JPS583671B2 - アポグルコ−スオキシダ−ゼの、フラビンアデニンジヌクレオチド及びその誘導体と結合する能力を増大する方法、複合体並びに液体媒体中のリガンドを測定するための均一系特異的結合分析法、均一系免疫分析法、試薬及 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、フラビンアデニンジヌクレオチド（ＦＡＤ）
及びＦＡＤ誘導体と結合して活性グルコースオキシダー
ゼを形成するアポグルコースオキシダーゼの能力を増大
する方法、即ちアポグルコースオキシダーゼの活性化法
に関する。

本発明は、更に、液体媒体中の抗原、ハプテンまたは抗
体のようなリガンドを測定する均一系特異的結合分析法
、試薬及び試験キットに関し、その際、ＦＡＤを標識と
して使用し、そして、ＦＡＤ標識を、アポグルコースオ
キシダーゼと結合して活性グルコースオキシダーゼを形
成するＦＡＤの能力によって検査する。

グルコースオキシダーゼは、酵素活性を有しない高分子
量蛋白質成分（アポ酵素）及びＦＡＤ（低分子量非蛋白
質補欠分子団）から成る複合酵素である。

アポグルコースオキシダーゼ及びＦＡＤは高い結合親和
性（約１０１０ｍｏｌａｒ−１の結合定数）を有するが
、酸性硫酸アンモニウムで処理することによって有効に
分離することができる〔スウオボダ（Ｓｗｏｂｏｄａ）
著、バイオキム・バイオフイズ・アクタ（Ｂｉｏｃｈｉ
ｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ）１７５巻３６５〜３７
９頁（１９６９年）〕。

スウオボダは、アポグルコースオキシダーゼが溶液中に
主として弛いフレキシブルコイルの分子構造で存在し、
少量は緻密な球形で存在するが、ＦＡＤを添加すると、
蛋白質はグルコースオキシダーゼ活性を有する緻密な、
ほぼ球状の形に変わることを証明した。

ＦＡＤは、球形のアポグルコースオキシダーゼと最も有
効に結合して活性グルコースオキシダーゼを生ずると考
えられる。

グルタルアルデヒドとの分子内交叉結合によりアポグル
コースオキシダーゼを安定化することは、既に報告され
た〔ソロモン（Ｓｏｌｏｍｏｎ）ら著、バイオポリマー
ス（Ｂｉｏｐｏｌｙｍｅｒｓ）１６巻１８３７〜１９５
２頁（１９７７年）〕。

本譲受人に譲渡されている米国特許第 ４２３８５６５号明細書には、標識としてＦＡＤを使用
し、アポグルコースオキシダーゼと結合して活性グルコ
ースオキシダーゼを形成するＦＡＤの能力によって検査
する特異的結合分析法が記載されている。

均一系及び不均一系の形式が予想される。

液体媒体中の抗原を測定する均一系分析においては、液
体媒体の試料を抗原に対する抗体及び抗原またはその、
ＦＡＤに結合した類縁体を含む標識複合体と混合すると
、試料からの抗原は抗体と結合するため抗原−ＦＡＤと
競争する。

アポグルコースオキシダーゼも存在するか、または適切
な温置期間後に添加され、これは抗体によって結合され
ない抗原−ＦＡＤと結合して活性グルコースオキシダー
ゼを生成することができる。

しかしながら、抗体と結合した抗原−ＦＡＤは、アポグ
ルコースオキシダーゼとそのように結合することはでき
ない。

従って、試料中の抗原の濃度は、生成する測定可能なグ
ルコースオキシダーゼの量を示す。

グルコースオキシダーゼ活性は、比色法を含む、広範な
公知方法で測定することができる。

ＦＡＤ−標識均一系特異的結合分析は、一般に広い濃度
範囲にわたって広範な種類のリガンドの測定に適用しう
る。

しかしながら、この分析法を、高い温度で短期間、分析
反応混合物の温置を必要とする現存の分析機器に適用す
ることは、限られていることが知られている。

アポグルコースオキシダーゼと結合して活性グルコース
オキシダーゼを形成する、ＦＡＤ及びＦＡＤ−誘導体（
即ち、リガンド−ＦＡＤ複合体）の能力が、温度を室温
より高めると共に急速に減少し、約３０℃以上の温度で
は、投与量一応答曲線を得るために分析反応混合物に著
しく多量のアポグルコースオキシダーゼを添加しなけれ
ばならなくなることが知られている。

３５〜４０℃では、ＦＡＤ−アポグルコースオキシダー
ゼの再結合反応は、１０−６以下の濃度のリガンドを測
定するため短い温置期間（例えば、１０分以下）で分析
に有用な投与量一応答曲線が得られなくなる程、遅延す
る。

グルコースオキシダーゼに対する抗体の製造は、グリー
ン（Ｇｒｅｅｎ）らによって、ジャーナル・オブ・イム
ノール（Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．）１０４巻１０９４〜１
１００頁（１９７０年）に報告されている。

