JPS5919088B2 - 水溶液からのピロジエン性物質の除去法 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 少量のピロジエン（ｐｙｒｏｇｅｎｓ）はその強イオン
溶液を塩基性陰イオン交換樹脂を通すことにより水溶液
から除去される。

Ｌ−アスパラギナーゼはアスパラギンのアスパラギン酸
及びアンモニアへの加水分解を触媒する能力を持つこと
が発見された既知酵素である。

それ故それは、増殖にアスパラギンを要求する腫瘍（ｔ
ｕｍｏｒｓ ）に対する治療法として、非常に有望な利
用価値をもつことが判った。

Ｌ−アスパラギナーゼは一般にエシエリッヒア コリ （Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ）の菌株を用
いて微生物によって作られる。

しかしながら、菌体内Ｌ−アスパラギナーゼが醗酵混合
液中に放出されるとき、Ｅ、コリ（Ｅ、ｃｏｌｉ）細胞
からかなりの量エンドトキシン即ちピロジエンも又放出
される。

これらのピロジエンは醗酵培地から又は非無菌的過程に
おいて混入した他のピロジエンと同様に、精製したＬ−
アスパラギナーゼから除去することは困難であり、Ｌ−
アスパラギナーゼとともに少量投与した場合でも、ある
毒性症状が施した対象に現われる。

毒性副作用を最小化するためにこれらのピロジエンをＬ
−アスパラギナーゼ及び他の酵素及び注射用製品から除
去する有効な方法を発見することはこの分野を研究する
者の目標であった。

合衆国特許第３６３４１９６号（Ｕ、Ｓ。

Ｐａｔｅｎｔ ３６３４１９６ ）はジエチ／Ｉｚ７ミ
ノエチル ゲルのカラム及び弱イオン性バッファーを使
用したＬ−アスパラギナーゼからの少量のピロジエンの
除去法を記載している。

この方法を使用して、ＵＳＰうさぎピロジエン試験にお
いて動物にｇ当り２００単位の酵素投与で０．４８℃温
度上昇を示すＬ−アスパラギナーゼが得られた。

しかしながら、ｋｇ当２００単位でＵＳＰうさぎピロジ
エン試験を通過するＬ−アスパラギナーゼは、現在では
実際にＬ−アスパラギナーゼの投与量が増大している故
、残留するピロジエンによってなおある毒性症状を示す
ことが判明した。

その結果Ｌ−アスパラギナーゼがＵＳＰうさぎピロジエ
ン試験を通過しなげればならない最少投与量はｋｇ当り
１．０００単位に高められ、更に酵素はｍｌ当９２５０
０単位でリムラス溶解質試験を通過しなげればならなく
なった。

それ故この試験の要求に応え、商品として安全な生産物
を提供する方法を発見する仕事は続けられた。

更にＬ−アスパラギナーゼ溶液以外の水溶液からピロジ
エン性物質を除去するよう方法を拡大させる研究も行わ
れた。

このような方法によって、他の酵素及び注射投与のため
の他の製品も、ピロジエン性物質を除（ために処理する
ことができる。

次に述べる本発明はピロジエンをＬ−アスパラギナーゼ
から除（ための特異的な方法を提供すること及びピロジ
エン性物質をＬ−アスパラギナーゼ以外の水溶液から除
（ための一般方法を提供することの両方に成功した。

このように少量のピロジエンを水溶液から除去するため
の方法を述べることが本発明の目的である。

本発明のもう一つの目的はピロジエンを酵素の水溶液か
ら除去するための方法を述べることである。

更にもう一つの目的はピロジエンのＬ−アスパラギナー
ゼ水溶液からの除去方法を述べることである。

もう一つの目的は少量のピロジエンをＬ−アスパラギナ
ーゼから、生じた精製Ｌ−アスパラギナーゼがＵＳＰう
さぎピロジエン試験をｋｇ当り１０００単位で、リムラ
ス溶解質検定（Ｌｉｍｕｌｕｓ Ｌｙｓａｔｅ ａｓｓ
ａｙ）をｍｌ当り２５００単位で通過する程度まで除去
する方法を述べることである。

更なる目的は少量のピロジエンをＬ−アスパラギナーゼ
溶液から選択的に吸着させる方法を記述することである
。

次の目的は不純なＬ−アスパラギナーゼを高イオン強度
溶液に溶解させて、少量のピロジエンを塩基性陰イオン
交換樹脂のカラムに選択的に吸着させる方法を述べるこ
とである。

