JPS5813160B2 - コレステロ−ルノテイリヨウホウ - Google Patents
コレステロ−ルノテイリヨウホウInfo
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Landscapes
- Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Description
【発明の詳細な説明】
本発明は液体試料例えば、血清の如き体液中のコレステ
ロールの酵素的定量法に関するものである。
ロールの酵素的定量法に関するものである。
コレステロール・オキシダーゼはコレステロールを△４
−コレステノンおよび過酸化水素に転換する酵素で、自
然界特に微生物中に広く存在している。
−コレステノンおよび過酸化水素に転換する酵素で、自
然界特に微生物中に広く存在している。
この酵素は高血圧症、動脈硬化症などの診断の目的で血
清コレステロールの定量に使用することができ、また、
血清コレステロールの測定は近年、老人病対策の一環と
して、臨床的にコレステロール値が重視されており、日
常検査として、その測定頻度が年々増加している。
清コレステロールの定量に使用することができ、また、
血清コレステロールの測定は近年、老人病対策の一環と
して、臨床的にコレステロール値が重視されており、日
常検査として、その測定頻度が年々増加している。
従来のコレステロールの測定はコレステロールの有機溶
媒による抽出→ケン化→ジギトニン沈澱→精製→呈色→
比色という複雑かつ困難な操作からなり立っており、簡
便かつ鋭敏で、正確な測定法の開発が望まれていた。
媒による抽出→ケン化→ジギトニン沈澱→精製→呈色→
比色という複雑かつ困難な操作からなり立っており、簡
便かつ鋭敏で、正確な測定法の開発が望まれていた。
これに対して、コレステロール・オキシダーゼを使用し
た場合はコレステロールを酵素のもつ特異性により、特
異的にかつ直接定量することが可能であり、コレステロ
ール・オキシダーゼの提供はコレステロールの酵素法に
よる新規定量法に恩恵を与えるものである。
た場合はコレステロールを酵素のもつ特異性により、特
異的にかつ直接定量することが可能であり、コレステロ
ール・オキシダーゼの提供はコレステロールの酵素法に
よる新規定量法に恩恵を与えるものである。
多くの微生物がコレステロールを代謝することができる
が、コレステロールを△４−コレステノンと過酸化水素
に転換するコレステロール・オキシダーゼの酵素系につ
いでは、現在まで、ミコバクテリウム属、ノカルジア属
、プレピバクテリウム属についてのみ報告がなされてい
るにすぎない。
が、コレステロールを△４−コレステノンと過酸化水素
に転換するコレステロール・オキシダーゼの酵素系につ
いでは、現在まで、ミコバクテリウム属、ノカルジア属
、プレピバクテリウム属についてのみ報告がなされてい
るにすぎない。
本発明者らは、先に酵素法によるコレステロールの定量
に使用されるコレステロール・オキシダーゼの工業生産
を目的として、コレステロール・オキシダーゼの生産菌
を広く検索し、その菌株の中から、アルスロバクター属
に属する細菌が、強力なコレステロール・オキシダーゼ
活性を有することを認め本菌を液体培養し、その培養液
から抽出、精製することにより、効率よく、高純度かつ
極めて安定なコレステロール・オキシダーゼを製造する
方法を確立した。
に使用されるコレステロール・オキシダーゼの工業生産
を目的として、コレステロール・オキシダーゼの生産菌
を広く検索し、その菌株の中から、アルスロバクター属
に属する細菌が、強力なコレステロール・オキシダーゼ
活性を有することを認め本菌を液体培養し、その培養液
から抽出、精製することにより、効率よく、高純度かつ
極めて安定なコレステロール・オキシダーゼを製造する
方法を確立した。
その方法の詳細に関しては、昭和４９年特許願第１４２
１７１号（特開昭５１−６７７８６号公報特公昭５７−
２１９８１号公報参照）に詳述されているとおりである
。
１７１号（特開昭５１−６７７８６号公報特公昭５７−
２１９８１号公報参照）に詳述されているとおりである
。
また、用いる菌株も昭和４９年特許願第１４２１７１号
に記載されている如く、アルスロバクター属に属する菌
株が使用されるが、代表的な菌株としてはアルスロバク
ター・シンプレツクスＩＦＯ１２０６９が使用される。
に記載されている如く、アルスロバクター属に属する菌
株が使用されるが、代表的な菌株としてはアルスロバク
ター・シンプレツクスＩＦＯ１２０６９が使用される。
なお、上記菌株のＩＦＯ番号は財団法人発酵研究所（Ｉ
ｎｓｔｉｔｕｔｅｆｏｒ Ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ，
