JPS5918989B2 - 生物学的活性物質の製法 - Google Patents
生物学的活性物質の製法Info
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- JPS5918989B2 JPS5918989B2 JP16347881A JP16347881A JPS5918989B2 JP S5918989 B2 JPS5918989 B2 JP S5918989B2 JP 16347881 A JP16347881 A JP 16347881A JP 16347881 A JP16347881 A JP 16347881A JP S5918989 B2 JPS5918989 B2 JP S5918989B2
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Description
【発明の詳細な説明】
本発明は、病原性菌として知られているボルデテラ（Ｂ
ｏｒｄｅｔｅｌｌａ ）属に属する微生物を利用した生
物学的活性物質の製法に関する。
ｏｒｄｅｔｅｌｌａ ）属に属する微生物を利用した生
物学的活性物質の製法に関する。
ボルデテラ属に属する微生物としては、百日咳菌、バラ
百日咳菌、気管支敗血症菌等があり、これらは種々の生
物学的活性物質を産生ずる。
百日咳菌、気管支敗血症菌等があり、これらは種々の生
物学的活性物質を産生ずる。
例えば、百日咳■相菌の培養物（培養培地と菌体）から
は、各種糖尿病治療乃至予防薬としての展開が期待しう
るところの、インシュリン分泌増強活性物質（ｌ５ｌｅ
ｔ ａｃｔｉｖａｔｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎ以下Ｉ
ＡＰと略記する）や、百日咳菌のワクチンコンポーネン
トとして注目されている白血球増加因子（Ｌｅｕｃｏｃ
ｙｔｏｓｉｓ Ｐｒｏｍｏｔｉｎｇ Ｆａｃｔｏｒ、以
下ＬＰＦと略記する）等、医療上有効な生物学的活性物
質が得られる。
は、各種糖尿病治療乃至予防薬としての展開が期待しう
るところの、インシュリン分泌増強活性物質（ｌ５ｌｅ
ｔ ａｃｔｉｖａｔｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎ以下Ｉ
ＡＰと略記する）や、百日咳菌のワクチンコンポーネン
トとして注目されている白血球増加因子（Ｌｅｕｃｏｃ
ｙｔｏｓｉｓ Ｐｒｏｍｏｔｉｎｇ Ｆａｃｔｏｒ、以
下ＬＰＦと略記する）等、医療上有効な生物学的活性物
質が得られる。
ところが、百日咳■相菌は相変化をおこし易く安定した
培養が難しく、その結果菌の抗原性、病原性、ＬＰＦ産
生能あるいはＩＡＰ産生能が培養条件によって著しく異
なるという問題点があった。
培養が難しく、その結果菌の抗原性、病原性、ＬＰＦ産
生能あるいはＩＡＰ産生能が培養条件によって著しく異
なるという問題点があった。
かかる問題点を解消する試みが従来性なわれてきた。
例えば、ロワットら（Ｒｏｗａｔｔ Ｅｏ、ジャーナル
オブ ジェネラル マイクロバイオロジー（Ｊ、 ｇｅ
ｎ、 Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ ） １７巻、２７９
−２９６頁及び２９７−３２６頁、１９５７年）によれ
ばボルデテラ属の微生物、とりわけ百日咳■相菌の培養
を抑制する因子としては、以下のものが挙げられている
。
オブ ジェネラル マイクロバイオロジー（Ｊ、 ｇｅ
ｎ、 Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ ） １７巻、２７９
−２９６頁及び２９７−３２６頁、１９５７年）によれ
ばボルデテラ属の微生物、とりわけ百日咳■相菌の培養
を抑制する因子としては、以下のものが挙げられている
。
（１）システィンの加熱（オートクレーブ）処理によっ
て得られるコロイド状サルファイド又はサルファー。
て得られるコロイド状サルファイド又はサルファー。
（２）カゼイン加水分解物のオートクレーブ処理により
得られる過酸化水素又は有機過酸化物。
得られる過酸化水素又は有機過酸化物。
（３）菌が二次的に産生ずる不飽和脂肪酸、とりわけオ
レイン酸。
レイン酸。
そしてこれらの抑制効果を打消す培地への添加物として