ＦＡＤ−標識特異的結合分析法に有用なアポグルコース
オキシダーゼ製剤は、１９７９年６月４日に出願され、
本譲受人に譲渡されている米国特許出願番号第４５１９
１号明細書に記載されている。

ところで、現在、ＦＡＤと結合して活性グルコースオキ
シダーゼを形成するアポグルコースオキシダーゼの能力
が、グルコースオキシダーゼに対する特異的結合親和性
を有する免疫学的に誘導された結合物質とアポグルコー
スオキシダーゼを反応させることによって増強されるこ
とが判明している。

このような結合物質（以下、「抗−グルコースオキシダ
ーゼ」と記す）はグルコースオキシダーゼに対する抗体
またはそのフラグメント、例えば、Ｆａｂ，Ｆ（ａｂ’
）若しくはＦ（ａｂ’）２、またはグルコースオキシダ
ーゼに対する特異的結合親和性を有する他の物質であっ
てよい。

アポグルコースオキシダーゼ／抗−グルコースオキシダ
ーゼ複合体はＦＡＤとの再結合に対して活性化されてい
ることが知見された。

アポグルコースオキシダーゼの活性化は、２５〜３７℃
の間で温度を高めると共に増大し、３７℃では活性グル
コースオキシダーゼの形成は抗一グルコースオキシダー
ゼの存在によって１００〜１０００倍に向上することが
知見された。

従って、１０−５〜１０−８Ｍの濃度で存在するリガン
ドに関するＦＡＤ−標識化均一系特異的結合分析が、高
い反応温度（例えば、３７℃）及び短い温置時間（例え
ば、５〜７分）を必要とする分析機器と共に使用するこ
とが可能になる。

本明細書において、下記の用語は特に記載しない限り下
記の意味を表わすものとする： リガンド− 分析の対象である被分析物、即ち、液体媒体中での存在
または量を測定すべき物質または類似物質類。

リガンドの特異的結合対手引く 他の物質を排除してリガンドに対する特異的結合親和性
を有する物質または物質類。

ＦＡＤ−標識特異的結合分析− 標識がＦＡＤである前記米国特許第 ４２３８５６５号明細書（参考のため本明細書に含める
）に記載した均一型分析、通常免疫分析。

試薬− ＦＡＤ−標識特異的結合分析を行なうため使用する試薬
を含む組成物、試験具または試験キット。

本発明の抗−グルコースオキシダーゼは、抗体、抗体フ
ラグメント、またはグルコースオキシダーゼに対する特
異的結合親和性を有し、免疫学的方法から誘導された他
の物質であってよい。

完全な抗体の形である場合には、抗−グルコースオキシ
ダーゼは公知の類、例えば、ＩｇＧ，ＩｇＭ等及びその
亜類であってよい。

グルコースオキシダーゼに対する特異的結合親和性を保
有するそのような抗体のフラグメント、例えば、Ｆａｂ
，Ｆ（ａｂ’）及びＦ（ａｂ’）２として従来知られて
いるＩｇＧのフラグメントを使用することもできる。

グルコースオキシダーゼに対する抗体は任意の公知方法
により得られる。

特に、このような抗体は、グルコースオキシダーゼに対
して免疫された動物（例えば、マウス、ウサギ、モルモ
ット、ヤギ等）から抗血清の形で得られる。

このような抗体は、体細胞ハイブリット形成技術により
得ることもでき、一般に単クローン性抗体と言われる。

このような単クローン性抗体技術の概要はリンフオサイ
ト・ハイブリードーマス（ＬｙｍｐｈｏｃｙｔｅＨｙｂ
ｒｉｄｏｍａｓ）（メルヒヤース （Ｍｅｌｃｈｅｒｓ）ら編、シュプリンガー−フエルラ
ーク（Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ）ニユーヨーク
、１９７８）、ネイチャー２６６巻４９５頁（１９７７
年）及びサイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ）２０８巻６９２
頁（１９８０年）に記載されている。

ＦＡＤと結合したときに活性グルコースオキシダーゼの
形成に好適な分子構造にアポ酵素を保持する傾向のある
免疫複合体が生成することに基づいて抗−グルコースオ
キシダーゼによるアポグルコースオキシダーゼの活性化
が行なわれものと思われる。

最適に活性化するために所定量のアポグルコースオキシ
ダーゼに添加すべき抗−グルコースオキシダーゼの量は
実験により決定される。

一般に、一定量のアポグルコースオキシダーゼに添加す
る抗−グルコースオキシダーゼの量が増すに従って、ア
ポ酵素活性は最大に達するまで向上することが知られて
いる。

それ以上抗−グルコースオキシダーゼを添加しても活性
を向上しないで、むしろ一般に現実には活性を低下する
。

従って、過剰の抗−グルコースオキシダーゼは望ましく
ないであろう。

グルコースオキシダーゼ活性に対して抗−グルコースオ
キシダーゼを滴定すると、所定の量または濃度のアポ酵
素に関して、使用する抗−グルコースオキシダーゼの最
適の量または濃度が判るであろう。

