JPS5846317B2 - コウソノ カガクテキコテイホウホウ - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、酵素を担体上に化学的に固定する（ ｉｍｍ
ｏｂｉｌｉｚｅ ）方法に関するものである。

酵素は或特定の分野の諸反応に対して触媒作用を行う生
物学的に活性な蛋白質である。

酵素は種種の産業分野および研究分野において使用され
ており、たとえば発酵、薬学分野、医学研究、食品加工
処理の諸分野において使用されている。

酵素は特異な生物学的活性を有し、そして一般に「大量
の好ましくない副生成物」は生成しない。

酵素の回収および再使用のために酵素を種々の担体（５
ｕｐｐｏｒｔｓ ）上に化学的または物理学的に固定す
る方法の開発に関する研究が種々行われている。

過去においては、酵素は、共有結合形成カップリング（
ｃｏｖａｌｅｎｔ ｃｏｕｐｌｉｎｇ ）、吸着、イオ
ン結合形成操作（１ｏｎｉｃ ｂｏｎｄｉｎｇ ）等に
より無機担体マトリ′すｙ＜ （ｓｕｐｐｏｒｔｉｎｇ
ｍａｔｒｉｃｅｓ ）の上に担持させることにより固定
されていた。

また、非水溶性担体への酵素の共有結合形成カップリン
グについて、今迄多くの研究が行われた。

この場合の担体は大抵有機重合体であった。

しかしながら最近では、酵素をセラミック材料に結合さ
せる研究も行われている。

たとえば米国特許第３５１９５３８号明細書には、シラ
ン系カップリング剤を用いて酵素をガラスまたはアルミ
ナの如き無機担体に結合させる方法が記載されている。

従来の最も簡単な不溶化（１ｎｓｏｌｕｂｉｌｉｚａｔ
ｉｏｎ）技術は、酵素を有機またｔ’ｓ機非水溶性担体
に吸着させることである。

これは良い方法である。なぜならばこの場合には溶液中
の酵素を単に担体にさらすだけでよいからである。

しかしながらこの易吸着性には、それに対応する易脱着
性が伴うことが多い。

米国特許第３５５６９４５号および第３８５０７５１号
明細書には、酵素を多孔性（ｐｏｒｏｕｓ ）無機担体
に吸着させる方法が記載されている。

もう１つの公知技術は、基質（５ｕｂｓｔｒａｔｅ ）
の存在下に酵素を担体に結合させ、そして酵素の活性点
（ａｃｔｉｖｅ ５ｉｔｅｓ ）の「見掛は上の（すな
わち一時的の）ブロッキング」（ａｐｐａｒｅｎｔｌｙ
ｂｌｏｃｋｉｎｇ ） を行って該活性点と担体との
反応を避けるようにすることを含むものである。

この技術では粉末ガラス、アルミナ等が使用される（米
国特許第３６６６６２７号明細書）。

従来の技術の詳細は次の刊行物に記載されている：ジョ
ージ、Ｒ，スターク著「バイオケミカル、アスペクツ、
オン、リアクションズ、オン、ソリッド、サラポーラ」
〔アカデミツク、プレス；ニューヨーク、Ｎ、Ｙ、（１
９７１））；Ｈ，Ｈ，ライ−トールの論文「エンザイム
ズ、イムモビライズド、オン、インオーガニック、キャ
リャーズ」（「リサーチ／デベロップメントＪｌ ９７
１年１２月号） ； Ｒ，Ａ、メツシングの論文「ザ、
ポテンシャル、アプリケーションズ、オン、モレキュラ
ー、インクルージヨン、ツウ、ビア、プロセシング」（
ブルーワーズ、ダイジエス）、１９７１年１２月号）；
米国特許第３５１２９８７号および第３１６７４８５号
明細書等。

これらの従来の技術は多くの分野において有利に実施で
きるものであるけれども、なお一層すぐれた技術の開発
が所望されている。

すなわち、長期間にわたる貯蔵および使用された後でも
当初の活性をほとんどそのまま保っているような酵素活
性保有複合体（ｅｎｚｙｍａｔｉｃａｌｌｙ ａｃｔｉ
ｖｅｃｏｍｐｏｓｉｔｅ ） を作るための、簡単な
、効果的な、かつ経済的な酵素の化学的固定方法の開発
が望まれている。

本発明の目的は、かかる有用な酵素固定方法を提供する
ことである。

すなわち本発明は、酵素と、酵素担持のために充分な表
面積を有する不活性で寸法の安定な多孔性担体と、化学
的固定剤（Ｃｈｅｍｉｃａｌｉｍｍｏｂｉｌｉｚｉｎｇ
ａｇｅｎｔ ）とを、酵素を担体上に化学的に固定す
るのに充分な温度で充分な時間、接触状態に保つことに
より担体上に酵素を固定する方法において、前記化学固
定剤として、Ｃ１−１８アルカンジアミンとＣ１−ｔＯ
アルカンシバライドとの「前もって形成された反応液（
ｐｒｅｆｏｒｍｅｄｒｅａｃｔｉｏｎ ５ｏｌｕｔｉｏ
ｎ ） ｊを使うことを特徴とする、前記の酵素固定方
法を提供する。

本明細書において使用された用語「アルカンシバライド
」は、アルカンの分子構造の中に２つのハロゲン基（た
とえばブロモ−、ヨード−、クロロ基またはその混合基
）を有するアルカン化合物を意味するものである。

用語「アルカンジアミン」は、アルカンの分子構造の中
に２つのアミノ基を有するアルカン化合物を意味する。

本発明の多くの具体例においては、反応液を容易に製造
できるようにするために、炭素原子を１−１０個、好ま
しくは１−６個有するアルカン基が用いられる。

水溶液中へのアルカンシバライドの溶解度は、アルカン
基中の炭素原子数が増えるにつれて減少する傾向がある
ことが見出された。

前記アルカンジアミンは分枝状または直鎖状アルカンジ
アミンであり得、そしてその例には次のものがあげられ
るニジアミノメタン、ジアミノエタン、ジアミノプロパ
ン、ジアミノブタン、ジアミノペンタン、ジアミノ−ジ
アミノイソオクタン、ジアミノヘキサン、ジアミノへブ
タン、ジアミノオクタン、ジアミノイソブタン、ジアミ
ノイソヘキサン。

本発明においてはアルカン基中のアミノ基の位置は臨界
条件ではないということが見出された。

適当なアルカンシバライドの例にはジブロモ−ショート
−、ジクロロ−形態の分校状および直鎖状アルカノン・
・ライドがあげられ、その具体例には次の化合物があげ
られるニジブロモメタン、ジブロモエタン、ジブロモプ
ロパン、ショートプロパン、ジブロモペンタン、ジクロ
ロエタン、ジブロモブタン、ショートペンクン、ショー
トメタン、ジクロロメタン、および他のジハロアルカン
（炭素原子を１−１０個有すもの）。

本発明においてはアルカン基土のハライド基の位置は臨
界条件ではないということが見出された。

本発明の多くの具体例においては、反応液が容易に製造
できるようにするために、炭素原子を１１０個、好まし
くは１−６個有するアルカン基が用いられる。

水溶液中のアルカンシバライドの溶解度は、アルカン基
中の炭素原子の数が増すにつれて減少する傾向があるこ
とが見出された。

酵素は錯体型ポリペプチド（ｃｏｍｐｌｅｘｐｏｌｙｐ
ｅｐｔｉｄｅ ）であってその分子構造の中にアミノ官
能基（ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌｉｔｙ ）およびカルボキ
シ／１／官能基を有する。

酵素は一般に次の３つの種類に大別できる：加水分解酵
素（ｈｙｄｒｏｌｙｔｉｃｅｎｚｙｍｅｓ ） 、レド
ックス酵素（ｒｅｄｏｘ ｅｎｚｙｍｅ ）、トランス
フェラーゼ酵素（ｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ ｅｎｚｙｍ
ｅｓ）。

第１のグループである加水分解酵素の例には、蛋白質を
加水分解する蛋白質加水分解酵素 （ｐｒｏｔｅｏｌｙｔｉｃ ｅｎｚｙｍｅｓ ） 、た
とえばパノ（イン、フィシン（フィチンともいう）、ペ
プシン、トリプシン、キモトリプシン、ブロメリン、ケ
ラチナーゼ；炭水化物を加水分解するカルボヒドラーゼ
、たとえばセルロアーゼ、アミラーゼ、マルターゼ、ペ
クチナーゼ、チタナーゼ；エステルを加水分解するエス
テラーゼ、たとえばリパーゼ、コリンエステラーゼ、レ
シチナーゼ、アルカリ性および酸性のホスファチアーゼ
；核酸を加水分解するヌクレアーゼ、たとえばリボヌク
レアーゼ、デスオキシリボヌクレアーゼ；アミンを加水
分解するアミダーゼ、たとえばアルギナーゼ、アスパラ
ギナーゼ、グルタミナーゼ、ヒスチダーゼ、ウレアーゼ
。

