−ノルロイシ
ンを生成蓄積する能力を有していることを報告した〔昭
和４９年度日本発酵工学会大会講演要旨集、７１〜７２
頁参照〕。
イシン、バリン要求性でかつロイシンによる代謝調節機
構が解除された変異株がノルバリンからＬ−ノルロイシ
ンを生成蓄積する能力を有していることを報告した〔昭
和４９年度日本発酵工学会大会講演要旨集、７１〜７２
頁参照〕。
しかしながら、該菌株は培地中にメチオニンを添加しな
ければ全く生育せず、ノルバリンからＬ−ノルロイシン
を生成蓄積させることはできなかった。
ければ全く生育せず、ノルバリンからＬ−ノルロイシン
を生成蓄積させることはできなかった。
そこで本発明者らは、培地中にメチオニンおよびノルバ
リンを添加しなくてもＬ−ノルロイシンを生成蓄積せし
めうる微生物を広く検索した結果、セラチア属に属し、
イソロイシン、バリン要求性（部分要求性も含む、以下
同じ）でかつロイシンによる代謝調節機構およびメチオ
ニンによる代謝調節機構が解除されている変異株が、メ
チオニンおよびノルバリンの両者を含まない培地におい
てもＬ−ノルロイシンを生成蓄積せしめうる能力を有し
ていることを見い出し、本発明を完成するに至った。
リンを添加しなくてもＬ−ノルロイシンを生成蓄積せし
めうる微生物を広く検索した結果、セラチア属に属し、
イソロイシン、バリン要求性（部分要求性も含む、以下
同じ）でかつロイシンによる代謝調節機構およびメチオ
ニンによる代謝調節機構が解除されている変異株が、メ
チオニンおよびノルバリンの両者を含まない培地におい
てもＬ−ノルロイシンを生成蓄積せしめうる能力を有し
ていることを見い出し、本発明を完成するに至った。
本発明において用いられる微生物の例としては、例えば
セラチア・マルセツセンス〔バージーのマニュアル・オ
ブ・デターミネイティブ・バクテリオロジー、第８版、
３６２頁参照〕イソロイシン、バリン要求性かつロイシ
ンによる代謝調節機構およびメチオニンによる代謝調節
機構が解除された変異株が挙げられる。
セラチア・マルセツセンス〔バージーのマニュアル・オ
ブ・デターミネイティブ・バクテリオロジー、第８版、
３６２頁参照〕イソロイシン、バリン要求性かつロイシ
ンによる代謝調節機構およびメチオニンによる代謝調節
機構が解除された変異株が挙げられる。
かゝる変異株の取得は、例えば次の如くして行なうこと
ができる。
ができる。
まず通常の変異誘導操作、例えは紫外線照射あるいは変
異誘起剤（例えばＮ−メチル−Ｎ′−ニトロ−Ｎ−ニト
ロソグアニジン、エチルメタンスルホネート等）処理に
より原株に変異を誘起せしめ、これをロイシン代謝拮抗
体、例えばα−アミノ酪酸および４−アザロイシンを各
々約１０ｍｇ／ｍｌ添加した平板培地（例えばデービス
基礎培地）に２〜３日間培養し、生じた大コロニーを分
離することにより、ロイシンによる代謝調節機構が解除
された変異株を取得することができる。
異誘起剤（例えばＮ−メチル−Ｎ′−ニトロ−Ｎ−ニト
ロソグアニジン、エチルメタンスルホネート等）処理に
より原株に変異を誘起せしめ、これをロイシン代謝拮抗
体、例えばα−アミノ酪酸および４−アザロイシンを各
々約１０ｍｇ／ｍｌ添加した平板培地（例えばデービス
基礎培地）に２〜３日間培養し、生じた大コロニーを分
離することにより、ロイシンによる代謝調節機構が解除
された変異株を取得することができる。
次にこの変異株に前記と同様に変異を誘起せしめ、これ
をイソロイシンおよびバリンを各々約２μｇ／ｍｌ添加
した平板培地（例えばデービス基礎培地）に１〜２日間
培養し、生じた小〜中コロニーを分離し、この菌株の要
求性をレプリカ法により確認することにより、イソロイ
シン、バリン要求性でかつロイシンによる代謝調節機構
が解除された変異株を取得することができる。
をイソロイシンおよびバリンを各々約２μｇ／ｍｌ添加
した平板培地（例えばデービス基礎培地）に１〜２日間
培養し、生じた小〜中コロニーを分離し、この菌株の要
求性をレプリカ法により確認することにより、イソロイ
シン、バリン要求性でかつロイシンによる代謝調節機構
が解除された変異株を取得することができる。
次にこの変異株に前記と同様に変異を誘起せしめ、これ
を要求アミノ酸少量とメチオニン代謝拮抗体（例えばノ
