JPS5816879B2 - シンキナコウソソガイザイラクタム ｂ ノ セイゾウホウ - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 本発明はノジリマイシンＢを酸化する酵素または本酵素
を含有する微生物菌体を用いて、ノジリマイシンＢをラ
クタムＢに変換反応せしめることにより新規な酵素阻害
剤ラクタムＢを製造する方法に関するものである。

ノジリマイシンＢは分子式Ｃ６Ｈ１３０５Ｎの新規化合
物で、先に本発明者等によって見出されたノジリマイシ
ン（５−アミノ−５デオキシ−Ｄ−グルコビラノース）
の構造異性体の１種であり、β−グルコシダーゼに対し
強い阻害作用を有する酵素阻害剤である（本出願人の同
日出願に係る「ノジリマイシンＢの製法」の特願昭５０
−７３７４８号参照）。

本発明者等は先にノジリマイシンがグルコース酸化酵素
またはグルコース酸化酵素を含有する微生物菌体を作用
させることにより、容易に酸化されてＤ−グルコニック
−δ−ラクタムに変換されることを見出し、その製法を
確立した（特願昭４８−１０６９２８号明細書参照）。

この方法をノジリマイシンＢに適用したところ、ノジリ
マイシンＢもノジリマイシン同様酸化されることを知り
、その酸化により生成した変換物質を色々研究した結果
、その性状はＤ−グルコニック−δ−ラクタムと極めて
類似するが、これとは明らかに理化学性状が異なる別異
の新規物質であることを知り、この本体の物質をラクタ
ムＢと命名し、本発明を完成した。

本発明に用いるノジリマイシンＢ酸化酵素とは、ノジリ
マイシンＢを酸化する能力を有する酵素を言い、このノ
ジリマイシンＢ酸化酵素としては、一般にグルコース酸
化酵素が使用出来る。

グルコース酸化酵素としては、グルコースオキシダーゼ
およびグルコースデヒドロゲナーゼが知られており、グ
ルコースオキシダーゼの例としては公知菌ペニシリウム
・アマガサキニンシスの培養物から抽出された粗酵素標
品デオキシン（長潮産業膜）や、アスペルギルス・ニガ
ーから抽出されたグルコースオキシダーゼ（米国、マイ
ルスラボラトリー製）等が知られているが、ノジリマイ
シンＢはこれらのグルコースオキシダーゼによって容易
に酸化されラクタムＢに変換される。

一方グルコースデヒドロゲナーゼについてであるが、本
酵素は動植物界に広く存在するが、本発明の目的には微
生物酵素を用いることが望ましい。

微生物のグルコースデヒドロゲナーゼは菌体内酵素であ
るから、本酵素を用いるのに菌体から分離精製して用い
るよりも、本酵素を保持、含有する菌体を用いる方が工
業的には有利である。

グルコースデヒドロゲナーゼを生産する微生物としては
グルコン酸醗酵菌がその代表例として知られている。

グルコン酸醗酵菌はカビ、細菌類に広く存在し、カビで
はアスペルギルス属（Ａｓｐｅｒ−ｇｉｌｌｕｓ）、ペ
ニシリウム属（Ｐｅｎ ｉｃ ｉ Ｉ ｌ ｉ ｕｍ）
及びリゾプス属（Ｒｈｉｚｏｐｕｓ）の糸状菌に、また
細菌ではアセトバクター属（Ａｃｅ ｔｏｂａｃ ｔｅ
ｒ ） 、グルコノバクタ−属（Ｇｌ ｕｃｏｎｏｂ
ａｃ ｔｅｒ ）やシュードモナス属（Ｐｓｅｕｄ□ｍ
ｏｎａｓ ）に存在する、ことが知られている。

これらの菌を用いて本発明の方法でノジリマイシンＢを
酸化するためには、先ず糖質、蛋白質、アミノ酸および
無機塩等から成る一般に用いられる培養培地で培養する
ことが必要である。