第２番目のグループであるレドックス酵素は酸化−およ
び還元反応において触媒作用を示すものであって、その
例には次のものがあげられるニゲルコースオキシダーゼ
、キサンチンオキシダーゼ、カタラーゼ、ペルオキシダ
ーゼ、リポオキシダーゼ、チトクロムレダクターゼ。

第３番目のグループであるトランスフェラーゼ酵素は１
つの分子から他の分子へ化学基を移す作用を行う酵素で
あって、その例にはグルタミックービルピックトランス
アミナ１ゼ（ｇｌｕｔａｍ ｉ ｃ−ｐｙｒｕｖｉ ｃ
ｔｒａｎｓａ ｍ ｉ ｎａｓｅ ）、グルタミツクー
オキザルアセティツク（ｇｌｕｔａｍｉｃ −ｏｘａｌ
ａｃｅｔｉｃ ） ）ランスアミナーゼ、トランスメ
チラーゼ、ホスホピルビックトランスホスホリラーゼが
あげられる。

本発明においては前記酵素は単独で使用でき、あるいは
他の酵素と組合わせて使用できる。

担体の組成は臨界条件ではない。

しかしながら担体は、不活性であり、寸法安定性を有し
、かつ酵素担持のために充分な表面積を有するものでな
げればならない。

この担体は米国特許第３８３９１７５号明細書に記載さ
れているような多孔性の、かつ流体透過性の膜（ｍｅｍ
ｂｒａｎｅｓ ）であってもよく、あるいは米国特許第 ３８５０７５１号明細書記載の多孔性粒状物（ｐａｒｔ
ｉｃｕｌａｔｅｓ ） であってもよい。

多孔性担体を使用する場合には、生物学的に活性な複合
体を形成するために酵素を充分に担持し得る程度の多孔
性および収着性を有する多孔性担体を使用すべきである
。

本発明の好ましい具体例（工業的に重要な具体例）に従
って製造された「固定された酵素／担体複合体」の活性
度は少なくともＮ、００１国際単位（１，Ｕ、 ）／Ｃ
Ｃ（複合体）である。

生物学的活性度の国際単位（Ｉ、Ｕ、）について説明す
る。

Ｉｌ、Ｕ、は、１分間当り１マイクロモルの速度で基質
を生成物に変換させるに要する活性酵素の量として定義
される。

本発明においては、空隙率（容量％）が１０−８０％（
好ましくは１５−５０％）である多孔性マトリックス（
すなわち担体）を用いるのが有利であることが見出され
た。

担体中の空隙の寸法は臨界条件であって、この寸法は酵
素の固定を妨げる程度に小さいものであってはならない
。

多くの利用分野において、０．０１−１０ミクロンの範
囲内の平均空隙寸法を有する液体透過性膜または多孔性
粒状物を用いるのが有利である。

効率および経済的立場からみて、平均空隙寸法は０．０
１−２ミクロンであることが好ましい。

多孔性粒状物である担体は耐火性セラミック酸化物の粉
末であってよく、その例にはアルミナ粉末、ジルコニア
粉末、マグネシア粉末、シリカ粉末、トリア粉末、ガラ
ス粉末、クレー粉末、タルク粉末等があげられる。

多孔性粒状物の粒子径は臨界条件ではないが、粒子径は
、−５メツシユないし＋４００メツシユの範囲内にある
のが適当であろう。

一般に効率および経済的立場からみて、−２０メツシユ
ないし＋１００メツシユ（米国ふるい）の範囲内の粒子
径を有する粒状物を用いるのが好ましい。

多孔性の、不活性な、剛性を有する、かつ寸法安定性を
有する耐火性の液体透過性膜である担体は、次の製法に
従って製造できる。

適当な耐火性酸化物の粉末を圧密化（ｃｏｍｐａｃｔｉ
ｎｇ ）することにより、所望の形態を有する「グリー
ンコンパクト」（未焼成圧密化物） （ｇｒｅｅｎ ｃ
ｏｍｐａｃｔ ） を作る。

次いでこのグリーンコンパクトを充分高い温度において
充分な時間焼成して、多孔性の、不活性な、剛性および
寸法安定性を有する液体透過性耐火物型担体を生成させ
る。

この焼結操作（ｓｉｎｔｅｒｉｎｇ ）は、粒子が崩壊
または合体して非多孔性生成物となるような温度または
時間条件のもとで実施すべきでない。

焼結の程度は、焼結された圧密化生成物（ｆｉｒｅｄ
ｃｏｍｐａｃｔ ） の実際の密度を、焼結酸化物の
理論密度と比較することにより知ることができる。

本発明に使用できる多くの酸化物のうちでは、アルミナ
が好ましいものである。

なぜならばアルミナは化学的耐久力がよ（、かつ製造が
容易であるからである。

耐火性酸化物の粉末から前記担体を作る場合には、前記
の範囲内の空隙寸法および空隙率を有する焼結された圧
密化生成物を得るために該粉末の粒子径を適宜選択すべ
きである。

多孔性担体を得るための圧密化技術および焼結技術自体
は当業界で周知であり、本発明の一部を構成するもので
はない。

したがってこれらの技術について詳細に説明することは
不必要であると思われる。

ただ、１０００−１００００ｐ、ｓ、ｉの範囲内の圧密
化圧力および１３００−１７００℃の範囲内の焼成温度
を用いるのが工業的に有利であるということたけ述べて
おく。

耐火性酸化物の圧密化技術および焼結技術の詳細は、Ｅ
、リシュケウイツチ著「オキサイド、セラミックス」〔
アカデミツク、フレス、ニューヨーク、Ｎ、Ｙ、（１９
６０））等に記載されている。

この多孔性マトリックスはまた多孔性の銀または多孔性
のステレンス鋼の如き多孔性金属からも製造できる。

この多孔性マ） ＩＪフラックスかなる幾何学的形態の
ものであってもよ（、たとえばロンドシリンダーディス
ク（ｒｏｄ ｃｙｌｉｎｄｅｒ ｄｉｓｃｓ ） 、プ
レート、棒、ブロック等の形のものであってよい。

他の適当な担体の例には天然また壮合成繊維、たとえば
ポリプロピレン、ポリエチレン、綿、羊毛、ナイロン、
レーヨン、ポリエステル、アクリル繊維等があげられる
。

この複体は天然繊維と合成繊維との両者の混合物であっ
てもよい。

またこの担体は炭素、アスベスト、ガラスまたは他の同
様な繊維状セラミック（たとえば珪酸アルミニウム）等
から作られた無機繊維であってもよい。

銅、ステンレス鋼の如き金属の繊維も使用できる。

繊維状担体の直径は約０．００１−０．２５インチの範
囲内の値であってよい。

固定された酵素を用いる処理および濾過を１回の操作で
行うことからなるイン−ライン（ｉｎ −１ｉｎｅ ）
濾過操作に使用するためにフィルターカートリッジ（
米国特許第３８２８９３４号明細書参照）を作る場合に
は、前記の繊維状材料を用いるのが非常に有利である。

このイン−ライン濾過操作は、ビールのチルプルーフィ
ング（ｃｈｉｌｌ ｐｒｏｏｆｉｎｇ ） の場合に
特に有用なものである。

既述の「前もって形成された反応液」は一般に、アルカ
ンシバライドとアルカンジアミンとを水溶液中で、これ
らの成分がその限界溶解度までの量で完全に溶解するま
で混合することにより製造できる。

或場合には、前もって製造された反応液の中に有機相（
ｏｒｇａｎｉｃ ｐｈａｓｅ ）を存在させることがで
きる。

ただし、存在させた有機相（ｒｅｓｉｄｕａｌｏｒｇａ
ｎｉｃ ｐｈａｓｅ ）が酵素を変性させるかまたはそ
の機能を低下させる傾向を有するものである場合には、
このような有機相の添加は一般に好ましくないであろう
。

或場合には、水溶液中へのアルカンシバライドおよびア
ルカンジアミンの溶解度を高めるために、水混和性有機
溶媒が若干量（たとえば０．１−９０重量％）添加でき
る。

このような水混和性有機溶媒の例にはアルコール（たと
えばメタノール、エタノール、プロパツール）、ケトン
（たとえばアセトン、メチルエチルケトン）があげられ
る。

あるいは或場合には、水の不存在下に前記反応液を生成
させるために有機溶媒が使用できるが、この有機溶媒は
酵素の変性をもたらさないものでなげればならない。

本発明においては、反応液中の前記２つのアルカン化合
物の各々の濃度は臨界条件ではないが、これらのアルカ
ン化合物の各々の該濃度は０．００１−５重量％である
ことが大抵の利用分野において適当であろうと思われる
。

