JPS5835680B2 - Ｓ−ノルニコチンの製造法 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は培養法によるＳ−ノルニコチンの製造法に関す
る。

Ｓ−ノルニコチンは、Ｓ−ニコチンなどとともに葉たば
こ中に含有されるアルカロイドの１種で、その含有量は
葉たばこの種類によって異なるが、通常栽培種葉たばこ
中にはｏ、ｉ〜２．５重量斜、野生種葉たばこ中には３
〜４重量φ程度含有されている。

周知のようにＳ−ニコチンは、たばこの喫煙による満足
感を賦与する上で極めて重要な因子とされているが、最
近の研究によれば、Ｓ−ノルニコチンもＳ−ニコチンと
同様たばこの喫味満足感の賦与に有効であり、かつ、Ｓ
−ノルニコチンを少量種々のたばこ原料に添加すること
により、たばこ煙の悪癖を抑え喫味をまろやかにするな
どの品質改良効果を有することが判明している。

しかも、Ｓ−ノルニコチンの生理作用はＳ−ニコチンに
比して弱いので、近年開発が進められている人工たばこ
あるいは脱ニコチン処理を施した再生たばこ等に対する
喫煙満足感の賦与および香喫味改良の観点からＳ−ノル
ニコチンの利用は極めて有効であると考えられる。

さらに、Ｓ−ノルニコチンと種々の糖類との加熱縮合物
は、すぐれたたばこの香喫味改良剤となることが知られ
ており（特公昭５４−６６３９号）、Ｓ−ノルニコチン
の用途は今後拡大することが期待される。

従来、ノルニコチンの製造方法としては、次の２方法が
考えられる。

すなわち、第１の方法は葉たばこを栽培し収穫した葉た
ばこからＳ−ノルニコチンを抽出精製する方法であり、
第２の方法はミオスミンを化学的に合成し、これを還元
することによりノルニコチンを得る方法である。

第１の方法によれば、Ｓ−ノルニコチンを直接抽出しう
る利点があるが、葉たばこ中のＳ−ノルニコチン含量は
極めて少量であるためＳ−ノルニコチン含量の比較的高
い葉たばこの野生種にコチアナ・グルチノーザ等）を栽
培するとしても、野生種の収量は栽培種にくらべ畑の面
積当り上程０ 度の収量であり、また野生種のアルカロイドはＳ−ノル
ニコチンやＳ−ニコチンなどの混合物であるため、抽出
、分離、精製の工程が複雑となる。

第２の方法ではラセミノルニコチンが製造され、これを
光学分割することは知られていないのでＳ型のノルニコ
チンのみを得ることは現状では不可能である。

本発明者等は、上記の方法によることなく、培養法によ
ってＳ−ノルニコチンを製造する方法について鋭意研究
を重ねた結果、Ｓ−ニコチンを分解してＳ−ノルニコチ
ンを生成する菌株を見出し、本発明をなすにいたった。

すなわち、本発明はＳニコチンを加えた培地にペリキュ
ラリア フィラメントーザに属するニコチン分解菌を接
種培養して得られる培養物からＳ−ノルニコチンを抽出
採取する方法である。

Ｓ−ニコチンを分解してＳ−ノルニコチンを生成する菌
としては、現在までに不完全菌であるカニングハメラ
エキニュラータ（Ｃｕｎｎｉｎｇｈａｍｅｌｌａｅｃｈ
ｉｎｕｌａｔａ）が報告されている（Ａｐｐｌｉｅｄ
ａｎｄＥｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ Ｍｉｃｒｏｂｉ
ｏｌｏｇｙ、３８．８３６（１９７９））。

しかし、この菌によるＳノルニコチン生成量は極めて低
く、分析機器を用いて検出できる程度にすぎない。

しかるに、本発明者等が見出したＳ−ニコチン分解菌は
、効率よくＳ−ニコチンからＳ−ノルニコチンを生威し
、極めて実用性に富むものである。

本菌株は、１９７８年に日本専売公社岡山試験場圃場で
分離されたペリキュラリア フイラメントーザ（Ｐｅｌ
ｌｉｃｕｌａｒｉａ ｆｉｌａｍｅｎｔｏｓａ ）Ｊ
ＴＳ−２０８（以下、本菌株ともいう）で、工業技術院
微生物工業技術研究所に受託香号第５９５５号として寄
託されている公知の菌で、従来タバコ腰折病菌として知
られているものである。

