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JPS5928865B2 - 安定化された血小板因子4免疫分析標準液 - Google Patents
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JPS5928865B2 - 安定化された血小板因子4免疫分析標準液 - Google Patents

安定化された血小板因子4免疫分析標準液

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JPS5928865B2
JPS5928865B2 JP54077589A JP7758979A JPS5928865B2 JP S5928865 B2 JPS5928865 B2 JP S5928865B2 JP 54077589 A JP54077589 A JP 54077589A JP 7758979 A JP7758979 A JP 7758979A JP S5928865 B2 JPS5928865 B2 JP S5928865B2
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Description

【発明の詳細な説明】 本発明は安定化された血小板因子4免疫分析標準液に関
する。
血小板因子4(PF4)は細胞が放出反応をうけた時血
小板のα一粒子から分離される小分子量蛋白質である。
この現象は血小板が内皮下組織およびトロンビン、AD
Pおよびエピネフリンの様な種々の生理学的薬剤との接
触によつて活性化された場合に起る。血小板因子4は正
統放射免疫分析法、ThrombosisResear
ch且、51−58(1976)およびThrombo
sisResearch11、673−686、(19
77)を使用して定量される。血小板因子4(PF4)
は放射性ラベルをつけられていてもいなくても特定抗血
清と結合する。
ラベル付きおよびラベルなし(1251−PF4および
PF4)蛋白質の混合物中で各々は混合物中の濃度の割
合で抗血清の一定量に結合する。血漿、血清又は標準液
からのPF4が1251−PF4およびPF4抗血清と
平衡した場合抗血清に結合している1251−PF4の
量は試料又は標準液中にある非一放射性PF4量に逆比
例する。非結合PF4から抗血清複合物を分離し複合物
に結合した1251−PF4の放射能を測定することに
より加えたPF4濃度を結合1251−PF4のパーセ
ントに対しプロツトできる。次いで患者の試料中のPF
4量決定に標準曲線を使用できる。安定な標準試料が血
小板因子4の信頼できる測定に重要である。意外なこと
にヘパリン(メルク索引9版4510)またはヘパリン
活性をもつ化合物が血小板因子4標準試料およびラベル
付き試薬を安定化することが発見されたのである。ヘパ
リンは特殊の非凝固性をもつ高度硫酸塩化した右旋性粘
多糖類である。それはD−グルコサミンおよびD−グル
クロン酸残基より成り約20,000の分子量をもつ。
ヘパリン酸、生理学的に適当するアルカリ金属およびア
ルカリ土金属、例えばナトリウム、カリウム、リチウム
、マグネシウム、カルシウムおよびアンモニウムの陽イ
オン性塩類、並びにヘパリンの様な活性をもつ硫酸塩化
ぺクチン類およびデキストリン類の様な硫酸塩化多糖類
は本発明の実施においてヘパリン活性を有する化合物の
適当な例である。血小板因子4はヘパリンを中和する活
性をもつ血小板特殊蛋白質で、それはヘパリントロンビ
ン固化時間試験(ThrombosisResearc
h8,51−58(1976))により測定の際血小板
放出反応中遊離する。本発明は血小板因子4 10乃至
100n9/ml1抗血清中の抗体に結合している血小
板因子4と共沈澱しうる蛋白質(以下共沈澱性蛋白質と
呼ぶ)および有効安定化量のヘパリンを含む水溶液より
成る安定化された血小板因子4免疫分析標準液を包含す
る。
同様に本発明はまた血小板因子41251ラベルをつけ
られた安定化試薬並びにこの試薬を用いる試験用具およ
び試験方法を包含する。血小板因子4の0乃至100n
gノiの生理学的濃度に対応する一組の標準液は例えば
O,10,30,50,100ngノdである。これら
標準液は抗体一抗原沈澱の分離を助けまた試薬および試
験びん壁に付着する血小板因子4の量を減少する為の共
沈澱性蛋白質を含む。共沈澱性蛋白質の一部は抗血清中
