JPS5850720B2 - テクテ−トデヒドロゲナ−ゼのイソチ−ム４及び５を一緒に測定する試薬 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、ＬＤＨのイソチーム４及び５を一緒に測定す
る試薬並びに該試薬を含有する、女性の下部生殖管内の
病的変化を検査するための診断剤に関するものである。

ラクテートデヒドロゲナーゼ（通常ＬＤＨと称される）
が５種類のイソ型で生じることは公知である。

個々のイソチームの活性測定では異った至適−基質及び
ｐＨ値が重要な要素であり、これらは個々のイソチーム
に関しては未だ完全には知られていない。

全てのイソチームを測定する際には、従来はイソチーム
を電気泳動法で分離する（例えば”ディー・イソエンチ
ーメ・デア・ラクテートデヒドロゲナーゼ（Ｄｉｅ Ｉ
ｓｏｅｎｚｙｍｅ ｄｅｒ Ｌａｃｔａｔ −ｄｈｙｄ
ｒｏｇｅｎａｓｅ ）”、Ｓ、Ｌ、コノくレヴイスキー
（Ｋｏｗａｌｅｗｓｋｉ ）著うイエ・ビオケミ−・ラ
ント・クリニック（Ｒｅ１ｈｅ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｅ
ｕｎｄ Ｋ１１ｎｉｋ ）、Ｇ、チーメ（Ｔｈｉｅｍｅ
）出版、シトツツガルト在、１９７２年、第２９頁）
又は全てのＬＤＨを溶液中に保持し、ＬＤＨ−２〜５を
結合させかつ出現頻度の最も高いＬＤＨ−１を測定する
ことにより行われた。

この種の標準操作法に関する概要は例えば文献ｔ１エン
チマテイツシエ・アナリーゼ（Ｅｎｚｙｍａｔｉｓｃｈ
ｅ Ａｎａｌｙｓｅ ’）”第１巻、ケミ−（Ｃｈｅｍ
ｉｅ ’）出版社、ワインハイム在、（１９７０年、第
５５７頁）に記載されている。

これにはラクテートをピルベートにする反応のためのｐ
Ｈ−至適値ば８．３〜８．９であると記載されている。

実際には、全ての公知測定法では、イソチームなできる
だけ完全に検出するためには塩基性かオたはせいぜい中
性ｐＨ範囲が適用される。

ランブレヒト（Ｌａｍｐｒｅｃｈｔ ）他による〔“カ
ルジオロギイ”（Ｃａｒｄｉｏｌｏｇｙ ）第５６巻：
３７１〜３７５頁（１９７１／７２年）及び”フォルト
シュリッチ・デア・クリニツシエン・ケミ−エンチーメ
・ラント・ホルモネ”（Ｆｏｒｔ −５ｃｈｒｉｔｔｅ
ｄｅｒ Ｋ１１ｎｉｓｃｈｅｎ Ｃｈｅｍｉｅ 、Ｅｎ
ｚｙｍｅｕｎｄＨｏｒｍｏｎｅ）、ウィナ−・メデイチ
ニシエン・アカデミ−出版（Ｖｅｒｌａｇ ｄｅｒ Ｗ
ｉｅｎｅｒ ＭｅｄｉｚｉｎヒｓｃｈｅｎＡｋａｄｅｍ
ｉｅ’）１９７２年、２７７〜２８３頁〕によれば、個
々のイソチームはｐＨ−変化により相互に移行すること
ができる、即ちコンフオルメーション変化がか起ること
が立証された。

本発明の課題は、公知方法における複雑な分離操作が不
必要であり、しかもＬＤＨのイソチーム４及び５を一緒
に確実に測定することができる試薬を提供することであ
った。

ところで、ラクテートとＮＡＤとを反応させてピルベー
トにする公知方法に釦いて、ｐＨ値を中性点以下に低下
させるとＬＤＨ−イソチーム、特にイソチーム４及び５
が一緒に最適に検出されることが判明した。

