JPS585038B2 - ジペプチドエステルの製造方法 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 本発明はジペプチドエステルの製造方法に関するもので
ある。

ペプチドの誘導体が種々の生理活性を示すことは周知の
ことであり、その製造法についても種々の方法が知られ
ている。

ペプチド鎖中に酸性アミノ酸残基を含むものについても
同様で、例えば甘味物質として知られているＬ−アスパ
ルチルフェニルアラニンメチルエステル等は通常そのア
ミン基をベンジルオキシカルボニル基などで保護した前
駆体から保護基を離脱させて得られる。

この様な前駆体のジペプチドエステルを製造する方法と
してはアミノ基を保護した酸性アミノ酸の無水物とアミ
ノ酸のアルキルエステルを反応させる方法（特開昭４８
−６１４５１号、特開昭４８−７６８３５号など）が知
られている。

本発明はアミノ基を保護したモノアミノジカルボン酸と
アミノ酸エステルから酵素反応を利用して上述したジペ
プチドエステルとアミノ酸エステルとの付加化合物を生
成させ、これを分解してジペプチドエステルとするもの
である。

即ち本発明は一般式 で表わされ、少なくともその一部はＬ−型の光学異性体
であるＮ−置換モノアミノジカルボン酸（式中Ｒ１は脂
肪族オキシカルボニル基、核置換基を有することのある
ベンジルオキシカルボニル基、ベンゾイル基、芳香族ス
ルフォニル基又は芳香族スルフィニル基であり、ｎは１
又は２である）と、一般式 で表わされ、少なくともその一部はＬ−型の光学異性体
であるアミノ酸エステル（式中Ｒ２はメチル基、イソプ
ロピル基、イソブチル基、イソアミル基又はベンジル基
であり、Ｒ３は低級アルコキシ基、ベンジルオキシ基又
はベンズヒドリルオキシ基である）とを水性媒体中蛋白
分解酵素の存在下で反応させて、一般式 で表わされる化合物（式中Ｒ１，Ｒ２，Ｒ３及びｎは前
記同様の意味を表わす）を生成させ、これを反応液から
分離し、分離されたこの化合物を酸性水溶液と混合反応
させ、反応混合液を固液分離し、一般式 （式中Ｒ１，Ｒ２，Ｒ３及びｎは前記同様の意味である
）で表わされるＬＬ−型ジペプチドエステルを固相とし
て回収することを特徴とするジペプチドエステルの製造
方法を提供するものである。

本発明で一方の出発物質として用いる一般式（Ｉ）で表
わされるＮ−置換モノアミノジカルボン酸はアスパラギ
ン酸（一般式（Ｉ）中のｎが１のとき）又はグルタミン
酸（同様にｎが２のとき）の誘導体である。

Ｒ１は第３級ブチルオキシカルボニル基 （（ＣＨ３）３Ｃ−０−ＣＯ−）、第３級アミルオキシ
カルボニル基（（ＣＨ３）２Ｃ（Ｃ２Ｈ５）−Ｏ−ＣＯ
−）の様な脂肪族オキシカルボニル基；ベンジルオキシ
カルボニル基（φ−ＣＨ２−Ｏ−ＣＯ−）若くはｐ−メ
トキシベンジルオキシカルボニル基（ｐ−ＣＨ３Ｏ−φ
−ＣＨ２−Ｏ−ＣＯ−）、３，５−ジメトキシベンジル
オキシカルボニル基（３，５−（ＣＨ３Ｏ）２−φ−Ｃ
Ｈ２−Ｏ−ＣＯ−）、２，４，６−トリメトキシベンジ
ルオキシカルボニル基（２゜４．６（ＣＨｓＯ）３−φ
−ＣＨ２−Ｏ−ＣＯ−）等のその核置換誘導体基：ベン
ゾイル基（φ−ＣＯ−）：ｐ−トルエンスルホニル基（
ｐ−ＣＨ３−φ−８Ｏ２−）等の芳香族スルホニル基；
又はｏ−ニトロスルフィニル基（ｏ−ＮＯ２−φ−８Ｏ
−）等の芳香族スルフィニル基である。

Ｒ１はアミノ基の保護基であるが、本発明が後述する様
に一般式（ＩＶ）で表わされるＬＬ−型ジペプチドエス
テルの水又は酸性水溶液に対する溶解度の小さいことを
利用する工程を含むものであるから、一般式（５）で表
わされるＬＬ−型ジペプチドエステルの水溶性を大きく
増大させる様な置換基を持つものであってはならない。

他方の出発物質である一般式（ＩＩ）で表わされるアミ
ノ酸エステルは、Ｒ１がメチル基のときはアラニンの、
イソプロピル基のときはバリンの、イソブチル基のとき
はロイシンの、イソアミル基のときはイソロイシンの、
またベンジル基のときはフェニルアラニンのそれぞれエ
ステルである。

またＲ３はアルコール残基であって、メトキシ基（ＣＨ
３Ｏ−）、エトキシ基（Ｃ２Ｈ５Ｏ−）、プロポキシ基
（Ｃ３Ｈ７Ｏ−）、ブトキシ基（Ｃ４Ｈ９Ｏ−）などの
低級アルコキシ基；又はベンジルオキシ基である。

一般式（１）で表わされる化合物及び一般式（ＩＶ）で
表わされるジペプチドエステルはアスパラギン酸又はグ
ルタミン酸の骨格を有するものであるが、これらの酸性
アミノ酸がそのカルボキシル基でペプチド結合するとき
一般式（■）又は（■）の様にアミン基に対してα位の
カルボキシル基で結合する場合と、β位又はγ位のカル
ボキシル基で結合する場合があるが、本明細書中ではジ
ペプチドエステル又はそのアミノ酸エステルとの付加化
合物については、特記しない限りα位のカルボキシル基
でペプチド結合した化合物を意味する。

本発明では、まず一般式（Ｉ）で表わされ、少なくとも
その一部はＬ−型の光学異性体であるＮ−置換アミノジ
カルボン酸と一般式（■）で表わされ、少なくともその
一部はＬ−型の光学異性体であるアミノ酸エステルとを
水性媒体中蛋白分解酵素の存在下で反応させて一般式（
■）で表わされる化合物を生成析出させこれを分離する
。

