JPS58141785A - 抗腫瘍物質の製法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は抗腫瘍物質の製造方法に関し、さらに具体的に
は動物の単球に由来する細胞を利用し、抗腫瘍性の体液
性因子を高収率にしかも純度の高い状態で回収する方法
に関するものである。

この因子は米国スローンケタリング癌センター副所長オ
ールド博士らによって発見されたＴＮ　Ｆ　（Ｔｕｍｏ
ｒ　ｎｅｃｒｏｓｉｓｆａｃｔｏｒ　）と同様の作用を
有している。

瘍の治療法においては現在外科療法、放射線療法、化学
療法および免疫療法などが主として行なわれているが、
各療法共に未だ根治療法とはいいがたく、また特に化学
療法剤は正常細胞に与える障害が大きいのが欠点である
。

１９７５年、米国スローンケタリング癌センターのオー
ルド博士らは正常細胞に何ら障害を与えず、癌細胞のみ
を特異的に攻撃するといわれる糖タンパク質性の物質、
ＴＮＦを報告したｅ　　（Ｅ、　Ａ、　Ｃａｒｓｓｅｅ
ｌｌ　　ｅｔ、　ａｌ、　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔ、　Ａｃ
ａｄ。

Ｓｃｉ、ＵＳＡ　　７２巻　３６６６頁　１９７５年、
）これによれば、ＢＣＧ等をマウスの静脈内に投与し、
１〜２週間後にダラム陰性桿菌由来の細菌内毒素である
リポポリサンカライド（Ｌ　Ｐ　Ｓ）を投与し、１〜２
時間後に血清を採取して目的の抗腫瘍性因子すなわちＴ
ＮＦの粗液を得ることができる。

しかしながらＬＰＳを投与されたマウスはエンドトキシ
ンショックをひき起子ため、採取される血清量は僅かで
あってまた粗液が血清であるために非常に多くの夾雑物
質を含み、これらの夾雑物質を除去することは煩雑がっ
困難であり、それ故精製過程における目的物の損失が大
きがった。

従って、従来ＴＮＦは非常に有用な制癌剤であり得ると
いう事を知られていながら大量に得る事ができなかった
。

本発明者らはこの癌治療上有用な抗腫瘍性物質を大量に
かつ夾雑物の少ない状態で得ることを目的として鋭意研
究を重ね本発明をなすに至った。

以下詳細に説明する。

すなわちマウス、ラット、ウサギその他の動物を用い、
嫌気性コリネバクテリア、ＢＣＧもしくはリステリア・
モノサイトゲネスなどの不活性化菌体を腹腔内に投与し
、１〜２週間の後にダラム陰性桿菌由来の細菌内毒素で
あるリポポリサンカライド（ＬＰ、Ｓ）を静脈内、もし
くは腹腔内に投与し、同時に生理的食塩水を大量に腹腔
内に注入し、２〜４時間後に動物を穿刺また仲間、腹し
て有用目的物質を含む生理的食塩水を回収する。この粗
液は超遠心分離、イオン交換樹脂吸着法、ゲル濾過法、
電気泳動などを用いて比較的容品に精製することができ
る。

本発明には、ダラム陰性桿菌由来の細菌内毒素ＬＰＳに
感受性があるすべての動物を使用することができ４゜た
とえばマウス、ラット、ウサギ、山羊などをあげる事が
できる。

本発明について更に詳細に説明すれば、嫌気性コリネバ
クテリア不活性イヒ菌体を投与してから７日から１０日
の間ではいつＬＰＳを投与しても活性に変化はない。ま
たＬＰＳはダラム陰性桿菌由来のりポポリサンカライド
であればエシェリヒア・コリ、サルモネラ、セラチア、
シゲラその他であっても同様の活性物質を得る事が出来
る。また、投与量は９例えばマウスの腹腔内投与の場合
にはマウス−匹あたり　０．５〜５０γまで、静脈内投
与の場合にはマウス−匹当り１０γ〜３０γの量で同様
の活性物質を得る事ができる。