ルロイシン、メチオニンハイドロキサメート、α−メチ
ルメチオニンなど）を約１０ｍｇ／ｍｌ添加した平板培
地（例えばデービス基礎培地）に２〜３日間培養し、生
じた大コロニーを分離することにより、イソロイシン、
バリン要求性でかつロイシンによる代謝機構およびメチ
オニンによる代謝調節機構が解除されたＬ−ノルロイシ
ン生産菌を取得することができる。
を要求アミノ酸少量とメチオニン代謝拮抗体（例えばノ
ルロイシン、メチオニンハイドロキサメート、α−メチ
ルメチオニンなど）を約１０ｍｇ／ｍｌ添加した平板培
地（例えばデービス基礎培地）に２〜３日間培養し、生
じた大コロニーを分離することにより、イソロイシン、
バリン要求性でかつロイシンによる代謝機構およびメチ
オニンによる代謝調節機構が解除されたＬ−ノルロイシ
ン生産菌を取得することができる。
このようにして得られたＬ−ノルロイシン生産菌の具体
例としては、例えばセラチア・マルセツセンスＮＬＶ−
１１（微工研菌寄第３４９８号）（イソロイシン、バリ
ン要求性でかつα−アミノ酪酸、４−アザロイシンおよ
びノルロイシン耐性な変異株）、セラチア・マルセツセ
ンスＮＬＧ−２１（微工研菌寄第３４９９号）（イソロ
イシン、バリン要求性でかつα−アミノ酪酸、４−アザ
ロイシンおよぴノルロイシンに耐性な変異株）などが挙
げられる。
例としては、例えばセラチア・マルセツセンスＮＬＶ−
１１（微工研菌寄第３４９８号）（イソロイシン、バリ
ン要求性でかつα−アミノ酪酸、４−アザロイシンおよ
びノルロイシン耐性な変異株）、セラチア・マルセツセ
ンスＮＬＧ−２１（微工研菌寄第３４９９号）（イソロ
イシン、バリン要求性でかつα−アミノ酪酸、４−アザ
ロイシンおよぴノルロイシンに耐性な変異株）などが挙
げられる。
尚、本発明に係るＬ−ノルロイシン生産菌の誘導法は特
に制限されるものではなく、例えばまずロイシンによる
代謝調節機構が解除された変異株を取得し、次にこの変
異株にメチオニンによる代謝調節機構が解除された性質
を付与し、最後にこの変異株にイソロイシン、バリン要
求性を付与することによってもＬ−ノルロイシン生産菌
を取得することができる。
に制限されるものではなく、例えばまずロイシンによる
代謝調節機構が解除された変異株を取得し、次にこの変
異株にメチオニンによる代謝調節機構が解除された性質
を付与し、最後にこの変異株にイソロイシン、バリン要
求性を付与することによってもＬ−ノルロイシン生産菌
を取得することができる。
また、形質導入の可能な菌株においては、上記３つの性
質のいずれかを持つ変異株を各々別個に取得し、それら
の性質を互いに形質導入することによってもＬ−ノルロ
イシン生産菌を取得することができる。
質のいずれかを持つ変異株を各々別個に取得し、それら
の性質を互いに形質導入することによってもＬ−ノルロ
イシン生産菌を取得することができる。
かくして得られた微生物のＬ−ノルロイシン生産用培地
としては、炭素源としてブドウ糖、でん粉加水分解物の
如き糖類、フマール酸、クエン酸の如き有機酸類、グリ
セロールの如きアルコール類等を２〜１５％、窒素源と
して酢酸アスモニウムの如き有機アンモニウム塩、硫酸
アンモニウム、塩化アンモニウムの如き無機アンモニウ
ム塩、尿素等を０．５〜３％、有機栄養物としてコーン
スチープリカー、ペプトン、酵母エキス等を０〜２％、
さらにイソロイシン、バリンなどの要求アミノ酸を少量
含む培地が好適に用いられる。
としては、炭素源としてブドウ糖、でん粉加水分解物の
如き糖類、フマール酸、クエン酸の如き有機酸類、グリ
セロールの如きアルコール類等を２〜１５％、窒素源と
して酢酸アスモニウムの如き有機アンモニウム塩、硫酸
アンモニウム、塩化アンモニウムの如き無機アンモニウ
ム塩、尿素等を０．５〜３％、有機栄養物としてコーン
スチープリカー、ペプトン、酵母エキス等を０〜２％、
さらにイソロイシン、バリンなどの要求アミノ酸を少量
含む培地が好適に用いられる。
これらの他にリン酸カリウム、硫酸マグネシウム等を少
量加え、また培地のｐＨを６〜９に保つために炭酸カル
シウムあるいは必要によりアンモニアを添加してもよい
。
量加え、また培地のｐＨを６〜９に保つために炭酸カル
シウムあるいは必要によりアンモニアを添加してもよい
。