一般式（■）で表わされる化合物は一般式側で表わされ
るＬＬ−型ジペプチドエステルと一般式（ＩＩ）で表わ
されるアミノ酸エステルとの付加化合物である。

この反応は特開昭５３−９２７２９号公報中に開示され
ている条件下で行なうことができる。

即ち水性媒体として最も適当なものは水溶液であり、反
応はこれらの水性媒体中蛋白分解酵素が酵素活性を示す
液性で行なわれる。

蛋白分解酵素として最も適当なものは、サーモライシン
、サモアーゼ、放線菌起源の中性プロテアーゼ、プロリ
シン、コラゲナーゼ、クロタルス、アトロツクス、プロ
テアーゼ等の金属プロテアーゼであり、その場合、反応
はｐＨ約５ないし約８の範囲内で行なうのが好ましい。

一般式（Ｉ）で表わされるＮ−置換アミノジカルボン酸
の光学異性体のうち、反応に関与するのはＬ一体だけで
あり、Ｄ一体はこれに関与しない。

しかし後者はこの反応を妨害しないので、出発原料とし
てＤＬ一体の様なり一体を含むものを使用してよい。

一般式（ＩＩ）で表わされるアミノ酸エステルとしては
フェニルアラニンのメチル又はエチルエステルの様な低
級アルキルエステルを典型的なものとして例示すること
ができる。

一般式（ｎ）で表わされるアミノ酸エステルの光学異性
体のうちペプチド結合形成反応に関与するのはＬ一体の
みであるが、Ｄ一体、Ｌ一体ともに生成するジペプチエ
ステルと結合して一般式（１）で表わされる化合物を形
成することができる。

従って原料としてＤ一体を含むアミノ酸エステルを用い
るとＬＬ−型の一般式（ＩＶ）で表わされるジペプチド
エステルと、Ｄ−型又はＤ−型とＬ−型との混合型の一
般式（■）で表わされるアミノ酸エステルとの付加化合
物である、一般式（■）で表わされる化合物が生成する
。

その他の反応条件は酵素反応における慣用の条件を採用
してよい。

一般式（■）で表わされる化合物と反応させる酸性水溶
液の酸性成分としては無機酸又は有機酸を用いる。

無機酸の例としては塩酸、臭化水素酸、硫酸、リン酸等
を挙げることができる。

有機酸の例としてはギ酸、酢酸、クエン酸、トルエンス
ルホン酸等を挙げることができる。

これらの酸性成分の濃度には格別の限定はないので、後
述する酸性成分及び酸性水溶液の各使用量から他律的に
定めてよい。

一般式（■）で表わされる化合物に対する酸性水溶液の
酸性成分の使用量は、この工程が一般式（■）で表わさ
れる化合物の、一般式（ＩＩ）で表わされるアミノ酸エ
ステルの部分を酸性成分によって電離させ、その塩の水
溶液とするものであるから、化学量論量又はそれ以上、
即ち一般式（■）で表わされる化合物１モルに対して１
ないし１００当量、好ましくは１ないし２０当量、最も
好ましくは１ないし１０当量程度である。

しかし目的により、一般式（ＩＶ）で表わされるＬＬ−
型ジペプチドエステルは必ずしもそれ程の高純度を必要
としない場合もあり得るので、その様な場合は化学量論
量以下の量、例えば化合物一般式（■）で表わされる１
モルに対して０．５当量などの様に、を用いることを妨
げるものでない。

目的によっては一般式（１）で表わされる化合物１モル
に対して０．８当量程度の量用いれば実際上充分である
ことも多い。

一般式（■）で表わされる化合物に対する酸性水溶液の
使用量は、本発明の方法が、得られる一般式（ＩＶ）で
表わされるＬＬ−型のジペプチドエステルを固体成分と
して分離するものであるから、これが少なくとも固相と
して存在し得る程度以内で用いる必要がある。

しかし一般式（５）で表わされるＬＬ−型ジペプチドエ
ステルは水や酸性水溶液に対する溶解度が小さい（Ｎ−
ベンジルオキシカルボニル−Ｌ−アスパルチル−Ｌ−フ
ェニルアラニンメチルエステルの場合、２５℃での溶解
度；０．０２８ｇ／１００ｇ水及び０．０１７ｇ／１０
０ｇ稀塩酸水溶液（１０−２Ｍ））ので可成多量でも実
施が可能である。

また本発明の方法が出発物質を酸性水溶液と接触させて
固液分離可能な状態とするものであるから、これが少な
過ぎるのも好ましくない具体的には一般式（■）で表わ
される化合物１重量部に対して１．５ないし５０重量部
程度、好ましくは２ないし１０重量部である。

本発明の方法において一般式（■）で表わされる化合物
１と酸性水溶液とを混合反応させるときの温度は通常０
ないし１００℃、好ましくは５ないし８０℃である。

一般式（■）で表わされる化合物の分解反応は撹拌が十
分であれば、通常１０分以内程度で終結する。

但し保護基Ｒ１又はＲ３が比較的加水分解され易い基、
例えばｐ−メトキシベンジルオキシカルボニル基の様な
場合は、これらの基の離脱を起さない様、反応時間及び
反応温度に注意する必要がある。

一般式（■）で表わされる化合物は固体であるが酸性水
溶液との接触によって分解されて、一般式（ＩＶ）で表
わされるＬＬ−型ジペプチドエステルと、一般式（Ｉ）
で表わされるアミノ酸エステルの酸性成分との塩となる
。

一般式（ＩＶ）で表わされるＬＬ−型ジペプチドエステ
ルは前述した様に酸性水溶液に対する溶解度が小さいの
でその実質的部分が固相として存在する。

一方アミノ酸エステルの塩は酸性水溶液によく溶解する
ので液相中に溶は込む。

こうして反応系は一般式（ＩＶ）で表わされるＬＬ−型
ジペプチドエステルの固相とアミノ酸エステルの塩の水
溶液（勿論過剰の酸性成分を含むことがあり得るが）の
混合系となる。