ただし、一般に濃度の上部限界値（ｕｐｐｅｒ ｒａｎ
ｇｅ ）は、限界溶解度（５ｏｌｕｂｉｌｉｔｙ １１
ｍ１ｔ ）の値により左右されるであろう。

これらの成分が溶解した直後に、反応液はすぐに、酵素
固定のために使用できる。

この溶解は、２０℃（すなわち室温）から半該混合物の
沸点までの或温度において数秒ないし数時間またはそれ
以上の時間の後に完了するであろう。

約２０−５０℃の温度において約１分間ないし半時間溶
解操作を行うのが実際には便利であろう。

本発明においてはアルカンジアミン対アルカンシバライ
ドのモル比は臨界条件ではないことが見出された。

本発明者の経験によれば、アルカンジアミン対アルカン
シバライドのモル比が０．００５：１ないし１０００：
１であるときに良い結果が得られるように思われる。

多くの利用分野においては、この比が０．１：１ないし
１：２０であることが実際上便利である。

得られた「前もって形成された反応液」のｐＨ値は臨界
条件ではないけれども、使用酵素の種類および最終溶液
のｐＨ値に応じて前記の「前もって形成された反応液」
のｐＨ値は２．５−１１の範囲内の値であることが実際
には有利であろう。

容易に理解され得るように、或利用分野においては、担
体の性状または酵素の特性に基いて、このｐＨ値を前記
の値より高くまたは低くすることが必要な場合もあり得
る。

前記のアルカンシバライドとアルカンジアミンとの間に
は完全な化学反応が起るかどうかということについては
、未た充分解明されていない。

これらの成分は相互に反応して複雑なポリアルキレン化
合物を生成し得るものであることは、米国特許第２６９
６５０４号明細書に記載されているように既に公知であ
る。

しかしながら本発明の実施時にこの反応が進行するかど
うかということは未た明らかではない。

このような中間化合物の生成および単離は決して本発明
の一部を占めるものではない。

本明細書に使用された用語「前もって形成された反応液
」は、酵素または担体と接触させる前にアルカンシバラ
イドとアルカンジアミンとを溶液と混合することを示す
ために使用された用語である。

本発明方法においては、酵素を担体上にその場で（ｉｎ
−５ｉｔｕ ）固定させるのに充分な温度において充
分な時間酵素と「前もって形成された反応液」と担体と
を接触させるのである。

一般にこの接触操作は温度、濃度および他の条件に応じ
て数分間ないし数十時間ないし数百時間（たとえば１０
０時間）の時間を要するものである。

酵素の変性を防ぐために、一般に該温度は２０℃以下ま
た３０℃以下に保つのが有利であり、約０−１０℃に保
つのが好ましい。

この接触操作の実施方法の１具体例によれば、最初に酵
素を担体上に付着させ（たとえば収着または含浸により
付着させ）、次いで、「前もって形成された反応液」と
接触させるのである。

これによって、酵素は化該的に固定させることができる
。

ここに「収着」は吸着および吸収の両者を包含するもの
である。

もう１つの具体例では、担体を「前もって形成された反
応液」と接触させ、次いでこれを酵素と接触させること
ができる。

さらにもう１つの具体例では、前もって形成された反応
液と酵素とを、担体と接触させる前に相互に接触させる
ことができる。

これらの具体例のうちでは第１番目の具体例が効率およ
び経済上の理由から好ましい。

なぜならば、最初に酵素が担体上に付着するか担体中に
混入されるので、酵素による担体の最大限の１湿潤Ｊ
（ｗｅｔｔｉｎｇ ）が達成され、かつ、その場での交
叉結合の生成により酵素がこの位置で固定され、これに
よって、高い活性および長い有効寿命（５ｅｒｖｉｃｅ
１ｉｆｅ ）が確実に維持できるからである。

本発明の固定方法は次の利用分野において特に有利に利
用できるものであるニゲルコースの分析（カナダ特許第
１０７２６３４号明細書）のときのグルコースオキシダ
ーゼの固定；尿素の分析（米国特許第３９２６７３４号
明細書）のときのウレアーゼの固定；ピールのチルプル
ーフィング（ｃｈｉｌｌ ｐｒｏｏｆｉｎｇ）のときの
パパインおよび他の酵素の固定；デン粉の加水分解のと
きのアミラーゼの固定等。

本明細書中に引用された各特許文献および技術文献は、
参考資料として引用されたものである。

以下の実施例において、特に断わらない限りすべての「
部」は重量部であり、「％」は重量％であり、温度の単
位は「℃」である。

例Ｉ Ａ部 アルミナ粉末上に固定されたグルコースオキシダーゼ 粉末状アルミナ１ｒを蒸留水で充分洗浄した。

この粉末状アルミナの粒子径は−４０ないし＋７０メツ
シユ（米国ふるい）の範囲内にあり、平均空隙寸法は０
．１−ｏ、２ミクロンであった。

燐酸二水素カリウムと燐酸水素二ナトリウムとの混合物
からなる標準緩衝剤でｐＨ値を５．５にした水溶液４０
ｍ１中に前記粉末状アルミナを入れ、この湿った粉末状
アルミナにグルコースオキシダーゼ（ウオシングトン、
バイオケミカル、コーポレーションから入手したもので
あって、その公称活性度は１４０国際単位／■である）
を５０■添加した。

かくして得られた混合物を６−８℃において半時間縁や
かに攪拌して酵素をアルミナに収着させた。

この混合物に、前もって形成された架橋反応液（ｃｒｏ
ｓｓｌｉｎｋｉｎｇ ｒｅａｃｔｉｏｎ ５ｏｌｕｔｉ
ｏｎ ） を添加した。

この反応液は、メタノール２０ｍ１と蒸留水１０ｍ１と
濃塩酸０．１５ｍ１とジアミノプロパン０．０８ｍ１と
ジブロモエタン０．０２ｍ１とを室温において約１５分
間混合して溶液を形成させる操作を行うことにより製造
されたものであった。

反応液中のジアミノプロパン対ジブロモエタンのモル比
は４：１である。

アルミナ、グリコースオキシダ−ゼおよび架橋反応液か
らなる混合物を６−８℃において磁力攪拌機により１晩
中緩やかに攪拌してグルコースオキシダーゼをアルミナ
上に固定させた。

かくして得られた「固定されたグルコースオキシダーゼ
／アルミナ複合体」を蒸留本釣２１で洗浄し、そして蒸
留水中に入れて貯蔵した。

Ｂ部 固定されたグルコースオキシダーゼ／アルミナ※※ 複
合体の試験 Ａ部である固定されたグルコースオキシダーＶアルミナ
複合体の触媒活性は、このグルコースオキシダーゼ／ア
ルミナ複合体の存在下におけるｐ−ベンゾキノンによる
β−Ｄ−グルコースからグルコン酸への酸化反応の反応
速度の測定値から次の方法に従って算出された。

この反応は次式で表わされる。

この反応の進行度は、ハイドロキノン濃度の経時変化を
ポテンショメトリーにより測定することにより追跡した
。

白金検出電極（ペックマン、モデル３９２７３）を、二
重接続カロメル−銀／塩化銀参照電極（オリオン、モデ
ル９Ｏ−２０−ＯＯ）と一緒に使用した。

この電極系をキャリフレートするための標準溶液は、ハ
イドロキノンと少なくとも１００モル過剰のｐ−ベンゾ
キノンとの各水溶液または緩衝液（ｐＨ＝ ５．５ ）
から製造した。

ｐ−ベンゾキノンの濃度は０．ＯＩＭであった。

ハイドロキノンの濃度をポテンショメーターのミリボル
ト値（読みとり値）に対してプロットすることにより、
キャリブレーショングラフを作った。

グルコースの酸化反応を行うための反応媒質は、デキス
トロース０．１モルおよびホスフェート緩衝剤０．０１
モルを含むｐＨ５，５の水溶液であった。

これをｌ晩生攪拌してα−Ｄ−グルコースとβ−Ｄ−グ
ルコースとの間に平衡が確実に保たれるようにした。

最終溶液中にｐ−ベンゾキノンを１．０×１０−２Ｍ１
ハイドロキノンを１．０Ｘ１０−’Ｍを含ませるのに充
分な量のｐ−ベンゾキノンおよびハイドロキノンを添加
した。

所定量（容量単位）の反応媒質に酸量のグルコースオキ
シダーゼ／アルミナ複合体を添加し、そして、溶液中に
漬けた電極のポテンシャルの経時変化を、前記の電極系
を用いて追跡した。

ミリボルト値を読みとり、キャリブレーショングラフを
用いてそのときのハイドロキノンの濃度を測定した。

そして、試験溶液における濃度／時間の値をグラフ上に
プロットした。

かくして得られたグラフ上の曲線の初期勾配（１ｎｉｔ
ｉａｌ ５１ｏｐｅ ）は、固定された酵素の触媒作用
により進行したβ−Ｄ−グルコースの酸化反応の反応速
度を表わすものである。

酵素の活性度は次式から算出された。

前記の試験方法に従って、Ａ部であるグルコースオキシ
ダーゼ／アルミナ複合体の活性度を測定したが、その値
は１．０×１０３国際単位（グルコースオキシダーゼ）
／Ｃａｔ （グルコースオキシダーゼ／アルミナ複合
体）であった。

蒸留水中で４℃において１０日間貯蔵した後の活性度の
値は８．３×１０２国際単位（グルコースオキシダーゼ
）／ｉ（グルコースオキシダーゼ／アルミナ／複合体）
であった。

生物学的活性度の国際単位（１単位）は、基質を生成物
に１分間当り１マイクロモル （ｍｉｃｒｏｍｏｌｅ ）の速度で変換されるために要
する活性酵素の量として定義されるものである。

