JPS5934111B2 - 固定化グルコ−スイソメラ−ゼの製造法 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 本発明はグルコースをフラクトースに異性化するのに有
用な固定化グルコースイソメラーゼの製造法に関するも
のである。

従来からＤ−フラクトースの製造法としてショ糖を加水
分解してＤ−フラクトースを分離する方法が行なわれて
いるが、近年グルコースイソメラーゼをグルコースに作
用させて異性化させる方法が工業的な規模で拡まってい
る。

ところで、グルコースからグルコースイソメラーゼを用
いて異性化された液糖を製造するには、一般に約４０〜
５０重量係のグルコース溶液にグルコースイソメラーゼ
生産菌を投入し、約７０°Ｃの温度で長時間異性化反応
を生じさせた後、濾過、脱色および脱イオンなどの諸工
程を経ることにより異性化された液糖を得ている。

しかしながら、上記方法では異性化反応終了後、酵素活
性が反応前に比べて約半分に低下し、新しく異性化反応
を行なうときには損失酵素量を補わなければならないと
いう大きな欠点がある。

このため酵素を固定化することによって酵素の長期使用
および酵素反応の連続化を可能にすることが強く望まれ
ている。

グルコースイソメラーゼの固定化については遊離酵素と
菌体内酵素を問わず種々の方法が従来から知られている
。

遊離酵素については、たとえば多孔性ガラスのアミノシ
ラン誘導体を担持として用いる共有結合による担体結合
法、ＤＥＡＥ−セルロースあるいはデュオライトなどの
イオン交換体を担体として用いるイオン結合による担体
結合法、ポリアクリルアミドゲル、コラーゲンあるいは
セルローストリアセテートなどを組材とする包括法など
がある。

これらの方法では、工業的に使われる固定化酵素として
製造コスト、安全性、安定性あるいは耐久性など全ての
点で満足すべきものが得られていない。

また菌体を５５℃以上、９０°Ｃ以下の温度に加熱して
グルコースイソメラーゼを菌体内に固定化させる方法も
知られている。

この方法では無処理菌体に比べて酵素活性の低下を大幅
に改良させたとはいえ、残存活性値は初期の４０〜５０
％であり、工業的には充分とはいえなかった。

工業的用途は満足させるグルコースイソメラーゼの固定
化酵素剤には、次の特性を保持することが特に強く望ま
れている。

（１）酵素活性が長期間の使用に対して充分保持されて
いること。

（［１）グルコースの異性化液が着色されないこと。

（面 カラムに充填したとき目詰まりしないこと。

ＧＶＩ 物理的にグルコース溶液中で堅牢であること
。

（ｖ）取扱いが簡単であること。

υＩ）酵素剤が安価であるこ吉。

このような目的に対して本発明者等はグルコースイソメ
ラーゼの菌体内酵素の固定化について種種鋭意検討した
結果、菌体を特定の酸またはその塩で処理することによ
って所期の目的を達成することを見出し本発明に到達し
た。

すなわち本発明は、グルコースイソメラーゼ生産菌を重
合リン酸またはその塩で処理することを特徴とする固定
化グルコースイソメラーゼの製造法である。

グルコースイソメラーゼ生産菌体としては、たとえばス
トレプトマイセス・フエオクロモゲネス（Ｓｔｒｅｐｔ
ｏｍｙｃｅｓ Ｐｈａｅｏｃｈｒｏｍｏｇｅｎｅ、ｓ）
、ストレプトマイセス・フラジアエ（Ｓ、ｆｒａｄｉａ
ｅ）ストレプトマイセス・ロゼオクロモゲナス（Ｓ。

ｒｏｓｅｏｃｈｒｏｍｏｇｅｎｅｓ ）、ストレプトマ
イセス。

オリバセウス（Ｓ 、 ｏｌ １ｖａｃｅｕｓ）、スト
レプトマイセス・カリフオルニカス（Ｓ、ｃａｌｉｆｏ
ｒｎｉｃａｓ ）、ストレプトマイセス・ベヌセウス（
Ｓ 、 ｖｅｎｕｃｅｕｓ ）、ストレプトマイセス・
バアジニア（８−ｖｉｒｇｉｎｉａｅ）などの放線菌、
シュードモナス・ハイドロヒイラ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎ
ａｓ ｈｙｄｒｏｐｈｉｌａ）、などのシュードモナス
属菌、バチルス−メガテリウム（Ｂａｃｉｌｌｕｓｍｅ
ｇａｔｅｒ ｉｎｍ）などのバチルス属菌、ブレビバク
テリウム属菌、ラクトバチルス属菌、エアロバクテリウ
ム属菌のようなバクテリアなど広範囲の微生物菌体が挙
げられる。

