JPS584557B2 - 乳酸またはラクテ−ト分析用組成物 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は乳酸又はラクテートの定着分析用組成物及び定
量分析法に関し、詳しくはラクテートオキシダーゼーＨ
２０検出機構に基づく乳酸又はラクテートの定着分析に
関する。

血液中の乳酸量は一般に血液循環が正常に行われている
かどうかの指標となりそしてそれはラクテート量の増大
がみられる循環器系の障害の程度のすぐれた指標である
。

それは重症患者の予後に関する一般的な基準を得る為の
一つのすぐれた研究室測定である。

正常人間におけるラクテート及びピルベートの量も、グ
ルコースを投与するか又はインシュリンを注射するに従
って急速に増大する。

この増大は真性糖尿病患者では遅れるか又は見られない
。

それ故ラクテート及びグルコース濃度を測定することに
より、膵性糖尿病と低下したグルコース耐容性を示すそ
の他の障害とを区別しえるであろう。

通常乳酸はラクテートデヒドロゲナーゼ（ＬＤＨ）反応
により酵素的に定着する。

これはヌクレオチド関連法であり、還元ニコチンアミド
アデニンジヌクレオチド（ＮＡＤＨ）生成を紫外吸収又
はけい光のいずれかにより測定する。

しかしながら反応の平衡は乳酸生成の方向であるが乳酸
を利用するものではない。

ラクテートのピルベートへの酸化（ＮＡＤＨ 生成を伴
う）はカルボニルトラツピング剤の存在下において８．
０より高いｐＨ値の時のみ有利に展開する。

これらのことは当然、紫外吸収測定又はけい光測定を行
う際の一般的な諸問題及びラクテートデヒドロゲナーゼ
とヌクレオチド共通因子との安定性に関する一般的な諸
問題に加えてこの方法を実施する場合の障害となる。

ＬＤＨを用いた乳酸分析のさまざまな方法が「酵素的方
法（ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｏｆ ＥｎｚｙｍａｔｉｃＡｎ
ａｌｙｓｉｓ ）第二英語版、Ｈ． Ｕ． Ｂｅｒｇｍ
ｅｇｅｒ発行、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ社、ニュ
ーヨーク及びロンドン（１９７０）ｊの第１４７２、１
４７５、１４８３及び１４９２ページからはじまる文献
に記載されている。

第１４８３ページには、イーストラクテートテヒドロゲ
ナーゼとカリウムへキサシアノフエレート（ｍ）とを用
いることによる血清のラクテート測定の為のＷｉｅｌａ
ｎｄ等による比色法が記載されている。

アスコンビン酸、グルタチオン、システイン及びＮＡＤ
Ｈ （すべてヘキサシアノフエレートを還元するもの
である）による妨害が見られる。

Ｇａｗｅｈｎ等によるＮＡＤ＋及びＬＤＨを用いた乳酸
の測定が第１４９２頁に、そしてＮｏ１による方法が第
１４７５頁に記載されている。

ＭＡＤ＋のかわりに３−アセチルピリジン−アテニンジ
ヌクレオチド（ＡＰＡＤ）を用いたＭａｕｒｅｒ等によ
る乳酸測定法が第１４７２頁に記載されている。

この方法では試薬は新調せねばならず測定はＵＶ範囲の
スペクトルで行う。

すべての前記方法には更に血清試料の脱蛋白を行はねば
ならないという次点がある。

乳酸測定用の公知のＬＤＨ参照方法の欠点がｒ Ｃｌｉ
ｎｉｃａｌ ＣｈｅｍｉｓｔｒｙＹｏｕｎｇ 等著、
第１８巻、第１０４１頁、１９７２年」に一般的に記載
されている。

種々なラクテートオキシダーゼが報告されている。

しかしながら一般に、報告されたラクテートオキシダー
ゼは過酸化水素生成反応な触媒しない。

前記ラクテートオキシダーゼは「Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ
Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ − Ｓｕ
ｔｔｏｎ著、第２２６巻、第３９５頁、１９５７年」及
び「Ｊｏｕｒｎａｌｏｆ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ、
Ｌｏｎｄｏｎ著、第９：５巻、Ｎｏ４、第１３８０頁、
１９６８・年」に報告ざれている。

［酵素ハンドブック第１巻、Ｔｈｏｍａｓ：Ｅ．Ｂａｒ
ｍａｎ著、Ｓｐｒｉｎｇｅｒ − Ｖａｒｌａｇ ニュ
ーヨーク社、１９６９年」には、過酸化水素を生成する
Ｌ−ラクテートの酸化を触媒すると言われているミコバ
クテリウムフレエイ（ Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｐ
ｈｌｅｉ ）から採取されるラクテートオキシダーゼが
記載されている。

Ｂａｒｍａｎにより引用された文献をしらべたとどろ、
過酸化水素の生成を示す反応式は誤りであり、過酸化水
素のかわりに水の生成が示されねばならぬことが分った
。

我々の知識によれば、ラクテートをピルビン酸塩と過酸
化水素とに転化すると言われているラクテートオキシダ
ーゼは「Ｊ ｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａ
ｌＣｈｅｍｉｓｔｒｙ、第２３７巻、Ａ３、第１９４０
頁、１９６２年」及び「テトラヒメナピリホルミスにお
ける呼吸酵素研究（ Ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ Ｅｎｚ
ｙｍｅＳ ｔｕｄｉｅｓ ｉｎ Ｔｅｔａｈｙｍｅｎａ
ｐｙｒｉｆｏｒｍｉｓ ）、Ｅｉｃｈｅｌ等発行」に
のみ報告されている。

テトラヒメナピリホルミスから得られたラクテートオキ
シダーゼ調製物にカタラーゼ活性があると報告されてい
るので、特に過酸化水素検出に基づく分析にそれを用い
ることは不適切であろう。

（カタラーゼは過酸化水素を分解するのでそれは誤差の
替在源となる）。

テトラヒメナから得られたラクテートオキシダーゼのそ
の他の欠点には、その部分的溶解性（４ないし５７％の
酸素だけが可溶性であると報告された）、低安定性（２
℃で２４時間透析するか又は貯蔵の後４３ないし６０％
の活性が失われると報告された）、比較的低い比活性（
Ｑ２（Ｎ）＝１６２に基づいて約ラクテート０．０２マ
イクロモル／分／蛋白質ｍｇの比活性が測定された。

