JPS5921596B2 - 生理活性物質固定化方法及び臨床化学簡易検査器 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は酵素、抗原、抗体などの生理活性物質を有機シ
ランと架橋剤とを用いてポリスチレン試験管内壁に固定
化する方法に関するものである。

従来、生理活性物質を有機シランと架橋剤とを用いて多
孔性ガラスに固定化する方法や多孔性ガラスの代りに硅
素を含有する無機性または有機性担体（ガラス、シリカ
、シリコンなど）を用いて生理活性物質を固定化する方
法も試みられるが、これらは生理活性物質の反応表面積
を拡げるために、たとえ硝酸、フッ化水素などの表面処
理を施したとしても、単位面積当りの固定化生理活性が
低すぎるため、産業上の利用に供するには満足すべき結
果は得られない。

即ちシリコンチューブおよびガラス試験管等の内壁への
生理活性物質の固定化率は本発明のポリスチレン試験管
内壁へのそれに対して１０％以下にすぎないのである。

なおナイロンチューブはその構造中にペプチド結合を有
するのでアミノ化、アミド化、アルキル化などにより酵
素等の生理活性物質を効率的に固定化することも可能で
ある。

しかし、ナイロンチューブは実用に供されているものの
、強度等から実用化されていないのでナイロン試験管へ
の生理活性物質を固定化する応用は現在の新年可能であ
る。

一方、ラジオイムノアッセイ及び酵素免疫測定法を簡略
化する試みとしてポリプロピレン及びポリスチレン試験
管内壁に直接生理活性物質を吸着して検査に使用する試
みがなされている。

（シー・リービングらジャーナルオブイムノロジー１０
９巻８３４頁（１９７２） Ｃ，Ｌｉｖｉｎｇ ｅｔａ
ｌ 、 Ｊ。

Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ １０９．８３４、’７２及び
イー・エングボールら、ジャーナル・オプ・イムノロジ
−１０９巻、１２９頁（１９７２） Ｅ、Ｅｎｇｖａｌ
ｌｅｔａｌ、 Ｊ、 Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ １０
９．１２９、′７２）この方法は試験管内に生理活性物
質を含むアルカリ性溶液を満たし、一夜３７°Ｇで貯量
することにより試験管内壁に生理活性物質を吸着せしめ
ることを原理としているが、吸着量が非常に少量である
こと、比較的簡単に内壁から離脱しやすいことなどのた
め同一試験管での繰返し測定は不可能であり、また超微
量の測定方法以外には応用出来ないのである。

一般に酵素及び抗原、抗体は高価なものであり、日常の
簡易測定検査に使用する場合に使い捨ててしまうのは経
済性からみて重大な問題である。

そこで本発明者は酵素、抗原、抗体等の生理活性物質を
ポリスチレン試験管内壁に固定化することを試みたので
ある。

即ち、ポリスチレン試験管に何らかの処理により直接酵
素、抗原、抗体等の生理活性物質を固定化することが出
来れば診断用酵素的測定法、ラジオイムノアッセイ法及
び酵素免疫測定法等の簡易検査の方法が確立されること
になるのである。

従来、ポリスチレン樹脂（パウダー状）への酵素等の蛋
白質の固定化方法としてはクロロメチルスチレンからア
ミノポリスチレンを調製（エム・ジエー・ホーンとアー
ル・ニー・ローゼン、フエブスレター３６巻、２８５頁
（１９７３）、Ｍ。

Ｊ、 Ｈｏｒｎ ＆ Ｒ，Ａ、 ＬａｕｒｓｅｎｌＦ
ＥＢＳｌｅｔｔｅｒｓ、 ３６．２８５（’７３））
Ｌ、これに酵素等の蛋白質を固定化する方法が知られて
いる。

しかしながらこの方法をポリスチレン試験管への固定化
に応用しようとしてもポリスチレン試験管にはポリマー
以外に添加物が存在するため使用するクロロメチルエー
テル、ジオキサン等の溶剤により膨化溶解等の現象がみ
られて、生理活性物質が固定化されることはないのであ
る。

そこで本発明者は鋭意検討を重ねた結果、ポリスチレン
試験管内壁に生理活性物質を固定化するには、有機シラ
ンを介在させ、架橋剤によって固定化することに成功し
たのである。

詳細には、まず始めにポリスチレン試験管にγ−アミノ
プロピルトリエトキシシラン等の有機シランの原液を数
滴々下して、試験管内壁をまんべんなくコーティングし
て空気中に約１時間放置した後、脱イオン水にて洗浄す
るのである。

この操作によりポリスチレン試験管はすりガラス様の白
濁を呈するが、表面は比較的平滑であり、膨化も少ない
。

こうして得られたポリスチレン試験管に架橋剤として０
．２〜１％グルタルアルデヒド水溶液を加え、４℃で１
〜２時間反応させる。

この場合、ポリスチレンと有機シランとは一般に直接反
応を行わないと考えられているので、上記反応の結果、
ポリスチレンと有機シランとが直接共有結合を生じてい
るかどうか明らかではない。