得られた混合系を固液分離すれば目的物である一般式（
ＩＶ）で表わされるＬＬ−型ジペプチドエステルが固相
として得られる。

固液分離は慣用の方法、例えば濾過、遠心沈降等で行な
うことができる。

液相からは慣用の方法、例えばこれを濃縮してアミノ酸
エステルを塩の形で晶出させるとか、或は液相をアルカ
リ性とした後、適当な有機溶媒で抽出する等の方法によ
ってアミノ酸エステルを回収することができる。

本発明で得られる一般式（ＩＶ）で表わされるＬＬ−型
ジペプチドエステルはペプチド合成での中間体としてそ
れ自体有用であるが、そのアミン基の保護基Ｒ１を離脱
させて得られるジペプチドエステルも亦有用な化合物で
ある。

例えばすでに述べた様にＬ−アスパルチル−Ｌ−フェニ
ルアラニンメチルエステルは甘味剤として有用であるが
、その他のものもペプチド合成のフラグメント等として
用いることができる。

本発明の方法によれば、極めて温和な条件下で、容易に
一般式（Ｉ）及び（ＩＩ）で表わされる化合物から、一
般式（■）で表わされる有用なジペプチドを製造するこ
とができる。

実施例 １ Ｎ−ベンジルオキシカルボニル−Ｌ−アスパラギン酸５
．３４ｇ（２０ミリモル）及びＬ−フェニルアラニンメ
チルエステル７．５３ｇ（４２ミリモル）を内容積約１
００ｍ１のフラスコにとり、水７０ｍ１を加えて溶解す
るとｐＨ６，２〜６．３の溶液となった。

この溶液にサーモライシン２００ｍｇを加えて、３８な
いし４０℃で４時間かきまぜた。

析出した沈殿を濾集し、水７０ｍ１で洗った後乾燥し融
点１１７ないし１２０℃を示す結晶１０．１１ｇを得た
。

この物質は以下のことからＮ−ベンジルオキシカルボニ
ル−Ｌ−アスパルチル−Ｌ−フェニルアラニンメチルエ
ステルとＬ−フェニルアラニンメチルエステルとの１：
１付加化合物であることが確認された。

即ち、この物を酢酸エチル−ｎ−ヘキサン混合溶媒から
再結晶して得た物の物性及び元素分析結果は： 融 点；１２０ないし１２４℃ 〔α〕■；＋７．２（Ｃ＝１、メタノール）元素分析； 赤外吸収スペクトルは ３．２６０ｃｍ−１にＮ−Ｈ伸縮に、３，０００〜３．
２００ｃｍ−１にＣ−Ｈ伸縮に、１，７４０ｃｍ−１に
工ステルのＣ＝Ｏに、１，７２０ｃｍ−１にウレタンの
Ｃ＝０に、１，６６０ｃｍ−１にアミド第１吸収に、１
，６３０ｃｍ−１にカルボキシレートに、１，５４０ｃ
ｍ−１にアミド第■吸収に、１，４３０及び１，４５０
ｃｍ−１にＣ−Ｈ変角に、１，３９０ｃｍ−１にカルボ
キシレートに、１．２２０〜１，２９０ｃｍ−１にＣ−
０−Ｃ伸縮及びアミド第１吸収に 角に、７４０及び６９５ｃｍ−１にモノ置換ベンゼン環
面外変角に、それぞれ由来する吸収がみられるまた核磁
気共鳴スペクトルはδ：２．７５ｐｐｍ，３．０２ｐｐ
ｍ，３．６１ｐｐｍ，３．７ｐｐｍ，４．４〜４．８ｐ
ｐｍ，５．０５ｐｐｍ５、８２ｐｐｍ、及び７．３ｐｐ
ｍに特徴がある。

更にまたこの物質を塩酸等の強酸で処理した後酢酸エチ
ル等の有機溶剤で抽出し溶媒を蒸発させるとＮ−ペンジ
ルオキシカルボニルーＬーアスパルチルーＬ−フェニル
アラニンメチルエステルが得られる。

こうして得られたＮ−ペンジルオキシカルボニルーＬー
アスパルチルーＬ−フェニルアラニンメチルエステルと
Ｌ−フェニルアラニンメチルエステルとの付加化合物１
００ｇ（１．６５ミリモル）を内容積約３０ｍｌのフラ
スコにとり、水２ｍｌおよび塩酸（１Ｎ）２０ｐｐを加
えて、室温で１０分間かきまぜた。

得られたスラリーを濾過し、水４ｍｌで洗ってから乾燥
し、Ｎ−ベンジルオキシカルボニル−Ｌ−アスパルチル
−Ｌ−フェニルアラニンメチルエステルの結晶０．７２
ｇを得た（収率９８．８％）。

この物質の確認は高速液体クロマトグラフ法によって標
準品と比較する等の方法によって行なった。

また同法による純度は１００％であった。高速液体クロ
マトグラフ分析の測定装置及び測定条件は下記の通りで
ある。

この条件等は実施例２以下でも同様である。

測定装置及び条件 高速液体クロマトグラフ装置；東洋曹達工業株式会社製
（ＴＳＫ−ＨＬＣ８０１） カラム 内径７．５ｍｍ×長さ３０ｃｍ 充填剤 デンプン系ゲル粒径５μ、東洋曹達工業株式会
社製 （ＴＳＫ−ＧＥＬ ＬＳ１７０） 溶離液 ０．５％酢酸ナトリウム水溶液 流 速 ０．８ｍｌ／ｍｉｎ 圧損失２０Ｋｇ／ｃｍ２ 測定温度 室温 検出器 示差屈折率 また得られた結晶を酢酸エチルに溶解し、これにｎ−ヘ
キサンを加えて再結晶した。

このものの物性及び元素分析結果は、 融 点；１２１〜１２４℃ 〔α〕■；−１５．４（Ｃ＝１、メタノール）元素分析 であり赤外吸収スペクトルも標準品と一致した。

実施例 ２ 実施例１で得たＮ−ベンジルオキシカルボニル−Ｌ−ア
スパルチル−Ｌ−フェニルアラニンメチルエステルとＬ
−フェニルアラニンメチルエステルとの付加化合物１．
００ｇ（１．６５ミリモル）を内容積３０ｍｌのフラス
コにとり、水２ｍｌおよび塩酸（ＩＮ）１．３２ｐｐを
加えて、室温で１０分間かきまぜた。