）等がある。本発明は乳酸又はラクテートを測定する為
の別の方法をとり、そしてラクテートオキンダーゼを用
いたそのような測定用の組成物及び方法を提供する。

本発明に従って乳酸又はラクテートを含有している流体
試料はラクテートオキシダーゼ及び酸素の存在下で反応
してピルベート及び過酸化水素を生成する。

次いで過酸化水素を検出し試料中に存在する乳酸又はラ
クテートの量を測定する。

本発明の好ましい態様では、パーオキンダーゼの存在下
で色原体を酸化することにより過酸化水素を検出する。

本発明に用いるラクテートオキシダーゼ調製物は実質的
にカタラーゼがない。

この明細書では「実質的にカタラーゼがない」という表
現により、検出可能なカタラーゼが存在しないが又はカ
タラーゼが存在していたとしても極く微量であり分析の
精度及び再現性に影響しないことが意味される。

ラクテートをピルベートと過酸化水素とへ転化しうる好
ましいラクテートオキンダーゼは、ストレプトコツカス
フアエカリス（ Ｓｔｒｅｐｔｃｏｃｃｕｓｆａｅｃａ
ｌｉｓ ） ＡＴＣＣ １ ２ ７ ５ ５により製造
されることが見い出された。

このＳ．ファエカリスからのラクテートオキシダーゼは
Ｌ−ラクテートに対し非常に特異的であり、ラクテート
オキンダーゼのラクテートに対するＫｍ（ミハエリス定
数）は約０．２ｍＭである。

このラクテートオキンダーゼも可溶性であり、カタラー
ゼがなく、テトラヒメナから得られたラクテートオキン
ダーゼに比べて非常に安定でありそして１分間に蛋白質
１ｍｇ当り約０．１マイクロモル以上のラクテートを消
失（又は変化）させるような比活性を有する。

Ｓ．ファエカリスからのラクテートオキンダーゼは透析
及び（ＮＨ４）２８０４分画に対し安定でありそして−
２０℃で貯蔵した時３ケ月以上安定であることが分った
。

また本発明のラクテートオキンダーゼは乳酸のピルビン
酸への酸化を触媒し、同時に過酸化水素を生成する。

分子状酸素は電子受容体として作用する。

硫酸プロタミン及び硫酸アンモニウム分別操作によって
部分的に精製されたラクテートオキシダーゼは広いｐＨ
範囲（最適ｐＨ６．２５〜７．５）にわたって活性であ
ったが、３４℃を超える温度において急速に失活した。

Ｌ（＋）乳酸は基質として用いられる唯一の化合物であ
った（Ｋｍ＝０．２９ｍＭ）。

一方低級同族体であるグリコール酸はラクテートオキシ
ダーゼの有力な競争阻害剤（ Ｋｉ＝０．０２５ｍＭ）
であった。

Ｄ（−）ラクテート及びＤＬ−α−ヒドロキシブチレー
トのようなし（＋）乳酸に構造的に関連したいくつかの
他の化合物は基質又は阻害剤のいずれとしても完全に不
活性であった。

ラクテートオキシダーゼを含む本発明組成物を用い未知
量の乳酸又はラクテートを含む試料を分析する時、試料
中の乳酸又はラクテートの量に比例して過酸化水素が生
成する。

過酸化水素を公知方法により検出しそして既知量の乳酸
又はラクテートを含む試料の分析により得られた標準曲
線を用いて、未知量の乳酸又はラクテートを測定する。

本発明記載のような分析において過酸化水素を検出及び
／又（ま定量する公知方法では一般に、過酸化作用のあ
る物質（たとえばパーオキシダーゼ及びパーオキイダー
ゼの様な物質）、及び過酸化水素と過酸化作用を備えた
物質との存在下で検出可能な変化（一般に可視変化）を
引きおこす物質を含む組成物が使用される。

そのような組成物に関する先行技術の完全なリストをこ
こで示すには余りにも数が多すぎるがそのような物質に
関する代表的な特許には、米国特許第２９１２３０９号
、同第２９８１６０６号、同第３３４９００６号、同第
３０９２４６５号、同第３５５８４３５号、同第３５９
５７５５号、同第３６２７６９７号、同第３６２７６９
８号、同第３６３０８４７号、同第３６５４１７９号、
同第３６５４１８０号及び同第３８５３４７０号がある
。

先行技術で提唱されている、過酸化水素の存在下で検出
可能な変化を生成する物質には次の物質がある（必要な
場合には発色剤を一緒に用いる）。

（１）アニリン及びその誘導体、オルトートルイジン、
パラートルイジン等のようなモノアミン。

（２）オルトーフエニレンジアミン、Ｎ−Ｎ’−ジメチ
ルーパラーフエニレンジアミン、Ｎ−Ｎ′−ジエチルフ
エニレンジアミン、ベンジン、ジアニシジン等のような
ジアミン。

（３）フェノールそれ自体並びにチモール、オルトー、
メター及びパラークレゾール、α−ナフトール、β−ナ
フトール等のようなフェノール。

（４）カテコール、グアヤコール、オキシノール、ピロ
ガロール、ｐ’ｐ−ジヒドロキシジフエニル及びフロロ
グルシノールのようなポリフェノール。

（５）サリチル酸、ピロカテコール酸及び没食子酸のよ
うな芳香族酸 （６）ロイコマラカイトグリーン及びロイコフェノール
フタレインのようなロイコ染料（アルカリ性媒質中で用
いるのが望ましい） （７）２・６−ジクロロフェノール、インドフェノール
のような着色染料 （８）エピネフリン、フラボン、チロシン、ジヒドロキ
シフエニルアラニン及びトリプトファンのような種々な
生物学的物質 （９）グアイヤクゴム、グアイヤコン酸、沃化カリウム
、沃化ナトリウム及びその他の水溶性沃化物、ビリルビ
ン並びに （１０）２・２’−アジン−ジ（３−エチルベンゾチア
ゾリンー（６）一スルホン酸及び３・３′−ジアミノベ
ンジゾンのような特別な染料 パーオキシダーゼは、過酸化水素により別の物質が酸化
される反応を触媒する酵素である。