このグルコースオキシダーゼ／アルミナ複合体を「カナ
ダ特許出願第１０７２６３４号明細書の実施例１に記載
のグルコースの分析操作」のときに使用した。

精度、正確度および有効寿命の点からみて非常に良い結
果が得られた。

前記の操作においてジアミノプロパンおよびジブロモエ
タンの代りに、それに相当するモル量のジアミノブタン
およびメチレンジアイオダイドを用いた場合においても
同様に良い結果が得られた。

また、前記の操作においてジアミノプロパンおよびジブ
ロモエタンの代りに、それに相当するモル量のジアミノ
ペンタンおよびジブロモプロパンを用いた場合において
も、同様に良い結果が得られた。

例２ 固定されたグルコースオキシダーゼの調製−６０ないし
＋７０メツシユ（米国ふるい）の範囲内の粒子径および
０．１−０．２ ミクロンの平均空隙直径を有する粉末
状アルミナ５１を１１５０℃に２時間加熱した。

冷却後に、この粉末状アルミナを１．ＯＮのＨＣｌ に
１晩中浸漬した。

次いでこれを蒸留水で洗浄し、そしてこのアルミナを、
０．００１−ホスフェート緩衝液（ｐＨ６，０）が５０
Ｍ入っているビーカーの中に入れ、半時間後にグルコー
スオキシダーゼ液２５ｍ１を添加した。

このグルコースオキシダーゼ（Ａｓｐｅｒｉ ｌｌｉｇ
ｕｓｎｉｇｅｒ ）はピアス、ケミカル、カンパニーか
ら入手したもので、緩衝液（ｐＨ４，０）中に入ってお
り、その公称活性度は１０００国際単位／ｍｌであつｔ
もかくして得られたグルコースオキシダー七／アルミナ
混合物を３−８℃において半時間ゆるやかに攪拌した。

架橋反応液を、メタノール２ｏｍｌ、ジアミノプロパン
０．０１ｒｒＬ１１濃ＨＣＩ ０．１５ｍｌ、ジブロ
モエタン０．０３ｍ１および水１０ｍ１を室温において
約１５分間混合することにより調製した。

ジアミノプロパンとジブロモエタンとのモル比は約０．
３：１．０であった。

前記の前もって作られた反応液をグルコースオキシダー
ゼ／アルミナ混合物に０．１５−０．２０ｍ１１分の添
加速度で添加した。

この添加操作のときには磁力攪拌機を用いてゆるやかな
攪拌を行い、そして温度を３−８℃に１６−２０時間保
った。

かくして得られた固定されたグルコースオキシダーゼ／
アルミナ複合体を蒸留水２１で洗浄し、次いでこれを、
試験を行うまで蒸留水中で貯蔵した。

試験方法は例１の場合と同一であった。

この複合体試料の活性度は２．３Ｘ１０＋”国際単位／
ｍｌ（固定されたグルコース／アルミナ複合体）であっ
た。

このグルコースオキシダーゼ／アルミナ複合体を「１９
７４年６月１０日に出願された米国特許出願第４７７９
２２号明細書中の実施例３に記載のグルコースの分析操
作」に使用した。

精度、正確度、有効寿命からみて非常に良い結果が得ら
れた。

例３ Ａ部（収着されたウレアーゼ） ウレアーゼ（ウオーシングトン、バイオケミカル、コー
ポレーションから市販されており、そして６３１．Ｕ、
／■の初期活性度を有するジャックビーン、ミール）を
粉末状の多孔性アルミナ担体の上に次の方法に従って固
定した。

ウレアーゼ１００１ｎＩｊと粉末状アルミナ１．０ Ｐ
とをトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタンの０．０
１ Ｍ溶液（希ＨＣＩまたは希ＮａＯＨによりｐＨ値を
８．２に調節、維持したもの）の中で、４０℃において
１時間攪拌、混合した。

この粉末状アルミナの粒子径は−５０ないし＋１００メ
ツシユ（米国ふるい）の範囲内にあり、平均空隙直径は
約０．１−０．２ミクロンであった。

このようにして固定されたウレアーゼ／アルミナ反応生
成物を０℃において１晩中放置した。

前記の固定されたウレアーゼ反応生成物を次いで焼結ガ
ラス漏斗で沢過し、０．５ Ｍ −Ｎａ Ｃ１５００ｒ
ｒＬｌで洗浄しく第１洗浄）、其後に蒸留水１−２Ｊで
洗浄した（第２洗浄）。

水洗後の、固定されたウレアーゼ反応生成物を、それを
所望用途において使用するまで、０．０１Ｍ−４リス（
ヒドロキシメチル）アミノメタン緩衝液１Ｏ−２ＱＴＬ
ｌ中に入れて貯蔵した。

米国特許第３９２６７３４号明細書に記載の方法に従っ
て、前記の固定されたウレアーゼ／アルミナ生成物の初
期活性度を調べたところ、その値は１．５Ｘ １０３Ｉ
、Ｕ、／ｃｉであることが見出された。

この生成物を１１日間貯蔵した後に、該生成物を緩衝液
の連続流の中に１日間さらした。

其後に活性度を調べたところその値は６１１．Ｕ、／−
であった。

Ｂ部（アルカンシバライドで架橋されたもの）■・２−
ジブロモエタン０．２５ｍ１をメタノール２０ＴＩｌｌ
で希釈することにより１・２−ジブロモエタン溶液を作
った。

このジブロモエタン溶液を０．０１Ｍ−トリス（ヒドロ
キシメチル）アミノメタン液（緩衝剤によりｐＨ値を８
．２に調節したもの）２００ｍｌに添加した。

かくして得られた溶液に、必要に応じて希ＨＣＩまた希
ＮａＯＨを滴下することにより、前記溶液のｐＨ値を８
．２に調節、維持した。

ウレアーゼ１００■および多孔性アルミナ粉末１．１’
（Ａ部において使用されたアルミナ粉末と同じもの）を
、前記の緩衝剤含有ジブロモエタン溶液に、温度を４０
℃に維持しながら攪拌下に徐徐に添加した。

この反応混合物を４０ ’Ｃにおいて１時間攪拌し、そ
して０℃において１晩中放置した。

濾過、洗浄後に、前記の固定されたウレアーゼ／アルミ
ナ複合体の初期活性度を調べたところ、その値は６．２
Ｘ １０２１．Ｕ、／ｃｒｉｌであった。

この生成物を１１日間保存した後に該生成物をＡ部の場
合と同様な条件のもとで流れの中に１日間さらし、そし
て活性度を調べたところ、その値は４，７Ｘ １０２Ｉ
、 Ｕ、 ｌｃｒ＆テアツｆ、：。

Ｃ部（アルカンジアミンにより架橋されたもの）Ｂ部で
使用されたジブロモエタン溶液の代りに１・３−ジアミ
ノプロパン０．７５ｍ１を用いたことを除いて、Ｂ部の
場合と同様な操作を繰返した。

かくして得られた固定されたウレアーゼ／アルミナ生成
物の初期活性度を、米国特許第 ３９２６７３４号明細書に記載の方法に従って調ヘタト
コロ、ソノ値ハ１．４ Ｘ １０３１．Ｕ、／７’Ｃ’
あった。

この生成物を１１日間貯蔵した後に、該生成物を緩衝剤
含有流の中に１日間置き、そして活性度を調べたところ
、その値は４．７Ｘ １０２Ｉ、Ｕ、／−であった。

Ｄ部（前もって形成されたアルカンジアミンとアルカン
シバライドとの溶液により架橋されたもの）Ｂ部の場合
と同様な操作を行った。

ただし此度はジブロモエタン溶液の代りに、１・２−ジ
ブロモエタン０．０２ｍ１および１・３−ジアミノプロ
パン０．０８ｍ１をメタノール２０ｍ１中に含む前もっ
て形成された反応液を使用した。

さらに、アルミナ５１およびウレアーゼ２５０■を使用
した。

このウレアーゼはウオシングトン、バイオケミカル、コ
ーポレーションから入手したものであって、その活性度
は約１６０１．Ｕ、／■であった。

したがって、この場合にはアルミナ１１当りウレアーゼ
が５０■存在していた。

これに対し、既述のＡ部、Ｂ部、Ｃ部では、前記ウレア
ーゼより活性の低いウレアーゼがアルミナ１１当り１０
０ｍｇ存在していた。

しかしながら、この４種の試料（Ａ部、Ｂ部、Ｃ部、Ｄ
部）において、アルミナ１１当りの活性ウレアーゼの量
は大体同じであったことに注目されたい。

すべての溶液は室温において製造したが、固定化反応は
Ｏ−５℃において１晩中進行させた。

かくして得られた固定されたウレアーゼ／アルミナ複合
体の初期活性度は１．２Ｘ １０” Ｉ、Ｕ、／ｍｌで
あった。

１週間後における活性度の測定値は９６２ Ｉ 、Ｕ、
／ｒｄ （アルミナ）であった。

この活性度測定操作の後に、この材料を用いてコラムを
作り、このコラムを、米国特許第３９２６７３４号明細
書に記載の尿素分析操作に使用した。

この実質的に連続的流動系において２２日間使用した後
でさえ、活性度の低下は全（認められなかった。

７７５種の試料（このうちの４５２種の試料は血清試料
であった）を分析する操作を行ったが、精度および正確
度の点からみて非常に良い結果が３週間にわたって得ら
れた。