以下実施例１と同様に処理して融点１００ないし１２６
℃を示す微細な柱状晶０．７０ｇを得た（Ｎ〜ベンジル
オキシカルボニル−Ｌ−アスパルチル−Ｌ−フェニルア
ラニンメチルエステル含有量９６．８％）。

実施例 ３ Ｎ−ペンジルオキシカルボニル−Ｌ−アスパラギン酸０
．５３４ｇ（２ミリモル）およびＤＬ−フェニルアラニ
ンメチルエステル塩酸塩０．８６３ｇ（４ミリモル）を
内容積約３０ｍｌのフラスコにとり、水１０ｍｌを加え
て溶解し、アンモニア水（７重量％）でｐＨ６．０に調
整した。

この溶液にサーモライシン５０ｍｌを加え、３８ないし
４０℃で一夜振とうした。

析出した沈殿を濾集し、水１０ｍｌで洗った後乾燥して
融点１２０ないし１２６℃を示す結晶０．９０ｇを得た
。

この結晶の一部を酢酸エチル−ｎ−ヘキサン混合溶媒か
ら再結晶したものは融点１２８ないし１３４℃で、〔α
〕■；ー６．３（Ｃ＝１、メタノール）を示す他はＮ−
ペンジルオキシカルボニル−Ｌ−アスパルチル−Ｌ−フ
ェニルアラニンメチルエステルとＬ−フェニルアラニン
メチルエステルとの１：１付加化合物と実質的に同一の
赤外吸収スペクトル及び核磁気共鳴スペクトルを示す。

また酸分解によってＮ−ベンジルオキシカルボニル−Ｌ
−アスパルチル−Ｌ−フェニルアラニンメチルエステル
とＤ−フェニルアラニンメチルエステルとを１：１の割
合で与える。

元素分析の結果は： であった。

これらのことから得られた結晶はＮ−ベンジルオキシカ
ルボニル−Ｌ−アスパルチル−Ｌ−フェニルアラニンメ
チルエステルとＤ−フェニルアラニンメチルエステルと
の１：１付加化合物であることが確認された。

こうして得た付加化合物の結晶０．５０５’（０，８２
ミリモル）に水４７７２７！とクエン酸０．２６ｒを加
えて室温で１０分間かきまぜた。

以下実施例１と同様に処理してＮ−ベンジルオキシカル
ボニル−Ｌ−アスパルチル−Ｌ −フェニルアラニンメ
チルエステルの結晶０．３５ｒを得た（純度１００％、
収率９９．３％）。

実施例 ４ 実施例１で得たＮ−ベンジルオキシカルボニル−Ｌ−ア
スパル ルエステルとＬ−フェニルアラニンメチルエステルとの
付加化合物０．５０Ｓ’（０．８２ミＩＪモル）を内容
積３０ｒＩｌｌのフラスコにとり、水４ゴ及びｐ −ト
ルエンスルホン酸・ｌ水和物０．２４Ｆ（１．２ミリモ
ル）を加えて、実施例１に準じて反応を行なｔｚ）Ｎ−
ペンジルオキシカルボニル−Ｌ−アスパルチル−Ｌ−フ
ェニルアラニンメチルエステルの結晶０．３３Ｆを得た
（純度１００％、収率９３．６％実施例 ５ 内容積約３０ゴのフラスコにギ酸（８５％）０、４ ５
ｆｔ（ ８．２ミリモル）と水８−をとり、これに実
施例１で得たＮ−ペンジルオキシカルボニル−Ｌ−アス
パルチル−Ｌ−フェニルアラニンメチルエステルとＬ−
フェニルアラニンメチルエステルとの付加化合物０．５
Ｏ ｒ（ ０．８ ２ ：： １７モル）を加えて、
室温で２０分間かきまぜた後瀘過し、水１０ｒｒｌＩ！
で洗浄し、乾燥した。

Ｎ−ペンジルオキシカルボニル−Ｌ−アスパルチル−Ｌ
−フェニルアラニンメチルエステルの白色結晶０．３１
２ｒを得た（純度１００％、収率８８．６％）。

実施例 ６ 内容積約３０１ｎｌのフラスコに氷酢酸０．４７Ｓ’（
８．２ １で得たＮ−ペンジルオキシカルボニル−Ｌ−アスパラ
チル−Ｌ−フェニルアラニンメチルエステルとＬ−フェ
ニルアラニンメチルエステルとの付加化合物０．５０ｇ
（０．８２ミリモル）を加えて、室温で３０分間かきま
ぜた後炉過し、水１０ｍｌで洗浄し、乾燥した。

Ｎ−ペンジルオキシカルボニル−Ｌ−アスパルチル−Ｌ
−フェニルアラニンメチルエステルの白色結晶０．３０
１を得た（純度１００％、収率８７．２％）。

実施例 ７ 実施例１で得たＮ−ベンジルオキシカルボニル−Ｌ−ア
スパルチル−Ｌ−フェニルアラニンメチルエステルとＬ
−フェニルアラニンメチルエステルとの付加化合物１．
００ｇ（１．６５ミリモル）を内容積３０ｍｌのフラス
コにとり、水２ｍｌおよび塩酸（１Ｎ）２．０ｍｌ（２
．０ミリモル）を加えて、６０℃で３分間かきまぜた。

以下実施例１と同様に処理してＮ−ペンジルオキシカル
ボニル−Ｌ−アスパルチル−Ｌ−フェニルアラニンメチ
ルエステルの結晶０．３５ｇを得た（純度１００％、収
率１００％）。

実施例 ８ Ｎ−Ｐ−メトキシ−ベンジルオキシカルボニル−Ｌ−ア
スパラギン酸０．５９４ｇ（２ミリモル）及びＬ−フェ
ニルアラニンメチルエステル塩酸塩０、８６０ｇ（４ミ
リモル）を内容積約３０ｍｌのフラスコにとり、水酸化
ナトリウム溶液（ＩＮ）を加えて溶解し、ｐＨ６．０に
調整した。