さらにこのような培地にＬ−ノルロイシンの生合成系の
前駆物質、例えはノルバリンまたはα−ケト吉草酸を１
〜３％含有させれぱＬ−ノルロイシンの生成蓄積量を顕
著に高めることができる。
前駆物質、例えはノルバリンまたはα−ケト吉草酸を１
〜３％含有させれぱＬ−ノルロイシンの生成蓄積量を顕
著に高めることができる。
本発明によれは、これらの培地に前記のＬ−ノルロイシ
ン生産菌を接種し、好気的条件下、例えば強振とうする
如き酸素供給の良好な条件下、２５〜３７℃にて１〜４
日間培養することにより培地中にＬ−ノルロイシンを生
成蓄積せしめることができる。
ン生産菌を接種し、好気的条件下、例えば強振とうする
如き酸素供給の良好な条件下、２５〜３７℃にて１〜４
日間培養することにより培地中にＬ−ノルロイシンを生
成蓄積せしめることができる。
生成したＬ−ノルロイシンの採取は、例えばイオン交換
樹脂を用いる通常の分離精製法により容易に行なうこと
ができる。
樹脂を用いる通常の分離精製法により容易に行なうこと
ができる。
以下、実施例を挙げて本発明を具体的に説明するが、実
施例中Ｌ−ノルロイシンの定性は第３級アミルアルコー
ル：酢酸：水（２０：１：２０）の上層を用いるペーパ
ークロマトグラム上のニンヒドリン反応により、またそ
の定量は該反応による発色部分を切抜き抽出し、比色法
により行なった。
施例中Ｌ−ノルロイシンの定性は第３級アミルアルコー
ル：酢酸：水（２０：１：２０）の上層を用いるペーパ
ークロマトグラム上のニンヒドリン反応により、またそ
の定量は該反応による発色部分を切抜き抽出し、比色法
により行なった。
実施例 １
ブドウ糖２％、デキストリン１０％、尿素１％、ＤＬ−
ノルバリン２％、第２リン酸カリウム０．１％、硫酸マ
グネシウム７水和物０．０５％、コーンスチープリカー
０．７％、Ｌ−イソロイシン０．５〜／ｍｌ、Ｌ−バリ
ン１．０ｍｇ／ｍｌおよび炭酸カルシウム３％を含む培
地（ｐＨ７．０）１５ｍｌを５０ｍｌ容振とうコルベン
に注入し、加圧滅菌する。
ノルバリン２％、第２リン酸カリウム０．１％、硫酸マ
グネシウム７水和物０．０５％、コーンスチープリカー
０．７％、Ｌ−イソロイシン０．５〜／ｍｌ、Ｌ−バリ
ン１．０ｍｇ／ｍｌおよび炭酸カルシウム３％を含む培
地（ｐＨ７．０）１５ｍｌを５０ｍｌ容振とうコルベン
に注入し、加圧滅菌する。
但し、ブドウ糖およびデキストリンは別滅菌後添加する
。
。
これにセラチア・マルセツセンスＮＬＶ−１１（微工研
菌寄３４９８号）（イソロイシン、バリン要求性でかつ
α−アミノ酪酸、４−アザロイシンおよひノルロイシン
に耐性な変異株）を１白金耳植菌し、３０℃、１４０回
転／分、振幅８ｃｍの条件で７２時間振とう培養する。
菌寄３４９８号）（イソロイシン、バリン要求性でかつ
α−アミノ酪酸、４−アザロイシンおよひノルロイシン
に耐性な変異株）を１白金耳植菌し、３０℃、１４０回
転／分、振幅８ｃｍの条件で７２時間振とう培養する。
培養液中に生成したＬ−ノルロイシンの量は４．５ｍｇ
／ｍｌであった。
／ｍｌであった。
培養液１ｌを集め、熱処理後ロ過する。
ロ液を強酸性イオン交換樹脂アンバーライト１Ｒ−１２
０カラムに導通する。
０カラムに導通する。
このカラムを水洗後、０．１５Ｍアンモニア水で溶出す
る。
る。
溶出したＬ−ノルロイシン区分を減圧下に濃縮し、メタ
ノールを加え、析出する結晶をロ取することによりＬ−
ノルロイシン２．５ｇを得る。
ノールを加え、析出する結晶をロ取することによりＬ−
ノルロイシン２．５ｇを得る。
実施例 ２
実施例１と同様の培地を用い、セラチア・マルセツセン
スＮＬＧ−２１（微工研菌寄第３４９９号）（イソロイ
シン、バリン要求性でかつα−アミノ酪酸、４−アザロ
イシン８よびノルロイシンに耐性な変異株）を実施例１
と同様に培養した。
スＮＬＧ−２１（微工研菌寄第３４９９号）（イソロイ
シン、バリン要求性でかつα−アミノ酪酸、４−アザロ
イシン８よびノルロイシンに耐性な変異株）を実施例１
と同様に培養した。
培養液中に生成したＬ−ノルロイシンの量は２５ｍｇ／
ｍｌであった。
ｍｌであった。
実施例 ３
実施例１の培地からＤＬ−ノルバリンを除いた培地を用
い、セラチア・マルセツセンスＮＬＧ−２１（微工研菌
