JPS5818080B2 - コレステリンの測定法及び測定試薬 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 本発明はコレステリンオキシダーゼを使用してコレステ
リンを測定するための方法及び試薬に関する。

コレステリンを、場合によりあらかじめ化学的又は酵素
的な鹸化によりそのエステルから遊離させた後、分子状
酸素の存在下にコレステリンオキシダーゼを用いて、コ
レステノン及びＨ２Ｏ２に変換させ、この定量的に経過
する反応をコレステリンの測定に使用することは公知で
ある。

この際、生じたコレステノンもしくはＨ２０□、又は消
費された酸素を測定する。

この酵素的コレステリン−測定法はたしかにその特異性
により、従来常用されていた化学的測定法にくらべて大
きな進歩をもたらしたのではあるが、この方法は現在ま
で迅速で、実用的な動力学的な実施法に適していない。

反応工程の最も特異的な部分工程を触媒するコレステリ
ンオキシダーゼのＫＭ−値が低いために、コレステリン
測定に重要な１３ミリモル／ｌまでの濃度範囲でこの反
応は１次もしくは擬１次的に進行しないのである。

この種の反応経過は、従来必要であった終点法もしくは
動力学的法に対し何個の分析あたりの必要時間を著しく
短縮する、試料空位を必要としない、迅速で、実用的な
動力学的な測定法にとって必要なことである。

従来の測光法に必要な時間は１０〜６分であったが、動
力学的な方法により１〜３分の分析時間が得られる。

新しい時代の自動分析機は高い試料通過量を想定。

しており、コレステリン検出の分野における従来の方法
では達成することのできない短かい培養時間を可能とす
る。

従って、今日常用の高い分析量を有する自動分析機は十
分に使用されていないのである。

； 従って、本発明の課題は擬１次に進行するコレステ
リンオキシダーゼ反応の動力学的測定法を見い出すこと
である。

関与する酵素のＫＭ値が低くすぎる際に人工的なＫＭ値
上昇によりこの種の反応経過を達成する１ことが多くの
場合可能であることは公知である。

ミヒヤエリス（Ｍｉｃｈａｅｌｉｓ）及びメントン（Ｍ
ｅｎｔｏｎ）の理論によれば、酵素のミヒヤエリス定数
が最大基質濃度より著しく犬である場合、酵素により触
媒される一基質反応は広い濃度範囲ノにおいて一次的に
経過する。

ノカルディア（Ｎｏｃａｒｄｉａ）、ブレビバクテリウ
ム（Ｂｒｅ−ｒｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ）又はストレプ
トマイセチン（Ｓｔｒｅｐｔｍｙｃｅｔｅｎ）のような
種々の微生物属からの従来公知のコレステリンオキシダ
ーゼは；１０−’〜１０−５モル／ｌのＫＭ値を示すの
で、非常に僅かなコレステリン濃度でのみ動力学的に測
定することができる。

競合的阻害剤を添加すること（こよりコレステリンオキ
シダーゼ゛のＫＭイ直を自体公知方法で人工的に上昇さ
せるという実験は無）効であることを示した。

しかしながら、一定の起源のコレステリンオキシダーゼ
及び一定のフェノール誘導体の選択により擬１次的反応
経過を達成することができることが意外にも判明した。

シ 従って、コレステリンオキシダーゼ及び場合により
コレステリンエステラーゼを用いて酸素消費量、生じた
過酸化水素又は生じたコレステノンを測定することによ
り遊離又は結合した形のコレステリンを測定するための
本方法はストレプトマインセス属の微生物から得られた
コレステリンオキシダーゼを使用し、かつ３，４−ジク
ロルフェノールの添加下に、この測定を動力学的に実施
することを特徴とする。

従来コレステリン測定に常用のノカルジア又はブレビバ
クテリアからのコレステリンオキシダーゼを用いず、か
つ競合的阻害剤として先ず第１に考えられるコレステリ
ン類似ステロイド又は胆汁酸を用いることもなく、動力
学的測定をはじめて可能とした、そのような反応経過を
達成することができた。

ジクロルフェノールの他の異性体も反応経過に全く影響
を与えないか、又は不十分にしか影響を与えない。

従って、３，４−ジクロルフェノールとストレプトマイ
セス属の微生物からの酵素との間に特別な相互作用が生
じると思われる。

ストレフトマイセス属のものからコレステリンオキシダ
ーゼを得ることは西ドイツ国特許公開第２９２４８７５
．７号公報に記載されている。

好適な種類の例はストレプトマイセス・グリセオフスカ
ス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｇｒｉｓｅｏｆｕｓ
ｃｕｓ。