この溶液にサーモライシン５０ｍｇを加え、３８ないし
４０℃で一夜間振とうした。

析出した沈殿を濾集し、水１０ｍｌで洗った後乾燥し、
融点６８ないし７４℃を示す結晶０．９２８ｇを得た。

この物質は以下のことがらＮ−ｐ−メトキシ−ベンジル
オキシカルボニル−Ｌ−アスパルチル−Ｌ−フェニルア
ラニンメチルエステルとＬ−フェニルアラニンメチルエ
ステルとの１：１付加化合物であることが確認された。

即ち、この物を酢酸エチル−ｎ−ヘキサン混合溶媒から
再結晶して得た物の物性及び元素分析結果は： 融 点；７２ないし７６℃ 〔α〕■；＋６．５（Ｃ＝１、メタノール）赤外吸収ス
ペクトルは第１図に示す様に、３．２８０ｃｍ−１にＮ
−Ｈ伸縮に、３，０２０及び２．９３０ｃｍ−１にＣ−
Ｈ伸縮に、１，７３５ｃｍ−１にエステルのＣ＝Ｏに、
１，７００ｃｍ−１にウレタンのＣ＝０に、１，６４０
ｃｍ−１にアミド第１吸収に、１．５００〜１，５４０
ｃｍ−１にアミド第■吸収に、１．４３５ｃｍ−１にＣ
−Ｈ変角に、１，３８０ｃｍ−１にカルボキシレートに
、１，２１０〜１，２４０ｃｍ−１にＣ−０−Ｃ伸縮及
びアミド第■吸収に、１，０３０ｃｍ−１にフェニル面
内変角に６９０，７４０及び８１０ｃｍ−１にフェニル
面外変角にそれぞれ由来する吸収が見られる。

核磁気共鳴スペクトルはδ値で （１） ２．７ｐｐｍ（２Ｈ） ；（２）３．１ｐｐｍ
（４Ｈ）；（３） ３．６ｐｐｍ（３Ｈ）及び３．７ｐ
ｐｍ（３Ｈ）：（４） ３．８ｐｐｍ（３Ｈ） ；（５
）４．０ｐｐｍ（１Ｈ）；（６） ４．５ｐｐｍ（１Ｈ
） ；（７）４．８ｐｐｍ（１Ｈ）；（８） ５．０ｐ
ｐｍ（２Ｈ） ；（９）５．６５ｐｐｍ（３Ｈ）；（１
０） ５．６５ｐｐｍ（１Ｈ）；（１１）６．２ｐｐｍ
（１Ｈ）；及び（１２） ６．８〜７．３ｐｐｍ（１４
Ｈ）に特徴があり、これらは下式のそれぞれ相当する番
号のプロトンに帰属させることができる。

こうして得られたＮ−ｐ−メトキシ−ベンジルオキシカ
ルボニル−Ｌ−アスパルチル−Ｌ−フェニルアラニンメ
チルエステルとＬ−フェニルアラニンメチルエステルと
の付加化合物０．５００ｇ（０，７８４ミリモル）を内
容積約３０ｍ１のフラスコにとり、水２ｍｌ及び塩酸（
１Ｎ）０．９４ｍ１（０，９４ミリモル）を加えて、６
０℃で３分間かきまぜた。

得られたスラリーを濾過し、水６ｍｌで洗浄した後乾燥
し、０．３２ｇの結晶を得た。

この結晶は以下のことからＮ−ｐ−メトキシ−ベンジル
オキシカルボニル−Ｌ−アスパルチル−Ｌ−フェニルア
ラニンメチルエステルであることが確認された。

（純度１００％、収率８９．１％）即ち、この結晶を酢
酸エチルに溶解し、これにｎ−ヘキサンを加えて再結晶
して得た物の物性及び元素分析結果は： 融 点；１２８〜１３０℃ 〔α〕■；−１５，１（Ｃ＝１ メタノール）赤外吸収
スペクトルは第２図に示す様に、３．２８０ｃｍ−１に
Ｎ−Ｈ伸縮に、２，９３０及び３．０２０ｃｍ−１にＣ
−Ｈ伸縮に、１，７３５ｃｍ−１にエステルのＣ＝Ｏに
、１，７００ｃｍ−１にウレタンのＣ＝Ｏに、１，６５
０ｃｍ−１にアミド第１吸収に、１．５１０〜１，５４
０ｃｍ−１にアミド第■吸収に、１．４４０ｃｍ−１に
Ｃ−Ｈ変角に、１，２２０〜１，２７０ｃｍ−１にＣ−
０−Ｃ伸縮及びアミド第■吸収に、１．０３０及び１，
０５０ｃｍ−１にフェニル面内変角に、６９０及び８１
０ｃｍ−１にフェニル面外変角にそれぞれ由来する特徴
がある。

また核磁気共鳴スペクトルはδ値で （１） ２．８ｐｐｍ（２Ｈ）；（２） ３．０ｐｐｍ
（２Ｈ）；（３） ３．６ｐｐｍ（３Ｈ）；（４） ３
．８ｐｐｍ（３Ｈ）；（５） ４．５ｐｐｍ（１Ｈ）；
（６） ４．８ｐｐｍ（１Ｈ）；（７） ５．０ｐｐｍ
（２Ｈ）；（８） ６．０ｐｐｍ（１Ｈ）；（９） ６
．６ｐｐｍ（１Ｈ）；（１０） ６．６ｐｐｍ（１Ｈ）
；（１１） ６．８〜７．３ｐｐｍ（９Ｈ）に特徴があ
り、これらは下式のそれぞれ相当する番号のプロトンに
帰属させることができる。

こうして得たＮ−ｐ−メトキシベンジルカルボニル−Ｌ
−アスパルチル−Ｌ−フェニルアラニンメチルエステル
０．２重量部をアセトン２重量部に溶解し、塩酸（４Ｎ
）１重量部を加えて湯浴上で１．５時間おだやかに環流
させたところ完全に分解し、Ｌ−アスパルチル−Ｌ−フ
ェニルアラニンメチルエステル、Ｌ−フェニルアラニン
メチルエステル及びアニスアルコールを主成分とする溶
液となった。