この場合、酸性ｐＨに釦いて測定する際にのみＬＤＨ４
及び５が完全に検出されることは、極めて興味深いこと
である。

この新規方法は、特願昭５０−１１０７９９号の目的と
するところである。

それによれば、ラクテートト酸化型ニコチンアミド−ア
デニン−ジヌクレオチド（ＮＡＤ＋）とを反応させてピ
ルベートにすることによりラクテートデヒドロゲナーゼ
のイソチーム４釦よび５を一緒に測定する方法に関し、
該方法は上記反応をｐＨ６〜６．５でかつフェナジンメ
トスルフェートの存在で実施することを特徴とする。

この反応のためには、僅少量の液体で十分であるが、し
かしながら液体媒体中で反応の実施するのが有利である
。

即ち、複数のイソチームを一緒に測定するための最適条
件はオた緩衝剤に左右されることが判明した。

大抵の緩衝剤にとっては、この最適条件はほぼｐＨ６〜
６．５である。

燐酸塩緩衝液内で操作するとしても、な釦実際に測定す
ることができるが、しかしながらこの場合には、ｐ Ｈ
７，９でその一部、例えばイソチーム５が検出されるに
すぎない。

しかしながら、酸性ｐＨ値は複数のイソチームを一緒に
測定するためには極めて好適である。

約６．３〜６．４のｐＨ値は、例えば膣液中に現われる
ＬＤＨ４及び５を一緒に検出するために特に好適である
。

反応媒体中に大きな緩衝能を与えるのが有利である。

このことは、ｐＨ６から極端にずれたｐＨ値を有する体
液を調査する際にも至適ｐＨ値が反応の際に下回りも上
回りもしないという利点を有している。

この反応は自体公知の形式で約３７℃の温度で実施する
。

この際に、補酵素量を全ての存在せるイソチームにとっ
て十分に適応するように調整する、この調整は下記記載
に基いて数回の練習実験によって決定することができる
。

ＬＤＨの測定は、特に体液の検査の際に極めて重要であ
る。

これらのイソチームは健康ｉ人にかいてはかもに組織内
に固持されるが、これらは異常な組織戒長渣たは白血病
捷たはその他の疾病の際には血清會たは他の体液中に顕
著な濃度で検出される。

特に、女性の下部生殖管内の病的変化の際にはこれらが
膣液に含捷れていることを確認することができる。

前記測定法は全ての体液にとって適用可能である。

検査する試料の’ｐＨ値の調整は試料の個有−ｐＨ値に
関係する。

あらゆる場合に釦いて、反応のためにはｐＨは６．３〜
６．４、特に約６．３であるべきである。

従って、測定を行うためには試薬の組成を調整すべきで
ある。

標準法Ｃ”エンチマテイショ・アナリーゼ″第１巻、上
述の個所参照〕では至適ｐＨ値は８．３〜８．９と記載
含れているが、前記方法は明らかに上記ｐＨ範囲と相違
している。

上記の塩基性ｐＨ範囲が決定された理由は、反応： ラクテート＋ＮＡＤ＋ＬＤＨ（ピルベート）＋ＮＡＤ＋
Ｈ＋ の場合にはプロトンはラクテート−反応に対して化学量
的割合で生じることに起因する。

このＬＤＨの平衡を右方へ進行させたために、アルカリ
性範囲で操作される。

これに対して前記方法によれば、例えば血清又はリンパ
漿内で測定する場合には、被検試料をトリエタノールア
ミン−ＮａＯＨで約ｐＨ６，３〜６．４に緩衝しかつ検
査のために使用する試験組成物（試験試薬）をもとのｐ
Ｈ値に調整する。

