JPS5833240B2 - 蛋白多糖体ａｐｓ - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は抗ウイルス性を有する新規な蛋白多糖体に関す
るものである。

近年種々の高等植物や酵母などから抗ウイルス性を示す
多糖類や蛋白多糖類が抽出されることが報告されている
。

しかし、これらの物質はウィルスの生体内への侵入を阻
害するいわゆる感染阻害物質であり、全身病の発病を抑
制する効果は極めて低い。

したがってこれらの物質は学術上興味があるものとして
も実際上の有用性は極めて小さいものである。

従来報告されてきた微生物により生産される多糖体ある
いは蛋白多糖体は、菌体より抽出されるものがほとんど
であったが、本発明者らは、多種類の糸状菌を培養し、
培養を液についてその抗ウイルス性を研究した結果、ア
スペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ）属に属する
糸状菌が培養Ｐ液中に抗ウイルス性を有する蛋白多糖体
を生産することを見出した。

本物質はウィルス感染を阻害するのみではなく、植物体
内への浸透移行性を示し、全身病の発病をも抑制する。

したがって本発明はウィルス病を防除する新規な蛋白多
糖体を提供することを目的とする。

本発明者らは、アスペルギルス・オリゼー（Ａｓｐｅｒ
ｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ ＮＦ−１２４４）菌、微
工研菌寄第３１００号（以下ＮＦ−１２４４菌と称する
）を大豆粉培地で培養し、菌体を除去し、培養ｆ液に等
量のアセトンを添加し、沈澱物を除去した上澄を濃縮乾
固し、熱メタノールで洗浄後、残渣を水に再溶解した。

この水溶液に８０％アセトン水になるようアセトンを添
加し、沈澱を得た。

この沈澱物を水に再溶解し、８０％フェノール水で除蛋
白し、水層よりフェノールを除去し、凍結乾燥した。

ここで得られた粉末をデキストラン（セファデックス）
濾過クロマトグラフィーにより有効成分を得ることに成
功し、この物質の特徴的性質を解明し、本発明が得られ
た。

＊＊ 以下、本発明について詳しく説明する
。

本発明の蛋白多糖体ＡＰＳ物質は、白色ないし乳白色を
呈する粉末である。

ＡＰＳは前記特許請求の範囲に記載された事項により特
徴づけられるものであり、以下順を追って、その特徴的
事項について説明する。

物理的ならびに化学的性質 （１）元素分析 ＡＰＳの元素分析結果を第１表に示した。

（２）呈色反応 ＡＰＳを水に溶解し呈色反応を行った結果を第２表に示
した。

第２表の呈色反応からＡＰＳは、糖類と蛋白質を含有し
、糖類はアルドヘキンースを主成分とし、２−デオキシ
糖、アミノ糖、ウロン糖を含まないことが明らかである
。

（３）溶解性 ＡＰＳは、メタノール、アセトン、クロロホルム、ベン
ゼン、ヘキサンにはほとんど溶けない。

水には溶は易く、吸湿性は強くはないが、湿度が高いと
ころでは外観的変化を起す。

この場合、無機物質に見られるような潮解などの現象は
みられない。

（４）融点 ＡＰＳは、１９７〜２０３℃間で褐変を起し２２０〜２
２７℃で発泡分解する。

（５） ｐＨ値 ＡＰＳＩＰをＬｏｏｍｌの水に溶解し、ｐＨを測定した
ところ６．７〜７．０であり、はぼ中性である。

（６）旋光度 ＡＰＳの０．８６％水溶液について旋光度を測定し、比
旋光度〔α〕ｂを求めたところ ３３．９５±３．０２を示した。

（７）赤外線吸収スペクトル ＡＰＳのＫＢｒ 錠剤法による赤外線吸収スペクトルを
添附図面の第１図に示した。

第１図において３６００〜３２００ｃｒｎ ’にみられ
るブロードな吸収は種々の度合に水素結合したＯ−Ｈ伸
縮振動に由来するものと考えられる。

このことは試料をメチル化すると減少するところからも
推定できる。

１６００〜１７００ＣＩｒＬ−１の吸収はアミド吸収で
試料中の蛋白質部分に起因するものと思われる。

１１００〜１０００−’のブロードな吸収は、糖質部の
ピラノース環Ｃ−Ｏ−Ｃ結合の非対称的伸縮振動による
ものと考えられる。

（８）核磁気共鳴吸収（Ｎ−Ｍ−Ｒ） 本物質について、溶剤として重水を用い２・２−ジメチ
ル−２−シラノペンタン−５−スルホン酸ンーダ（Ｄ、
Ｓ、Ｓ）を内部基準として８０ ＭＨｚ でそのプロト
ンＮＭＲを測定した結果を第２図に示す。