の抗体に結合しているラベル付きおよびラベルなし血小
板因子4と共沈澱する。水溶液は約5−10の範囲の生
理学的に適合するpHに緩衝されるとよい。例えば0.
15M塩化ナトリウム中のO.O1Mトリス緩衝液、…
約8.2が好ましい稀釈緩衝液である。0.05−20
%(重量/容量)で約半分アルブミンで半分ガンマグロ
ブリンである共沈澱性蛋白質は有効に抗体一抗原を沈澱
させ試験試料の試料管壁に付着するのを減少する共沈澱
性蛋白質の有効量である。
共沈澱性蛋白質の好ましい量は約0.2%の牛の血清ア
ルブミンと1.5Tflg/TILI,の牛のガンマグ
ロブリンである。ナトリウムアジ化物又はチメロサルの
様な抗菌姓貯蔵剤は標準液内の細菌成長を防ぐのに望ま
しい。
O.02%のアジ化ナトリウムは抗菌性貯蔵剤の好まし
い有効量である。試薬および免疫分析の知識ある者は緩
衝液、蛋白質、貯蔵剤および適当する稀釈緩衝液および
共沈澱性蛋白質有効量および抗菌性貯蔵剤有効量を得る
為の種々な量の相互交換性を認めるであろう。ヘパリン
の有効安定化量は血小板因子4ng当りヘパリン活性約
3乃至10−5単位である。
好ましい量は約10−1乃至10−2単位/n9である
。如何なる場合も少なくも約10−5単位/nf!なけ
ればならない。血小板因子4、10,30,50および
100n9をそれぞれ含む緩衝稀釈液ml当りヘパリン
活性1単位は非常に有効な一組の標準液を与える。代表
的ナトリウムヘパリン調合物は約170単位/〜を含む
。米国薬局フアーマキヤピアーヘパリン1単位の定義−
ヘパリン1単位はO.8mlの塩溶液に溶解しまた再石
灰化した羊血漿(0.2ml塩化カルシウム溶液、10
1/2)1mlを加えた場合混合物が少なくも1時間液
体のままでいる量である。本発明は抗菌性貯蔵剤、共沈
澱性蛋白質およびヘパリンの有効安定化量を含む水溶液
中の1251−ラベル付き試薬をも包含する。
その放94目ま一般に検出用放射能有効量として0.5
μCi/dより小さく、好ましくはO.2−0.45μ
Ci/dの範囲である。本発明のヘパリン試薬は血小板
因子4測定用分析用具に普通組合わされる。
次の実施例は本発明を例証するものであつて本発明の真
意又は範囲を限定するつもりはない。実施例 1 標準静脈穿刺法によつて血液試料をとり冷却し遠心分離
した。
血漿をとり50μ2を未知試料として試験管に入れた。
1.5T!19/Tnlの牛のガンマグロブリツ、0.
2%の牛の血清アルブミン、1μ/mlのナトリウムヘ
パリンおよび0.02%のアジ化ナトリウムを含む0.
15M塩化ナトリウム中に0.01Mトリス緩衝剤(2
−アミノ−2−ヒドロオキシメチル−1,3−プロパン
ジオールHCI)溶液中0,10,30,50および1
00n9/mlの血小板因子4を含む標準液50μlを
標準試料として試験管に入れた。
稀釈緩衝液300μlを非特定結合性試料として試験管
にピペツトでとつた。
上記試料すべてに0.2%牛血清アルブミン、1.5w
9/ml牛ガンマグロブリン、2.2μ/dナトリウム
ヘパリンおよび0.02%アジ化ナトリウムを含む0.
15M塩化ナトリウム中0.01Mトリス緩衝液中の放
射能0.45μCi/ml又はそれ以下の1251−ラ
ベル付き血小板因子4溶液2501t1を加えた。
次いで未知および標準試料に更に0.2%牛血清アルブ
ミン、1.5〜/d牛ガンマグロブリンおよび0.02
%アジ化ナトリウムを含む0.15M塩化ナトリウム中
0.01Mトリス緩衝液中の山羊血小板因子4抗血清2
50It1を加えた。
別の管に1251−ラベル付き血小板因子4を250μ
′ピペツトでとり全カウント管をつくつた。
試験管を全部22−25℃で約2時間培養した。全カウ
ント管(TCT)を除く各管に硫酸アンモニウム(73
%飽和)1WLIを加えた後管を混合し、20分間10
00xgで遠心分離し、上澄液を流し、沈澱した硫酸ア
ンモニウム蛋白質中の放射能をシンチレーシヨンウエル
計数管で測定した。結果2.各PF4標準液平均結合%
を垂直Y軸上にとりそれに対応する各びんのラベル濃度
を水平X軸上にとり図示する。
5点をつかつてなめらかな曲線を画がく。
3.未知試料中のPF4濃度決定の為Y軸上に求めた計
算結合率%から水平線を曲線に引く。
交叉点から垂直線をX軸に引いて未知試料に対応するP
F4値を読む。代表的臨床結果は通常血漿中10nf!
/d以下である。
実施例 1群を除きすべての点で同じ標準液はヘパリン1μ/m
lを含んでいた。