大体に釦いて、ｐＨ値を６．０〜６．５に調整しかつ測
定する際にはｐＨ値が６．３〜６．４であるように緩衝
する。

血清アルブミンの場合には、自体公知の形式でグルタチ
オンを添加する。

ラクテートデヒドロゲナーゼのイソチームは、式： ラクテート＋ＮＡＤ＋ＬＤＨ（ピルベート）十ＮＡＤＨ
＋Ｈ＋ の反応平衡を逐次反応によって右方に進行す′るように
配慮すればｐ Ｈ６，３〜６．４で最上に検出される。

この目的のためには、補１酵素ＮＡＤＨを再酸化するフ
ェナジンメトスルフェートを加える。

ｐＨ６，０〜６．５に調節することは１ずＬＤＨ５を完
全に検出する可能性を提供する。

このことはなかんずく、ＬＤＨ５が存在していることが
癌腫が存在するという証拠であり、ひいては正確かつ精
密な測定が癌腫を早期発見するための手段であるという
ことから重要なことである。

しかしながら或種の体液においては、上記関係は当ては
！らない、それというのもその種の体液はｐ Ｈ６，３
〜６．４からはずれた特徴ある個有−ｐＨ値ヲ呈するか
らである。

この種の体液は特に膣液であり、とＯｐＨ値は約４であ
る。

この場合には。使用する試験組成物によって至適ｐＨ値
に反応の際には調節しなければならない、このことはそ
の際に膣液のｐＨ値によって約ｐＨ６〜６．５に引下げ
られる程の高さのｐＨ値を有していることを意味する。

従って、本発明の目的は、ラクテートと酸化型ニコチン
アミド−アデニン−ジヌクレオチドとを反応させてピル
ベートにすることによりラクテートデヒドロゲナーゼの
イソチーム４及び５を一緒に測定する試薬であって該試
薬がラクテート、酸化型ニコチンアミド−アデニン−ジ
ヌクレオチド、フェナジンメトスルフェート、酵素性Ｎ
ＡＤ−還元を可視化するためのテトラゾリウム塩及び緩
衝剤を含有する乾燥製剤から戒り、該製剤が試料に溶解
した際にｐＨ値６〜６，５が生じるように調整されてい
ることを特徴とする。

本発明の実施態様によれば、試薬は被検体液中での個有
の反応の際に例えばトリエタノールアミン−ＮａＯＨ−
緩衝剤又は燐酸塩−緩衝剤を除いた他の酸性に調整可能
な緩衝剤にとって、緩衝剤に特異なｐＨ値６．３〜６．
４がもたらされるようなｐＨ値に緩衝されている。

従って、乾燥プレパラートを使用する際には、とＯｐＨ
値が溶解後に生じる必要がある。

大体ＶＣ釦いて、約６．０〜６．５のｐＨ値が有利であ
る。

自体ではその初期のｐＨ−値が変化していない膣液を検
査する特殊な場合には、トリエタノ−ルア□ンーＮａＯ
Ｈ−緩衝剤を用いて検査する適用形が特に好適であり、
この場合には試験組成物’４）Ｈ７、０に調整し、一方
被検試料がｐＨ６，３〜６．４に調整されている場合に
は試験組成物をもこのｐＨ値に調整すればよい。

更に、本発明のもう１つの目的は、本発明による試薬を
、女性の下部生殖管内の万一の病的変化を確認するため
に試験材料を用いて膣内の膣液を検査する特殊な場合に
適用する方法に関し、この場合には試験組成物が適当な
担体、特にタンポン、オた例えば試験条片に施されてか
りかつこれを膣内に挿入することによってｐＨ値約６．
０〜６．５、特に６．３〜６，４で膣内に存在するＬＤ
Ｈ−イソチームと反応させることから成る。