、（１）に関してはアルブミン、赤血球又はその破砕物
、活性炭、イオン交換樹脂、（２）に関してはカタラー
ゼ、ヘミン、ＦｅＳＯ４、（３）に関してはスターチ、
アミロース、デキストリン等が挙げられているが、これ
ら添加物の効果は菌の接種数が１×１０６個以下では不
安定である。
、（１）に関してはアルブミン、赤血球又はその破砕物
、活性炭、イオン交換樹脂、（２）に関してはカタラー
ゼ、ヘミン、ＦｅＳＯ４、（３）に関してはスターチ、
アミロース、デキストリン等が挙げられているが、これ
ら添加物の効果は菌の接種数が１×１０６個以下では不
安定である。
また活性炭、イオン交換樹脂、アミロースなどの吸着剤
の添加も効果があるとされるが、培地中に不均一な部分
を形成しやす（必ずしも十分なものであるとは言えない
。
の添加も効果があるとされるが、培地中に不均一な部分
を形成しやす（必ずしも十分なものであるとは言えない
。
赤血球、アルブミンなどの添加物は、これらがロット的
に組成変化しやす（又、変性し易いので、保存に適し且
つ安定した培地を調製するには適切ではない。
に組成変化しやす（又、変性し易いので、保存に適し且
つ安定した培地を調製するには適切ではない。
近年、ステナー（５ｔａｉｎｅｒ ）及びショルテー（
５ｃｈｏｌｔｅ ）によってこの百日咳■相菌の大量培
養のための合成培地が開発された（ジャーナルオブ ジ
ェネラル マイクロバイオロジーＪ。
５ｃｈｏｌｔｅ ）によってこの百日咳■相菌の大量培
養のための合成培地が開発された（ジャーナルオブ ジ
ェネラル マイクロバイオロジーＪ。
ｇｅｎ、 Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ ） ６３巻、２１１
−２２０頁、１９７１年）このステナー・ショルテー培
地（以下ＳＳ培地と略記する）は天然物由来の血液及び
ポリペプトン等、ロット差に変動の考えられる添加物を
含まないため、菌の培地組成を厳密にコントロールし得
るので、菌性状に変化をもたらすことな（、培養を行い
得ること、及び前述したＩＡＰもしくはＬＰＦの如き生
物学的活性物質の分離・精製に際し、不要な他種蛋白質
の夾雑を防ぎ得る等の特長を有すので近年百日咳ワクチ
ン及び百月咳菌よりの生物学的活性物質を工業的規模で
製造するのに広（用いられているが、攪拌下もしくは静
置下の液体培養条件で、特に接種サイズが１０７コロニ
ー／ｍｌ以下の場合、ＬＰＦの産生能力等の点で安定な
生育特性が得られないという欠点を有する。
−２２０頁、１９７１年）このステナー・ショルテー培
地（以下ＳＳ培地と略記する）は天然物由来の血液及び
ポリペプトン等、ロット差に変動の考えられる添加物を
含まないため、菌の培地組成を厳密にコントロールし得
るので、菌性状に変化をもたらすことな（、培養を行い
得ること、及び前述したＩＡＰもしくはＬＰＦの如き生
物学的活性物質の分離・精製に際し、不要な他種蛋白質
の夾雑を防ぎ得る等の特長を有すので近年百日咳ワクチ
ン及び百月咳菌よりの生物学的活性物質を工業的規模で
製造するのに広（用いられているが、攪拌下もしくは静
置下の液体培養条件で、特に接種サイズが１０７コロニ
ー／ｍｌ以下の場合、ＬＰＦの産生能力等の点で安定な
生育特性が得られないという欠点を有する。
またＳＳ培地に寒天を１．２％となるように加えて固化
して得た寒天培地（以下ＳＳＡ培地と略記する）では、
１０３コロニー数以下の播種（シード）でのコロニー形
成は認められないという大きな欠陥を有する。
して得た寒天培地（以下ＳＳＡ培地と略記する）では、
１０３コロニー数以下の播種（シード）でのコロニー形
成は認められないという大きな欠陥を有する。
本発明者らは、従来技術の欠点を改良し、ボルデテラ層
に属する微生物から安定にかつ効率良く生物学的活性物
質を得るべく鋭意研究の結果、本発明に到達した。
に属する微生物から安定にかつ効率良く生物学的活性物
質を得るべく鋭意研究の結果、本発明に到達した。
即ち、本発明はボルデテラ層に属する微生物を、シクロ
デキストリン又はその誘導体を含有する培地で培養し、
培養物（培養培地と菌体）から赤血球凝集活性を有する
物質を採取することを特徴とする、生物学的活性物質の
製法と、その際に使用される培地である。
デキストリン又はその誘導体を含有する培地で培養し、