アポグルコースオキシダーゼを活性化する抗−グルコー
スオキシダーゼの能力は、０℃から蛋白質が著しく変性
する温度に及ぶかなり広い温度範囲にわたって生ずる。

この活性化は１０〜４５℃、殊に約３０〜４０℃の範囲
で特に有意義である。

抗−グルコースオキシダーゼでアポグルコースオキシダ
ーゼを活性化しうろことは、ＦＡＤ−標識均一系特異的
結合分析に適用する際に特に有利である。

このような分析は基本的には、ＦＡＤ標識をアポグルコ
ースオキシダーゼと結合して活性グルコースオキシダー
ゼを形成する能力によって検査することを特徴とする。

本発明によれば、このようなアポグルコースオキシダー
ゼは、抗−グルコースオキシダーゼとの反応により活性
化される。

本発明は、特に、液体媒体中のリガンドを測定するため
ＦＡＤ−標識均一系免疫分析法に適用することができ、
この場合、（ａ）前記リガンドまたはその結合類縁体、
即ち、リガンド結合対手によってリガンドと実質的に同
様に結合される物質に結合したＦＡＤ標識を含む標識複
合体、（ｂ）リガンドに対する抗体、及び（Ｃ）アポグ
ルコースオキシダーゼを含む試薬と液体媒体を混合する
ことにより反応混合物を作り、その後反応混合物中のグ
ルコースオキシダーゼ活性を分析される液体媒体中のリ
ガンドの量の直接関数として測定する。

このような分析法は、抗体を含めた抗原性蛋白質、並び
に１，０００〜１０，０００，０００の分子量を有する
ポリペプチド及び１００〜１，５００の分子量を有する
ハプテンのようなリガンドを測定するために使用するこ
とができる。

また、被測定リガンドがリガンドに対するＦＡＤ一標識
結合対手として、アポグルコースオキシダーゼと結合す
るＦＡＤ標識の能力に影響しうる場合、例えば、リガン
ドが結合蛋白質であり、標識結合対手がリガンドによっ
て結合される物質である場合には、本発明を液体媒体中
のそのようなリガンドを測定するＦＡＤ−標識均一系免
疫分析法に適用することができ、この場合には、（ａ）
リガンドの前記結合対手に結合したＦＡＤ標識を含む標
識複合体及び（ｂ）アポグルコースオキシダーゼを含む
試薬と液体媒体を混合することにより反応混合物を作り
、反応混合物中でその後測定したグルコースオキシダー
ゼ活性は被分析液体媒体中のリガンドの量の逆関数であ
る。

このような方法を適用しうる前記のようなリガンド／結
合対手対は、抗体／ハプテンまたは抗原、チロキシン結
合性グロブリン／チロキシンまたはトリヨードチロニン
等である。

ＦＡＤ−標識特異的結合分析に使用する場合には、種々
の方法でアポ酵素を抗−グルコースオキシダーゼと反応
させるこ吉により、アポグルコースオキシダーゼの活性
化を達成することができる。

一実施態様では、抗−グルコースオキシダーゼ並びに、
通常（ａ）ＦＡＤ−標識形のリガンドまたはその類縁体
、（ｂ）リガンドの特異的結合対手、例えば抗体、（ｃ
）アポグルコースオキシダーゼ及び（ｄ）グルコースオ
キシダーゼ指示薬系を含む主分析試薬を別々の試薬とし
て組み合わせて分析反応混合物を形成する。

別の実施態様では、若干の試薬、例えば、（ａ）アポグ
ルコースオキシダーゼ及び結合対手、及び（ｂ）ＦＡＤ
−標識複合体及びグルコースオキシダーゼ指示薬系を、
予め合し、混合試薬として他の試薬に添加する。

抗−グルコースオキシダーゼ及びアポグルコースオキシ
ダーゼを分析反応混合物に活性化複合体の形で添加する
ことができる。

このことは、分析温置時間が短く、被分析物濃度が低い
場合に好ましい。

それというのは、このような場合には、ほとんどすべて
のアポグルコースオキシダーゼが、分析反応混合物を作
ったときに直ちに活性化された形で存在するからである
。

別々の試薬として添加する場合には、アポ酵素及び抗−
グルコースオキシダーゼは、抗−グルコースオキシダー
ゼと複合体を形成することによりアポグルコースオキシ
ダーゼを完全に活性化するために若干の時間を必要とす
る。

アポグルコースオキシダーゼ／抗−グルコースオキシダ
ーゼ複合体試薬を使用する場合には、抗−グルコースオ
キシダーゼとして一価抗体フラグメント、例えば、Ｆａ
ｂまたはＦ（ａｂ’）を使用することが好ましい。

