JPS5848064B2

JPS5848064B2 - 尿構成物質類の分析方法

Info

Publication number: JPS5848064B2
Application number: JP1046179A
Authority: JP
Inventors: 宏行宮城; 芳矩高田; 順吉三浦; 守滝
Original assignee: Hitachi Ltd
Current assignee: Hitachi Ltd
Priority date: 1979-02-02
Filing date: 1979-02-02
Publication date: 1983-10-26
Also published as: JPS55103462A

Description

【発明の詳細な説明】本発明はイオン交換クロマトグラフイーによる尿構成物
質類の分析方法に係り、特に該方法に用いる溶離液の改
良に関する。

尿構成物質は約２０００成分にも耘よぶと云われ、しか
もこれら成分の多くは人体の病態に密接に関連し、特定
の病患に対して特異的に増減することが知られている。

従って、尿構成物質を分析することは、患者の病態診断
、治療むよび人工臓器の開発等に大きく寄与するものと
期待されている。

従来の分析方法として、尿中の個々の構成物質について
定量する吸光々度法や酢酸と酢酸アンモニウムの緩衝液
を溶離液として用いる陰イオン交換クロマトグラフイー
が一般に知られている。

しかし、前者の吸光々度法によるとき＆も共存する他の
戒分に妨害される場合もあり、また試料の前処理等に長
時間を要することもあって、尿構戒物質と生理的機能と
の相関々係を必ずしも明らかにできないという欠点があ
る。

他方、後者の陰イオン交換クロマトグラフイーは、試料
の前処理をほとんど要することなく尿本来の状態の１ヘ
で分析可能であること、１回の分析で得られる情報が極
めて多いため個々の成分の定性、定量分析とともに、尿
構成物質組或と病気との相関々係についても解析が可能
になるという利点があるが、現状では未だ以下の欠点が
避けられない。

すなわち、この方法の１つに、溶離液として酢酸と酢酸
アンモニウムの緩衝液を、検出器として紫外吸光々度計
をそれぞれ用いて溶離液の濃度を直線的に上昇させるこ
とを要旨とする濃度こう配溶離法によって尿構成物質を
分離、展開する方法が知られているがＣＣｔＤ
ｔＳｃｏｔｔ外３：Ａｍ，Ｊ，Ｃｔ：ｎ，Ｐａ
ｔｈ，５３，７０１（１８６８）〕、この方法によると
きは、１試料の分析に４０時間を費す等のため分析時間
が非常に長くなる上に、溶離液として用いる酢酸系の緩
衝液は紫外吸収を示すので、ベースラインの上昇にとも
なう検出精度の低下と検出波長の制限という欠点が避け
られない。

前記欠点を改善し、例えば２時間で尿構成物質約１００
成分を分離、検出する方法も開発されているが〔瀬田外
４：分化，７３，２７（１９７８），：］、この方法
による場合でも、分析結果を病態把握に利用するにはな
お・時間がか＼りすぎる上に、溶離液は酢酸系の緩衝液
を適用しているため紫外吸光上依然として問題がある。

前記紫外吸収上の問題点について布延するに、紫外吸光
々度計は他の検出器、例えばけい光検出器等に比して取
扱いが容易であること、反応試薬を要しないこと等の利
点があるため賞用されているが、検出波長は溶離液が紫
外吸収性の酢酸系緩衝液である場合には通常２５４
ｎｍと２８０ｎｍに限られ、他の領域、特に有
効とされる短波長側、例えば２３４ｎｍに吸収極
大のあるクレアチニン等の検出は不可能であった。

そのため、尿構成物質の組成と病態との関連をより詳し
く追求して行く上で限界があった。

本発明の目的は、前記従来技術の欠点をなくし検出精度
の向上と検出波長域の拡大並びに分析時間の大巾な短縮
化が可能な尿構成物質類のイオン交換クロマトグラフイ
ーによる分析方法を提供するにある。

前記目的を達成するため、本発明は、溶離液濃度を分析
時間の経過とともに変化させる所謂こう配溶離イオン交
換クロマトグラフイーを適用した尿構成物質類の分析方
法に釦いて、前記溶離液として塩化物とアセトニトリル
を含む水溶液を用い、該水溶液中の塩化物卦よびアセト
ニトリル濃度を連続的または段階的にそれぞれ０．００
１Ｍから３、ＯＭおよびＯ、１容量饅から３０容量％ｔ
で変化させることを特徴とする。

本発明に釦いて、分析の対象となる尿構成物質類は、尿
構成物質をはじめ生体関連物質、核酸等の各種有機酸を
広く含む。

渣た、分析方法は、溶離液を本発明構成とする以外は従
来のこう配溶離イオンクロマトグラフイーの手法、装置
をその渣＼適用すればよい。

な督、通常用いる陰イオン交換樹脂充填分離カラムの前
段に、陽イオン交換樹脂充填分離カラムを付加する等の
変型は必要に応じて実施すればよい。

溶離液の調整は、従来法に従って塩化物とアセトニトリ
ルをそれぞれ低濃度（アセトニトリルがＯの場合もある
）で含む水溶液（初期液）と高濃度で含む水溶液（最終
液）を用意し、これらをグラジエント装置で処理して溶
離液濃度を分析時間の経過とともに連続的に高めて行く
方法でもよく、１た、段階的に濃度を変えた溶離液を用
意臥これらを順次使用する方法でもよい。