この溶液からＬ−アスパルチル−Ｌ−フェニルアラニン
メチルエステルを得た。

実施例 ９ Ｎ−ベンジルオキシカルボニル−Ｌ−グルタミン酸０．
５６２ｇ（２ミリモル）及びＬ−フェニルアラニンメチ
ルエステル塩酸塩０．８６０ｇ（４ミリモル）を内容積
約３０ｍ１のフラスコにとり水酸化す ６、０に調整した。

この溶液にサーモライシン５０■を加え、３８ないし４
０℃で一夜聞損とうした。

析出した沈殿を濾集し、水１０ｍｌで洗った後乾燥し、
融点８０ないし８５℃を示す結晶０．５１０ｇを得た。

この物質は以下のことがらＮ−ペンジルオキシカルボニ
ルーＬーグルタミルーＬ−フェニルアラニンメチルエス
テルとＬ−フェニルアラニンメチルエステルとの１：１
付加化合物であることが確認された。

即ち、この物を酢酸エチル−ｎ−へキサン混合溶媒から
再結晶して得た物の物性及び元素分析結果は： 融 点；９２ないし９７℃ 〔α〕■；０．１（Ｃ＝１、メタノール〕元素分析； 赤外吸収スペクトルは第３図に示す様に、３、３４０ｃ
ｍ−１にＮ−Ｈ伸縮に、２，９５０及び３、０３０ｃｍ
−１にＣ−Ｈ伸縮に、１，７３０及び１、７４５ｃｍ−
１にエステルのＣ＝Ｏに、１，６９０ｃｍ−１にウレタ
ンのＣ＝Ｏに、１，６６０ｃｍ−１にアミド第Ｉ吸収に
、１，６２０ｃｍ−１にカルボキシレートに、１、５３
０ｃｍ−１にアミド第■吸収に、１，４４０ｃｍ−１に
Ｃ−Ｈ変角に、１，４０５ｃｍ−１にカルボキシレート
に、１，２４０〜１，３１０ｃｍ−１にＣ−Ｏ−Ｃ伸縮
及びアミド第１吸収に、１，０５０ｃｍ−１にフェニル
面内変角に、７００及び７５０ｃｍ−１にフェニル面外
変角にそれぞれ由来する特徴がある。

核磁気共鳴スペクトルはδ値で （１）２．０ｐｐｍ（２Ｈ）；（２）２．３ｐｐｍ（２
Ｈ）；（３）３．０ｐｐｍ（４Ｈ）；（４）３．６ｐｐ
ｍ（３Ｈ）及び３、７ｐｐｍ（３Ｈ）；（５）３．８ｐ
ｐｍ（１Ｈ）；（６）４．３ｐｐｍ（１Ｈ）；（７）４
．８ｐｐｍ（１Ｈ）；（８）５．０ｐｐｍ（２Ｈ）；（
９）５．８ｐｐｍ（３Ｈ）；（１０）５．８ｐｐｍ（１
Ｈ）；（１１）７．２ｐｐｍ（１Ｈ）；（１２）７．２
ｐｐｍ（１０Ｈ）；（１３）７．３ｐｐｍ（５Ｈ）に特
徴があり、これらは下式のそれぞれ相当する番号のプロ
トンに帰属させることができる。

こうして得たＮ−ベンジルオキシカルボニル−Ｌ−グル
タミル−Ｌ−フェニルアラニンメチルエステルとＬ−フ
ェニルアラニンメチルエステルとの付加化合物０．１０
０ｇを内容積約１５ｍ１の試験管中で塩酸（０，１４Ｎ
）２．３ｍ１（０，３２ミリモルにかきまぜながら加え
、室温で１５分間攪拌を継続した。

生成した白色不溶物を濾過し、水３ｍｌで洗浄後乾燥し
たところ０．６８３ｇの結晶を得た。

この物は以下のことがらＮ−ベンジルオキシカルボニル
−Ｌ−グルタミル−Ｌ−フェニルアラニンメチルエステ
ルであることが確認された（純度１００％、収率９５．
８％）。

即ちこの結晶を酢酸エチルに溶解し、これにｎ−ヘキサ
ンを加えて再結晶して得た物の物性及び元素分析結果は
： 融 点；９７ないし９９℃ 〔α〕■；−１１，０（Ｃ＝１、メタノール）元素分析
； 赤外吸収スペクトルは第４図に示す様に、３．３００ｃ
ｍ−１にＮ−Ｈ伸縮に、２，９３０及び３．０３０ｃｍ
−１にＣ−Ｈ伸縮に、１，７３５ｃｍ−１にエステルの
Ｃ＝Ｏに、１，６９０ｃｍ−１にウレタンのＣ＝Ｏに、
１，６５０ｃｍ−１にアミド第１吸収に、１．５３０ｃ
ｍ−１にアミド第■吸収に、１，４４０ｃｍ−１にＯ−
Ｈ変角に１，２２０〜１，２８０ｃｍ−１にＣ−０−Ｃ
伸縮及びアミド第■吸収に、１，０５０ｃｍ−１にフェ
ニル面内変角に、６９５及び７３５ｃｍ−１にフェニル
面外変角にそれぞれ由来する特徴がある。

核磁気共鳴スペクトルはδ値で （１）２．０ｐｐｍ（２Ｈ）；（２）２．４ｐｐｍ（２
Ｈ）；（３）３．１ｐｐｍ（２Ｈ）；（４）３．７ｐｐ
ｍ（３Ｈ）；（５）４．３ｐｐｍ（１Ｈ）；（６）４．
８ｐｐｍ（１Ｈ）；（７）５．１ｐｐｍ（２Ｈ）；（８
）５．９ｐｐｍ（１Ｈ）；（９）７．２ｐｐｍ（１Ｈ）
；（１０）７．２ｐｐｍ（５Ｈ）；（１１）７．３ｐｐ
ｍ（５Ｈ）；（１２）８．１ｐｐｍ（１Ｈ）；に特徴が
あり、これらは次式のそれぞれ相当する番号のプロトン
に帰属させることができる：こうして得たＮ−ベンジル
オキシカルボニル−Ｌ−グル ステルは水素還元によってＬ−グルタミル−Ｌ−フェニ
ルアラニンメチルエステルとすることができた。

