JPS583673B2 - 酵素または微生物菌体を固定化する方法 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は光増感剤を含む光重合可能な水溶性または非水
溶性のエチレン性不飽和樹脂と酵素または微生物菌体の
水懸濁液とを均一に混合して目的とする形状に困定し，
そこへ２５００〜６０００Åの活性光線を冷却した状態
で照射してエチレン性不飽和樹脂を重合させるか．ある
いは．光増感剤を含む光重合可能な前記エチレン性不飽
和樹脂と酵素または微生物菌体の水懸濁液を均一に混合
したのち，脱水して目的とする形状に固定し．そこへ２
５００〜６０００Åの活性光線を冷起した状態で照射し
て重合させる方法に関すする。

酵素は、生物，植物を採取源としており．微生物菌体は
生物そのものであるので，例外的には耐熱性酵素といわ
れるように７０〜８０℃位まで活性を維持できるもので
あるが，一般に熱に対する安定性に乏しい。

従って酵素または微生物菌体の固定化は酵素の安定性が
十分保たれるように温和な条件でおこなうことがての活
性保持に必要であり，熱安定性については特に注意する
必要がある。

光増感剤を含む光硬化性樹脂と酵素または微生物菌体と
の水懸濁液に２５００〜６０００Åの活性光線を照射し
て酵素または微生物菌体を固定化するとき温度上昇がみ
られるため、温度上昇により酵素活性のそこなわれやす
い酵素または微生物菌体の固定化には問題がある。

これまでから親水性低分子モノマー、すなわち，アクリ
ルアミド，ヒドロキシエチルメタクリレート、ヒドロキ
シエチルアクリレートなどと酵素または微生物菌体の水
懸濁液を均一に混合して，冷却した状態でそのまま重合
させて酵素または微生物菌体を固定化するという従来の
包括法では，重合反応速度が遅く，反応率も低いため酵
素などの溶離や脱離が著しいと同時に固定化物の加工性
が劣るという欠点を有している。

また，未反応の低分子モノマーが残存するため食品工業
、医薬品工業に利用するには毒性の問題が懸念される。

本発明の方法はこれらの欠点を改良すべく研究した結果
完成したものである。

すなわち、光増感剤を包む非水溶性または水溶性の光硬
化性エチレン性不飽和樹脂と酵素または微生物菌体の水
懸濁液との混合溶液をあらかじめ冷却して活性光線を照
射するか，あるいは、冷却しながら活性光線を照射して
酵素または微生物菌体を固定化する方法である。

本発明では低分子の親水性モノマーを重合初期物質とし
ないで、あらかじめ高分子化された光増感剤を含む光硬
化性樹脂を重合初期物質とするため，冷却した状態で酵
素または微生物菌体を固定化すると酵素などの溶離や脱
離が小さく，しかも固定化物の加工性も劣らない。

さらに未反応の光硬化性樹脂が溶離しにくいため毒性が
少ない状態で酵素または微生物菌体の活性保持率を高く
して固定化できる利点がある。

従って、従来よりも広範囲の酵素または微生物菌体を固
定化することが可能となった。

冷却する方法としては．光増感剤を含んだ光硬化性不飽
和樹脂と酵素または微生物菌体との水懸濁液を．冷却媒
体を通した壁面とを接触させたり光増感剤を含む光硬化
性不飽和樹脂と酵素または微生物菌体との水懸濁液に冷
却したガス媒体を吹きつけるなどして冷却する方法や，
ペルチェ効果を利用して電子冷却した表面と光増感剤を
含む光硬化性不飽和樹脂と酵素または微生物菌体との水
懸濁液とを接触させて冷却する方法などがある。

これらの冷媒および冷却操作装置は特に制限を受けるも
のではなく通常の方法が採用できる。

また本発明における冷却温度は約１０℃以下であればよ
く、その下限は光硬化性不飽和樹脂の反応性からみて約
−１００℃程度が適当である。

冷却する時期は，活性光線を照射する前の光増感剤を含
む光硬化性不飽和樹脂と酵素または微生物菌体との水懸
濁液をあらかじめ冷却したのち，この水懸濁液に活性光
線を照射して固定化してもよいし、または光増感剤を含
む光硬化性樹脂と酵素または微生物菌体との水懸濁液を
．冷却しながら活性光線を照射して固定化してもよい。