この図において０．５〜２．５ｐｐｍの吸収は糖質部分
の側鎖プロトンに起因し、２．５〜６．０ｐｐｍの吸収
は糖質部分のプロトンに起因するものである。

また溶媒として重水を用イシオキサンを内部基準として
８０ＭＨｚ でその１３Ｃ−ＮＭＲを測定した結果を第
３図に示した。

現在まで知られている多糖体の１３Ｃ−ＮＭＲとは一致
するものがな（、本物質は複雑なヘテロ多糖であろうと
推定されるが、現在のところその結合状態を明確に示す
ことは極めて困難である。

（９）紫外線吸収スペクトル ＡＰＳの０．０１％水溶液を用い、測定波長１９０〜３
４０ｎｍおよび測定感度Ａｂｓ、Ｏ〜１．１の条件で測
定した。

構造的特徴 ＡＰＳは、フェノール硫酸法により検出される約９０％
の糖質部とローリイ・フォーリン法により検出される約
５％の蛋白質部とにより構成される。

（１） 糖質部の構成 ＡＰＳの糖質部の構成糖については、試料に塩酸・メタ
ノールを加え、１００℃で１６時間メタツリシスを行な
った後、常法によりトリメチルシリル化を行なって、ガ
スクロマトグラフ分析を行なった結果、ガラクトース、
マンノース、グルコース、アラビノースを含有していた
。

それらの比率を第３表に示した。

（２）蛋白質部の構成 ＡＰＳの蛋白質部分のアミノ酸組成を常法に従って加水
分解し、アミノ酸分析装置を用いて分析した。

その結果を第４表に示した。（３）分子量 ＡＰＳの分子量は、ゲル１過法による測定では３０００
〜１ｏｏｏｏｏであり、超遠心法による沈降定数は１．
３Ｓ〜１．６８である。

またシュリーレンパターンは第４図に示した通り極めて
対称的なピークが１つしかなく、超遠心的に均一で純度
の高いものであることが認められた。

尚、シュリーレンパターンの測定は日立ＬＣＡｌ型を使
用し５５４３０ｒｐｍで、基礎生化学実験法第３巻、物
理化学的測定（Ｉ）、１９７５（丸善）、３０頁記載の
方法に従って測定を行なった。

蛋白多糖体ＡＰＳの製造法 アスペルギルスオリゼー（Ａｓｐｅｒｇｉ １１ｕｓＯ
ｒｙｚａｅ） に属するＮＦ−１２４４菌を、大豆粉
、コーンスチープリカー、廃糖蜜、糖類、有機酸、アミ
ノ化合物、その他の炭素源、窒素源の他、りん酸塩、硝
酸塩、硫酸塩、金属塩などの無機塩類、ビタミン、アミ
ノ酸など、生育必須物質を適宜添加した各種の培地に接
種した後、振盪培養、通気培養、静置培養など、好まし
くは好気的条件下でｐＨ３〜１０．温度２０〜４０℃に
おいて２〜７日間培養すれば、目的とする培養物が得ら
れる。

この培養物は、そのままで抗ウィルス活性を有するが、
その有効成分を精製、濃縮すればＡＰＳとなる。

例えば培養液に当量のアセトンを加え、不純物を沈澱さ
せて除き、この上澄に１．５〜２倍量のアセトンを加え
ることにより有効成分を沈澱させて得ることができる。

この場合用いる有機溶媒はアセトンに限らない。

さらにこのような有機溶媒による分別だけでなく、ゲル
濾過、限外濾過、透析処理、さらに各種吸着クロマトグ
ラフ法などによってもＡＰＳを得ることができる。

さらに詳しくは、ＡＰＳを生産するＮＦ−１２４４菌を
大豆粉培地など、菌の生育に適当な培地で培養し、培養
後、滅菌し、または滅菌しないで菌体を除去し、培養Ｐ
液を得る。

この培養涙液に等量のアセトンを添加し、沈澱物を除去
する。

このアセトン等量処理を行なう場合には、菌体の除去は
必ずしも必要ではない。

この上澄を濃縮乾固し、熱メタノールで洗浄し、残渣を
水に溶解し、８０％アセトン水となるようにアセトンを
添加する。

ここに生じた沈澱を集め、フェノール水で除蛋白し、さ
らにフェノールをエーテルを用いて除去し、乾燥した後
、セファデックスＧ−５０カラムで分画すればＡＰＳを
得ることができる。

また、工業的には、前記培養Ｐ液を直接あるいはアセト
ン等量処理し、イオン交換樹脂（例えばアンバーライト
ＩＲ−１２０ＢおよびアンバーライトｌＲ４５の両者あ
るいは両者の混合物など）カラム処理を行ない、その通
過液よりＡＰＳを得る方法が有利である。