ＤＳＭ４０１９１ ）、ストレフトマイセス・ヒゲロス
コピカス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｈｙｇｒｏｓ
−ｃｏｐｉｃｕｓ、ＤＳＭ４０７７１ ）及びストレプ
トマイセス・アシドマイセチカス（Ｓｔｒ６ｐｔｏｍ−
ｙｓｅｓ ａｃｉｄｏｍｙｃｅｔｊｃｕｓ、ＤＳＭ４
０７９８）である。

この所望の一次の反応経過は広い濃度範囲の３゜４−ジ
クロルフェノール及びコレステリンオキシダーゼにおい
て達成することができる。

３，４−ジクロルフェノール０．５〜１０ミリモル／ｌ
）及びストレプトマイセスからのコレステリンオキシダ
ーゼ０．１〜２０ Ｘ １０３Ｕ／１１を使用するのが
有利である。

その他の点では本発明の実施方法は動力学的測定に常用
の方法で行なわれた。

あらかじめ決めた時間範囲内に少なくとも２回の測定を
実施するのが有利である。

この測定はストレプトマイセスからのコレステリンオキ
シダーゼが活性である全ｐＨ値範囲で実施することがで
きる、但し使用した補助酵素がこのｐＨ範囲で同様に活
性であることを前提とする。

６．５〜８のｐＨ値で緩衝させた溶液中で、この測定を
実施するのが有利である。

すでに記載したように、コレステリンオキシダーゼを使
用してコレステリンを測定するすべての公知法を原則的
に使用することができる。

しかし、２３０〜２５０ｎｍでのコレステノン形成の測
定は、３，４−ジクロルフェノールがコレステノンの測
定光において吸収を行なうので、高濃度の３゜４−ジク
ロルフェノールにおいてはあまり好適ではない。

従って、本発明方法のこの実施形式において、３，４−
ジクロルフェノールの濃度は１５ミリモル／ｌを越える
べきではない。

本発明方法の有利な実施形式は生じた過酸化水素を４−
アミノアンチピリン、フェノール、ペルオキシダーゼ及
びこれらの混合系に好適な緩衝剤の添加により測定する
こさよりなる。

ここで燐酸塩緩衝剤、へペス緩衝剤（ＨＥＰＥＳ ：
４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジンエクン
ースルホン酸）又はトリス緩衝剤は好適である。

本発明のこの実施形式において、更に非イオン系界面活
性剤及び場合により付加的にコール酸グループの界面活
性剤を添加する場合最高の結果が得られる。

本発明のもの１つの課題はコレステリンオキシダーゼ及
びＨ２０□又はコレステノンの測定用混合系並びに場合
によりコレステリンエステラーゼを含有するコレステリ
ンの動力学的測定用試薬であり、これは付加的に３，４
−ジクロルフェノールを含有し、このコレステリンオキ
シダーゼはストレプトマイセス属の微生物からのもので
あることを特徴とする。

Ｈ２０□の測定用混合系は４−アミノアンチピリン又は
その誘導体、フェノール又はフェノール誘導体、緩衝剤
及び界面活性剤の組み合わせ（しばしばこれは’ＰＡＰ
”−混合系として表４つされる）が有利である。

ＰＡＰ−混合系及びその変化したものは、その生じた色
素がＵＶにおいて３，４−ジクロルフェノールと異なる
波長を吸収し、これにより吸光の重なりによる精度に対
する妨害が生じないので特に有利である。

非イオン系界面活性剤を単一で又は場合によりコール酸
グループの界面活性剤と一諸に使用するのが特に好適で
ある。

、本発明による試薬は緩衝剤を含有するのが有利であり
、この際関与した酵素の活性範囲、有利に６．５〜８の
ｐＨ範囲で緩衝作用を有する、すべての緩衝剤をあげる
ことができる。