培養物（培養培地と菌体）から赤血球凝集活性を有する
物質を採取することを特徴とする、生物学的活性物質の
製法と、その際に使用される培地である。
ボルデテラ族に属する微生物、例えば百日咳菌は、百日
咳の感染防御抗原となる２種類の赤血球凝集素（ＨＡ）
を産生ずることが知られている。
咳の感染防御抗原となる２種類の赤血球凝集素（ＨＡ）
を産生ずることが知られている。
一つは繊維状赤血球凝集素（Ｆ−ＨＡ）であり、他はＬ
ＰＦ−赤血球凝集素（ＬＰＦ−ＨＡ）である。
ＰＦ−赤血球凝集素（ＬＰＦ−ＨＡ）である。
繊維状赤血球凝集素は分子量約１３万の蛋白質で菌体表
面に存在し、この物質自身は生体に毒性は示さないが、
赤血球や各種動物細胞の細胞膜に吸着、細胞凝集を導く
性質がある。
面に存在し、この物質自身は生体に毒性は示さないが、
赤血球や各種動物細胞の細胞膜に吸着、細胞凝集を導く
性質がある。
このＨＡの分子形態が２×４０ｎｍの繊維状構造をして
いることからＦ ｉｌａｍｅｎｔｏｕｓ −Ｈｅｍａｇ
ｇｌｕｔｉｎｉｎ （Ｆ −ＨＡ）とよばれる。
いることからＦ ｉｌａｍｅｎｔｏｕｓ −Ｈｅｍａｇ
ｇｌｕｔｉｎｉｎ （Ｆ −ＨＡ）とよばれる。
ＬＰＦ−赤血球凝集素は分子量約１１万の粒子状蛋白で
、高度に精製され、結晶化されたこのＨＡは赤血球凝集
活性以外に、生体に投与した場合、種々のユニークな生
物活性を発現する。
、高度に精製され、結晶化されたこのＨＡは赤血球凝集
活性以外に、生体に投与した場合、種々のユニークな生
物活性を発現する。
たとえば、この蛋白質を０．１μ？、マウス尾静脈に接
種すると、２〜３日後、末梢血中の白血球数、特に小リ
ンパ球数が著しく増加し、いわゆる白血球増多症Ｌｅｕ
ｋｏｃｙｔｏｓｉｓ （またはＬｙｍｐｈｏｃｙｔｏｓ
ｉｓ ）が導かれる。
種すると、２〜３日後、末梢血中の白血球数、特に小リ
ンパ球数が著しく増加し、いわゆる白血球増多症Ｌｅｕ
ｋｏｃｙｔｏｓｉｓ （またはＬｙｍｐｈｏｃｙｔｏｓ
ｉｓ ）が導かれる。
それゆえこの蛋白質は白血球増多因子（Ｌｅｕｋｏｃｙ
ｔｏｓｉｓ −Ｐｒｏｍｔｉｎｇ −Ｆａｃｔｏｒ ：
ＬＰＦ）とも呼ばれている。
ｔｏｓｉｓ −Ｐｒｏｍｔｉｎｇ −Ｆａｃｔｏｒ ：
ＬＰＦ）とも呼ばれている。
また、この物質はヒスタミン増感因子（Ｈｉｓｔ−ａｍ
ｉｎｅ −Ｓ ｅｎｓｉｔｉｚｉｎｇ −Ｆａｃｔｏｒ
： ＨＳ Ｆ ）とも呼ばれる。
ｉｎｅ −Ｓ ｅｎｓｉｔｉｚｉｎｇ −Ｆａｃｔｏｒ
： ＨＳ Ｆ ）とも呼ばれる。
それは、この物質で処理されたマウス、ラットなどは生
体の有毒アミンであるヒスタミン、セロトニンなどに著
しく感受性が高められ、通常の致死量のｉ／１００程度
のヒスタミン接種で容易に死亡するようになるためであ
る。
体の有毒アミンであるヒスタミン、セロトニンなどに著
しく感受性が高められ、通常の致死量のｉ／１００程度
のヒスタミン接種で容易に死亡するようになるためであ
る。
また、この物質は、アイレット活性化蛋白（Ｉ ５ｌｅ
ｔ −Ａｃｔｉｖａｔｉｎｇ −Ｐｒｏｔｅｉｎ ：
Ｉ ＡＰ ）とも呼ばれる。
ｔ −Ａｃｔｉｖａｔｉｎｇ −Ｐｒｏｔｅｉｎ ：
Ｉ ＡＰ ）とも呼ばれる。
すなわち、この蛋白質を投与された動物の末梢血中のイ
ンスリン濃度の上昇が知られ、それはこの物質が膵臓の
ランゲルハンス島のβ細胞を刺激してインスリン分泌を
促進するためであるといわれている。
ンスリン濃度の上昇が知られ、それはこの物質が膵臓の
ランゲルハンス島のβ細胞を刺激してインスリン分泌を
促進するためであるといわれている。
本発明におけるボルデテラ層に属する微生物とは、百日
咳菌、バラ百日咳菌、気管支敗血症菌をいう。
咳菌、バラ百日咳菌、気管支敗血症菌をいう。
本発明において好ましく用いられるのは百日咳菌であり
、なかでも百日咳■相菌が好ましい。
、なかでも百日咳■相菌が好ましい。
ボルデテラ層に属する微生物の菌学的性質及び培養条件
等に関しては、Ｂｅｒｇｙｓ Ｍａｎｕｓｌ ｏｆＤ
ｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｖｅ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ
、第８版、１９７４年、Ｔｈｅ Ｗｉｌｌｉａｍｓ ＆
ＷｉｌｌｋｉｎｓＣｏ、 発行やＪ、Ｅｘｐ Ｍｅ