このＤ部の場合には、固定されたウレアーゼは安定性を
有するものであったが、Ａ部、Ｂ部、Ｃ部の試料は、そ
れと同様な条件のもとで使用された後にその活性度がそ
れぞれ次の値に低下した：ＡＡ部８；Ｂ部９３；Ｃ部４
゜ 例４ この実験では担体材料として非多孔性アルミナを使用し
た。

この非多孔性アルミナは酸洗浄されたものであって、そ
の粒度はマイナス１００メツシユであった。

１６２Ｉ、Ｕ、／■の活性度を有するウレアーゼ４００
ｍｇを水２００ｒＩＬｌ中に溶解し、遠心分離操作を行
って、透明なうわずみ溶液を採取した。

この溶液を前記アルミナ約３ｚに添加し、かくして得ら
れた混合物を、その温度を約２℃に保ちながら１２時間
攪拌した。

化学的固定剤混合物を次の製法に従って製造した。

１・２−ジブロモエタン０．１ｍｌ、１・３−ジアミノ
プロパン０．１ ｍｌ、メタノール２０ｍ１および蒸留
水３０ｍ１を混合し、かくして得られた混合液に塩酸を
添加してｐＨ値を７．２５に調節した。

この場合のジアミノプロパン対ジブロモエタンの使用モ
ル比は約１：１に相当する値であった。

このようにして得られた薬剤混合液をウレアーゼ／アル
ミナ混合物に添加し、これによって得られた組成物をさ
らに１２時間約２℃に保った。

この製法により得られたウレアーゼ／アルミナ複合体を
最初に０．４ Ｍ −Ｎａ Ｃｌで洗浄し、次いで０．
ＯＯＩＭ−β−メルカプトエタノールで洗浄し、最後に
蒸留水で洗浄した。

洗浄後のウレアーゼ／アルミナ複合体生成物の活性度の
測定値は１３７ Ｉ、Ｕ、／ｍｌであった。

例５ 例１の場合と同様なアルミナ試料２ＣＪ？Ｃ粒度は−４
０ないし＋５０メツシユ（米国標準ふろい：を蒸留水４
１で充分に洗浄した。

このアルミナを真空フラスコ中に置き、そして２Ｘ１０
−”Ｍのトリス−マレエート緩衝剤［ｐＨ８，９：）リ
ス（ヒドロキシメチル）アミノメタンとマレイン酸とを
１：１のモル比で混合し、そして、ｐＨ値を所定の値に
調節するに充分な量のＮａＯＨまたはＨＣＩ を添加
して作ったもの〕を添加した。

水流アスピレータ−により真空を適用し、そして半時間
にわたって前記フラスコを定期的にしんとうした。

次いでこの緩衝液をげいしやにより排出し、そして同様
な組成の新鮮な緩衝液３００ｍ１を添加した。

コノトリス−マレエート緩衝液１２０ｍ１中にウレアー
ゼ１グを溶かし、遠心分離操作をｓｏｏ。

♂の遠心力のもとで２０分間行った。

このウレアーゼ溶液を前記のアルミナ緩衝溶液に添加し
、この混合物を０−６℃において半時間烈しくしんとう
した。

１−２−ジブロモエタ７０．０８ｍ１および１・３ジア
ミノプロパン０．３２ｍ１をメタノール８０ ｍｌおよ
び蒸留水４０ｍ１の中に溶解することにより架橋反応液
を調製した。

すなわちこの場合には、ジアミノプロパンとジブロモエ
タンとが約４：１０モル比で使用された。

この反応混合物を半時間攪拌し、ｐＨ値を塩酸により約
８に調節した。

この架橋反応混合物を次いでウレアーゼ／アルミナ複合
体混合物に、穏和な攪拌下に温度をＯ−６℃に維持しな
がら徐々に添加した。

この温度、攪拌条件を約１５時間維持した。

前記期間経過後にウレアーゼ／アルミナ複合体を沢過し
、２．０Ｘ１０ Ｍ＝トリス−マレエート緩衝液（
ｐＨ７，０；これはＮａＣ１１，ＯＭおよびＥＤＴＡ５
．Ｏｘｌｏ−３Ｍを含むものである）１−２１で洗浄し
た。

洗浄後の新鮮なウレアーゼ／アルミナ複合体の初期活性
度は２．２Ｘ１０＋２Ｉ 、 ［Ｊ、 ／ｍｌであった
。

前記の方法に従って１連の１５種の実験を行った。

この１連の実験ではアルミナの粒子径（メツシュ）を約
４０メツシユから約１００メツシユまでの範囲にわたっ
て種々変えた。

使用したウレアーゼは種々の供給源から得られたもので
あって、その酵素活性度は５０−１６０ Ｉ、Ｕ、／■
であつた。

この１５種の実験において得られたウレアーゼ／アルミ
ナ複合体の初期活性度は約１００Ｉ、Ｕ、／ｆｆｌカラ
約７５０ Ｉ 、Ｕ、／ｉミノ囲内ニワたっていたが、
或１つの試料は５２ Ｉ 、 Ｕ、 ／ｍｌという低い
活性度を有し、また、１３７０ Ｉ 、Ｕ、／ｍｌｌと
いう高い活性度を有するものもあった。

これらの実験において（東アルミナの化学的耐久力を一
層増すためにアルミナを約１０５０−１１００℃に数時
間加熱することが好ましい場合もあった。

しかしながら、このような高温への烈しい加熱は空隙率
を低下させ、かつ平均空隙直径の値を変化させる場合も
あり得る。

例に の実施例は、既述の実施例に記載の架橋方法の効果と、
この架橋により与えられたウレアーゼ／アルミナ複合体
の安定性とを実際に評価する方法を例示したものである
。

例３中のＤ部に記載の方法に従って製造された＋３７ｏ
■、ｕ、／ｉの初期活性度を有するウレアーゼ／アルミ
ナ複合体の一部を管内に詰めて床を作った。

このコラムは内径（内部直径）２．８ｍｍ、外径６間の
７５ｍ１１Ｄ硼珪酸塩ガラス管であった。

酵素成分を保持するためにコラムの１端に４００メツシ
ユナイロンスクリーンを取付けた。

このコラムを、米国特許第３９２６７３４号明細書の添
付図面第１図に記載の尿素分析装置に取付けて使用した
。

０．０１Ｍのトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン
を希釈して作った緩衝液（これは、エチレンジアミンテ
トラ酢酸ジナトリウム１０−３Ｍ、 ＮａＣ１０，０９
Ｍ、 ＮＨ，Ｃ１１０−５Ｍを含むものである）を、こ
の系の中をポンプにより１．３ｍｌ／分の速度で通過さ
せた。

ベース流（ｂａｓｅ ｓｔｒｅａｍ ）は０．０３Ｎ−
水酸化ナトリウムからなるものであって、その流速は１
．３ｍ４／分であった。

尿素標準溶液の種々の試料〔その容積は２０マイクロリ
ットル；尿素含有量は１４■または７０■（尿素）／１
００ｍＡ、ｌを酵素コラムの頂部から緩衝液流中に注入
した。

電極応答値を記録し、そして電子検出器（ｅｌｅｃｔｒ
ｏｎｉｃｄｅｔｅｃｔｏｒ ） のキャリブレーション
を行った。

約３週間にわたる期間中に、全部で１２１５個の試料を
このコラムに入れた。

そのうちの７００個は血清試料であり、５１５個は水性
尿素試料であった。

この期間中コラムを常に室温に保った。この実験期間の
終末期に１００■（尿素）７１００ｍ１（標準溶液）か
ら採取した１０マイクロリツトル試料をコラムに入れた
。

誤差範囲内の１００ｍ９（尿素）／ｘｏｏｙという測定
値が検出器により記録された。

さらに、この長期間使用の後でさえ、このコラム材料は
、この試料中の尿素を完全に加水分解し得る程度の充分
に高い活性度をもっていた。

このように、ウレアーゼ／アルミナ生成物に架橋を行う
ことは格別顕著な効果をもたらすものである。

アルミナが０．００２−０．５ミクロンの範囲内の空隙
寸法分布を有するものであったことを除いて、例５記載
の方法と同様な方法に従って製造された３種のウレアー
ゼ／アルミナ複合体の活性度を調※※べ、次いでこの複
合体を用いてコラムを作り、このコラムを、米国特許第
３９２６７３４号明細書に記載の尿素分析操作のときに
使用した。

