JPS587649B2 - Ｎａｄ↑＋−ポリエチレングリコ−ル誘導体 - Google Patents
Ｎａｄ↑＋−ポリエチレングリコ−ル誘導体Info
- Publication number
- JPS587649B2 JPS587649B2 JP3789880A JP3789880A JPS587649B2 JP S587649 B2 JPS587649 B2 JP S587649B2 JP 3789880 A JP3789880 A JP 3789880A JP 3789880 A JP3789880 A JP 3789880A JP S587649 B2 JPS587649 B2 JP S587649B2
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- nad
- polyethylene glycol
- derivative
- glycol derivative
- molecular weight
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired
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Landscapes
- Immobilizing And Processing Of Enzymes And Microorganisms (AREA)
- Saccharide Compounds (AREA)
- Polyethers (AREA)
Description
【発明の詳細な説明】
本発明は、応用生化学、酵素工学、酵素レアクター等の
技術分野で用いられるＮＡＤ＋−ポリエチレングリコー
ル誘導体に関する。
技術分野で用いられるＮＡＤ＋−ポリエチレングリコー
ル誘導体に関する。
従来、補酵素、ＮＡＤ＋（＝コチンアミドーアデニンジ
ヌクレオチド）を高分子化して尚かつ補酵素活性を保有
させた高分子化ＮＡＤ＋とじては、次のようなものが合
成されている。
ヌクレオチド）を高分子化して尚かつ補酵素活性を保有
させた高分子化ＮＡＤ＋とじては、次のようなものが合
成されている。
すなわち、Ｎ６−（６−ａｍｉｎｏｈｅｘｙｌ）一ｃａ
ｒｂａｍｏｙｌ一ＮＡＤ＋一ｄｅｘｔｒａｎ、Ｎ６−（
６−ａｍｉｎｏｈｅｘｙｌ）−ｃａｒｂａｍｏｙｌ−Ｎ
ＡＤ＋−ｓｅｐｈａｄｅｘ，８−（２−ｃａｒｂｏｘｙ
ｅｔｌｙｌｔｈｉｏ）−ＮＡＤ十一ｐｏｌｙｅｔｈｙｌ
ｃｎｅｉｍｉｎｅ、８−（２−ｃ’ａｒｂｏｘｙｅｔｌ
ｙｌｔｈｉｏ）−ＮＡＤ十−ｐｏｌｙｌｙｓｉｎｅ，Ｓ
ｕｃｃｉｎｙｌ−ＮＡＤ＋ｐｏｌｙｅｔ｝ｙｌｅｎｅｉ
ｍｉｎｅ、Ｓｕｃｃｉｎｙｌ−ＮＡＤ十−ｆｏｒｒｙｌ
ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｅｉｍｉｎｅ、Ｎ６−（４−（
３−Ｈｙｄｒｏｘｙｂｕｔｙｌ））−ＮＡＤ＋−ｐｏｌ
ｙｅｔｈｙｌｅｎｅｉｍｉｎｅなどがある。
ｒｂａｍｏｙｌ一ＮＡＤ＋一ｄｅｘｔｒａｎ、Ｎ６−（
６−ａｍｉｎｏｈｅｘｙｌ）−ｃａｒｂａｍｏｙｌ−Ｎ
ＡＤ＋−ｓｅｐｈａｄｅｘ，８−（２−ｃａｒｂｏｘｙ
ｅｔｌｙｌｔｈｉｏ）−ＮＡＤ十一ｐｏｌｙｅｔｈｙｌ
ｃｎｅｉｍｉｎｅ、８−（２−ｃ’ａｒｂｏｘｙｅｔｌ
ｙｌｔｈｉｏ）−ＮＡＤ十−ｐｏｌｙｌｙｓｉｎｅ，Ｓ
ｕｃｃｉｎｙｌ−ＮＡＤ＋ｐｏｌｙｅｔ｝ｙｌｅｎｅｉ
ｍｉｎｅ、Ｓｕｃｃｉｎｙｌ−ＮＡＤ十−ｆｏｒｒｙｌ
ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｅｉｍｉｎｅ、Ｎ６−（４−（