特に好ましい培地としてはグルコース・ブイヨン、グル
タミン酸ソーダ及び無機塩からなる培地が挙げられる。

培養温度は２０〜３７℃の範囲から選ばれ、培養時間は
通気、振盪、静置等の培養方法にもよるが、はぼ２０〜
７０時間が適当である。

培養菌体は培養プロスから分離採集し、無機又は有機緩
衝溶液で洗滌して用いることが好ましい。

一方、本発明の方法で原料として用いられるノジリマイ
シンＢであるが、本物質はノジリマイシンの培養生産に
よってノジリマイシンと同時に副生されるので、その培
養Ｐ液から精製してノジリマイシンＢのみを単離して用
いることが出来る。

しかし、ノジリマイシンＢの精製過程で得られるノジリ
マイシンとの混合物である、ノジリマイシン８部分精製
物を用い、これを酵素又は菌体と作用させ、その反応終
了混液よりラクタムＢを分離し精製するのも有利な方法
である。

酸化酵素ないし酸化酵素を含む微生物菌体をノジリマイ
シンＢに作用させる酸化反応に当っては、ノジリマイシ
ンＢまたは部分精製ノジリマイシンＢ（ノジリマイシン
を含む）は適当な緩衝溶液（中性ないし弱アルカリ性）
に２〜２０％濃度に溶解し用いることが好ましい。

微生物菌体を作用させる場合、ノジリマイシンＢ溶液に
加える菌体量は、湿潤重量で７９１７４９７８重量に対
し１１５〜等重量が反応を比較的速やかに進行させるた
めに適当である。

酸化反応は２０〜４０℃で行うのが適当で、振盪ないし
撹拌を行なう方が好ましい。

反応は１〜２４時間で終了させることが出来る。

なお、反応に使用する菌体は洗滌菌体等の如く湿潤の状
態であっても、乾燥または凍結乾燥菌体であっても使用
出来る。

また一度の反応のみでなく、反応終了後、菌体を分離し
集め、再使用することも可能である。

以上に述べた菌体を用いノジリマイシンＢからラクタム
Ｂを製造する方法はグルコース酸化酵素又はこれら酵素
を含む粗酵素標品を用いてノジリマイシンＢをラクタム
Ｂに変換反応する場合にもほぼそのまま適用出来る。

即ちノジリマイシンＢ又はノジリマイシン８部分精製物
を溶解した水溶液にグルコース酸化酵素標品を酵素反応
が十分進行するに足る適当濃度に添加し、ｐＨ５〜８５
の間で通気撹拌する。

反応温度は室温から６０℃位まで許容されるが、３０〜
４０℃が最も好適である。

反応時間は反応温度、酵素濃度にもよるが、通常２〜７
０時間で完了する。

反応終了液よりラクタムＢを分離するに当っては、反応
液は必要があればｒ過や遠心分離等の操作で菌体等を分
離しＰ液を得る。

このＦ液は強酸性イオン交換樹脂、例えばアンバーライ
ｔ−ＩＲ−１２０（Ｈ型）の塔を通過させ、未反応のノ
ジリマイシンＢやノジリマイシンを除き、通過液を塩基
性イオン交換樹脂、例えばアンバーライト■Ｒ−４５（
ＯＨ型）で中和して濃縮する。

この時に、高収率で酸化反応が行なわれた場合には、ラ
クタムＢの結晶又はラクタムＢとＤ−グルコニック−δ
−ラクタムの混晶が直接に析出して来る。

ラクタムＢが不純物を含む場合やＤ−グルコニック−δ
−ラクタムとの混晶として析出した場合は、カーボンカ
ラムクロマトグラフィーその他の手段でラクタムＢを分
離精製したのち濃縮し、目的物を結晶として得ることが
可能である。

また必要があれば水−アルコールから再結晶法によって
精製することも可能である。

ラクタムＢの検定法であるが本物質は抗菌活性がなく、
適当な検定法はないが、強力なβ−グルコシダーゼ阻害
作用を有する。

例えばアグリ力ルチュアル・アンド・バイオロジカルケ
ミストリー、３４巻、９６６頁、１９７０年記載の測定
方法に従えば、杏エムルシンに対するラクタムＢの５０
％阻害濃度は１．Ｉ Ｘ １０ ”−６Ｍである。

従ってβ−グルコシダーゼに対するラクタムＢの５０％
阻害濃度を求め、ラクタムＢの含有量を知ることが出来
るが、ラクタムＢ以外の酵素阻害物質が含まれない場合
に限られる。