この方法で、アポグルコースオキシダーゼの間で分子間
交叉結合の形成を防止することができ、これを防止でき
なければ、分析反応または測定されるシグナルを妨害す
る懸濁液または沈殿を生ずることがある。

本発明の試薬は、本発明の所望の分析法を実施するため
必要なすべての必須化学要素を含む。

このような試薬は、工業的に包装された形で、試薬の相
溶性が許す場合には組成物または混合物として、任意の
現在または未来の型の試験装置の構造で、または試験キ
ット、即ち、必要な試薬を保持する１個以上の容器の組
み合わせ包装として提供される。

本発明の試薬は、（ａ）所期の所定の分析技術に応じて
、リガンド、その結合類縁体またはその特異的結合対手
に結合したＦＡＤを含むＦＡＤ−標識複合体、（ｂ）ア
ポグルコースオキシダーゼ、（ｃ）ＦＡＤ−標識複合体
がリガンドまたはその類縁体を含む場合には、リガンド
の特異的結合対手（例えば、抗体または他の結合蛋白質
）、及び（ｄ）前記の抗−グルコースオキシダーゼ、及
び場合によりグルコースオキシダーゼ活性を検出する指
示薬組成物１種以上または全部（例えば、グルコース、
ベルオキシダーゼ及びグルコースオキシダーゼがグルコ
ースに作用したときに生成する過酸化水素に応答する色
原体または色原体系を含む）を含む。

もちろん、試薬はこの分野に公知の、商業及び使用者の
観点から望ましい他の物質、例えば、緩衝剤、希釈剤、
標準品等を含んでいてよい。

次に、実施例に基づいて本発明を詳述するが、本発明は
これに限定されるものではない。

残留グルコースオキシダーゼ活性を実質的に含まないア
ポグルコースオキシダーゼは、１９７９年６月４日に出
願され、本譲受人に譲渡されている米国特許出願番号第
４５１９１号明細書に記載されている方法によって製造
する。

テオフイリン−ＦＡＤ複合体は、本譲受人に譲渡されて
いる米国特許番号第４２３８５６５号明細書に記載され
ている方法により製造する。

３，５−ジクロロ−２−ヒドロキシベンゼンスルホン酸
ナトリウム（ナトリウムＤＨＳＡ）は、ナトリウム３，
５−ジクロロ−２−ヒドロキシベンゼンスルホニルクロ
リド〔ウィスコンシン州ミルウオーキイのアルドリツヒ
・ケミカル社 （Ａｌｄｒｉｃｈ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．）製〕を
重炭酸ナトリウム溶液で加水分解することによって製造
する。

０．１〜１．０ｍｇの範囲でグルコースオキシダーゼを
含む合計３ｍｌの補助薬（アジュバント）（フロイント
のアジュバント１．５ｍｌ及び食塩水１． ５ｍｌ）を
ヤギに肩付近の４個の皮下部位で注射することによって
グルコースオキシダーゼに対する抗体が得られる。

初回注射には完全フロイントアジュバントを使用し、補
助（ブースター）注射には不完全フロイントアジュバン
トを使用する。

初回注射後、５週間後に、１週間間隔で下記の計画に従
う：追加刺激、放血、放血、安静、反復。

グルコースオキシダーゼに対する抗血清の存在及び不存
在におけるアポグルコースオキシダーゼの活性化に対す
る温度の影響 Ａ．試薬 混合物Ａ− アミノフエナゾン４ミリモル（ｍＭ） 、グリセリン１
０％及びウシ血清アルブミン０．１％（ｗ／ｖ）を含む
０．１モル（Ｍ）燐酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．０）
中の２マイクロモル（μＭ）アポグルコースオキシダー
ゼ。

この混合物を室温で温置した。

混合物Ｂ− １．０ナノモル（ｎＭ）のテオフイリン−ＦＡＤを０．
１Ｍの燐酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．０），０．１０
５Ｍのグルコース、２．１１ｍＭのナトリウムＤＨＳＡ
，１．０５％（ｗ／ｖ）のウシ血清アルブミン及び６３
マイクログラム／ミリリットル（μｇ／ｍｌ）のパーオ
キシダーゼから成るグルコースオキシダーゼ分析試薬溶
液に加えた。

この混合物の既知量を下記の種々の温度で温置した。

Ｂ．分析 混合物Ａ（１００マイクロリットル（μｌ）〕を使い捨
てキュベット中でグルコースオキシダーゼに対するヤギ
抗血清（抗−ＧＯ血清）１０μｌまたはヤギ非免疫血清
（ＮＩ血清）１０μｌと混合した。