Ｏｓａｋａ，Ｊａｐａｎ）の保存菌であることを示して
いる。
ｎｓｔｉｔｕｔｅｆｏｒ Ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ，
Ｏｓａｋａ，Ｊａｐａｎ）の保存菌であることを示して
いる。
本菌は栄養培地好ましくは酵素生産を高めるために、コ
レステロールを添加した培地で液体培養することにより
、コレステロール・オキシダーゼを培養液中に蓄積する
ので、公知の方法で精製することにより酵素製剤を得る
ことができる。
レステロールを添加した培地で液体培養することにより
、コレステロール・オキシダーゼを培養液中に蓄積する
ので、公知の方法で精製することにより酵素製剤を得る
ことができる。
本発明で使用するコレステロール・オキシダーゼの製造
法についてさらに具体的に説明すると、本菌を適当な培
地、例えば適当な糖質、窒素源、無機塩類と酵素生産を
高めるためにコレステロールおよび有機促進物質を含む
培地中で培養し、コレステロール・オキシダーゼを培養
液中に蓄積せしめるのであるが、ここで糖質にはグルコ
ース、シュークロースなどの単糖類、二糖類、澱粉およ
び澱粉加水分解物が使用できる。
法についてさらに具体的に説明すると、本菌を適当な培
地、例えば適当な糖質、窒素源、無機塩類と酵素生産を
高めるためにコレステロールおよび有機促進物質を含む
培地中で培養し、コレステロール・オキシダーゼを培養
液中に蓄積せしめるのであるが、ここで糖質にはグルコ
ース、シュークロースなどの単糖類、二糖類、澱粉およ
び澱粉加水分解物が使用できる。
窒素源には、酵母エキス、ペプトン、肉エキス、コーン
スチープリカーなどの有機窒素源が有効である。
スチープリカーなどの有機窒素源が有効である。
無機塩類としては、塩化アンモニウム、燐酸２カリウム
、硫酸マグネシウム、硫酸第１鉄、食塩などが用いられ
る。
、硫酸マグネシウム、硫酸第１鉄、食塩などが用いられ
る。
有機促進物質として、酵母エキスや、ペプトン、肉エキ
ス、コーンスチープリカなどが良い。
ス、コーンスチープリカなどが良い。
培地のｐＨは中性付近とし、通気撹拌などの好気的培養
を３０℃前後で１〜４日間行なう。
を３０℃前後で１〜４日間行なう。
上記の方法で得られたコレステロール・オキシダーゼを
含む培養液を濾過または遠心分離によって菌体を分別し
、その濾液または上澄みから、硫酸アンモニウム塩析、
あるいはアセトン、アルコール等を用いる溶剤沈澱など
の公知の方法で、酵素標品を得る。
含む培養液を濾過または遠心分離によって菌体を分別し
、その濾液または上澄みから、硫酸アンモニウム塩析、
あるいはアセトン、アルコール等を用いる溶剤沈澱など
の公知の方法で、酵素標品を得る。
さらに高度に精製された酵素標品を得るには、イオン交
換を応用した吸着溶出法および電気泳動法などを用いれ
ば良い。
換を応用した吸着溶出法および電気泳動法などを用いれ
ば良い。
上記方法で得られる酵素は、中性付近に最適のｐＨ値を
示し、最適温度は３５℃付近である。
示し、最適温度は３５℃付近である。
熱安定性に関しては、４０℃まではほぼ安定であるが、
それ以上になると次第にその活性を失う。
それ以上になると次第にその活性を失う。
上記酵素の活性は、例えば酵素消費量、コレステロール
と反応によって生成した△４−コレステノン、または過
酸化水素を定量することによって測定することができる
。
と反応によって生成した△４−コレステノン、または過
酸化水素を定量することによって測定することができる
。
本酵素の活性の表示を説明すると、コレステロール・オ
キシダーゼ１単位はｐＨ７．０，３０℃の条件で、１分
間に１マイクロモルの酸素消費量、△４−コレステノン
、または過酸化水素を生成するに要する酵素量を示す。
キシダーゼ１単位はｐＨ７．０，３０℃の条件で、１分
間に１マイクロモルの酸素消費量、△４−コレステノン
、または過酸化水素を生成するに要する酵素量を示す。
Δ４−コレステノンの量はその２４５ｍμの特異吸光を
測定することによって求めることができる。
測定することによって求めることができる。
また、過酸化水素の量は例えはパーオキシダーゼと色原
体を組み合わせた試薬と反応させることによって測定す
ることができる。
体を組み合わせた試薬と反応させることによって測定す
ることができる。
上記の如くして得られたアルスロバクター属のコレステ
ロール・オキシダーゼはコレステロールの定量に充分応
用できるものである。
ロール・オキシダーゼはコレステロールの定量に充分応
用できるものである。
たとえば公知の方法である酸素消費量、生成する過酸化
水素または△４−コレステノン量を測定することによる
コレステロールの定量方法に全て適用し得るものである
。