次に、実施例で本発明による試薬並びにそれによる作用
効果について説明する。

試験組成物は下記組成の溶液から成る： 有オＩＩ＆ｆｉ 下限及び上限 バッチ トリエタノールアミン −ＮａＯＨ− 緩衝剤ｐＨ７，０ Ｎａ−ラクテート（Ｄ。

Ｌ−乳酸のナトリウム 塩） ５．０ ｍＭ １．０〜１５０ｒｒＭ６７．５ｍＭ ２０〜３５０ｍＭ フェナジンメトスルフ エート（ＰＭＳ） ニコチンアミド−アブ ニンージヌクレオチド （ＮＡＤ＋） ０．１ｍＭ １．５ｍＭ ０．０１〜１０ｍＭ （）、０１〜１０ｍＭ ニトロ−プラウ−テトラ ゾリウムクロリド ０．３ｍＭ Ｏ，０１〜１０
ｍＭ（ＮＢＴ） これらの試験組成物を遮光状態で適当な担体、例えばタ
ンポンに施しかつこの担体を使用する！で遮光状態で保
存する。

膣液内にＬＤＨが存在すれば、タンポンに約５〜１０分
後に青色変化が生じる。

このことは下記反応過程で生じる： １、 ラクテート十ＮＡＤ＋ＬＤＨピルベート＋ｆｆｉ
い。

Ｈ＋□＋２、ＮＡＤＨ＋フェナジンメトスルフェート＋
Ｈ＋→ＮＡＤ＋十還元されたフェナジンメトスルフェー
ト ３、還元されたフェナジンメトスルフェート＋ニトロ−
プラウ−テトラゾリウムクロリド→ホルマザン＋フェナ
ジンメトスルフェート第２次及び捷た第３次の、ラクテ
ート反応に連結された反応は形成され還元された補酵素
を第１次反応同様に引出す、即ちそのことによりラクテ
ート反応の平衡がな釦強度に右方に進行せしめられるの
で、タンポンの挿入後に試験バッチのｐＨ７、０への緩
衝の際に実際の反応はｐＨ約６、特に６．３〜６．４で
進行する。

この場合に、異常変化の際に膣液に存在するイソチーム
、特にＬＤＨ−４及びＬＤＨ−５は最適に検出される。

膣内で使用すべき試験組成物に釦いては、安定でかつ組
織親和性である緩衝剤を選択すべきである。

この場合には、特にトリエタノールアミン−ＮａＯＨ−
緩衝剤が好適である。

試験組成物は担体、特にタンポンにあらゆる任意の方法
で施すことができる。

このような試験組成物の取扱いは遮光状態で行うべきで
ありかつ試験組成物を施した担体は、さらにそれを使用
する寸で遮光下に保存すべきであることは公知である３
タンポンに試験組成物を含浸させる２つの有利な方法は
、有利な試験組成物内２ｍｌを注入するかあるいは試験
組成物を同様に約２ｍｌをタンポンの端の３／４の長さ
に含浸させかつ引続きタンポンを乾燥、特に凍結乾燥さ
せる方法である。

しかし、捷た例えば専ら撤去糸に試験組成物を塗布する
だけでもよく、これは必要な場合に後でタンポンから容
易に取り除くことができる。

特に有利には、タンポンに挿入されるバンド寸たはコー
ド状木綿製品に試験組成物を施すことである。

膣内に挿入することによって下部生殖管９病的変化を迅
速に検査する際にどれだけの量の膣液が存在するか、場
合に応じた量並びに膣液の生じ得るｐＨ値はいかに変動
するかはもちろん知られていないので、試験組成物内に
高い緩衝能が存在すべきであり、それによって本来の定
量の際には反応個所で６〜６．５、特に約６．３〜６．
４のｐＨ値が堅持される。

この場合に撤去系内に存在する試験組成物の緩衝能は実
際に多々にして不十分であるので、この場合には、いか
なる場合にもタンポンに隣接した撤去糸の部分で十分な
緩衝が保証される程度の量の緩衝物質をタンポンに含浸
させるのが有利である。