溶液を室温で１５分間温置した。所望の分析温度に対し
て平衡した混合物Ｂ（１９０ｍｌ）を次に加え、反応混
合物を倒置によって混合した。

所望の分析温度で１５分間温置した後、５２０ナノメー
タ（ｎｍ）での吸光度を混合物Ｂに対して読んだ。

混合物Ｂからテオフイリン−ＦＡＤを省いた以外は、前
記と全く同様にブランク試験を行なった。

結果を下記の表及び図面の第１図にグラフとして吸光度
の読みをブランク試験に対して補正した。

これらのデータは、抗−グルコースオキシダーゼ抗血清
がテオフイリン−ＦＡＤ複合体と結合して活性グルコー
スオキシダーゼを形成するアポグルコースオキシダーゼ
の能力を向上することを証明する。

室温（２５℃）では、抗−グルコースオキシダーゼの存
在はアポグルコースオキシダーゼ活性化を４倍増加する
。

３７℃での効果は１００〜１０００倍と概算される。

グルコースオキシダーゼに対する抗血清の存在及び不存
在における３７℃でのテオフイリン免疫分析 ■．抗−グルコースオキシダーゼの不存在における分析 試薬： 混合物Ａ− 混合アポ酵素／抗−テオフイリン試薬；ウシ血清アルブ
ミン０．１％（Ｗ／Ｖ）を含む０．１Ｍ燐酸ナトリウム
緩衝液（ｐＨ７．０）に１ｍｌ当り３２μＭのアポグル
コースオキシダーゼ及び５０μｌの抗−テオフイリン抗
血清を加えた。

この混合物を２０℃で温置した。

混合物Ｂ− 混合グルコースオキシダーゼ分析及びテオフイリン−Ｆ
ＡＤ標識；グルコース０．１０５Ｍ，ナトリウムＤＨＳ
Ａ２．１１ｍＭ，アミノフエナゾン０．２１ｍＭ、ウシ
血清アルブミン１．０５％（Ｗ／Ｖ）及び西洋わさびペ
ルオキシダーゼ６３μｇ／ｍｌを含む０．１Ｍ燐酸ナト
リウム緩衝液（ｐＨ７．０）に６３ｎＭのテオフイリン
−ＦＡＤを加えた。

この混合物を３７℃で温置した。テオフイリン標準品： 重量を測定して種々の量のテオフィリンをプールされた
ヒト血清に加えることによって調製した（種々の既知量
のテオフイリンを秤量し、それを別々の体積のプールさ
れたヒト血清に加えることによって調製した）。

これらの標準品を０．１Ｍ燐酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ
７．０）で１０倍に希釈した。

分析操作： 使い捨てキュベット中で混合物Ｂ（１．９０ｍｌ）を希
釈したテオフイリン標準品５０μｌと混合し、３７℃で
平衡にした。

次に、混合物Ａ（０．１０ｍｌ）を加え、反応混合物を
倒置により混合した。

３７℃で６分温置した後、５２０ｎｍでの吸光度を混合
物Ｂに対して読んだ。

主な試薬の最終分析濃度は下記のとおりであった： アポグルコースオキシダーゼ １．６０ μＭテオフ
イリン−ＦＡＤ ６０ ｎＭ抗−テオフイ
リン ２．５μｌ／ｍｌ結果を下記の表
及び図面の第２図にグラフとして示す。

テオフイリン血清濃度の全範囲にわたる吸光度変化は、
わずか０．０５２であった。

このデータは、抗−グルコースオキシダーゼの不存在に
おいて現在最適なテオフイリン分析であることを示す。

■．抗−グルコースオキシダーゼの存在における分析 試薬： 混合物Ａ− アミノフエナゾン４ｍＭ及びグリセリン１０％を含む０
．１Ｍ燐酸塩緩衝液（ｐＨ７．０）にアポグルコースオ
キシダーゼ６００ｎＭ、グルコースオキシダーゼに対す
るウサギ抗血清１００μｌ／ｍｌ及び抗−テオフイリン
２０μｌ／ｍｌを加えた。

この混合物を室温で温置した。

混合物Ｂ− グルコース０．１０５Ｍ，ナトリウムＤＨＳＡ２．１１
ｍＭ，ウシ血清アルブミン１．０５％（ｗ／ｖ）及び西
洋わさびペルオキシダーゼ６３μｇ／ｍｌを含む０．１
０Ｍ燐酸塩緩衝液（ｐＨ７．０）にテオフイリン−ＦＡ
Ｄ１０．５ｎＭを加えた。

この混合物を３７℃で温置した。

テオフイリン標準品： 前記と同 分析操作： 混合物Ｂ（１．９０ｍｌ）を使い捨てキュベット中で希
釈したテオフイリン標準品２０μｌと混合した。

混合物Ａ（０．１０ｍｌ）を次に加え、反応混合物を倒
置によって混合した。

３７℃で５分温置した後、５２０ｎｍにおける吸光度を
混合物Ｂに対して読んだ。

主な試薬の最終分析濃度は下記のとおりであった： アポグルコースオキシダーゼ ０．０３ μＭテオ
フイリン−ＦＡＤ １０ ｎＭ抗−テオフイ
リン １．０μｌ／ｍｌ結果を下記の表及
び図面の第２図にグラフとして示す。