バーオキンダーゼは一般に鉄ポルフイリンを含む複合蛋
白質である。

パーオキシダーゼは、西洋わさび、じゃがいも、いちぢ
くの木の樹液及びかぶら（植物パーオキシダーゼ）；牛
乳（ラクトパーオキシダーゼ）；及び白血球（ベルドパ
ーオキシダーゼ）に存在し、また微生物中にも存在しそ
して発酵によって生産することもできる。

「 Ａｃｓａ ｃｈｅｍ， Ｓｅｃａｎｄ第４巻、第４
２２〜４３４頁、１９５０年、Ｔｈｅｏｒｅｌｌ及びＭ
ａｅｈｌｙ著」に開示されているようなある合成パーオ
キンダーゼもＨ２Ｏ２検出系に用いるに十分である。

へミン、メトヘモグロビン、オキシヘモグロビン、ヘモ
グロビン、ヘモグロモゲン、アルカリ性ヘマチン、ヘミ
ン誘導体及びその他の、過酸化作用又はパーオキシダー
ゼのごとき作用を示す化合物のような物質はかようなパ
ーオキンダーゼに劣る。

酵素ではないが過酸化作用を示すその他の物質には、チ
オシアン酸鉄、スズ酸鉄、フエロシアン酸第一鉄、シリ
カゲルに吸着させた第二クロム塩（たとえば硫酸クロム
カリウム）等がある。

本発明記載の乳酸及びラクテート検出用組成物及び方法
は従来の液体分析に有用である。

すべての試薬は乾燥又は凍結乾燥状態で入取できそして
使用直前に水で湿潤又は希釈して使用に供することは当
業者に自明である。

この型の組成物は明きらかに本発明の範囲内である。

当然、この明細書記載の分析組成物を業界周知の型の吸
収性材料のマトリックス中に、含浸又はその他の方法で
組み入れ、乳酸又はラクテートの定量又は半定量分析に
適する試験組成物を製造することが可能である。

典型的なそのような材料及び、乳酸又はラクテートの分
析に使用可能な、それでもって製造した要素はたとえば
以下の特許に記載されている。

米国特許第３０９２４６５号、同第３４１８０９９号、
同第３４１８０８３号、同第２８９３８４３号、同第２
８９３８４４号、同第２９１２３０９号、同第３００８
８７９号、同第３８０２８４２号、同第３７９８０６４
号、同第３２９８７３９号、同第３９１５６４７号、同
第３９１７４５３号、同第３９３３５９４号、同第３９
３６３５７号等。

更に本発明記載の組成物及び方法は、被検物（本明細書
で以下アナライトと呼ぶ）測定をＥ．Ｐ ， Ｐ ｒｚ
ｙｂｙｌｏｗｉｃｚ及びＡ， Ｇ， Ｍｉｌ ｌｉｋａ
ｎの米国特許第３９９２１５８号（１９７６年１１月１
６日公告）記載の型の多層要素で行う時特に有用である
。

この型の要素は一般に （１）拡散層 （２）使用条件下で拡散層と流体接触する試薬層、及び
（３）場合によっては支持体 から成る。

この型の要素には非繊維性拡散層を用いるのが好ま
しい。

本発明の実施に有用な多層要素には、レジストレーショ
ン（ ｒｅｇｉｓｔｒａｔｉｏｎ ）層（即ち拡散層及
び試薬層の下にある層）が含まれていてもよく、それに
は相互作用のある物質が含まれていてはならず、そして
それは被覆層中で生成する染料を受容する働きのみをし
ちる。

そのような層は一般に染料浸透性マトリツレスを含みそ
して所望により媒染剤、界面活性剤のようなその他のア
ジュバントを含む。

分析要素における層及びそれらの配置を強化するこれら
の物質についてはベルギー国％許８３１６６０号、１９
７６年１月２３日公告の液体分析用一体型要素（Ｐ．ク
レメント著）に更け詳しく記載されている。

この明細書に記載のレジストレーション層又は試薬用の
マトリックス材料の選択は当然可変であり、そしてそれ
は目的とする要素の使用方法並びに、以下に記載するよ
うに要素に組み入れる特別な相互作用のある物質に依存
する。

望ましいマトリックス材料には、ゼラチン、ゼラチン誘
導体、親水性セルロース誘導体、多糖類（たとえばデキ
亥トラン）、アラビアゴム、アガロース等のような天然
物質並びに水溶性ポリビニル化合物（たとえばポリ（ビ
ニルアルコール）及びポリ（ビニルピロリドン）、アク
リルアミド重合体等のような合成物質の双方を含む親水
性物質が含まれうる。

セルロースエステル樽のような親油性物質も有用であり
うる。

ある場合は物質の選択は特定要素の使用パラメーターと
なる。

多孔性でない場合には、試薬層の浸透性を強化する為に
分析下の液体の分散媒質又は溶謔中緩徐に膨潤しうるマ
トリックス材料を使用することが有用である場合が多い
。

支持体二一体型分析要素を自己支持性とすることが出来
るか又は拡散層、試薬層及び任意のその他の共働層を支
持体上に被覆することが出来る。

このように用いる有用な支持体材料には、紙、ポリオレ
フィン被覆紙並びに種々な重合体状物質がある。

かような重合体状物質にはたとえば酢酸セルロース、ポ
リ（エチレン、テレフタレート）、ポリカーボネート及
びポリスチレンのようなポリビニル化合物がある。

支持体は不透明であってもよいしまた当然検出様式に依
存して光又はその他のエネルギーを透過可能でもある。

用いる支持体はいずれの場合も目的とする検出様式と相
反さない。

好ましい支持体ｋは約２００ｎｍと約９００ｎｍの間の
範囲内の波長の電磁放射線を透過しうる透明な支持体物
質がある。

一つ又はそれ以上の狭い波長の範囲に亘って光透過性で
ありそして近傍の波長において光透過性でない支持体を
有することも望ましいであろう。

たとえば適切な吸収特性を有する一つ以上の着色剤を支
持体に含浸させるか又はそれで支持体を被覆することに
より前記のような支持体を得ることができる。

要素に支持体な含める時、試薬層を支持体と拡散層との
間にさしはさむ。

その他の層：一体型分析要素をスペクトロフォトメトリ
ー分析の反射技法による分析系に用いるに適合させるの
が好しい。

従ってこの分析要素には一般に反射層としての機能をは
だす層が含まれる。

この層：によって、比色又は他の指示反応の要素の支持
体側を通したスペクトロフオトメトリー測定用の適切な
背景が提供される。

反射層は、アナライトが試薬層又はレジストレーイヨン
層へ通過できるようになっておりそしてそれによりリフ
ラクションスペクトロフォトメトリー用の有効な背景が
提供されねばならない。