Claims (1)

  1. 【特許請求の範囲】 1 血小板因子4を10乃至100ng/ml、抗血清
    中の抗体に結合している血小板因子4と共沈澱しうる蛋
    白質および有効安定化量のヘパリンまたはヘパリン活性
    を有する化合物を含む水溶液より成ることを特徴とする
    安定化された血小板因子4免疫分析標準液。 2 血小板因子4を10乃至100ng/ml、抗血清
    中の抗体に結合している血小板因子4と共沈澱しうる蛋
    白質、有効抗菌量の貯蔵剤および有効安定化量のヘパリ
    ンまたはヘパリン活性を有する化合物を含む緩衝稀釈液
    より成ることを特徴とする安定化された血小板因子4免
    疫分析標準液。 3 0.45μCi/ml迄の放射能をもつ^1^2^
    5I−ラベル付き血小板因子4、抗血清中の抗体に結合
    している血小板因子4と共沈澱しうる蛋白質および有効
    安定化量のヘパリンまたはヘパリン活性を有する化合物
    を含む水溶液より成ることを特徴とする安定化された^
    1^2^5I−ラベル付き血小板因子4免疫分析標準液
    。 4 0.45μCi/ml迄の放射能をもつ^1^2^
    5I−ラベル付き血小板因子4、抗血清中の抗体に結合
    している血小板因子4と共沈澱しうる蛋白質、有効抗菌
    量の貯蔵剤および有効安定化量のヘパリンまたはヘパリ
    ン活性を有する化合物を含む緩衝稀釈液より成ることを
    特徴とする安定化された^1^2^5I−ラベル付血小
    板因子4免疫分析標準液。 5 ^1^2^5I−ラベル付き血小板因子4と試験試
    料からの血小板因子4を血小板因子4抗血清と競合結合
    させた後沈澱させかつ結合した^1^2^5I−ラベル
    付き血小板因子4を測定することにより血漿中の血小板
    因子4の濃度を求める為に標準液中の血小板因子4濃度
    を用いる血漿中の血小板因子4の放射免疫分析法におい
    て、ヘパリンで安定化した血小板因子4標準液およびヘ
    パリンで安定化した^1^2^5I−ラベル付き血小板
    因子4を用いることを特徴とする改良法。
JP54077589A 1978-07-05 1979-06-21 安定化された血小板因子4免疫分析標準液 Expired JPS5928865B2 (ja)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US000000922135 1978-07-05
US05/922,135 US4195072A (en) 1978-07-05 1978-07-05 Stabilized platelet factor 4 immunoassay standards

Publications (2)

Publication Number Publication Date
JPS5510598A JPS5510598A (en) 1980-01-25
JPS5928865B2 true JPS5928865B2 (ja) 1984-07-16

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ID=25446555

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Application Number Title Priority Date Filing Date
JP54077589A Expired JPS5928865B2 (ja) 1978-07-05 1979-06-21 安定化された血小板因子4免疫分析標準液

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US (1) US4195072A (ja)
EP (1) EP0007163B1 (ja)
JP (1) JPS5928865B2 (ja)
AT (1) ATE336T1 (ja)
AU (1) AU525406B2 (ja)
CA (1) CA1116078A (ja)
DE (1) DE2961056D1 (ja)
ES (1) ES482215A1 (ja)
ZA (1) ZA792524B (ja)

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AU525406B2 (en) 1982-11-04
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ES482215A1 (es) 1980-08-16
CA1116078A (en) 1982-01-12
ZA792524B (en) 1980-06-25
ATE336T1 (de) 1981-11-15
EP0007163A1 (en) 1980-01-23
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