ｄ、 １２９巻、第５２３−５５０頁、１９６９年あ
るいは細菌学実習提要、第３版、第８０頁以下、昭和４
７年、丸善発行等がありすでに公知である。
等に関しては、Ｂｅｒｇｙｓ Ｍａｎｕｓｌ ｏｆＤ
ｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｖｅ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ
、第８版、１９７４年、Ｔｈｅ Ｗｉｌｌｉａｍｓ ＆
ＷｉｌｌｋｉｎｓＣｏ、 発行やＪ、Ｅｘｐ Ｍｅ
ｄ、 １２９巻、第５２３−５５０頁、１９６９年あ
るいは細菌学実習提要、第３版、第８０頁以下、昭和４
７年、丸善発行等がありすでに公知である。
シクロデキストリンは、澱粉あるいは澱粉の加水分解物
にＢａｃｉｌｌｕｓ ｍａｃｅｒａｕｓ ａｍｙｌａ
ｓｅ（ｔｒａｎｓｇｌｙｃｏｓｙｌａｓｅ ）等を作用
させて得られる、Ｄ−グリコピラノース基が６〜１０個
α−１・４グリコシド結合によって環状に結合した王冠
状の分子である。
にＢａｃｉｌｌｕｓ ｍａｃｅｒａｕｓ ａｍｙｌａ
ｓｅ（ｔｒａｎｓｇｌｙｃｏｓｙｌａｓｅ ）等を作用
させて得られる、Ｄ−グリコピラノース基が６〜１０個
α−１・４グリコシド結合によって環状に結合した王冠
状の分子である。
そのうち主なものは６．７または８個のＤ−グリコピラ
ノース基からなり、それぞれα−１β−１γ−シクロデ
キストリンと呼ばれている。
ノース基からなり、それぞれα−１β−１γ−シクロデ
キストリンと呼ばれている。
本発明におけるシクロデキストリンとは、前記α、β、
γ等のシクロデキストリン又はそれらの混合物をいう。
γ等のシクロデキストリン又はそれらの混合物をいう。
シクロデキストリン分子は多数の１級及び２級水酸基を
有するので、単糖類に広く用いられている反応を適用し
て種々の誘導体が得られる。
有するので、単糖類に広く用いられている反応を適用し
て種々の誘導体が得られる。
本発明におけるシクロデキストリン誘導体とはかかる方
法で得られる誘導体を意味し、例えばアミノシクロデキ
ストリンやアミノデオキシシクロデキストリンの如きア
ミノ化誘導体、アセチルシクロデキストリンやニトロシ
クロデキストリンの如キエステル化誘導体、メチルシク
ロデキストリン、エテルシクロデキストリン、プロピル
シクロデキストリン、カルポキンルメテルシクロデキス
トリンの如きエーテル化誘導体（エーテル化シクロデキ
ストリン）がある。
法で得られる誘導体を意味し、例えばアミノシクロデキ
ストリンやアミノデオキシシクロデキストリンの如きア
ミノ化誘導体、アセチルシクロデキストリンやニトロシ
クロデキストリンの如キエステル化誘導体、メチルシク
ロデキストリン、エテルシクロデキストリン、プロピル
シクロデキストリン、カルポキンルメテルシクロデキス
トリンの如きエーテル化誘導体（エーテル化シクロデキ
ストリン）がある。
本発明において好ましいのはエーテル化シクロデキスト
リンであり、中でもヘキサキス（２・６−０−ジメチル
）α−シクロデキストリン（Ｍｅα−ＣＤ）やヘプタキ
ス（２・６−〇−ジメチル）β−シクロデキストリン（
Ｍｅβ−ＣＤ）等のメチルシクロデキストリンが特に好
ましい。
リンであり、中でもヘキサキス（２・６−０−ジメチル
）α−シクロデキストリン（Ｍｅα−ＣＤ）やヘプタキ
ス（２・６−〇−ジメチル）β−シクロデキストリン（
Ｍｅβ−ＣＤ）等のメチルシクロデキストリンが特に好
ましい。
本発明において培地とは、ブイヨンやペプトン水などの
従来公知の液状培地、あるいは液状培地に寒天、ゼラチ
ン、卵白、血清などを加えて固形にした従来公知の固形
培地を意味するが好ましいのはＳＳ培地、及びこれに寒
天を１〜２ ％（Ｗ／Ｖ）程度添加し固化したＳＳ培地である。
従来公知の液状培地、あるいは液状培地に寒天、ゼラチ
ン、卵白、血清などを加えて固形にした従来公知の固形
培地を意味するが好ましいのはＳＳ培地、及びこれに寒
天を１〜２ ％（Ｗ／Ｖ）程度添加し固化したＳＳ培地である。
ＳＳ培地は、１１あたり、ダルタミン酸ナトリウム、■
−プロリン、塩化ナトリウム、リン酸２水素カリウム、
塩化カリウム、塩化マグネシウム、塩加カルシウム、ト
リスヒドロキシメチルアミンメタンを、それぞれ１０．
７．０．２４．２．５．０，５．０．２．０．１．０．