白色背景は一般にこの目的に好ましい。

試薬層又はレジストレーション層中で生成する指示薬用
の背景としての機能の観点から反射層を通常拡散層及び
試薬層又はレジストレーシヲン層の間におく。

：しかしながら試薬層とレジストレーション層との間に
あるのが適切な場合には格射層なそのように配置する。

反射性はたとえば拡散層としても働く層によっても付与
可能であるしまた、要素内でその他の機能を有さないそ
の他の層によっても付与することができる。

二酸化チタン及び硫酸バリウムのような顔料は反射性が
ありそして反射層に有利に用いることができる。

ブラッシュ重合体（ ｂｌｕｓｈ ｐｏｌｙｍｅｒ ）
も適切な反射埜料になすことができる。

もちろんのことである力不顔料拡散層も、拡散層でもあ
りえるブラツシュ重合体層がこの目的に有用であると同
様にこの目的に有用でありえる。

ある好ましい態様では、ブラッシュ重合体層に顔料をも
組み込み、拡散及び／又は反射を強化することができる
。

沢過層を要素に存在させてもよい。

そのような層の組成及び製造は業界周知である。

ろ過層が存在する場合それらは、指示反応ケ妨害又は別
のやり方で定量を妨害する成分を試料から除去する働き
をする。

従って全血液中の乳酸の分析に多量分析要素を使用する
際、ろ過層によって赤血球細胞が取り去られ、血清は下
層へ泳動する。

血清又は他の流体を分析する際、ろ過層は、最初の指示
反応を妨害又は混乱させうる不望の成分を除去する働き
をすることができる。

他に前記ブラッシュ重合体層もろ過層として機能を果し
うる。

この要素を全血液の分析に用いる場合、ろ過層の孔サイ
ズは０．５ないし５ミクロンであるのが望ましい。

重ね合せる拡散層、ろ過層及び反射層への試薬層り粘着
を増強する為に、そのような層間の粘着性を改善する働
きをする浸透性中間層を適用することが有用である場合
があることを見い出した。

中間層が、アナライトが試薬層に達しうる程に十分浸透
性であり、隣接層の試薬な妨害せずそして望ましく改善
された粘着性を提供する限り、中間層をほとんど任意の
物質から製造してよい。

そのような物質は当業者に周知である。

特に有用な結果を与えた中間層物質には、ポリ（ｎ−ビ
ニルー２−ピロリドン）、ポリ（ｎ−インプロビルアク
リルアミド）、コポリ（酢酸ビニル／ビニルネオデカノ
エート）（酢酸ビニル２０重量％）及びコポリ（ビニル
ネオデカノエート／ｎ−ビニル−２−ピロリドン）（ビ
ニルネオデカノエート１０ないし３０重量％）のような
重合体状フイルム形成性物質がある。

中間層は浸透性を保持せねばならないのでこれらの層は
必然的に非常に薄くそして一般に厚さは０．０２５ｍｍ
のオーダーの単層ないし各層から成る。

前記物質から成る重合体状中間層を用いる時、重合体の
密度、下塗り層の浸透性等のような性質に依介してそれ
らを一般に約９０ｍｇ／ｍ２ないし約１０００ｍｇ／ｍ
２の範囲の量で適用する。

たとえば電子衝撃等のような層間の粘着性を改善する表
面処理も望ましい場合がある。

要素製造二一体型分析要素製造の際、層を単独層として
予備形成し、その後積層するか又は要素使用時に流体接
触させるまで単独層として保持する。

単独部材として製造した層はその表面上を典型的には溶
液又は分散液で被覆しそして乾燥時にそれを物理的には
がすことができる。

しかしながら連続層が所望な場合何回ものはがし及び積
層工程の枢要性を回避しうる簡便方法は、裸表面又は支
持体上に最初の層を被覆し、所望ならその後これら前も
って形成した被覆上へ直接次の層を被覆することから成
る。

そのような被覆は翼被覆装置を用いて手で行うか又は浸
漬被覆若しくはビード被覆のような方法で機械により行
うことができる。

機械被覆技法を用いる場合、感光性写真フイルム及び紙
の製造においてよく知られているホッパ被覆技法を用い
て隣接層を同時に被覆可能であることが多い。

ある態様では、ある試薬物質を拡散層へ組み入れてもよ
い。

たとえばラクテートオキシダーゼをこの層へ組み入れて
、Ｈ２Ｏ２との作用により検出可能な変化を生成する物
質を含む試薬層に試料が達する前に過酸化水素を生成さ
せる。

拡散層がろ過及び拡散の機能を果す態様に従って、拡散
層を、混合有機溶媒に溶解した酢酸セルロースのような
バインダの二層を同時に被覆することにより有利に製造
し、前記Ｐｒｚｙｂｙｌｏｗｉｃｚ及びＭｉｌｉｋａｎ
記載のようなブラッシュ重合体層を製造する。

そのような方法により、多数回に及ぶ多層の被覆を一回
で行えるようになり一方非常に有用な拡散及びろ過層が
得られるようになる。

場合によっては所望により個々の層双方ともか又は一方
がＴｉＯ２のような反射性顔料を層中に分散含有してい
てもよい。

種々な個々の層を拡散層又は試薬層のいずれかに同
時に被覆するに適する装置及び方法は米国特許第２９３
２８５５号（１９６０年４月１９日公告）に記載されて
いる。

拡散層の厚さは可変でありそして目的とする試料容積に
幾分依存し、この試料容積は簡便さ及び清潔さの理由か
ら拡散層が吸収可能でなければならない量であり、更に
拡散層の厚さは、層中に吸収されうる試料量にも影響し
うる層のボイドボニュームにも依存する。

