JPS595276B2 - ビタミン ｂ１２ ガンユウキンタイノセイゾウホウホウ - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、メタノール資化性細菌を用いるビタミンＢ１
□含有菌体の製造方法に関するものである。

詳しくは、アエロモナス属またはアクロモバククー属に
属するメタノール資化性のビタミンＢ□２生産菌を、メ
タノールを炭素源として、培地中にコバルト塩およびイ
ミダゾールを添加してなる培地に培養し、培養終了液よ
り菌体を分離、乾燥することにより、ビタミンＢ□２を
高率に含有する菌体を製造する方法である。

ビタミンＢ１□は抗質血性ビタミンとして肝臓から分離
されたビタミンであり、最近、飼料添加物としてのビタ
ミンＢ１□が重要視されている。

ビタミンＢ１□はプロピオン酸発酵菌酪酸発酵菌、クロ
ストリジウム属細菌などの嫌気性細菌、ロドシュードモ
ナス属細菌などの光合成細菌、さらにはノカルディア属
、アルスロバクタ−属、シュードモナス属に属するｎ−
パラフィン炭化水素資化性細菌、メタン資化性細菌、シ
ュードモナス属およびプロトアミノバクター属に属する
メタノール資化性細菌において生成蓄積することが認め
られている。

本発明者らは、メタノール資化性細菌を培養し、その乾
燥菌体を家畜の飼料にする一連の研究を行なってきた。

その過程で、メタノールを炭素源とする培地に、コバル
ト塩およびイミダゾールを添加し、エアロモナス属なら
びにアクロモバククー属に属するメタノール資化性細菌
を培養すると、該菌の菌体内にビタミンＢ１□が蓄積す
ることを見い出し本発明を完成したのである。

ビタミンＢ１２を微生物の菌体中に著量蓄積させる場合
、培地中にビタミンＢ１２の構成成分、あるいは代謝前
駆体を添加することが有効であるが、メタノール資化性
細菌の培養液にコバルト塩ならびにイミダゾールを添加
する方法については、本発明をもって最初とされる。

本発明に使用する微生物は、アエロモナス・メタノコ−
ラム（Ａｅｒｏｍｏｎａｓ ｍｅｔｈａｎｏｐｈｉｌｕ
ｍｎｏｖ、ｓｐ 、 Ｒ−１０１４、微工研寄託番号２
８０８）、アエロモナス・メタノコーラ（Ａｅｒｏｍｏ
ｎａｓｍｅｔｈａｎｏｃｏｌａ ｎｏｖ、 ｓｐ、Ｒ
−１３３２、微工研寄託番号２８０９）などのアエロモ
ナス属細菌、アクロモバクター−メタノールオキシダン
ス（Ａｃｈｒｏｍｏｂａｃｔｅｒ ｍｅｔｈａｎｏｌｏ
ｘｉｄａｎｓ ｎｏｖ、 ｓｐ。

Ｒ−１０１３、微工研寄託番号２６９３）などのアクロ
モバクタ−属細菌であり、これらはいずれも微生物工業
技術研究所に保管委託されている（４？願昭４９−１３
８５３４特願昭４９−１１２５５４）。

これらの細菌の菌学的性質は次のとおりである。

アエロモナス・メクノフイラムＲ−１０１４（Ａ 形態
学的性質（１，５％メタノール肉汁寒天平板３２℃、２
４時間培養） 画形：短桿菌、単−又は２〜３個連鎖、単−極毛のべん
毛あり。

大きさ二〇、５〜０．７Ｘ０．８〜１．３ミクロン運動
性：運動性あり ダラム染色：陰性 抗酸性染色：陰性 胞子：形成しない 細胞の多形性：なし く５）培養的性質 １．５％メタノール肉汁寒天コロニー 生育良好、円形、表面平滑、隆起、金縁、光沢あり、ク
リーム色、バター質′；色素生成なし。