燐酸塩緩衝剤、ヘペス緩衝剤及びトリス緩衝剤は特に好
適である。

Ｈ２０□の測定用混合系としてＰＡＰ−混合系を含有す
る本発明の試薬は有利に次の組成を示す：コレステリン
オキシダ ーゼ ０．１〜１０ Ｘ １０３Ｕ／Ｉｔ
１コレステリンエステラ ーゼ ｏ、ｉ〜２０×１０３Ｕ／１１ペル
オキシダーゼ ０．１〜５ Ｘ １０３Ｕ／ｌ。

３，４−ジクロルフェ ノール １〜１０ミリモル／１１゜４−
アミノアンチピリ ン ０．５〜１０ミリモル／１３
１フェノール又はフエ／ 一ル誘導体 ５〜２０ミリモル／Ｌ非イオン
系界面活性剤 １〜１０ｇ／ｌ。

コール酸グループの界 面活性剤 Ｏ〜１５ミリモル／ｌ及び緩衝音Ｉ
Ｊ、 ｐＨ６，５〜 ５０〜２００ ’、 ’Ｊ ’：
：）’／ １３ 。

その他に、本発明による試薬は酵素試薬に常用の添加剤
、例えば安定化剤、例えばマンニット、殺菌剤、例えば
アジ化物、無機塩を含有していてよい。

前記トリツプ−（Ｔｒｉｎｄｅｒ）によるＰＡＰ−混合
系において、フェノールのかわりにフェノール誘導体、
アニリン誘導体、ナフトール、ナフトール誘導体、ナフ
チルアミン、ナフチルアミン誘導体、アミノキノリン、
ヒドロキシキノリン、ジヒドロキシフェニル酢酸及び類
似に反応する物質を使用することができる。

４−アミノアンチピリンハ例エバフェニレン−ジアミン
−スルホン酸、メチルベンゾチアゾロン−ヒドラゾン、
スルホン化メチルベンゾチアソ泊ンーヒドラゾン誘導体
及び類似構造の化合物により置換することができる。

本発明範囲においてＰＡＰ混合混合化わりに、他の公知
のＨ２Ｏ２−測定混合系を使用することもできる。

これらの中では、蛍光又は化学的発光を測定する発光法
（Ｌｕｍｉｎｅｓｚｅｎｚｍｅｔｈａｄｅ））例工ばペ
ルオキシダーゼ／ルミノール−混合系が有利である。

他の好適な混合系はカタラーゼ、β−ジケトン、例えば
、アセチルアセトン、及びアルコール、例えばメタノー
ル、エタノール又はメチレングリコールからなる。

その他の好適な混合系はペルオキシダーゼ及び２，３′
−アミノベンズチアゾリン−スルホン酸のような発色団
からなる。

本発明による試薬がコレステノンの測定のための混合系
を含有しているならば、このためには公知の検出用混合
系カζ好適である。

前記のように、３．４−ジクロルフェノールも２４０ｎ
ｍの波長で吸収を行なうので、ある程度の感度の損失を
甘受するならば、コレステノン形成を２４０ｎｍで直接
測定することもできる。

本発明による試薬は固体の担体上に含浸されて′Ｊ）で
もよい。

その場合、この測定をａ）試薬で含有させた担体を試料
中に漬けるか、又は ｂ）試薬担体上に一定の試料量を滴下するか、又は Ｃ）一定の試料容量でこの試薬を担体から溶離すること
により行なう。

反応速度を担体上で直接測定するならば、例え：ずこれ
は反射測定又は発光測定により可能である。

試薬の溶離後、測定を行なうならば、測定は担体を有さ
ない試薬におけると同様に行なわれる。

担持材料としては分析用検出試薬に常用の担体、例えば
紙、セルロース、繊維ブリース、多孔性プラスチックｌ
莫等が好適である。

本発明方法により著しく迅速なコレステリン量の確認が
達成され、これは従来の分析法に対し大きな時間の倹約
に導ひく。

多くの場合自動分析システムにとっては、これによりは
じめて酵素的コレステリン測定が可能となる。

次に実施例につき本発明の詳細な説明する。

例１ 次の試薬を使用したニ スプレブトマイセスからの コレステリンオキシダーゼ ５００ Ｕ／１３゜ペ
ルオキシダーゼ １５００ Ｕ／Ｖ。

コレステリンエステラーゼ ８００Ｕ／Ｖ３．４−
ジクロルフェノール ５ミリモル／１１フェノール
５ミリモル／１３゜４−アミノフェナ
ジン １ミリモル／１１非イオン系界面活性剤 （Ｇｅｎａ、ｐｏｌ ＯＸ １００） 、 ４
．８ ｇ／１３１ナトリウムデスオキシコ レート ９．４ミリモル／Ｌ燐酸
塩緩衝剤、ｐＨ７，８２００ミリモル／２０市販自動分
析機（ＣＥＮＴＲＩ’ＦＩＣＨＥＭ ４００という名称
で市販）を用いて、次の調整で血清中のコレステリン測
定を実施する： 温度：２５°Ｃ；フィルター：５００ｎｍ：ｔ。