冷却しながら活性光線を照射して酵素または微生物菌体
を固定化する場合は．光増感剤を含む光硬化性樹脂と酵
素または微生物菌体の水懸濁液に活性光線を照射するの
を妨げないように冷却することが必要で，冷却装置は必
ずしも透光性を有する必要はない。

たとえばこの水懸濁液を充填する容器の，活性光線を照
射する部分（壁）を光透過性にしておき、他の部分から
冷却する。

本方法で用いる光硬化性樹脂と酵素または微生物菌体の
水懸濁液との混合溶液には光重合反応を促進する目的で
公知の光増感剤．例えば、ベンゾイン、アセトインなど
のα−カルボニルアルコール類、ベンゾインメチルエー
テル，ベンゾインエチルエーテル，ベンゾインプロピル
エーテル、アニソインエチルエーテル、ピバロインエチ
ルエーテルなどのアシロインエーテル類、ナフトール、
ヒドロキシアントラセンなどの多環芳香族化合物類，メ
チルベンゾイン、α−メトキシベンゾインなどのα−置
換アシロイン類．２−シアノ−２−ブチルアゾホルムア
ミドなどのアゾアミド化合物類、硝酸ラウニル、塩化第
２鉄などの金属類、メルカプタン類，ジスルフイド類．
ハロゲン化合物類、染料類を加えることができる。

また，照射に用いる活性光線の光源としては，波長、２
５０〜６００ｍμの光を発するものであればいずれでも
使用可能で，たとえば，低圧水銀灯，高圧水銀灯、けい
光灯，キセノンランプ，カーボンアークランプ、太陽光
などが用いられる。

照射時間は通常１〜１０分間の範囲である。

不活性ガス中で照射を行なうことは照射時間の短縮のた
めに有効である。

本発明における光硬化性不飽和樹脂は水溶性または非水
溶性であり、その樹脂骨格中または樹脂粒子（非水溶性
樹脂）の表面に少なくとも光重合性不飽和結合を有する
ものである。

かかる樹脂としては，例えば光重合性不飽和結合を導入
した不飽和ポリエステル，不飽和アクリル樹脂、不飽和
エポキシ樹脂，不飽和アクリル−ウレタン樹脂、不飽和
ポリエステル−ウレタン樹脂、不飽和ウレタン樹脂など
がある。

これらの樹脂を水溶化する場合または非水溶性樹脂の水
分散安定性を付与する場合はこれらの樹脂中に親水基を
導入すればよい。

また樹脂粒子の大きさは１ｍμ〜１μの範囲が好ましい
。

固定化せしめる好適な酵素の例としてはウレアーゼ，グ
ルコースオキシターゼ、グルコアミラーゼ、グルコース
イソメラーゼ，グルコース−６−リン酸デヒドロゲナー
ゼ、カタラーゼ、インベルターゼ，グルコースオキシタ
ーゼ−カタラーゼ、ラクターゼ、Ｄ−アミノ酸オキシタ
ーゼ、α−ガラクトシダーゼ，アミノアシラーゼ、アス
パルターゼ，ペニシリンアシターゼ、ペニシリナーゼな
どがあり、微生物菌体の例としてはラクトバチルス・ブ
ルガリクス，アエロバクターアエロケネス，バチルスズ
ブチリス，アゾトバクタービネランデイ、プロテウス、
ブルガリス，クロエツケラン等の酵母などをあげること
ができる。

実施例 １ ＮＫエステル２３Ｇ（分子量１０００のポリエチレング
リコールのジメタクリレート、新中村化学工業製）９０
部，ｐＨ６の０．１Ｍ酢酸緩衝液にとかした０．１％イ
ンベルターゼ水溶液１０ 部、ベンゾインエチルエーテ
ル１部を均一に混合した。

水平に配置された厚さ０．１ｍｍのポリエステルシ一ト
上に厚さ１ｍｍのスペーサーで内径５ｃｍ×５ｃｍの正
方形を作って，上記混合液を流し込み、その上に厚さ０
．１ｍｍのポリエステルフイルムを密着させた。