広範囲の厚さも許容可能でありそしてそれは特定要素に
とっては望ましいこともあるけれども約５０ミクロンな
いし約３００ミクロンの厚さの拡散層が特に有用であっ
た。

等方的に多孔性の拡散層を製造する時、ボイドボリュー
ムが総体積全体の少くとも約２５％であることが有用で
ありそして５０−９５％が望ましい。

マトリックスを含みかつ相互作用のある物質が組み入れ
られている被覆溶液又は分散液をこの明細書に記載のご
とく製造し、被覆しそして寸法が安定な層を試薬層とし
て形成する。

試薬層の厚さ及びその浸透性の度合は広範囲に可変であ
りそして実際の使用に依存する。

約１０ミクロンないし約１００ミクロンの乾燥厚が有用
であった。

更に要素に、それぞれが分析の際特別な機能を果すいく
つかの個々の試薬層を組み入れることができる。

ある態様では乳酸測定の試薬系を二つのバラバラの層で
被覆してもよい。

これらの層のうち一番上の層に乳酸又はラクテートから
過酸化水素を生成するに必要な試薬を含めることが出来
そして二番目の層に検出可能な変化を生成する物質を含
めることが出来る。

乳酸又はラクテート分析用の要素ではラクテートオキン
ダーゼが、適用量５０ないし５００Ｕ／ｍ２、好ましく
は約１５０ないし３５０Ｕ／ｍ２で拡散層又は試薬層の
いずれか中へ組み入れられる。

パーオキンダーゼは用いる検出可能な変化な生成する物
質の型に依存して適用量約２０００ないし２００００Ｕ
／ｍ２、好ましくは約３０００ないし１００００Ｕ／ｍ
２でそのような要素に有利に用いる。

しかしながら特定の環境下では前記範囲より低いか又は
高い被覆量のパーオキシダーゼが有用であることもある
。

当業者は容易に、特定の用途の度に適切な量な決定する
ことができる。

好ましい態様では、この明細書に記載の層を、たとえば
前記Ｐ ｒｚｙｂｙｌｏｗｉｃｚ及びＭｉｌｌｉｋａｎ
の特許に記載のように溶液又は分散液から被覆すること
により製造する。

被覆の為に、層へ適切な被覆性質を付与する被覆助剤を
含めることが必要である場合が多い。

被覆助剤をこの為又は以下に記載の目的の為に用いるい
かなる場合も、それらによって種々な試薬層に存在する
ラクテートオキシダーゼ又はその他の試薬の活性が阻害
されないことが重要である。

この為に特に有用な被覆助剤には、非イオン性及びアニ
オン性界面活性剤がある。

試薬層中において約０．５ないし約４．０ｇ／ｍ２そし
て拡散層中において約１．０ないし約５．Ｏｇ／ｍ２の
オーダーの界面活性剤の量が一般にほとんど又は全然阻
害作用を起こさず、改善された被覆及び試料拡散性を与
えることが見い出された。

層製造の際硬化剤を用いることにより、媒質の適切で素
早い硬化を確実に行うことができ、取り扱いの際の損傷
を防ぐことができそして隣接層との不望の混合を防止す
ることができる。

これらの使用は業界周知であって十分実証されておりそ
れ故ここではこれ以上言及しない。

有機又は無機の硬化剤をこの為に用いる時はいつでもそ
れらが、層に存在するその他の試薬に過度に悪影響を与
えないことが重要である。

この為に特に有用であることが見い出された硬化剤には
、グルタールアルデヒド及びビス（ビニルスルホニルメ
チル）エーテルがある。

要素の使用：かくして以下に示すラクテート測定例によ
り示すごとく使用の際、約５ないし約５０μｌのオーダ
ーの滴サイズの試料を、公知の滴適用技法を用いて拡散
層又はその他の一番外側の層へ適用する。

拡散層通過の際試料滴は拡散しその結果採取量の試料が
下部の試薬層へ導ひかれる。

試薬層ではラクテートの分解がおこり過酸化水素が生成
する。

別法としては用いる態様に依存して過酸化水素の生成が
拡散層又は上部試薬層中でおこりそして過酸化水素が下
部試薬層へ導びかれる。

いずれの場合も過酸化水素を試薬層において検出可能な
変化を生成する選定物質及び公知の技法を用いて定量し
そして適用試料中に存在するラクテート濃度を測定する
。

本発明の特別な態様では、第１図に示した多層要素を血
清中の乳酸又はラクテートの分析に用いる。

好ましい要素は支持体を被覆した四つの層を含む。

第一の層は試薬層でありそしてこの態様ではこの層は乳
酸又はラクテートを分解しそしてかくして生成した過酸
化水素の量を検出するに必要なすべての試薬を含む。

二番目の層は脱イオン化ゼラチンを含むゲルパッドであ
り、これはこの態様において検出可能な変化な生成する
選定物質（たとえばロイコ染料可溶性溶媒であってもよ
い色原体）が要素の製造において拡散層被覆の間に拡散
層へ泳動するのを防ぐ。

三番目の層は、拡散層である四番目の層とゲルパッドと
の間の粘着性を促進する下塗層である。

本発明を以下の例により更に詳細に説明する。

特にことわらない限り昇下に記載の操作を例に適用する
。

１．ラクテートオキシダーゼの製造 ａ ストレプトコツ．カスファエカリスの培養：酵母抽
出物、グル．コース、トリプトン、Ｋ２ＨＰＯ４、金属
塩及びビタミンを含ハ媒地でストレプトコツカスファエ
カリスを培養した。