前記溶離液の調整あるいは送液に先立って、塩化物むよ
びアセトニトリルを含渣ない水を一定時間送液すること
が分離カラムの平衡を保つ上から望捷しい。

溶離液の戒分として用いる塩化物は、水溶性の無機塩化
物から広く選択される八特に塩化アンモニウム、塩化ナ
トリウム、塩化カリウムが好ましい。

溶離液中の塩化物濃度は、分析時間の経過とともに０．
００１Ｍから３．０Ｍｔで変化させることが望捷し
い。

０．ＯＯＩＭより低濃度では本発明効果が十分でなく、
また３．０Ｍより高濃度ではカラムの再生を含む後処理
に時間を要する等のため好筐しくない。

１た、アセトニトリルの濃度は、分析時間の経過ととも
に０．１容量多から３０容量多！で変化させることが望
１しい。

０．１容量俸より低濃度では本発明効果が十分でた〈、
１た３０容量φを越えて使用しても格別効果の向上はな
い。

前記必須成分以外に、調整あるいは助剤として他の戒分
例えばメチルアルコールエチルアルコール等を添加
することは必要に応じて実施すればよい。

前記アルコール類の添加量は、分析時間の経過とともに
０．５容量多から３０容量多の範囲で変化させればよい
。

以下、図面に示す態様例により本発明をさらに詳しく説
明する。

第１図に示す装置は、本発明にも適用可能な従来の液体
クロマトグラフイーを示すもので、塩化物とアセトニト
リルを低濃度で含む水溶液（初期液）用貯槽ＩＡ，同高
濃度で含む水溶液（最終液）用貯槽ＩＢ，貯槽１Ａおよ
び１Ｂの溶離液を分析時間の経過に応じて混合調整する
ためのどラジエント装置８、グラジエント装置から導か
れる液を試料注入口３を経て分離カラム４に送るための
ポンプ２、分離カラム４から排出される液を遂次検出す
るための一般に紫外吸光々度計で代表される検出器５、
検出器５からの信号に基づいて作動する記録計６から主
として構威されている。

なお、図中７は検出後の排出液を、筐た９は水の注入口
を示す。

前記構成の装置に釦いて、試料注入口３から供給される
尿等の試料＋４注入口９、ポンプ２を介して送られる水
で予め平衡とされた分離カラムに導かれ、その構成成分
は該カラムに充填された陰イオン交換樹脂に吸収される
。

しかる後にグラジエント装置８を始動させ、かくするこ
とにより、陰イオン交換樹脂に吸収された尿構成物質は
それぞれの戒分に分離されて順次検出器５に到達し、こ
こで各成分の量に応じた信＊＊号が発信され、記録計６
に記録される。

次に、第７図に示す装置屯第１図に示す各貯槽とグラジ
エント装置の組合せに代えて濃度を段階的に変化させた
溶離液の貯槽ＩＣ，ＩＤ，ＩＥＩＦ，ＩＧ，Ｉ
Ｈとこれら各槽の切替弁１０を設ける以外は同様な構成
としたものであり、か＼る構成の装置による場合でも切
替弁１０により各槽の溶離液を低濃度から高濃度へ順次
変化させ得るので同様にして分析することが可能となる
。

以下、実施例により本発明の作用効果をさらに詳しく説
明する。

比較例第１図に示す装置に基づき、既述瀬田等の方法によりか
つ第１表に示す条件で尿の分析を行なった。

分析の結果、第２図のクロマトグラムが得られた。

図中、Ａは尿酸、Ｂは馬尿酸、Ｃはインドール酢酸の各
ピークを示す。

吸光度のベースラインが時間の経過とともに上昇してい
るため精度が著しく劣ること、分析時間に２時間を要し
長過ぎること等の欠点が知られた。

実施例１０．００６Ｍの酢酸一酢酸アンモニウムからなる初期液
に代えＯ．ＯＯＩＭの塩化アンモニウム水溶液を、ｌた
６．ＯＭの酢酸一酢酸アンモニウムからなる最終液
に代え２、ＯＭ塩化アンモニウムと３０溶量多のアセト
ニトリルからなる混合水溶液を用いる以外は比較例と同
一条件にて実施し、第３図に示すクロマトグラムを得た
。

第３図から明らかなように、本実施例によれば時間の経
過にともなうベースラインの上昇はなくかつ分析時間も
１時間と大巾に短縮されることが明らかとなった。

前記ベースラインの上昇をともなわない理由は、本発明
では紫外吸収性の酢酸系溶離液を使用しないためと考え
られる。

ちなみに、溶離液として酢酸系の緩衝液を使用する場合
と本発明の溶離液を用いる場合とについて、紫外透過率
と波長との関係を求めたところそれぞれ第４図および第
５図の結果が得られた。