更なる目的はこの明細書を読むことにより明らかとなる
であろう。

合衆国特許第３６３４１９６号（Ｕ、Ｓ。

Ｐａｔｅｎｔ ３６３４１９６ ）は多量のピロジエン
を含むし一アスパラギナーゼを弱イオン性（０，０２４
モル）バッファー溶液に溶かしジエチルアミノエチル
セファデックス デキストラン ゲル（５ｅｐｈａｄｅ
ｘ ｄｅｘｔｒａｎ ｇｅｌ 、 ）のカラムを通す方
法を記載している。

この方法においては、Ｌ−アスパラギナーゼはデキスト
ラン ゲルに吸着し、次にカラムを同じ弱イオン性バッ
ファーで傾斜溶離して、ピロジエンを酵素から分離する
。

しかしながらこの従来の方法はＵＳＰうさぎピロジエン
試験をｋｇ当り１０００単位の新しい条件で通過するの
に十分ピロジエンを除去するほど選択的ではない。

加えてこの方法は少量の酵素を提供するだけの限られた
能力しかもたない。

ＵＳＰうさぎピロジエン試験とは、３匹のうさぎに薬を
投与した時、ピロジエン性物質の存在のための個々のう
さぎの温度上昇は０．６℃以下であり、３匹全ての温度
上昇の合計は１．４℃以下でなければならないというも
のである。

エンドトキシンの存在の特異的な検出に使用するもう一
つの方法はリムラス溶解質検定である。

この検定試薬はリムラス ポリフエムス （Ｌｉｍｕｌｕｓ ｐｏｌｙｐｈｅｍｕｓ ） （かぶ
とかに）の血液中の円形アメーバ様細胞の溶解質からな
る。

溶解質試薬を試験試料と適当な条件で混ぜ、３７℃で３
０分から１時間培養する。

もしエンドトキシンが存在すれば、試験溶液はゲルを形
成する。

試験はエンドトキシンに対してＵＳＰうさぎピロジエン
試験よりも一般に鋭敏であると考えられており、試験の
迅速性、必要な試料の少量さく ０．１ ｒｕｌ）、検
定のエンドトキシンに対する特異性及び特殊な装置を必
要としない検定の単純性の故に研究室において使用され
ている。

ＵＳＰうさぎピロジエン試験及びリムラス溶解質検定の
方法及び結果の比較はジャーナル オブ ラボラトリ−
＆クリニカルメジシン（Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｌａｂ
ｏｒａｔｏｒｙ ｇｚ ｃｌｉｎｉｃａｌＭｅｄｉｃｉ
ｎｅ ） ７８巻３８−４８ページ（１８７１年）に見
られる。

驚（べきことにピロジエンは、高イオン強度を有するそ
の水溶液を塩基性陰イオン交換樹脂を通すことにより、
水溶液から除去できるということが発見された。

ピロジエンは塩基性陰イオン交換樹脂に不可逆的に吸着
し、ピロジエンを含まぬ水溶液がカラムから溶出する。

溶液のＰＨは適当な鉱酸又はアルカリ金属又はアルカリ
土類金属の水酸化物、炭酸塩又は重炭酸塩を使用して６
．０から１０．０に保つ。

より詳しくは、不純なＬ−アスパラギナーゼを強イオン
性バッファー溶液に溶解し塩基性陰イオン交換樹脂を通
した時、ピロジエンは選択的かつ不可逆的に陰イオン交
換樹脂に吸着し、一方ピロジエンを含まぬＬ−アスパラ
ギナーゼ溶液はカラムを通過するということが発見され
た。

このようにして、ＵＳＰうさぎピロジエン試験をｋｇ当
り１０００単位で、そして、リムラス溶解質検定を１ｒ
Ｌｌ当り２５００単位で通過するための必要条件を備え
たＬ−アスパラギナーゼが回収される。

本発明の方法の１つを行うには、少量のピロジエンを含
むＬ−アスパラギナーゼを０．１かう０．２モルの高イ
オン強度のバッファー溶液に溶解させる。

好ましい濃度は０．１１から０．１４モルであり、０．
１２モルが最も好ましい濃度である。

更にホルムアルデヒドのような殺菌剤をクロマトグラフ
ィー系の滅菌性を保つためのゲルの前処理のために加え
ることができる。

標準バッファー及び塩のいづれも本発明に必要な高イオ
ン強度溶液を得るために使用できる。

バッファー及び塩の例にはトリスバッファー（２−アミ
ノ−２−ヒドロキシメチル−１・３−プロパンジオール
）；アルカリ金属及びアルカリ土類金属の炭酸塩、重炭
酸塩、又はリン酸塩；塩化アンモニウム、酢酸アンモニ
ウム、ギ酸アンモニウム等のアンモニウム塩；アルカリ
金属及びアルカリ土類金属の塩酸塩等がある。