その菌学的性質は中村壽夫著、煙草植物病学Ｐ、７８〜
８１、（１９５５年）朝食書店発行に述べられている通
りである。

次に本発明の詳細な説明する。

まず、オートクレーブ等を用いて第１表の組成のＭＹ培
地を常法により加熱加圧滅菌する。

第１表の培地組成はカビ、酵母保存用ＭＹ培地として公
知である。

次に、外径１８ｍｍ試験管内のジャガイモ・グルコース
寒天培地（以下ＰＤＡ培地という。

）に、あらかじめ２０〜３０°Ｃ１５〜１０日間、望ま
しくは１週間培養した本菌株の試験管１本分の菌体を、
３１容の三角フラスコ中に第１表の培地１１を加え滅菌
したものに無菌的に接種し、温度２０〜３０℃で好気的
に振盪培養する。

３〜５日間、望ましくは４日間培養を行い、菌体がほぼ
最大量になった時に、あらかじめｒ過滅菌したＳ−ニコ
チン水溶液（塩酸でｐＨ５，５に調整）を約０．１重量
φ以下の濃度になるように添加−培養を継続する。

Ｓ−ニコチン濃度が培地の０．１重量多以上になると、
菌の生育が阻害されるので望ましくない。

培養期間はＳ−ニコチン添加後７〜２０日間の範囲がよ
い。

７日未満ではＳ−ノルニコチンの生成量が不充分であり
、また２０日以上培養を継続してもＳ−ノルニコチン生
成量の増加はわずかである。

この培養操作によって、基質としてのＳ−ニコチンの約
１０％をＳ−ノルニコチンに変換させることができる。

又、本菌株によるＳ−ニコチンからＳ−ノルニコチンの
変換は常法によりジャーファーメンタ−中で、通気攪拌
によっても行うことができる。

次いでこの培養液中に生成したＳ−ノルニコチンを抽出
する。

すなわち、培養終了後の液に炭酸カリウム、苛性ソーダ
などのアルカリを加えてｐＨを約１０以上に調整した後
、有機溶媒を加えて抽出する。

この有機溶媒層にｐＨ３以下の塩酸水溶液を加えてさら
に抽出しＳ−ノルニコチン２塩酸水溶液を得る。

抽出用有機溶媒としてはエーテルまたはクロロホルムな
どを使用することができる。

また抽出に先立って培養終了後の液を減圧濃縮したのち
溶媒抽出を行うことにより、使用する有機溶媒等を節約
できる。

この塩酸水溶液をエバポレーター等を用いて減圧濃縮す
る。

しかしこの方法ではＳ−ノルニコチンと共にＳ−ニコチ
ンも抽出される。

従ってＳ−ノルニコチンと残存Ｓ−ニコチンとの分離は
薄層クロマトグラフィー、高速液体クロマトグラフィー
又は蒸留などの常法によって行う。

本発明によるＳ−ノルニコチンの製造法は培養法である
ため、操作を常温常圧下で実施することができ、葉たば
こより抽出する方法に比し高収率で簡易に製造すること
ができる利点がある。

次に本発明を実施例によって説明する。

実施例 １ オートクレーブを用いて１２１°Ｃで加圧加熱滅菌した
第１表の組成のＭＹ培地５１を入れた三角フラスコに、
前もって試験管５本の滅菌済みＰＤＡ斜面培地に２８℃
で７日間培養しておいた本菌株を滅菌水を１０ｍ１ずつ
添加して試験管からかきとって加え混合し、これを滅菌
済み３１容三角フラスコ５個に１１ずつ無菌的に分注し
、２８８Ｃで４日間振盪培養した。

ついで塩酸でｐＨを５．５に調節した滅菌済み１０％Ｓ
−ニコチン水溶液をそれぞれＳ−ニコチンとして０．５
ｇずつになるように加え同様の条件で１４日間培養を行
なった。

この培養済み液全量５１の中のＳ−ノルニコチン平均濃
度は０．０５５ ｍ９７ｍ１（基質Ｓ−ニコチンの１２
φ（モル比）に相当）であった。

この培養済みの溶液５１をガーゼでｅ過して菌体を除い
たのち１０重量係の炭酸カリウム水溶液を用いてｐＨ１
０に調節し、全量約２１のクロロホルムを用いて３回に
分けて抽出し、クロロホルムを合せたものを０．５規定
の塩酸水溶液７００ｍ１で抽出した。