これらの菌体は窒素源としてコーンステープリカー単独
または脱脂大豆を併用し、炭素源として澱粉、キジロー
ズなどの炭水化物類、無機塩としては燐酸カリウム、塩
化コバルトおよび塩化マグネシウムなどを含んだ培地に
培養して取得するものである。

本発明において用いる菌体は、詩に上記菌体を培養後、
培養液から分離した菌体そのままかあるいは加熱処理さ
れた菌体が好ましい。

また、この菌体はｐＨ５〜９、特に５〜７．０の緩衝溶
液に分散もしくは懸濁されていてもよい。

菌体の濃度は通常０．１〜５０重量係重量型しくは０．
５〜４０重量係である。

本発明において用いる酸は重合リン酸もしくはその塩、
たとえばトリポリリン酸、ヘキサメタリン酸、ポリリン
酸、ピロリン酸、メタリン酸もしくはこれらの酸のナト
リウム塩、カリウム塩、カルシウム塩などであるが、こ
れらの酸またはその塩は食品添加物であって、安全なも
のであり、各種の食品の加工に使用されているものであ
る。

本発明方法においてグルコースイソメラーゼを含有する
菌体を重合リン酸またはその塩で処理することにより菌
体より着色成分等の不純物を抽出し、菌体当りの活性を
増加させることが出来る。

また該処理した菌体を用いた固定化酵素剤でグルコース
を異性化すると、異性化液の着色の原因となる不純物が
菌体から除去されているので、異性化液の着色を防止す
ることが出来る。

該処理して後、菌体をキトサンあるいは部分脱アセチル
化キチンで処理してもよい。

菌体とキトサンとの混合物あるいは菌体と部分脱アセチ
ル化キチンとの混合物を重合リン酸またはその塩で処理
すると、酵素の安定化および菌体表面のキトサン膜ある
いは部分脱アセチル化キチン膜の強化の両面の効果が達
成される。

キトサンあるいは部分脱アセチル化キチンの混合量は、
菌体の乾燥物に対してキトサンあるいは部分脱アセチル
化キチンが０．１重量係以上であることが好ましい。

上記処理の条件としては、菌体を処理する重合リン酸ま
たはその塩の濃度０．５％以上において効果がみとめら
れるが、一般に２〜８係の濃度が好ましい。

重合リン酸またはその塩の水溶液のｐＨはグルコースイ
ソメラーゼを失活させない範囲のｐＨＸ’％にｐＨ５〜
７であることによって効果がみとめられる。

上記処理された菌体は必要により乾燥するか、あるいは
成型した後、乾燥することによって固定化酵素製品とす
ることができる。

乾燥条件はグルコースイソメラーゼが失活しない温度範
囲、特に５０℃以下で行なうことが好ましい。

乾燥方法としては真空乾燥、天日乾燥、凍結乾燥などの
種々の方法が採用される。

本発明方法により得られる固定化グルコースイソメラー
ゼは乾物当りの活性がきわめて高く、グルコースの異性
化液の着色がほとんどない。

さらに従来の単に加熱処理された菌体に比べて著しく失
活が少なく耐久性があり、長期間使用が可能であり、酵
素反応を連続して行なうことができる。

以下実施例を用いて本発明を説明する。

なお、グルコースイソメラーゼ活性は国際グルコースイ
ソメラーゼ単位を用い、グルコース溶液（グルコース濃
度２Ｍ、０．０２Ｍ硫酸マグネシウム、０．００１Ｍ塩
化コバルト、ｐＨ６，８５）で反応温度６０８Ｃ，１分
間でグルコース１μモルを異性化する酵素活性を１単位
とする。

膨潤度は固定化酵素１ｇを水に懸濁した時、水中で占め
る体積で表わす。

強度は粒度２０〜３０メツシユの固定化酵素を水で膨潤
させた後、固定化酵素１粒に分銅を載せ漬れはじめる時
の重さでもって示す。

着色度は１ｃｒｆＬのセルを用いた４２０ｍμまたは３
７０ｍμの波長における吸光度でもって示す。

実施例 １ ストレプトマイセス・フエオクロモケネス（Ｓｔｒｅｐ
ｔｏｍｙｃｅｓ ｐｈａｅｃｈｒｏｍｏｇｅｎｅｓ）（
微工研菌寄第２２１号）をコーンステープリカー、キシ
ロース、燐酸カリウム、硫酸マグネシウム、塩化コバル
トを含む培地で通気培養して後、濾過して菌体を取得し
た。