試験組成物を施したこの種の担体は医者によって適用さ
れる必要はなく、婦人自ら適用することができる。

膣内にタンポンを１５〜３０分間挿入した後青色化が現
われると、病的変化の危険を知らせるものであり、医者
の診断を受けねばならないという警告である。

しかしながら、使用済のタンポン捷たは撤去糸オたは撤
去コードを保存したい場合（このことは医者によって適
用された場合に生じ得る）！たは患者がタンポンを医者
に提示したい場合には、使用済みのタンポンの後処理が
必要である、即ち不快な臭気を排除し、タンポンを消毒
しかつ長期間ニ渡って保存するために変色を起さないよ
うに処理する必要がある。

さらに、この後処理は検査のために使用したタンポンを
２０％のパラロイド溶液〔メルク（Ｍｅｒｋ’）社のパ
ラロイド（Ｐａｒａｌｏｉｄ ）、ドルオール中［２０
％を溶解したもの〕に浸漬することによって行うことが
できる。

ＬＤＨ−測定の従来の方法（これらの方法は冒頭に述べ
た欠点を有している）は明らかに実験室法であるが、本
発明によっては訓練されていない利用者により特定の用
途、例えば膣液に関する迅速かつ十分な測定の可能性が
もたらされる。

このことは腫瘍患者［ｉ−いては特に重要なことである
。

多数の腫瘍患者に釦いて、文献によれば今日寸で２６種
の酵素が検出された。

ＬＤＨは最高の病理学的感性を有している；血清（非分
泌物）内では４０〜９０％の上昇が検出される。

腫瘍を確認された場合には、血清内のＬＤＨの一連の測
定を行うことが進行−及び治療コントロールのために好
適である。

確かにＬＤＨ−増加は腫瘍特異性のものではない。

しかし、このことは常に重大な病気に対する教示であり
かつ他の特徴との関係に釦いて腫瘍の予想診断の助けと
するのに適当である。

本発明による有利な試験組成物をタンポンに施して、約
１００名の健康な婦人と子宮頚癌、子宮体癌および上皮
内癌を有する患者とにかいて集団検診を実施した。

最良な結果を得るために、タンポンを１５〜３０分間挿
入させた。

取出し後、下記変色を直接的に確認することができた。

変色孔 陰 性淡紅色の変色
なお陰性紫色の斑点を有する明青
色 十 青色 ＋＋ 暗青色 ＋＋＋＋色（＋＋
）ｔたは暗青色（＋＋＋）の変色が生じると、全ての場
合に癌が存在し、このことは常に病理学的所見と一致し
た。

明青色の変色の場合に、殆んど例外なくパ転移帯域″の
診断を確認することができた。

淡紅色の変色はこれ１で健康な婦人（妊婦の場合でも１
５日才で）においてのみ見られた。

試験管内での定量法、即ち例えば血清又はリンパ漿の検
査は自体公知の形式で行われる。

唯一の必要な変更は従来使用された強塩性ｐＨ値に対し
て緩衝剤に特異なｐＨ値の調整を行うことである。

絶対測定のために、標準−ＬＤＨ−試料につき色変化の
検測を行うことができる。

測定試料は、タンポンの保存に関して述べたと同様に、
数時間色保存を行うことができる。

次に、参考例として１．な釦タンポンに試験組成物を施
すための２つの可能性を記載する。

ａ）浸漬法 通常の衛生タンポン、例えば’ Ｄｒ−Ｃａｒｌ Ｈａ
ｈｎ”社の％ｏ、ｂ１１に対しその中央部に１ ｃｍ幅
のテサバンドを帯状ＶＣ１〜２回強く巻き付ける。