この塩酸水溶液を東京理化学製エバポレーク−を用いて
減圧濃縮し、メルク社製シリカゲル６０の薄層プレート
（厚さ５ｍｆｆ１）に展開剤としてクロロホルム：メタ
ノール：５８ダアンモニア水の混合比が６０：１０：１
の溶液を用いて上昇法で展開させ、展開終了後、風乾さ
せたものの片すみに、０．２％イサチン（５饅酢酸水に
溶解させたもの）をスプレーびんを用いてスプレーさせ
たのち、１１０℃で１５分間加熱し、青色に発色した位
置と同じＲｆ値の部分をかきとって、１規定の塩酸水溶
液５０ｍ１で抽出し、エバポレーターで減圧濃縮を行い
、Ｓ −ノルニコチン２塩酸塩０．３７５９〔Ｓ−ニコ
チンの１１饅（モル比）に相当〕を得た。

実施例 ２ 第１表のＭＹ培地７１を調製し丸菱理化装置研究所製の
１０１容ＭＤ ５００回発酵槽に入れオートクレーブで
１２１℃、１５分間加圧加熱滅菌した。

前もって試験管７本の滅菌済みＰＤＡ斜面培地に本菌株
を接種し、２５°Ｃ１７日間培養後、谷試験管に滅菌水
を１０ｍ１ずつ添加して菌体をかきとりこの全量を滅菌
済み発酵槽中の培地に添加して２５°Ｃ１３日間攪拌通
気培養した。

攪拌用プロペラの回転数は３０Ｃ）ｒｌ）Ｉｎ、通気量
は０．５ＶＶＭとした。

この培地に滅菌済みＳ−ニコチンに３．！Ｉｌｌ添加し
、同一条件下で７日間培養を続けた。

この培養終了後のＳ−ノルニコチン量は０．４１５ｇ（
基質ｓ−ニコチンの１３多（モル比）に相当〕であった
。

この培養済みの溶液７１をヌッチェを用い東洋沢紙嵐１
の１紙で１過して菌体を除去した。

エバポレーターを用い約１１になるまで減圧濃縮を行っ
たのち１０％炭酸カリウム水溶液でｐＨ１０に調節しエ
ーテル３１で３回に分けて抽出し、さらにこれを０．５
規定の塩酸水溶液１１で抽出した。

エバポレーターを用い塩酸水溶液を約１０ｍ１に濃縮し
たものを、米国ウォーターズ社製の高速液体クロマトグ
ラフでマイクロボンダパックＣＩ８カラム、溶媒として
メタノールと０．０５モル重炭酸アンモニウム水溶液の
１＝１混合物を１分間に２ｍｌの流速で流して、Ｓ−ノ
ルニコチン相当部分のピーク部分の溶媒を０．５規定の
塩酸水溶液に捕集し、減圧濃縮して約２０ｍ１とした。

この濃縮液は再度２Ｎ苛性ソーダでｐｆ−１１１に調製
後、クロロホルム３０ｍ１と０．５規定の塩酸水溶液１
０Ｔｎｌで抽出し、減圧濃縮を行い、Ｓ−ノルニコチン
２塩酸塩０．５５ｇＣ基質Ｓ−ニコチンの１１．５％（
モル比）に相当〕を得た。

Ｓ−ノルニコチンは反応性に富み、不安定な物質である
ため、Ｓ−ノルニコチン２塩酸塩の形で保存し、使用す
る直前にアルカリ性溶媒を用いてＳ−ノルニコチンとし
て使用に供する。

なお本発明においてＳ−ノルニコチンの定量法は次の方
法によった。

すなわち、培養液に等量のメタノールを加えて遠心分離
器を用いて毎分ｓ、ｏ ｏ 。

回転で菌体と沈澱物を除いた上澄を、ウォーターズ社製
の高速液体クロマトグラフ、マイクロボンダパックＣＩ
８カラム、溶媒としてメタノールと０．０５モルの重炭
酸アンモニウム水溶液１：ｌ、検出器として波長２５４
ｒ／Ｌ１１に調整した分光光度計を用いて、チャートの
ピーク面積からＳ−ノルニコチンの量を求めた。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １ Ｓ−ニコチンを加えた培地にペリキュラリアフィラ
   メントーザに属するニコチン分解菌を接種培養して得ら
   れる培養物からＳ−ノルニコチンを抽出採取することを
   特徴とするＳ−ノルニコチンの製造法。 ２ ニコチン分解菌がペリキュラリア フイラメントー
   ザＪＴＳ−２０８菌株である特許請求の範囲第１項記載
   のＳ−ノルニコチンの製造法。