水素または△４−コレステノン量を測定することによる
コレステロールの定量方法に全て適用し得るものである
。
次に本発明を以下の実施例によって詳説するが、しかし
これによって本発明は限定されるものではない。
これによって本発明は限定されるものではない。
なお参考例として、本発明で使用する酵素の製造も示す
。
。
参考例 １
本参考例はアルスロバクター・シンプレックスＩＦＯ１
２０６９を培養して、コレステロール・オキシダーゼの
製造に関するものである。
２０６９を培養して、コレステロール・オキシダーゼの
製造に関するものである。
グルコース０．５％、酵母エキス０．５％、ペプトン０
．５％、塩化アンモニウム０．４％、リン酸２カリウム
０．１％、硫酸マグネシウム０．０５％、硫酸第１鉄０
．０１％、食塩０．５％、Ｃ．Ｓ．Ｌ．０．５％とコレ
ステロール０．２％、ｐＨ７．０からなる培地１５ｌを
含む３０ｌ容ジャーファーメンタ（２００ｒ・ｐ・ｍ）
にアルスロバクター・シンプレックスＩＦＯ１２０６９
を植菌し、３０℃、４０時間、通気撹拌培養後、培養液
を遠心分離によって、菌体を分別し、上澄みに６０％（
Ｗ／Ｖ）の硫安塩析を行ない、塩析物を濾別後、限外濾
過法によって脱塩後、凍結乾燥した結果、２００単位／
ｇの酵素粉末７．６ｇを得た。
．５％、塩化アンモニウム０．４％、リン酸２カリウム
０．１％、硫酸マグネシウム０．０５％、硫酸第１鉄０
．０１％、食塩０．５％、Ｃ．Ｓ．Ｌ．０．５％とコレ
ステロール０．２％、ｐＨ７．０からなる培地１５ｌを
含む３０ｌ容ジャーファーメンタ（２００ｒ・ｐ・ｍ）
にアルスロバクター・シンプレックスＩＦＯ１２０６９
を植菌し、３０℃、４０時間、通気撹拌培養後、培養液
を遠心分離によって、菌体を分別し、上澄みに６０％（
Ｗ／Ｖ）の硫安塩析を行ない、塩析物を濾別後、限外濾
過法によって脱塩後、凍結乾燥した結果、２００単位／
ｇの酵素粉末７．６ｇを得た。
実施例 １
本実施例は酸素消費量の測定による、血清中の遊離コレ
ステロールの定量に関するものである。
ステロールの定量に関するものである。
溶存酸素測定装置において、内室にアルスロバクター属
のコレステロール・オキシダーゼ２単位、ヨウ化カリウ
ム１．８ｍＭ、ヘプタモリブデン酸アンモニウム７．５
ｍＭ、塩化ナトリウム８００ｍＭを含有する０．２Ｍリ
ン酸緩衝液（ｐＨ６．０）の１．８ｍｌに０ｍｇ／１０
０ｍｌ〜５００ｍｇ／１００ｍｌの範囲のコレステロー
ル含有液測定用試料２０μｌを添加し、反応を開始し、
溶液中の酸素濃度の減少を測定し、測定値とコレステロ
ール濃度間の検量線を求めた。
のコレステロール・オキシダーゼ２単位、ヨウ化カリウ
ム１．８ｍＭ、ヘプタモリブデン酸アンモニウム７．５
ｍＭ、塩化ナトリウム８００ｍＭを含有する０．２Ｍリ
ン酸緩衝液（ｐＨ６．０）の１．８ｍｌに０ｍｇ／１０
０ｍｌ〜５００ｍｇ／１００ｍｌの範囲のコレステロー
ル含有液測定用試料２０μｌを添加し、反応を開始し、
溶液中の酸素濃度の減少を測定し、測定値とコレステロ
ール濃度間の検量線を求めた。
次に検体として遊離コレステロールの表示値が４０ｍｇ
／１００ｍｌの標準血清試料を用いて、測定を行ない、
検量線より遊離コレステロール濃度を求めると４３ｍｇ
／１００ｍｌの濃度であった。
／１００ｍｌの標準血清試料を用いて、測定を行ない、
検量線より遊離コレステロール濃度を求めると４３ｍｇ
／１００ｍｌの濃度であった。
実施例 ２
本実施例は過酸化水素量の測定による、血清中の遊離コ
レステロールの定量に関するものである。
レステロールの定量に関するものである。
アルスロバクター属のコレステロール・オキシダーゼ０
．２５単位、パーオキシダーゼ０．６単位、４−アミノ
アンチピリン０．２ｍｇ、フェノール０．５ｍｇ、トリ
トンＸ−１００（非イオン界面活性剤の商標）０．０５
％を含有する０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）の５
．０ｍｌに０ｍｇ／１００ｍｌ〜５００ｍｇ／１００ｍ
ｌの範囲のコレステロール含有液測定試料５０μｌを添
加し、３７℃の恒温槽中で３０分間インキユベートしそ
の後呈色度を５１０ｍμでＯ．Ｄ．を測定し、測定値と
コレステロール濃度間の検量線を求めた。
．２５単位、パーオキシダーゼ０．６単位、４−アミノ
アンチピリン０．２ｍｇ、フェノール０．５ｍｇ、トリ
トンＸ−１００（非イオン界面活性剤の商標）０．０５
％を含有する０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）の５
．０ｍｌに０ｍｇ／１００ｍｌ〜５００ｍｇ／１００ｍ
ｌの範囲のコレステロール含有液測定試料５０μｌを添
加し、３７℃の恒温槽中で３０分間インキユベートしそ
の後呈色度を５１０ｍμでＯ．Ｄ．を測定し、測定値と