細胞を中間対数期に採取し、遠心分離により集め、ｐＨ
７．０のリン酸カリウム緩衡液で一回洗浄しそして使用
するまで凍結貯蔵した。

ｂ ラクテートオキシダーゼの抽出及び精製Ｓ．ファエ
カリス細胞（２６０ｇ湿潤重量）を５℃で約６５時間暖
めた。

細胞を全部で１ｌのｐＨ７．０の０．１Ｍリン酸カリウ
ム緩衡液に懸濁させそしてワーリン（ Ｗａｒｉｎｇ
）ブレンダーで２分間均一に混合した。

細胞懸濁液に１３０００Ｘｇで２０分間遠心分離を行い
そして細胞破片を含むペレットを捨てた。

これらの操作及び残りの操作すべてを５℃で行った。

１％のプロタミンスルフエート溶液ヲ１時間に亘って攪
拌しながら緩徐に添加し、粗細胞のない０．０５％のプ
ロタミンスルフエートの抽出液とした。

次いで抽出液を２０分に亘って１３０００Ｘｇで遠心分
離しそして沈澱した核酸を含むペレットを捨てた。

固体の酵素グレードの（ ＮＨ４ ） ２ ＳＯ４を、
攪拌しながら９０分に亘って緩徐にプロタミンスルフエ
ート処理抽出液へ添加し抽出液を５０％飽和とした。

これを２０分間１３０００Ｘｇで遠心分離した。

ラクテートオキシダーゼを含むペレソトをｐＨ７の０．
１Ｍリン酸カリウム緩衡液に溶解しこの緩衡液に対して
透析しそして凍結貯蔵した。

２ ラクテートオキシダーゼの分析 ラクテートオキシダーゼの分光光度計による測定の為に
、標準反応混合物は総量１．Ｏｍｌ中に、ｐＨ７．０の
リン酸カリウム緩衡剤１００マイクロモル、乳酸２５マ
イクロモル、西洋わさびパーオキンダーゼ３０マイクロ
グラム（プルプロガリン単位５．６）及びオルトジアニ
ンジン０．２５マイクロモルを含んだ試料を３０℃で平
衡状態とし次いでＳ．ファエカリスラクテートオキシダ
ーゼの添加により反応を開始した。

４３０Ｈｍにおける吸収をベソクマンＡ−２５分光光度
計で測定した。

曲線の直線部分から最初の速度を計算しそして必要な場
合にはラクテートオキンダーゼ活性の単位へ転換した。

１単位＝ｏ−ジアニンジンに対しε＝１．１×１０４を
用いて３０℃で１分間に１マイクロモルの色素の生成。

ラクテートオキシダーゼ活性測定の別法は酸素電極によ
る。

たとえば次の方法がある。酸素電極分析用にＹｅｌｌｏ
ｗ Ｓｐｒｉｎｇｓ Ｉ ｎｓｔｒｕｍｅｎｔＣｏｍｐ
ａｎｙＭｏｄｅ１５３酸素電極装置を用いた。

これは恒温槽及び恒速攪拌モーターを備えていた。

通常は、窒素フラツシングした蒸留水試料の場合はメー
ターを酸素零パーセントにセットしそして空気飽和蒸留
水試料の場合は１００％にセットした。

総容積３．０ｍｌ中に、ｐＨ７．０のリン酸カリウム緩
衡剤２８０マイクロモルとＬ（＋）ラクテート４．１７
マイクロモルとが含まれた培養混合物を３０°で平衡状
態とした。

ラクテートオキシダーゼ０．４２単位の添加により反応
を開始しそして溶解酸素の減少を測定した。

ラクテートオキンダーゼ以外のすべての成分が含まれて
いる対照培養物では溶解酸素の減少又はカタラーゼ添加
の際の酸素の発生のいずれも見られなかった。

３ 乳酸又はラクテート測定法 ａ ラクテートデヒドロゲナーゼ参照方法：カルフオル
ニア州ロスアンジェルスのカリビオケムにより供給され
るラピツドラクテート（ Ｒａｐｉｄ Ｌａｃｔａｔｅ
） ＳＴＡＴ−Ｐａｃｋを試薬として用いた。

総容１．０ｍｌの反応混合物には、トリス緩衡剤（ ｐ
Ｈ ９．４ ） ０．２ ２ミリモル、グルタメート２
２モル、グルタメートビルベートトランスアミナーゼ２
．４単位、ラクテートテヒドロゲナーゼ２１単位及びＮ
ＡＤ＋３．１モルが含まれていた。

試料を３０℃で平衡状態としそして最初の吸光度をベツ
クマンＡ２５分光晃度計を用い３４０ｎｍで測定した。

Ｌ（＋）−ラクテート標準（６〜５０×１０−１９モル
）又は血清２０マイクロリットルのいずれかの添加によ
り反応を開始そして５分後に最終的な吸光度を３４０ｎ
ｍで測定した。

各血清試料に対し、総容１０ｍｌ中に血清と０．９％Ｎ
ａｃｌとを含むブランクを試料と同一方法で処理した。

各ブランクのΔＡ３４０（３４０ｎｍにおける血清吸光
度の補正）を適切な試料のΔＡ３４０から引きそして血
清試料のラクテート濃度をラクテート標準曲線と比較す
ることにより測定した。

ｂ ラクテートオキシダーゼ法：リン酸カリウム緩衡剤
（ｐＨ７．０）９０マイクロモル、ｏ−ジアニシジン０
．２マイクロモル又は４−アミンアンチピレンヒドロク
ロリド９６マイクログラム及び１・７ジヒドロキシナフ
タリン３２マイクログラム、西洋わさびパーオキシダー
ゼ（プルプロガリン単位５．６）２５マイクログラム及
びラクテートオキンダーゼ ０．６４ｍｇ（０．４単位）が総容１．Ｏｍｌの反応混
合物中に含まれた。

試料を３０℃で平衡状態にしそして最初の吸光度を４３
０ｎｍで測定した。

Ｌ（＋）−ラクテート標準（６〜４０×１Ｏ−１９モル
）又は血清（２０マイクロリットル）のいずれかの添加
により反応を開始しそして６分後に最終的な吸収を４３
０ｎｍにおいて測定した。

それぞれの血清試料に対して、ラクテートオキノダーゼ
以外のすべての成分を含むブランクを試料と同一方法で
処理した。

各ブランクのΔＡ４３０を適切な試料のΔＡ４３０から
引きそしてラクテート濃度をラクテート標準曲線と比較
することにより測定した。

例１ ラクテートオキシダーゼ溶液分析による乳酸の定量 Ｓ．ファエカリスから得られたラクテートオキシダーゼ
を前記操作に用いて乳酸な測定した。

第２図に示した濃度でＬ（＋）ラクテートの添加により
開始した反応は３０℃において６分で完了した。

わずか０．４単位の酵素の存在下でのこの素早い反応は
、Ｌ（＋）−ラクテートに対する脂（０．２０ミリモル
）が比較的低いことが原因であった。

吸収（６分反応させた後）を、第３図に示すごとくＬ（
＋）−ラクテート濃度の関数としてプロットした。

染料生成は試験範囲に亘って乳酸濃度に比例した。

各血清試料２０μｌを添加して全体を１．０ｍｌとする
場合には、この範囲は血清濃度２．９７ないし１８．６
ｍｇ／ｄｌ（０．３３ミリモルないし２．０３）に等し
かった。