撤去糸が付いているタンポンの反対側の、タンポンの被
包を開く。

そうすることによってタンポンの円柱面を露出させる。

容量１８ｍ１の市販の試薬ガラスＣＤｌＮ−規格、ショ
ト（５ｃｈｏｔｔ ’）社、マインッ在〕から湾曲底を
たち切る。

こうして得られたガラス管に、一方が露出したタンポン
がその面を管端部と同面をなすように導入する。

撤去糸を絆創膏、テサバンド捷たは同種のもので管の端
部に固定する。

露出したタンポン外皮を有する管の側を１）に記載する
溶液に浸漬する。

タンポン１個当２．０ｍｌを吸入させる。

溶液の調製及び試験組成物溶液と結び付いて行われる、
ここで述べた操作は、暗室内で単色光（赤色範囲内の写
真用光、赤光）の下で実施すべきである。

こうして調製したタンポンをガラス管と一緒に暗室内で
凍結乾燥させる。

乾燥したタンポンを管から、例えば撤去糸を用いて取出
しかつ常に暗室内で写真用光の下で遮光性の紙ないしシ
ートないし着色紙で包装しかつ遮光下に保存する。

ｂ）注入法 下記操作は暗室内で行う。

２ｍ１−注射器を用いて試験組成物１）をタンポンに注
入する。

撤去糸が付いているタンポンの反対側に、外皮を貫通し
て注射針をタンポンに突き刺す間に針を縦方向にタンポ
ンのもう一方の端部捷で貫通させながら、徐々に注入す
る。

こうすることによって、均等に湿潤されたタンポンが得
られる。

引続き、タンポンを凍結乾燥させかつａ）に記載したと
同様に包装しかつ保存する。

試薬混合物は原則としてあらゆる吸湿性の担体に施すこ
とができる。

膣液又は膣内の検査を行うためには、透明々シート、例
えば電気泳動法に使用されるよう々酢酸セルロースシー
ト玄たはアメリカンセミコンパ＝ −（Ａｍｅ ｒｉ
ｃａｎ Ｃｈｅｍｃｏｍｐａｎｙ）社の″″１１パラフ
イルムＭ Ｐａｒａ−ｆ ｉ １ｍＭ ’） ”が極め
て有利であることが立証された。

塗布によってＬＤＨと結合されるシートの個所に、青色
の方向への変色が生じる。

この種のシートは、例えばフィルタシートよりも機械的
により強くかつさらに安定化寸たは保管のために完全に
透明にすることができるという利点を有している。

酢酸セルロースシートのための透明浴としては下記のも
のを使用することができる： ａ）メタノール：酢酸 ８５：１５の量比ｂ）イ
ア７°″−“： １：１〜３ニアの量比ジオキサン Ｃ）メチルエチルケトン ３：２の量比ニジ
オキサン ｄ）酢酸エステル：ジオキサン ３：２の量比ｅ）メ
タノール：氷酢酸：グリセリン ８７：１２：１の量比 パラフィルムシートに関しては７−５ ％の酢酸溶液に
短時間浸漬するのが好適である。

油処理を行ってもよい。

この場合には１゛ホワイトモアーオイル（Ｗｈｉｔｅｍ
ｏｒｅ−Ｏｉｌ）１２０ｆたはオンジノーオイル（Ｏｎ
ｄｉ ｎｏ−０ｉ１）１７（Ｓｈｅｌｌ）が適当である
。

この面積１．５〜２．ｏｃ曲有するシートは、有利に専
門医によって膣内の推定された粘膜変化に対して膣鏡診
断を行う際に適用することができる。

腫瘍性の細胞塊が在る個所にタンポンと同様に斑点状の
変色が生じる。

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. １ ラクテートと酸化型ニコチンアミド−アデニン−ジ
   ヌクレオチドとを反応させてピルベートにすることによ
   りラクテートデヒドロゲナーゼのイソチーム４及び５を
   一諸に測定する試薬に−Ｌ−いて、該試薬がラクテート
   、酸化型ニコチンアミド−アデニン−ジヌクレオチド、
   フェナジンメトスルフェート、酵素性ＮＡＤ−還元を可
   視化するためのテトラゾリウム塩及び緩衝剤を含有する
   乾燥製剤から成り、該製剤が試料に溶解した際ＶｃｐＨ
   値６〜６．５が生じるように調整されていることを特徴
   とする、ラクテートデヒドロゲナーゼのイソチーム４及
   び５を一緒に測定する試薬。