従って酵素ないし微生物菌体によるノジリマイシンＢの
ラクタムＢへの変換状況を知るには後述のシリカゲル薄
層クロマトグラフィーを用いると簡便である。

本発明の方法で製造される新規な酵素阻害物質ラクタム
Ｂの理化学的性状は以下に示す通りである。

本物質は白色の針状結晶で融点は１４０〜１４１℃であ
る。

溶解性は水に良く溶けるが、一般の有機溶媒には微溶又
は不溶である。

本物質の紫外部吸収は、２１０−３６０ｍμに特異吸収
を示さず、光外部吸収曲線は第１図に示されている。

水溶液中で１％濃度で測定した比旋光度は［ａ］ ２０
＋１．６°であった。

本物質の元素分析値は、Ｃ４０，５３、Ｈ６，２８、Ｎ
７．５４％の値を示した。

ラクタムＢは無水酢酸−ピリジンによるアセチル化でテ
トラアセチル化物を与えるが、このものを質量分析に付
した所、ｍ／ ｅ ３４６にＭ＋１のピークを示した。

したがってラクタムＢの分子量は１７７であり、分子式
は０６Ｈ１１０５Ｎが最も適当である。

この分子式はノジリマイシンの酸化物であるＤ−グルコ
ニック−δ−ラクタムと同一であることからラクタムＢ
はＤ−グルコニック−δ−ラクタムの構造異体であるこ
とが強く示唆される。

ｎ−ブタノール−酢酸−水（３：１：１）の系を用いた
シリカゲル薄層クロマトグラフィーに於いてＤ−グルコ
ニック−δ−ラクタムのＲｆ値は０．２９であり、ラク
タムＢのＲｆ値は０．３３であるから、両者が異なる物
質であることは明確である。

実施例 １ ノジリマイシンＢ２００■を試験管に取り、蒸留水１０
ｍ１を加え溶解し、これにデオキシン（ｉｏｏｏ単位／
７ＩＩｇ、長潮産業製）６０■を添加し、ｐＨを６．０
に調節後、チューブシェーカーにて２８℃、６時間振盪
反応を行なった。

反応終了液をアンバーライトＩＲ−１２０（Ｈ型）の小
カラム（３ｍｌ）を通過させ、更に蒸溜水５Ｔｌｌをカ
ラムに通し、通過液及び水洗液を合せ、アンバーライト
ＩＲ−４５（ＯＨ型）にて中和後、小量の炭末（１００
７ＩＩＩすを加え脱色する。

炭末を漣過し、泥液を減圧濃縮するとラクタムＢの結晶
が析出する。

５℃にしばらく静置し結晶析出を光子させ、これを戸別
し真空乾燥してラクタムＢの白色針状晶１３５ｍＩ！を
得た。

（収率６８％）実施例 ２ 蔗糖２％、ペプトン０°５％、イーストエキス０．２％
、グルタミン酸ソーダ０．２％、Ｋ２ＨＰＯ４゜０．２
％、ＭｇＣ７２０，０１％、ＦｅＳＯ４０，００１％及
びＭｎＳＯ４０，００１％から成る液体培地（ｐＨ６，
８）を試験管にＩＣ１１づつ分注し減菌後、アスペルギ
ルス・ニガーＩＡＭ ２０９４、ＩＪゾプス・デレマー
ＩＡＭ６０１５、グルコノバクタ−・サブオキシダンス
ＩＡＭ１８２９及びシュードモナス・オパリスＩＦＯ１
２０５１をそれぞれ一白金茸づつ接種し、２８℃のチュ
ーブシェーカーにて４２時間培養する。

それぞれの培養菌体を遠心分離し、ｐＨ７，５，０，０
５Ｍリン酸緩衝液で洗滌し各洗滌菌体を得る。

２％ノジリマイシンＢ溶液（ｐＨ７，５，０，０５Ｍリ
ン酸緩衝液に溶解） ’ ２ ｍｌを試験管に取り、各
洗滌菌体（湿潤）４０■を加え２８℃のチューブシェー
カーで１６時間振盪反応した後、遠心分離により各反応
泥液を得る。