水性尿素溶液（既知濃度のもの）および血清の種々の試
料を約１−２週間の期間にわたってコラムの頂部から入
れた。

このコラムは、実際に使用していないときには、室温に
おいて０．０１Ｍ−４リス（ヒドロキシメチル）アミノ
メタン緩衝液（ｐＨ７，０）の存在下に維持した。

この緩衝液はエチレンジアミンテトラ酢酸のジナトリウ
ム塩を約１×１０−３Ｍ含むものであった。

コラム通過時に１００％変換し得る「尿素の最高濃度」
を測定することにより、この酵素組成物の効力を評価し
た。

その結果を次の第１表に示す。例７ この実施例は、アルミナ上にグルコースオキシダーゼを
固定するために使用される薬剤中のジアミノプロパンと
ジブロモエタンとのモル化の値を種々変えたときの影響
を調べるために行われた一連の実験の結果を示したもの
である。

これらの実験は既述の実験と大体同じ方法に従って行わ
れた。

すなわち、−６０ないし＋７０メツシユの粒子径および
０．１４ ミクロンの平均空隙直径を有するアルミナ１
１を、１．０Ｎ−ＨＣＩ 溶液２５２５−３Ｏの入っ
ているフラスコに入れ、このフラスコに水流アスピレー
タ−により半時間真空を適用することによりこのアルミ
ナの脱気を行った （ ｄｅａｒｅａｔｅｄ ）。

げいしやによりＨＣＩ をアルミ゛すから分離し、脱
イオン蒸留本釣２０２０−３Ｏを用いてアルミナ粉末を
５０ｍ１ビーカーの方に移した。

ＨＣＩ によりｐＨ７，０に調節されたトリス（ヒド
ロキシメチル）アミノメタン緩衝液２５ｍ１中にグルコ
ースオキシダーゼ約２５■を溶解した。

この酵素溶液を、前記のアルミナを含むビーカー中に注
ぎ入れた。

かくして得られた混合物を室温においてゆるやかに半時
間攪拌シタ。

■・３−ジアミノプロパン０．０８ｍ１．所望量の１・
２−ジブロモエタン（第２表参照）、メタノ−／１／
１０ ｍｌ、水５ｍｌおよび濃ＨＣＩ ０．１５ｍｌ
を混合することにより、「前もって形成された反応液」
を製造した（ただし、試料のうちの１つは別の方法で製
造した；後記参照）。

この薬剤混合物を１度に前記酵素／アルミナ混合物に添
加し、かくして得られた混合物を室温において１晩中ゆ
るやかに攪拌した。

しかしながら或１つの実験（実験７Ａ）においては、「
前もって形成された反応液」を作るためにジブロモエタ
ン８．２７Ｔｔｌ、ジアミノプロパン０．０８ＴＬｌ、
Ｈ２Ｏ１０ｍｌおよびメタノール１０ｍ１を混合したと
きに２層混合物が生じた。

有機相約２０ｍ１中の溶液１０ｍ１を使い、これに濃Ｈ
ＣＩ ０．１５ｍ１を添加し、この混合物を前記の酵
素／アルミナ試料に添加し、１晩中室温において攪拌し
た。

この実験７Ａにおいて認められた重要なことは、この場
合には反応液は有機相中に存在するであろうと解釈され
やすいということである。

しかしながら第２表に示されているように、良い結果は
得られなかった。

他のいくつかの実験においては、水性混合物中に「前も
って形成された反応液」の他に少量の有機相もまた認め
られた。

これは多分ジブロモエタン※ンの溶解度に関する制限に
よるものであろう。

しかしながらこの混合物全部が酵素／アルミナ混合物に
移され、前記有機相の存在に起因する好ましくない影響
は全く認められなかった。

各々の実験において酵素／アルミナ複合体は脱イオン水
１−２１で洗浄した。

そして活性度を測定するまでこれを脱イオン蒸留水５ｍ
ｌ中で０−５℃において貯蔵した。

固定化された酵素／アルミナ複合体の活性度は例１０Ｂ
部に記載の方法に従って測定した。

ジアミンとシバライドの比率の変化が複合体の初期活性
度の値に及ぼす影響、ならびに脱イオン蒸留水中で２箇
月間保った後の活性度の値を次の第２表に示した。

例８ ここで使用した枝体材料は、コマーシャル、フィルター
ズ、コーポレーションから入手したポリエステル繊維で
あって、これは標準ハニコウム巻フィルターカートリッ
ジ（５ｔａｒｄａｒｄ Ｈｏｎｅｙｃｏｍｂｗｏｕｎｄ
ｆｉｌｔｅｒ ｃａｒｔｒｉｄｇｅ ）の形をしたも
のであった。

すなわちこの繊維は中空円筒状プラスチック芯に巻かれ
たフィルターカートリッジの形をしたものであった。

このカートリッジの長さは約１０インチ、内径は１．０
インチ、外径は２．５インチであった。

したがってこの繊維の壁部（ｆｉｂｅｒｗａｌｌ ）の
厚さは約０．７５インチであった。

このフィルターは、流体の流れから５ミクロンないしそ
れ以上の寸法の粒子の９５％を除去できるように設計さ
れているものであった。

この型のフィルターチューブは化学処理分野において広
く使用されている。

ベリー編「ケミカル、エンジニャーズ、ハンドブック」
（第５版）の第１９章、第８３頁−第８５頁には、この
ようなフィルターチューブを用いた沢過系が記載されて
いる。

パパインをウオシングトン、バイオケミカル、コーポレ
ーションから入手した。

このパパインは基質（カゼイン）に対して２．９Ｉ、Ｕ
、／■の活性度を有するものであった。

このフィルターチューブを洗剤水溶液で洗浄した。

このチューブを２１容量の目盛付円筒（ｇｒａｄｕａｔ
ｅｄ ｃｙｌｉｎｄｅｒ ） 中に懸濁し、そして洗
浄液を磁力攪拌機により約１５−１８時間（すなわち１
晩中）攪拌した。

前記洗剤溶液を流出させ蒸留本釣１１を加えそして攪拌
を２０−３０分間行うことからなるすすぎ操作を行った
。

このすすぎ操作を、さらに６倍の量の蒸留水を用いて繰
返した。

同様な方法に従って、このフィルターチューブを次いで
３Ｍ＝塩化ナトリウム液８００ｍ１で１時間洗浄し、そ
して蒸留水を用いて３回すすぎ操作を行った。

このフィルターチューブを最後に０．００２Ｍ−ラクテ
ート緩衝液（ｐＨ３，５：０、ＯＩＭ−硫酸亜鉛を含む
もの）で２回洗浄した。

このラクテート−硫酸亜鉛緩衝液は次の方法に従って作
られたものであった。

最初に８５％乳酸溶液２．１２Ｐを蒸留水５００ｍ１中
に溶かし、そのｐＨ値を０．ＩＮ−水酸化ナトリウム液
により３．５に調節した。

この溶液を次いで全容積が１１になるまで希釈した。

このラクテート溶液の１００ｍ１アリコツト（ａｌｉｑ
ｕｏｔ ）を０．１ Ｍ−硫酸亜鉛溶液１００ｒＩｌｌ
と混合し、この混合物を１１になるまで希釈した。

この希釈溶液が最終ラクテート−硫酸亜鉛緩衝液であっ
た。

このフィルターチューブを前記シリンダー中に懸濁し、
そして新鮮な緩衝液Ｂｏｏｍｌを添加した。

約５℃に冷却した後に、連続的に攪拌しながら全量５０
０１ｎ９のパパインを少量づつ添加した。

この温度において攪拌を１５分分間性た。

水４０ｍ１とスペクトル級メタノール（ｓｐｅｃｔｒａ
１ｇｒａｄｅ ｍｅｔｈａｎｏｌ ） １６ Ｏｍｌ
とからなる溶媒に１・３−ジアミノプロパン０．０１ｍ
１および１・２−ジブロモエタン１．８ ｍｌを溶かす
ことにより酵素固定用反応液を作った。

ジアミノプロパン対ジブロエタンのモル比は０．０１
： １．０であった。

ｐＨ値は濃塩酸で４．０±０．５に調節した。

この緩衝液の温度がＯ−５℃の範囲に充分維持できるよ
うに前記の酵素−フィルターチューブ緩衝剤系を充分冷
却し、磁力攪拌機による攪拌を行った。

次いで、酵素を化学的に固定するための固定用反応液を
室温において１ｍ１１分の割合で添加した。

攪拌を０−５℃において１５−１８時間（すなわち１晩
中）続げた。

ｐＨ値は３．６であった。

硫酸亜鉛０．００１Ｍおよび塩化す） ＩＪウム３、Ｏ
Ｍを含む０．ＯＩＭ−）リス−マレエート緩衝液８００
ｍ１を用いて既述の洗浄方法に従ってフィルターチュー
ブを２回洗浄した。

この緩衝液のｐＨ値は６．０であった。

この溶液中でフィルターチューブを、分析または基質変
換反応に使用するまで０−５℃において貯蔵した。

活性度の測定 前記のフィルターチューブを貯蔵液中から取出し、そし
て０．０５Ｍ−に２ＨＰＯ４８００ｍ１゜０．１Ｍ−ジ
チオトレイトール（ＤＴＴ）８．Ｏｍｌおよび０．１Ｍ
−エチレンジアミンテトラ酢酸（ＥＤＴＡ）８．Ｏｍｌ
からなる溶液で１５分洗浄した。