コレステロール濃度間の検量線を求めた。
次に検体として遊離コレステロールの表示値が４０ｍｇ
／１００ｍｌの標準血清試料を用いて測定を行ない、検
量線より遊離コレステロール濃度を求めると４１ｍｇ／
１００ｍｌの濃度であった。
／１００ｍｌの標準血清試料を用いて測定を行ない、検
量線より遊離コレステロール濃度を求めると４１ｍｇ／
１００ｍｌの濃度であった。
実施例 ３
本実施例は△４−コレステノン量の測定による血清中の
遊離コレステロールの定量に関するものである。
遊離コレステロールの定量に関するものである。
アルスロバクター属のコレステロール・オキシダーゼ０
．２５単位、トリトンＸ−１００（商標）０．０５％を
含有する０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）の５．０
ｍｌに０ｍｇ／１００ｍｌ〜５００ｍｇ／１００ｍｌの
範囲のコレステロール含有液測定試料５０μｌを添加し
、３７℃の恒温槽中で３０分間インキユベートしその後
△４−コレステノンの特異吸光を２４５ｍμでＯ．Ｄ．
を測定し、測定値とコレステロール濃度間の検量線を求
めた。
．２５単位、トリトンＸ−１００（商標）０．０５％を
含有する０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）の５．０
ｍｌに０ｍｇ／１００ｍｌ〜５００ｍｇ／１００ｍｌの
範囲のコレステロール含有液測定試料５０μｌを添加し
、３７℃の恒温槽中で３０分間インキユベートしその後
△４−コレステノンの特異吸光を２４５ｍμでＯ．Ｄ．
を測定し、測定値とコレステロール濃度間の検量線を求
めた。
次に検体として遊離コレステロールの表示値が４０ｍｇ
／１００ｍｌの標準血清試料を用いて測定を行ない、検
量線より遊離コレステロール濃度を求めると４２ｍｇ／
１００ｍｌの濃度であった。
／１００ｍｌの標準血清試料を用いて測定を行ない、検
量線より遊離コレステロール濃度を求めると４２ｍｇ／
１００ｍｌの濃度であった。
Claims (1)
- １ アルスロバクター属に属する細菌から得られるコル
ステロール・オキシダーゼ活性を有する酵素製剤を用い
、液体試料と共にインキユベートし、試料中の酸素消費
量、または生成する過酸化水素量、もしくは△４−コレ
ステノン量を測定することを特徴とする液体試料中のコ
レステロールの定量法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP8303875A JPS5813160B2 (ja) | 1975-07-04 | 1975-07-04 | コレステロ−ルノテイリヨウホウ |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP8303875A JPS5813160B2 (ja) | 1975-07-04 | 1975-07-04 | コレステロ−ルノテイリヨウホウ |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS526594A JPS526594A (en) | 1977-01-19 |
| JPS5813160B2 true JPS5813160B2 (ja) | 1983-03-11 |
Family
ID=13791033
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP8303875A Expired JPS5813160B2 (ja) | 1975-07-04 | 1975-07-04 | コレステロ−ルノテイリヨウホウ |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPS5813160B2 (ja) |
Families Citing this family (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP7695892B2 (ja) * | 2019-12-11 | 2025-06-19 | キッコーマン株式会社 | ２５－ヒドロキシビタミンｄ３の定量方法、定量用組成物、定量用キット、電極、センサーチップ、及びセンサー |
-
1975
- 1975-07-04 JP JP8303875A patent/JPS5813160B2/ja not_active Expired
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPS526594A (en) | 1977-01-19 |
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