３−Ｈｙｄｒｏｘｙｂｕｔｙｌ））−ＮＡＤ＋−ｐｏｌ
ｙｅｔｈｙｌｅｎｅｉｍｉｎｅなどがある。
ところで上述の高分子化ＮＡＤ＋は、いずれも補酵素活
性が不安定であるか、低いか、特定の酵素に対してしか
補酵素活性を示さないものであったし、あるいは高い濃
度で使用したとき高粘度のため酵素レアクターに応用で
きないものであった本発明は、上述の諸点に鑑みて提案
されるもので、脱水素酵素反応またはその逆反応生産物
の全部に適当しうるＮＡＤ＋−ポリエチレングリコール
誘導体を提供することを目的とする。
性が不安定であるか、低いか、特定の酵素に対してしか
補酵素活性を示さないものであったし、あるいは高い濃
度で使用したとき高粘度のため酵素レアクターに応用で
きないものであった本発明は、上述の諸点に鑑みて提案
されるもので、脱水素酵素反応またはその逆反応生産物
の全部に適当しうるＮＡＤ＋−ポリエチレングリコール
誘導体を提供することを目的とする。
このため本発明は、分子量３０００〜２００００のポリ
エチレングリコールの末端にアミノ基を導入した誘導体
と、Ｎ６−カルボキシアルキル−ＮＡＤ＋とからなり、
ポリエチレングリコール誘導体１分子に対してＮＡＤ十
残基１分子がペプチド結合した化学構造式、 で示されるＮＡＤ十一ポリエチレングリコール誘導体を
要旨とする。
エチレングリコールの末端にアミノ基を導入した誘導体
と、Ｎ６−カルボキシアルキル−ＮＡＤ＋とからなり、
ポリエチレングリコール誘導体１分子に対してＮＡＤ十
残基１分子がペプチド結合した化学構造式、 で示されるＮＡＤ十一ポリエチレングリコール誘導体を
要旨とする。
以下、本発明の実施例について説明すると、その具体例
としては次のようなものがある。
としては次のようなものがある。
こには、ＮＡＤ＋のアデニン環の６位のアミン基をカル
ボキシアルキル化したＮＡＤ十誘導体と、分子量３００
０〜２００００のポリエチレングリコールの末端水酸基
をテミノ基に置換した誘導体とをペプチド結合させた誘
導体である。
ボキシアルキル化したＮＡＤ十誘導体と、分子量３００
０〜２００００のポリエチレングリコールの末端水酸基
をテミノ基に置換した誘導体とをペプチド結合させた誘
導体である。
ｎは７０以上４５０以下のもの、ｍは１以上６以下のも
のである。
のである。
ただしポリエチレングリコール誘導体１分子ＫＮＡＤ十
残基１分子が結合されている。
残基１分子が結合されている。
次に、その合成例について説明すると、Ｎ６−ｃａｒｂ
ｏｙｅｔｈｙｌ−ＮＡＤ＋０．６？と、ポリエチレング
リコールの末端をアミン化した誘導体（以下、ＮＨ２−
ＰＥＧと略称する。
ｏｙｅｔｈｙｌ−ＮＡＤ＋０．６？と、ポリエチレング
リコールの末端をアミン化した誘導体（以下、ＮＨ２−
ＰＥＧと略称する。
）（分子量３０００〜３７００）４．９６ｆとを水１５
ｍｌに溶かし、ｐＨを４．５以下に保ちながら少量ずつ ｄｉｃｙｃｌｏｈｅｘｙｌ ｃａｒｂｏｄｉ ｉｍｉｄ
ｅを合計５１加えて反応させる。
ｍｌに溶かし、ｐＨを４．５以下に保ちながら少量ずつ ｄｉｃｙｃｌｏｈｅｘｙｌ ｃａｒｂｏｄｉ ｉｍｉｄ
ｅを合計５１加えて反応させる。
室温で２４時間反応させた反応混液をヂクロ口メタンで
抽出し、カチオン交換、アニオン交換、カラムクロマト
グラフイにより精製し、薄層クロマトグラフにより単一
スポットを与えるＮＡＤ十一ポリエチレングリコール誘
導体を得た。
抽出し、カチオン交換、アニオン交換、カラムクロマト
グラフイにより精製し、薄層クロマトグラフにより単一