水洗後、酵素、抗原、抗体などの生理活性物質溶液を加
えて室温で２時間または４℃で一夜ゆるやかに試験管を
回転させながら反応させる。

反応終了後、反応に使用した緩衝液及び０．５ ＭＮａ
Ｃｌで充分洗浄したあと、０．２Ｍエタノールアミン緩
衝液（ｐＨ８，０）でよく洗浄し、未反応基をアミン基
でブロックする。

なお生理活性物質溶液の濃度範囲は広＜ ０．０１ ｍ
９７ｍ１程度でも充分固定化が可能である。

ただし有機シランとしてγ−メルカプトプロピルトリメ
トキシシランで処置したポリスチレン試験管は反応基の
ＳＨ基をＳ−８結合とするためグルタルアルデヒドの代
りに１．５ｍＭの２・２−ジピリジルサルファイド（２
・２− ｄｉｐｙｒｉｄｙｌｓｕｌｆｉｄｅ ） で処理し、洗
浄したのち、生理活性物質溶液を加えて固定化しなけれ
ばならない。

本固定化に使用する有機シランとしてはγ−アミノプロ
ピルトリエトキシシランおよびγ−メルカプトプロピル
トリメトキシシランの他にＮ−β−７ミノエテルーγ−
アミノプロピルトリメトキシシラン、Ｎ−β−アミノエ
テル−α−メチル−γ−アミノプロピルジメトキシメチ
ルシラン、Ｎ−ビスーβ−ヒドロキシエチル−γ−アミ
ノプロピルトリエトキシシラン等があげられる。

又架橋剤としては上記グルタルアルデヒド、２・２−ジ
ピリジルサルファイドの他に酵素等の架橋剤として一般
に使用されているヒドロキシアジプアルデヒド、種々の
イソシアネート誘導体等が用いられる。

本発明の固定化方法によって得られる生理活性物質固定
化物は、ポリスチレン試験管内壁上に有機シラン、その
上層に架橋剤を介して生理活性物質が固定化されている
。

そしてこの固定化物はすぐれた臨床化学簡易検査器を提
供するものである。

本発明の臨床化学簡易検査器を診断用酵素的測定法に適
用する場合には次の各検査項目が挙げられる。

即ち、血糖、尿素窒素、尿酸、クレアチニン、アンモニ
ア、コレステロール、中性脂質、燐脂質、ＧＯＴ、ＧＰ
Ｔ、凝固線溶検査、補体結合反応などである。

また、ラジオイムノアッセイ、および酵素免疫測定法へ
の適用例としてはＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＭ。

ＩｇＤ、ＩｇＥｌ α−フェトプロティン、Ｈｂ抗原、
ＣＲＰ、 イアー／ニリン、各種ステロイドホルモン、
甲状腺ホルモン、各種ペプタイドホルモン等の定量およ
び薬物中毒の検査などがあげられる。

本発明における生理活性物質としての酵素、抗原、抗体
の例としては上記の臨床用測定項目に用いられる酵素は
ほとんどすべて本発明においてポリスチレン試験管に固
定化されるが、特に例示すれば次の如きものである。

即ち酵素としてはブドウ糖定量用としてのグルコース芽
キシダーゼ、パーオキシダーゼ、カタラーゼ、ヘキソキ
ナーゼ、Ｇ−６−Ｐデヒドロゲナーゼ等、尿素窒素定量
用としてのウレアーゼ、尿酸定量用としてのウリカーゼ
、アンモニア定量用としてのグルタメートデヒドロゲナ
ーゼ、クレアチニン定量用としてのクレアテニンアミド
ヒドロラーゼ、クレアテニンデイミナーゼ、コレステロ
ール定量用とし゛てのコレステロールエステルヒドロラ
ーゼ、コレステロールオキシダーゼ、トリグリセライド
定量用としてのリパーゼ、グリセロールキナーゼ、パイ
ルベートキナーゼ、ラクテートデヒドロゲナーゼ、燐脂
質定量用としてのホスホリパーゼＣ１アルカリホスフア
ターゼ、ＡＴＰａｓｅ等である。

しかしながら上記酵素に限定されず、あらゆる診断用酵
素に本固定化方法は適応されうる。

そして抗原、抗体としては各種免疫グロブリン、ホルモ
ン、蛋白質等の抗原及びそれに対する抗体はすべて可能
である。

以上の如く、本発明においてポリスチレン試験管に有機
シシンと架橋剤を介して酵素、抗原、抗体などの生理活
性物質を固定化することおよび該固定化生理活性物質を
診断用酵素的測定法、ラジオイムノアッセイおよび酵素
免疫測定法などの臨床化学簡易検査方法へ利用する場合
の特徴には、（１）固定化効率がよい、（２）定量性が
よい、（３）簡単に測定できる。