−タイム−プレイ：６０秒；△を−間隔：１分間；ブラ
ンク、オート；テストモード：ターム；プリントアウト
：濃：標準値：ゾ゛ル値Ｐｒｅｃ １ｌｉ４；テスト
コード：００；試薬容量＝３５０μｌ；試量：５μｌ；
試量及び水：３０μｌ。

この測定は少なくとも１３ミリモル／ｌまで直！線であ
る。

使用したコレステリンオキシダーゼはストレプトマイセ
ス・グリセオフスカス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍ−ｙｃｅｓ
ｇｒｉｓｅｏｆｕｓｃｕｓ ）ＤＳＭ４０１９１から
得られた。

１例２ 次の試薬を用いた： ストレプトマイセスからの コレステリンオキシダーゼ ５００Ｕ／Ａ’１ペル
オキシダーゼ １５００Ｕ／ｌご３．４−ジ
クロルフェノール ５ミリモル／１１フェノール
５ミリモル／１１゜４−アミノフェナジン
１ミリモル／１１イソトリデシルエーテル
４ｇ／ｌ。

トリス緩衝剤、ｐＨ７，７１００ミリモル／１０この試
薬を例１に記載されているように市販の自動分析機（Ｃ
ＥＮＴＲＩＦＩＣＨＥＭ ４００ ）で血清中のコレ
ステリンの測定に使用した。

ここでも、２少なくとも１３ミリモル／ｌまで直線であ
ることが判明した。

同様な結果が他の自動分析機（ＥｐｐｅｎｄｏｒｆｆＡ
ＣＰ ５０４０）で達せられた。

この場合にはコレステリンオキシダーゼ５Ｕ／ｒｒＬｌ
を含有する出３発試薬を使用した。

例３ 次の試薬を使用した： ストレプトマイセスからの コレステリンオキシダーゼ ５００Ｕ／ｌ、３コレ
ステリンエステラーゼ １５００Ｕ／７゜ペルオキシ
ダーゼ １５００Ｕ／１１３．４−ジクロル
フェノール ５ミリモル／１１サリチルアルコール
１４ ミＩＪモル／１１４−アミノフエナゾン
０．５ミリモル／ｌ、４イソトリデシルエーテル
４ｇ／ｌ。

ナトリウムコレート １０ミリモル／１１゜へペ
スー緩衝剤、ｐＨ６，９５０ミリモル／１２゜この試薬
を用いて例１及び２と同様な結果が得られた。

一連の、上記二個の自動分析機で得られた精度を次の表
に示す。

表 ＣＥＮＴＲＩＦＩＣＨＥＭ ４００ ＡＣＰ ５
０４０ｎ ＝ ８ ｎ ＝ ８又
＝３１１．３ 又＝２８５．６８＝６．
８４ ８＝２．１３ＶＫ＝２．２０％
ＶＫ＝０．８％例４ ２４０ｎｍでコレステノンの測定下に動力学的測定： 試薬ニドリス−緩衝剤 （ｐＨ７，６） ０．１モル／Ｌイソト
リデシル エーテル ３９／１１ ３．４−ジクロ ルフェノール １．０ミリモル／ｌ コール酸ナトリ ラム １０．０ミリモル／ｌ コレステリンオ キシダーゼ ０．２ Ｕ／ｍｌ配合：試薬
２ｍｌ、試量（コレステリンオキシダーゼ） １０
μｌ 試験条件： Ｔ ２５℃ Ｅｌ 反応開始後 １分 Ｅ２ 反応開始後 ２分 結果：コレステリン濃度／吸光度変化 ２．５９ミリモル／ＩＪ ３０ｍＥ ５．１７ミリモル７１３ ６０ｍＥ １０．３４ミリモル／／Ｊ １２０ｍＥ列５ 酸素消費量の測定 試薬ニドリス緩衝剤、ｐＨ７，６０，１モル／１１イソ
トリデシルエーテル ３ｇ／１３゜３．４−ジクロ
ル フェノール ３ミリモル／１１コール酸ナト
リウム １０ミリモル／１３、コレステリンオキシダー
ゼ ２ Ｕ ／ｒｄ配合：試薬 １．５ ｒｕｌ、試
料１０ｐ／１試験条件：Ｔ：２５℃ 酸素消費の速度を２分及び３分の間に測定する。