スポットを与えるＮＡＤ十一ポリエチレングリコール誘
導体を得た。
これは、セファデツクスＧ−７５によるクロマトグラフ
イにより高分子化されたＮＡＤ＋であり、その収率は４
６％であった。
イにより高分子化されたＮＡＤ＋であり、その収率は４
６％であった。
また分子量２００００のポリエチレングリコールを出発
物質として末端をアミン基に置換し、Ｎ６−ｃａｒｂｏ
ｘｙｅｔｈｙｌ−ＮＡＤ十と結合させた。
物質として末端をアミン基に置換し、Ｎ６−ｃａｒｂｏ
ｘｙｅｔｈｙｌ−ＮＡＤ十と結合させた。
このようにして得られる本発明のＮＡＤ＋−ポリエチレ
ングリコール誘導体は、高い補酵素活性を広汎な脱水素
酵素に対して有するのみでなく、長期間の連続反応にも
安定であり、しかもＮＡＤ＋相当で３ｍＭに濃度を上げ
ても粘度、溶解性などの物性が酵素反応の障害にならな
いという特性がある。
ングリコール誘導体は、高い補酵素活性を広汎な脱水素
酵素に対して有するのみでなく、長期間の連続反応にも
安定であり、しかもＮＡＤ＋相当で３ｍＭに濃度を上げ
ても粘度、溶解性などの物性が酵素反応の障害にならな
いという特性がある。
そして、適当な分子量のものを合成するのが容易である
。
。
また本発明のＮＡＤ＋ーポリエチレングリコール誘導体
が試験したすべての脱水素酵素に対して高い補酵素活性
をもっていることは、次表により示される。
が試験したすべての脱水素酵素に対して高い補酵素活性
をもっていることは、次表により示される。
ＮＡＤ＋−ポリエチレングリ
コール誘導体の補酵素活性
従来の高分子化ＮＡＤ＋では、アルコール脱水素酵素と
乳酸脱水素酵素との双方に対して５０％以上という高活
性を有するものが得られていない。
乳酸脱水素酵素との双方に対して５０％以上という高活
性を有するものが得られていない。
その原因は、ポリマー分子にＮＡＤ＋を密に結合させる
と、却って酵素反応を阻害するものが生成するからであ
る。
と、却って酵素反応を阻害するものが生成するからであ
る。
これに対し、本発明では、ポリマー１分子に対してＮＡ
Ｄ＋ｌ残基しか結合させていないので、高い補酵素活性
を広範囲の脱水素酵素に対して発現しうるのである。
Ｄ＋ｌ残基しか結合させていないので、高い補酵素活性
を広範囲の脱水素酵素に対して発現しうるのである。
本発明のＮＡＤ＋−ポリエチレングリコール誘導体（Ｐ
ＥＧ−ＮＡＤ＋）の利用の１つとして、２種の脱水素酵
素の共役による連続反応系を組むことができる。
ＥＧ−ＮＡＤ＋）の利用の１つとして、２種の脱水素酵
素の共役による連続反応系を組むことができる。
この共役反応系は、次のようなものである。
限外沢過膜（許容分子量１ＯＯＯ）を付した反応器中に
、乳酸脱水素酵素２５ｎＭ、アルコール脱水素酵素７５
ｎＭおよびＰＥＧ−ＮＡＤ＋３ｍＭを入れ、これに１０
ｍＭピルビン酸５００ｍＭエタノール溶液を滞留時間３
０分の速度で注入する。
、乳酸脱水素酵素２５ｎＭ、アルコール脱水素酵素７５
ｎＭおよびＰＥＧ−ＮＡＤ＋３ｍＭを入れ、これに１０
ｍＭピルビン酸５００ｍＭエタノール溶液を滞留時間３
０分の速度で注入する。
そして、注入液量と同量の液量を沢過膜を通して取出し
連続反応させた。
連続反応させた。
この条件でピルビン酸の乳酸への転換率は１００％であ
り、エタノール濃度を１００ｍＭに低下しても転換率は
９５％であった。
り、エタノール濃度を１００ｍＭに低下しても転換率は
９５％であった。
７日間の連続運転後、アルコール脱水素酵素を添加する
と、再び９５％の転換率が得られたが、これはＰＥＧ−