正常なラクテートの値は５ないし１５ｍｇ／ｄｌである
ことは既知である。

例２ ラクテートオキシダーゼ法と参照方法との比較−溶液分
析 前述の操作による参照方法と、色原体としてオルトジア
ニンジンを用い次いで色素生成系として１・７−ジヒド
ロキンナフタリン（ＤＨＮ） 及びアミノアンチピレ
ン（ＡＡＰ） 一ＨＣ１を用いたラクテートオキンダー
ゼ法とにより血清試料（２０μｌ）を分析した。

二つの異なる色素生成系な選択することにより、ラクテ
ートオキンダーゼ法による乳酸測定の波長選択の巾が得
られる。

表Ｉによりこれら二法の間に良好な関係が存在すること
が示される。

例３ ラクテートオキシダーゼ法による乳酸溶液分析の再現性 オルトジアニンジン色素生成系を用いた前記方法による
正常血清の反復試験により本発明方法の精度を測定した
。

表■の値から変化率２．８８％が計算された。

この値は、ラクテートテヒドロゲナーゼ法を用いた場合
の変化率３％と比べて好ましい。

第１図に示すような各層分析要素を用いた本発明の好ま
しい態様を以下の例に示す。

例４ ラクテートオキシダーゼとトリアリールイミダゾール染
料系を用いた乳酸測定用多層分析要素Ａ．（１）ゼラチ
ン（１１ｇ／ｍ２）、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ
）のオレイン酸エーテル（ＰＥＧ）（１６１ｍｇ／ｍ２
）、アルカノールＸＣ（３２３ｍｇ／ｍ２）、リン酸カ
リウム（８０７ｍｇ／ｍ２）、５・５−ジメチル−１・
３ーシクロヘキサンジオン（２１５ｍｇ／ｍ２）、パー
オキシダーゼ（６４６０Ｕ／ｍ２）、ラクテートオキシ
ダーゼ（２８０Ｕ／ｍ２）、ビス（ビニルスルホニルメ
チル）エーテル（１３０ｍｇ／ｍ２）及びジエチルラウ
ルアミド（３５８ｍｇ／ｍ２）に２（３・５−ジメトキ
シー４−ヒドロキシフエニル）−４・５−ビス（４−ジ
メチルアミノフエニル）イミダゾール（２６９ｍｇ／ｍ
２）を分散させた分散液を有する試薬層（２）ゼラチン
（５．４ｇ／ｍ２）、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ
）のオレイン酸エーテル（１６１ｍｇ／ｍ２）、アルカ
ノールＸＣ（１６１ｍｇ／ｍ２）、リン酸カリウム（８
０７ｍｇ／ｍ２）及びビス（ビニルスルホニルメチル）
エーテル（６５ｍｇ／ｍ２）を有するゲルパッド層（３
）ポリーｎ−イソプロピルアクリルアミド（３２０ｍｇ
／ｍ２）から成る下塗層並びに（４）酢酸セルロース６
ｇ／ｍ２及びＴｉｅ２４６ｇ／ｍ２を有する酢酸セルロ
ース／Ｔｉ０２拡散層で０．１７５ｍｍのエスター（Ｅ
ｓｔａｒ）支持体を被覆した。

新調製した７％牛の血清アルブミン（０．９％の塩添加
）２．０ｍｌ（３３．３ミリモル）にｄｌリチウムラク
テート６．４■を溶解することにより標準を製造した。

Ｌ−ラクテート濃度に対する反射濃度のプロットにより
第４図に示す標準曲線が得られた。

血清ラクテート値は１０μｌ試料を２回直接ウエブヘ適
用した平均であった。

濃度測定を１０分で行いそしてラクテート濃度を標準曲
線から得た。

例５ ウエブホルマットにおけるラクテートオキシダーゼ法と
溶液参照法との比較 例４に記載の分析要素及び前記溶液参照法を用いて血清
乳酸を測定した。

表■に示すこれら二法から得られた値のプロットにより
ウエブ法に対する１０％のずれが示された。

結晶状Ｌ−ラクテートと凍結乾燥した牛の血清アルブミ
ンに関してずれを見込んでウエブの補正をした。

例６ ウエブホルマットを用いた本発明の再現性二種の異なる
量、５及び１０ｍｇ／ｄｌの血清乳酸を二つの別々の日
に試験し、本発明の被覆要素態様に基づいて正確な値を
得た。

結果を表■に示した。

例７ 自己カップリング染料系による乳酸測定用多層分析要素 この分野の分析範囲を広げた入取し易い色原体、４−イ
ソプロポキシ−１−ナフトール自己カツプリング染料系
をこの要素に用いた。

この要素の型は第１図に示す。

層の組成は次の通りである； Ａ（１）ゼラチン（１６．０ｇ／ｍ）、リン酸ナトリウ
ム（ ５ ９ ２ｍｇ／ｍ２）、リン酸カリウム（ ３
５ ６ｍｇ／ｍ２）トライトンＸ−１００（ ３ ２
３ｍｇ／ｍ２）、４−イングロポキシー１一ナフトー
ル（８６１■／ｍ２）、コポリ（ｎ−プチルメタクリレ
ートーコースチレンーコ−２−アクリルアミドー２−メ
チルプロパンスルホン酸（５５：４０：５）（３．４ｇ
／ｍ２）、５・５−ジメチル−１・３−シクロヘキサン
ジオン（２１５ｍｇ／ｍ２）、パーオキシダーゼ（１１
８ｍｇ／ｍ２）、ラクテートオキシダーゼ（２８０Ｕ／
ｍ２）及びビス（ビニルスルホニルメチル）エーテル（
２ ４ ２ｍｇ／ｍ２）を有する試薬層、（２）ゼラ
チン（５．４ｇ／ｍ２）、リン酸ナトリウム（１４０ｍ
ｇ／ｍ２）、リン酸カリウム（２８０ｍｇ／ｍ２、トラ
イトンＸ−１００（１０８ｍｇ／ｍ２） 及びビス（ビ
ニルスルホニルメチル）エーテル（８１ｍｇ／ｍ２）を
有するゲルパッド、（３）ポリーｎ−イソプロビルアク
リルアミド（３２０ｍｇ／ｍ２）を有する下塗層並びに
（４）酢酸セルロースＴｉＯ２拡散層（前述の型）で０
．１７５ｍｍ厚のエスター支持体を被覆した。

