JPS582672B2 - ウロキナ−ゼノ ブンリセイセイホウホウ - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 本発明はプラスミノーゲン活性化酵素であるウロキナー
ゼを、ウロキナーゼを包有する溶液から、直接かつ簡便
に分離精製せしめる新規な方法に関するものである。

ウロキナーゼは人の尿、血液、臓器中に微量存在する酵
素でありこれを分離精製した製剤は静注したとき、血栓
溶解剤、制ガン作用増強剤などとして有効であることが
知られている。

それ故に人の尿、血液、臓器の組織培養液からウロキナ
ーゼを効率よく増得する方法が産業上強く要望されてい
る。

従来の方法としては多孔性シリカ吸着法（米国特許第３
７５５０８３号明細書参照）及びリジン結合アガロース
吸着法（特開昭４９−１２５５８４号明細書参照）等が
知られている。

しか１−ながら、本発明の検討の結果、前者の方法は溶
離操作が煩雑であること、後者の方法は吸着剤自体が混
状化し易く溶離条件のポイントとなる流速の厳密な調節
が困難であることなど依然として改良の望まれる方法で
あることが明らかになった。

しかも従来法がいずれも吸着前に酸又はアルカリを添加
してウロキナーゼを含有する溶液の水素イオン濃度の調
節を必要としているため溶液を前処理することなく、直
接かつ簡便にウロキナーゼを分離する方法が要請される
。

かかる観点から、本発明者らはこれら公知の取得方法の
欠点を克服すべく鋭意研究を重ねた結果、従来法よりも
すぐれた簡便なウロキナーゼの分離方法を見出したので
ある。

すなわち本発明の方法は、フエニルアラニン、チロシン
、ロイシン、イソロイシン、パリン、グルタミン酸、ア
スパラギン酸からなる群から選ばれたアミノ酸を水不溶
性担体に結合させた吸着剤を、ウロキナーゼを含有する
水性溶液と接触させて該溶液中のウロキナーゼを吸着さ
せた後、その吸着せるウロキナーセヲ溶離させることを
特徴とするウロキナーゼの分離精製法である。

次に本発明の態様を説明する。

本発明方法に用いられる吸着剤は、水不溶性担体にアミ
ノ酸を吸着させたものであるが、該アミノ酸としては、
フエニルアラニン、チロシン、ロイシン、インロイシン
、パリン、グルタミン酸およびアスパラギン酸よりなる
群から選ばれた少くとも１種であり、このうちフエニル
アラニン、バリンは親和性が高く特に好適なものである
。

水不溶性担体とは、有機、無機いずれでもよく、水に不
溶性で該アミノ酸と結合しうるものであればよいもので
ある。

例えば、アルミナ（Ａｔ２０３）、シリカ（ Ｓ １０
２ ）、チタニア（ Ｔ ｔ ０２ ） 、ジルコニア
（ＺｒＯ２）、ニッケルオキサイド（ Ｎ ｉ Ｏ ）
あるいはこれらを主成分とする無機担体、ガラス、カラ
ムライト、カオリン、シラス、ケイソウ土、粘土などを
無機担体の例としてあげることができる。

これら無機担体の形状は、どのようなものであってもよ
いが、微粒状、多孔状、繊維状などできる丈表面積の大
きい形状が好ましい。

又、ポリスチロール系弱酸性陽イオン交換樹脂（商品名
、例えばアンバーライトＣＧ−５０、同Ｉ ＲＣ−５
０、ダウエックスＣＣＲ−２）、アクリル系弱酸性陽イ
オン交換樹脂（商品名、例えば、ダイヤイオンＷＫ−１
０、同ＷＫ−１１、デュオライトＣＣ−３、同ＣＣ−４
）などの側鎖にカルボキシル基を有する弱酸性イオン交
換樹脂を有機担体の例としてあげることができる。

次に本発明方法に用いる吸着剤を調製するためには、ア
ミノ酸を上記担体に結合するいかなる化学的方法を用い
でもよいが、例えば（１）アルミナ、シリカなどの無機
担体の場合には活性化後シランカツブリング剤でアミノ
基を導入し、更に無水コハク酸でカルボキシル基を導入
し、最終的に水溶性力ルポジイミドで縮合する方法〔バ
イオテクニーク・アンド・バイオエンジニアリング （Ｂｉｏｔｅｃｈ． Ｂｉｏｅｎｇ．） １ ２、３
９９９（１９７０）参照〕が、（２）チタニア、ジルコ
ニアなどの無機担体の場合にはＷｅｅｔａｌｌらの方法
（Ｂｉｏｔｅｃｈ． Ｂｉｏｅｎｇ． １５、４５５（
１９７３）参照）が、（３）ニッケルオキサイドなどの
無機担体の場合にはＷｅ ａ ｒ ｉ ｎｇらの方法（
Ｂｉｏｔｅｃｈ．Ｂｉｏｅｎｇ，１４． ９７５（ １
９７２）参照）が適用できる。