テオフィリン血清濃度の全範囲にわたる吸光度の変化は
、抗−グルコースオキシダーゼを使用しない最適な分析
（前記の■）に関する０．０５２に比べて０．３３３で
あった。

更に、抗−グルコースオキシダーゼが存在する場合、３
７℃での最適なテオフイリン分析は約５０倍少ないアポ
グルコースオキシダーゼ、６倍少ないテオフイリン−Ｆ
ＡＤ複合体及び２．５倍少ない抗−テオフイリンしか必
要としなかった。

これらのデータは、抗−グルコースオキシダーゼの存在
しない場合に比して、抗−グルコースオキシダーゼが存
在する場合に３７℃での最適な分析が著しく改良されて
いることを証明する。

アポグルコースオキシダーゼを活性化するため抗体フラ
グメントの使用 ■．抗−グルコースオキシダーゼＩｇＧの製造グルコー
スオキシダーゼに対するヤギ抗血清（３５ｍｌ）を１５
ｍＭ燐酸カリウム（ｐＨ８．０）２ｌに対して室温で１
６時間透析した。

透析した溶液を１５ｍＭ燐酸カリウム（ｐＨ８．０）で
平衡にしたＤＢ−５２セルロース〔英国のホワットマン
社（Ｗｈａｔｍａｎ Ｌｔｄ．）〕カラム（２．５×３
０ｃｍ）に加えた。

カラムを同じ緩衝液で５０ｍｌ時の流速で溶出し、フラ
クション１２ｍｌを集めた。

溶出液の吸光度を２８０ｎｍで検査した。

最初の吸光度ピークはフラクション１４〜２１で溶出さ
れ、これをプールし、「Ｆ■」とラベルを付した。

溶出緩衝液を５０ｍＭ燐酸カリウム（ｐＨ８．０）に変
え、第２の主吸光ピークをフラクション３９〜４４で集
め、これをプールし、「Ｆ■」とラベルを付した。

２つの吸光度ピークは、フラクションのアポグルコース
オキシダーゼ活性化能と良好に相関した。

■．抗−グルコースオキシダーゼＩｇＧのパパイン消化
（Ｆａｂフラグメント） Ｆ■からの蛋白質（５０ｍｌ）を、塩化ナトリウム０．
１５Ｍ， システイン２５ｍＭ，エチレンジアミン四
酢酸（ＥＤＴＡ）１ｍＭ及びパパイン１ｍｇを含む５０
ｍＭ燐酸ナトリウム（ｐＨ７．３）５ｍｌ中に混合した
。

この溶液を３７℃で６０分間温置した。

次に、固体ヨードアセトアミド（２８ｍｇ）を加えて、
パパインを不活性化するため３０ｍＭ溶液を加えた。

この溶液を更に１５分間温置し、その後アジ化ナトリウ
ム０．０２％（ｗ／ｖ）を含む５０ｍＭ燐酸ナトリウム
（ｐＨ７．０）で平衡にしたセファデツクスＧ１５０の
カラム（２５×９０ｃｍ）に加えた。

同じ緩衝液を用いて２５ｍｌ時間の流速で溶出すること
によりカラムを展開し、フラクション４．６ｍｌを集め
た。

２８０ｎｍにおける吸光度を検査したところ、フラクシ
ョン４７〜７２で溶出されるピークはＦａｂ及びＦｃフ
ラグメントを含むことが判り、フラクションのアポグル
コースオキシダーゼ活性化能と良好に相関した。

この物質をプールし、蛋白質７． ９ｍｇ／ｍｌに濃縮
し、「Ｆ■（ａ）」とラベルを付した。

完全なＩｇＧは溶出されず、ＩｇＧの完全な消化が起っ
たことを結論した。

Ｆ■からの蛋白質（５０ｍｇ）を上記のように消化した
。

セファデツクスＧ１５０上でクロマトグラフイーを上記
のように実施した。

２８０ｎｍにおける吸光度のピークを溶出し、フラクシ
ョン３４〜５０の間のピークはＩｇＧと同定され、フラ
クション５６〜７５の間の第二ピークはＦａｂ及びＦｃ
フラグメントの混合物を含むことが判った。

両方の吸光ピークはフラクションのアポグルコースオキ
シダーゼ活性化能と良好に相関する。

第一ピークをプールし、１６．８ｍｇ／ｍｌに濃縮し、
「Ｆ■（ａ）」とラベルを付した。

第二ピークをプールし、６．２ｍｇ／ｍｌに濃縮し、「
Ｆ■（ｂ）」とラベルを付した。

■．Ｆａｂフラグメントによるアポグルコースオキシダ
ーゼの活性化 Ａ．試薬 アミノフエナゾン８ｍＭ及びグリセリン １０％を含む０．１Ｍ燐酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．
０）中でアポグルコースオキシダーゼ（３．２μＭ）を
製造した。