ＬＰＳを投与してから目的物を採取するまでの時間は２
時間から４時間が最適であり、６時間を経過するとその
活性は消失する。

本発明において得らむた目的物の抗腫瘍活性は、癌細胞
と正常細胞をそれぞれ標的細胞として細胞障害を測定す
ることによって確認した。また、同時に、正常細胞には
障害を示さない事をも確認した。

ここで標的細胞とした癌細胞は２．マウス由来線維芽細
胞Ｌ−９２９（ＮＣＴＣ−Ｃ１ｏｎｅ　９２９　）であ
り、１牛血清（Ｇｉｂｃｏ社製）を１０％となる様に加
えた組織培養用イーグルのＭＥＭ培地　にラス４社製）
に細胞数　４０万７ｍｌとなる様に接種した後１組織培
養用２４穴マルチウェルプレート（リンプロ製）に分注
し、それに上記の培地で希釈した目的物を混和して３７
℃、５％ＣＯ□−９５％空気中の条件で培養し、７２時
間後に細胞障害の有無を観察した。

また正常細胞としては、健常なマウスを屠殺した後、腎
臓を無菌的に摘出してハサミで細切した後、　４℃、攪
拌の条件下で０．２５％トリプシン消化し、毎分１　、
０００回転５分間遠心分離して細胞を集め、牛胎児血清
（Ｇ　ｉ　ｂｃｏ社製）を１０％となる様に加えたカナ
マイシン添加組織培養用ＲＰ旧−１６４０培地にラスイ
社Ｗ）に細胞数４０万／ｍｌとなる様に接種した後、癌
細胞の場合と同様の操作をもって細胞障害を観察した。

細胞障害は３７℃、　５％ＣＯ２−９５％空気中で７２
時間培養の後、培地を捨て、生細胞が単層となって固着
したウェルをＰＢＳ　（燐酸緩衝生理的食塩水）で洗浄
した後０．０３６％のニュートラルレッドＰＢＳ溶液を
注入し１．３７℃　５％　ｃｏ２−９５％空気中で放置
し、１時間後に取り出してウェルをＰＢＳでよく洗浄し
た後、　０．１Ｍ−Ｎａ　Ｈ２ＰＯ４溶液と９９．５％
エタノールを等量混合した溶液で生細胞に取り込まれた
ニュートラルレッドを抽出し、波長５４０ｎ−の吸収を
測定することにより観察した。

その結果を表１に示す。

目的物を含む生理食塩水がコントロールに対して、１〜
２％の危険率をもって有意に癌細胞を障害していること
は明らかである。

また測定結果は表には示していないが、正常細胞には全
く影響を与えなかった。

以上の如く観察の結果、以下実施例に示すＬＰＳを静脈
内に投与する方法、ＬＰＳを腹腔内に投与する方法、い
ずれの方法で採取した粗目的物も、癌細胞を特異的に充
分な強さをもって障害する事が判明した。

また、この目的物を含む生理的食塩水を超遠心分離を行
って上清をあつめＤ　Ｅ　Ａ　Ｅ　−５ｅｐｈａｄｅｘ
、　ＣＭ−３ｅｐｈａｄｅｘで処理した後、　　５ｅｐ
ｈａｄｅｘ　Ｇ　−１００でゲル濾過し、活性画分を集
めた後、ポリアクリルアミドゲル電気泳動を行って純品
の目的物質を得た。このものには、ＬＰＳの混在は認め
られなかった。

この物質は１分子量３０．０００〜５０．０００　（Ｓ
Ｏ３−ポリアクリルアミドゲル電気泳動法による。　）
、　５６℃　３０分で安定、ｐＨ５〜１０で安定である
。

このような純品の目的物を粗目的物から大量に得るため
。

以下の操作をおこなった。

この純品の目的物をフロイントの完全アジュバント（半
井製）と共に家兎に数回皮下注射したあと静脈内注射を
して免疫し、試験採血してＬ　−９２９細胞に対する目
的物の殺細胞効果の消失を指標として抗体価を測定して
抗体価が充分に上昇した時点で採血して抗血清を得、こ
れを、上記した純品の目的物を結合せしめたＣＮＢｒ活
性化セファロース４Ｂ（ファルマシア製）カラムに通過
させて目的物に対する抗体以外の抗体を除去し、目的物
の抗体を得る。