泥液をアンバーライト１Ｒ１２０の小カラム（２ｍｌ）
に通し、蒸溜水５ｍｌでカラムを水洗し、通過液と水洗
液を合せ、その液の杏エムルシンに対する５０％阻害を
示すに必要な希釈倍数を求め、ラクタムＢの含有量を算
出した。

結果を次の表に示した。

表 １ ノジリマイシンＢの微生物酸化 によるラクタムＢの生成 使用微生物 ラクタムＢ収量 アスペルギルス・ニガー ２３．１％ＡＭ２０
９ リゾプス・テレマー ３３．２％ＩＡＭ
６０１５ 使用微生物 ラクタムＢ収量 プルコノバクター・ サブオキシダンスＩＡＭ１８２９ ９８．０％シュード
モナス・ オバリス ＩＦＯ１２０５１７８，５％ 実施例 ３ 実施例２と同じ液体培地を５００ ｍｌ、容坂ロフラス
コ１本当り１００ｍ１づつ１５本に分注し、綿栓を施し
殺菌後（１２０℃、１５分）、グルコノバクタ−・サブ
オキシダンスＩＡＭ１８２９を一白金耳づつ接種し２８
℃のレシプロシェーカーで４４時間培養する。

培養プロスを遠心し集菌する。得られた菌体をｐＨ７，
５，０，０５Ｍのリン酸緩衝液で洗滌し、洗滌菌体１１
．５Ｓ’を得た。

ノジリマイシンの精製過程で得たノジリマイシンＢの部
分精製物（凍結乾燥粉末、約９０％のノジリマイシンを
含む）３０グをｐＨ７，５，０，０５Ｍリン酸緩衝液に
３％濃度に溶解し、先に得られたグルコノバククー・サ
ブオキシケンスの洗滌菌体１０グ（湿潤）を加え３０℃
で７時間撹拌反応を行なった。

反応混液を遠心分離して除菌し、その上澄液をアンバー
ライトＩＲ−１２０（Ｈ型）４００７１２１の塔を通過
させ、さらに蒸溜水６００’／Ｉｌｌを通し塔を水洗し
、通過液と水洗液を合せた液１，５ｔを得た。

これをアンバーライ１−ＩＲ−４５（ＯＨ型）を用い中
和し、中和液を減圧濃縮すると初めにＤ−グルコニック
−δ−ラクタムの結晶（１８，７Ｐ）が析出して来る。

さらに減圧濃縮するとラクタムＢとＤ−グルコニック−
δ−ラクタムとの混晶が析出し、これを戸別し、真空乾
燥してラクタムＢの混晶３．１ｆ（ラクタムＢ含量、約
５０％）を得た。

実施例 ４ 実施例３で得られたラクタムＢの混晶２．９ｖを２０ｍ
１の蒸溜水に溶解し、９００ｍ１のカーボンカラム（和
光紬薬製、クロマト用）に掛け、蒸溜水で展開する。

試験管に１本２０ｍ１づつのフラクションに分画して行
くと、最初Ｄ−グルコニックーδ−ラクタムが溶出され
、次いでラクタムＢが溶出されて来る。

各フラクションを薄層クロマトグラフィー調べ、ラクタ
ムＢのみの両分（フラクション！１０３〜１６２）を集
め（約１．２７）、減圧濃縮し約３０ｍ１となし、これ
にメタノールを等量加えさらに濃縮するとラクタムＢの
結晶が析出する。

これを戸別し真空乾燥し、ラクタムＢの白色針状晶８８
０１ｎｇを得た。

結晶母液に等量のメタノールを加え再度減圧濃縮すると
結晶が析出し、これを戸別し、真″空乾燥してラクタム
Ｂの二番結晶５９０〜を得た。

【図面の簡単な説明】

第１図は本発明の方法で製造されたラクタムＢの赤外部
吸収曲線図である。

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. １ ノジリマイシンＢまたはノジリマイシンＢの部分精
   製物を、ノジリマイシンＢ酸化酵素または本酵奏を生産
   し含有する微生物菌体と反応せしめてノジリマイシンＢ
   をラクタムＢに変換せしめ、その反応混合物よりラクタ
   ムＢを採取することを特徴とする、ラクタムＢの製造法
   。