また加水分解によってＮ−ペンジルオキシカルボニル−
Ｌ−グルタミル−Ｌ−フェニルアラニンとすることがで
きた。

比較例 Ｌ−フェニルアラニンメチルエステル塩酸塩０、６８６
ｇ（３．１２ミリモル）を内容積１００ｍｌのフラスコ
にとり、水２５ｍを加えて溶解し、水冷かつ撹拌下に水
酸化ナトリウム水溶液（２Ｎ）を加えてｐＨを７．５と
し、更に攪拌を継続しながらかつ水酸化ナトリウム水溶
液（２Ｎ）の添加によってｐＨを７．０乃至７．５に保
ちながら、Ｎ−ベンジルオキシカルボニル−Ｌ−アスパ
ラギン酸無水物０．３６０ｇ（１．４４ミリモル）を除
々に加えた。

添加後更に２時間攪拌を続けたのち反応液に塩酸（１Ｎ
）を加えてｐＨ６とした。

生成した白色沈殿を濾葉し、水５０ｍｌで洗った後乾燥
してＮ−ベンジルオキシカルボニル−Ｌ−アスパルチル
フェニルアランメチルエステル（Ｎ−ペンジルオキシカ
ルボニル−Ｌ−アスパルチル−（Ｃα）−Ｌ−フェニル
アラニンメチルエステル８６％及びＮ−ペンジルオキシ
カルボニル−Ｌ−アスパルチル−（Ｃβ）一Ｌーフエニ
ルアラニンメチルエステル１４％よりなる）とＬ−フェ
ニルアラニンメチルエステルとの１：１付加化合物（融
点１０８乃至１１５℃）０．４１６ｇを得た。

尚反応の際相当量のＮ−ベンジルオキシカルボニル−Ｌ
−アスパルチル−（Ｃβ）−Ｌ−フェニルアラニンメチ
ルエステルが生成したが、その大部分は濾過洗浄の際濾
洗液の方に残った。

こうして得たＮ−ベンジルオキシカルボニル−Ｌ−アス
パルチル−Ｌ−フェニルアラニンメチルエステルとＬ−
フェニルアラニンメチルエステルとの付加化合物０．２
００ｇ（０．３２９ミリモル）を内容積的１２−のビー
カー中で塩酸（０．４Ｎ）１、７ミリ（０．７ミリモル
）にかきまぜながら加え、室温で１５分間攪拌を継続し
た。

生成した白色不溶物を濾過し、水３ｍｌで洗浄後乾燥し
てＮ−ベンジルオキシカルボニル−Ｌ−アスパルチル−
Ｌ−フェニルアラニンメチルエステル（Ｎ−ベンジルオ
キシカルボニル−Ｌ−アスパルチル−（Ｃβ）−Ｌ−フ
ェニルアラニンメチルエステルを１７％含む）の結晶（
融点１１０乃至１１８℃）０．１３６ｇを得た（収率９
６．３％）。

実施例 １０ Ｎ−ベンジルオキシカルボニル−Ｌ−アスパラギン酸０
．５４３ｇ（２ミリモル）及びＬ−フェニルアラニンエ
チルエステル塩酸塩０．９１８ｍｇ（４ミリモル）を内
容積的３０ｍｌのフラスコにとり、水５ｍｌを加えて溶
解し、水酸化す （４Ｎ）を加えてｐＨを６に調整した。

この溶液にサーモライシン５０ｍｇを加え、３８ないし
４０℃で一夜聞損とうした。

析出した沈殿を濾葉し、水３０ｍｌで水洗後乾燥し、融
点８５ないし９０℃を示す結晶０．９１３ｇを得た。

この物質は以下のことがらＮ−ベンジルオキシカルボニ
ル−Ｌ−アスパルチル−Ｌ−フェニルアラニンエチルエ
ステルとＬ−フェニルアラニンエチルエステルとの１：
１付加化合物であることが確認された。

即ち、この物を酢酸エチル−ｎ−ヘキサン混合溶媒から
再結晶して得た物の物性及び元素分析結果は：融 点
；９３ないし９５℃ 〔α〕■；＋６．０（Ｃ＝１、メタノール）元素分析： 赤外吸収スペクトルは第５図に示す様に３，３００ｃｍ
−１にＮ−Ｈ伸縮に、２，９００ないし３，０５０にＣ
−Ｈ伸縮に、１，７１０ないし１，７４０ｃｍ−１にエ
ステルのＣ＝Ｏ及びウレタンのＣ＝０に、１，６４０ｃ
ｍ−１にアミド第Ｉ吸収に、１，５８５ｃｍ−１にカル
ボキシレートに、１，５２０ｃｍ−１にアミド第■吸収
に、１、４４０ｃｍ−１にＣ−Ｈ変角に、１，３８０ｃ
ｍ−１にカルボキシレートに、１，２００および１，２
７０ｃｍ−１にＣ−Ｏ−Ｃ伸縮およびアミド第Ｉ吸収に
、１、０５５ｃｍ−１にフェニル面内変角に、７００。

７３０および７５０ｃｍ−１にフェニル面外変角にそれ
ぞれ由来する吸収が見られる。

核磁気共鳴スペクトルはδ値で （１）１．１ｐｐｍ（６Ｈ）；（２）２．７ｐｐｍ（２
Ｈ）；（３）３．０ｐｐｍ（４Ｈ）；（４）４．０ｐｐ
ｍ（４Ｈ）；（５）４．１ｐｐｍ（１Ｈ）；（６）４．
５ｐｐｍ（１Ｈ）；（７）４．７ｐｐｍ（１Ｈ）；（８
）５．０ｐｐｍ（２Ｈ）；（９）６．２ｐｐｍ（１Ｈ）
；（１０）６．７ｐｐｍ（３Ｈ）；（１１）７．２ｐｐ
ｍ（１Ｈ）；（１２）７．２ｐｐｍ（１０Ｈ）及び（１
３）７．３ｐｐｍ（５Ｈ）； に特徴があり、これらは下式のそれぞれ相当する番号の
プロトンに帰属させることができる。