リン酸イオンがバッファーの陰イオンとして好ましい。

一般にリン酸２水素ナトリウムを使用する。バッファー
溶液のＰＨは注意深く測定し、７．０から７５に保って
酵素の安定性を保証する。

もし必要ならば希鉱酸、又はアルカリ金属又はアルカリ
土類金属の水酸化物を加えてＰＨをこの範囲内に保つ。

Ｌ−アスパラギナーゼは上の条件内でバッファー溶液に
溶かし、塩基性陰イオン交換樹脂カラムに通す。

上の濃度内ではピロジエンは塩基性陰イオン交換樹脂に
選択的に吸着し、ピロジエンを含まぬＬ−アスパラギナ
ーゼを与える。

天然及び合成のポリマー骨格を有し、それに置換した４
級アンモニウム又はアミン型の塩基性基をもつ種々の塩
基性陰イオン交換樹脂が、本発明を行う時使用できる。

陰イオン交換樹脂の例には、ワットマン（Ｗｈａｔｍａ
ｎ ） ＤＥ −５２、アンバーライト（Ａｍｂｅｒｌ
ｉｔｅ ） Ｉ ＲＡ −９３８、ダウエックス（Ｄｏ
ｗｅｘ ） Ｉ Ｘ ２、セファデックス（５ｅｐｈａ
ｄｅｘ ） ＤＥＡＥ Ａ−２５及びセファデックス
（５ｅｐｈａｄｅｘ ） ＤＥＡＥ Ａ −５０があ
る。

ワットマｙ（Ｗｈａｔｍａｎ）ＤＥ−５２はイギリスケ
ント州メイドストーンのＷ＆Ｒパルストン社（Ｗ＆ＲＢ
ａｌｓｔｏｎ Ｌ ｔｄ 、ｏｆ Ｍａｉｄｓｔｏｎｅ
、 Ｋｅｎｔ 、Ｅｎｇｌａｎｄ ）によって製造さ
れているジエチルアミノエチル置換基を有する微粒子状
セルロース樹脂である。

アンバーライト（Ａｍｂｅｒｌｉｔｅ） Ｉ ＲＡ −
９３８はペンシルバニア州、フィラデルフィアのローム
アンドハース社（Ｒｏｈｍ ａｎｄ Ｈａａｓ ｃｏ
、ｏｆＰｈｉ １ａｄｅｌｐｈｉａ 、 Ｐ ｅｎｎｓ
ｙｌｖａｎｉａ ）によって販売されているトリメチル
アンモニウム置換基をもつポリスチレン−ジビニルベン
ゼン樹脂である。

ダウエックス（Ｄｏｗｅｘ ） Ｉ Ｘ ２はミシガン
州ミドランドのダウケミカル社（Ｄａｗ ｃｈｅｍ １
ｃａｌ ｃｏ 、 ｏｆＭｉｄｌａｎｄ ９Ｍｉｃｈｉ
ｇａｎ ）によって販売されているトリメチルベンジル
アンモニウム置換基をもつポリスチレン−ジビニルベン
ゼン樹脂である。

セファデックス（５ｅｐｈａｄｅｘ ） ＤＥＡＥ
Ａ −２５及びＤＥＡＥＡ−５０はスウェーデン、ウプ
サラのアクティボラゲット ファルマシア（Ａｋｔｅｉ
ｂｏｌａｇｅｔＰｈａｒｍａｃｉａ ｏｆ Ｕｐｐｓａ
ｌａ 、 Ｓｗｅｄｅｎ ）によって販売されているジ
エチルアミノエチル置換基をもつデキストラン ゲルで
ある。

本発明の方法は高濃度のピロジエン水溶液を短いカラム
（約１／１までの高さ一直経比）に通し、より希釈した
溶液で得たものに等しい結果を得ることができるという
点で従来の方法に優る利点を有する。