ＮＡＤ＋が安定に作動していたことを示している。
と、再び９５％の転換率が得られたが、これはＰＥＧ−
ＮＡＤ＋が安定に作動していたことを示している。
従来の高分子化ＮＡＤ＋を用いた連続反応では、転換率
は３０％以下であり、連続運転も１日以内であったので
、これにより本発明のＮＡＤ＋−ポリエチレングリコー
ル誘導体の高性能が証明されている。
は３０％以下であり、連続運転も１日以内であったので
、これにより本発明のＮＡＤ＋−ポリエチレングリコー
ル誘導体の高性能が証明されている。
なお、同定資料としては、次のものがある。
（！）Ｎ６−（２−ｃａｒｂｏｘｙｅｔｈｙｌ）−ＮＡ
Ｄ＋の同定 （ａ）Ｕｖ；吸収：最犬２６６ｎｍ（ε−１８６００Ｍ
−ＩＣｍ−１）はＮＡＤ＋のアデニン環６位の修飾を示
す。
Ｄ＋の同定 （ａ）Ｕｖ；吸収：最犬２６６ｎｍ（ε−１８６００Ｍ
−ＩＣｍ−１）はＮＡＤ＋のアデニン環６位の修飾を示
す。
（ｂ）元素分析：測定値 Ｃ、３５．５１％；Ｈ、４，
０９％；Ｎ，１１．７４％： Ｃ２４Ｈ２９Ｎ７０１６ｐ２”Ｎａ３Ｈ２０として計算
値Ｃ，３５．１２％；Ｈ１４．７９％一Ｎ−１１．９５
％を得る。
０９％；Ｎ，１１．７４％： Ｃ２４Ｈ２９Ｎ７０１６ｐ２”Ｎａ３Ｈ２０として計算
値Ｃ，３５．１２％；Ｈ１４．７９％一Ｎ−１１．９５
％を得る。
（ｅ）赤外スペクトル分析；１６３０Ｃｍ―’に広い吸
収がありＣＯＯ−の存在を示す。
収がありＣＯＯ−の存在を示す。
（ｄ）原子吸光スペクトル分析；ＮＡＤ＋誘導体１分子
につき３．１モルのＮａ原子の存在を示した。
につき３．１モルのＮａ原子の存在を示した。
（ｅ）ＮＭＲスペクトル分析；Ｄ２０中でＮＡＤ十のプ
ロトンシグナルの他にδ値 ２．５６ｐｐｍ（２Ｈ，ｔ，ＣＨ２ＣＯＯ）と３．６５
ｐｐｍ（（２Ｈ，ｔ，Ｎ６−ＣＨ２）が観測できた。
ロトンシグナルの他にδ値 ２．５６ｐｐｍ（２Ｈ，ｔ，ＣＨ２ＣＯＯ）と３．６５
ｐｐｍ（（２Ｈ，ｔ，Ｎ６−ＣＨ２）が観測できた。
（ｉｉ）アミノポリエチレングリコールの同定（ａ）Ｍ
Ｊニトロベ゛ンセンスルホン酸法により求めたアミン基
の数はポリエチレングリコール１分子当り１．２〜１．
４である。
Ｊニトロベ゛ンセンスルホン酸法により求めたアミン基
の数はポリエチレングリコール１分子当り１．２〜１．
４である。
（ｔ）ＳＰ−Ｓｅｐｈａｄｅｘに吸着され４５ｍＭＮａ
Ｃｌで溶出される。
Ｃｌで溶出される。
（１ｉ）ＮＡＤ＋−ポリエチレングリコール誘導体の同
定 （ａ）シリカゲル薄層クロマトグラフイ；溶媒系（イソ
酪酸：水：２８％アンモニア水−６６：３３：１、７）
または（ジクロロメタン：メタノール＝５：１）で単一
スポットを与える。
定 （ａ）シリカゲル薄層クロマトグラフイ；溶媒系（イソ
酪酸：水：２８％アンモニア水−６６：３３：１、７）
または（ジクロロメタン：メタノール＝５：１）で単一
スポットを与える。
（ｈ｝透析膜Ｓｐｅｃｔｒａｐｏｒ Ｎｏ．６（透過最
大分子量＝１０００）２４時間透析で漏出せず。
大分子量＝１０００）２４時間透析で漏出せず。
（ｃ）標品の２６６ｎｍ吸光度分析と、トリニトロさン
センスルホン酸によるアミノ基の測定からＮＡＤ＋ｌ残
基当りのアミノ基数は１．２〜１．４である。
センスルホン酸によるアミノ基の測定からＮＡＤ＋ｌ残
基当りのアミノ基数は１．２〜１．４である。
（ｄ）ＳＰ−Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｃ−２５にもＤＥＡＥ
−Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ａ−２５にも非吸着である。
−Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ａ−２５にも非吸着である。
（ｅ）このものは酵母アルコール脱水素酵素、エタノー
ルの存在下で３４０ｎｍの吸光が増大する。
ルの存在下で３４０ｎｍの吸光が増大する。
以上合成反応原料の化学構造と、生産物のアミン基数、
カルボキシール基の不存在および分子量とから化学構造
式が正しいものと考えられる。
カルボキシール基の不存在および分子量とから化学構造
式が正しいものと考えられる。
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 １ 分子量３０００〜２００００のポリエチレングリコ
ールの末端にアミン基を導入した誘導体と、Ｎ６−カル
ボキシアルキルーＮＡＤ＋とからなり、ポリエチレング
リコール誘導体１分子に対してＮＡＤ＋残基１分子がペ
プチド結合した化学構造式、 で示される、ＮＡＤ＋−ポリエチレングリコール誘導体
。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP3789880A JPS587649B2 (ja) | 1980-03-25 | 1980-03-25 | Ｎａｄ↑＋−ポリエチレングリコ−ル誘導体 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP3789880A JPS587649B2 (ja) | 1980-03-25 | 1980-03-25 | Ｎａｄ↑＋−ポリエチレングリコ−ル誘導体 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS56133334A JPS56133334A (en) | 1981-10-19 |
| JPS587649B2 true JPS587649B2 (ja) | 1983-02-10 |
Family
ID=12510354
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP3789880A Expired JPS587649B2 (ja) | 1980-03-25 | 1980-03-25 | Ｎａｄ↑＋−ポリエチレングリコ−ル誘導体 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPS587649B2 (ja) |
Families Citing this family (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPH0644927B2 (ja) * | 1987-03-14 | 1994-06-15 | 日本油脂株式会社 | 徐放性活性成分放出剤 |
| GB9814212D0 (en) | 1998-07-01 | 1998-09-02 | Dow Corning Gmbh | Polymer composition |
-
1980
- 1980-03-25 JP JP3789880A patent/JPS587649B2/ja not_active Expired
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPS56133334A (en) | 1981-10-19 |
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