肉汁寒天コロニー 生育良好、円形、表面平滑、隆起、金縁、光沢あり、淡
い肌色、幾分粘性、色素生成なし。

１．５％メタノール合成寒天コロニー 生育良好、円形、表面平滑、隆起、金縁、光沢あり、白
クリーム色、バター質、色素生成なし。

１．５％メタノール肉汁寒天斜面 生育良好、糸状生育、光沢あり、淡い肌色、色素生成な
し。

肉汁寒天斜面 生育良好、糸状生育、光沢あり、淡い肌色、色素生成な
し。

１．５％メタノール合成寒天斜面 生育良好、糸状生育、光沢あり、淡い肌色、色素生成な
し。

１．５％メタノール合成液体培地 生育良好、白色皮膜形成、白色沈渣あり、液は白濁、色
素生成なし。

肉汁 生育良好、白色皮膜形成、白色菌環、沈渣あり、液は白
濁、色素生成なし。

肉汁ゼラチン穿刺培養 上面部灰クリーム、穿刺部分淡い肌色の生育、穿刺部分
にガス発生、液化なし。

（Ｑ 生理的性質（試験培地にメタノール１．５％を含
む） 生育温度二１９℃〜４２℃で生育する。

４５℃では生育しない。

生育ｐＨ： ５〜９ 酸素要求性：メタノールを炭素源とする時には好気性。

グルコースを炭素源とする時には通性嫌気性。

ＯＦ試験（ヒューレイフソン培地）：発酵により嫌気的
にも酸を生成する。

ガスの発生（グルコース培地）ニガス発生ありリドマス
ミルク：生育良好、白色の菌環を形成する。

ペプ）゛ン化する。リドマスは脱色される。

牛乳凝固なし。ゼラチン液化：液化しない。

硫化水素の生成：生成する。

澱粉の分解二分解する。

インドール生成：生成しない。

硝酸塩の還元：亜硝酸を生成する。

カタラーゼ活性：陽性 オキシダーゼ活性：陽性 ウレアーゼ活性二陽性 ｖＰ反応二陰性 ＭＲ試験：陰性 アンモニアの生成：陽性 窒素の利用性：アンモニウム塩、硝酸塩、尿素を利用す
る。

脱窒反応：あり。

クエン酸の利用： Ｋ ｏｓ ｅｒ培地 利用する。

Ｃｈｒｉｓｔｅｎｓｅｎｊ＠地 利用する。

食塩耐性：６％まで生育する。

炭素源の利用性、酸、ガスの生成 分離源：海水 アエロモナス・メタノコーラＲ−１３３２人 形態学的
性質（１，５％メタノール肉汁寒天平板３２℃、２４時
間培培養 画形：短桿菌、単−又は２〜３個連鎖、２〜４本の極毛
のべん毛あり。

大きさ＝０．４〜０．７ Ｘ Ｏ，８〜１．２ミクロン
運動性：運動性あり。

ダラム染色：陰性 抗酸性染色：陰性 胞子：形成しない。

細胞の多形性：なし。

（Ｂ） 培養的性質 １．５％メタノール肉汁寒天コロニー 生育良好、円形、表面平滑、中心が隆起、金縁光沢あり
、クリーム色、バター質、色素生成なし。

肉汁寒天コロニー 生育良好、円形、表面平滑、中心が隆記、金縁、光沢あ
り、クリーム色、バター質、色素、生成なし。

１．５％メタノール合成寒天コロニー 生育良好、円形、表面平滑、隆起せず平坦、周囲はわず
かに波状、灰クリーム色、光沢あり、バター質、色素生
成なし。

１．５％メタノール肉汁寒天斜面 生育良好、糸状生育、光沢あり、灰クリーム色色素生成
なし。

肉汁寒天斜面 生育良好、糸状生育、光沢あり、入日クリーム色、色素
生成なし。

１．５％メタノール合成寒天斜面 生育良好、糸状生育、光沢あり、灰クリーム色、色素生
成なし。

１．５％メタノール合成液体培地 生育良好、白色皮膜形成、白色沈渣あり、液白濁、色素
生成なし。

肉汁 生育良好、わずかに白色の菌環、皮膜を形成、液白濁、
色素生成なり 肉汁ゼラチン穿刺培養 穿刺部分に灰クリーム色の綿様生育、液化あり。

Ｃ）生理的性質（試験培地にメタノール１，５％を含む
） 生育温度：１３℃〜３９°Ｃで生育する。

４３℃では生育しない。

生育ｐＨ：５〜９ 酸素要求性：メタノールを炭素源とする時には好気性、
グルコースを炭素源とする時には通性嫌気性。

ＯＦ試験（ヒューレイノソン培地）：発酵により嫌気的
にも酸を生成する。

ガス発生（グルコース培地）：ガス発生なし。

リトマスミルクニ生育良好、白色の菌環を形成、ペプト
ン化する。

リドマスは脱色される。牛乳凝固する。

ゼラチン液化：液化する。

硫化水素の生成：生成する。

澱粉の分解二分解する。

インドール生成：生成しない。

硝酸塩の還元二亜硝酸を生成する。

カタラーゼ活性：陽性 オキシダーゼ活性：陽性 ウレアーゼ活性：陽性 ｖｐ反応：、陽性 ＭＲ試験：陰性 アンモニアの生成：陽性 窒素の利用性：アンモニウム塩、硝酸塩、尿素を利用す
る。