Ｌ−アスパラギナーゼの場合は、約５％までの濃度の溶
液が使用できる。

これは、ピロジエンを含まぬ溶液の高い生産性及び最大
流速が得られる点で、実用面で重要である。

本方法は、塩基性陰イオン交換樹脂を高イオン強度バッ
ファー溶液と混ぜ、もし必要ならば適当なＰＨに調整し
、樹脂を平衡化させる。

次に陰イオン交換樹脂なカラムに移し、充填しバッファ
ー溶液で洗う。

次に同じリン酸バッファー中し−アスパラギナーゼのよ
うな精製すべき物質溶液をカラムの断面の平方センナメ
ートル当り１時間１から８ｍｌの速度でカラムに通す。

酵素はゲルに吸着しない故、従来のようにカラムを傾斜
濃度の塩で溶出する必要はない。

ピロジエンは高イオン強度のバッファー溶液中でカラム
に不可逆的に吸着し、ピロジエンを含まぬ溶液をカラム
から出すには単一濃度の溶出液を使用することだけが必
要である。

ピロジエンを含まぬ水溶液をひとたびカラムから除くと
精製すべき物質はこの分野の精通者の既知技術でバッフ
ァー溶液から単離する。

本発明の方法によるピロジエンの水溶液からの除去の結
果、バッファー溶液から単離した物質の純度は一般に増
大する。

Ｌ−アスパラギナーゼの場合、蛋白質η当り２０単位以
上の純度の酵素をカラムにかげることができる。

η当り約４５０単位までのＬ−アスパラギナーゼがカラ
ムから溶出する。

一般に本発明をＬ−アスパラギナーゼの精製の最終段階
において用いることが好ましく、そこではカラムにかげ
る酵素はすでに実質上精製されていて（蛋白質η当り約
２００単位又はそれ以上）、存在するただ一つの不純物
はピロジエン性物質である。

そのような方法でカラムから溶出した酵素は十分な程度
にピロジエンを含まない故、その乾燥生成物はもしあっ
たとしても非常に少ない毒性症状しか示さずガンの治療
に使用できる。

本発明を次の例で説明するが、これは限定のためのもの
ではない。

例１ スウェーデン、ウプサラ、アクテイボラゲットファルマ
シア（Ａｋｔｅｉｂｏｌａｇｅｔ ｐｈａｒｍａｃｉａ
ｏｆＵｐｐｓａｌａ 、Ｓｗｅｄｅｎ ）より得たジ
メチルアミノエチル セファデックスＡ−５０デキスト
ラン２９２クラムを０．１２モル リン酸バッファー（
リン酸２水素ナトリウム）１６リツトル中Ｐ Ｈ７，２
で平衡化させる。

樹脂を直径１５ｃｒｒＬのパイレックス（Ｐｙｒｅｘ）
カラムに移し、充填し、Ｐ Ｈ７，２の０．１２モル
リン酸バッファーで洗う。

カラム洗滌液をエンドトキシンに対してリムラス溶解質
検定で試験すると、エンドトキシン不純物を含まないこ
とを示す。

充填した樹脂の容量は４８００ｒＩｌｌであり、高さ一
重径比は１．８：１である。

Ｌ−アスパラギナーゼ水溶液（ｍｌ当り１０９３０単位
、蛋白質η当り２７１単位）４０００ｍｌに濃リン酸塩
（リン酸２水素ナトリウムの形で）及び希水酸化ナトリ
ウム溶液を加えＰ Ｈ７，８の０．１２モル リン酸塩
に調整する。

Ｌ−アスパラギナーゼのバッファー溶液を樹脂カラムに
かけ、０．１２モルバッファーで溶出する。

Ｌ−アスパラギナーゼは前通過液を３９００ｍ１集めた
後、カラム通過液中に検出される。

Ｌ−アスパラギナーゼの多い分画を集め、アスパラギナ
ーゼ活性及びリムラス溶解質試験によってエンドトキシ
ン不純物を検定する。

Ｌ−アスパラギナーゼの多い分画を合わせ、希酢酸でＰ
Ｈ５−１に調整し、エタノールで沈澱させる。

スラリーを遠心分離し、固形物を０．０１モルリン酸ナ
トリウムバッファーに溶かし希水酸化ナトリウムでＰ
Ｈ７，４に調整する。

濁ったＬ−アスパラギナーゼ溶液（ｍｌ当り９４００単
位）は元の活性の７３％を有し、蛋白質■当り２８５単
位の比活性を有する。

次に溶液を０．２２ミクロンのフィルターを通して澄明
化及び減菌する。

カラム装填液及び澄明化したＬ−アスパラギナーゼ溶液
をＵＳＰうさぎピロジエン試験でｋｇ当９１０００単位
の投与量で検定すると、３匹に対する平均温度上昇は各
々０．７３及び０．１３℃であった。