以下、ＡＰＳの製造方法および抗ウィルス活性の実施例
を記載する。

実施例 １ アスペルギルスオリゼー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓｏｒ
ｙｚａｅ ）に属するＮＦ−１２４４菌（微工研菌寄第
３１００号）を後記の大豆粉培地※を用いて３０℃、約
４日間振盪培養し、培養後１２０℃、５分間オートクレ
ーブにより滅菌処理し、菌体を除去後、培養涙液に等量
のアセト／を添加し、遠心分離により上澄を得る。

この上澄を濃縮乾固後、熱メタノールにより洗浄し、不
溶物を水に再溶解し、８０％になるようにアセトンを添
加する。

８０％アセトン水により沈澱した部分を水に溶解して凍
結乾燥し、褐色の粉末を収量約５ ｒ／ １ 、／の培
養濾液の割合で得た。

このものはＡＰＳを約１２％含有していた。

（ＡＰＳの含有率はセファデックスＧ−５０分画による
高分子部分の面積比より求めた。

）この粉末を試料としてカーボランダム法によりウィル
スを接種し、抗ウイルス性を検定した。

検＊＊定植物にはキュウリまたはタバコを供試し、ウィ
ルスにはキュウリモザイクウィルス（以下ＣＭＶと略す
）またはタバコモザイクウィルス（以下ＴＭＶと略す）
を供試して検定した。

調査は接種３週間後に行なった。

その結果を第５表と第６表に示した。

上記のとと＜ＡＰＳを含有する物質はＣＭＶ病およびＴ
Ｍ’Ｖ病に卓効を示し、植物ウィルス病の防除に有用な
物質である。

※ 犬豆粉培地組戒 大豆粉 Ｐ ブドウ糖 ０１ 硫酸アンモニウム １ 炭酸カルシウム ｉ 燐酸２カリウム ０．５Ｐ 水 ０００１ｒＬｌとする。

実施例 ２ ＮＦ−１２４４菌を大豆粉培地で３０℃５日間振盪培養
し、滅菌後菌体を除去し、培養Ｆ液にアセトンを等量添
加し、沈澱物を遠心分離で除去し、アセトン水画分から
アセトンを除去し、イオン交換樹脂（アンバーライトＩ
Ｒ−１２０ＢおよびアンバーライトＩＲ−４５）で処理
した。

その通過液を凍結乾燥し、培地成分を含むＡＰＳを約５
０％含有する白色ないし乳白色の粉末を収量およそ［相
］［相］７００ｒｆＬｌ／ｌ培養濾液の割合で得た。

この粉末を試料として抗ウイルス性を検定した。

検定植物にはタバコ（品種：ＫＹ−５７）、ウィルスに
はＣＭＶを供試し、接種はカーボランダム法による。

薬剤処理は各濃度ともウィルス接種直後１回散布である
。

調査はウィルス接種２週間後に行なった。その結果を第
７表に示した。

上記のごとくイオン交換樹脂処理によって得られたＡＰ
Ｓを含有する物質もウィルス病に対して卓効を示し、ウ
ィルス病の防除に有用な物質である。

実施例 ３ ＮＦ−１２４４菌を大豆粉培地で約３０℃、４日間振盪
培養し、１２０℃、５分間オートクレーブ処理後、濾過
法により培養Ｐ液を得た。

６Ｎｆ（Ｃ１でｐＨ４に調整した培養Ｆ液にアセトンを
等量添加し、沈澱物を遠心分離により除去し、上澄を濃
縮乾固し、熱メタノールで洗浄後、残渣を遠心分離によ
り集め、水に再溶解した。

この水溶液に８０％アセトン水となるようにアセトンを
添加し、沈澱物を得た。

この沈澱物を水に再溶解し、８０％フェノール水で処理
し、水層を採取して、フェノールをエーテルで除去し、
凍結乾燥した。

ここで得られた粉末を水に再溶解し、セファデックスＧ
−５０を用いてゲル１過し、高分子部分を分取し、その
液を凍結乾燥して白色粉末を１３０■／ｌ培養瀘液の割
合で得た。