０２．１．５２５１を含む水溶液を濃塩酸でｐＨ７，６
に調整した後１２１℃で１５分間オートクレーブで滅菌
して得られる基礎培地に、ｌ−シスチン、硫酸第１鉄、
アスコルビン酸、ニアシン、還元型グルタチオンを１１
あたり、それぞれ４．１．２．０．４．１０１含む溶液
をミリポアフィルタ−（０，４５μ）で除菌して得られ
る補液を、基礎培地に対して１．０％（Ｖ／Ｖ’）の割
合で加えて得られる。
−プロリン、塩化ナトリウム、リン酸２水素カリウム、
塩化カリウム、塩化マグネシウム、塩加カルシウム、ト
リスヒドロキシメチルアミンメタンを、それぞれ１０．
７．０．２４．２．５．０，５．０．２．０．１．０．
０２．１．５２５１を含む水溶液を濃塩酸でｐＨ７，６
に調整した後１２１℃で１５分間オートクレーブで滅菌
して得られる基礎培地に、ｌ−シスチン、硫酸第１鉄、
アスコルビン酸、ニアシン、還元型グルタチオンを１１
あたり、それぞれ４．１．２．０．４．１０１含む溶液
をミリポアフィルタ−（０，４５μ）で除菌して得られ
る補液を、基礎培地に対して１．０％（Ｖ／Ｖ’）の割
合で加えて得られる。
本発明において、前記培地に添加混合されるシクロデキ
ストリン又はその誘導体の量は、接種される菌の量に依
存するが、例えば、接種される菌が１０６〜１０５コロ
ニー／ｒＪｌの場合には、前記培地に１０〜５０００１
ｎ９／ｍ１１好ましくは１００〜１０００μ？／ｒｒｔ
ｌの割合でシクロデキストリン又はその誘導体を添加混
合し、本発明において用いられる培地を得る。
ストリン又はその誘導体の量は、接種される菌の量に依
存するが、例えば、接種される菌が１０６〜１０５コロ
ニー／ｒＪｌの場合には、前記培地に１０〜５０００１
ｎ９／ｍ１１好ましくは１００〜１０００μ？／ｒｒｔ
ｌの割合でシクロデキストリン又はその誘導体を添加混
合し、本発明において用いられる培地を得る。
かかるシクロデキストリン又はその誘導体の添加培地、
とりわけ添加ＳＳ培地は菌が安定に且つ効率良く生育す
るので糖尿病治療薬としての医薬効果が期待されるＩＡ
Ｐ、百日咳ワクチンコンポーネントとして期待されるＬ
ＰＦ及び菌体ワクチン等の活性物質の製造上極めて有利
な培地である。
とりわけ添加ＳＳ培地は菌が安定に且つ効率良く生育す
るので糖尿病治療薬としての医薬効果が期待されるＩＡ
Ｐ、百日咳ワクチンコンポーネントとして期待されるＬ
ＰＦ及び菌体ワクチン等の活性物質の製造上極めて有利
な培地である。
かかる培地を用いたボルデテラ属に属する微生物の培養
方法及び条件は特に限定されるものではなく、従来公知
の方法及び条件を採用できるが、静置培養よりは振と５
培養の方が好ましく、培養温度は３５℃前後、培養時間
は１０〜１００時間が適当である。
方法及び条件は特に限定されるものではなく、従来公知
の方法及び条件を採用できるが、静置培養よりは振と５
培養の方が好ましく、培養温度は３５℃前後、培養時間
は１０〜１００時間が適当である。
培養物（培養培地と菌体）から、生成された生物学的活
性物質を採取する方法、手段も特に限定されるものでは
なく、公知の方法、手段を利用できる。
性物質を採取する方法、手段も特に限定されるものでは
なく、公知の方法、手段を利用できる。
例えば、ＬＰＦを得るには、百日咳Ｉ相菌（ボルデテラ
・パタシス東浜株）を３００μｙ′／ｙｄのメチルβ−
シクロデキストリンを含むＳＳ培地にて３５℃で１８時
間培養し、得られる培養液の遠心上清（ｐＨ８，６）を
、ｐＨ８，０の０．００１Ｍリン酸緩衝液で平衡化した
・・イドロキシアパタイトカラムに通過せしめる。
・パタシス東浜株）を３００μｙ′／ｙｄのメチルβ−
シクロデキストリンを含むＳＳ培地にて３５℃で１８時
間培養し、得られる培養液の遠心上清（ｐＨ８，６）を
、ｐＨ８，０の０．００１Ｍリン酸緩衝液で平衡化した
・・イドロキシアパタイトカラムに通過せしめる。
そして、得られる通過液をｐＨ６，０に調整した後、今
度は、ｐＨ６，０の０．０１Ｍ！Ｊン酸緩衝液で平衡化
したハイドロキシアパタイトカラムに吸着させ、これを
０．５ Ｍ塩化ナトリウムを含む０．１Ｍリン酸緩衝液
（ｐＨ７，０）で溶出して蛋白分画を得る。
度は、ｐＨ６，０の０．０１Ｍ！Ｊン酸緩衝液で平衡化
したハイドロキシアパタイトカラムに吸着させ、これを
０．５ Ｍ塩化ナトリウムを含む０．１Ｍリン酸緩衝液