こうして得られたＮ−ベンジルオキシカルボニル−Ｌ−
アスパルチル−Ｌ−フェニルアラニンエチルエステルと
Ｌ−フェニルアラニンエチルエステルとの付加化合物０
．１２５ｇ（０，１９７ミリモル）を内容積約３０ｍ１
のフラスコにとり、水２ｍｌ及び塩酸（１Ｎ）０．２４
ｍ１（０，２４ミリモル）を加えて、室温で３０分間か
きまぜた。

得られたスラリーを濾過し、水５ｍｌで洗浄した後乾燥
し、０．０８０７ｇの結晶を得た。

この結晶はＮ−ベンジルオキシカルボニル−Ｌ−アスパ
ルチル−Ｌ−フェニルアラニンエチルエステルで（純度
１００％、収率９２．６％）、これを酢酸エチル−ｎ−
ヘキサン混合溶媒から再結晶して得た物は：融 点：
１２８ないし１３５℃ 〔α〕■；−１７．３（Ｃ＝１、メタノール）元素分析
値； を与えた。

その赤外吸収スペクトルは、３，３００ｃｍ−１゜２．
９００〜３，１００ｃｍ−１，１，７３０ｃｍ−１，１
，６９０ｃｍ−１，１，６５５ｃｍ−１，１，５３０ｃ
ｍ−１，１，４４０ｃｍ−１１，２００〜１，２８０ｃ
ｍ−１，１，０３０ｃｍ−１，６９０ｃｍ−１及び７４
０ｃｍ−１に特徴があった。

また核磁気共鳴スペクトルはδ値で１．ｌｐｐｍ、２．
８ｐｐｍ、３．０ｐｐｍ。

４、ｌｐｐｍ、４．６１ｐｐｍ、４．８ｐｐｍ、５．ｌ
ｐｐｍ、６．０ｐｐｍ、７．ｌｐｐｍ、７．３ｐｐｍ及
び９．６ｐｐｍに特徴があった。

【図面の簡単な説明】

第１図、第３図及び第５図は本発明の方法で中間体とし
て経由する化合物の赤外吸収スペクトルを示す図であり
、第２図及び第４図は本発明の方法で得られる化合物の
赤外吸収スペクトルを示す図である。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １ 一般式（１） で表わされ、少なくともその一部はＬ−型の光学異性体
   であるＮ−置換モノアミノジカルボン酸（式中Ｒ８は脂
   肪族オキシカルボニル基、核置換基を有することのある
   ベンジルオキシカルボニル基、ベンゾイル基、芳香族ス
   ルフォニル基又は芳香族スルフィニル基であり、ｎは１
   又は２である）と、一般式（Ｉ） で表わされ、少なくともその一部はＬ−型の光学異性体
   であるアミノ酸エステル（式中Ｒ２はメチル基、イソプ
   ロピル基、イソブチル基、イソアミル基又はベンジル基
   であり、Ｒ３は低級アルコキシ基、ベンジルオキシ基又
   はベンズヒドリルオキシ基である）とを水性媒体中蛋白
   分解酵素の存在下で反応させて、一般式（１） で表わされる化合物（式中Ｒ１，Ｒ２，Ｒａ及びｎは前
   記同様の意味を表わす）を生成させ、これを反応液から
   分離し、分離されたこの化合物を酸性水溶液と混合反応
   させ、反応混合液を固液分離し、一般式（５） （式中Ｒ１，Ｒ２，Ｒ３及びｎは前記同様の意味である
   ）で表わされるＬＬ−型ジペプチドエステルを固相とし
   て回収することを特徴とするジペプチドエステルの製造
   方法。 ２ Ｒ１がベンジルオキシカルボニル基であり、Ｒ２が
   ベンジル基であり、Ｒ３がメトキシ基でありｎが１であ
   る特許請求の範囲第１項記載の製造方法。 ３ Ｒ１がｐ−メトキシ−ベンジルオキシカルボニル基
   であり、Ｒ２がベンジル基であり、Ｒ３が低級アルコキ
   シ基であり、ｎが１である特許請求の範囲第１項記載の
   製造方法。 ４ Ｒ１がベンジルオキシカルボニル基であり、Ｒ２が
   ベンジル基であり、Ｒ３がメトキシ基でありｎが２であ
   る特許請求の範囲第１項記載の製造方造。 ５ 水性媒体中、蛋白分解酵素の存在下で行なう反応で
   用いる水性媒体及び蛋白分解酵素が、それぞれ水溶液及
   び金属プロテアーゼであり、その反応をｐＨ５乃至８で
   行なう特許請求の範囲第１項ないし第４項のいずれかの
   項記載の製造方法。 ６ 一般式（ｎ）で表わされるアミノ酸エステルがＬ一
   体であり、一般式（１）中の がＬ−型である特許請求の範囲第１項ないし第５項のい
   ずれかの項記載の製造方法。 ７ 一般式（ｎ）で表わされるアミノ酸エステルがＤＬ
   一体であり、一般式（１）中の がＤ−型又はＤ−型とＬ−型との混合型である特許請求
   の範囲第１項ないし第５項のいずれかの項記載の製造方
   法。 ８ 酸性水溶液の酸性成分が無機酸である特許請求の範
   囲第１項ないし第７項のいずれかの項記載の製造方法。 ９ 酸性水溶液の酸性成分が有機酸である特許請求の範
   囲第１項ないし第７項のいずれかの項記載の製造方法。 １０ 酸性水溶液の酸性成分の使用量が一般式（ＩＩＩ
   ）で表わされる化合物１モルに対して１ないし１０当量
   である特許請求の範囲第１項ないし第９項のいずれかの
   項記載の製造方法。 １１ 酸性水溶液の使用量が一般式（１）で表わされる
   化合物１重量部に対して２ないし１０重量部である特許
   請求の範囲第１項ないし第１０項のいずれかの項記載の
   製造方法。