この菌体の懸濁液を７０℃にて３０分間熱処理した後、
菌体を濾別し、よく水で洗滌し、再び水を加えて菌体懸
濁液５００ｒＩ′Ｌｌ（固形分２．４係、活性１１．８
５ ＩａＩＵ、／ｍｌ）を得た。

この菌体懸濁液を５０ｍ、ｌ！ずつに分けて、各々にあ
らかじめ調整しておいた各種の１０係重合リン酸ソーダ
溶液（ｐ）（６，０） ５ ｏｒｒｔｌを加え、よく混
合した後、１時間室温で放置した。

次いで１０．０００ｒｐｍ、Ｉ Ｏ分間遠心分離を行な
い菌体と上澄液とを分離した。

得られた菌体の活性および上澄液の着色度を測定した。

その結果を第１表に示す。

なお、比較のため１０％重合リン酸ソーダ溶液５０ＴＩ
Ｌｌの代わりに水５０ｍ１を用い、上記方法と同様にし
て菌体懸濁液を処理した。

第１表から重合リン酸塩で菌体を処理すると、菌体乾物
当りのグルコースイソメラーゼ活性が３０〜５０係増加
し、菌体を分離した上澄液が著しく着色されていること
から、菌体中より不純物が溶出されていることが明らか
である。

実施例 ２ 実施例１と同様にして調製した加熱処理菌体〔固形分３
０％、４９３．８１ｃ＋Ｉｕ／ｇ（乾物）〕１２６．１
を水１５００ｍｌに懸濁した。

この懸濁液に１０ ％ ） ’Ｊポリリン酸ソーダ溶液
（ｐＨ６，０）１５００ｍｌを加えよく混合した後、１
時間放置した。

次いで菌体を濾過し、水洗した。再び菌体を水に懸濁し
て６０００ｍ１（固形分０．５０６％）とした。

この菌体懸濁液に予め調製しておいた０、２％キトサン
−酢酸溶液（ｐＨ６，２５） ４．Ｏｌを激しく攪拌し
ながら加え、キトサン−菌体反応物を得た。

この反応物を脱水した後、ノズルから押し出し成型し、
次いで乾燥した。

乾燥物を適宜破砕し、篩にかけて２０〜４０メツシユの
固定化酵素（Ａ）を得た。

比較のため、１０係トリポリリン酸ソーダ溶液（ｐＨ６
，０）Ｉ５００ＴＬｌを加える代わりに水１５００ＴＬ
ｌを加える以外は上記方法と同様にして固定化酵素（Ｂ
）を得た。

これらの固定化酵素（Ａ）および（Ｂ）の特性を第２表
に示す。

得られた固定化酵素（Ａ）または（Ｂ）（グルコースイ
ソメラーゼ活性３２ＩＧＩＵ）をグルコース溶液（グル
コース５０重量係、硫酸マグネシウム０．００５Ｍ１塩
化コバルト０．００１Ｍ１マレイン酸塩緩衝液０．０５
Ｍ ） ２０ＴＬｌ！に加え、ｐＨ６，８４〜７．２
に維持しながら６０℃で１日間振盪して異性化反応を行
なわせた。

異性化反応装置としてモノマルシェーカーＪ型（大洋科
学工業製）を使用し、グルコース溶液を入れたＬ型試験
管を３８回／分で振盪させた。

反応終了後、固定化酵素を濾別して回収し、再び同じ組
成のグルコース溶液を加えて異性化反応を行なった。

この異性化反応を５回繰返した異性化率、異性化維持率
および着色度を第３表に示す。

なお、異性化率および異性化維持率は次式に従い算出さ
れたものである。

第３表から明らかなように、固定化酵素（Ａ）は固定化
酵素（Ｂ）に比べて異性化維持率が高く、異性化液の着
色度もきわめて少ない。

実施例 ３ 実施例１において酸処理された菌体を２回水洗した後、
３０℃で１４時間真空乾燥し、粉砕して固定化酵素製品
とした。

この固定化酵素製品（グルコースイソメラーゼ活性３２
ＩＧＩＵ）を実施例２と同様にして異性化反応を繰返し
行なった。

異性化率および異性化率維持率および異性化液の色を第
４表に示す。

比較のため、酸処理を施さない菌体および他の酸で処理
されたものについても第４表に示す。

表中、朱印の付いた酸は比較例を示す。

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. １ グルコースイソメラーゼ生産菌を重合リン酸または
   その塩で処理することを特徴とする固定化グルコースイ
   ソメラーゼの製造法。