このように澄明化したＬ−アスパラギナーゼ溶液は容易
にＵＳＰピロジエン試験を通る。

更にリムラス溶解質検定はＴＬｌ当り２５００単位の濃
度でどのようなエンドトキシンも検出しなく（６０分後
にゲルを形成しない）、これに対して、装填溶液はｍｌ
当り１００単位の濃度で陽性である（２０分後にゲル形
成）。

例２ ジエチルアミノエチルセファデックスＡ−５０樹脂３０
０グラムを樹脂の滅菌を保つために０．５％のホルムア
ルデヒドを含むＰ Ｈ７，４の０．１２モル リン酸バ
ッファー１７１中で平衡化させる。

樹脂スラリーを２０時間攪拌し、次に直径１５ｃｒｒＬ
のカラムに充填し０．１２モルリン酸バッファーで洗滌
する。

全ての操作は室温中で行う。樹脂の容積は６８００ｍ１
であり、高さ、直経比は２．２：１である。

Ｌ−アスパラギナーゼ溶液５５００ｒｕｌ（ｍｌ当り１
２３００単位、η当り３８５単位）を０．１１モル リ
ン酸に調整し、０．ＩＮ水酸化カリウムでＰ Ｈ７，４
に調整する。

Ｌ−アスパラギナーゼをＰ Ｈ７，４の０．１２モル
リン酸バッファーでカラムから溶出する。

６０００ｍ１の前溶出液を捨てた後、各々約１１のＬ−
アスパラギナーゼの多い分画な集める（８分画を分取）
。

Ｌ−アスパラギナーゼの多い分画を合わせ、Ｐ Ｈ５，
１に調整し、エタノールで結晶化させる。

酵素の多い分画はリムラス検定でエンドトキシンを示さ
ない（６０分後にゲルを形成せず）、スラリーを遠心分
離して固形物を集め、そのうちの５４８グラムを０．０
１モル リン酸バッファーに溶かし０．ＩＮ水酸化ナト
リウムでＰ Ｈ７，３に調整する。

不溶固形物を遠心分離で除去し、元のＬ−アスパラギナ
ーゼ活性の９２％を有する溶液を得る（１１１１当り１
０６００単位、蛋白質■当り４０９単位）。

この溶液をすムラス溶解質検定で１００００単位／ｍｌ
で試験すると、６０分後にゲルを形成しなかった。

溶液を０．２２ミクロンのフィルターを通して更に澄明
化及び滅菌する。

カラム装填液、合わせた分画及び澄明化した溶液をＵＳ
Ｐ うさぎ試験でにｇ当り１０００単位の投与量で検定
すると、３匹のうさぎの平均温度上昇は各々１．０７．
０，２０及び０．１０℃であった。

更に澄明化したＬ−アスパラギナーゼ溶液をｋｇ当り８
０００単位で試験すると、３匹のうさぎに対して０．５
℃の平均温度上昇を示した。

リムラス溶解質検定はｒＩＬｌ当り２５００単位で澄明
溶液中にエンドトキシン活性を検出しなかった（６０分
後にゲルを形成せず）。

例３ リムラス溶解質検定で強い陽性反応（１／１００希釈で
１０分後にゲル形成）を示すピロジエン性水道水（うさ
ぎ当り１．５℃の平均温度上昇）を、０．１２モル リ
ン酸カリウムに調整し、水酸化ナトリウムでＰ Ｈ８，
０に調整する。

この溶液を分けて同じＰＨ８、Ｏのバッファーで平衡化
した種々の陰イオン樹脂（ダウエックス１×２、アンバ
ーライトＩＲＡ−９３８、セファデックスＤＥＡＥ
Ａ−２５）に通す。

カラム容量の２０倍量の水を各各のカラムに通しカラム
通過液を各々合わせる。

２０倍量の装填後集めたカラム通過液並びに合わせた通
過液はリムラス溶解質検定で全て陰性である（６０分後
にゲルを形成せず）。

合わせた通過液をうさぎピロジエン試験によってピロジ
エンに対して試験すると、それはアンバーライ）ＩＲＡ
−９３８、セファデックスＤＥＡＥ Ａ−２５及びダ
ウエックス１×２の各々に対してうさぎ当り０．３．０
．１及び０．２℃の平均温度上昇でＵＳＰ試験を通った
。