これにサーミスタ温度計を挿入してから、２ｋＷの高圧
水銀灯をポリエステルフイルム上面から３分間照射して
、その温度変化を測定した。

水平に配置された厚さ０．１ｍｍのポリエステルシ一ト
の下側へ電子冷熱を利用した冷却板を敷いてから，同様
に活性光線を照射してその温度変化を測定した。

その結果を表１に示す。実施例 ２ キシリレンジイソシアネート、１モルと分子量約１５０
０のポリエチレングリコール，７５０ｇ、２−ヒドロキ
シエチルメタクリレート、１．１モルからなる光硬化性
樹脂（数平均分子量２１６０）８５部とｐＨ８．５の１
５ｍＭトリス−塩酸緩衝液にとかした０．１１％グルコ
ース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ（酵母より抽出）水
溶液１５部，ベンゾインメチルエーテル１部を均一に混
合した混合溶液を液体窒素から発生する窒素蒸気を用い
て５℃に冷却しながら低圧水銀灯を用いて３分間光照射
をおこない、固定化酵素膜を得た。

得られた固定化酵素膜を用いて、グルコース−６−リン
酸を基質として微量のＭｇＣｌ２の存在下でニコチンア
ミド−アデニンジヌクレオチドリン酸（ＮＡＤＰ）の還
元３４０ｍμ吸光度の増加により測定し、酵素活性の存
在を確認した。

また、冷却をおこなわないで同様にしてグルコース−６
リン酸デヒドロゲナーゼを固定化した場合には酵素活性
は認められなかった。

実施例 ３ エピコート１００１樹脂（シェルケミカル社製、商品名
）１モルにアジピン酸１．５モルを反応させ，次いで無
水コハク酸４．５モルでエステル化後，グリシジルメタ
クリレート２．７５モルを反応させて生成した酸価７５
の光硬化性樹脂（数平均分子量４１００）８５部、０．
２％ＮａＯＨ溶液５部とｐＨ７．２の０．１Ｍリン酸緩
衝液に懸濁させたクロエツケラ種酵母１０部を均一に混
合し，水平に配置された厚さ０．１ｍｍのポリプロピレ
ンシ一ト上に厚さ１ｍｍのスペーサーで内枠５ｃｍ×５
ｃｍの正方形を作って、上記混合液を流し込み、その上
に厚さ０．２ｍｍのポリエステルフイルムを密着させ，
フイルム上面から低圧水銀灯で５分間照射して透明な膜
状固定化酵母を得た。

同様な混合液をクールニクスで１０℃にした冷却水を通
して温度冷却している冷却板上で同様に酵母を固定し．
その固定化酵母のカタラーゼ活性を２４０ｎｍのＨ２Ｏ
２の吸光度の増大より測定した結果，冷却しながら固定
した酵母のカタラーゼ活性は冷却しない場合の１．５倍
の活性を示した。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １ 冷却された状態にある光増感剤を含んだ光硬化性樹
   脂と酵素または微生物菌体との水性懸濁液に活性光線を
   照射して酵素または微生物菌体を固定化する方法。 ２ 冷却された状態が、約１０〜−１００℃である特許
   請求の範囲第１項記載の酵素または微生物菌体を固定化
   する方法。 ３ 光増感剤が，α−カルボニルアルコール類，アシロ
   インエーテル類、多環芳香族化合物類、α−置換アシロ
   イン類．アゾアミド化合物類，金属類，メルカプタン類
   ，ジスフイド類，ハロゲン化物類，染料などである特許
   請求の範囲第１項記載の酵素または微生物を固定化する
   方法。 ４ 光硬化性樹脂が，水溶性または非水溶性であり、そ
   の樹脂骨格中または樹脂粒子表面に少なくとも２個のエ
   チレン性不飽和結合を有するものである特許請求の範囲
   第１項記載の酵素または微生物菌体を固定化する方法。 ５ 酵素が，たとえばウレアーゼ．グルコースオキシタ
   ーゼ、グルコアミラーゼ．グルコースイソメラーゼ、グ
   ルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ．カタラーゼ，
   インベルターゼ、グルコースオキシターゼ−カタラーゼ
   ，ラクターゼ、Ｄ−アミノ酸オキシターゼ，α−ガラク
   トシダーゼ．アミノアシラーゼ，アスパルターゼ，ペニ
   シリンアシダーゼ，ペニシリナーゼなどである特許請求
   の範囲第１項記載の酵素または微生物菌体を固定化する
   方法。 ６ 微生物菌体が、たとえばラクトバチルス・プルガリ
   クス、アエロバクターアエロゲネス，バチルスズブチリ
   ス．アゾトバクタービネランデイ，プロテウス・ブリガ
   リス，クロエツケラ等の酵母などである特許請求の範囲
   第１項記載の酵素または微生物菌体を固定化する方法。