寄第３４９９号）を実施例１と同様に培養した。
い、セラチア・マルセツセンスＮＬＧ−２１（微工研菌
寄第３４９９号）を実施例１と同様に培養した。
培養液中に生成したＬ−ノルロイシンの量は０．８ｍｇ
／ｍｌであった。
／ｍｌであった。
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 １ セラチア属に属し、イソロイシン、バリン要求性で
かつロイシンによる代謝調節機構およびメチオニンによ
る代謝調節機構が解除されているＬ−ノルロイシン生産
菌株を培地に培養して培地中にＬ−ノルロイシンを生産
蓄積せしめ、これを採取することを特徴とする発酵法に
よるＬ−ノルロイシンの製法。 ２ 菌体がセラチア属に属し、イソロイシン、バリン要
求性でかつロイシン代謝拮抗体およびメチオニン代謝拮
抗体に耐性なＬ−ノルロイシン生産菌である特許請求の
範囲第１項記載の製法。 ３ 菌株がセラチア属に属し、イソロイシン、バリン要
求性でかつα−アミノ酪酸、４−アザロイシンおよびノ
ルロイシンに耐性なＬ−ノルロイシン生産菌である特許
請求の範囲第１項記載の製法。 ４ 菌株がイソロイシン、バリン要求性でかつロイシン
による代謝調節機構およびメチオニンによる代謝調節機
構が解除されているＬ−ノルロイシン生産能を有するセ
ラチア・マルセツセンスである特許請求の範囲第１項記
載の製法。 ５ 菌株がイソロイシン、バリン袈求性でかつロイシン
代謝拮抗体およびメチオニン代謝拮抗体に耐性なＬ−ノ
ルロイシン生産能を有するセラチア・マルセツセンスで
ある特許請求の範囲第１項記載の製法。 ６ 菌株がイソロイシン、バリン要求性かつα−アミノ
酪酸、４−アザロイシンおよびノルロイシンに耐性なＬ
−ノルロイシン生産能を有するセラチア・マルセツセン
スである特許請求の範囲第１項記載の製法。 ７ 培養を好気的条件下、ｐＨ５〜９、温度２５〜３７
℃で行なう特許請求の範囲第１項、第２項、第３項、第
４項、第５項または第６項記載の製法。 ８ 培養をＬ−ノルロイシン生合成系の前駆物質を含む
培地中、好気的条件下、ｐＨ５〜９、温度２５〜３７℃
で行なう特許請求の範囲第１項、第２項、第３項、第４
項、第５項または第６項記載の製法。 ９ Ｌ−ノルロイシン生合成系の前駆物質がノルバリン
またはα−ケト吉草酸である特許請求の範囲第８項記載
の製法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP4051076A JPS5813151B2 (ja) | 1976-04-10 | 1976-04-10 | 発酵法によるｌ−ノルロイシンの製法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP4051076A JPS5813151B2 (ja) | 1976-04-10 | 1976-04-10 | 発酵法によるｌ−ノルロイシンの製法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS52125693A JPS52125693A (en) | 1977-10-21 |
| JPS5813151B2 true JPS5813151B2 (ja) | 1983-03-11 |
Family
ID=12582531
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP4051076A Expired JPS5813151B2 (ja) | 1976-04-10 | 1976-04-10 | 発酵法によるｌ−ノルロイシンの製法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPS5813151B2 (ja) |
-
1976
- 1976-04-10 JP JP4051076A patent/JPS5813151B2/ja not_active Expired
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPS52125693A (en) | 1977-10-21 |
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