これを５０％硫酸アンモニウムで析出せしめ、沈殿を採
取してさらにプロティンＡ−セファロースで精製してＩ
ｇＧ画分を得、このＩｇＧ画分をＣＮＢｒ活性化セフ１
アロース４Ｂに結合させてカラムに充填した。

このカラムに粗目的物を通過せしめて親和性クロマトグ
ラフィーを行い、純品の目的物を得た。

上記の方法により、粗目的物から簡単な操作でしかも高
収率で純品の目的物を得ることができた。

この物質について、３−メチルコラントレンで誘発した
フィブロザルコーマであるＭｅｔｈＡ癌をマウス当り細
胞数１００万個皮下移植し、７日目で癌腫が直径５〜７
態となったＢＡＬＢＺＣ系のマウスの静脈内に投与する
と、投与後２４時間以内に癌腫が出血性の壊死に至るこ
とが判った。

この結果について、　Ｃａｒｓｗｅｌｌ、　Ｏｌｄらに
よる活性の強弱の分類に従って評価してみると表２のご
とくとなる。

このときにも癌腫のみは出血性壊死を起したが、宿主マ
ウスの組織に対する影響は全く見られなかった。

特にＬＰＳを静脈内に投与した場合は目的物には癌に対
する細胞障害もあり、しかもＬＰＳの混在がなく精製の
際非常に容易かつ有利である。また、ＬＰＳを腹腔内に
投与した場合には動物から滅菌済注射器で無菌的に穿刺
して粗目的物を回収すれば、動物を層殺することがない
ので、一定期間を経て再び粗目的物の製造に供すること
もできるので非常に有利である。

次にこの様にして大量に、しかも夾雑物の少ない状態で
目的物を得る過程を実施例において示す。

実施例１゜ ＩＣＲ系雌性マウスの腹腔内に嫌気性コリネバクテリア
不活性化菌体すなわちコリネバクテリウム　パープムの
培養菌体を熱処理、ホルマリン処理によって不活化した
後凍結乾燥し、また生理的食塩水に再懸濁したものをマ
ウス−匹当り乾燥重量として１■投与し、　８日後にダ
ラム陰性桿菌由来の細菌内毒素の一種であるエシェリヒ
ア・コリ　０５５　Ｂ５のＬＰＳ　（ディフコ社製）を
ＩＴ／Ｉ１１含有する様に調整した生理的食塩水を５ｍ
ｌマウス腹腔内に注入し、２時間経過した後、そのマウ
スを頚動脈切断により層殺し、ただちに開腹して目的物
を含有する生理的食塩水を内臓その他の組織を傷つける
事のない様に注意深くピペットで吸引し１回収する。

得られた生理的食塩水は遠沈管に移し、４℃に冷却した
冷凍遠心分離器で毎分ａ、ｏｏｏ回転で１０分間遠心分
離して腹腔内細胞などの固形物を除去し、その上清を粗
目的物質液とする。

実施例２゜ ＩＣＲ系雌性マウスの腹腔内に実施例１の場合と同じ嫌
気性コリネバクテリア不活性化菌体をマウス−匹当り乾
燥重量として１■投与し、　８日後に実施例１の場合と
同じダラム陰性桿菌由来の細菌内毒素ＬＰＳを生理的食
塩水でマウス１匹当り１０ｙ　／　０．２ｍｌ　　とな
るように調整して静脈内に投与し、しかる後ただちに生
理的食塩水５ｍｌを腹腔内に注入する。２時間後に頚動
脈切断によって層殺し、直ちに開腹する。

また、途中エンドトキシンショックで死亡したマウスは
その時点で開腹し、以下実施例１と同様の操作を行なっ
て粗目的物を得る。

実施例３゜ 実施例１と同様に嫌気性コリネバクテリア不活性化菌体
をマウス−匹当り乾燥重量として１■投与し、　８日後
に実施例１の場合と同じダラム陰性桿菌由来の細菌内毒
素ＬＰＳを含む生理的食塩水を腹腔内に投与したマウス
を、その２時間後仰臥位に固定し、動物用バリカンで腹
面を刺毛した後腹面を消毒用７０％アルコールで消毒し
、滅菌済注射器（容量１０ｍ１．注射針２２Ｇ　１１／
２テルモ社製）を用いて穿刺し１組織を傷つけないよう
に注意深く吸引して粗目的物質を回収する。