グルコースオキシダーゼ分析試薬は０．１０Ｍ燐酸ナト
リウム緩衝液（ｐＨ７．０），０．１０５Ｍのグルコー
ス、２．１１ｍＭのナトリウムＤＨＳＡ，１．０５％（
ｗ／ｖ）ウシ血清アルブミン、６３ μｇ／ｍｌのペルオキシダーゼ及び１．０ｍＭのテオフ
イリン−ＦＡＤを含んでいた。

Ｂ．分析 抗体または抗体フラグメントを含む０．１０Ｍ燐酸ナト
リウム緩衝液（ｐＨ７．０）の既知量（０．２０ｍｌ）
を、使い捨てキュベット中で０．０３ｍｌのアポグルコ
ースオキシダーゼ試薬と混合し、室温で１５分間温置し
た。

グルコースオキシダーゼ試薬（１．９０ｍｌ）を３７℃
で平衡にし、キュベットに加えた。

分析溶液を３７℃で１５分間温置し、基準としてのグル
コースオキシダーゼ試薬溶液に対して ５２０ｎｍで吸光度を読んだ。

記録された吸光度をブランク試験（テオフイリン−ＦＡ
Ｄを含まない分析溶液）に対して補正した。

結果は下記のとおりであった。

これらのデータは、抗−グルコースオキシダーゼ抗体の
フラグメント（Ｆａｂ）がアポグルコースオキシダーゼ
の活性化に有効であることを証明する。

【図面の簡単な説明】

第１図は抗−グルコースオキシダーゼの存在及び不存在
におけるＦＡＤ／アポグルコースオキシダーゼ再結合反
応に対する温度の影響を示す実施例のデータのグラフ、
第２図は抗−グルコースオキシダーゼを用いる場合及び
用いない場合の３７℃でのテオフイリン分析に関する最
適標準曲線を示す実施例のデータのグラフである。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １ フラビンアデニンジヌクレオチド及びその誘導体と
   結合して活性グルコースオキシダーゼを形成するアポグ
   ルコースオキシダーゼの能力を増大するため、アポグル
   コースオキシダーゼをグルコースオキシダーゼに対する
   特異的結合親和性を有する、免疫学的に誘導された結合
   物質と反応させる工程から成ることを特徴とするアポグ
   ルコースオキシダーゼの、フラビンアデニンジヌクレオ
   チド及びその誘導体と結合する能力を増大する方法。 ２ 前記結合物質がグルコースオキシダーゼに対する抗
   体またはそのフラグメントである特許請求の範囲第１項
   記載の方法。 ３ 前記抗体がＩｇＧ類のものである特許請求の範囲第
   ２項記載の方法。 ４ 前記結合物質が前記抗体のＦａｂ，Ｆ（ａｂ’）ま
   たはＦ（ａｂ′）２フラグメントである特許請求の範囲
   第３項記載の方法。 ５ アポグルコースオキシダーゼとグルコースオキシダ
   ーゼに対する特異的結合親和性を有する、免疫学的に誘
   導された結合物質との複合体。 ６ 前記結合物質がグルコースオキシダーゼに対する抗
   体またはそのフラグメントである特許請求の範囲第５項
   記載の複合体。 ７ 前記抗体がＩｇＧ類のものである特許請求の範囲第
   ６項記載の複合体。 ８ 前記結合物質が前記抗体のＦａｂ，Ｆ（ａｂ’）ま
   たはＦ（ａｂ’）２フラグメントである特許請求の範囲
   第７項記載の複合体。 ９ フラビンアデニンジヌクレオチドを標識として使用
   し、これをアポグルコースオキシダーゼと結合して活性
   グルコースオキシダーゼを形成する能力によって検査す
   ることにより液体媒体中のリガンドを測定する均一系特
   異的結合分析法において、 前記アポグルコースオキシダーゼをグルコースオキシダ
   ーゼに対する特異的結合親和性を有する、免疫学的に誘
   導された結合物質と反応させることを特徴とする均一系
   特異的結合分析法。 １０ 前記結合物質がグルコースオキシダーゼに対する
   抗体またはそのフラグメントである特許請求の範囲第９
   項記載の分析法。 １１ 前記抗体がＩｇＧ類のものである特許請求の範囲
   第１０項記載の分析法。 １２ 前記結合物質が前記抗体のＦａｂ，Ｆ（ａｂ’）
   またはＦ（ａｂ’）２フラグメントである特許請求の範
   囲第１１項記載の分析法。 １３液体媒体を、 （ａ） リガンドまたはその結合類縁体に結合したフ
   ラビンアデニンジヌクレオチドを標識として含む標識複
   合体、 （ｂ） 前記リガンドに対する抗体、及び（ｃ）
   アポグルコースオキシダーゼ を含む試薬と混合することにより反応混合物を作り、こ
   の反応混合物中のグルコースオキシダーゼ活性を測定す
   ることにより液体媒体中のリガンドを測定する均一系免
   疫分析法において、 前記反応混合物にグルコースオキシダーゼに対する特異