（ｐＨ７，０）で溶出して蛋白分画を得る。
この蛋白分画をハプトグロビン−セファロースを支持体
とするアフィニティークロマトグラフィーに吸着させ、
０．５ＭＮａ Ｃ１及び３Ｍのチオシアン化カリウムを
含む０．１Ｍリン酸緩衝液で脱着してＬＰＦを得ること
ができる。
とするアフィニティークロマトグラフィーに吸着させ、
０．５ＭＮａ Ｃ１及び３Ｍのチオシアン化カリウムを
含む０．１Ｍリン酸緩衝液で脱着してＬＰＦを得ること
ができる。
またｐＨ８，０のハイドロキシアパタイトカラムに吸着
されたものを、０．５Ｍ塩化ナトリウムを含む０．１
Ｍ ＩＪン酸緩衝液（ｐＨ７，０）で溶出して蛋白分画
を得る。
されたものを、０．５Ｍ塩化ナトリウムを含む０．１
Ｍ ＩＪン酸緩衝液（ｐＨ７，０）で溶出して蛋白分画
を得る。
この蛋白分画をハプトグロビンセファロース４Ｂを支持
体とするアフィニティークロマトグラフィーに通過せし
め、通過液よりＦ−ＨＡを得ることができる。
体とするアフィニティークロマトグラフィーに通過せし
め、通過液よりＦ−ＨＡを得ることができる。
以下、実施例により本発明を詳述する。
実施例 １
ボルデテラパタシス（Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａｐｅｒｔｕ
ｓｓｉｓ ） （百日咳菌）東浜株■相菌の凍結乾燥菌
体を１％カザミノ酸溶液に懸濁させ、脱繊維馬血液を２
０％含むボルダ・ジャングー （Ｂｏｒｄｅｔ −Ｇｅｎｇｏｕ ）培地（以下ＢＧ培
地という）で３５℃、３日間培養した。
ｓｓｉｓ ） （百日咳菌）東浜株■相菌の凍結乾燥菌
体を１％カザミノ酸溶液に懸濁させ、脱繊維馬血液を２
０％含むボルダ・ジャングー （Ｂｏｒｄｅｔ −Ｇｅｎｇｏｕ ）培地（以下ＢＧ培
地という）で３５℃、３日間培養した。
この菌を１白金耳かき取り、更にＢＧ培地で２４時間リ
フレッシュした菌をＳＳ培地に懸濁し、接種菌懸濁液を
得た。
フレッシュした菌をＳＳ培地に懸濁し、接種菌懸濁液を
得た。
この接種菌懸濁液を、所定の濃度のＭｅβ−ＣＤを含む
ＳＳ培地に１０７コロニー／ｒｆＬｌとナル様に懸濁さ
せ、静置又は振とう条件下、３５℃で１８時間培養を行
った。
ＳＳ培地に１０７コロニー／ｒｆＬｌとナル様に懸濁さ
せ、静置又は振とう条件下、３５℃で１８時間培養を行
った。
培養後、培養液の濁度（０Ｄ６５０ ）を測定し、次に
以下の如き方法で産生されたＬＰＦを採取しその活性を
測定した。
以下の如き方法で産生されたＬＰＦを採取しその活性を
測定した。
培養液の遠心上清（ｐＨ８，６）を、ｐＨ８，０の０．
ＯＩＭＩＪン酸緩衝液で平衡化したハイドロキシアパタ
イトカラムに通過せしめ、得られる通過液をｐＨ６０に
調整した後、今度はｐＨ６０の０．ＯＩＭ’Ｊン酸緩衝
液で平衡化したハイドロキシアパタイトカラムに吸着さ
せ、これを０．５Ｍ塩化ナトリウムを含む０．１Ｍリン
酸緩衝液（ｐＨ７，０）で溶出して蛋白分画を得た。
ＯＩＭＩＪン酸緩衝液で平衡化したハイドロキシアパタ
イトカラムに通過せしめ、得られる通過液をｐＨ６０に
調整した後、今度はｐＨ６０の０．ＯＩＭ’Ｊン酸緩衝
液で平衡化したハイドロキシアパタイトカラムに吸着さ
せ、これを０．５Ｍ塩化ナトリウムを含む０．１Ｍリン
酸緩衝液（ｐＨ７，０）で溶出して蛋白分画を得た。
この蛋白分画をハプトグロビン−セファロースを支持体
とするアフィニティークロマトグラフィーに吸着させ、
０．５Ｍ ＮａＣ１及び３Ｍのチオシアン化カリウム
を含む０．１ Ｍ ）リス緩衝液で脱着してＬＰＦを得
た。
とするアフィニティークロマトグラフィーに吸着させ、
０．５Ｍ ＮａＣ１及び３Ｍのチオシアン化カリウム
を含む０．１ Ｍ ）リス緩衝液で脱着してＬＰＦを得
た。
ＬＰＦ活性は、佐原らの酵素抗体法（ＥＬＩＳＡ法、第
２８回毒素シンポジウム（１９８１年７月２３日〜２４
Ｂ、岩手県八幡平）講演要旨集、第１４１〜１４４頁参
照）によって測定し、ＬＰＦの活性単位（ｕ）は、ＯＤ
４００ｍμが、単位容量（ｍｌ）当り０．１を与える各
サンプルの希釈倍数であられした。
２８回毒素シンポジウム（１９８１年７月２３日〜２４
Ｂ、岩手県八幡平）講演要旨集、第１４１〜１４４頁参
照）によって測定し、ＬＰＦの活性単位（ｕ）は、ＯＤ
４００ｍμが、単位容量（ｍｌ）当り０．１を与える各