脱窒反応：あり。

クエン酸の利用： Ｋ ｏｓｅｒ培地 利用する。

Ｃｈｒｉｓｔｅｎｓｅｎｆ＠地 利用する。

食品耐性＝８％まで生育する。

炭素源の利用性、酸、ガスの生成 注二酸の生成は認められるが、培養 進行と共にｐｎ指示薬は脱色され る。

分離源：海水 アクロモバクタ−・メタノールオキシダンスＲ−０１３ （８）形態学的性質（１，５％メタノール肉汁寒天平板
、３２℃、２４時間培養） 画形：短桿菌であり、長い−は認められない。

単一または２個連鎖状になる。

多形態性なし。べん毛なし。

大きさ二０．５〜０．８ミクロン×０．９〜１．２ミク
ロン 運動性：非運動性 ダラム染色ニゲラム陰性 抗酸性染色：陰性 胞子二なし Ｂ）培養的性質 １．５％メタノール肉汁寒天コロニー 生育良好、円形、表面平滑、平坦な隆起、全綴、灰色が
かった黄褐色、光沢あり、バター質。

１．５％メタノール合成寒天コロニー 生育良好、円形、表面平滑、隆起状、全綴、わずかに肌
色をした灰クリーム色、光沢あり、バター質。

１．５％メタノール肉汁寒天斜面 生育良好、糸状、光沢あり、灰褐色、 １．５％メタノール合成寒天斜面 生育良好、糸状、光沢あり、やや肌色をした灰クリーム
色。

１．５％メタノール合成液体培地 皮膜の形成は認められない。

液は白濁する。やや肌色をした沈渣あり。

肉汁 皮膜は形成しない。

液は濁らない。灰クリーム色の沈渣あり。

肉汁寒天斜面 生育良好、灰褐色がかったクリーム色、糸状の生育。

：Ｑ 生理的性質（試験培地にメタノール１．５％含む
） 生育温度＝２０℃〜４０℃で生育良好。

４３℃では生育しない。

生育ｐＨ： ｐＨ６〜９で生育する。

酸素要求性：好気性 リドマスミルク：わずかに白色の菌環を形成する。

ペプトン化しないが牛乳凝固が認められる。

液は紫色であるがアルカリ性にならない。ゼラチン液化
：液化しない。

硫化水素の生成：生成する。

澱粉の分解：分解しない インドール生成：生成しない。

硝酸塩の還元：亜硝酸の生成はない。

カタラーゼ活性：陽性 ウレアーゼ活性：陰性 ｖｐ反応：陰性 ＭＲ試験：陰性 アンモニアの生成：陰性 窒素源の利用性：アンモニウム塩、硝酸塩を利用する。

クエン酸の利用性：利用しない。

食塩耐性：４％まで生育する。

炭素源の利用性、酸の生成 生 育 酸の生成 メタノール 十 − エタノール −− グルコース −− フラクト−ス −− グリセリン −− ガラクトース −− イノシト−ル −−− ソルビ １・−ル −− マニトール −− アラビノース −− キシロース −− シュークロース −− トレハロース −− ラクトース −− マルトース −− 澱粉 −− 分離源：土壌 本発明に使用する発酵培地は、主炭素源としてメタノー
ルを含み、さらに通常の窒素源、無機塩および必要に応
じて微量有機栄養源を添加した培地が使用される。

炭素源としてはメタノールを使用するが、メタノールの
濃度が高すぎると微生物の生育を阻害するので、培養中
のメタノール濃度は余り高（ない方力よい。

したがって、最初に添加したメタノールのみで培養を終
了させることもできるが、一般には低濃度に維持しつつ
培養を行なうことがよいので、逐次メタノールを添加し
、培養液中のメタノール濃度を０．０５〜１．５（重量
％）に維持する。

窒素源としては、通常の発酵に用いられる硫酸７７モニ
ウム、塩化アンモニウム、アンモニア、リン酸アンモニ
ウム、尿素、硝酸アンモニウム、硝酸ナトリウム等が用
いられる。

無機塩はリジ酸カリウム、硫酸マグネシウム、リン酸、
塩化カリウム、塩化ナトリウムの他に、鉄、マンガン、
亜鉛、カルシウム等の塩類の添加が有効である。

微量有機栄養源としては、大豆蛋白加水分解液、甘蔗廃
糖蜜、コーンステイープリカー、酵母、エキスなどの添
加がビタミンＢ１２の生成蓄積に有効である。

さらに本発明の特徴であるコバルト塩およびイミダゾー
ルを添加する。

コバルト塩はコバルトの硫酸塩、塩酸塩、硝酸塩、炭酸
塩などが使用できる。

これらは培養初発時に添加すればよい。培養条件は通気
攪拌がよく、培養温度２５〜３８℃、ｐＨは６．０〜８
．０に調整する必要がある。

培養は通常２〜５日間で終了する。

培養終了液から遠心分離法により菌体を分離し、これを
通常用いられるドラムドライア−、スプレードライア−
などの乾燥機によって乾燥すれば、ビタミンＢ１□を含
有する粉末菌体が取得される。