この白色粉末は以下の性状を有していた。

元素分析 炭素 水素 窒素 呈色反応 α−ナフトール・硫酸反応 アンスロン反応 トリプトファン・硫酸反応 オルシン・塩酸反応 フェノール・硫酸反応 システィン・硫酸反応 Ｋ１１ｉａｎｉの反応 Ｍｏｒｇａｎ −Ｅ １ｓｏｎ法 ナフトレゾルシン反応 キサントプロティン反応 ローリイ・フォリン法 ビウレット反応 ４１．８％ ６．８％ ０．９％ ジフェニルアミン 融点 １９７〜２０３℃ ２２０〜２２７℃ ｐＨ値（１％水溶液） 比旋光度〔α〕 赤外線吸収スペクトル ＮＭＲスペクトル 紫外線吸収スペクトル 構成単糖（モル比） ガラクトース マンノース グルコース アラビノース アミノ酸分析（％） イソロイシン スレオニン グルタミン酸 アスパラギン酸 セリン 陰性 褐変 分解 ６．８ −３３．８０ 第１図 第２図、第 ３図および 第４図 第５図 １４．３ １３．０ １１．８ １０．５ ９．５ ＊ ＊ プロリン バリン アラニン グリシン チロシン リジン アルギニン ヒスチヂン フェニルアラニン メチオニン ロイシン 分子量（ＸＩＯ３） ７．５ ７．８ ６．２ ３．５ ３．２ ３．０ １．８ ０．５ ｒａｃｅ ｒａｃｅ ｒａｃｅ ３〜１００ ン 以上からこの白色粉末を蛋白多糖体ＡＰＳとした。

ＡＰＳを試料として抗ウイルス性を検定した。

検定植物にはタバコ（品種：ＫＹ−５７）、ウィルスに
はＣＭＶを供試し、ウィルス接種はカーボランダム法に
よった。

また、ウィルス病の発病調査はウィルス接種２週間後に
行なった。

ウィルス接種直後にＡＰＳの薬液を散布した結果を第８
表に、治療効果試験の結果を第９表に、予防効果試験の
結果を第１０表に、浸透移行性試験の結果を第１１表に
それぞれ示した。

上記のごとく、ＡＰＳはＣＭＶ病に対して全身病微の発
病阻止作用があり、植物体内への浸透移行性があり、ま
た、予防効果とともに治療効果も認められた。

従ってＡＰＳはＴＭＶ病等、接触伝染性のウィルス病の
みならず、ＣＭＶ病等、虫媒伝染性のウィルス病にも卓
効を示すものである。

【図面の簡単な説明】

第１図は本発明の蛋白多糖体ＡＰＳの赤外線吸収スペク
トルを示し、第２図はＡＰＳのプロトン核磁気共鳴スペ
クトル、第３図は同炭素−１３核磁気共鳴スペクトルを
それぞれ示す。 第４図にはＡＰＳのシュリーレンパターンの写真の複写
図を示す。 第５図はＡＰＳの紫外線吸収スペクトルを示す。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １ ゲル濾過法による測定により分子量３０００〜１０
   ００００を示し、糖質部はガラクトース、マンノース、
   グルコース、アラビノースより構成され、蛋白質部分は
   、少（ともアスパラギン酸、スレオニン、セリン、グル
   タミン酸、プロリン、グリシン、アラニン、バリン、メ
   チオニン、インロイシン、ロイシン、チロシン、フェニ
   ルアラニン、リジン、ヒスチヂン、アルギニンより構成
   され、融点２２０〜２２７℃（分解）を示すことを特徴
   とする蛋白多糖体ＡＰＳ。 ２ 超遠心法による沈降定数が１．３Ｓ〜１．６８を示
   す特許請求の範囲第１項記載の蛋白多糖体ＰＳ０ ３ アスペルギルス・オリゼーに属するＮＦ−１２４４
   菌（微工研菌寄第３１００号）を培養し、その濾液より
   精製沈澱させて採取することを特徴とする蛋白多糖体Ａ
   ＰＳの製造方法。 ４ 培養濾液の精製沈澱方法として有機溶媒分別沈澱法
   を用いることを特徴とする特許請求の範囲第３項記載の
   蛋白多糖体ＡＰＳの製造方法。 ５ 培養濾液の精製方法としてイオン交換樹脂カラム法
   を用いることを特徴とする特許請求の範囲。 第３項記載の蛋白多糖体ＡＰＳの製造方法。 ６ 培養濾液の精製方法として培養濾液もしくは中間精
   製液をゲル濾過による分別法を用いることを特徴とする
   特許請求の範囲第３項記載の蛋白多糖体ＡＰＳの製造方
   法。 ７ 有機溶媒分別沈澱法に用いる有機溶媒がアセトンで
   あることを特徴とする特許請求の範囲第４項記載の蛋白
   多糖体ＡＰＳの製造方法。 ８ ゲル濾過法の担体としてデキストランゲルを用いる
   ことを特徴とする特許請求の範囲第６項記載の蛋白多糖
   体ＡＰＳの製造方法・ ９ 蛋白多糖体ＡＰＳを有機成分として含有する抗ウィ
   ルス剤。