（緩衝液または反応呈色液を添加すれば簡単にどこでも
測定できる。

）（４）一本の試験管でくり返し長時間の測定が可能で
ある。

（例えば酵素的測定法では１％２ケ月は１本の試験管で
くり返し測定できる。

（５）簡単に試験管に固定化出来、そのまま測定に使用
できるので経済性がある、等の効果があげられる。

次に本発明の実施例について示す。

実施例 １ ポリスチレン試験管（１０ｍｍ×５０ｍｍまたは１５ｍ
ｍＸ １００ｍｍ ）にγ−アミノプロピルトリエトキ
シシラン原液数滴を滴下し、所定の高さく１０〜５０ｍ
ｍ）まで試験管内壁をまんべんなくコーティングし、空
気中に約１時間放置し、水洗後１％グルタルアルデヒド
（ｐＨ７，４）を５Ｔｎｌ加え水冷下で、１時間反応さ
せ洗浄後グルコースオキシダーゼ（１５ＥＶ／７７１１
）−パーオキシダーゼ（５０Ｖ／ｍ１）（いずれもシ
グマ製タイプ■）（ｐＨ７，４）をｏ、 ５ｍｌ加え室
温で１〜２時間試験管内を回転させ両酵素を試験管内壁
に均一に固定化する。

固定化後０．５Ｍ ＮａＣ１で洗浄し、未固定化酵素
を除去したのち、０．２Ｍエタノールアミン（ｐＨ８，
０）で充分洗浄しくサーモミキサー使用）未反応基なア
ミン基でブロックする。

本固定化酵素のうちグルコースオキシダーゼの固定化率
は２２％、パーオキシダーゼの固定化率は２５％である
。

（蛋白量として）実施例 ２ 実施例１に準じて得られた固定化酵素をコーティングし
たポリスチレン試験管に０．６ｍＭ４−アミノアンチピ
リン、１０ｍＭフェノール、５０ｍＭリン酸カリ（ｐＨ
７，４）からなる呈色液１．０Ｔｌｌ、および血清（人
）１０〜２０μｌを加えて室温で反応を開始し、１０分
経過後、試験管から反応液を取り出し、比色計で（５０
０ｎｍ）測定する。

なお血清中のブドウ糖量はあらかじめブドウ糖水溶液の
標準検量線を求めておき、一方、反応により得られた供
試血清の測定値を検量線に対応させて求める。

本検査器は室温に放置して定色液添加や洗滌をくりかえ
しても、少なくとも１ケ月連続使用可能である。

なお、測定において、試料を添加して数秒で肉眼的に明
らかな発色を呈するので３０秒〜１分間放置すれば充分
測定可能であるが、エンドポイントで測る場合には約１
０分間は放置した方がよい。

なお又この操作上の特色としては反応停止操作を必要と
しない点にある。

実施例 ３ 実施例１に準じてコレステロールオキシダーゼ、パーオ
キシダーゼの混液をポリスチレン試験管の内壁に固定化
したものに、実施例２で使用した反応液（４アミノアン
チピリン−フェノール−リン酸カリ（ｐＨ７，４）にト
ライトンＸ−１００（ロームアンドハース社製品名）を
最終濃度で０．１％になるように加え、これに試料（血
清）２０μｌを添加して反応を開始し、１５分経過後試
験管から反応液を取り出し、比色計にて５００ｎｍのＯ
Ｄを測定し、あらかじめ求めておいたコレステロール検
量線より遊離コレステロール量を測定する。

なお総コレステロール量を測定する場合には別のポリス
チレン試験管（１０Ｘ５０ｍｍ）にコレステロールエス
テルヒドロラーゼを固定化しておき、この試験管に血清
２０μｌと０．１％トライトンＸ−１ｏｏ含有０．１Ｍ
リン酸緩衝液ＣｐＨ７，０）０．５ｍｌヲ加工、前取っ
てコレステロールエステルを水解しておき（３７℃で２
０分間反応）、これを遊離コレステロール測定用試験管
に移しかえ上記呈色反応液を加えて前記と同様に比色測
定し、コレステロール検ｉａ よ、’）ｈコレステロー
ル量ヲ求める。

実施例 ４ 実施例１に準じてポリスチレン試験管に抗ヒトＩｇＧ抗
血清を固定化したものに、パーオキシダーゼを固定化し
たＩｇＧ （Ｓ、 Ａｖｒａｍｅａｓ ＆Ｂ。

Ｇ ｕｉ ｌｂｅ ｒｔ 、、Ｂ ｉｏｃｈｉｍｉｅ
、 ５４．８３７、（”７２）の方法で調製）とＩｇＧ
を含む試料（１００００倍希釈の血清）１０〜５０μｌ
をリン酸緩衝液（ｐＨ７，４）と共に加え競走的に抗体
を結合させ、上清を捨て充分洗浄したのち、基質である
過酸化水素を加え実施例２で用いた反応液（４〜アミノ
アンチピリンフエノール緩衝液）で反応径比色しく５０
０ｎｍ）、得られるＯＤ値をあらかじめ求めておいた標
準曲線と対応させ、試料中のＩｇＧ量を求める。

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. １ ポリスチレン試験管内壁を有機シランで処理し、次
   いで架橋剤で処理し、その表面に酵素、抗原、抗体など
   の生理活性物質を固定せしめることを特徴とする生理活
   性物質固定化方法。