活性度の測定は主としてワイスラーおよびガーザの論文
Ｃｒ Ａｍ、 Ｓｏｃ、 Ｂｒｅｗｉｎｇ Ｃｈｅｍｉ
ｓｔｓ。

ｐｒｏｃ、Ｊ第２２５頁−第２３８頁（１９６５年）〕
に記載の測定方法に従って行った。

前記引用文献に記載の方法に従ってカゼイン基質溶液を
作り、そしてこの溶液８００ｍ１に０．１Ｍ−ＤＴＴ８
．ＯｍｌおよびＯ，ＬＭ−ＥＤＴＡ８．Ｏｍｌを添加し
た。

この溶液を室温に保ち、そして洗浄後のフィルターチュ
ーブ（固定されたパパインを含むもの）をその中に懸濁
した。

この溶液を磁力攪拌機により攪拌した。

基質溶液の各５ｍｌアリコツトをフィルターチューブと
接触させて、１分、５分、１０分、２０分、３０分およ
び６０部間隔で抽出した。

各アリコツトにトリクロロ酢酸の３０％溶液３ｍｌおよ
び水２ｍｌを添加した。

これらの試料を４０℃に３０分間加熱し、そして２ミク
ロンフィルターで沢過した。

ｐ液の光学濃度（ｏｐｔｉｃａｌ ｄｅｎｓｉｔｉｅｓ
）を２７７ｎｍのところで測定し、カゼインの加水分
解生成物（チロシンを含むもの）の濃度を、キャリブレ
ーショングラフを用いて測定した。

試料中のチロシン濃度を時間に対してグラフ上にプロッ
トすることにより直線が得られた。

この直線の勾配は、固定されたパパインによるカゼイン
の加水分解の速度を表わす。

この結果を用いてフィルター１個当りの国際単位を求め
た。

この国際単位は、１分当りのチロシンの生成量（当量マ
イクロモル）として定義されるものである。

既述のフィルターチューブについては、活性度は１９．
８国際単位であった。

例９ ラクテート緩衝液のｐＨ値を４，５に調節したこと、お
よびジアミノプロパン／ジブロモエタン反６混合物を添
加する前にパパイン溶液をフィルターチューブの存在下
に半時間攪拌したことは除いて、例８記載の場合と同じ
方法および同じ量の原料物質を用いて操作を行った。

このようにして固定された酵素複合体を含むフィルター
チューブの初期活性度は３８．５国際単位であった。

Ｏ−５℃において緩衝液中で４日間貯蔵した後の活性度
は１８．６ Ｉ、Ｕ、／フィルターであった。

例１０ 繊維がオーロン（デュポン社製のアクリロニトリル系重
合体）から作られたものであったことを除いて、例８記
載のフィルターチューブと同じものを酵素担体材料とし
て使用した。

このフィルターチューブを３Ｎ−ＨＣＩ 中に１晩中
浸漬してサイジング剤および他の表面処理剤を除去した
。

次いでこのフィルターチューブを蒸留水で４回洗浄し、
其後に３．０ Ｍ −ＮａＣｌ溶液を攪拌しながらその
中に前記フィルターチューブを１時間懸濁した。

このフィルターチューブを再び蒸留水で４回洗浄し、最
後にｐＨ４ｙ５のラクテート／硫酸亜鉛緩衝液で２回洗
浄した。

このフィルターチューブを前記緩衝液８００ｍ１中に懸
濁し、次いでＯ−５℃に冷却し、ワラ−スタインパパイ
ン（０，０５５Ｉ、 Ｕ、／■）を少量づつ添加した。

かくして得られた混合物を半時間攪拌し、そしてこの系
の温度をＯ−５℃に維持しながら連続攪拌下に化学固定
用反応液を１．０ｍ１１分の添加速度で添加した。

この固定用反応液は１・３−ジアミノプロパン０６０１
７７１１１１・２−ジブロモエタン１．８ ｍｌ、蒸留
水４Ｃ）ｍｌ、スペクトル等級のメタノール１６０ｒｎ
ｌからなるものであった。

この場合のジアミノプロパン対ジブロモエタンのモル比
は０．０１：１．０であった。

反応を１５−１８時間（１晩中）進行させた。

この時間の後の反応液のｐＨ値は５．０であった。

この固定された酵素／フィルターチューブ複合体を洗浄
し、そして例８記載の方法に従って活性度を調べた。

初期活性度は３８８国際単であった。３０日間緩衝液中
で０−５℃において貯蔵した後の活性度は１１．６国際
単位であった。

例工１ 繊維がダイネル（登録商標；ユニオン、カーバイド、コ
ーポレーションにより作られたビニルクロライドとアク
リロニトリルとの共重合体）から作られたものであった
ことを除いて、例８記載のものと同じ構造および寸法を
有する繊維巻回フィルターチューブ（ｆｉｂｅｒ ｗｏ
ｕｎｄ ｆｉｌｔｅｒ ｔｕｂｅ ）を、酵素担体材料
として使用した。

このフィルターチューブを３Ｎ−ＨＣＩ 中に１晩中
浸漬してサイジング剤および他の表面処堆済りを除去し
た。

例８記載の方法に従ってラクテート／硫酸亜鉛緩衝液（
ｐＨ４−５）で２回洗浄した後に、このフィルターチュ
ーブをこの緩衝液中に懸濁し、酵素を含浸させ、そして
化学固定用反応液を添加した。

酵素固定操作および活性度測定操作は例９記載の方法と
同様な方法に従って行った。

ただし比変（東固定用反応液添加前にパパイン溶液をフ
ィルターチューブと接触させて２時間攪拌した。

このフィルターチューブの初期活性度は３０．４国際単
位であった。

２４日後のフィルターチューブの活性度は２．９国際単
位であった。

それから２１日経った後には、すなわち製造してから４
５日後には、活性度は５．７国際単位であった。

これらの活性度測定試験を行うまでの間は、この固定さ
れた酵素／フィルターチューブ複合体はＯ−５℃におい
て緩衝液中で貯蔵した。

例１２ この実施例はラクテート緩衝液の不存在下において精製
パパインを固定する方法を例示したものである。

「ワラ−スタインパパイン９０」の２０１試料を０．Ｏ
ＩＭ−硫酸亜鉛溶液（ｐＨ４，５）２００ｍｌ中に分散
させた。

この分散液に１０．４００ｇ／ｓの遠心力を適用して遠
心分離操作を半時間行い、生じた沈殿を排出した。

うわずみ液を室温においてゆっくり攪拌しながらこれに
塩化ナトリウム６２．６ｚを添加した。

２時間後にこの混合物に１０、０００ ｇ’ｓの遠心力
を適用して遠心分離操作を２０分間行った。

うわずみ液は廃棄し、沈殿したパパインを０．ＯＩＭ−
硫酸亜鉛溶液８００ｍ１（希塩酸でｐＨ４，５に調節し
たもの）の中に溶解した。

このパパイン溶液をＯ−５℃に冷却し、そしてその中に
、例１１に記載の方法と同様な方法に従って製造された
フィルターチューブを懸濁した。

このとき攪拌を４５分間行った。

例１０記載のものと同じジブロモエタン／ジアミノプロ
パン反応液をこのパパイン／フィルター系に１．０ｍｌ
／分の添加速度で添加し、そして攪拌を１晩中続げた。

かくして得られた固定された酵素／フィルターチューブ
複合体を洗浄し、そして例８記載の方法に従って活性度
を測定した。

活性度は５８．６国際単位であった。

６日間貯蔵した後に再び活性度を測定したが、そのとき
の値は３９１．Ｕ、であった。

例１３ ワラ−スタインパパイン４００の５０１試料をｐＨ４，
５の０．０１Ｍ−硫酸亜鉛溶液４００ｒ／Ｌｅ中に分散
させた。

これに１６．３００ｇ’ｓの遠心力を適用して遠心分離
操作を半時間行い、生じた沈殿を除去した。

うわずみ液に塩化ナトリウム１２５．２１を徐々に添加
し、その結果得られた混合物を室温において２時間放置
した。

次いでこれに１６．３０（ｌの遠心力を適用して遠心分
離を４０分間行い、うわずみ液を廃棄し、パパイン沈殿
を前記硫酸亜鉛溶液８００ｍ１中に溶解した。

ダイネルフィルターチューブ（「ダイネル」は登録商標
）を例１１記載の方法に従ってＨＣＩ中に浸漬し、ｐＨ
４，５の０．０１ Ｍ−硫酸亜鉛溶液で１時間洗浄した
。

次いでこれを前記パパイン溶液（Ｏ−５℃に冷却したも
の）中に懸濁した。

このｐＨ値をＩＮ−水酸化ナトリウム液で４．８に調節
した。

このパパイン溶液を４５分間攪拌し、酵素固定用反応液
を１．Ｑｍｌ／分の添加速度で添加した。

この固定用反応液は１・３−ジアミノプロパンｏ、０１
ｍｌ、 １ ・２−ジブｏ−ローエタン１．８ｍ１１
０．００５Ｍ−乳酸液４０ｍ１およびスペクトル等級の
メタノール１６０ｍ１からなるものであって、そのｐＨ
はＨＣＩ で３．３に調節した。