第１表にメタノール資化性細菌の培養に用いる基本培地
組成の１例を示す。

この培地にメタノール資化性細菌を接種（−１５００ｒ
ｆＬｌ容量の振盪フラスコに培養液５０ｒＩｌｌの条件
で、温度３６℃、メタノールは初発時１．０（重量％）
、１６時間目、２４時間目にそれぞれ１．５（重量％）
添加し、４８時間培養したのち菌体を遠心分離して集め
、ニジエリチア・コリ （Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ２１５ ）を用
いる微生物定量法により菌体中のビタミンＢ１２を定量
した。

第２表に示すように、本発明で使用するメタノール資化
性細菌をコバルト塩およびイミダゾールの存在下で培養
することにより、菌体中にビタミンＢ０２を著量生成す
ることが認められた。

以下に実施例をもって本発明の詳細な説明するが、これ
らは単なる例示であって何ら本発明を制限するものでは
ない。

実施例 １ 第１表に示した基本培地に塩化コバル） ０．００２（
重量％、以下同じ）およびイミダゾール０．１５％を添
加した培地５０ ｏｚを、１０００７培養槽に仕込み、
１２９℃、２０分間加熱殺菌した。

冷却後、これにメタノールを１．０％添加し、同時にメ
タノール資化性細菌アエロモナス・メタノンイラムＲ−
１０１４の種培養液２０．／？を接種し、ｐＨ７，０に
アンモニアで中和しつつ、温度３６℃、攪拌速度毎分２
５０回転、通気量毎分５００１の通気攪拌条件で培養を
開始した。

培養中メタノール濃度をガスクロマトグラフィーによる
常法によって分析し、培養液中濃度を０．１〜０．８％
に維持するように逐次添加しつつ２０時間培養した。

培養終了液中の菌体濃度は３５．ｉ／７であった。

これは添加メタノールに対して４６．１％の収率であっ
た。

培養終了液５００７をシャープレス型遠心分離機によっ
て菌体を集め、スプレードライア−により乾燥し、１５
．９ｋｇの粉末菌体を取得した。

菌体の一部をとり熱水抽出後、ニジエリチア・コリを使
用する微生物定量法の常法によりビタミンＢ１２の定量
を行なったところ２８１ｍｐ／ｋｇのビタミンＢ１２を
含有していた。

これは５００１の培養液から４．４７９のビタミンＢ１
□の生成量に相当した。

実施例 ２ 第１表に示した基本培地に硝酸コバルト０．００２（重
量％、以下同じ）およびイミダゾール０．２０％を添加
した培地５００１を、１０００１培養槽に仕込み、１２
０℃で２０分間殺菌した。

冷却後、これにメタノールを１．０％添加し、同時にメ
タノール資化性細菌アクロモバクタ−・メタノールオキ
シダンスＲ−１０１３の種培養液２０１を接種し、実施
例１と同様にして通気攪拌培養を２０時間行なった。

培養終了液中の菌体濃度は３７．７？／ｌであり、これ
は添加メタノールに対して４８．１％の収率であった。

培養終了液５ｏＯ１をシャープレス型遠心分離機によっ
て菌体を集め、スプレードライア−により乾燥し、１６
．６ｋｇの粉末菌体を取得した。

菌体の一部をとり、実施例１と同様にして菌体中のビタ
ミンＢ１□を定量したところ、１８２ｍＩ？／ｋｙのビ
タミンＢ１２を含有していた。

これは５００１の培養液から３．０２？のビタミンＢ１
２の生成量に相当した。

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. １ アエロモナス属（ｇｅｎｕｓ Ａｅｒｏｍｏｎａ
   ｓ ）またはアクロモバクタ−属（ｇｅｎｕｓ Ａｃｈ
   ｒｏｍｏｂａｃｔｅｒ）に属するメタノール資化性細菌
   のビタミンＢ□２生産菌を、メタノール炭素源とし、コ
   バルト塩およびイミダゾールを含有してなる培地に培養
   し、培養液より菌体を分離、乾燥することを特徴とする
   ビタミンＢｔ２含有菌体の製造方法。