使用した動物は傷痕の感染に注意しつつ１力月飼育した
後、嫌気性コリネバクテリア不活性化菌体の腹腔内投与
以下上記の操作をもって繰り返し粗目的物を回収する。

（以下余白） ：ぐ ２１ｓＩａ４　　　６　　　ｃｏｎｔ。

（ＬＰＳ投与から採取までの嘲”ＪＤ （２）ＬＰＳを静脈内に投与した場合 報肯甲、幼ｌ貝のｌ’１ｇ−１に８Ｇ１奮〃矧に促っ−
（灯っん。

手続補正書く方式〉 峰町５１６庁−７Ｒ 特許庁長官　島１）専権　殿 １、事件の表示 昭和５７年特許願第２３９７７号 ２、発明の名称 抗腫瘍物質の製法 ３、補正をする者 事件との関係　特許出願人 住所　　〒６０１京都市南区吉祥院西ノ庄門口町１４番
地名称　（４１５）日本新薬株式会社 ゛　取締役社長　森下　　弘 ４、代理人 居所　　〒６０１京都市南区吉祥院西ノ庄門ロ町１４番
地昭和５７年５月２５日（発送日） ６、補正の対象 願書及び明細書 手続補正書（自発） 昭和５８年　１月２０日 特許）庁長官　若杉　和夫　殿 １、事件の表示 昭和５７年特許願第２３９７７号 ２、発明の名称 抗腫瘍物質の製法 ３、補正をする者 事件との関係　　　　特許出願人 住所　　〒６０１京都市南区吉祥院西ノ庄門口町１４番
地名称　（４１５）日本新薬株式会社 取締役社長　森　下　　　弘 ４、代理人 括”所　　〒６０１京都市南区吉祥院西ノ庄門口町１４
番地明細書の発明の詳細な説明１７）［ ６、補正の内容 （１）明細書第７頁第５行の「この物質は、−−−−−
−Ｊから、同頁第７行の「−・−・安定である。」まで
の文を、以下のように訂正する。

「この物質はマウスより採取したものを精製した純品で
はセファデックスＧ　−２００によるゲルろ過で４０．
０００．５ＤＳ−ポリアクリルアミド電気泳動で５５．
０００の分子量を有し、ポリアクリルアミド電気泳動で
α−グロブリンからアルブミン領域にかけて泳動される
、５６℃３０分で安定、ｐＨ５〜１０で安定な、等電点
５．０〜５．２．　　レクチン（たとえば、コンカナバ
リンＡ、フィトヘムアグルチニン）に対して親和性を示
さず、またアミコン社のＤｙｅ−ｓ＋ａｔｒｅｘ　ｋｉ
ｔの種々の色素、たとえばＣ１ｂａｃｒｏｎ　Ｂｌｕｅ
　Ｐ３Ｇ−八に対して親和性を示さないシアル酸を含む
糖タンパクである。」 以上

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 （１１動物に免疫賦活物質を腹腔内投与し９次いでダラ
   ム陰性桿菌由来のりボボリサンカライドを投与し、同時
   に腹腔内に多量の生理的食塩水を注入し２次いでその生
   理的食塩水を回収してこれを精製することを特徴とする
   抗腫瘍物質の製造法。 （２）動物が、マウス、ラット又はウサギである特許請
   求の範囲第１項記載の方法。 （３）免疫賦活物質が、嫌気性コリネバクテリア、ＢＣ
   ，Ｇ、又はリステリア・モノサイトゲネスの不活性菌体
   である特許請求の範囲第１項又は第２項記載の方法。 （４）ダラム陰性桿菌のりボポリサッカライドの投与方
   法が。 静脈内投与である特許請求の範囲第１項乃至第３項記載
   の方法。 （５）ダラム陰性桿菌のりボボリサッカライドの投与方
   法が。 腹腔内投与である特許請求の範囲第１項乃至第３項記載
   の方法。