   的結合親和性を有する、免疫学的に誘導された結合物質
   を添加することを特徴とする均一系免疫分析法。 １４ 前記結合物質がグルコースオキシダーゼに対する
   抗体またはそのフラグメントである特許請求の範囲第１
   ３項記載の分析法。 １５ 前記抗体がＩｇＧ類のものである特許請求の範囲
   第１４項記載の分析法。 １６ 前記結合物質が前記抗体のＦａｂ，Ｆ（ａｂ´）
   ，またはＦ（ａｂ’）２フラグメントである特許請求の
   範囲第１５項記載の分析２法。 １７ 前記結合物質が前記アポグルコースオキシダーゼ
   との免疫複合体の形で前記反応混合物に添加されている
   特許請求の範囲第１３項〜第１６項のいずれか１項に記
   載の分析法。 １８前記反応混合物を約３０℃〜約４０℃の温度で保持
   する特許請求の範囲第１７項記載の分析法。 １９ 前記温度を約３７℃に保持する特許請求の範囲第
   １８項記載の分析法。 ２０ 均一系特異的結合分析法により液体媒体中のリガ
   ンドを測定するための、（ａ）標識がフラビンアデニン
   ジヌクレオチドである標識複合体及び（ｂ）アポグルコ
   ースオキシダーゼを含む試薬において、前記試薬が、グ
   ルコースオキシダーゼに対する特異的結合親和性を有す
   る、免疫学的に誘導された結合物質を含むことを特徴と
   する試薬。 ２１ 前記結合物質がグルコースオキシダーゼに対す
   る抗体またはそのフラグメントである特許請求の範囲第
   ２０項記載の試薬。 ２２ 前記抗体がＩｇＧ類のものである特許請求の範囲
   第２１項記載の試薬。 ２３ 前記結合物質が前記抗体のＦａｂ，Ｆ（ａｂ’）
   またはＦ（ａｂ′）２フラグメントである特許請求の範
   囲第２２項記載の試薬。 ２４ 前記結合物質が前記アポグルコースオキシダーゼ
   との免疫複合体の形で前記反応混合物に添加されている
   特許請求の範囲第２０項〜第２３項のいずれか１項に記
   載の試薬。 ２５（１）リガンドまたはその結合類縁体に結合したフ
   ラビンアデニンジヌクレオチドを標識として含む標識複
   合体、 （２）前記リガンドの特異的結合対手、 （３）アポグルコースオキシダーゼ、及び（４）グルコ
   ースオキシダーゼに対する特異的結合親和性を有する免
   疫学的に誘導された結合物質を含むことを特徴とする液
   体媒体中のリガンドを測定する試験キット。 ２６ 前記結合物質がグルコースオキシダーゼに対する
   抗体またはそのフラグメントである特許請求の範囲第２
   ５項記載の試験キット。 ２７ 前記抗体がＩｇＧ類のものである特許請求の範囲
   第２６項記載の試験キット。 ２８ 前記結合物質が前記抗体のＦａｂ，Ｆ（ａｂ’）
   またはＦ（ａｂ’）２フラグメントである特許請求の範
   囲第２７項記載の試験キット。 ２９ 前記結合物質が前記アポグルコースオキシダーゼ
   との免疫複合体の形で前記反応混合物に添加されている
   特許請求の範囲第２５項〜第２８項のいずれか１項に記
   載の試験キット ３０前記リガンドの前記特異的結合対手が前記リガンド
   に対する抗体である特許請求の範囲第２５項記載の試験
   キット ３１ 前記リガンドがハプテンである特許請求の範囲第
   ３０項記載の試験キット。 ３２ （１） 前記リガンドの特異的結合対手に結合し
   たフラビンアデニンジヌクレオチドを標識として含む標
   識複合体、 （２）アポグルコースオキシダーゼ、及び（３）グルコ
   ースオキシダーゼに対する特異的結合親和性を有する、
   免疫学的に誘導された結合物質 を含むことを特徴とする液体媒体中のリガンドを測定す
   る試験キット。 ３３ 前記結合物質がグルコースオキシダーゼに対する
   抗体またはそのフラグメントである特許請求の範囲第３
   ２項記載の試験キット。 ３４ 前記抗体がＩｇＧ類のものである特許請求の範囲
   第３３項記載の試験キット。 ３５ 前記結合物質が前記抗体のＦａｂ，Ｆ（ａｂ’）
   またはＦ（ａｂ′）２フラグメントである特許請求の範
   囲第３４項記載の試験キット。 ３６ 前記結合物質が前記アポグルコースオキシダーゼ
   との免疫複合体の形で前記反応混合物に添加されている
   特許請求の範囲第３２項〜第３５項のいずれか１項に記
   載の試験キット ３７ 前記リガンドが抗体であり、前記結合対手がハプ
   テンまたはハプテンに結合された抗原である特許請求の
   範囲第３２項記載の試験キット。