サンプルの希釈倍数であられした。
結果を第１図に示した。
第１図から、Ｍｅβ−ＣＤは、特に振とう条件下で、菌
体当りのＬＰＦ産生能を著しく増大させていることがわ
かる。
体当りのＬＰＦ産生能を著しく増大させていることがわ
かる。
なお、Ｍｅα−ＣＤを用いた場合も、はぼ同様な結果が
得られた。
得られた。
実施例 ２
実施例１と同様の方法で得られた接種菌懸濁液を、Ｍｅ
β−ＣＤを５００ ｉｔ？／ｒ／ｌｌ含むＳＳ培地１５
０ＴＬｌに３．３Ｘ１０８コｏ −＝−−／ｒｕｌとな
る様に懸濁させ、振と５条件下、３５℃で所定時間培養
を行った。
β−ＣＤを５００ ｉｔ？／ｒ／ｌｌ含むＳＳ培地１５
０ＴＬｌに３．３Ｘ１０８コｏ −＝−−／ｒｕｌとな
る様に懸濁させ、振と５条件下、３５℃で所定時間培養
を行った。
培養時間と培養液の濁度及び産生されたＬＰＦの量（Ｌ
ＰＦ活性）との関係を第２図に示した。
ＰＦ活性）との関係を第２図に示した。
なお、ＬＰＦ活性の測定は実施例１の場合と同様にして
行った。
行った。
第２図から、少なくとも培養時間が２０時間を越るとＭ
ｅβ−ＣＤの有無によって、培養液の測度、即ち生育し
た菌の絶対量は大差がないが、産生されるＬＰＦＯ量は
著しく異なり、Ｍｅβ−ＣＤの存在によって百日咳菌の
ＬＰＦ産生能が著しく増大していることがわかる。
ｅβ−ＣＤの有無によって、培養液の測度、即ち生育し
た菌の絶対量は大差がないが、産生されるＬＰＦＯ量は
著しく異なり、Ｍｅβ−ＣＤの存在によって百日咳菌の
ＬＰＦ産生能が著しく増大していることがわかる。
第１図は、培地へのＭｅβ−ＣＤの添加量と培養液の濁
度及び産生されたＬＰＦの量（ＬＰＦ活性）との関係を
示す図である。 第２図は、培地へのＭｅβ−ＣＤの添加の有無の場合に
おける、培養時間と培養液の濁度及びＬＰＦＯ量との関
係を示す図である。
度及び産生されたＬＰＦの量（ＬＰＦ活性）との関係を
示す図である。 第２図は、培地へのＭｅβ−ＣＤの添加の有無の場合に
おける、培養時間と培養液の濁度及びＬＰＦＯ量との関
係を示す図である。
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 １ ボルデテラ（Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ ）族に属する
微生物を、シクロデキストリン又はその誘導体を含有す
る培地で培養し、培養物から赤血球凝集活性を有する物
質を採取することを特徴とする、生物学的活性物質の製
法。 ２ シクロデキストリンの誘導体がエーテル化シクロデ
キストリンである、特許請求の範囲第１項記載の生物学
的活性物質の製法。 ３ エーテル化シクロデキストリンがメチルシクロデキ
ストリンである、特許請求の範囲第２項記載の生物学的
活性物質の製法。
Priority Applications (11)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP16347881A JPS5918989B2 (ja) | 1981-10-15 | 1981-10-15 | 生物学的活性物質の製法 |
| US06/427,039 US4500639A (en) | 1981-10-15 | 1982-09-29 | Culturing Bordetella in media containing etherified cyclodextrin |
| AU89192/82A AU554066B2 (en) | 1981-10-15 | 1982-10-07 | Cyclodextrin additive to bordetella culture medium |
| CA000413002A CA1198702A (en) | 1981-10-15 | 1982-10-07 | Method of culturing microbes belonging to the genus bordetella and culture medium |
| ES516507A ES8404407A1 (es) | 1981-10-15 | 1982-10-14 | Un metodo para el cultivo estable y eficaz de microbios del ginero bordetella. |