結果：コレステリン濃度／比較反応速度 ２．５９ミリモル／ｌ ２５ ５．１７ミリモル７７１ ５０ １０．３４ミリモル／ｌ！ １００

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １ コレステリン−オキシダーゼ及び場合によりコレス
   テリン−エステラーゼを用いて、酸素消費量、生じた過
   酸化水素又は生じたコレステノンを測定することにより
   遊離又は結合した形のコレステリンを測定するために、
   ・ストレプトマイセス属の微生物から得られたコレステ
   リン−オキシダーゼを使用し、かつ３，４−ジクロルフ
   ェノールの添加下に、この測定を動力学的に実施するこ
   とを特徴とするコレステリンの測定法。 ２３．４−ジクロルフェノール０．５〜５０ミリモル／
   ｌ及びコレステリン−オキシダーゼ０．１〜５０Ｘ１０
   ３Ｕ／ｌを添加する特許請求の範囲第１項記載の方法。 ３ あらかじめ決定した時間範囲内で測定を少なくとも
   ２回行なう特許請求の範囲第１項又は第２項記載の方法
   。 ４ 反応を６．５〜８のｐＨ値で緩衝させた溶液中で実
   施する特許請求の範囲第１項〜第３項のいずれ１か１項
   に記載の方法。 ５ 生じた過酸化水素を測定するために４−アミノアン
   チピリン、フェノール、ペルオキシダーゼ及び燐酸塩−
   緩衝剤、へペス緩衝剤又はトリス緩衝剤を添加する特許
   請求の範囲第１項〜第４項の・いずれか１項に記載の方
   法。 ６ 非イオン系界面活性剤及び場合により付加的にコー
   ル酸−グループの界面活性剤を添加する特許請求の範囲
   第１項〜第５項のいずれか１項に記載の方法。 ７ コレステリン−オキシダーゼ及びＨ２Ｏ２又はコレ
   ステノンを測定するための混合系並びに場合によりコレ
   ステリンエステラーゼを含有するコレステリンの動力学
   的測定試薬において、付加的に３．４−ジクロルフェノ
   ールを含有しており、かつコレステリン−オキシダーゼ
   はストレプトマイセス属の微生物からのものであること
   を特徴とするコレステリンの測定試薬。 ８ Ｈ２Ｏ２を測定するための混合系とは４−アミノア
   ンチピリン、フェノール又はその誘導体、緩衝剤及び界
   面活性剤を含有する特許請求の範囲第７項記載の試薬。 ９ 非イオン系界面活性剤を単一で、又はコール酸−グ
   ループの界面活性剤と一諸に含有する特許請求の範囲第
   ７項又は第８項に記載の試薬。 １０燐酸塩−緩衝剤、へペスー緩衝剤又はトリス−緩衝
   剤を含有する特許請求の範囲第７項〜第９項のいずれか
   １項に記載の試薬。 １１ コレステリン−オキシ ダーゼ ０．１〜１０ Ｘ’ １０３Ｕ／１
   コレステリン−エステ ラーゼ ０．１〜２０ Ｘ １０３Ｕ／１１
   ペルオキシダーゼ ０．１〜５×１０３Ｕ／１３．４
   −ジクロルフェ ノール １〜１０ミリモル／１４−アミ
   ノアンチピリ ン ０．５〜１０ミリモル／ｌフェ
   ノール又はフェノ ール誘導体 ５〜２０ミリモル／ｌ非イオン
   系界面活性剤 １〜１０ｇ／ｌコール酸グループ
   の界 面活性剤 Ｏ〜１５ミリモル／ｌ緩衝剤（
   ｐＨ６，５〜８） ５０〜２００ミリモル／ｌ を含有する特許請求の範囲第８項〜第１０項のいずれか
   １項に記載の試薬。 １２固体担体上に含浸されている特許請求の範囲第７項
   〜第１１項のいずれか１項に記載の試薬。