例４ ピロジエン性水道水をＰ Ｈ７，４の０．１２モルリン
酸ナトリウムバッファーを調整するために使用する。

このピロジエン性バッファーを同じバッファーで平衡化
したダウエックス（Ｄｏｗｅｘ ） １×２、ワットマ
ン（Ｗｈａｔｍａｎ ） Ｄ Ｅ−５２及びセファデッ
クス（５ｅｐｈａｄｅｘ ）ＤＥＡＥ Ａ−２５に通
す。

カラム容量の１０倍量のバッファーを各々のカラムに通
し、カラム通過液を集める。

集めた通過液はリムラス溶解質検定で全て陰性であり（
１０分後にゲルを形成せず）、ダウエックス１×２、ワ
ットマンＤＥ−５２及びセファデックスＤＥＡＥ Ａ
−２５の各々に対してうさぎ当り０．２゜０．２．０．
１℃の平均温度上昇でＵＳＰピロジエン試験を通った。

例５ ピロジエン性溶液を標準Ｅ、コリ エンドトキシン試薬
〔ミズリー州セントルイス、マリンクロットケミカル社
（Ｍａｌ ｌ １ｎｋｒｏｄｔ Ｃｈｅ ｍ １ｃａｌ
Ｗｏｒｋｓ 、Ｓ ｔ 、 Ｌｏｕｉｓ ０Ｍｏ 、
） ）をピロジエンを含まない水に溶かして調整する。

標準Ｅ、コリ エンドトキシンをｍｌ当り１０ｒ１１４
１の濃度に希釈する。

溶液はＵＳＰピロジエン試験で高いピロジエン性を示し
く１／１０００希釈でうさぎ当り１２℃温度上昇）、リ
ムラス溶解質検定において強い反応を示す（１／１００
０希釈で１０分後にゲル形成）。

溶液を０．１２モル リン酸カリウムに調整し、水酸化
カリウムでＰ Ｈ７，２にする。

エンドトキシン溶液をＰ Ｈ７，２の０．１２モル リ
ン酸カリウムバッファーで平衡化したセファデックスＤ
ＥＡＥ Ａ−５０、ダウエックス１×２、及びワット
マンＤＥ−５２０カラムに通す。

カラム通過液をリムラス溶解質検定で測定しエンドトキ
シンのあふれを検出する。

セファデックスＤＥＡＥ Ａ−５０、ダウエックス１
×２及びワットマンＤＥ−５２樹脂に対して各々カラム
容量の１２．５及び８倍量のカラム通過液は陰性である
（１０分後にゲルを形成せず）。

バッファーの濃度を低下させるため１／１０希釈で行っ
たうさぎピロジエン試験は、合わせた通過液が各々０．
２．０．４及び０．３℃の平均温度上昇でＵＳＰ試験を
通った故、ピロジエンが除去されたことを示した。

本発明の実施態様は次の通りである。

（１）特許請求の範囲第１項記載の方法。

（２）水溶液をリン酸バッファーで０．１から０．２モ
ルのイオン強度に調整する第（１）項記載の方法。

（３）水溶液をアルカリ金属又はアルカリ土類金属のリ
ン酸塩バッファーで０．１から０．２モルのイオン強度
に調整する第（２）項記載の方法。

（４）水溶液を０．１１から０．１４モルのイオン強度
に調整する第（２）項記載の方法。

（５）水溶液を約０．１２モルのイオン強度に調整する
第（４）項記載の方法。

（６）特許請求の範囲第２項記載の方法。

（７）高イオン強度のバッファー溶液が０．１から０．
２モルのリン酸バッファーである第（２）項記載の方法
。

（８）高イオン強度のバッファー溶液が０．１１から０
．１４モルのリン酸バッファーである第（３）項記載の
方法。

（９）高イオン強度のバッファー溶液が０．１２モルの
リン酸バッファ・−であるフレイム第（４）項記載の方
法。

（１０）い（つかの点で実質上上述したもののような発
明。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １ 水溶液のイオン強度を０．１から０．２モルに、Ｐ
   Ｈを６から１０に調整し、調整した溶液を塩基性陰イオ
   ン交換樹脂に通すことを特徴とする水溶液からのピロジ
   エン性物質の除去法。 ２ Ｌ−アスパラギナーゼをイオン強度０．１から０．
   ２モル、Ｐ Ｈ７，０から７５のバッファー溶液に溶か
   し、この酵素溶液を前記バッファー溶液で平衡化したジ
   エチルアミンエチルデキストランゲルのカラムに通し、
   Ｌ−アスパラギナーゼヲ前記バッファー溶液でカラムか
   ら溶出することを特徴とするＬ−アスパラギナーゼから
   のピロジエン性物質の分離法。