ラクテート標準を前述のごとく製造しそして標準曲線（
第５図）を３７℃１０分における反射濃度に対するラク
テート濃度から作製した。

ラクテート１２．５ｍｇ／ｄｌにおける標準偏差は（ｎ
＝９）＝０．０２４であり変化率（％）を４．２であっ
た。

【図面の簡単な説明】

第１図は乳酸又はラクテート分析用多層要素を示す。 第２図は４３０ｎｍにおけるし（＋）ラクテートの吸光
度変化を示す。 第３図は４３０ｎｍにおけるＬ（＋）ラクテートの吸光
度値とラクテート濃度との関係を示す。 第４図及び第５図はＬ−ラクテート濃度に対して反射濃
度をプロットすることにより得られた曲線である。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １ 検出可能な過酸化水素を生成しうる、実質的にカタ
   ラーゼを含まないラクテートオキシダーゼを含んでなる
   ことを特徴とする乳酸又はラクテート分析用組成物。 ２ ラクテートオキンダーゼが、１分間に蛋白質１ｍｇ
   当り約０．１マイクロモル以上のラクテートを消失させ
   るような比活性を有するものである特許請求の範囲第１
   項記載の組成物。 ３ ラクテートオキシダーゼのラクテートに対するｋｍ
   が約０．２ミリモル以上である特許請求の範囲第１項記
   載の組成物。 ４ ラクテートオキンダーゼがストレプトコッカスファ
   エカリスＡＴＣＣ１ ２ ７ ５ ５から得られた酵素
   である特許請求の範囲第１項記載の組成物。 ５ 検出可能な過酸化水素を生成しうる、実質的にカタ
   ラーゼを含まないラクテートオキシダーゼ、過酸化作用
   のある物質、及び過酸化水素と過酸化作用のある物質と
   の存在下で検出可能な変化をなす物質を含んで成ること
   を特徴とする乳酸又はラクテート分析用組成物。 ６ ラクテートオキレダーゼが、１分間に蛋白質１〜当
   り約０．１マイクロモル以上のラクテートを消失させる
   ような比癌性を有するものである特許請求の範囲第５項
   記載の組成物。 ７ ラクテートオキシダーゼのラクテートに対するｋｍ
   が約０． ２ ミリモル以上である特許請求の範囲第６
   項記載の組成物。 ８ ラクテートオキレダーゼがストレプトコッヵスファ
   エカリスＡＴＣＣ １ ２ ７ ５ ５から得られた
   酵素である特許請求の範囲第５項記載の組成物。 ９ 拡散層及び試薬層妄有してなる乳酸又はラクテート
   分析用要素において、前記試薬層が（１）検出可能な過
   酸化水素を生成しうる、実質的にカタラーゼを含まない
   ラクテートオキシダーゼ、（２）過酸化作用のある物質
   及び（３）過酸化水素と過酸化作用のある物質との存在
   下で検出可能な変化をなす物質を含み、更に前記要素が
   拡散層と試薬層との間に検出可能な変化をなす物質が拡
   散層中に泳動するのを防ぐ第三の層を有してなることを
   特徴とする乳酸又はラクテート分析用要素。 １０ 更に支持体を有し、かつ拡散層よりも試薬層の
   方が支持体の近くにある特許請求の範囲第９項記載の要
   素。 １１ ラクテートオキシダーゼが、１分間に蛋白質１
   〜当り約０．１マイクロモル以上のラクテートを消失さ
   せるような比活性を有するものである特許請求の範囲第
   ９項記載の要素。 １２ ラクテートオキシダーゼのラクテートに対する
   ｋｍが約０．２ミリモル以上である特許請求の範囲第９
   項記載の要素。 １３ ラクテートオキンダーゼがストレプトコツカス
   ファエカリスＡＴＣＣ １２７５５から得られた酵素で
   ある特許請求の範囲第９項記載の要素。 １４ 拡散層及び試薬層を有してなり、前記試薬層が
   、過酸化水素及びパーオキシダーゼの存在下で検出可能
   な変化をなす物質とパーオキンダーゼとを含んでなる乳
   酸又はラクテート分析用要素であって、前記要素が検出
   可能な過酸化水素を生成しうる実質的にカタラーゼを含
   まないラクテートオキシダーゼを含み、前記ラクテート
   オキシダーゼが約５０ないし約５００Ｕ／ｍ２そして前
   記パーオキンダーゼが約２０００ないし約２００００Ｕ
   ／ｍ２の濃度で存在することを特徴とする乳酸又はラク
   テート分析用要素。 １５ 要素が、拡散層と試薬層との間に、検出可能な
   変化ななす物質が拡散層中に泳動するのを防ぐ第三の層
   を更に含む特咋請求の範囲第１４項記載の要素。 １６ 検出可能な変化を生成ｊる物質がトリアリール
   イミダゾール染料でありそしてパーオキシダーゼ濃度が
   約３０００ないし約１００００Ｕ／ｍである特許請求の
   範囲第１５項記載の要素。 １７ 検出可能な変化を生成する物質が自己カップリン
   グ染料であり、そしてイーオキンダーゼ濃度が約３００
   ０ないし約１００．００Ｕ／ｍである特許請求の範囲第
   １５項記載の要素。 １８ 要素が更に支持体料有し．、かつ拡散層よりも
   試薬層の方が支持体の近くにある特許請求の範囲第１４
   項記載の要素。 ．．゜１９ ラクテートオキシタ］一ゼが、１分間に
   蛋白質１〜当り約０．１マイクロ．七ノ一以上のラクテ
   ートを消失させるような比活憔を有するものである特許
   請求の範囲第１４項記載の展素。 ２０ ラクテートオキシタニーゼのラクテートに対す
   るｋｍが約０． ２ ミＩＪモル以上である特許請求の
   範囲第１４項記載の要素。 ．？１ ラクテートオキシダーゼがストレプトコツ
   カスファエ力リスＡＴＣＣ １ ２ ７ ５ ５から
   得られた酵素である特許請求の範囲第１４項記載の要素
   。