弱酸性イオン交換体の場合には水溶性カルボジイミドに
より直接縮合する方法でよい。

取得ウロキナーゼの比活性（純度）を高めるには、担体
として無機担体を用いたものでは導入したアミノ基、カ
ルボキシル基を、また、担体として弱酸性イオン交換体
を用いたものでは交換基として存在するカルボキシル基
を完全にアミノ酸に置換することが好ましい。

本発明方法の実施に際して、上記吸着剤をウロキナーゼ
を含有する水性溶液と接触せしめ該溶液中のウロキナー
ゼを吸着させるには、バッチ式で該溶液に吸着剤を添加
してもよいし、カラムで吸着充填塔に該溶液を通敵して
もよい。

ガラス、ダイヤイオン、アンバーライ１・などの比較的
粒子の大きい担体を用いる場合は、担体との溶液の分離
はろ過あるいは傾斜などの簡便な方法でよい。

本発明方法において用いられるウロキナーゼを含有する
水性溶液はｐＨが３乃至８であれば、特にｐｉ｛を調節
する必要はなく、健康人の尿、血清、臓器組織培養、Ｐ
［は通常そのまま用いられる。

該溶液はこのような体液ばかりでなく体液から他の方法
によって、あるいは本発明方法によって得たウロキナー
ゼ溶液でもよいことは勿論である。

該溶液中の塩濃度が高いと上記吸着剤への吸着が阻害さ
れるので接触前に塩濃度を下げるため、該溶液を水で希
釈するか、透析装置にかけて該溶液の電導度を１ ０ｍ
Ｕ／ｍ以下に下げることが好ましい。

なお、該溶液が不活性沈澱物等を含む場合には接触前に
戸過、遠心分離等の操作で沈澱物を除去するのがよい。

本発明方法により吸着したウロキナーゼを溶離させるに
は、該溶液と接触せしめた吸着剤から未吸着溶液を完全
に除去するため洗浄した後、イオン濃度の高い水溶液、
例えば４％アンモニア水、ＩＭ塩化ナトリウム溶液ある
いはＩＭ硫酸アンモニウム溶液にて洗浄するのがよい。

かくしてウロキナーゼは溶出液中に回収されるので、以
後通常の酵素分離方法、例えば硫安塩析、アルコール沈
澱、限外濃縮、凍結乾燥などによりウロキナーゼを取得
することができる。

本発明方法では吸着剤自体が経済的に有利に調製でき、
しかも性能的に大量操作に適しでいるという利点を有し
ている。

塩基性アミノ酸結合多糖体は反復使用中に結合塩基性ア
ミノ酸が脱離して吸着能が減少したりあるいは微粒子状
に崩壊して溶液の流速が次第に落ち、単位時間当りの増
得回収率が低下するばかりでなく、微生物によって分解
されるので多糖体断片が溶出して製品中に混入する欠点
がある。

本発明方法で使用する上記吸着剤の大量操作に適してい
る性能には反復使用しても吸着能に変化がなく安定であ
ること、連続力ラム操作に重要な機械的強度、圧縮時の
体積変化率、溶液通液時の圧力損失、表面の液切れがあ
り、いずれも従来の吸着剤よりも優れている。

次に本発明方法を実施例を上げて詳細に説明するが、必
ずしもこれらに限定されるものではない。

なお実施例中のウロキナーゼの活性単位はフイブリン平
板法によって測定したものである。

実施例 １ ポリスチロール系弱酸性陽イオン交換樹脂であるアンバ
ーライトＩＲＣ−５０（オルガノ社製）一を５ｇとり、
常法に従い活性化を行いＨ型として用いた。

そしてこれを０． １ Ｍ ＩＪン酸緩衝液ｐＨ ７．
０、５０ｒｒＬｌに分散し、しかるのちに水溶性カル
ボジイミド（蛋白質研究奨励会製）ｌＷｌｌを添加しよ
く攪拌混和させた。