ジアミノプロパン対ジブロモエタンのモル比は０５０１
対１．０であった。

約１５−１８時間（１晩中）経った後に、この固定され
た酵素／フィルターチューブ複合体を０．０１Ｍ−）リ
ス−マレエート緩衝液８００ｍ１で２５分間洗浄した。

この０．ＯＩＭ−）リス−マレエート緩衝液は硫酸亜鉛
０．ＯＯＩＭおよび塩化ナトリウム１．０Ｍを含むもの
であって、そのｐＨは６．０であった。

このフィルターチューブを其後に前記緩衝液と同様な緩
衝液（たたし、塩化ナトリウムを含んでいないもの）で
１５−３０分間にわたって２回洗浄した。

これをその活性度を測定するまでこの緩衝液の中でＯ−
５℃において貯蔵した。

このフィルターチューブの活性度を例８記載の測定方法
に従って測定したところその値は１０９国際単位であっ
た。

緩衝液中で１箇月間貯蔵した後の活性度は９４４国際単
であった。

例１４ 繊維がオーロンであったことを除いて例８記載のフィル
ターチューブと同じものを、酵素担体材料として用いた
。

このフィルターチューブを最初に洗剤溶液で洗浄し、次
いで３Ｎ−ＨＣＩ 中に２日間入れた。

すなわち、このＨＣＩ溶液を攪拌しながらその中にこの
フィルターチューブを懸濁させた。

脱イオン蒸留水で数回すすいだ後に、このフィルターチ
ューブを０．０１Ｍ−硫酸亜鉛溶液中でＯ−５℃におい
て約１＋時間放置した。

酵素溶液は次の製法に従って製造した。

最初に「ワラ−スタインパパイン４００Ｊ５０Ｐを再結
晶した。

この再結晶は次の再結晶方法に従って行った。

該酵素を０． ＯＩ Ｍ−硫酸亜鉛液４００ｒｆＬｌと
混合し、１４．０００ｇ’ｓの遠心力を適用して遠心分
離操作を半時間行った。

そのうわずみ液にＮａＣ１１２５，２？を徐々に添加し
、この混合物を再遠心分離操作実施前に室温において２
時間放置した。

再遠心分離操作により生じた沈殿を、３ＮＨＣＩ に
よりｐＨ４，８に調節した０、ＯＩＭ−硫酸亜鉛液８０
０ｍ１に溶解し、そしてフィルターチューブをその中に
浸漬した。

必要に応じてｐＨ値を再び４．８に調節し、そしてこの
系を冷却室（ｃｏｏｌｉｎｇ ｂａｔｃｈ ）中で０−
５℃に４５分間保った。

メタノール１６０ｒｎｌにジブ０−Ｅメタン３．９ ｍ
１１０．００５Ｍ−乳酸水溶液４０７７１１１１・３−
ジアミノプロパン０．０３１ｒＬｌを添加し、そしてｐ
Ｈ値を３．２に調節するに充分な量の塩酸を添加するこ
とにより酵素固定用溶液を作った。

ジアミノプロパン対ジブロモメタンのモル比は０．００
６４：１．０であった。

この溶液を前記のフィルターチューブ−酵素系に１．Ｑ
ｍｌ／分の添加速度で添加した。

この薬剤の添加後に、攪拌および冷却を１晩中続げた。

次の日にはｐＨ値が４．５になっていた。このフィルタ
ーチューブを次の洗液の各々（８００ｍので順次洗浄し
た：（１）硫酸亜鉛０．００１ＭおよびＮａＣ１１，０
モルを含む０．０１Ｍトリス−マレエート緩衝液：（２
）硫酸亜鉛を０．００１Ｍ含む０．０１Ｍ−トリス−マ
レエート緩衝液〔緩衝液（２）は１６００ｍ１作り、各
回８００ＴＬｌづつ用いて洗浄操作を２回行った〕。

このフィルターチューブを、最後に述べた洗液と同じ組
成の洗液３−４１中で貯蔵した。

これは。その活性度を測定するまでＯ−５℃に保った。

このフィルターチューブの活性度を例８記載の測定方法
に従って測定した。

活性度は５１国際単位であった。

例１５ ７０ないし＋８０メツシユの粒子径を有する多孔性アル
ミナ試料３１を１０５０ ’Ｃにおいて４５分間焼成し
た。

冷却後に、このアルミナ粉末に蒸留水を加えて水性スラ
リーを作り、このスラリーを長さ３０．５ｃｒｒＬ、直
径２．０間のコラムに充填した。

ウレアーゼ４００ｍ９を水２００ｍ１と混合し、遠心分
離操作を行って不溶性懸濁物質を除去した。

透明なうわずみ液（ｐＨ５，６）を２℃に冷却し、ぜん
動ポンプ（ｐｅｒｉｓｔａｌｉｃ ｐｕｍｐ ） に
より前記コラム中を通過させることからなる溶離操作を
行った（ ｅｌｕｔｅｄ ）。

このとき系は低い温度に保った。ウレアーゼ溶液がコラ
ムを通じて０．９ ｒｒＬｌ／分の速度で溶離された。

其後にこの溶離生成物を、前もって形成された酵素固定
用反応液のコラムを通過させることにより収着ウレアー
ゼの化学的固定が行われた。

この「前もって形成された酵素固定用反応液」は１・２
−ジブロモエタン０．１ｍｌ、１・３−ジアミノプロパ
ン０．４ ｍｌ、メタノール２０ｍ１．水３０ｍ１と、
ｐＨ値を７，２５に調節するに充分な量の濃ＨＣ１とか
らなるものであった。

ジアミノプロパン対ジブロモエタンのモル比は４．０：
１．０であった。

この混合物をコラム中を室温において５時間を要して徐
々に通過させることからなる緩速度溶離操作を行った。

次いでこのコラムを次の方法に従って洗浄した。

最初に０．５ Ｍ−ＮａＣ１４０ｍｌで洗浄し、次いで
０、ＯＯＩＭ−β−メルカプトエタノール液１０ｒｆＬ
ｌで洗浄し、最後に水５０ｒＩＬｌで洗浄した。

このコラムの活性度を測定したところ、その初期活性度
は１．ＯＸ １０” Ｉ、Ｕ、／ｉ（固定された酵素複
合体）より大きい値であることが判った。

このコラムを蒸留水中で貯蔵し、そして２日後に再び活
性度測定実験を行った。

この場合にはこれを、β−メルカプトエタノール、エチ
レンジアミンテトラ酢酸およびナトリウムアジドを各々
０．００１モルづつ含む溶液で洗浄し、そして該溶液の
存在下に活性度を測定した。

後者の場合の活性度もまたｉ、０：：ｘ １０＋３１．
Ｕ、 ／ｉ（固定された酵素複合体）より大きいことが
見出された。

以上本発明の詳細な説明したが、本発明の構成の具体例
を述べれば次のとおりである。

（１） アルカンジアミンとアルカンシバライドとの
モル比が約０．００５：１〜約１０００：１の範囲内に
あるものを使う、前記特許請求の範囲に記載の方法。

（２）反応液として水性溶液を使う前記特許請求の範囲
に記載の方法。

（３）酵素を担体に付着させた後、反応液と接触させて
行う、前記特許請求の範囲に記載の方法。

（４）反応液として水混和性有機溶媒を含むものを使う
、前記特許請求の範囲に記載の方法。

（５）担体として、耐火性酸化物粉末を圧密、焼結させ
た多孔性マトリックスを使う、前記特許請求の範囲に記
載の方法。

（６）複体として繊維状のものを使う、前記特許請求の
範囲に記載の方法。

（７）酵素を担体に付着させて酵素／担体複合体を形成
し、 Ｃ１−ｔＯアルカンシバライドとＣ１−１０アルカンジ
アミンとの「前もって形成された反応液」と前記複合体
とを接触させ、 酵素を化学的に固定するのに充分な温度で充分な時間、
前記複合体と前記反応液との接触状態を保つ ことから戒る、前記特許請求の範囲に記載の方法。

（８）酵素としてグルコースオキシダーゼを使う、前項
（７）に記載の方法。

（９）酵素としてウレアーゼを使う、前項（７）に記載
の方法。

（１０）酵素としてパパインを使う、前項（７）に記載
の方法。

０υ 反応液として水性溶液を使う、前項（７）に記載
の方法。

（１２）アルカンシバライドおよびアルカンジアミンと
して、それぞれ炭素原子１〜６個を含むものを使う、前
項（１０）に記載の方法。

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. １ 酵素と、酵素担持のために充分な表面積を有する不
   活性で寸法の安定な多孔性担体と、化学的固定剤とを、
   酵素を担体上に化学的に固定するのに充分な温度で充分
   な時間、接触状態に保つことにより担体上に酵素を固定
   する方法において、前記化学的固定剤として、ｃｌ−１
   ０アルカンジアミンとｃｌ−１０アルカンシバライドと
   の「前もって形成された反応液」を使うことを特徴とす
   る前記の酵素固定方法。