ナ釦、図中、２０は酢酸一酢酸アンモニウムの濃度が０
．００．ＩＭの場合（初期液）、２１は同０．
１Ｍ、２２は同６．０Ｍ（最終液）の場合を示し、
１た、３０は塩化アンモニウム濃度が０．００１Ｍの場
合（初期液）、３１は塩化アンモニウム濃度が０．７５
Ｍ，アセトニトリル濃度力、：５容量宏３２は塩化アン
モニウム濃度が３，ＯＭ，アセトニトリル濃度が１
５容量φの場合（最終液）をそれぞれ示す。

各図から明らかなように、いずれの場合も溶離液濃度が
高くなるにつれて吸収増大時の波長は長波長側へ移動す
るが、本発明（第５図参照）では最終液でも２２０
ｎｍ程度迄は大きな吸収を示さないのに反し、従来法
では２５０ｎｍでも吸収が大きくなるという特徴
を有している。

このことは、本発明によれば溶離液の濃度が高くなって
も（換言すれば時間が経過しても）通常使用される波長
、例えば２５４ｎｍあるいは２８０ｎｍで
はベースラインの上昇を来たさないばかりか、より低波
長の利用も可能であることを示唆するものである。

また、本発明により分析時間が短縮される点について考
察するに、本発明で使用する塩化物から生ずる塩素イオ
ンは強塩基性陰イオン交換樹脂に神１対する選択係数が
従来の酢酸イオンよりも約１０倍大きいこと訃よび塩化
物と共存せしめるアセトニトリルの作用により、溶質の
移動相への溶解度が高められることの相乗効果に起因す
るものと考えられる。

実施例２０．００１Ｍ塩化アンモニウム水溶液に代え０．０３Ｍ
塩化ナトリウム水溶液を、寸た３．ＯＭ塩化アンモニウ
ム−１５容量多アセトニトリルの混合水溶液に代え２．
０Ｍ塩化ネトリウム−３０容量多アセトニトリルの
混合水溶液を用いる以外は実施例１と同様にして実施し
、第６図に示すクロマトグラムを得た。

第６図から明らかなように、本実施例によれば実施例１
と同様な効果が達成された。

実施例３第７図に示す装置の各貯槽１Ｃ〜１Ｈに第４表に示す組
或の各溶離液を満した後、切替弁１０を作動させて同表
に示す送液時間で各液を順次通液する以外は実施例１釦
よび２と同様にして腎疾患者尿の分析を実施し、第８図
に示すクロマトグラムを得た。

第８図から明らかなように、本実施例による場合も、実
施例１むよび２と同様な効果の達成されることが知られ
た。

以上説明したように、本発明によれば、従来の分析方法
では不可能であった２５０ｎｍ以短の波長域にあ
る紫外線を吸収する尿構成物質の検出が可能になること
、溶離液の流速が従来法と同程度であっても分析時間を
従来の２時間から１時間程度へ大巾に短縮できること、
ベースラインが分析時間の経過にともなって上昇しない
ため、各成分の定量精度が向上する上に検出器の感度を
大巾（数十倍）に上げ得るので微量成分の検出も可能に
なる等の種々の効果が達成される。

【図面の簡単な説明】

第１図は本発明に適用可能な従来液体クロマトグラフイ
ー例の系統図、第２図は従来法により得られるクロマト
グラム、第３図は本発明実施例により得られるクロマト
グラム、第４図は従来溶離液使用下での紫外吸収特性図
、第５図は本発明溶離液使用下での紫外吸収特性図、第
６図は本発明実施他例により得られるクロマトグラム、
第７図ハ本発明による液体クロマトグラフィー例の系統
図、第８図は本発明の他の実施例により得られるクロマ
トグラムである。１Ａ・・・初期液貯槽、１Ｂ・・・最終液貯槽、１Ｃ，
１Ｄ，ＩＥ，１Ｆ，ＩＧ，ＩＨ・・・溶離液貯槽、２・
・・ポンプ、３・・・試料注入口、４・・・分離カラム
、５・・・検出器、６・・・記録計、７・・・排出液、
８・・・グラジエント装置、９・・・水注入口、１０・
・・切替弁、２０・・・酢酸一酢酸アンモニウム０．０
０１Ｍ，２１・・・酢酸一酢酸アンモニウム０．１
Ｍ、２２・・・酢酸一酢酸アンモニウム６．０Ｍ，３０
・・・塩化アンモニウム０．００１Ｍ，３１
・・・塩化アンモニウム０．７５Ｍ−アセトニトリル５
％、３２・・・塩化アンモニウム３，ＯＭ−アセトニ
トリル１５饅。

Claims

【特許請求の範囲】

１溶離液濃度を分析時間の経過とともに変化させるこ
う配溶離イオン交換クロマトグラフイーを適用した尿構
成物質類の分析方法にち・いて、前記溶離液として塩化
物とアセトニトリルを含む水溶液を用い、該水溶液中の
上記塩化物濃度を０．００１モルから３．０モルの間
で連続的１たは段階的に変化させ、上記アセトニトリル
濃度を０．１容量パーセントから３０容量パーセントの
間で連続的１たは段階的に変化させることを特徴とする
尿構或物質類の分析方法。