次に、Ｌ−フエニルアラニン５ｇ１を加え常温で５時間
反応させた。

反応後ろ過して不溶性担体を集め充分水洗したのち、吸
着剤として用いた。

こうして調製した吸着剤２，９を４倍に希釈した尿４０
０ｍ／ｌ’中に分散させ、常温で３０分間攪拌し１た。

その後ろ過して、ウロキナーゼを吸着した不溶性担体を
集め、ロート上で４％アンモニア水２ ０ ｍ．ｌ．を
徐々に加えながらウロキナーゼを溶出させた。

モして原尿からの回収率７６％比活性１４０単位／Ｉｎ
９（蛋白量）のウロキナーゼを得た。

Ｓ実施例 ２ ケインウ士（半井化学製）１１’をとり、有機溶媒（ア
セトン又はアルコール）で洗浄した。

その後０． Ｉ Ｎ − ＮａＯＨ １０ ０ｍｌに分
散しよく洗浄した。

ろ紙にてろ過し、ロート上で蒸留水にて洗液が中Ｓ性に
なるまで洗浄した。

そののち０、ＩＮ−ＨＣＡ１００ｒｒＬｌに分散しよく
攪拌した。

再びろ紙にてろ過しロート上で蒸留水にて洗液が中性に
なるまで洗浄し、その後、減圧にて乾燥させた。

こうしてｇＭＥ化したケイソウ土を８ｇとり、８０ＪＷ
Ｌｌのトルエン中に分散させた。

ここにアミノプ口ピルＩ− ＩＪ工１・キシシラン１２
．８ｇを加え、還流冷却管を付し、シリコンバス温度を
１８０℃前後ニ調節しながら加温し７時間以上反応させ
た。

反応後ろ集しアセトン又はメタノールにてよく洗浄し、
；乾燥後冷水に分散し無水コハク酸８９を添加して氷冷
しながら氷冷した２Ｎ−ＮａＯ’Ｈを加えｐＨを６．０
に調節した。

攪拌しながら一晩反応させ、反応物をろ集した。

充分水洗後、次の操作に移った。こうして得られたケイ
ソウ士を０．１Ｍ−リン酸ｌ緩衝液ｐＨ ７． ０、３
Ｑｍｌに分散し水溶性カルボジイミド（前述）ｌｍｇを
添加しよく攪拌した。

これに２ｇのＬ−バリンを加え、５時間常温で攪拌を続
けた。

反応後ろ過して不溶性担体を集め充分水洗したのち吸着
剤として用いた。

以下実施例１の方法と同様の操作により尿中よりウロキ
ナーゼを回収した。

原尿からの回収率は８７％、比活性は２６０単位／〜（
蛋白量）であった。

実施例 ３ アクリル系弱酸性陽イオン交換体であるダイヤイオンＷ
Ｋ−１１（三菱化成製）を２ｇとり常法に従い活性化を
行いＨ型として用いた。

そしてこれを０．１Ｍ−リン酸緩衝ｉ＆ｐＨ ７． ０
、３０ｍＡに分散させた後、水溶性、カルボジイミド１
ｒｒＬｌを加えよく攪拌した。

次に、Ｌ−フエニルアラニン２ｇを添加し常温で５時間
攪拌をつづけた。

反応後、不溶性担体を集め充分水洗したのち吸着剤とし
て用いた。

こうして調製した吸着剤をＩＣｒｒＬ×２ＣｒｒＬのカ
ラムにつめ、上方より４倍に希釈した尿を流下させた。

完全に流し去ったのち、４％アンモニア水２０ｒＩＬｌ
をゆっくり流し、そしてウロキナーゼを溶出せしめた。

こうして得られたウロキナーゼ標品は活性が１６０単位
／Ｔｌ１ｙ蛋白量であり、回収率は６５％であった。

実施例 ４ 実施例２の方法で用いたケイソウ土担体の代わりにシラ
スバルーン（サン工業製）を、更にＬ一バリンの代わり
にＬ−フエニルアラニンを用い同様な方法によって調製
した吸着剤２ｙを、４倍に希釈した尿４００ｒｒＬｌに
分散し３０分間常温でウロキナーゼを吸着せしめた。

ウロキナーゼを吸着した担体をろ過によって口−ト上に
集め、ロート上で４％アンモニア水を徐徐に加えウロキ
ナーゼを流出せしめた。

こうして得られたウロキナーゼ標品は回収率６５％、比
活（”４２７０単位／〜（蛋白量）であった。

実施例 ５ 実施例３と同様の操作により、ダイヤイオンにＬ−バリ
ンを結合させ吸着剤を調製した。

かくして得られた吸着剤を用いて実施例３の方法と同様
の操作により回収率８６％、比？ｆ３性１９０単位／■
（蛋白量）のウロキナーゼ標品を得た。

比較例 １ アミノ酸化してないケイソウ士自体を用いて実施例２の
方法と同じ操作によりウロキナーゼを吸着、溶出させた
結果を表１にかかげた。

グルタミン酸あるいはバリンを結合させたケイソウ士を
用いた例を併記したが、この方が活性回収率、比活性と
もに高く、結合させたアミノ酸の効果は顕著であること
がわかる。

比較例 ２ ダイヤイオンＷＫ−１０（三菱化成製）のみでウロキナ
ーゼを吸着溶出させた場合と、ダイヤイオンＷＫ−１０
にバリンを結合させた担体でウロキナーゼを吸着溶出さ
せた場合の比較を表２に示す。

バリンを結合させると比活性は約１．４倍、活性回収率
は約４倍上昇し、バリンの結合の効果が明らかである。

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. １ フエニルアラニン、チロシン、ロイシン、イソロイ
   シン、パリン、グルタミン酸、アスパラギン酸からなる
   群から選ばれたアミノ酸を水不溶性担体に結合させた吸
   着剤を、ウロキナーゼを含有する水性溶液と接触させて
   、該溶液中のウロキナーゼを吸着させた後、その吸着せ
   るウロキナーゼを溶離させることを特徴とするウロキナ
   ーゼの分離精製方法。