| DE8282305465T DE3279841D1 (en) | 1981-10-15 | 1982-10-14 | Method of culturing microbes belonging to the genus bordetella and culture medium |
| AT82305465T ATE44979T1 (de) | 1981-10-15 | 1982-10-14 | Verfahren zur zuechtung von mikroben der gattung bordetella und naehrboden. |
| EP82305465A EP0077646B1 (en) | 1981-10-15 | 1982-10-14 | Method of culturing microbes belonging to the genus bordetella and culture medium |
| SU823505901A SU1384206A3 (ru) | 1981-10-15 | 1982-10-15 | Способ культивировани бактерий ВоRDетеLLа реRтUSSIS |
| KR8204639A KR870001650B1 (ko) | 1981-10-15 | 1982-10-15 | 보르데텔라 속에 속하는 미생물의 배양방법 및 배양배지 |
| MYPI87000101A MY100052A (en) | 1981-10-15 | 1987-02-05 | Method of culturing microbes belonging to the genus bordetella and culture medium. |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP16347881A JPS5918989B2 (ja) | 1981-10-15 | 1981-10-15 | 生物学的活性物質の製法 |
Related Child Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP58244546A Division JPS59187778A (ja) | 1983-12-27 | 1983-12-27 | 微生物を培養するための培地 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS5867188A JPS5867188A (ja) | 1983-04-21 |
| JPS5918989B2 true JPS5918989B2 (ja) | 1984-05-01 |
Family
ID=15774632
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP16347881A Expired JPS5918989B2 (ja) | 1981-10-15 | 1981-10-15 | 生物学的活性物質の製法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPS5918989B2 (ja) |
Families Citing this family (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS61271986A (ja) * | 1985-05-27 | 1986-12-02 | Agency Of Ind Science & Technol | リンパ系細胞用培地 |
| GB201316351D0 (ja) * | 2013-09-13 | 2013-10-30 | Glaxosmithkline Biolog Sa |
-
1981
- 1981-10-15 JP JP16347881A patent/JPS5918989B2/ja not_active Expired
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPS5867188A (ja) | 1983-04-21 |
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